NO342278B1 - Isolert humant monoklonalt antistoff eller en antigen-bindende del derav og fremgangsmåte for fremstilling og anvendelse derav for behandling, transgen mus, isolert nukleinsyremolekyl, sammensetning, bispesifikt molekyl, samt immunokonjugat. - Google Patents

Isolert humant monoklonalt antistoff eller en antigen-bindende del derav og fremgangsmåte for fremstilling og anvendelse derav for behandling, transgen mus, isolert nukleinsyremolekyl, sammensetning, bispesifikt molekyl, samt immunokonjugat. Download PDF

Info

Publication number
NO342278B1
NO342278B1 NO20062630A NO20062630A NO342278B1 NO 342278 B1 NO342278 B1 NO 342278B1 NO 20062630 A NO20062630 A NO 20062630A NO 20062630 A NO20062630 A NO 20062630A NO 342278 B1 NO342278 B1 NO 342278B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
antibody
seq
variable region
chain variable
human
Prior art date
Application number
NO20062630A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20062630L (no
Inventor
Shrikant Deshpande
Mohan Srinivasan
Haichun Huang
Josephine M Cardarelli
Changyu Wang
David Passmore
Vangipuram S Rangan
Thomas E Lane
Hans S Keirstead
Michael T Liu
Original Assignee
Squibb & Sons Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Squibb & Sons Llc filed Critical Squibb & Sons Llc
Publication of NO20062630L publication Critical patent/NO20062630L/no
Publication of NO342278B1 publication Critical patent/NO342278B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/16—Central respiratory analeptics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C07K14/522—Alpha-chemokines, e.g. NAP-2, ENA-78, GRO-alpha/MGSA/NAP-3, GRO-beta/MIP-2alpha, GRO-gamma/MIP-2beta, IP-10, GCP-2, MIG, PBSF, PF-4, KC
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer isolerte monoklonale antistoffer, spesielt humane antistoffer, som binder til IP-10 med høy affinitet, hemmer bindingen av IP-I0 til dens reseptor, hemmer IP-10-indusert kalsiumstrøm og hemmer IP-10-indusert cellemigrering. Nukleinsyremolekyler som koder for antistoffene ifølge oppfinnelsen, ekspresjonsvektorer, vertsceller og fremgangsmåter for å uttrykke antistoffene ifølge oppfinnelsen tilveiebringes også. Immunokonjugater, bispesifikke molekyler og farmasøytiske blandinger omfattende antistoffene ifølge oppfinnelsen tilveiebringes også. Oppfinnelsen tilveiebringer ogsa fremgangsmåter for å hemme IP-I0-aktivitet ved anvendelse av antistoffene ifølge oppfinnelsen, inkludert fremgangsmåter for behandling av forskjellige inflammatoriske og autoimmune sykdommer.

Description

Bakgrunn for oppfinnelsen
Interferon gamma inducible protein 10 (IP-10) (også kjent som CXCL10) er et kjemokin på 10kDa som opprinnelig ble identifisert basert på ekspresjon av IP-10-genet i celler behandlet med interferon gamma (IFN-gamma) (Luster, A.D. et al. (1985) Nature 315:672-676). IP-10 oppviser homologi med proteiner som har kjemotaktisk virkning, slik som blodplatefaktor 4 og beta-thromoboglobulin og med proteiner som har mitogen effekt, slik som bindevevs-aktiverende peptid III (”connective tissue-activating peptide III”) (Luster, A.D. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2868-2871). IP-10 sekreteres av en rekke celler, omfattende endotelceller, monocytter, fibroblaster og keratinocytter, i respons til IFN-gamma (Luster, A.D. og Ravetch, J.V. (1987) J. Exp. Med.166:1084-1097). IP-10 er også vist å være til stede i makrofager i huden og endotelceller i forsinket hypersensitivitet (DTH)-responser i human hud (Kaplan, G. et al. (1987) J. Exp. Med. 166:1098-1108). Selv om den opprinnelig ble identifisert basert på at den induseres av IFN-gamma, kan IP-10 også induseres av IFN-alfa, for eksempel i dendrittiske celler (Padovan, E. et al. (2002) J. Leukoc. Biol.71:669-676). IP-10-ekspresjon kan også induseres i celler i sentralnervesystemet, slik som astrocytter og mikroglia, ved stimuli slik som IFN-gamma, virus og lipopolysakkarid (Vanguri, R. og Farber, J.M. (1994) J.
Immunol. 152:1411-1418; Ren, L.Q. et al. (1998) Brain Res. Mol. Brain Res.59:256-263). Immunbiologien for IP-10 er gjennomgått i Neville, L.F et al. (1997) Cytokine Growth Factor Rev.8:207-219.
WO 0215932 beskriver en metode for behandling av demyelinerende sykdommer
Liu MT. et al. beskriver at nøytralisering av kemokinet CXCL10 reduserer inflammatorisk cellinvasjon og demyelinering og forbedrer den neurologiske funksjonen i en viral model av multippel sklerose. J Immunol.2001, vol. 167, no.7, side 4091-4097.
CARR DJ. et al. beskriver at nøytralisering av kemokinet CXCL10 reduserer oculær Inflammasjon og forsinker viral spredning etter corneal HSV-1 infeksjon. ARVO Annual Meeting abstract search and program planner. 2003, vol.05, abstract no.4183.
Carr DJ. et al. beskriver effekten av anti-CXCL10 monoclonalt antistoff på herpes simplex virus type 1 keratitt og retinal infeksjon. J Virol.2003, vol.77, no.18, side10037-10046.
Reseptoren for IP-10 har blitt identifisert som CXCR3, en sju transmembranreseptor (Loetscher, M. et al. (1996) J. Exp. Med.184:963-969). CXCR3 er blitt vist å uttrykkes på aktiverte T-lymfocytter men ikke på hvilende T-lymfocytter, heller ikke på B-lymfocytter, monocytter eller granulocytter (Loetscher, M. et al., supra).
CXCR3-ekspresjon er vist å være oppregulert på NK-celler ved stimulering med TGF-beta 1 (Inngjerdingen, M. et al. (2001) Blood 97:367-375). To andre ligander for CXCR3 har også blitt identifisert: MIG (Loetscher, M. et al., supra) og ITAC (Cole, K.E. et al. (1998) J. Exp. Med.187:2009-2021).
Binding av IP-10 til CXCR3 har blitt vist å mediere kalsiummobilisering og kjemotaksi i aktiverte T-celler (Loetscher, M. et al., supra). Kjemotaksi og intracellulær kalsiummobilisering induseres også ved IP-10-binding til CXCR3 på aktiverte NK-celler (Maghazachi, A.A. et al. (1997) FASEB J.11:765-774). I thymus, er IP-10 vist å være en kjemoattraktant for TCR α β<+>CD8<+>T-celler, TCR γ δ<+>T-celler og NK-type celler (Romagnani, P. et al. (2001) Blood 97:601-607).
IP-10 eller dens reseptor CXCR3 har blitt identifisert i en rekke forskjellige inflammatoriske og autoimmune lidelser, omfattende multippel sklerose (se f. eks., Sorensen, T.L. et al. (1999) J. Clin. Invest.103:807-815), revmatoid artritt (se f. eks., Patel, D.D. et al. (2001) Clin. Immunol. 98:39-45), colitis ulcerosa (se f. eks., Uguccioni, M. et al. (1999) Am. J. Pathol. 155:331-336), hepatitt (se f. eks., Narumi, S. et al. (1997) J.
Immunol. 158:5536-5544), ryggmargskade (se f. eks., McTigue, D.M. et al. (1998) J.
Neurosci. Res.53:368-376; Gonzalez et al. 2003. Exp. Neurol. 184:456-463), systemisk lupus erythematosus (se f. eks., Narumi, S. et al. (2000) Cytokine 12:1561-1565), avstøtning av transplantat (se f. eks., Zhang, Z. et al. (2002) J. Immunol.168:3205-3212), Sjøgrens syndrom (se f. eks. Ogawa, N. et al. (2002) Arthritis Rheum.46:2730-2741). Følgelig er terapeutiske midler som hemmer aktiviteten ønskelig, spesielt midler som er egnet for anvendelse for mennesker.
Oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer isolerte monoklonale antistoffer, spesielt humane monoklonale antistoffer, som binder til IP-10 og som fremviser en rekke ønskelige egenskaper. Disse egenskapene omfatter høyaffinitetsbinding til human IP-10, så vel som kryssreaktivitet med IP-10 fra rhesusape men mangel på vesentlig kryssreaktivitet med både human MIG, human ITAC og mus IP-10. Videre hemmer antistoffene binding av IP-10 til dens reseptor, CXCR3, hemmer kalsiumstrømmen indusert av IP-10 i reseptoruttrykkende celler og hemmer IP-10-indusert cellemigrering (kjemotaksi). Videre er antistoffer ifølge oppfinnelsen vist å binde til IP-10 i hjernesnitt fra et humant subjekt diagnostisert med multippel sklerose.
Foreliggende oppfinnelse vedrører isolert human monoklonalt antistoff eller en antigen-bindende del derav, idet antistoffet spesifikt bindes til human IP-10 og kryssreagerer ikke med human MIG og kryssreagerer ikke med human ITAC. Idet antistoffet ifølge krav 1, er et full-lengde antistoff av en IgG1 eller IgG4 isotype eller er et antistoffragment.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre antistoff eller antigen-bindende del ifølge krav 1, idet det omfatter en tungkjede variabel region som omfatter CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser og en lettkjede variabel region som omfatter CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser, idet:
(a) tungkjedevariable region CDR3 sekvensen omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR: 32 og lettkjedvariable region CDR3 sekvensen omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR: 81;
(b) tungkjedevariable region CDR3 sekvensen omfatter aminosyresekvensene ifølge SEKV ID NR: 24 og lettkjedevariable region CDR3 sekvensen omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR: 73; eller
(c) tungkjedevariable region CDR3 sekvensen omfatter aminosyresekvensene ifølge SEKV ID NR: 28 og lettkjedevariable region CDR3 sekvensen omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR: 77.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre antistoff eller antigen-bindende del ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 3, idet det omfatter:
(a) en tungkjede variabel region CDR1 omfattende SEKV ID NR: 9, en tungkjede variabel region CDR2 omfattende SEKV ID NR: 21, en tungkjede variabel region CDR3 omfattende SEKV ID NR: 32, en lettkjede variabel region CDR1 omfattende SEKV ID NR: 59, en lettkjede variabel region CDR2 omfattende SEKV ID NR: 70 og en lettkjede variabel region CDR3 omfattende SEKV ID NR: 81;
(b) en tungkjede variabel region CDR1 omfattende SEKV ID NR: 1, en tungkjede variabel region CDR2 omfattende SEKV ID NR: 13, en tungkjede variabel region CDR3 omfattende SEKV ID NR: 24, en lettkjede variabel region CDR1 omfattende SEKV ID NR: 51, en lettkjede variabel region CDR2 omfattende SEKV ID NR: 62 og en lettkjede variabel region CDR3 omfattende SEKV ID NR: 73; eller
(c) en tungkjede variabel region CDR1 omfattende SEKV ID NR: 5, en tungkjede variabel region CDR2 omfattende SEKV ID NR: 17, en tungkjede variabel region CDR3 omfattende SEKV ID NR: 28, en lettkjede variabel region CDR1 omfattende SEKV ID NR: 55, en lettkjede variabel region CDR2 omfattende SEKV ID NR: 66 og en lettkjede variabel region CDR3 omfattende SEKV ID NR: 77.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre antistoff eller antigen-bindende del ifølge krav 1 eller 2, idet det konkurrerer for binding til IP-10 med antistoffet ifølge krav 4 eller som bindes til den samme epitopen på IP-10 som antistoffet ifølge krav 4.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre immunokonjugat, idet det omfatter antistoffet eller antigen-bindende del ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4 koblet til et terapeutisk middel så som et cytotoksin eller radioaktiv isotop.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre bispesifikt molekyl, idet det omfatter antistoffet eller den antigen-bindende delen ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, koblet til en andre funksjonell del som har en annen bindingsspesifisitet enn nevnte antistoff eller antigen-bindende del.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre sammensetning, idet den omfatter antistoffet eller antigen-bindende del ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, immunokonjugatet ifølge krav 6 eller bispesifikt molekyl ifølge krav 7, og en farmasøytisk akseptabel bærer.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre isolert nukleinsyremolekyl, idet det koder for antistoffet eller antigen-bindende del ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, eller en ekspresjonsvektor omfattende nevnte nukleinsyre, eller en vertscelle omfattende nevnte ekspresjonsvektor.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre transgen mus, idet den omfatter humane immunoglobulin tung og lettkjede transgener, idet musen uttrykker antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, eller en hybridom dannet fra nevnte mus hvor hybridomet produserer nevnte antistoff.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre antistoff eller antigen-bindende del ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4 for anvendelse i en metode for behandling av en inflammatorisk eller autoimmun sykdom.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre antistoff eller antigen-bindende del ifølge krav 11 for anvendelse i en metode for behandling ifølge krav 11, idet sykdommen er valgt fra multippel sklerose, revmatoid artritt, inflammatorisk tarmsykdom (f.eks. ulcerativ kolitt, Crohns sykdom), systemisk lupus erythematosus, Type I diabetes, inflammatoriske hudlidelser (f.eks. psoriasis, lichen planus), autoimmun thyroid sykdom (f.eks. Graves sykdom, Hashimotos thyroiditt), Sjøgrens syndrom, inflammasjon i lungene(f.eks. astma, kronisk obstruktiv lungesykdom, sarkoidose i lungene, lymfocytisk alveolitt), avstøtning av transplantat, ryggmargskade, hjerneskade (f.eks. slag), neurodegenerativ sykdom (f.eks. Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom), gingivitt, genterapi-indusert inflammasjon, angiogenesesykdom, inflammatorisk nyresykdom (f.eks. IgA nefropati, memranproliferativ glomerulonefritt, hurtig progressiv glomerulonefritt) og aterosklerose.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre antistoff eller antigen-bindende del ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4 for anvendelse i en metode for behandling av en viral eller bakteriell infeksjon som involverer uønsket IP-10 aktivitet.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre antistoff eller antigen-bindende del ifølge krav 13 for anvendelse i en metode for behandling ifølge krav 13, idet den virale infeksjonen er mediert av humant immunsviktvirus (HIV), hepatitt C virus (HCV), herpes simplex virus type I (HSV-1) eller alvorlig akutt luftveissyndrom (SARS) virus.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre fremgangsmåte for fremstilling av antistoffet eller antigen-bindende del som definert i krav 1 idet den omfatter :
(a) tilveiebringing av:
(i) en tungkjede variabel region antistoffsekvens omfattende en CDR1 sekvens som er valgt fra SEKV ID NR: 5, 9 og 1, en CDR2 sekvens som er valgt fra SEKV ID NR: 17, 21 og 13; og en CDR3 sekvens som er valgt fra SEKV ID NR: 28, 32 og 24; eller
(ii) en lettkjede variabel region antistoffsekvens omfattende en CDR1 sekvens som er valgt fra SEKV ID NR: 55, 59 og 51, en CDR2 sekvens som er valgt fra SEKV ID NR: 66, 70 og 62 og en CDR3 sekvens som er valgt fra SEKV ID NR: 77, 81 og (b) endring av minst en aminosyrerest innenfor minst en variabel region antistoffsekvens, hvor nevnte sekvens er valgt fra tungkjedevariabel region antistoffsekvensen og lettkjede variabel region antistoffsekvensen, for å danne minst en endret antistoffsekvens; og
(c) uttrykke den endrede antistoffsekvensen som et protein.
Det humane IP-10 et polypeptid har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 121 [Genbank Aksesjonsnummer NP_001556]; CXCR3 omfatter et polypeptid som har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 122 [Genbank Aksesjon. nr.
NP_001495]; rhesusape IP-10 omfatter et polypeptid som har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 123 [Genbank Aksesjon nr. AAK95955]; IP-10 fra mus omfatter et polypeptid som har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 124 [Genbank Aksesjon nr. NP_067249]; det humane MIG omfatter et polypeptid som har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 125 [Genbank Aksesjon nr. NP_002407]; og/eller det humane ITAC omfatter et polypeptid som har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 126 [Genbank Aksesjon nr. NP_005400].
Tung kjede variabel region CDR2-sekvensen kan omfatte en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av aminosyresekvenser ifølge SEKV ID NR: 13-23 og konservative modifikasjoner derav; og lett kjede variabel region CDR2-sekvensen omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av aminosyresekvenser ifølge SEKV ID NR: 62-72 og konservative modifikasjoner derav. I en annen foretrukket utførelsesform omfatter den tunge kjede variable region CDR1-sekvensen en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av aminosyresekvenser ifølge SEKV ID NR: 1-12 og konservative modifikasjoner derav; og den lette kjede variable region CDR1-sekvensen omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av aminosyresekvenser ifølge SEKV ID NR: 51-61 og konservative modifikasjoner derav. Antistoffet kan for eksempel være et humant antistoff, et humanisert antistoff eller et kimært antistoff.
Antistoffer eller antigenbindende deler derav kan konkurrerer om binding til IP-10 med hvilke som helst av de ovennevnte antistoffene.
Antistoffene heri kan for eksempel være fullengde antistoffer, for eksempel av en IgG1 eller IgG4-isotype. Alternativt kan antistoffene være antistoffragmenter, slik som Fab eller Fab’2-fragmenter eller enkeltkjede antistoffer.
Oppfinnelsen tilveiebringer også et immunokonjugat omfattende et antistoff ifølge oppfinnelsen eller antigenbindende del derav, bundet til et terapeutisk middel, for eksempel et cytotoksin eller en radioaktiv isotop. Oppfinnelsen tilveiebringer også et bispesifikt molekyl omfattende et antistoff eller antigenbindende del derav, ifølge oppfinnelsen, bundet til en andre funksjonell gruppe som har en annerledes bindingsspesifisitet enn nevnte antistoff eller antigenbindende del derav.
Blandinger omfattende et antistoff eller antigenbindende del derav eller immunokonjugat eller bispesifikt molekyl ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer tilveiebringes også.
Nukleinsyremolekyler som koder for antistoffene eller antigenbindende deler derav, ifølge oppfinnelsen er også omfattet av oppfinnelsen, så vel som ekspresjonsvektorer omfattende slike nukleinsyrer og vertsceller omfattende slike ekspresjonsvektorer. Videre tilveiebringer oppfinnelsen en transgen mus omfattende humane immunglobulin tung og lett kjede transgener, hvor musen uttrykker et antistoff ifølge oppfinnelsen, så vel som hybridomer fremstilt fra en slik mus, hvor hybridomet produserer antistoffet ifølge oppfinnelsen.
Det er mulig å hemme en inflammatorisk eller autoimmunrespons mediert av aktiverte T-celler eller NK celler omfattende å kontakte T-cellene eller NK-cellene med antistoffet eller antigenbindende del derav, ifølge oppfinnelsen, slik at den inflammatoriske eller autoimmunresponsen hemmes.
Det er mulige for behandling av en virus eller bakterieinfeksjon som omfatter uønsket IP-10-aktivitet hos et individ med behov for behandling å administrere til subjektet antistoffet eller antigenbindende del derav, slik at virus eller bakterieinfeksjonen hos subjektet behandles. For eksempel kan antistoffene anvendes for å behandle viral meningitt, viral encefalitt eller bakteriell meningitt. Viral infeksjon som skal behandles ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan være mediert av, for eksempel humant immunsviktvirus (HIV), hepatitt C-virus (HCV), herpes simplex virus type I (HSV-1) eller alvorlig akutt luftveissyndrom (SARS)-virus.
Andre trekk og fordeler ifølge foreliggende oppfinnelse vil fremgå av den følgende detaljerte beskrivelsen og eksemplene.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1A viser nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 99) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 35) av tung kjede variabel region av det humane monoklonale antistoffet 1D4. CDR1 (SEKV ID NR: 1), CDR2 (SEKV ID NR: 13) og CDR3 (SEKV ID NR: 24)-regionene er skissert og V, D og J kjønnscelle-avledningene (”derivations”) er angitt.
Figur 1B viser nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 110) og aminosyresekvens (SEKV ID NR: 84) av lett kjede variabel region av det humane monoklonale antistoffet 1D4. CDR1 (SEKV ID NR: 51), CDR2 (SEKV ID NR: 62) og CDR3 (SEKV ID NR: 73)-regionene er skissert og V og J kjønnscelle-avledningene er angitt.
Figur 2A viser nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 100) og aminosyresekvens (SEKV ID NR: 36) av tung kjede variabel region av det humane monoklonale antistoffet 1E1. CDR1 (SEKV ID NR: 2), CDR2 (SEKV ID NR: 14) og CDR3 (SEKV ID NR: 25)-regionene er skissert og V og J kjønnscelle-avledningene er angitt.
Figur 2B viser nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 111) og aminosyresekvens (SEKV ID NR: 85) av lett kjede variabel region av det humane monoklonale antistoffet 1E1. CDR1 (SEKV ID NR: 52), CDR2 (SEKV ID NR: 63) og CDR3 (SEKV ID NR: 74)-regionene er skissert og V og J kjønnscelle-avledningene er angitt.
Figur 3A viser nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 101) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 37) av tung kjede variabel region av det humane monoklonale antistoffet 2G1. CDR1 (SEKV ID NR: 3), CDR2 (SEKV ID NR: 15) og CDR3 (SEKV ID NR: 26)-regionene er skissert og V og J kjønnscelle-avledningene er angitt.
Figur 3B viser nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 112) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 86) av lett kjede variabel region av det humane monoklonale antistoffet 2G1. CDR1 (SEKV ID NR: 53), CDR2 (SEKV ID NR: 64) og CDR3 (SEKV ID NR: 75)-regionene er skissert og V og J kjønnscelle-avledningene er angitt.
Figur 4A viser nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 102) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 38) av tung kjede variabel region av det humane monoklonale antistoffet 3C4. CDR1 (SEKV ID NR: 4), CDR2 (SEKV ID NR: 16) og CDR3 (SEKV ID NR: 27)-regionene er skissert og V, D og J kjønnscelle-avledningene er angitt.
Figur 4B viser nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 113) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 87) av lett kjede variabel region av det humane monoklonale antistoffet 3C4. CDR1 (SEKV ID NR: 54), CDR2 (SEKV ID NR: 65) og CDR3 (SEKV ID NR: 76)-regionene er skissert og V og J kjønnscelle-avledningene er angitt.
Figur 5A viser nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 103) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 39) av tung kjede variabel region av det humane monoklonale antistoffet 6A5. CDR1 (SEKV ID NR: 5), CDR2 (SEKV ID NR: 17) og CDR3 (SEKV ID NR: 28)-regionene er skissert og V, D og J kjønnscelle-avledningene er angitt.
Figur 5B viser nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 114) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 88) av lett kjede variabel region av det humane monoklonale antistoffet 6A5. CDR1 (SEKV ID NR: 55), CDR2 (SEKV ID NR: 66) og CDR3 (SEKV ID NR: 77)-regionene er skissert V og J kjønnscelle-avledningene er angitt.
Figur 6A viser nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 104) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 40) av tung kjede variabel region av det humane monoklonale antistoffet 6A8. CDR1 (SEKV ID NR: 6), CDR2 (SEKV ID NR: 18) og CDR3 (SEKV ID NR: 29)-regionene er skissert og V og J kjønnscelle-avledningene er angitt.
Figur 6B viser nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 115) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 89) av lett kjede variabel region av det humane monoklonale antistoffet 6A8. CDR1 (SEKV ID NR: 56), CDR2 (SEKV ID NR: 67) og CDR3 (SEKV ID NR: 78)-regionene er skissert og V og J kjønnscelle-avledningene er angitt.
Figur 7A viser nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 105) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 41) av tung kjede variabel region av det humane monoklonale antistoffet 6B10. CDR1 (SEKV ID NR: 7), CDR2 (SEKV ID NR: 19) og CDR3 (SEKV ID NR: 30)-regionene er skissert og V, D og J kjønnscelle-avledningene er angitt.
Figur 7B viser nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 116) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 90) av lett kjede variabel region av det humane monoklonale antistoffet 6B10. CDR1 (SEKV ID NR: 57), CDR2 (SEKV ID NR: 68) og CDR3 (SEKV ID NR: 79)-regionene er skissert og V og J kjønnscelle-avledningene er angitt.
Figur 8A viser nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 106) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 42) av tung kjede variabel region av det humane monoklonale antistoffet 7C10. CDR1 (SEKV ID NR: 8), CDR2 (SEKV ID NR: 20) og CDR3 (SEKV ID NR: 31)-regionene er skissert og V, D og J kjønnscelle-avledningene er angitt.
Figur 8B viser nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 117) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 91) av lett kjede variabel region av det humane monoklonale antistoffet 7C10. CDR1 (SEKV ID NR: 58), CDR2 (SEKV ID NR: 69) og CDR3 (SEKV ID NR: 80)-regionene er skissert og V og J kjønnscelle-avledningene er angitt.
Figur 9A viser nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 107) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 43) av tung kjede variabel region av det humane monoklonale antistoffet 8F6. CDR1 (SEKV ID NR: 9), CDR2 (SEKV ID NR: 21) og CDR3 (SEKV ID NR: 32)-regionene er skissert og V, D og J kjønnscelle-avledningene er angitt.
Figur 9B viser nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 118) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 92) av lett kjede variabel region av det humane monoklonale antistoffet 8F6. CDR1 (SEKV ID NR: 59), CDR2 (SEKV ID NR: 70) og CDR3 (SEKV ID NR: 81)-regionene er skissert og V og J kjønnscelle-derivatene er angitt.
Figur 10A viser nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 108) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 44) av tung kjede variabel region av det humane monoklonale antistoffet 10A12. CDR1 (SEKV ID NR: 10), CDR2 (SEKV ID NR: 22) og CDR3 (SEKV ID NR: 33)-regionene er skissert og V og J kjønnscelle-avledningene er angitt. Alternativt kan aminosyrerest 32 innenfor CDR1 muteres fra cystein til serin (SEKV ID NR: 11), hvilket fører til VH-sekvensen ifølge SEKV ID NR: 45.
Figur 10B viser nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 119) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 93) av lett kjede variabel region av det humane monoklonale antistoffet 10A12. CDR1 (SEKV ID NR: 60), CDR2 (SEKV ID NR: 71) og CDR3 (SEKV ID NR: 82)-regionene er skissert og V og J kjønnscelle-avledningene er angitt.
Figur 11A viser nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 109) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 46) av tung kjede variabel region av det humane monoklonale antistoffet 13C4. CDR1 (SEKV ID NR: 12), CDR2 (SEKV ID NR: 23) og CDR3 (SEKV ID NR: 34)-regionene er skissert og V, D og J kjønnscelle-avledningene er angitt.
Figur 11B viser nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 120) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 94) av lett kjede variabel region av det humane monoklonale antistoffet 13C4. CDR1 (SEKV ID NR: 61), CDR2 (SEKV ID NR: 72) og CDR3 (SEKV ID NR: 83)-regionene er skissert og V og J kjønnscelle-derivatene er angitt.
Figur 12 viser sammenstillingen av aminosyresekvensen av tung kjede variabel region av 1D4, 1E1, 2G1, 6A5, 6A8, 7C10 og 10A12 med den humane kjønnscelle VH3-33-aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 47).
Figur 13 viser sammenstillingen av aminosyresekvensen av tung kjede variabel region av 6B10 og 8F6 med den humane kjønnscelle VH3-30,3-aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 48).
Figur 14 viser sammenstillingen av aminosyresekvensen av tung kjede variabel region av 3C4 med den humane kjønnscelle VH5-51-aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 49).
Figur 15 viser sammenstillingen av aminosyresekvensen av tung kjede variabel region av 13C4 med den humane kjønnscelle VH4-61-aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 50).
Figur 16 viser sammenstillingen av aminosyresekvensen av lett kjede variabel region av 1D4, 2G1, 6A5, 6A8, 10A12 og 13C4 med den humane kjønnscelle VkA27-aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 95).
Figur 17 viser sammenstillingen av aminosyresekvensen av lett kjede variabel region av 1E1, 6B10 og 8F6 med den humane kjønnscelle VkL6 aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 96).
Figur 18 viser sammenstillingen av aminosyresekvensen av lett kjede variabel region av 3C4 med den humane kjønnscelle VkL18-aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 97).
Figur 19 viser sammenstillingen av aminosyresekvensen av lett kjede variabel region av 7C10 med den humane kjønnscelle VkL15-aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 98).
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse angår isolerte monoklonale antistoffer, spesielt humane monoklonale antistoffer, som bindes spesifikt til IP-10 og som hemmer funksjonelle egenskaper av IP-10. I visse utførelsesformer er antistoffene ifølge oppfinnelsen avledet fra bestemte tung og lett kjede kjønnscellesekvenser og/eller omfatter bestemte strukturelle trekk slik som CDR-regioner omfattende bestemte aminosyresekvenser. Oppfinnelsen tilveiebringer isolerte antistoffer, fremgangsmåter for fremstilling av slike antistoffer, immunokonjugater og bispesifikke molekyler omfattende slike antistoffer og farmasøytiske sammensetninger som inneholder antistoffene, immunkonjugatene eller de bispesifikke molekylene ifølge oppfinnelsen. Antistoffene kan anvendes for å hemme inflammatoriske eller autoimmunresponser, for eksempel ved behandling av forskjellige inflammatoriske eller autoimmune sykdommer, så vel som fremgangsmåter for behandling av virale infeksjoner som omfatter uønsket IP-10-aktivitet.
For at foreliggende oppfinnelse lettere kan forstås, defineres først visse betegnelser. Ytterligere definisjoner er angitt gjennom hele den detaljerte beskrivelsen.
Betegnelsene "interferon gamma inducible protein 10" “IP-10," og “CXCL10” anvendes om hverandre og omfatter varianter, isoformer og arts homologer av human IP-10. Følgelig kan humane antistoffer ifølge oppfinnelsen, i visse tilfeller, kryssreagere med IP-10 fra arter forskjellig fra humane. I andre tilfeller kan antistoffene være fullstendig spesifikke for human IP-10 og kunne ikke oppvise arts eller andre typer av kryssreaktivitet. Den fullstendige aminosyresekvensen av human IP-10 har Genbank aksesjonsnummer NP_001556 (SEKV ID NR: 121). Den fullstendige aminosyresekvensen av IP-10 fra rhesusape har Genbank aksesjonsnummer AAK95955 (SEKV ID NR: 123). Den fullstendige aminosyresekvensen av mus IP-10 har Genbank aksesjonsnummer NP_067249 (SEKV ID NR: 124).
Betegnelsen “CXCR3” angir reseptoren for IP-10 (CXCL10). Den fullstendige aminosyresekvensen av human CXCR3 har Genbank aksesjonsnummer NP_001495 (SEKV ID NR: 122).
Betegnelsen “MIG” referer til en ligand for CXCR3 også kjent som monokin indusert av gammainterferon, som skiller seg fra IP-10. Den fullstendige aminosyresekvensen av human MIG har Genbank aksesjonsnummer NP_002407 (SEKV ID NR: 125).
Betegnelsen “ITAC” angir en ligand for CXCR3 også kjent som interferoninduserbar T-celle alfa kjemoattraktant, som skiller seg fra IP-10. Den fullstendige aminosyresekvensen av human ITAC har Genbank aksesjonsnummer NP_005400 (SEKV ID NR: 126).
Betegnelsen "immunrespons" refererer til virkningen av, for eksempel lymfocytter, antigenpresenterende celler, fagocyttiske celler, granulocytter og oppløselige makromolekyler produsert av de ovennevnte cellene eller leveren (omfattende antistoffer, cytokiner og komplement) som resulterer i selektiv skade på, destruksjon av eller fjerning fra menneskekroppen av invaderende patogener, celler eller vev infisert med patogener, kankrøse celler, eller, i tilfeller av autoimmunitet eller patologisk inflammasjon, normale humane celler eller vev.
En “signaltransduksjon-overføringsbane (”pathway”)” refererer til den biokjemiske forbindelsen mellom en rekke signaltransduksjonsmolekyler som har en funksjon ved transmisjonen av et signal fra én del av en celle til en annen del av en celle. Som anvendt heri omfatter uttrykket "celleoverflatereseptor" for eksempel molekyler og komplekser av molekyler som er i stand til å motta et signal og transmisjonen av et slikt signal gjennom plasmamembranen i en celle. Et eksempel på en "celleoverflatereseptor" ifølge foreliggende oppfinnelse er CXCR3-reseptoren som IP-10-molekylene binder til.
Betegnelsen “antistoff” som referert til heri omfatter hele antistoffer og hvilke som helst antigenbindende fragment (dvs. “antigenbindende del”) eller enkeltkjeder derav. Et "antistoff" refererer til et glykoprotein omfattende minst to tunge (H) kjeder og to lette (L) kjeder innbyrdes forbundet ved disulfidbindinger eller en antigenbindende del derav. Hver tung kjede omfatter en tung kjede variabel region (forkortet her som VH) og en tung kjede konstant region. Den tunge kjede konstante regionen omfatter tre domener, CH1, CH2og CH3. Hver lett kjede omfatter en lett kjede variabel region (forkortet her som VL) og en lett kjede konstant region. Den lette kjede konstante region omfatter ett domene, CL. VHog VL-regionene kan være ytterligere delt opp i regioner av hypervariabilitet, kalt komplementaritetsbestemmende regioner (CDR), hvor regioner som er mer konserverte, kalt struktur (framework”)-regioner (FR) er flettet inn. Hver VHog VLer sammensatt av tre CDR’er og fire FR’er, arrangert fra den aminoterminale til den karboksyterminale enden i den følgende rekkefølgen: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. De variable regionene av de tunge og lette kjedene inneholder et bindingsdomene som interagerer med et antigen. De konstante regionene av antistoffene kan mediere binding av immunglobulinet til vertsvev eller faktorer, inkludert forskjellige celler av immunsystemet (f. eks., effektorceller) og den første komponenten (Clq) av det klassiske komplementsystemet.
Betegnelsen "antigenbindende del" av et antistoff (eller ganske enkelt "antistoffandel"), som anvendt her, refererer til ett eller flere fragmenter av et antistoff som beholder evnen til å spesifikt binde til et antigen (f. eks., IP-10). Det er vist at den antigenbindende funksjonen av et antistoff kan oppfylles av fragmenter av et fullengde antistoff. Eksempler på bindende fragmenter omfattet innenfor betegnelsen "antigenbindende del" av et antistoff omfatter (i) et Fab-fragment, et monovalent fragment bestående av VL, VH, CLog CH1-domenene; (ii) et F(ab')2-fragment, et bivalent fragment omfattende to Fab-fragmenter bundet av en disulfidbro ved hengselsregionen; (iii) et Fd-fragment bestående av VHog CH1-domenene; (iv) et Fv-fragment bestående av VLog VH-domenene av en enkelt arm av et antistoff, (v) et dAb-fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), som består av et VH-domene; og (vi) en isolert komplementaritetsbestemmende region (CDR). Videre kan de to domenene av Fv-fragmentet, VLog VH, selv om de kodes for av separate gener, bindes sammen, ved anvendelse av rekombinante metoder, ved en syntetisk linker som tillater dem å fremstilles som en enkelt proteinkjede hvor VLog VH-regionene pares for å danne monovalente molekyler (kjent som enkeltkjede Fv (scFv); se f. eks., Bird et al.
(1988) Science 242:423-426; og Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Slike enkeltkjede antistoffer er også ment å være omfattet innenfor betegnelsen "antigenbindende del" av et antistoff. Disse antistoffragmentene oppnås ved anvendelse av konvensjonelle teknikker kjent for fagfolk på området og fragmentene screenes for anvendelighet på samme måte som intakte antistoffer.
Et "isolert antistoff", som anvendt heri, skal referere til et antistoff som er hovedsakelig fri for andre antistoffer som har ulike antigene spesifisiteter (f. eks., et isolert antistoff som spesifikt binder IP-10 er hovedsakelig fritt for antistoffer som spesifikt binder antigener forskjellig fra IP-10). Et isolert antistoff som spesifikt binder IP-10 kan imidlertid ha kryssreaktivitet med andre antigener, slik som IP-10-molekyler fra andre arter. Videre kan et isolert antistoff være hovedsakelig fritt for annet cellulært materiale og/eller kjemikalier.
Betegnelsene "monoklonalt antistoff" eller "monoklonal antistoff-blanding" som anvendt heri refererer til en fremstilling av antistoffmolekyler med enkel molekyl sammensetning. En monoklonalt antistoff-blanding oppviser en enkelt bindingsspesifisitet og affinitet for en bestemt epitop.
Betegnelsen "humant antistoff", som anvendt heri, skal omfatte antistoffer som har variable regioner hvor både struktur (framework”) og CDR-regionene er avledet fra immunglobulinsekvenser fra human kjønnscelle. Dersom antistoffet inneholder en konstant region, er videre den konstante region også avledet fra immunglobulinsekvenser fra human kjønnscelle. De humane antistoffene ifølge oppfinnelsen kan omfatte aminosyrerester ikke kodet for av immunglobulinsekvenser fra human kjønnscelle (f. eks., mutasjoner innført ved tilfeldig eller setespesifikk mutagenese in vitro eller ved somatisk mutasjon in vivo). Imidlertid er betegnelsen "humant antistoff", som anvendt heri, ikke ment å omfatte antistoffer hvor CDR-sekvenser avledet fra kjønnscelle fra en annen pattedyrart, for eksempel en mus, er bundet til humane struktur (framework”)-sekvenser.
Betegnelsen "humant monoklonalt antistoff" refererer til antistoffer som oppviser en enkelt bindingsspesifisitet som har variable regioner hvor både struktur (framework”) og CDR-regionene er avledet fra immunglobulinsekvenser fra human kjønnscelle. I én utførelsesform produseres de humane monoklonale antistoffene av et hybridom som omfatter en B-celle oppnådd fra et transgent ikke-humant dyr, f. eks., en transgen mus, som har et genom som omfattee et humant tung kjede transgen og et lett kjede transgen fusjonert til en immortalisert celle.
Betegnelsen "rekombinant humant antistoff", som anvendt heri, omfatter alle humane antistoffer som fremstilles, uttrykkes, dannes eller isoleres ved rekombinante metoder, slik som (a) antistoffer isolert fra et dyr (f. eks., en mus) som er transgen eller transkromosomal for humane immunglobulingener eller et hybridom fremstilt derfra (ytterligere beskrevet nedenfor), (b) antistoffer isolert fra en vertscelle transformert til å uttrykke det humane antistoffet, f. eks., fra et transfectoma, (c) antistoffer isolert fra et rekombinant, kombinatorisk humant antistoffbibliotek og (d) antistoffer fremstilt, uttrykt, dannet eller isolert ved hvilke som helst andre metoder som omfatter spleising av humane immunglobulin-gensekvenser til andre DNA-sekvenser. Slike rekombinante humane antistoffer har variable regioner hvor struktur (framework”) og CDR-regionene er avledet fra immunglobulinsekvenser fra human kjønnscelle. I visse utførelsesformer kan imidlertid slike rekombinante humane antistoffer underlegges in vitro mutagenese (eller, når et dyr transgen for humane Ig-sekvenser anvendes, in vivo somatisk mutagenese) og følgelig er aminosyresekvensene av VHog VL-regionene av de rekombinante antistoffene sekvenser som, selv om de er avledet fra og relatert til humane kjønnscelle VHog VL-sekvenser, kanskje ikke finnes naturlig i det humane antistoff kjønnscelle-repertoaret in vivo.
Som anvendt heri refererer "isotype" til antistoffklassen (f. eks., IgM eller IgGl) som er kodet for av tung kjede konstant region-genene.
Uttrykkene "et antistoff som gjenkjenner et antigen" og "et antistoff spesifikt for et antigen" anvendes om hverandre heri med betegnelsen "et antistoff som binder spesifikt til et antigen.”
Som anvendt heri er et antistoff som “spesifikt binder til humant IP-10” ment å referere til et antistoff som binder til humant IP-10 med en KDpå 5 x 10<-9>M eller lavere, mer foretrukket 2 x 10<-9>M eller lavere og enda mer foretrukket 1 x 10<-10>M eller lavere. Et antistoff som “kryssreagerer med rhesusape IP-10” skal referere til et antistoff som binder til rhesusape IP-10 med en KDpå 0,5 x 10<-8>M eller lavere, mer foretrukket 5 x 10<-9>M eller lavere og enda mer foretrukket 2 x 10<-9>M eller lavere. Et antistoff som “ikke kryssreagerer med mus IP-10” eller “ikke kryssreagerer med humant MIG” eller “ikke kryssreagerer med human ITAC” er ment å referere til et antistoff som binder til mus IP-10, human MIG eller human ITAC med en KDpå 1,5 x 10<-8>M eller høyere, mer foretrukket a KDof 5-10 x 10-8 M eller høyere og enda mer foretrukket 1 x 10<-7>M eller høyere. I visse utførelsesformer oppviser slike antistoffer som ikke kryssreagerer med mus IP-10, human MIG og/eller human ITAC hovedsakelig udetekterbar binding mot disse proteinene i standard bindingsforsøk.
Som anvendt heri er et antistoff som “hemmer binding av IP-10 til CXCR3” ment å referere til et antistoff som hemmer IP-10-binding til CXCR3 med en Kipå 1 nM eller lavere, mer foretrukket 0,75 nM eller lavere, enda mer foretrukket 0,5 nM eller lavere og enda mer foretrukket 0,25 nM eller lavere.
Som anvendt heri skal et antistoff som “hemmer IP-10-indusert kalsiumstrøm” referere til et antistoff som hemmer IP-10-indusert kalsiumstrøm med en IC50på 10 nM eller lavere, mer foretrukket 7,5 nM eller lavere, enda mer foretrukket 5 nM eller lavere og enda mer foretrukket 2,5 nM eller lavere.
Som anvendt heri skal et antistoff som “hemmer IP-10-indusert cellemigrering” referere til et antistoff som hemmer human IP-10-indusert cellemigrering med en IC50på 2 μg/ml eller lavere, mer foretrukket 1 μg/ml eller lavere, enda mer foretrukket 0,5 μg/ml eller lavere og enda mer foretrukket 0,25 μg/ml eller lavere.
Betegnelsen "Kassos" eller “Ka”, som anvendt heri, skal referere til assosiasjonshastigheten for en bestemt antistoff antigen-interaksjon, mens betegnelsen "Kdis" eller “Kd,” som anvendt her, skal referere til dissosiasjonshastigheten for en bestemt antistoff antigen-interaksjon. Betegnelsen “KD”, som anvendt heri, skal referere til dissosiasjonskonstanten, som oppnås fra ratioen av Kdtil Ka(dvs. Kd/Ka) og uttrykkes som en molar konsentrasjon (M). KD-verdier for antistoffer kan bestemmes ved anvendelse av metoder veletablerte på området. En foretrukket metode for å bestemme KDfor et antistoff er ved anvendelse av overflate plasmon resonans, foretrukket ved anvendelse av et biosensorsystem slik som et Biacore® system.
Som anvendt heri refererer betegnelsen “høy affinitet” for et IgG-antistoff til et antistoff som har en KDpå 10<-8>M eller lavere, mer foretrukket 10<-9>M eller lavere og enda mer foretrukket 10<-10>M eller lavere for et målantigen. Imidlertid kan “høyaffinitets”-binding variere for andre antistoff-isotyper. For eksempel refererer “høyaffinitets”-binding for en IgM-isotype til et antistoff som har en KDpå 10<-7>M eller lavere, mer foretrukket 10<-8>M eller lavere.
Som anvendt her omfatter betegnelsen "subjekt" menneske eller hvilket som helst ikke-humant dyr. Betegnelsen "ikke-humant dyr" omfatter alle virveldyr, f. eks., pattedyr og ikke pattedyr, slik som ikke-humane primater, sauer, hunder, katter, hester, kuer kyllinger, amfibier, reptiler, osv.
Forskjellige aspekter av oppfinnelsen er beskrevet mer detaljert i de følgende avsnittene.
Anti-IP-10-antistoffer
Antistoffene heri er karakterisert ved spesielle funksjonelle trekk eller egenskaper av antistoffene. For eksempel binder antistoffene spesifikt til human IP-10. I tillegg kan antistoffene kryssreagere med IP-10 fra én eller flere ikke-humane primater, slik som rhesusape. Foretrukket kryssreagerer antistoffene ikke med mus IP-10. Videre, selv om MIG og ITAC også er ligander for CXCR3-reseptorene, kryssreagerer antistoffene ifølge oppfinnelsen foretrukket ikke med human MIG eller human ITAC.
Foretrukket binder et antistoff ifølge oppfinnelsen til IP-10 med høy affinitet, for eksempel med en KDpå 10<-8>M eller lavere eller 10<-9>M eller lavere eller til og med 10<-10>M eller lavere.
Videre er antistoffene ifølge oppfinnelsen i stand til å hemme én eller flere funksjonelle aktiviteter av IP-10. For eksempel hemmer, i én utførelsesform, antistoffene bindingen av IP-10 til CXCR3. I en annen utførelsesform hemmer antistoffene IP-10-indusert kalsiumstrøm. I enda en annen utførelsesform hemmer antistoffene IP-10-indusert cellemigrering (kjemotaksi).
Standardanalyser for å bedømme bindingsevnen for antistoffene til IP-10 fra forskjellige arter og/eller MIG eller ITAC er kjent på området, omfattende for eksempel ELISA, Western blots og RIA. Egnede analyser er beskrevet i detalj i eksemplene.
Bindingskinetikken (f. eks., bindingsaffinitet) for antistoffene kan også bedømmes ved standardanalyser kjent på området, slik som ved Biacore-analyse. Analyser for å bedømme effektene av antistoffene på funksjonelle egenskaper av IP-10 (f. eks., reseptorbinding, kalsiumstrøm, kjemotaksi) er beskrevet mer detaljert i eksemplene.
Følgelig vil et antistoff som “hemmer” én eller flere av disse funksjonelle egenskapene for IP-10 (f. eks., biokjemiske, immunokjemiske, cellulære, fysiologiske eller andre biologiske aktiviteter eller lignende) som bestemt i henhold til metoder kjent på området og beskrevet heri, være forstått å angå en statistisk signifikant reduksjon i den bestemte aktiviteten relativt til den sett i fravær av antistoffet (f. eks., eller når et kontrollantistoff med irrelevant spesifisitet er til stede). Et antistoff som hemmer en IP-10-aktivitet påvirker foretrukket en slik statistisk signifikant reduksjon med minst 10% av det målte parameteret, mer foretrukket med minst 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% eller 90% og i visse foretrukne utførelsesformer kan et antistoff ifølge oppfinnelsen hemme mer enn 92%, 94%, 95%, 97%, 98% eller 99% av en funksjonell aktivitet av IP-10.
Monoklonale antistoffer 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 og 13C4
Foretrukne antistoffer er de humane monoklonale antistoffene 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 og 13C4, isolert og strukturelt karakterisert som beskrevet i Eksemplene 1 og 2. Et annet foretrukket antistoff er 10A12S, hvor aminosyrerest 32 av tung kjede av 10A12 (i VHCDR1) er mutert fra et cystein til et serin. Aminosyresekvensene av VHfor 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S og 13C4 er vist i SEKV ID NR: 35-46, henholdsvis. Aminosyresekvensene av VLfor 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 og 13C4 er vist i SEKV ID NR: 84-94, henholdsvis.
Gitt at hvert av disse antistoffene kan binde til IP-10, kan VHog VL-sekvensene “blandes og matches” for å fremstille andre anti-IP-10 bindende molekyler ifølge oppfinnelsen. IP-10-binding for slike “blandede og matchede” antistoffer kan testes ved anvendelse av bindingsanalysene beskrevet ovenfor og i eksemplene (f. eks., ELISA). Foretrukket, når VHog VL-kjeder blandes og matches, erstattes en VH-sekvens fra en bestemt VH/VL-paring med en strukturelt lignende VH-sekvens. Likeledes ersattes en VL-sekvens fra en bestemt paring av VH/VLforetrukket med en strukturelt lignende VL-sekvens. For eksempel er VHog VL-sekvensene av 1D4, 2G1, 6A5, 6A8, 10A12 eller 10A12S spesielt mottagelige for blanding og matching, siden disse antistoffene anvender VHog VL-sekvenser avledet fra samme kjønnscellesekvenser (VH 3-33 og Vk A27) og følgelig oppviser de strukturell likhet. Likeledes er VHog VL-sekvensene av 6B10 og 8F6 også spesielt mottagelige for blanding og matching, siden de også anvender VHog VL-sekvenser avledet fra de samme kjønnscellesekvensene (VH 3-30,3 og Vk L6) og følgelig oppviser de strukturell likhet. Alternativt kan, for eksempel VH-sekvensen av 1D4, 2G1, 6A5, 6A8, 10A12 eller 10A12S pares med VLfra 13C4, siden VH-sekvensene av 1D4, 2G1, 6A5, 6A8, 10A12 og 10A12S opprinnelig var paret med en VL-sekvens av kjønnscelle Vk A27 og VL-sekvensen av 13C4 også er avledet fra kjønnscelle Vk A27. Likeledes kan VL-sekvensen av 7C10 eller 1E1 pares med VHav 1D4, 2G1, 6A5, 6A8, 10A12 eller 10A12S, siden VL-sekvensene av 7C10 og 1E1 opprinnelig var paret med en VH-sekvens av kjønnscelle VH 3-33 og VH-sekvensene av 1D4, 2G1, 6A5, 6A8, 10A12 og 10A12S også er avledet fra kjønnscelle VH 3-33. Det vil være tydelig for fagfolk at annen VH/VL-paring av strukturelt lignende sekvenser kan fremstilles fra VHog VL-sekvensene beskrevet her for de monoklonale antistoffene 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 og 13C4.
Antistoffer kan omfatte tung kjede og lett kjede CDR1’er, CDR2’er og CDR3’er av 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S og 13C4 eller kombinasjoner derav. Aminosyresekvensene av VHCDR1’ene av 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S og 13C4 er vist i SEKV ID NR: 1-12.
Aminosyresekvensene av VHCDR2’ene av 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 og 13C4 er vist i SEKV ID NR: 13-23. Aminosyresekvensene av VHCDR3’ene av 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 og 13C4 er vist i SEKV ID NR: 24-34. Aminosyresekvensene av VκCDR1’ene av 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 og 13C4 er vist i SEKV ID NR: 51-61.
Aminosyresekvensene av VκCDR2’ene av 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 og 13C4 er vist i SEKV ID NR: 62-72. Aminosyresekvensene av VκCDR1’ene av 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 og 13C4 er vist i SEKV ID NR: 73-83. CDR-regionene er skissert ved anvendelse av Kabat-systemet (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Femte Utgave, U.S. Department of Health and Human Services, NIH-publikasjon nr.91-3242).
Gitt at hvert av disse antistoffene kan binde til IP-10 og at antigenbindende spesifisitet primært gis av CDR1, 2 og 3-regionene, kan VHCDR1, 2 og 3-sekvensene og VLCDR1, 2 og 3-sekvensene “blandes og matches” (dvs. CDR’er fra forskjellige antistoffer kan blandes og matches, selv om hvert antistoff må inneholde en VHCDR1, 2 og 3 og en VLCDR1, 2 og 3) for å fremstille andre anti-IP-10 bindende molekyler ifølge oppfinnelsen. IP-10 binding for slike “blandede og matchede” antistoffer kan testes ved anvendelse av bindingsanalysen beskrevet ovenfor og i eksemplene (f. eks., ELISA).
Foretrukket, når VHCDR-sekvensene blandes og matches, erstattes CDR1, CDR2 og/eller CDR3-sekvensen fra en bestemt VH-sekvens med en strukturelt lignende CDR-sekvens(er). Likeledes blir, når VLCDR-sekvenser blandes og matches, CDR1, CDR2 og/eller CDR3-sekvensen fra en bestemt VL-sekvens foretrukket erstattet med en strukturelt lignende CDR-sekvens(s). For eksempel har VHCDR1’ene av 1D4, 1E1, 2G1, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 og 10A12S noe strukturell likhet og er derfor mottagelige for blanding og matching, mens VHCDR1’ene av 3C4 og 13C4 ikke er strukturelt lik VHCDR1’ene av 1D4, 1E1, 2G1, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 og 10A12S og skulle følgelig ikke blandes og matches med dem. Det vil være innlysende for fagfolk at nye VHog VL-sekvenser kan dannes ved å erstatte én eller flere VHog/eller VLCDR region-sekvenser med strukturelt lignende sekvenser fra CDR-sekvensene beskrevet her for monoklonale antistoffer antistoffene 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 og 13C4.
Antistoffer med bestemte kjønnscellesekvenser
I visse utførelsesformer omfatter et antistoff heri en tung kjede variabel region fra et bestemt tung kjede immunglobulingen fra kjønnscelle og/eller en lett kjede variabel region fra et bestemt lett kjede immunglobulingen fra kjønnscelle.
Som vist heri har det blitt fremstilt humane antistoffer spesifikke for IP-10 som omfatter en tung kjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant kjønnscelle VH 3-33 gen, VH 3-30,3-gen, VH 5-51-gen eller VH 4-61-gen. Et isolert monoklonalt antistoff eller en antigenbindende del derav, hvor antistoffet omfatter en tung kjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant VH kjønnscelle-gen er valgt fra gruppen bestående av: VH 3-33, VH 3-30,3, VH 5-51 og VH 4-61. Foretrukket er antistoffet spesifikt for et humant IP-10-polypeptid (f.eks. omfattende sekvensen fra Genbank aksesjon nr. NP_001556).
Som også vist heri har det blitt fremstilt humane antistoffer spesifikke for IP-10 som omfatter en lett kjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant kjønnscelle Vk A27-gen, Vk L15-gen, Vk L6-gen eller Vk L18-gen. Oppfinnelsen tilveiebringer følgelig et isolert monoklonalt antistoff eller en antigenbindende del derav, hvor antistoffet omfatter en lett kjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant Vk kjønnscelle-gen valgt fra gruppen bestående av: Vk A27, Vk L15, Vk L6 og Vk L18. Foretrukket er antistoffet spesifikt for et humant IP-10-polypeptid (f.eks. omfattende sekvensen fra Genbank aksesjon nr. NP_001556).
Antistoffer kan omfatte en tung kjede variabel region som er produktet av eller avledet fra én av de ovenfor opplistede humane kjønnscelle VH-genene og som også omfatter en lett kjede variabel region som er produktet av eller avledet fra én av de ovenfor opplistede human kjønnscelle Vk-genene. Et isolert monoklonalt antistoff eller en antigenbindende del derav kan omfatte:
(a) en tung kjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant VH kjønnscelle-gen valgt fra gruppen bestående av: VH 3-33, VH 3-30,3, VH 5-51 og VH 4-61; og
(b) en lett kjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant Vk kjønnscelle-gen valgt fra gruppen bestående av: Vk A27, Vk L15, Vk L6 og Vk L18. Antistoffet er foretrukket spesifikt for et humant IP-10-polypeptid (f.eks. omfattende sekvensen fra Genbank aksesjon nr. NP_001556).
I én utførelsesform omfatter antistoffet en lett kjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant Vk A27-gen. Eksempler på antistoffer som har VHog VKav VH 3-33 og Vk A27, henholdsvis, omfatter 1D4, 2G1, 6A5, 6A8, 10A12 og 10A12S. I en annen utførelsesform omfatter antistoffet en lett kjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant Vk L15-gen. Et eksempel på et antistoff som har VHog VKav VH 3-33 og Vk L15, henholdsvis, er 7C10. I en annen utførelsesform omfatter antistoffet en lett kjede variabel region av et humant Vk L6-gen. Et eksempel på et antistoff som har VHog VKav VH 3-33 og Vk L6, henholdsvis, er 1E1.
Eksempler på antistoffer som har VHog VKav VH 3-30,3 og Vk L6, henholdsvis, omfatter 6B10 og 8F6.
Et eksempel på et antistoff som har VHog VKav VH 5-51 og Vk L18, henholdsvis, er 3C4.
Et eksempel på et antistoff som har VHog VKav VH 4-61 og Vk A27, henholdsvis, er 13C4.
Som anvendt her omfatter et humant antistoff tung eller lett kjede variable regioner som er “produktet av” eller “avledet fra” en bestemt kjønnscellesekvens dersom de variable regionene av antistoffet oppnås fra et system som anvender immunglobulingener fra humane kjønnsceller. Slike systemer omfatter å immunisere en transgen mus som bærer humane immunglobulingener med antigenet av interesse eller screene et humant immunglobulingenbibliotek fremvist (”displayed”) på fag med antigenet av interesse. Et humant antistoff som er “produktet av” eller “avledet fra” et immunglobulingen fra human kjønnscelle kan identifiseres som sådan ved å sammenligne aminosyresekvensen av det humane antistoffet med aminosyresekvensene av immunglobulingener fra humane kjønnsceller og selektere den humane kjønnscelle immunglobulinsekvensen som er nærmest i sekvens (dvs. høyest % identitet) med sekvensen av det humane antistoffet. Et humant antistoff som er “produktet av” eller “avledet fra” en bestemt immunglobulinsekvens fra human kjønnscelle kan inneholde aminosyreforskjeller sammenlignet med kjønnscellesekvensen, på grunn av, for eksempel naturlig forekommende somatiske mutasjoner eller bevisst innføring av seterettet mutasjon.
Imidlertid er et valgt humant antistoff typisk minst 90% identisk i aminosyrsekvensen med en aminosyresekvens kodet for av et immunglobulingen fra human kjønnscelle og inneholder aminosyrerester som identifiserer det humane antistoffet som humant sammenlignet med kjønnscelle immunglobulin aminosyresekvensene fra andre arter (f. eks., murine kjønnscellesekvenser). I visse tilfeller kan et humant antistoff være minst 95% eller til og med minst 96%, 97%, 98% eller 99% identisk i aminosyresekvens med aminosyresekvensen kodet for av immunglobulingenet fra human kjønnscelle. Typisk vil et humant antistoff avledet fra en bestemt human kjønnscellesekvens ikke fremevise mer enn 10 aminosyreforskjeller fra aminosyresekvensen kodet for av det humane kjønnscelle immunglobulingenet. I visse tilfeller kan det humane antistoffet ikke fremvise mer enn 5 eller endog ikke mer enn 4, 3, 2 eller 1 aminosyreforskjell fra aminosyresekvensen kodet for av immunglobulingenet fra kjønnscelle.
Homologe antistoffer
Antistoffet kan omfatte tung og lett kjede variable regioner omfattende aminosyresekvenser som er homologe med aminosyresekvensene av de foretrukne antistoffene beskrevet her og hvor antistoffene beholder de ønskede funksjonelle egenskapene til anti-IP-10-antistoffene ifølge oppfinnelsen.
I forskjellige utførelsesformer kan antistoffet oppvise én eller flere, to eller flere, tre eller flere, fire eller flere, fem eller flere eller seks eller flere av de funksjonelle egenskapene listet opp som (d) til (j) ovenfor. Antistoffet kan for eksempel være et humant antistoff, et humanisert antistoff eller et kimært antistoff.
I andre utførelsesformer kan aminosyresekvensene av VHog/eller VLvære 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% homologe med sekvensene angitt ovenfor. Et antistoff som har VHog VL-regioner som har høy (dvs.80% eller høyere) homologi med VHog VL-regionene ifølge SEKV ID NR: 35-46 og 84-94, henholdsvis, kan oppnås ved mutagenese (f. eks., seterettet eller PCR-mediert mutagenese) av nukleinsyremolekyler som koder for SEKV ID NR: 35-46 og/eller 84-94, etterfulgt av testing av det kodede endrede antistoffet for beholdt funksjon (dvs. funksjonene angitt i (c) til (j) ovenfor) ved anvendelse av den funksjonelle analysen beskrevet her.
Som anvendt heri er prosent homologi mellom to aminosyresekvenser ekvivalent med prosent identitet mellom de to sekvensene. Prosent identitet mellom de to sekvensene er en funksjon av antall identiske posisjoner felles for sekvensene (dvs. % homologi = antall identiske posisjoner/totalt antall posisjoner x 100), tatt i betraktning antall gaps og lengden av hvert gap, som det er nødvendig å innføre for optimal sammenstilling av de to sekvensene. Sammenligningen av sekvenser og bestemmelse av prosent identitet mellom to sekvenser kan gjennomføres ved anvendelse av en matematisk algoritme, som beskrevet i de ikke-begrensende eksemplene nedenfor.
Prosent identitet mellom to aminosyresekvenser kan bestemmes ved anvendelse av algoritmen ifølge E. Meyers og W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) som er innarbeidet i ALIGN-programmet (versjon 2,0), ved anvendelse av en PAM120 vekt resttabell, en gap lengde-straff på 12 og en gap-straff på 4. I tillegg kan prosent identitet mellom to aminosyresekvenser bestemmes ved anvendelse av Needleman og Wunsch (J. Mol. Biol.48:444-453 (1970))-algoritmen som er innarbeidet i GAP-programmet i GCG programvarepakken (tilgjengelig ved http://www.gcg.com), ved anvendelse av enten en Blossum 62-matrise eller en PAM250-matrise og en gap vekt på 16, 14, 12, 10, 8, 6 eller 4 og en lengde vekt på 1, 2, 3, 4, 5 eller 6.
I tillegg eller alternativt kan proteinsekvensene heri ytterligere anvendes som en "spørsmål (”query”)-sekvens" for å utføre et søk mot offentlige databaser for å, for eksempel identifisere relaterte sekvenser. Slike søk kan utføres ved anvendelse av XBLAST-programmet (versjon 2,0) ifølge Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-10. BLAST-proteinsøkene kan utføres med XBLAST-programmet, score = 50, ordlengde = 3 for å oppnå aminosyresekvenser homologe med antistoffmolekylene ifølge oppfinnelsen. For å oppnå ”gapped” sammenstillinger for sammenligningsformål, kan Gapped BLAST anvendes som beskrevet i Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402. Ved anvendelse av BLAST og Gapped BLAST-programmer, kan stardardparametrene for de respektive programmene (f. eks., XBLAST og NBLAST) anvendes. Se http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Antistoffer med konservative modifikasjoner
I visse utførelsesformer omfatter et antistoff en tung kjede variabel region omfattende CDR1, CDR2 og CDR3-sekvenser og en lett kjede variabel region omfattende CDR1, CDR2 og CDR3-sekvenser, hvor én eller flere av disse CDR-sekvensene omfatter spesifiserte aminosyresekvenser basert på de foretrukne antistoffene beskrevet heri (f. eks., 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S eller 13C4) eller konservative modifikasjoner derav og hvor antistoffene beholder de ønskede funksjonelle egenskapene til anti-IP-10-antistoffene ifølge oppfinnelsen.
I en foretrukket utførelsesform omfatter tung kjede variabel region CDR2-sekvensen en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av aminosyresekvenser ifølge SEKV ID NR: 13-23 og konservative modifikasjoner derav; og lett kjede variabel region CDR2-sekvensen omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av aminosyresekvenser ifølge SEKV ID NR: 62-72 og konservative modifikasjoner derav. I en annen foretrukket utførelsesform omfatter tung kjede variabel region CDR3-sekvensen en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av aminosyresekvenser ifølge SEKV ID NR: 1-12 og konservative modifikasjoner derav; og lett kjede variabel region CDR3-sekvensen omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av aminosyresekvenser ifølge SEKV ID NR: 51-61 og konservative modifikasjoner derav.
I forskjellige utførelsesformer kan antistoffet oppvise én eller flere, to eller flere, tre eller flere, fire eller flere, fem eller flere eller seks eller flere av de funksjonelle egenskapene listet opp som (d) til (j) ovenfor. Slike antistoffer kan for eksempel være humane antistoffer, humaniserte antistoffer eller kimære antistoffer.
Som anvendt her er betegnelsen “konservative sekvensmodifikasjoner” ment å referere til aminosyremodifikasjoner som ikke betydelig påvirker eller endrer bindingsegenskapene av antistoffet inneholdende aminosyresekvensen. Slike konservative modifikasjoner omfatter aminosyresubstitusjoner, addisjoner og delesjoner.
Modifikasjoner kan innføres i et antistoff ifølge oppfinnelsen ved standard teknikker kjent på området, slik som seterettet mutagenese og PCR-mediert mutagenese. Konservative aminosyresubstitusjoner er slike hvor aminosyreresten erstattes med en aminosyrerest som har en lignende sidekjede. Familier av aminosyrerester som har lignende sidekjeder er definert på området. Disse familiene omfatter aminosyrer med basiske sidekjeder (f. eks., lysin, arginin, histidin), sure sidekjeder (f. eks., asparaginsyre, glutaminsyre), uladede polare sidekjeder (f. eks., glysin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tyrosin, cystein, tryptofan), ikke-polare sidekjeder (f. eks., alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, metionin), beta-forgrenede sidekjeder (f. eks., treonin, valin, isoleucin) og aromatiske sidekjeder (f. eks., tyrosin, fenylalanin, tryptofan, histidin). Følgelig kan én eller flere aminosyrerester innenfor CDR-regionene av et antistoff ifølge oppfinnelsen erstattes med andre aminosyrerester fra samme familie av sidekjeder og det endrede antistoffet kan testes for beholdt funksjon (dvs. funksjonene angitt i (c) til (j) ovenfor) ved anvendelse av den funksjonelle analysen beskrevet heri.
Antistoffer som binder til samme epitop som anti-IP-10-antistoffer ifølge oppfinnelsen Antistoffer kan binde til samme epitop som de forskjellige anti-IP-10-antistoffene ifølge oppfinnelsen gitt heri, slik som andre humane antistoffer som binder til samme epitop som antistoffene 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S eller 13C4 beskrevet heri. Slike ytterligere antistoffer kan identifiseres basert på deres evne til å kryss konkurrere (f. eks., for å kompetitivt hemme binding av, på en statistisk signifikant måte) med andre antistoffer ifølge oppfinnelsen, slik som 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S eller 13C4, i standard IP-10-bindingsforsøk. Evnen for et testantistoff til å hemme bindingen av, f. eks., 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S eller 13C4 til humant IP-10 viser at testantistoffet kan konkurrere med dette antistoffet om binding til humant IP-10; et slikt antistoff kan, i henhold til ikke-begrensende teori, binde til samme eller en relatert (f. eks., et strukturelt lignende eller spatially proksimal) epitop på humant IP-10 som antistoffet med hvilket det konkurrerer. I en foretrukket utførelsesform er antistoffet som binder til samme epitop på humant IP-10 som 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S eller 13C4 et humant monoklonalt antistoff. Slike humane monoklonale antistoffer kan fremstilles og isoleres som beskrevet i eksemplene.
Konstruerte og modifiserte antistoffer
Et antistoff ifølge oppfinnelsen kan videre fremstilles ved anvendelse av et antistoff som har én eller flere av VHog/eller VL-sekvensene beskrevet her som utgangsmateriale for å konstruere et modifisert antistoff, hvilket modifiserte antistoff kan ha endrede egenskaper enn utgangsantistoffet. Et antistoff kan konstrueres ved å modifisere én eller flere rester innenfor én eller begge variable regioner (dvs. VHog/eller VL), for eksempel innenfor én eller flere CDR-regioner og/eller innenfor én eller flere struktur (framework”)-regioner. I tillegg eller alternativt kan et antistoff konstrueres ved å modifisere rester innenfor de(n) konstante regionen(e), for eksempel for å endre effektorfunksjonen(e) for antistoffet.
En type konstruksjon av variabel region som kan utføres er ”CDR-grafting”.
Antistoffer interagerer med målantigener overveiende gjennom aminosyrerester som er lokalisert i de seks tunge og lette kjede komplementaritetsbestemmende regionene (CDR’ene). På grunn av dette er aminosyresekvensene innenfor CDR’ene mer ulike mellom individuelle antistoffer enn sekvenser utenfor CDR’ene. Fordi CDR-sekvenser er ansvarlig for de fleste antistoff-antigen-interaksjoner, er det mulig å uttrykke rekombinante antistoffer som etterligner egenskapene til spesifikke naturlig forekommende antistoffer ved å konstruere ekspresjonsvektorer som omfatter CDR-sekvenser fra det spesifikke naturlig forekommende antistoffet bundet (”grafted”) til struktur (framework”)-sekvenser fra et ulikt antistoff med ulike egenskaper (se f. eks., Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A.86:10029-10033; U.S. patent nr.5,225,539 ved Winther og U.S. patenter nr.5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 og 6,180,370 ved Queen et al.)
Et isolert monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav, kan omfatte en tung kjede variabel region omfattende CDR1, CDR2 og CDR3-sekvenser omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR: 1-12, SEKV ID NR: 13-23 og SEKV ID NR: 24-34, henholdsvis og en lett kjede variabel region omfattende CDR1, CDR2 og CDR3-sekvenser omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR:51-61, SEKV ID NR: 62-72 og SEKV ID NR: 73-83, henholdsvis. Følgelig inneholder slike antistoffer VHog VLCDR-sekvensene av de monoklonale antistoffene 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S eller 13C4 men kan enda inneholde forskjellige struktur (framework”)-sekvenser fra disse antistoffene.
Slik struktur (framework”)-sekvenser kan oppnås fra offentlige DNA-databaser eller publiserte referanser som omfatter gensekvenser fra kjønnscelle antistoff. For eksempel kan kjønnscelle DNA-sekvenser for human tung og lett kjede variabel regiongener finnes i "VBase" human kjønnscelle sekvensdatabase (tilgjengelig på internett ved www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), så vel som i Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Femte Utgave, U.S. Department of Health and Human Services, NIH-publikasjon nr.91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VHSequences Reveals about Fifty Groups of VHSegments of Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol.227:776-798; og Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germline VHSegments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836; fra hvilke innholdet er uttrykkelig inntatt heri ved referanse.
Foretrukne struktur (framework”)-sekvenser for anvendelse i antistoffene ifølge oppfinnelsen er de som er strukturelt lik struktursekvensene anvendt ved selekterte antistoffer ifølge oppfinnelsen, f. eks., lik VH3-33, 3-30,3, 4-61 eller 5-51-sekvensene [SEKV ID NR:47-50] og/eller VkA27, L6, L18 eller L15 struktur (framework”)-sekvenser [SEKV ID NR:95-98] anvendt ved foretrukne monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen. VHCDR1, 2 og 3-sekvensene og VLCDR1, 2 og 3-sekvensene, kan bindes til struktur (framework”)-regioner som har identiske sekvenser som de funnet i immunglobulingenet fra kjønnsceller fra hvilken struktur (framework”)-sekvensen er avledet eller CDR-sekvensene kan bindes til struktur-regioner som inneholder én eller flere mutasjoner sammenlignet med kjønnscelle-sekvensene. For eksempel har det blitt funnet at det i visse tilfeller er fordelaktig å mutere rester innenfor struktur-regionene for å opprettholde eller forbedre den antigenbindende evnen av antistoffet (se f. eks., U.S. patenter nr.5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 og 6,180,370 ved Queen et al).
En annen type av variabel region-modifikasjon er å mutere aminosyrerester innenfor VHog/eller VLCDR1, CDR2 og/eller CDR3-regionene for derved å forbedre én eller flere bindingsegenskaper (f. eks., affinitet) av antistoffet av interesse. Seterettet mutagenese eller PCR-mediert mutagenese kan utføres for å innføre mutasjonen(er) og effekten på antistoffbinding eller annen funksjonell egenskap av interesse, kan evalueres i in vitro eller in vivo-analyser som beskrevet heri og gitt i eksemplene. Foretrukket innføres konservative modifikasjoner (som beskrevet ovenfor). Mutasjonene kan være aminosyresubstitusjoner, addisjoner eller delesjoner, men er fortrinnsvis substitusjoner. Videre endres typisk ikke mer enn én, to, tre, fire eller fem rester innenfor en CDR-region.
Isolerte anti-IP-10 monoklonale antistoffer eller antigenbindende deler derav, kan omfatte en tung kjede variabel region omfattende: (a) en VHCDR1-region omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR: 1-12 eller en aminosyresekvens som har én, to, tre, fire eller fem aminosyresubstitusjoner, delesjoner eller addisjoner sammenlignet med SEKV ID NR: 1-12; (b) en VHCDR2-region omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR: 13-23 eller en aminosyresekvens som har én, to, tre, fire eller fem aminosyresubstitusjoner, delesjoner eller addisjoner sammenlignet med SEKV ID NR: 13-23; (c) en VHCDR3-region omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR: 24-34 eller en aminosyresekvens som har én, to, tre, fire eller fem aminosyresubstitusjoner, delesjoner eller addisjoner sammenlignet med SEKV ID NR: 24-34; (d) en VLCDR1-region omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR: 51-61 eller en aminosyresekvens som har én, to, tre, fire eller fem aminosyresubstitusjoner, delesjoner eller addisjoner sammenlignet med SEKV ID NR: 51-61; (e) en VLCDR2-region omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR: 62-72 eller en aminosyresekvens som har én, to, tre, fire eller fem aminosyresubstitusjoner, delesjoner eller addisjoner sammenlignet med SEKV ID NR: 62-72; og (f) en VLCDR3-region omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR: 73-83 eller en aminosyresekvens som har én, to, tre, fire eller fem aminosyresubstitusjoner, delesjoner eller addisjoner sammenlignet med SEKV ID NR: 73-83.
En foretrukket substitusjonsmutasjon er substitusjonen av en cysteinrest med serinrest i posisjon 32, innenfor CDR1, av VH-kjeden av 10A12 mAb. Denne modifiserte formen av 10A12 refereres til her som 10A12S. Aminosyresekvensen av VH-kjeden av 10A12 er vist i SEKV ID NR: 44 og aminosyresekvensen av VH-kjeden av 10A12S er vist i SEKV ID NR: 45.
Konstruerte antistoffer omfatter de hvor modifikasjoner har blitt utført på struktur (framework”)-restene innenfor VHog/eller VL, f. eks. for å forbedre egenskapene til antistoffet. Slike struktur (framework”)-modifikasjoner utføres typisk for å redusere immunogenisiteten av antistoffet. For eksempel er en metode å “tilbakemutere” én eller flere struktur (framework”)-rester til den tilsvarende kjønnscellesekvensen. Nærmere bestemt kan et antistoff som har gjennomgått somatisk mutasjon inneholde struktur-rester som skiller seg fra kjønnscellesekvensen som antistoffet er avledet av. Slike rester kan identifiseres ved å sammenligne antistoff struktur (framework”)-sekvensene med kjønnscellesekvensene som antistoffet er avledet fra. For eksempel i 6A5 er aminosyrerest nr. 2 (innenfor FR1) av VHet metionin mens denne resten i den tilsvarende VH3-33 kjønnscellesekvensen er et valin (se Figur 12). For å bringe tilbake strukturregionsekvensene til deres kjønnscelle-konfigurasjon, kan de somatiske mutasjonene “tilbakemuteres” til kjønnscellesekvensen ved, for eksempel seterettet mutagenese eller PCR-mediert mutagenese (f. eks., kan rest 2 av VHav 6A5 “tilbakemuteres” fra metionin til valin). Slike “tilbakemuterte” antistoffer er også ment å være omfattet av oppfinnelsen.
En annen type struktur (framework”)-modifikasjon omfatter å mutere én eller flere rester innenfor struktur-regionen eller til og med innenfor én eller flere CDR-regioner, for å fjerne T-celle-epitoper for derved å redusere potensiell immunogenisitet av antistoffet. Denne metoden refereres også til som “deimmunisering” og er beskrevet i ytterligere detaljer i U.S. patent publikasjon nr.20030153043 ved Carr et al.
I tillegg eller alternativt til modifikasjoner utført innenfor struktur (framework”) eller CDR-regionene, kan antistoffer ifølge oppfinnelsen konstrueres til å omfatte modifikasjoner innenfor Fc-regionen, typisk for å endre én eller flere funksjonelle egenskaper av antistoffet, slik som halveringstid i serum, komplementbinding, Fc reseptorbinding og/eller antigenavhengig cellulær cytotoksisitet. Videre kan et antistoff ifølge oppfinnelsen modifiseres kjemisk (f. eks., én eller flere kjemiske grupper kan bindes til antistoffet) eller modifiseres for å endre dets glykosylering, igjen for å endre én eller flere funksjonelle egenskaper av antistoffet. Hver av disse utførelsesformene er beskrevet mer detaljert nedenfor. Nummereringen av rester i Fc-regionen er den ifølge EU-indeksen ifølge Kabat.
I én utførelsesform modifiseres hengselsregionen av CH1 slik at antall cysteinrester i hengselsregionen endres, f. eks., økes eller reduseres. Denne metoden er ytterligere beskrevet i U.S. patent nr.5,677,425 ved Bodmer et al. Antall cysteinrester i hengselsregionen av CH1 endres for å, for eksempel lette sammensetting av de lette og tunge kjedene eller for å øke eller redusere stabiliteten av antistoffet.
I en annen utførelsesform muteres Fc hengselsregionen av et antistoff for å redusere den biologiske halveringstiden av antistoffet. Nærmere bestemt innføres én eller flere aminosyremutasjoner i CH2-CH3-domene grenseflateregionen av Fc-hengselsfragmentet slik at antistoffet har svekket Staphylococcyl protein A (SpA)-binding relativt til nativt Fchengsel domene SpA-binding. Denne metoden er beskrevet mer detaljert i U.S. patent nr.
6,165,745 ved Ward et al.
I en annen utførelsesform modifiseres antistoffet for å øke dets biologiske halveringstid. Forskjellige metoder er mulig. For eksempel kan én eller flere av de følgende mutasjonene innføres: T252L, T254S, T256F, som beskrevet i U.S. patent nr. 6,277,375 ved Ward. Alternativt kan, for å øke den biologiske halveringstiden, antistoffet endres innenfor CH1 eller CL-regionen til å inneholde en ”rednings” (”salvage”) reseptorbindingsepitop tatt fra to løkker av et CH2-domene av en Fc-region av en IgG, som beskrevet i U.S. patent nr.5,869,046 og 6,121,022 ved Presta et al.
I enda andre utførelsesformer endres Fc-regionen ved å erstatte minst én aminosyrerest med en ulik aminosyrerest for å endre effektorfunksjonen(e) av antistoffet. For eksempel kan én eller flere aminosyrer valgt fra aminosyrerestene 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 og 322 erstattes med en ulik aminosyrerest slik at antistoffet har en endret affinitet for en effektor ligand men beholder den antigenbindende evnen til opphavsantistoffet. Effektor liganden til hvilken affinitet er endret kan for eksempel være en Fcreseptor eller C1-komponenten av komplement. Denne metoden er beskrevet mer detaljert i U.S. patent nr.5,624,821 og 5,648,260, begge ved Winter et al.
I et annet eksempel kan én eller flere aminosyrer valgt fra aminosyrerestene 329, 331 og 322 erstattes med en ulik aminosyrerest slik at antistoffet har endret C1q-binding og/eller redusert eller opphevet komplementavhengig cytotoksisitet (CDC). Denne metoden er beskrevet mer detaljert i U.S. patent nr.6,194,551 ved Idusogie et al.
I et annet eksempel endres én eller flere aminosyrerester innenfor aminosyreposisjonene 231 og 239 for derved å endre antistoffets evne til å binde komplement. Denne metoden er ytterligere beskrevet i PCT-publikasjon WO 94/29351 ved Bodmer et al.
I enda et annet eksempel modifiseres Fc-regionen for å øke antistoffets evne til mediere antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) og/eller for å øke antistoffets affinitet for en Fc γ-reseptor ved modifikasjon av én eller flere aminosyrer ved de følgende posisjonene: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 eller 439. Denne metoden er ytterligere beskrevet i PCT-publikasjon WO 00/42072 ved Presta. Videre har bindingssetene på human IgG1 for Fc γR1, Fc γRII, Fc γRIII og FcRn blitt kartlagt og varianter med forbedret binding er beskrevet (se Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem.
276:6591-6604). Spesifikke mutasjoner i posisjonene 256, 290, 298, 333, 334 og 339 ble vist å forbedre binding til Fc γRIII. I tillegg ble de følgende kombinasjonene av mutasjoner vist å forbedre Fc γRIII-binding: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A og S298A/E333A/K334A.
I enda en annen utførelsesform modifiseres glykosyleringen av et antistoff. For eksempel kan et uglykosylert antistoff fremstilles (dvs. antistoffet mangler glykosylering). Glykosylering kan endres for å, for eksempel øke affiniteten til antistoffet for antigen. Slike karbohydratmodifikasjoner kan oppnås ved, for eksempel å endre ett eller flere glykosyleringsseter innenfor antistoffsekvensen. For eksempel kan det foretas én eller flere aminosyresubstitusjoner som resulterer i fjerning av ett eller flere glykosyleringsseter i variabel region struktur (framework”) for derved å fjerne glykosylering ved dette setet. Slik avglykosylering kan øke affiniteten til antistoffet for antigen. En slik metode er beskrevet mer detaljert i U.S. patenter nr.5,714,350 og 6,350,861 ved Co et al.
I tillegg eller alternativt kan det fremstilles et antistoff som har en endret type glykosylering, slik som et hypofucosylert antistoff som har reduserte mengder av fucosylrester eller et antistoff som har øket delte GlcNac-strukturer. Slike endrede glykosyleringmønstre har blitt vist å øke ADCC evnen for antistoffer. Slike karbohydratmodifikasjoner kan oppnås ved, for eksempel å uttrykke antistoffet i en vertscelle med endret maskineri for glykosylering. Celler med endret maskineri for glykosylering er beskrevet på området og kan anvendes som vertsceller i hvilke det kan uttrykkes rekombinante antistoffer ifølge oppfinnelsen for derved å produsere et antistoff med endret glykosylering. For eksempel beskriver EP 1,176,195 ved Hanai et al. en cellelinje med et funksjonelt avbrutt FUT8-gen, som koder for en fucosyl transferase, slik at antistoffer uttrykt i en slik cellelinje oppviser hypofucosylering. PCT-publikasjon WO 03/035835 ved Presta beskriver en variant CHO-cellelinje, Lec13 celler, med redusert evne til å binde fucose til Asn(297)-bundne karbohydrater, hvilket også resulterer i hypofucosylering av antistoffer uttrykt i denne vertscellen (se også Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem.277:26733-26740). PCT-publikasjon WO 99/54342 ved Umana et al. beskriver cellelinjer konstruert til å uttrykke glykoprotein-modifiserende glykosyl transferaser (f. eks., beta(1,4)-N-acetylglucosaminyltransferase III (GnTIII)) slik at antistoffer uttrykt i de konstruerte cellelinjene oppviser øket delte GlcNac-strukturer som resulterer i øket ADCC-aktivitet av antistoffene (se også Umana et al. (1999) Nat. Biotech.
17:176-180).
En annen modifikasjon av antistoffene heri som er omfattet av oppfinnelsen er pegylering. Et antistoff kan pegyleres for å, for eksempel øke den biologiske halveringstiden (f. eks., i serum) av antistoffet. For å pegylere et antistoff, blir antistoffet eller fragment derav, typisk reagert med polyetylenglykol (PEG), for eksempel en reaktiv ester eller aldehydderivat av PEG, under betingelser hvor én eller flere PEG-grupper blir bundet til antistoffet eller antistoffragmentet. Foretrukket utføres pegyleringen via en acyleringsreaksjon eller en alkyleringsreaksjon med et reaktivt PEG-molekyl (eller en analog reaktiv vannløselig polymer). Som anvendt heri er betegnelsen “polyetylenglykol” ment å omfatte hvilke som helst av formene av PEG som har blitt anvendt for å derivatisere andre proteiner, slik som mono-(C1-C10)-alkoksy- eller aryloksypolyetylenglykol eller polyetylenglykol-maleimid. I visse utførelsesformer er antistoffet som skal pegyleres et uglykosylert antistoff. Metoder for pegylering av proteiner er kjent på området og kan anvendes til antistoffene ifølge oppfinnelsen. Se for eksempel EP 0154 316 ved Nishimura et al. og EP 0401 384 ved Ishikawa et al.
Metoder for konstruksjon av antistoffer
Som beskrevet ovenfor kan anti-IP-10-antistoffene som har VHog VL-sekvenser beskrevet heri anvendes for å fremstille nye anti-IP-10-antistoffer ved modifikasjon av VH og/eller VL-sekvensene eller konstant region(er) tilknyttet dertil. De strukturelle trekkene av et anti-IP-10 antistoff kan anvendes, f. eks.1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S eller 13C4, for å fremstille strukturelt relaterte anti-IP-10-antistoffer som beholder minst én funksjonell egenskap til antistoffene ifølge oppfinnelsen, slik som binding til human IP-10 og rhesusape IP-10, men ikke til mus IP-10 eller human MIG eller human ITAC og også hemme én eller flere funksjonelle egenskaper til IP-10 (f. eks., CXCR3-binding, kalsiumstrøm, kjemotaksi). For eksempel kan én eller flere CDR-regioner av 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S eller 13C4 eller mutasjoner derav, kombineres rekombinant med kjente struktur (framework”)-regioner og/eller andre CDR’er for å fremstille ytterligere, rekombinant konstruerte, anti-IP-10-antistoffer ifølge oppfinnelsen, som beskrevet ovenfor. Andre typer modifikasjoner omfatter de beskrevet i det foregående avsnittet. Utgangsmaterialet for konstruksjonsmetoden er én eller flere av VHog/eller VL-sekvensene tilveiebrakt heri eller én eller flere CDR-regioner derav. For å fremstille det konstruerte antistoffet er det ikke nødvendig å faktisk fremstille (dvs. uttrykke som et protein) et antistoff som har én eller flere av VHog/eller VL-sekvensene gitt her eller én eller flere CDR-regioner derav.
Informasjonen inneholdt i sekvensen(e) anvendes heller som utgangsmateriale for å fremstille en “andregenerasjon” sekvens(er) avledet fra den opprinnelige sekvens(e) og deretter blir “andregenerasjon”-sekvensen(e) prosessert og uttrykt som et protein.
Standard molekylærbiologiske teknikker kan anvendes for å fremstille og uttrykke den endrede antistoffsekvensen.
Foretrukket er antistoffet kodet for av den endrede antistoffsekvensen(e) ett som beholder én, noen eller alle de funksjonelle egenskapene til anti-IP-10-antistoffene beskrevet her, hvilke funksjonelle egenskaper omfatter, men er ikke begrenset til:
(i) binder spesifikt til human IP-10;
(ii) hemmer binding av IP-10 til CXCR3;
(iii) hemmer IP-10-indusert kalsiumstrøm;
(iv) hemmer IP-10-indusert cellemigrering;
(v) kryssreagerer med rhesusape IP-10;
(vi) kryssreagerer ikke med mus IP-10;
(vii) kryssreagerer ikke med human MIG; og
(viii) kryssreagerer ikke med human ITAC.
Det endrede antistoffet kan oppvise én eller flere, to eller flere, tre eller flere, fire eller flere, fem eller flere, seks eller flere eller syv eller flere av de funksjonelle egenskapene angitt som (i) til (viii) ovenfor.
De funksjonelle egenskapene til de endrede antistoffene kan vurderes ved anvendelse av standardanalyser tilgjengelige på området og/eller beskrevet her, slik som de angitt i eksemplene (f. eks., ELISA, analyser av kalsiumstrømmen, kjemotaksi-analyser).
I visse utførelsesformer av fremgangsmåtene for konstruksjon av antistoffer ifølge oppfinnelsen, kan mutasjoner innføres tilfeldig eller selektivt langs hele eller del av en anti-IP-10 antistoffkodende sekvens og de resulterende modifiserte anti-IP-10-antistoffene kan screenes for bindingsaktivitet og/eller andre funksjonelle egenskaper som beskrevet her. Mutasjonsmetoder er beskrevet på området. For eksempel beskriver PCT-publikasjon WO 02/092780 ved Short metoder for fremstilling og screening av antistoffmutasjoner ved anvendelse av metnings mutagenese (”saturation mutagenesis”), ”synthetic ligation assembly” eller en kombinasjon derav. Alternativt beskriver PCT-publikasjon WO 03/074679 ved Lazar et al. metoder for anvendelse av data-screeningsmetoder for å optimalisere fysiokjemiske egenskaper for antistoffer.
Nukleinsyremolekyler som koder for antistoffer ifølge oppfinnelsen
Nukleinsyrene kan være til stede i hele celler, i et cellelysat eller i en delvis renset eller hovedsakelig ren form. En nukleinsyre er "isolert" eller "gjort hovedsakelig ren" når den er renset vekk fra andre cellulære komponenter eller andre forurensninger, f. eks., andre cellulære nukleinsyrer eller proteiner, ved standard teknikker, omfattende alkalisk/SDS-behandling, CsCl banding, kolonnekromatografi, agarosegelelektroforese og andre velkjent på området. Se, F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York. En nukleinsyre ifølge oppfinnelsen kan for eksempel være DNA eller RNA og kan, eller ikke, inneholde intronsekvenser. I en foretrukket utførelsesform er nukleinsyren et cDNA-molekyl.
Nukleinsyrer kan oppnås ved anvendelse av standard molekylærbiologiske teknikker. For antistoffer uttrykt av hybridomer (f. eks., hybridomer fremstilt fra transgene mus som bærer humane immunglobulingener som beskrevet ytterligere nedenfor), kan cDNA’er som koder for de lette og tunge kjedene av antistoffet fremstilt av hybridomet oppnås ved standard PCR-amplifisering eller cDNA-kloningsteknikker. For antistoffer oppnådd fra et immunglobulin-genbibliotek (f. eks., ved anvendelse av fagdisplayteknikker), kan nukleinsyre som koder for antistoffet utvinnes fra biblioteket.
Foretrukne nukleinsyremolekyler ifølge oppfinnelsen er de som koder for VH og VL-sekvensene av de monoklonale antistoffene 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 eller 13C4. DNA-sekvenser som koder for VH-sekvensene av 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 og 13C4 er vist i SEKV ID NR: 99-109, henholdsvis. DNA-sekvenser som koder for VL-sekvensene av 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 og 13C4 er vist i SEKV ID NR: 110-120, henholdsvis.
Når DNA-fragmenter som koder for VH og VL-segmenter først er oppnådd, kan disse DNA-fragmentene manipuleres ytterligere ved standard rekombinant DNA-teknikker, for eksempel for å omdanne variabel region-genene til fullengde antistoffkjedegener, til gener for Fab-fragment eller til et scFv-gen. I disse manipulasjonene, bindes et VL- eller VH-kodende DNA-fragment operativt til et annet DNA-fragment som koder for en annet protein, slik som en antistoff konstant region eller en fleksibel linker. Betegnelsen "operativt bundet", som anvendt i denne sammenhengen, skal bety at de to DNA-fragmentene bindes slik at aminosyresekvensene kodet for av de to DNA-fragmentene forblir i leseramme.
Det isolerte DNA som koder for VH-regionen kan omdannes til et fullengde tung kjede-gen ved å operativt binde det VH-kodende DNA til et annet DNA-molekyl som koder for tung kjede konstante regioner (CH1, CH2 og CH3). Sekvensene av human tung kjede konstant region-genene er kjent på området (se f. eks., Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Femte Utgave, U.S. Department of Health and Human Services, NIH-publikasjon nr.91-3242) og DNA-fragmenter omfattende disse regionene kan oppnås ved standard PCR-amplifisering. Den tunge kjede konstante regionen kan være en IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM eller IgD konstant region, men er mest foretrukket en IgG1 eller IgG4 konstant region. For et Fab-fragment tung kjede-gen, kan det VH-kodende DNA bindes operativt til et annet DNA-molekyl som koder for kun tung kjede CH1 konstant region.
Det isolerte DNA som koder for VL-regionen kan omformes til et fullengde lett kjede-gen (så vel som et Fab lett kjede-gen) ved å operativt binde det VL-kodende DNA til et annet DNA-molekyl som koder for lett kjede konstant region, CL. Sekvensene av human lett kjede konstant region-genene er kjent på området (se f. eks., Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Femte Utgave, U.S. Department of Health and Human Services, NIH-publikasjon nr.91-3242) og DNA-fragmenter omfattende disse regionene kan oppnås ved standard PCR-amplifisering. Den lette kjede konstante regionen kan være en kappa eller lambda konstant region, men er mest foretrukket en kappa konstant region.
For å fremstille et scFv-gen, blir de VH- og VL-kodende DNA-fragmentene operativt bundet til et annet fragment som koder for en fleksibel linker, f. eks., som koder for aminosyresekvensen (Gly4-Ser)3, slik at VH og VL-sekvensene kan uttrykkes som et sammenhengende enkeltjede-protein, hvor VL og VH-regionene er bundet ved den fleksible linkeren (se f. eks., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554).
Fremstilling av monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen
Monoklonale antistoffer (mAbs) ifølge foreliggende oppfinnelse kan produseres ved en rekke teknikker, omfattende konvensjonell monoklonal antistoff-metodikk f. eks., den standard somatisk celle hybridiseringsteknikken ifølge Kohler og Milstein (1975) Nature 256: 495. Selv om somatisk celle-hybridiseringsmetoder er foretrukket, kan i prinsippet andre teknikker for å produsere monoklonalt antistoff anvendes f. eks., viral eller oncogen transformasjon av B-lymfocytter.
Det foretrukne dyresystemet for fremstilling av hybridomer er det murine systemet. Hybridomproduksjon i mus er en svært veletablert metode. Immuniseringsprotokoller og teknikker for isolering av immuniserte splenocytter for fusjon er kjent på området.
Fusjonspartnere (f. eks., murine myelomceller) og fremgangsmåter for fusjon er også kjent.
Kimære eller humaniserte antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles basert på sekvensen av et murint monoklonalt antistoff fremstilt som beskrevet ovenfor. DNA som koder for tung og lett kjede immunglobuliner kan oppnås fra det murine hybridomet av interesse og utformes til å inneholde ikke-murine (f. eks. humane) immunglobulinsekvenser ved anvendelse av standard molekylærbiologiske teknikker. For å fremstille et kimært antistoff, for eksempel, kan de murine variable regionene bindes til humane konstante regioner ved anvendelse av metoder kjent på området (se f. eks., U.S. patent nr.4,816,567 ved Cabilly et al.). For å fremstille et humanisert antistoff, kan de murine CDR-regionene inserteres inn i en human struktur (framework”) ved anvendelse av metoder kjent på området (se f. eks., U.S. patent nr.5,225,539 ved Winter og U.S. patenter nr. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 og 6,180,370 ved Queen et al.).
I en foretrukket utførelsesform er antistoffene ifølge oppfinnelsen humane monoklonale antistoffer. Slike humane monoklonale antistoffer rettet mot IP-10 kan fremstilles ved anvendelse av transgen eller transchromosom mus som bærer deler av det humane immunsystemet heller enn musesystemet. Disse transgene og transchromosomic musene omfatter mus referert til heri som HuMAb-mus og KM-mus, henholdsvis og refereres samlet til heri som “human Ig-mus.”
HuMAb mouse® (Medarex, Inc.) inneholder humane immunglobulingen miniloki som koder for ikke rearrangerte human tung ( μ og γ) og к lett kjede immunglobulinsekvenser, sammen med målrettede mutasjoner som inaktiverer de endogene μ og к kjede-loki (se f. eks., Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). Følgelig fremviser musen redusert ekspresjon av mus-IgM eller к og som respons på immunisering, gjennomgår de innførte humane tung og lett kjede transgenene klasseswitching og somatisk mutasjon for å frembringe høyaffinitets human IgG к monoklonale antistoffer (Lonberg, N. et al. (1994), supra; gjennomgått i Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. og Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol.13: 65-93 og Harding, F. og Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci.764:536-546). Fremstillingen og anvendelsen av HuMab mus og genomiske modifikasjoner båret av slike mus, er ytterligere beskrevet i Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J.12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol.152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; og Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, fra hvilke innholdet herved er spesifikt inntatt ved referanse i sin helhet. Se videre U.S. patenter nr.
5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; og 5,770,429; alle ved Lonberg og Kay; U.S. patent nr.5,545,807 ved Surani et al.; PCT-publikasjoner nr. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 og WO 99/45962, alle ved Lonberg og Kay; og PCT-publikasjon nr. WO 01/14424 ved Korman et al.
I en annen utførelsesform kan humane antistoffer ifølge oppfinnelsen frembringes ved anvendelse av en mus som bærer human immunoglobulin sekvenser i transgener og transchomosomer, slik som en mus som bærer et humant tung kjede transgen og et humant lett kjede transchromosom. Slik mus, referert til her som “KM mus”, er beskrevet i detalj i PCT Publikasjon WO 02/43478 til Ishida et al.
Videre er alternative transgene dyresystemer som uttrykker humane immunoglobulingener tilgjengelige på området og kan anvendes for å frembringe anti-IP-10 antistoffer ifølge oppfinnelsen. For eksempel et alternativt transgensystem referert til som the Xenomouse (Abgenix, Inc.) kan anvendes; slik mus er beskrevet i, for eksempel U.S. patenter nr.5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 og 6,162,963 til Kucherlapati et al.
Videre er alternative transchromosom dyresystemer som uttrykker humane immunoglobulingener tilgjengelige på området og kan anvendes for å frembringe anti-IP-10-antistoffer ifølge oppfinnelsen. For eksempel kan mus som bærer både et humant tung kjede transchromosom og et humant lett kjede tranchromosom, referert til som “TC-mus” anvendes; slike mus er beskrevet i Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Videre er kuer som bærer humane tung og lett kjede transchromosomer beskrevet på området (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) og kan anvendes for å frembringe anti-IP-10-antistoffer ifølge oppfinnelsen.
Humane monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen kan også fremstilles ved anvendelse av fagdisplaymetoder for screening av biblioteker av humane immunglobulingener. Slike fagdisplay-metoder for å isolere humane antistoffer er etablert på området. Se for eksempel: U.S. patenter nr.5,223,409; 5,403,484; og 5,571,698 ved Ladner et al.; U.S. patenter nr.5,427,908 og 5,580,717 ved Dower et al.; U.S. patenter nr.
5,969,108 og 6,172,197 ved McCafferty et al.; og U.S. patenter nr.5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 og 6,593,081 ved Griffiths et al.
Humane monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen kan også fremstilles ved anvendelse av SCID-mus inn i hvilke humane immunceller er rekonstituert slik at en human antistoffrespons kan frembringes ved immunisering. Slike mus er beskrevet i, for eksempel U.S. patenter nr.5,476,996 og 5,698,767 ved Wilson et al.
Immunisering av humane Ig-mus
Når humane Ig-mus anvendes for å frembringe humane antistoffer ifølge oppfinnelsen, kan slike mus immuniseres med et renset eller en anriket fremstilling av IP-10-antigen og/eller rekombinant IP-10 eller et IP-10-fusjonsprotein, som beskrevet av Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; og PCT-publikasjoner WO 98/24884 og WO 01/14424.
Foretrukket vil musene være 6-16 uker gamle ved den første infusjonen. For eksempel kan et renset eller rekombinant preparat (5-50 µg) av IP-10 antigen anvendes for å immunisere den humane Ig-musen intraperitonealt.
Detaljerte fremgangsmåter for å fremstille fullstendige humane monoklonale antistoffer mot IP-10 er beskrevet i Eksempel 1 nedenfor. Samlet erfaring med forskjellige antigener har vist at de transgene musene responderer når de initielt immuniseres intraperitonealt (IP) med antigen i complete Freund's adjuvans, fulgt IP-immuniseringer annenhver uke (opptil totalt 6) med antigen i incomplete Freund's adjuvans. Imidlertid er adjuvantia forskjellig fra Freund's også funnet å være effektive. I tillegg er hele celler i fravær av adjuvans funnet å være svært immunogene. Immunresponsen kan overvåkes under immunisering protokoll hvor plasmaprøver oppnås ved retroorbitale tappinger. Plasmaet kan screenes ved ELISA (som beskrevet nedenfor) og mus med tilstrekkelig titere av anti-IP-10 humant immunglobulin kan anvendes for fusjoner. Mus kan boostes intravenøst med antigen 3 dager før avlivning og fjerning av milten. Det er forventet at det kan være nødvendig å gjennomføre 2-3 fusjoner for hver immunisering. Mellom 6 og 24 mus blir typisk immunisert for hvert antigen. Vanligvis anvendes både HCo7 og HCo12-stammer. I tillegg kan både HCo7 og HCo12-transgen frembringes sammen i en enkelt mus som har to forskjellige humane tung kjede-transgener (HCo7/HCo12).
Fremstilling av hybridomer som produserer humane monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen
For å frembringe hybridomer som produserer humane monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen, kan splenocytter og/eller lymfeknuteceller fra immuniserte mus isoleres og fusjoneres til en passende immortalisert cellelinje, slik som en mus myelomcellelinje. De resulterende hybridomene kan screenes for produksjon av antigen-spesifikke antistoffer. For eksempel kan enkeltcellesuspensjoner av milt lymfocytter fra immuniserte mus fusjoneres til en sjettedel av antallet P3X63-Ag8,653 ikke-sekreterende mus myelomceller (ATCC, CRL 1580) med 50% PEG. Celler plates ut ved omtrent 2 x 10<5>i flatbunnet mikrotiterplate, etterfulgt av to ukers inkubering i selektivt medium inneholdende 20% føtalt Clone Serum, 18% "653" kondisjonert medium, 5% origen (IGEN), 4 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 5mM HEPES, 0,055 mM
2-merkaptoetanol, 50 enheter/ml penicillin, 50 mg/ml streptomycin, 50 mg/ml gentamycin og 1X HAT (Sigma; HAT tilsettes 24 timer etter fusjonen). Etter omtrent to uker kan celler dyrkes i medium hvor HAT erstattes med HT. Individuelle brønner kan deretter screenes ved ELISA for humane monoklonale IgM og IgG-antistoffer. Når omfattende vekst av hybridom forekommer, kan medium observeres vanligvis etter 10-14 dager. De antistoffutskillende hybridomene kan plates ut pånytt, screenes igjen og dersom de fortsatt er positive for human IgG, kan de monoklonale antistoffene subklones minst to ganger ved ”begrensende fortynning”. De stabile subklonene kan deretter dyrkes in vitro for å danne små mengder av antistoff i vevskulturmedium for karakterisering.
For å rense humane monoklonale antistoffer, kan selekterte hybridomer dyrkes i toliter spinner-kolber for rensing av monoklonalt antistoff. Supernatanter kan filtreres og konsentreres før affinitetskromatografi med protein A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Eluert IgG kan kontrolleres ved gelelektroforese og høytrykks-væskekromatografi for å sikre renhet. Bufferløsningen kan erstattes med PBS og konsentrasjonen kan bestemmes ved OD280 ved anvendelse av 1,43 ekstinksjonskoeffisient. De monoklonale antistoffene kan deles inn i alikvoter og lagres ved -80 ̊ C.
Fremstilling av transfectoma som produserer monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen
Antistoffer ifølge oppfinnelsen kan også produseres i et vertscelle transfectoma ved anvendelse av, for eksempel en kombinasjon av rekombinant DNA-teknikker og gentransfeksjonsmetoder som er velkjente på området (f. eks., Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
For å uttrykke antistoffene eller antistoffragmenter derav, for eksempel, kan DNA’er som koder for partielle eller fullengde lette og tunge kjeder oppnås ved standard molekylærbiologiske teknikker (f. eks., PCR-amplifisering eller cDNA-kloning ved anvendelse av et hybridom som uttrykker antistoffet av interesse) og DNA-ene kan inserteres i ekspresjonsvektorer slik at genene er operativt bundet til transkripsjonelle og translasjonelle kontrollsekvenser. I denne sammenhengen er betegnelsen "operativt bundet" ment å bety at et antistoffgen er ligert inn i en vektor slik at transkripsjonelle og translasjonelle kontrollsekvenser i vektoren tjener sine tilsiktede funksjoner med å regulere transkripsjonen og translasjonen av antistoffgenet. Ekspresjonsvektoren og ekspresjonskontrollsekvensene velges slik at de er kompatible med den anvendte ekspresjonsvertcellen. Antistoff lett kjede-genet og antistoff tung kjede-genet kan inserteres i separat vektor eller, mer typisk, inserteres begge genene i samme ekspresjonsvektor. Antistoff-genene inserteres inn i ekspresjonsvektoren ved standardmetoder (f. eks., ligering av komplementære restriksjonsseter i antistoffet genfragmentet og vektoren eller butt-ende-ligering hvis ingen restriksjonsseter er til stede). De lette og tunge kjede variable regionene av antistoffene beskrevet her kan anvendes for å frembringe fullengde antistoffgener av hvilken som helst antistoff-isotype ved å insertere dem inn i ekspresjonsvektorer som allerede koder for tung kjede konstante og lett kjede konstante regioner av den ønskede isotypen slik at VH-segmenter er operativt bundet til CH-segment(er) i vektoren og VL-segmenter er operativt bundet til CL-segmentet i vektoren. I tillegg eller alternativt kan den rekombinante ekspresjonsvektoren kode for et signalpeptid som letter sekresjon av antistoffkjeden fra en vertscelle. Genet som koder for antistoffkjeden kan klones inn i vektoren slik at signalpeptidet er bundet i leseramme til den aminoterminale enden av genet som koder for antistoffkjeden. Signalpeptidet kan være et immunglobulin-signalpeptid eller et heterologt signalpeptid (dvs. et signalpeptid fra et ikke-immunglobulinprotein).
I tillegg til antistoffkjede-genene, inneholder de rekombinante ekspresjonsvektorene ifølge oppfinnelsen regulatorsekvenser som kontrollerer ekspresjon av antistoffkjede-genene i en vertscelle. Betegnelsen "regulatorsekvens" skal omfatte promotere, enhancere og andre ekspresjonskontrollelementer (f. eks., polyadenyleringssignaler) som kontrollerer transkripsjonen eller translasjonen av antistoffkjede-genene. Slike regulatorsekvenser er beskrevet, for eksempel i Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Det vil forstås av fagfolk på området at utformingen av ekspresjonsvektoren, omfattende valg av regulatoriske sekvenser, kan avhenge av slike faktorer som valg av vertscellen som skal transformeres, nivået av ekspresjon av ønsket protein, osv.
Foretrukne reguleringssekvenser for ekspresjon i pattedyr-vertscelle omfatter virale elementer som styrer høye nivåer av proteinekspresjon i pattedyrceller, slik som promotere og/eller enhancere avledet fra cytomegalovirus (CMV), Simian Virus 40 (SV40), adenovirus, (f. eks., adenovirus major late promoter (AdMLP) og polyoma. Alternativt kan ikke-virale reguleringssekvenser anvendes, slik som ubiquitin-promoteren eller β-globinpromoteren. Videre regulatoriske elementer sammensatt av sekvenser fra forskjellige kilder, slik som SR α promotersystemet, som inneholder sekvenser fra SV40 tidlig promoter og den lange terminale repetisjonen fra human T-celle leukemi virus type 1 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol.8:466-472).
I tillegg til genene som koder for antistoffkjeden og regulatorsekvenser, kan de rekombinante ekspresjonsvektorene ifølge oppfinnelsen omfatte ytterligere sekvenser, slik som sekvenser som regulerer replikasjon av vektoren i vertsceller (f. eks.
replikasjonsorigo) og selekterbare markørgener. Genet som koder for selekterbar markør letter seleksjon av vertsceller som vektoren er innført i (se, f. eks., U.S. patenter nr.
4,399,216, 4,634,665 og 5,179,017, alle ved Axel et al.). For eksempel gir det selekterbare markørgenet resistens mot medikamenter, slik som G418, hygromycin eller metotrexat, for en vertscelle inn i hvilken vektoren er innført. Foretrukne selekterbare markørgener omfatter dihydrofolat reduktase (DHFR)-genet (for anvendelse i dhfr- vertsceller med metotrexat seleksjon/amplifisering) og neo-genet (for G418-seleksjon).
For ekspresjon av lette og tunge kjeder transfekteres ekspresjonsvektoren(e) som koder for de lette og tunge kjedene inn i en vertscelle ved standard teknikker. De forskjellige formene av betegnelsen "transfeksjon" skal omfatte en rekke teknikker vanlig anvendt for innføring av eksogent DNA inn i en prokaryot eller eukaryot vertscelle, f. eks., elektroporering, kalsium-fosfat presipitering, DEAE-dekstran transfeksjon og lignende. Selv om det er teoretisk mulig å uttrykke antistoffene ifølge oppfinnelsen i både prokaryote og eukaryote vertsceller, er ekspresjon av antistoffer i eukaryote celler og mest foretrukket pattedyr-vertsceller, mest foretrukket fordi det er mer sannsynlig at eukaryote celler og spesielt pattedyrceller setter sammen og utskiller et korrekt foldet og immunologisk aktivt antistoff, sammenlignet med prokaryote celler. Prokaryot ekspresjon av antistoffgener er angitt å være ineffektiv for produksjon av høye utbytter av aktivt antistoff (Boss, M. A. og Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).
Foretrukne mammalske vertsceller for ekspresjon av de rekombinante antistoffene ifølge oppfinnelsen omfatter ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO-celler) (omfattende dhfr- CHO-celler, beskrevet i Urlaub og Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, anvendt med en DHFR selekterbar markør, f. eks., som beskrevet i R. J. Kaufman og P. A. Sharp (1982) Mol. Biol.159:601-621), NSO myelomceller, COS-celler og SP2-celler. Spesielt er, for anvendelse med NSO myelomceller, et annet foretrukket ekspresjonssystem GS-genekspresjonssystemet beskrevet i WO 87/04462, WO 89/01036 og EP 338,841. Når rekombinante ekspresjonsvektorer som koder for antistoffgener innføres i mammalske vertsceller, produseres antistoffene ved å dyrke vertscellene i et tidsrom tilstrekkelig til å tillate ekspresjon av antistoffet i vertscellene eller, mer foretrukket, sekresjon av antistoffet inn i dyrkningsmediet hvor vertscellene dyrkes.
Antistoffer kan utvinnes fra dyrkningsmediet ved anvendelse av standard proteinrensningmetoder.
Karakterisering av antistoffbinding til antigen
Antistoffer ifølge oppfinnelsen kan testes for binding til IP-10 ved, for eksempel standard ELISA. I korthet blir mikrotiterplater belagt med renset IP-10 ved 0,25� μg/ml i PBS og deretter blokkert med 5% bovint serumalbumin i PBS. Fortynninger av antistoff (f. eks., fortynninger av plasma fra IP-10-immuniserte mus) blir tilsatt til hver brønn og inkubert i 1-2 timer ved 37<o>C. Platene blir vasket med PBS/Tween og deretter inkubert med sekundær reagens (f. eks., for humane antistoffer, en geit-anti-human IgG Fc-spesifikk polyklonal reagens) konjugert til alkalisk fosfatase i 1 time ved 37<o>C. Etter vasking blir platene utviklet med pNPP substrat (1 mg/ml) og analysert ved OD på 405-650.
Foretrukket vil mus som utvikler de høyeste titrene anvendes til fusjoner.
En ELISA-analyse som beskrevet ovenfor kan også anvendes for å screene for hybridomer som oppviser positiv reaktivitet med IP-10 immunogen. Hybridomer som binder med høy aviditet til IP-10 subklones og karakteriseres videre. En klon fra hvert hybridom, som beholder reaktiviteten til opphavscellene (ved ELISA), kan velges for fremstilling av en cellebank med 5-10 medisinglass lagret ved -140 °C og for antistoffrensning.
For å rense anti-IP-10 antistoffer, kan valgte hybridomer dyrkes i to-liter spinnerkolber for rensing av monoklonalt antistoff. Supernatanter kan være filtrert og konsentrert før affinitetskromatografi med protein A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). Eluert IgG kan kontrolleres ved gelelektroforese og høytrykks-væskekromatografi for å sikre renhet. Bufferløsningen kan utveksles inn i PBS og konsentrasjonen kan bestemmes ved OD280ved anvendelse av 1,43 ekstinksjonskoeffisient. De monoklonale antistoffene kan deles inn i alikvoter og lagres ved -80 °C.
For å bestemme om de selekterte anti-IP-10 monoklonale antistoffene binder til unike epitoper, kan hvert antistoff biotinyleres ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige reagenser (Pierce, Rockford, IL). Konkurranse-studier ved anvendelse av umerkede monoklonale antistoffer og biotinylerte monoklonale antistoffer kan utføres ved anvendelse av IP-10-belagte ELISA-plater som beskrevet ovenfor. Biotinylert mAbbinding kan detekteres med en strep-avidin-alkalisk fosfatase-probe.
For å bestemme isotypen av rensede antistoffer, kan isotype ELISA’er utføres ved anvendelse av reagenser spesifikke for antistoffer av en bestemt isotype. For eksempel for å bestemme isotypen av et humant monoklonalt antistoff, kan brønner av mikrotiterplater belegges med 1 μg/ml anti-humant immunglobulin over natten ved 4 ̊ C. Etter blokkering med 1% BSA, reageres platene med 1 μg /ml eller mindre av test monoklonale antistoffer eller rensede isotype-kontroller, ved omgivelsestemperatur i én til to timer. Brønnene kan deretter reageres med enten human IgG1 eller human IgM-spesifikk alkalisk fosfatasekonjugerte prober. Plater utvikles og analyseres som beskrevet ovenfor.
Anti-IP-10 humane IgG’er kan testes ytterligere for reaktivitet med IP-10-antigen ved Western blotting. I korthet kan IP-10 fremstilles og underlegges natrium dodekyl sulfat polyakrylamid gelelektroforese. Etter elektroforese overføres de separerte antigenene til nitrocellulosemembraner, blokkeres med 10% føtalt kalveserum og probes med de monoklonale antistoffene som skal testes. Human IgG-binding kan detekteres ved anvendelse av anti-human IgG alkalisk fosfatase og utvikles med BCIP/NBT substrat tabletter (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.).
Immunokonjugater
Et anti-IP-10-antistoff eller et fragment derav, kan være konjugert til en terapeutisk gruppe, slik som et cytotoksin, et medikament (f. eks., et immunosuppressivt stoff) eller et radiotoxin. Slike konjugater er referert til her som “immunokonjugater”.
Immunokonjugater som omfatter én eller flere cytotoksin refereres til som “immunotoksiner.” Et cytotoksin eller cytotoksisk middel omfatter hvilket som helst middel som er skadelig for (f. eks., dreper) celler. Eksempler omfatter taksol, cytochalasin B, gramicidin D, etidiumbromid, emetin, mitomycin, etoposid, tenoposid, vinkristin, vinblastin, colchisin, doksorubisin, daunorubicin, dihydroksyantracindion, mitoksantron, mitramycin, aktinomycin D, 1-dehydrotestosteron, glukokortikoider, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol og puromycin og analoger eller homologer derav. Terapeutiske midler omfatter også, for eksempel antimetabolitter (f. eks., metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, cytarabin, 5-fluoruracildekarbazin), alkyleringsmidler (f. eks., mekloretamin, tioepa klorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) og lomustin (CCNU), cyklothosphamid, busulfan, dibrommannitol, streptozotocin, mitomycin C og cis-diklordiaminplatina (II) (DDP) cisplatin), antracykliner (f. eks., daunorubicin (tidligere daunomycin) og doksrubisin), antibiotika (f. eks., daktinomycin (tidligere aktinomycin), bleomycin, mitramycin og antramycin (AMC)) og anti-mitotiske midler (f. eks., vinkristin og vinblastin).
Andre foretrukne eksempler på terapeutiske cytotoksiner som kan konjugeres til et antistoff ifølge oppfinnelsen omfatter duocarmyciner, calicheamiciner, maytansiner og auristatiner og derivater derav. Et eksempel på et calicheamicin antistoffkonjugat er kommersielt tilgjengelig (Mylotarg™; Wyeth-Ayerst).
Cytoksiner kan konjugeres til antistoffer ifølge oppfinnelsen ved anvendelse av linkerteknologi tilgjengelig på området. Eksempler på typer av linkere som har vært anvendt for å konjugere et cytotoksin til et antistoff omfatter, men er ikke begrenset til, hydrazoner, tioetere, estere, disulfider og peptid-inneholdende linkere. Det kan velges en linker som for eksempel er følsom for spalting ved lav pH i den lysosomale avdelingen eller følsom for spaltning ved proteaser, slik som proteaser fortrinnsvis uttrykt i tumorvev slik som kathepsiner (f. eks., kathepsinene B, C, D).
For ytterligere omtale av typer av cytotoksiner, linkere og metoder for konjugering av terapeutiske midler til antistoffer, se også Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev.
55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. og Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. og Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev.53:247-264.
Antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse kan også konjugeres til en radioaktiv isotop for å danne cytotoksiske radiofarmasøytika også referert til som radioimmunokonjugater. Eksempler på radioaktive isotoper som kan konjugeres til antistoffer for anvendelse diagnostisk eller terapeutisk omfatter, men er ikke begrenset til, jod<131>, indium<111>, yttrium<90>og lutetium<177>. Metode for fremstilling av radioimmunkonjugater er etablert på området. Eksempler på radioimmunokonjugater er kommersielt tilgjengelige, omfattende Zevalin™ (IDEC Pharmaceuticals) og Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals) og lignende metoder kan anvendes for å fremstille radioimmunokonjugater ved anvendelse av antistoffene ifølge oppfinnelsen.
Antistoffkonjugatene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å modifisere en gitt biologisk respons og medikamentgruppen skal ikke oppfattes som begrenset til tradisjonelle kjemiske terapeutiske midler. For eksempel kan medikamentgruppen være et protein eller polypeptid som har en ønsket biologisk aktivitet. Slike proteiner kan for eksempel omfatte et enzymatisk aktivt toksin eller aktivt fragment derav, slik som abrin, ricin A, pseudomonas eksotoksin eller difteritoksin; et protein slik som tumornekrosefaktor eller interferon- γ; eller, biologisk responsmodifikatorer slik som for eksempel lymfokiner, interleukin-1 ("IL-1"), interleukin-2 ("IL-2"), interleukin-6 ("IL-6"), granulocytt makrofag kolonistimulerende faktor ("GM-CSF"), granulocytt kolonistimulerende faktor ("G-CSF") eller andre vekstfaktorer.
Teknikker for å konjugere slik terapeutisk gruppe til antistoffer er velkjente, se, f. eks., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", i Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), s.243-56 (Alan R. Liss, Inc.1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", i Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), s.623-53 (Marcel Dekker, Inc.1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", i Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), s.
475-506 (1985); "Analysis, Results And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", i Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), s.303-16 (Academic Press 1985) og Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxical Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).
Bispesifikke molekyler
I et annet aspekt angår foreliggende oppfinnelse bispesifikke molekyler omfattende et anti-IP-10-antistoff eller et fragment derav, ifølge oppfinnelsen. Et antistoff ifølge oppfinnelsen eller antigenbindende deler derav, kan derivatisees eller bindes til et annet funksjonelt molekyl, f. eks., et annet peptid eller protein (f. eks., et annet antistoff eller ligand for en reseptor) for å danne et bispesifikt molekyl som bindes til minst to forskjellige bindingsseter eller målmolekyler. Antistoffet ifølge oppfinnelsen kan faktisk derivatiseres eller bindes til mer enn ett annet funksjonelt molekyl for å fremstille multispesifikke molekyler som binder til mer enn to forskjellige bindingsseter og/eller målmolekyler; slike multispesifikke molekyler er også ment å omfatte betegnelsen “bispesifikt molekyl” som anvendt her. For å danne et bispesifikt molekyl ifølge oppfinnelsen, kan et antistoff ifølge oppfinnelsen bindes funksjonelt til (f. eks., ved kjemisk kobling, genetisk fusjon, ikke-kovalent assosiering eller på annen måte) til ett eller flere andre bindingsmolekyler, slik som et annet antistoff, antistoffragment, peptid eller bindingetterligning, slik at det resulterer i et bispesifikt molekyl.
Følgelig omfatter foreliggende oppfinnelse bispesifikke molekyler omfattende minst én første bindingsspesifisitet for IP-10 og en andre bindingsspesifisitet for en andre målepitop. I en bestemt utførelsesform ifølge oppfinnelsen, er den andre målepitopen en Fc-reseptor, f. eks., human Fc γRI (CD64) eller en human Fc α-reseptor (CD89). Derfor omfatter oppfinnelsen bispesifikke molekyler i stand til å binde både til Fc γR, Fc αR eller Fc�R-uttrykkende effektorceller (f. eks., monocytter, makrofager eller polymorfonukleære celler (PMN’er)) og til målceller som uttrykker IP-10. Disse bispesifikke molekylene målretter IP-10-uttrykkende celler til effektorcelle og utløser Fc reseptor-medierte effektorcelle-aktiviteter, slik som fagocytose av en IP-10-uttrykkende celle, antistoff avhengig celle-mediert cytotoksisitet (ADCC), frigjøring av cytokin eller fremstilling av superoksydanion.
I en utførelsesform hvor det bispesifikke molekylet er multispesifikt, kan molekylet videre omfatte en tredje bindingsspesifisitet, i tillegg til en anti-Fc bindingsspesifisitet og en anti-IP-10 bindingsspesifisitet. I én utførelsesform er den tredje bindingsspesifisiteten en anti-forbedrings (”enhancement”)-faktor (EF)-andel, f. eks., et molekyl som binder til et overflateprotein involvert i cytotoksisk aktivitet og derved øker immunresponsen mot målcellen. "Anti-forbedringsfaktor-andelen" kan være et antistoff, funksjonelt antistoffragment eller en ligand som binder til et gitt molekyl, f. eks., et antigen eller en reseptor og derved resulterer i en forbedring av effekten av bindingsdeterminantene for Fc-reseptoren eller målcelle-antigenet. "Anti-forbedringsfaktor-delen" kan binde en Fcreseptor eller et målcelle-antigen. Alternativt kan anti-forbedringsfaktor-andelen binde til en enhet som er forskjellig fra enheten til hvilke de første og andre bindingsspesifisitetene binder. For eksempel kan anti- forbedringsfaktor-andelen binde en cytotoksisk T-celle (f. eks. via CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 eller annen immuncelle som resulterer i en øket immunrespons mot målcellen).
I én utførelsesform omfatter de bispesifikke molekylene ifølge oppfinnelsen som en bindingsspesifisitet minst ett antistoff eller et antistoffragment derav, omfattende, f. eks., en Fab, Fab', F(ab')2, Fv eller en enkeltkjede Fv. Antistoffet kan også være en dimer av lett kjede eller tung kjede eller hvilket som helst minste fragment derav slik som en Fv eller en enkeltkjedekonstruksjon som beskrevet i Ladner et al. U.S. patent nr.4,946,778.
I én utførelsesform gis bindingsspesifisiteten for en Fc γ-reseptor ved et monoklonalt antistoff, for hvilket bindingen ikke blokkeres av human immunglobulin G (IgG). Som anvendt heri angir betegnelsen "IgG-reseptor" hvilken som helst av de åtte γkjede-genene lokalisert på kromosom 1. Disse genene koder totalt for tolv transmembran eller oppløselig reseptor-isoformer som er gruppert inn i tre Fc γ-reseptorklasser: Fc γRI (CD64), Fc γRII (CD32) og Fc γRIII (CD16). I én foretrukket utførelsesform, er
Fc γ�reseptoren et human høyaffinitet Fc γRI. Den humane Fc γRI er et molekyl på 72 kDa, som fremviser høy affinitet for monomer IgG (10<8>- 10<9>M<-1>).
Produksjon og karakterisering av visse foretrukne anti-Fc �monoklonale antistoffer er beskrevet av Fanger et al. i PCT-publikasjon WO 88/00052 og i U.S. patent nr.
4,954,617. Disse antistoffene binder til en epitop av Fc γRI, Fc γRII eller Fc γRIII ved et sete som er forskjellig fra Fc γ-bindingssetet for reseptoren og, deres binding blokkeres følgelig hovedsakelig av fysiologiske nivåer av IgG. Spesielle anti-Fc γRI-antistoffer anvendelige i foreliggende oppfinnelse er mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 og mAb 197. Hybridomet som produserer mAb 32 er tilgjengelig fra American Type Culture Collection, ATCC Aksesjonsnummer HB9469. I andre utførelsesformer er anti-Fc γ reseptor-antistoffet en humanisert form av monoklonalt antistoff 22 (H22). Produksjon og karakterisering av H22-antistoffet er beskrevet i Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 og PCT-publikasjon WO 94/10332. Den H22-antistoffproduserende cellelinjen ble deponert ved American Type Culture Collection under betegnelsen HA022CL1 og har aksesjonsnummeret. CRL 11177.
I enda andre foretrukne utførelsesformer, tilveiebringes bindingsspesifisiteten for en Fc-reseptor ved et antistoff som binder til en human IgA-reseptor, f. eks., en Fc-alfareseptor (Fc αRI (CD89)), for hvilken bindingen fortrinnsvis ikke blokkeres av humant immunglobulin A (IgA). Betegnelsen "IgA-reseptor" skal omfatte genproduktet av ett αgen (Fc αRI) lokalisert på kromosom 19. Dette genet er kjent å kode for mange alternativt splicede transmembranisoformer på 55 til 110 kDa. Fc αRI (CD89) uttrykkes konstitutivt på monocytter/makrofager, eosinofile og nøytrofile granulocytter, men ikke på ikkeeffektorcellepopulasjoner. Fc αRI har middels affinitet (� 5� 10<7>M<-1>) for både IgA1 og IgA2, som økes ved eksponering for cytokiner slik som G-CSF eller GM-CSF (Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440). Fire Fc αRI-spesifikke monoklonale antistoffer, identifisert som A3, A59, A62 og A77, som binder Fc αRI utenfor det IgA ligand-bindende domenet, er beskrevet (Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol.
148:1764).
Fc αRI og Fc γRI er foretrukne trigger-reseptorer for anvendelse med hensyn til de bispesifikke molekylene ifølge oppfinnelsen fordi de (1) uttrykkes primært på immuneffektorceller, f. eks., monocytter, PMN’er, makrofager og dendrittiske celler; (2) uttrykkes ved høye nivåer (f. eks., 5,000-100,000 pr. celle); (3) er mediatorer av cytotoksiske aktiviteter (f. eks., ADCC, fagocytose); (4) medierer forbedret antigenpresentasjon av antigener, omfattende selv-antigener, målrettet mot dem.
Selv om humane monoklonale antistoffer er foretrukket, er andre antistoffer som kan anvendes i de bispesifikke molekylene ifølge oppfinnelsen murine, kimære og humaniserte monoklonale antistoffer.
De bispesifikke molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved å konjugere bestanddelene med bindingsspesifisitet, f. eks., anti-FcR og anti-IP-10-bindingspesifisitetene, ved anvendelse av metoder kjent på området. For eksempel kan hver bindingsspesifisitet av det bispesifikke molekylet dannes separat og deretter konjugeres til hverandre. Når bindingsspesifisitetene er proteiner eller peptider, kan en rekke koblingseller kryssbindingsmidler anvendes for kovalent konjugering. Eksempler på kryssbindingsmidler omfatter protein A, karbodiimid, N-succinimidyl-S-acetyl-tioacetat (SATA), 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzosyre) (DTNB), o-fenylendimaleimid (oPDM), N-succinimidyl-3-(2-pyridylditio)propionat (SPDP) og sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidometyl)-cyklohaxan-1-karboksylat (sulfo-SMCC) (se f. eks., Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med.160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Andre metoder omfatter de beskrevet i Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. nr.78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83) og Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Foretrukne konjugeringsmidler er SATA og sulfo-SMCC, begge tilgjengelige fra Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Når bindingsspesifisitetene er antistoffer, kan de konjugeres via sulfhydrylbinding av de C-terminale hengselsregionene av de to tunge kjedene. I en spesielt foretrukket utførelsesform, modifiseres hengselsregionen til å inneholde et oddetalls antall sulfhydrylrester, fortrinnsvis én, før konjugering.
Alternativt kan begge bindingsspesifisitetene kodes for i samme vektor og uttrykkes og settes sammen i samme vertscelle. Denne metoden er spesielt anvendelig hvor det bispesifikke molekylet er et mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2eller ligand x Fab fusjonsprotein. Et bispesifikt molekyl ifølge oppfinnelsen kan være et enkeltkjedemolekyl omfattende et enkeltkjede-antistoff og en bindingsdeterminant eller et enkeltkjede bispesifikt molekyl omfattende to bindingsdeterminanter. Bispesifikke molekyler kan omfatte minst to enkeltkjede-molekyler. Metoder for fremstilling av bispesifikke molekyler er beskrevet for eksempel i U.S. patent nummer 5,260,203; U.S. patent nummer 5,455,030; U.S. patent nummer 4,881,175; U.S. patent nummer 5,132,405; U.S. patent nummer 5,091,513; U.S. patent nummer 5,476,786; U.S. patent nummer 5,013,653; U.S. patent nummer 5,258,498; og U.S. patent nummer 5,482,858.
Binding av de bispesifikke molekylene til deres spesifikke mål kan bekreftes ved, for eksempel enzym-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), FACS-analyse, bioanalyse (f. eks., veksthemning) eller Western Blot-analyse. Hver av disse analysene detekterer generelt tilstedeværelsen av protein-antistoff-komplekser av spesiell interesse ved anvendelse av et merket reagens (f. eks., et antistoff) spesifikt for komplekset av interesse. For eksempel kan FcR-antistoff-komplekser detekteres ved anvendelse av f. eks., et enzym-bundet antistoff eller antistoffragment som gjenkjenner og spesifikt binder til antistoff-FcR-kompleksene. Alternativt kan kompleksene detekteres ved anvendelse av hvilke som helst av en rekke andre immunanalyser. For eksempel kan antistoffet merkes radioaktivt og anvendes i en radioimmunoassay (RIA) (se for eksempel Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, mars, 1986). Den radioaktive isotopen kan detekteres ved slike metoder som anvendelse av en� γ-teller eller en scintillasjonsteller eller ved autoradiografi.
Farmasøytiske blandinger
I et annet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en blanding, f. eks., en farmasøytisk sammensetning, inneholdende ett eller en kombinasjon av monoklonale antistoffer eller antigenbindende del(er) derav, ifølge foreliggende oppfinnelse, formulert sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer. Slike blandinger kan omfatte ett eller en kombinasjon av (f. eks., to eller flere forskjellige) antistoffer eller immunokonjugater eller bispesifikke molekyler ifølge oppfinnelsen. For eksempel kan en farmasøytisk blanding ifølge oppfinnelsen omfatte en kombinasjon av antistoffer (eller immunokonjugater eller bispesifikke molekyler) som binder til forskjellig epitoper på mål-antigenet eller som har komplementære aktiviteter.
Farmasøytiske blandinger ifølge oppfinnelsen kan også administreres i kombinasjonsterapi, dvs. kombinert med andre midler. For eksempel kan kombinasjonsterapien omfatte et anti-IP-10-antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse kombinert med minst ett annet anti-inflammatorisk eller immunosuppressivt middel.
Eksempler på terapeutiske midler som kan anvendes i kombinasjonsterapi er beskrevet mer detaljert nedenfor i avsnittet angående anvendelser av antistoffene ifølge oppfinnelsen.
Som anvendt her omfatter, "farmasøytisk akseptabel bærer" hvilke som helst og alle løsningsmidler, dispersjons-medium, belegg, antibakterielle og antifungale midler, isotoniske og absorpsjonsforsinkende midler og lignende som er fysiologisk kompatible. Fortrinnsvis er bæreren egnet for intravenøs, intramuskulær, subkutan, parenteral, spinal eller epidermal administrering (f. eks., ved injeksjon eller infusjon). Avhengig av administreringsveien, kan den aktive forbindelsen, dvs. antistoff, immunokonjugat eller bispesifikt molekyl, belegges i et materiale for å beskytte forbindelsen fra virkningen av syrer og andre naturlige betingelser som kan inaktivere forbindelsen.
De farmasøytiske forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan omfatte ett eller flere farmasøytisk akseptable salter. Et "farmasøytisk akseptabelt salt" refererer til et salt som beholder den ønskede biologiske aktiviteten til stamforbindelsen og ikke gir noen uønskede toksikologiske effekter (se f. eks., Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci.66:1-19). Eksempler på slike salter omfatter syreaddisjonssalter og baseaddisjonssalter.
Syreaddisjonssalter omfatter de avledet fra ikke-toksiske uorganiske syrer, slik som saltsyre, salpetersyre, fosforsyre, svovelsyre, bromhydrogensyre, jodhydrogensyre, fosfor og lignende, så vel som fra ikke-toksisk organiske syrer slik som alifatiske mono- og dikarboksylsyrer, fenyl-substituerte alkansyrer, hydroksyalkansyrer, aromatiske syrer, alifatiske og aromatiske sulfonsyrer og lignende. Baseaddisjonssalter omfatter de avledet fra jordalkalimetaller, slik som natrium, kalium, magnesium, kalsium og lignende, så vel som fra ikke-toksiske organiske aminer, slik som N,N'-dibenzyletylendiamin, N-metylglukamin, klorprokain, cholin, dietanolamin, etylendiamin, prokain og lignende.
En farmasøytisk blanding ifølge oppfinnelsen kan også omfatte en farmasøytisk akseptabel antioksydant. Eksempler på farmasøytisk akseptable antioksydasjonsmidler omfatter: (1) vannoppløselige antioksydasjonsmidler, slik som askorbinsyre, cysteinhydroklorid, natriumbisulfat, natriummetabisulfitt, natriumsulfitt og lignende; (2) oljeløselige antioksydasjonsmidler, slik som askorbyl-palmitat, butylert hydroksyanisol (BHA), butylert hydroksytoluen (BHT), lecitin, propylgallat, alfatokoferol og lignende; og (3) metall chelaterende midler, slik som sitronsyre, etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), sorbitol, vinsyre, fosforsyre og lignende.
Eksempler på egnede vandige og ikke-vandige bærere som kan anvendes i de farmasøytiske blandingene ifølge oppfinnelsen omfatter vann, etanol, polyoler (slik som glyserol, propylenglykol, polyetylenglykol og lignende) og egnede blandinger derav, vegetabilske oljer, slik som olivenolje og injiserbare organiske estere, slik som etyloleat. Passende fluiditet kan opprettholdes, for eksempel ved anvendelse av belegg-materialer, slik som lecitin, ved opprettholdelse av den nødvendige partikkelstørrelsen i tilfellet av dispersjoner og ved anvendelse av surfaktanter.
Disse blandingene kan også inneholde adjuvanser slik som konserveringsmidler, fuktemidler, emulgeringsmidler og dispergeringsmidler. Forhindring av tilstedeværelse av mikroorganismer kan sikres både ved steriliseringsmetoder, supra og ved inkludering av forskjellige antibakterielle og antifungale midler, for eksempel paraben, klorbutanol, fenol sorbinsyre og lignende. Det kan også være ønskelig å inkludere isotoniske midler, slik som sukkere, natriumklorid og lignende inn i blandingene. I tillegg kan forlenget absorpsjon av den injiserbare farmasøytiske formen være forårsaket av inklusjonen av midler som forsinker absorpsjon slik som aluminiummonostearat og gelatin.
Farmasøytisk akseptable bærere omfatter sterile vandige løsninger eller dispersjoner og sterile pulvere for ekstemporert fremstilling av sterile injiserbare løsninger eller dispersjon. Anvendelse av slike medier og midler for farmasøytisk aktive substanser er kjent på området. Bortsett fra for så vidt som noen konvensjonelle medium eller midler er inkompatible med den aktive forbindelsen, er anvendelse derav i de farmasøytiske blandingene ifølge oppfinnelsen omfattet. Supplerende aktive forbindelser kan også innføres i blandingene.
Terapeutiske blandinger må typisk være sterile og stabile under betingelsene for fremstilling og lagring. Blandingen kan formuleres som en løsning, mikroemulsjon, liposom eller annen anvist struktur egnet for høy medikamentkonsentrasjon. Bæreren kan være et løsningsmiddel eller dispersjonsmedium inneholdende, for eksempel vann, etanol, polyol (for eksempel glyserol, propylenglykol og flytende polyetylenglykol og lignende) og egnede blandinger derav. Passende fluiditet kan opprettholdes, for eksempel ved anvendelse av et belegg slik som lecitin, ved opprettholdelse av den nødvendige partikkelstørrelsen i tilfellet av dispersjon og ved anvendelse av surfaktanter. I mange tilfeller vil det være foretrukket å inkludere isotoniske midler, for eksempel sukkere, polyalkoholer slik som mannitol, sorbitol eller natriumklorid i blandingen. Forlenget absorpsjon av de injiserbare blandingene kan være forårsaket av inkludering av et middel, i blandingen, som forsinker absorpsjon, for eksempel monostearatsalter og gelatin.
Sterile injiserbare løsninger kan fremstilles ved å innlemme den aktive forbindelsen i den nødvendige mengden i et passende løsningsmiddel med én eller en kombinasjon av bestanddeler spesifisert ovenfor, som nødvendig, etterfulgt av sterilisering mikrofiltrering. Generelt fremstilles dispersjoner ved å inkorporere den aktive forbindelsen inn i en steril bærer som inneholder et basisk dispersjonsmedium og de nødvendige andre bestanddelene fra de spesifisert ovenfor. I tilfellet av sterile pulvere for fremstilling av sterile injiserbare løsninger, er de foretrukne fremstillingsmetodene vakuumtørking og frysetørking (lyofilisering) som gir et pulver av den aktive bestanddelen samt hvilken som helst ytterligere ønsket bestanddel fra en tidligere sterilfiltrert løsning derav.
Mengden av aktiv bestanddel som kan kombineres med et bærermateriale for å fremstille en enkelt doseringsform vil variere avhengig av subjektet som behandles og den spesielle administrasjonsmetoden. Mengden av aktiv bestanddel som kan kombineres med et bærermateriale for å fremstille en enkelt doseringsform vil generelt være den mengden av blandingen som gir en terapeutisk effekt. Generelt, av ett hundre prosent, vil denne mengden variere fra ca.0,01 prosent til omtrent nittini prosent aktiv bestanddel, fortrinnsvis fra ca.0,1 prosent til ca.70 prosent, mest foretrukket fra ca.1 prosent til ca.30 prosent aktiv bestanddel i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer.
Doseregimer justeres for å gi optimal ønsket respons (f. eks., en terapeutisk respons). For eksempel kan en enkelt bolus administreres, mange oppdelte doser kan administreres over tid eller dosen reduseres proporsjonalt eller økes proporsjonalt som angitt ved kravene for den terapeutiske situasjon. Det er spesielt fordelaktig å formulere parenterale blandinger i doseringsenhetsform for lettere administrering og ensartet dose. Doseringsenhetsform som anvendt heri angir fysisk adskilte enheter egnet som enhetsdoser for subjektene som skal behandles; hvor hver enhet inneholder en forutbestemt mengde av aktiv forbindelse beregnet for å fremstille ønsket terapeutisk effekt sammen med den nødvendige farmasøytiske bæreren. Spesifiseringen for doseringsenhetsformer ifølge oppfinnelsen dikteres av og er direkte avhengig av (a) de unike egenskapene av den aktive forbindelsen og den spesielle terapeutiske effekten som skal oppnås og (b) begrensningene iboende på området for formulering av en slik aktiv forbindelse for behandling av sensitivitet hos individer.
For administrering av antistoffet er dosen i området fra ca.0,0001 til 100 mg/kg og mer vanlig 0,01 til 5 mg/kg, med hensyn til vertens kroppsvekt. For eksempel kan doseringer være 0,3 mg/kg kroppsvekt, 1 mg/kg kroppsvekt, 3 mg/kg kroppsvekt, 5 mg/kg kroppsvekt eller 10 mg/kg kroppsvekt eller innenfor området på 1-10 mg/kg. Et eksempel på behandlingsregime innebærer administrering én gang pr. uke, én gang hver 2. uke, én gang hver tredje uke, én gang hver fjerde uke, én gang pr. måned, én gang hver 3. måned eller én gang hver 3. til 6. måned. Foretrukne doseregimer for et anti-IP-10-antistoff ifølge oppfinnelsen omfatter 1 mg/kg kroppsvekt eller 3 mg/kg kroppsvekt via intravenøs administrering, hvor antistoffet gis ved anvendelse av én av de følgende doseringsskjemaene: (i) hver fjerde uke for seks doser, deretter hver tredje måned; (ii) hver tredje uke; (iii) 3 mg/kg kroppsvekt én gang etterfulgt av 1 mg/kg kroppsvekt hver tredje uke.
Ved noen metoder administreres to eller flere monoklonale antistoffer med forskjellige bindingsspesifisiteter samtidig, i hvilket tilfelle dosen av hvert antistoff administrert er innenfor de angitte områdene. Antistoff administreres vanligvis ved flere anledninger. Intervaller mellom enkeltdoser kan for eksempel være ukentlig, månedlig, hver tredje måned eller årlig. Intervaller kan også være uregelmessige som angitt ved å måle blodnivåer av antistoff til mål-antigenet hos pasienten. Ved noen metoder, reguleres dose for å oppnå en antistoffkonsentrasjon i plasma på ca.1-1000 μg /ml og i noen metoder ca.25-300 μg /ml.
Alternativt kan antistoff administreres som en formulering med forlenget frigjøring, i hvilket tilfelle mindre hyppig administrering er nødvendig. Dose og hyppighet kan variere avhengig av halveringstiden av antistoffet i pasienten. Generelt fremviser humane antistoffer den lengste halveringstiden, etterfulgt av humaniserte antistoffer, kimære antistoffer og ikke-humane antistoffer. Dosen og administreringshyppigheten kan variere avhengig av hvorvidt behandlingen er profylaktisk eller terapeutisk. I profylaktiske anvendelser administreres en relativt lav dose ved relativt ufrekvente intervaller over en lang tidsperiode. Noen pasienter fortsetter å motta behandling for resten av livet. Ved terapeutiske anvendelser er en relativt høy dose ved relativt korte intervaller noen ganger nødvendig inntil progresjon av sykdommen reduseres eller avsluttes og foretrukket inntil pasienten viser delvis eller fullstendig forbedring av symptomer på sykdom. Deretter kan det administreres et profylaktisk regime til pasienten.
Reelle doseringsnivåer av de aktive bestanddelene i de farmasøytiske blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse kan varieres for å oppnå en mengde av den aktive bestanddelen som er effektiv for å oppnå den ønskede terapeutiske responsen for en bestemt pasient, blanding og administrasjonsmetode, uten at de er toksiske for pasienten. Det valgte doseringsnivået vil avhenge av en rekke farmakokinetiske faktorer omfattende aktiviteten av de spesielle blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendt eller esteren, saltet eller amidet derav, administrasjonsruten, tiden for administrering, utskillingshastighet av den bestemte forbindelsen som anvendes, varigheten av behandlingen, andre medikamenter, forbindelser og/eller materialer anvendt i kombinasjon med de bestemte blandingene anvendt, alderen, kjønn, vekt, tilstand, generell helse og tidligere medisinsk historie for pasienten som behandles og lignende faktorer velkjente innenfor det medisinske området.
En "terapeutisk effektiv dose" av et anti-IP-10-antistoff ifølge oppfinnelsen resulterer foretrukket i en reduksjon i alvorlighetsgraden av sykdomssymptomer, en økning i hyppigheten og varigheten av perioder fri for sykdomssymptomer eller en forebygging av svekkelse eller funksjonshemming på grunn av sykdomsplager. I tilfellet av revmatoid artritt (RA), forhindrer en terapeutisk effektiv dose foretrukket ytterligere skade ved fysiske symptomer forbundet med RA, slik som for eksempel smerte, tretthet, morgenstivhet (vedvarende mer enn én time), diffuse muskelsmerter, tap av appetitt, svakhet, leddsmerte med varme, svelling, ømhet og stivhet i et ledd etter inaktivitet. En terapeutisk effektiv dose forhindrer eller forsinker også foretrukket oppstart av RA, slik som kan være ønsket når tidlige eller preliminære tegn på sykdommen er til stede.
Likeledes omfatter det forsinkelse av kronisk progresjon forbundet med RA.
Laboratorietester anvendt i diagnose av RA omfatter kjemiske tester (omfattende måling av IP-10-nivåer), hematologi, serologi og radiologi. Følgelig kan hvilke som helst kliniske eller biokjemiske analyser som kontrollerer hvilke som helst av de foregående anvendes for å bestemme hvorvidt en bestemt behandling er en terapeutisk effektiv dose for behandling av RA. En fagmann på området ville være i stand til å bestemme slike mengder basert på slike faktorer som subjektets størrelse, alvorlighetsgraden av subjektets symptomer og den bestemte blandingen eller administrasjonsruten valgt.
En blanding ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres via én eller flere administrasjonsruter ved anvendelse av én eller flere av en rekke metoder kjent på området. Som det vil forstås av fagfolk vil ruten og/eller administreringsmetoden variere avhengig av de ønskede resultatene. Foretrukne administrasjonsruter for antistoffer ifølge oppfinnelsen omfatter intravenøs, intramuskulær, intradermal, intraperitoneal, subkutan, spinal eller andre parenterale administrasjonsruter, for eksempel ved injeksjon eller infusjon. Uttrykket "parenteral administrering" som anvendt her betyr administreringsmetoder forskjellig fra enteral og topisk administrering, vanligvis ved injeksjon og omfatter, uten begrensning, intravenøs, intramuskulær, intraarteriell, intratekal, intrakapsulær, intraorbital, intrakardiell, intradermal, intraperitoneal, transtrakeal, subkutan, under overhuden, intraartikulær, subkapsulær, subaraknoidal, intraspinal, epidural og intrasternal injeksjon og infusjon.
Alternativt kan et antistoff ifølge oppfinnelsen administreres via en ikke-parenteral rute, slik som en topisk, epidermal eller mukosal administreringsvei, for eksempel intranasalt, oralt, vaginalt, rektalt, sublingvalt eller topisk.
De aktive forbindelsene kan fremstilles med bærere som vil beskytte forbindelsen mot rask frigjøring, slik som en formulering med kontrollert frigjøring, omfattende implantater, transdermale plastere og mikroinnkapslede leveringssystemer.
Bionedbrytbare, biokompatible polymerer kan anvendes, slik som etylenvinylacetat, polyanhydrider, polyglykolsyre, kollagen, polyortoestere og polymelkesyre. Mange metoder for fremstilling av slike formuleringer er patenterte eller generelt kjent for fagfolk på området. Se, f. eks., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Terapeutiske blandinger kan administreres med medisinske anordninger kjent på området. For eksempel kan, i en foretrukket utførelsesform, en terapeutisk blanding ifølge oppfinnelsen administreres med en nålfri hypodermisk injeksjonsanordning, slik som anordningene beskrevet i U.S. patenter nr.5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; eller 4,596,556. Eksempler på velkjente implantater og moduler anvendelige i foreliggende oppfinnelse omfatter: U.S. patent nr.4,487,603, som beskriver en implanterbar mikroinfusjonspumpe for utlevering av medikament med en kontrollert hastighet; U.S. patent nr.4,486,194, som beskriver en terapeutisk anordning for administrering av medikament gjennom huden; U.S. patent nr.4,447,233, som beskriver en medikament-infusjonspumpe for levering av medikament ved en nøyaktig infusjonshastighet; U.S. patent nr.4,447,224, som beskriver en variabel strøm implanterbart infusjonsapparat for kontinuerlig medikamentlevering; U.S. patent nr. 4,439,196, som beskriver et osmotisk medikamentleveringssystem som har multikammer avdelinger; og U.S. patent nr.4,475,196, som beskriver et osmotisk medikamentleveringssystem. Disse patentene er inntatt heri ved referanse. Mange andre slike implantater, leveringssystemer og moduler er kjent for fagfolk på området.
I visse utførelsesformer kan de humane monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen formuleres for å sikre riktig fordeling in vivo. For eksempel utelukker blodhjerne-barrieren (BBB) mange svært hydrofile forbindelser. For å sørge for at de terapeutiske forbindelsene ifølge oppfinnelsen krysser BBB (om ønsket), kan de formuleres, for eksempel i liposomer. For metoder for fremstilling av liposomer, se, f. eks., U.S. patenter 4,522,811; 5,374,548; og 5,399,331. Liposomene kan omfatte én eller flere grupper som selektivt transporteres inn i spesielle celler eller organer, og følgelig forbedrer målrettet medikamentlevering (se, f. eks., V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Eksempler på målrettende grupper omfatter folat eller biotin (se f. eks., U.S. patent 5,416,016 ved Low et al.); mannosider (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res.
Commun. 153:1038); antistoffer (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett.357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother.39:180); surfaktant protein A-reseptor (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); se også K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett.346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.
Anvendelser og fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen
Antistoffene (og immunokonjugater og bispesifikke molekyler) ifølge foreliggende oppfinnelse har in vitro og in vivo diagnostiske og terapeutiske anvendelser. For eksempel kan disse molekylene administreres til celler i kultur, f. eks. in vitro eller ex vivo eller i et subjekt, f. eks., in vivo, for å behandle, forebygge eller diagnostisere en rekke forstyrrelser. Betegnelsen "subjekt" som anvendt her er ment å omfatte mennesker og ikke-humane dyr. Ikke-humane dyr omfatter alle virveldyr, f. eks., pattedyr og ikke pattedyr, slik som ikkehumane primater, sauer, hunder, katter, kuer, hester, kyllinger, amfibier og reptiler.
Metodene er spesielt egnet for behandling av humane pasienter som har en forstyrrelse forbundet med avvikende IP-10-ekspresjon. Når antistoffer mot IP-10 administreres sammen med et annet middel, kan de to administreres i hvilken som helst rekkefølge eller samtidig.
Antistoffene (og immunokonjugater og bispesifikke molekyler) ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å detektere nivåer av IP-10 eller nivåer av celler som inneholder IP-10. Dette kan oppnås, for eksempel ved å kontakte en prøve (slik som en in vitro prøve) og en kontrollprøve med anti-IP-10-antistoffet under betingelser som tillater dannelse av et kompleks mellom antistoffet og IP-10. Hvilke som helst komplekser dannet mellom antistoffet og IP-10 detekteres og sammenlignes i prøven og kontrollen. For eksempel kan standard deteksjonsmetoder, velkjente på området, slik som ELISA og flowcytometriske analyser, utføres ved anvendelse av blandingene ifølge oppfinnelsen.
Det er mulig å detektere tilstedeværelse av IP-10 (f. eks., humant IP-10-antigen) i en prøve eller måling av mengden av IP-10, omfattende å kontakte prøven og en kontrollprøve, med et antistoff ifølge oppfinnelsen eller en antigenbindende del derav, som spesifikt binder til IP-10, under betingelser som tillater dannelse av et kompleks mellom antistoffet eller delen derav og IP-10. Dannelsen av et kompleks blir deretter detektert, hvor en forskjell i kompleksdannelse mellom prøven sammenlignet med kontrollprøven er indikativ for tilstedeværelse av IP-10 i prøven.
Kit kan dannes omfattende blandingene (f. eks., antistoffer, human antistoffer, immunokonjugater og bispesifikke molekyler) ifølge oppfinnelsen og instruksjoner for anvendelse. Kitet kan videre inneholde minst én ytterligere reagens eller én eller flere ytterligere antistoffer ifølge oppfinnelsen (f. eks., et antistoff som har en komplementær aktivitet som binder til en epitop på mål-antigenet forskjellig fra det første antistoffet). Kit omfatter typisk en etikett som angir den tilsiktede anvendelsen av innholdet av kitet.
Betegnelsen merke omfatter hvilken som helst påskrift eller gjengitt materiale levert i eller med kitet eller som på annen måte følger kitet.
IP-10 er kjent å ha en kjemoattraktant-effekt på aktiverte T-celler og NK-celler og å rekruttere slike celler til inflammasjonssteder og autoimmunresponser. Følgelig kan anti-IP-10-antistoffene (og immunokonjugater og bispesifikke molekyler) ifølge oppfinnelsen anvendes til å hemme inflammatorisk respons eller autoimmunrespons mediert av aktiverte T-celler og/eller NK-celler ved en rekke klinisk indikasjoner. Det er mulig med en fremgangsmåte for å hemme en inflammatorisk eller autoimmunrespons mediert av aktiverte T-celler og/eller NK-celler omfattende å kontakte T-cellene eller NK-cellene med et antistoff eller antigenbindende del derav, ifølge oppfinnelsen (eller immunkonjugat eller bispesifikke molekyl ifølge oppfinnelsen) slik at den inflammatoriske eller autoimmunresponsen hemmes. Spesifikke eksempler på inflammatoriske eller autoimmune lidelser hvor antistoffene ifølge oppfinnelsen kan anvendes omfatter, men er ikke begrenset til, de følgende:
A. Multippel sklerose og andre demyeliniserende sykdommer
Ekspresjon av IP-10 mRNA er vist å være øket i murin eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE), en musemodell av multippel sklerose (Godiska, R. et al. (1995) J. Neuroimmunol. 58:167-176). Videre er økede nivåer av IP-10 funnet i cerebrospinalvæsken hos MS-pasienter under akutte demyeliniserende hendelser (Sorensen, T.L. et al. (1999) J. Clin. Invest. 103:807-815; Franciotta et al. (2001) J.
Neuroimmunol. 115:192-198). IP-10 er også vist å uttrykkes ved astrocytter i MS lesjoner, men ikke i uberørt hvit substans (Balashov, K.E. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:6873-6878) og å uttrykkes av makrofager i MS-plaque og av reaktive astrocytter i den omgivende parenchyma (Simpson, J.E. et al. (2000) Neuropathol. Appl. Neurobiol.
26:133-142). PCT-patent publikasjon WO 02/15932 fremviste at administrering av anti-IP-10-antistoffer i en mus hepatitt virus (MHV)-modell av MS resulterte i redusert T lymfocytt og makrofag-invasjon, hemmet progresjon av demyelinisering, øket remyelinisering og forbedret nevrologisk funksjon (se også Liu, M.T. et al. (2001) J.
Immunol. 167:4091-4097). Administrering av murine anti-IP-10 antistoffer er vist å redusere klinisk og histologisk sykdomsforekomst og alvorlighetsgrad i murin EAE (Fife, B.T. et al. (2001) J. Immunol. 166:7617-7624).
I betraktning av det foregående, kan anti-IP-10-antistoffene ifølge oppfinnelsen anvendes ved behandling av MS og andre demyeliniserende sykdommer ved administrering av antistoffet til et subjekt med behov for behandling. Antistoffet kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre anti-MS-midler, slik som interferon beta-1a (f. eks., Avonex�, Rebif�), interferon beta-1b (f. eks., Betaseron�), glatiramer-acetat (f. eks., Copaxon�) og/eller mitoksantron (f. eks., Novantron�).
B. Revmatoid artritt
IP-10 nivåer er vist å være betydelig forhøyet i synovialvæske, synovialvev og serum fra pasienter med revmatoid artritt (RA) (Patel, D.D. et al. (2001) Clin. Immunol. 98:39-45; Hanaoka, R. et al. (2003) Arthritis Res. and Therapy 5:R74-R81). IP-10-reseptoren, CXCR3, er vist å foretrukket uttrykkes på mastceller i synovialvev fra RA-pasienter (Ruschpler, P. et al. (2003) Arthritis Res. Ther.5:R241-R252). I en adjuvansindusert artritt (AA)-rottemodell, er en detekterbar autoantistoffrespons mot selv IP-10 angitt (Salomon, I. et al. (2002) J. Immunol.169:2685-2693). Administrering av en IP-10-kodende DNA-vaksine forhøyet videre produksjon av nøytraliserende anti-IP-10-antistoffer i rottene og disse IP-10-autoantistoffene kunne adoptivt overføre resistens mot AA til naïve rotter (Salomon, I. et al., supra).
I betraktning av det foregående, kan anti-IP-10-antistoffene ifølge oppfinnelsen anvendes ved behandling av revmatoid artritt ved administrering av antistoffet til et subjekt med behov for behandling. Antistoffet kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre anti-RA-midler, slik som ikke-steroide anti-inflammatoriske medikamenter (NSAID’er), smertestillende midler, kortikosteroider (f. eks., prednison, hydrokortison), TNF-inhibitorer (omfattende adilimumab (Humira�), etanrcept (Enbrel�) og infliksimab (Remicade�)), sykdom-modifiserende anti-revmatiske medikamenter (omfattende metotreksat, cyklofosfamid, cyklosporin, auranofin, azatioprin, gull natrium-tiomalat, hydroksyklorkinsulfat, leflunomid, minocyklin, penicillamin og sulfasalazin), medikamenter mot fibromyalgi, medikamenter mot osteoporose og giktmedikamenter.
C. Inflammatorisk tarmsykdom
Ekspresjon av IP-10 er vist å være betydelig forbedret i celler som infiltrerer lamina propria fra kolonbiopsier tatt fra pasienter med colitis ulcerosa (Uguccioni, M. et al. (1999) Am. J. Pathol.155:331-336). Videre er nøytralisering av IP-10 vist å beskytte mus fra epitelial ulcerasjon i akutt kolitt og å forbedre overlevelse av kryptceller (Sasaki, S. et al. (2002) Eur. J. Immunol. 32:3197-3205). Også, i IL-10 -/- mus, som utvikler kolitt lik Crohns sykdom hos mennesker, førte behandling med anti-IP-10-antistoffer til forbedring i scoring av inflammasjon (Singh, U.P. et al. (2003) J. Immunol.171:1401-1406).
I betraktning av det foregående, kan anti-IP-10-antistoffene ifølge oppfinnelsen anvendes ved behandling av inflammatorisk tarmsykdom (IBD), omfattende colitis ulcerosa og Crohns sykdom, ved administrering av antistoffet til et subjekt med behov for behandling. Antistoffet kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre anti-IBD-midler, slik som medikamenter inneholdende mesalamin (omfattende sulfasalazin og andre midler inneholdende 5-aminosalisylsyre (5-ASA), slik som olsalazin og balsalazid), ikkesteroide anti-inflammatoriske medikamenter (NSAID’er), analgetika, kortikosteroider (f. eks., predinison, hydrokortison), TNF-inhibitorer (omfattende adilimumab (Humira�), etanrcept (Enbrel�) og infliksimab (Remicade�)), immunosuppressive stoffer (slik som 6-merkaptopurin, azatioprin og cyklosporin A) og antibiotika.
D. Systemisk lupus erythematosus
IP-10-nivåer i serum er vist å være markert øket hos pasienter med systemisk lupus erythematosus (SLE) og nivåene er vist å korrelere med sykdomsaktivitet (se f. eks.
Narumi, S. et al. (2000) Cytokine 12:1561-1565). Følgelig kan, i en annen utførelsesform, anti-IP-10-antistoffene ifølge oppfinnelsen anvendes ved behandling av SLE ved å administrere antistoffet til et subjekt med behov for behandling. Antistoffet kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre anti-SLE midler, slik som ikke-steroide antiinflammatoriske medikamenter (NSAID’er), analgetika, kortikosteroider (f. eks., predinison, hydrokortison), immunosuppressive stoffer (slik som cyklofosfamid, azatioprin og metotrexat), antimalarials (slik som hydroksyklorkin) og biologiske medikamenter som hemmer fremstilling av dsDNA-antistoffer (f. eks., LJP 394).
E. Type I diabetes
Nivåer av IP-10 i serum er vist å være forhøyet hos pasienter med Type I diabetes, spesielt de med nyere oppstart av sykdom og nivåene ble vist å korrelere med antallet GAD-reaktive gamma-interferon-produserende T-celler hos pasienter positive for GAD autoantistoffer (Shimada, A. et al. (2001) Diabetes Care 24:510-515). I et separat studie, ble serum IP-10-nivåer funnet å være øket hos pasienter med nylig diagnostisert sykdom og hos pasienter med høy risiko for sykdommen og IP-10-konsentrasjoner samsvarte med nivåer av IFN-gamma (Nicoletti, F. et al. (2002) Diabetologia 45:1107-1110). Videre er beta-celler vist å utskille IP-10, hvilket fører til kjemoattraksjon av T-celler og mus defisiente for CXCR3 er vist å ha forsinket oppstart av type I diabetes (Frigerio, S. et al. (2002) Nature Medicine 8:1414-1420).
Følgelig kan anti-IP-10-antistoffene ifølge oppfinnelsen, i en annen utførelsesform, anvendes ved behandling av Type I diabetes ved å administrere antistoffet til et subjekt med behov for behandling. Antistoffet kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre antidiabetiske midler, slik som insulin.
F. Inflammatoriske hudlidelser
IP-10-ekspresjon er vist å være forbundet med en rekke inflammatoriske hudlidelser. For eksempel har IP-10 blitt detektert i keratinocytter og dermalt infiltrat fra aktive psoriatiske plaque (Gottlieb, A.B. et al. (1988) J. Exp. Med.168:941-948). Videre uttrykkes CXCR3 av dermale CD3+ lymfocytter, hvilket indikerer at CXCR3 er involvert i T lymfocytt traffikkering til psoriatisk dermis (Rottman, J.B. et al. (2001) Lab. Invest. 81:335-347). Følgelig kan anti-IP-10-antistoffene ifølge oppfinnelsen, i en annen utførelsesform, anvendes ved behandling av psoriasis ved å administrere antistoffet til et subjekt med behov for behandling. Antistoffet kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre midler eller behandlinger, slik som topiske behandlinger (f. eks., steroider, tjære, calcipotrien, tazaroten, antralin, salisylsyre), fototerapi, systemiske medikamenter (f. eks., metotrexat, orale retinoider, cyklosporin, fumarsyreestere) og/eller biologiske medikamenter (f. eks., alefacept, efalizumab).
Lichen ruber planus, en kronisk inflammatorisk sykdom i huden og oral mukosa, er vist å være forbundet med infiltrerende CD4+ og CD8+ T-celler som uttrykker CXCR3 og, videre, har de CD8+ infiltrerende cytolytiske T-cellene vist å ha IP-10 i deres cytolytisk granuler og de skadede keratinocyttene er vist å overuttrykke IP-10 (Iijima, W. et al.
(2003) Am. J. Pathol.163:261-268). Følgelig kan anti-IP-10-antistoffene ifølge oppfinnelsen, i en annen utførelsesform, anvendes ved behandling av lichen ruber planus ved å administrere antistoffet til et subjekt med behov for behandling. Antistoffet kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre midler eller behandlinger, slik som antiinflammatoriske midler, anti-histaminer, kortikosteroider og lysterapi.
IP-10-ekspresjon er vist å være forhøyet ved andre inflammatoriske hudlidelser, slik som kronisk lupus erythematosus discoides og Jessners lymfocyttinfiltrat av huden (Flier, J. et al. (2001) J. Pathol. 194:398-405). Følgelig kan anti-IP-10-antistoffene ifølge oppfinnelsen, anvendes ved behandling av disse inflammatoriske hudlidelsene ved å administrere antistoffet til et subjekt med behov for behandling. Antistoffet kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre midler eller behandlinger, som beskrevet ovenfor.
G. Autoimmun thyroid sykdom
Både IP-10 og CXCR3 er vist å uttrykkes i skjoldbruskkjertelen hos pasienter som lider av Tyreotoksikose (GD), men å ikke uttrykkes (eller dårlig uttrykt) i normalt thyroidea-vev og ekspresjon var høyest hos pasienter med nyere oppstart (”onset”) GD (Romagnani, P. et al. (Am. J. Patol.161:195-206). IP-10 er også vist å uttrykkes i thyroidea-vev hos pasienter som lider av Hashimotos struma (Kemp, E.H. et al. (2003) Clin. Endocrinol.59:207-213). Følgelig kan anti-IP-10-antistoffene ifølge oppfinnelsen, i en annen utførelsesform, anvendes ved behandling av autoimmun thyroid sykdom, omfattende Tyreotoksikose og Hashimotos struma, ved å administrere antistoffet til et subjekt med behov for behandling. Antistoffet kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre midler eller behandlinger, slik som antithyroid medikamenter, radioaktivt jod og subtotal tyroidektomi.
H. Sjøgrens syndrom
Ekspresjon av IP-10-mRNA har blitt vist å være betydelig oppregulert i spyttkjertlene hos pasienter med Sjøgrens syndrom (SS), hvor ekspresjon er mest fremtredende i duktalt epitel i nabostilling til lymfoide infiltrater (se f. eks. Ogawa, N. et al. (2002) Arthritis Rheum.46:2730-2741). Følgelig kan anti-IP-10-antistoffene ifølge oppfinnelsen, i en annen utførelsesform, anvendes ved behandling av Sjøgrens syndrom ved å administrere antistoffet til et subjekt med behov for behandling. Antistoffet kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre anti-SS midler, slik som kunstige glattemidler (f. eks., kunstige tårer uten konserveringsmiddel, kunstig spytt, uparfymerte hudkermer, saltholdig nesespray og vaginale smøremidler), Lacriserts® for behandling av tørre øyne, pilokarpinhydroklorid (Salagen®) og ceyimelin (Eyoksac®) for behandling av tørr munn, ikke-steroide anti-inflammatoriske medikamenter (NSAID’er), steroider og immunosuppressive medikamenter.
I. Inflammasjon i lungene
IP-10 ekspresjon har blitt undersøkt i en musemodell av allergisk astma, med resultater som viser at IP-10 oppreguleres i lungene etter allergen provokasjon og at overekspresjon av IP-10 ble forbundet med øket hyperaktivitet i luftveiene, eosinofili, økte IL-4 nivåer og rekruttering av CD8+ lymfocytter (Medoff, B.D. et al. (2002) J. Immunol.
168:5278-5286). Videre er røykere som utvikler kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS) vist å uttrykke IP-10 i deres bronkiolære epitel (Saetta, M. et al. (2002) Am. J. Respir. Crit. Care Med.165:1404-1409). Videre er høye nivåer av IP-10 vist i den bronkoalveolær lavasjevæsken hos pasienter med sarkoidose i lungene og lymfocyttisk alveolitt (Agostini, C. et al. (1998) J. Immunol. 161:6413-6420).
Følgelig kan anti-IP-10-antistoffene ifølge oppfinnelsen, i en annen utførelsesform, anvendes ved behandling av sykdom karakterisert ved inflammasjon i lungene, slik som astma, KOLS, sarkoidose i lungene eller lymfocyttisk alveolitt, ved å administrere antistoffet til et subjekt med behov for behandling. Antistoffet kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre midler for reduksjon av inflammasjon i lungene, slik som cromolyn-natrium, nedocromil-natrium, inhalerte kortikosteroider, systemiske (f. eks., oral) kortikosteroider, kortvirkende beta-antagonister, kortvirkende bronkodilatatorer, langtvirkende beta-antagonister eller agonister (oral eller inhalert), leukotrienmodifikatorer, teofyllin og oksygenbehandling.
J. Avstøtning av transplantat
IP-10 har blitt vist å ha en funksjon ved avstøtning av transplantert vev. For eksempel økte behandling av mus med nøytraliserende anti-IP-10 antistoffer overlevelsen av tynntarm allografter og reduserte akkumulering av verts T-celler og NK-celler i lamina propria (Zhang, Z. et al. (2002) J. Immunol.168:3205-3212). Videre, hos mus som mottar pankreas øycelle allografter, resulterte anti-IP-10-antistoffbehandling også i øket allograft overlevelse og redusert lymfocytisk graft infiltrering (Baker, M.S. et al. (2003) Surgery 134:126-133). I tillegg ble hjerte allografter, men ikke normale hjerter, vist å uttrykke IP-10 og CXCR3 og forhøyede IP-10 nivåer ble forbundet med hjerte allograft vaskulopati (Zhao, D.X. et al. (2002) J. Immunol. 169:1556-1560). CXCR3 og IP-10 har også blitt vist å uttrykkes av inflammatoriske celler som infiltrerer lunge allografter (Agostini, C. et al. (2001) Am J. Pathol.158:1703-1711). Nøytralisering av CXCR3 eller IP-10 in vivo ble vist å svekke bronchiolitis obliterans syndrom (BOS), den vikstigste begrensningen for overlevelse for mottagere av lungetransplantat, i en murin lungetransplantat-modell (Belperio, J.A. et al. (2002) J. Immunol. 169:1037-1049).
I betraktning av det foregående tilveiebringer oppfinnelsen også en fremgangsmåte for å hemme avstøtning av transplantat ved å administrere et anti-IP-10-antistoff ifølge oppfinnelsen til en mottager av transplantat med behov for behandling. Eksempler på vevstransplantater som kan behandles omfatter, men er ikke begrenset til, lever, lunge (f. eks., behandling av BOS), nyre, hjerte, tynntarm og pankreas øyceller. Antistoffet kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre midler for å hemme avstøtning av transplantat, slik som immunosuppressive midler (f. eks., cyklosporin, azatioprin, metylprednisolon, prednisolon, prednison, mykofenolatmofetil, sirilimus, rapamycin, tacrolimus), anti-infektive midler (f. eks., acyklovir, clotrimazol, ganciclovir, nystatin, trimethoprimsulfarnethoksazol), diuretika (f. eks., bumetanid, furosemid, metolazon) og ulcer-medikamenter (f. eks., cimetidin, farnotidin, lansoprazol, omeprazol, ranitidin, sucralfat).
K. Ryggmargskade
Traumatisk skade på ryggmargen fører til infiltrering av inflammatoriske celler. IP-10 er vist å spille en sentral rolle ved sekundær degenerasjon etter ryggmargskade (Gonzalez et al. (2003) Exp. Neurol, 184:456-463; se også PCT-patent publikasjon WO 03/06045). IP-10 er vist å være betydelig forhøyet i kvestede rotte-ryggmarger 6 og 12 timer etter skade (McTigue, D.M. et al. (1998) J. Neurosci. Res.53:368-376) og i den skadede ryggmargen hos mus 6 timer etter skade (Gonzalez et al. (2003) supra). Følgelig er hemning av IP-10-aktivitet etter ryggmargskade vist å være anvendelig ved reduksjon av infiltrering av inflammatoriske celler og følgelig reduksjon av sekundær vevskade ved inflammasjon. Hemning kan også redusere infiltrering av inflammatoriske celler, redusere sekundær degenerasjon og forbedre helbredelse etter traumatisk hjerneskade og slag. Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen også en fremgangsmåte for behandling av ryggmargskade og hjerneskade (f. eks., slag) hos et individ med behov for behandling omfattende å administrere til subjektet et anti-IP-10-antistoff ifølge oppfinnelsen.
Antistoffet kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre midler, slik som andre antiinflammatoriske midler.
L. Neurodegenerative sykdommer
IP-10 og CXCR3-ekspresjon i sentralnervesystemet har blitt funnet å være oppregulert sammen med patologiske endringer forbundet med Alzheimers sykdom (AD) (Xia, M.Q. og Hyman, D.T. (1999) J. Neurovirol.5:32-41). I AD-hjerner ble CXCR3 vist å uttrykkes konstitutivt ved neuroner og neuronale prosesser i forskjellige kortikale og subkortikale regioner og IP-10 ble vist å uttrykkes i astrocytter og dens nivå var markert forhøyet sammenlignet med normale hjerner (Xia, M.Q. et al. (2000) J. Neuroimmunol. 108:227-235). Følgelig kan antistoffene ifølge oppfinnelsen anvendes ved behandling av neurodegenerative sykdommer, slik som Alzheimers sykdom og Parkinsons sykdom, ved å administrere til et subjekt med behov for behandling anti-IP-10-antistoffet, alene eller i kombinasjon med andre terapeutiske midler. Eksempler på midler med hvilke anti-IP-10-antistoffet kan kombineres for behandling av Alzheimers sykdom omfatter cholinesteraseinhibitorer (donepezil, rivastigmin, galantamin, takrin) og vitamin E. Et eksempel på et middel med hvilke anti-IP-10-antistoffet kan kombineres for behandling av Parkinsons sykdom er levodopa.
M. Gingivitt
Marginal periodontitt er forbundet med betent gingivalvev. Celler som produserer IP-10 er funnet i betent humant gingivalvev, så vel som celler som uttrykker CXCR3-reseptoren (Kabashima, H. et al. (2002) Cytokine 20:70-77). Følgelig kan anti-IP-10 antistoffene ifølge oppfinnelsen, i en annen utførelsesform, anvendes ved behandling av gingivitt ved å administrere antistoffet til et subjekt med behov for behandling. Antistoffet kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre midler eller behandlinger, slik som antigingivalt munnvann (f. eks., antibiotisk munnvann), periodontal scaling og rot planing og periodontal kirurgi.
N. Inflammasjon forbundet med genterapi
Replikasjons-defisiente adenoviruser, anvendt som adenovirale vektorer anvendt i genterapi, kan forårsake akutt skade og inflammasjon i vev infisert med de virale vektorene. Slike adenovirale vektorer er vist å indusere ekspresjon av IP-10 gjennom kapsid-avhengig aktivering av NFkB (Borgland, S.L. et al. (2000) J. Virol.74:3941-3947). Følgelig kan anti-IP-10-antistoffene ifølge oppfinnelsen anvendes for å hemme IP-10-indusert skade og/eller inflammasjon under genterapibehandling som anvender en viral vektor, slik som en adenoviral vektor, som stimulerer uønsket produksjon av IP-10.
O. Angiogenesesykdom
IP-10 er vist å hemme angiogenese in vitro og in vivo (Strieter et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun.210:51-57; Angiolillo et al. (1995) J. Exp. Med.
182:155-162; Luster et al. (1995) J. Exp. Med.182:219-231). Angiogenese spiller en viktig rolle i mange sykdomsprosesser, slik som helingsresponsen ved traume. For eksempel forblir vaskulatur i den skadede ryggmargen i en tilstand av aktiv remodellering helt til minst 28 dager etter skade (Popovich et al. (1997) J. Comp. Neurol. 377:443-464).
IP-10 er antatt å utøve dens angiostatiske effekter gjennom hemning av endotelcellevekst og kjemotaksi. Den gjør dette gjennom dens heparinbindende motiv så vel som gjennom en reseptormediert mekanisme. Gjennom dens heparinbindende motiv forhindrer den de angiogene faktorene FGF-2 og VEFG165 fra å binde til deres reseptorer. Den utøver også sine effekter gjennom en reseptormediert prosess. Reseptoren for IP-10, CXCR3, blir alternativt splicet for å produsere de to kjente variasjonene CXCR3A og CXCR3B. IP-10 binding til CXCR3A-reseptoren fører til proliferasjon og kjemotaksi av målcellen, mens binding av IP-10 til CXCR3B-reseptoren har den motsatte effekten av hemning av vekst og kjemotaksi. Det er gjennom CXCR3B-reseptoren at IP-10 virker som en angiostatisk faktor (Lasagni et al. (2003) J. Exp. Med.197:1537-1549).
I betraktning av det foregående, kan anti-IP-10-antistoffene ifølge oppfinnelsen anvendes ved behandling av sykdommer som krever angiogenese for eksempel hvor den angiostatiske adferden av IP-10 forsinker eller forhindrer leging og forverrer sykdomsprosessen. Slike sykdommer omfatter: 1) avvikende fysiologisk neovaskularisering, som kan påvirke sårheling, den kvinnelig brunstsyklus, graviditet, treningsindusert hypertrofi og lignende; 2) indikasjoner som kan kreve stimulering av neovaskularisering, omfattende induksjon av kollateral kardannelse (omfattende myokardial iskemi, perifert iskemi, cerebral iskemi), koronararteriesykdom, perifer vaskulær sykdom, slag, sårheling, engraftment etter organtransplantasjon slik som øycelletransplantasjon, brudd og sene reparasjon, rekonstruktiv kirurgi, vevskonstruksjon, restenose, hårtap, dekubitus og stasis sår, gastrointestinale sår, placentainsufficiens, aseptisk nekrose, pulmonal og systemisk hypertensjon, vaskulær demens, Alzheimers sykdom, cerebral autosomal dominant arteriopati med subkortikale infarkter og leukoencefalopati (CADASIL); thyroid psuedocyste og lymfødem; og 3) indikasjoner som kan kreve vaskulær remodellering, omfattende vaskulære misdannelser, psoriasis og preeklampsi. Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre angiogenese-induserende midler.
P. Inflammatorisk nyresykdom
CXCR3-reseptoren er angitt å uttrykkes ved mesangialceller hos pasienter med IgA-nefropati, memranoproliferativ glomerulonefritt eller hurtig progressiv glomerulonefritt (Romagnani, P. et al. (1999) J. Am. Soc. Nephrol.10:2518-2526). Videre ble, i en musemodell av nefrotoksisk nefritt, IP-10 mRNA-nivåer øket seks ganger i cortex i nefritt-nyrer 7 dager etter induksjon av nefritt (Schadde, E. et al. (2000) Nephrol. Dial. Transplant. 15:1046-1053). Ytterligere ble høye nivåer av IP-10-ekspresjon observert i nyre biopsiprøver fra humane pasienter med glomerulonefritt sammenlignet med normale nyrer (Romagnani, P. et al. (2002) J. Am. Soc. Nephrol.13:53-64). Følgelig kan anti-IP-10-antistoffene ifølge oppfinnelsen anvendes ved behandling av inflammatorisk nyresykdom, omfattende IgA-nefropati, memranoproliferativ glomerulonefritt og hurtig progressiv glomerulonefritt. Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre midler eller behandlinger anvendt ved behandling av glomerulonefritt, slik som antibiotika, diuretika, medisinsk behandling ved høyt blodtrykk og dialyse.
Q. Aterosklerose
IP-10 er vist å være en mitogen og kjemotaktisk faktor for vaskulær glattmuskel, som er viktige trekk for glattmuskelceller for deres bidrag til patogenesen av aterosklerose (Wang, X. et al. (1996) J. Biol. Chem.271:24286-24293). IP-10 har også blitt vist å induseres i glattmuskelceller etter behandling med LPS eller interferon gamma og ble også indusert i karotidarterie hos rotte etter ballongangioplasti (Wang, X. et al. (1996) supra). Videre er IP-10 vist å uttrykkes i aterom-assosierte endotelceller, glattmuskelceller og makrofager, hvilket indikerer en funksjon for IP-10 ved rekruttering og bibehold av aktiverte T-celler som er observert i lesjoner i vaskulær vegg under aterogenese (Mach, F. et al. (1999) J. Clin. Invest. 104:1041-1050). Følgelig kan anti-IP-10-antistoffene ifølge oppfinnelsen anvendes for behandling eller forebygging av aterosklerose. Antistoffene kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre midler eller behandlinger anvendt ved behandling av aterosklerose, slik som medisiner mot høyt blodtrykk og kolesterolsenkende medikamenter.
R. Virale infeksjoner
IP-10 kan være oppregulert ved forskjellige virale infeksjoner og ha en fordelaktig funksjon ved rekruttering av aktiverte T-celler for å bekjempe den virale infeksjonen. I visse tilfeller kan imidlertid produksjon av IP-10 under viral infeksjon føre til skadelige effekter og følgelig kan IP-10-aktiviteten være uønsket og det kan være ønskelig å hemme IP-10-aktivitet ved slike virale infeksjoner ved anvendelse av et anti-IP-10-antistoff ifølge oppfinnelsen.
For eksempel har IP-10 blitt vist å stimulere replikasjon av humant immunsviktvirus (HIV) i monocyttavledede makrofager og perifere blodlymfocytter (Lane, B.R. et al. (2003) Virology 307:122-134). Videre er IP-10-nivåer forhøyet i cerebrospinalvæske og hjerne hos HIV-infiserte pasienter og i sentralnervesystemet hos HIV gp120-transgene mus (Asensio, V.C. et al. (2001) J. Virol.75:7067-7077).
IP-10-nivåer også er vist å være forhøyet hos pasienter med kronisk vedvarende hepatitt C virus (HCV) og hos pasienter med kronisk aktiv hepatitt (Narumi, S. et al.
(1997) J. Immunol.158:5536-5544). I HCV-infisert lever, ble IP-10 vist å uttrykkes av hepatocytter men ikke av andre celletyper i leveren og en betydelig høyere proporsjon av CXCR3-positive T-celler ble funnet i leveren sammenlignet med blod (Harvey, C.E. et al. (2003) J. Leukoc. Biol.74:360-369).
Øket sekresjon av IP-10 er vist å være forbundet med den inflammatoriske responsen til akutt okulær herpes simplex virus type I (HSV-1)-infeksjon hos mus og behandling av HSV-1-infiserte mus med anti-IP-10-antistoffer ble vist å redusere mononukleær celleinfiltrasjon inn i corneal stroma, redusere corneapatologi og hemme progresjon av viruset fra corneal stroma til retina under akutt infeksjon (Carr, D.J. et al. (2003) J. Virol.77:10037-10046).
IP-10 ekspresjon har også blitt vist å uttrykkes ved viral meningitt. IP-10 ble vist å være til stede i CSF hos pasienter med viral meningitt og å være ansvarlig for kjemotaktisk aktivitet i nøytrofiler, perifert blod mononukleære celler og aktiverte T-celler (Lahrtz, F. et al. (1997) Eur. J. Immunol.27:2484-2489; Lahrtz, F. et al. (1998) J. Neuroimmunol.
85:33-43).
I betraktning av det foregående, kan anti-IP-10-antistoffene ifølge oppfinnelsen anvendes ved behandling av virale infeksjoner som omfatter uønsket IP-10-aktivitet ved å administrere antistoffet til et subjekt med behov for behandling. Ikke-begrensende eksempler på virale infeksjoner som kan behandles omfatter HIV (f. eks., HIV-indusert encefalitt), HCV, HSV-1, viral meningitt og alvorlig akutt luftveissyndrom (SARS).
Antistoffet kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre antivirale midler, slik som, for HIV-infeksjon, nukleosid/nukleotid revers transkriptase-inhibitorer, ikke-nukleosid revers transkriptase-inhibitorer og/eller proteaseinhibitorer (og kombinasjoner derav), for HCV-infeksjon, interferon alfa 2a, pegylert interferon alfa 2a og/eller ribavirin og for HSV-1-infeksjon, acyklovir, valacyklovir og/eller famciclovir.
S. Bakterieinfeksjoner.
Bakterieinfeksjoner induserer IP-10-produksjon i affekterte celler (se Gasper, N.A. et al. (2002) Infect Immun.70:4075-82.) Bakteriell meningitt er også spesielt kjent å fremkalle IP-10-ekspresjon (Lapinet, J.A. et al. (2000) Infect Immun.68:6917-23). IP-10 blir også produsert av testikkel-somatiske celler i seminiferøse tubuli, i en bakterieinfeksjonsmodell, hvilket sterkt indikerer en sannsynlig rolle for disse kjemokinene i akkumulering av nøytrofiler og T-lymfocytter under inflammasjon i testiklene, hvilket klassisk observeres i patogenesen av bakterieinfeksjoner (Aubry, F. et al. (2000) Eur Cytokine Netw.11:690-8).
I betraktning av det foregående, kan anti-IP-10-antistoffene ifølge oppfinnelsen anvendes ved behandling av bakterieinfeksjoner som omfatter uønsket IP-10-aktivitet ved å administrere antistoffet til et subjekt med behov for behandling. Eksempler på bakterieinfeksjoner omfatter, men er ikke begrenset til, bakteriell meningitt og bakteriell pneumoni. Antistoffet kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre antibakterielle midler, slik som antibiotika.
Foreliggende oppfinnelse illustreres ytterligere ved de følgende eksemplene
Eksempel 1: Fremstilling av humane monoklonale antistoffer mot IP-10
Antigen
Renset rekombinant human IP10 avledet fra E.coli (PeproTech, Inc., Kat. nummer: 300-12) eller renset rekombinant human IP10 konjugert til keyhole limpet hemocyanin (KLH), ble anvendt som antigenet
Transgene HuMab og KM Mus
Fullstendige humane monoklonale antistoffer mot IP10 ble fremstilt ved anvendelse av HCo7, HCo12 og HCo17-stammer av HuMab transgene mus og KM-stammen fra transgene transchromosom mus som hver uttrykker humane antistoffgener. I hver av disse musestammene, er det endogene mus kappa lett kjede-genet homozygot avbrutt som beskrevet i Chen et al. (1993) EMBO J.12:811-820 og det endogene mus tung kjede genet er homozygot avbrutt som beskrevet i Eksempel 1 i PCT-publikasjon WO 01/09187. Hver av disse musestammene bærer et humant kappa lett kjede transgen, KCo5, som beskrevet i Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. HCo7-stammen bærer HCo7 humant tung kjede transgenet som beskrevet i U.S. patenter nr.5,545,806; 5,625,825; og 5,545,807. HCo12-stammen bærer HCo12 human tung kjede-transgenet som beskrevet i Eksempel 2 i PCT-publikasjon WO 01/09187. HCo17-stammen bærer HCo17 human tung kjede-transgenet som beskrevet i Eksempel 8 nedenfor. KM-stammen inneholder SC20 transchromosom som beskrevet i PCT-publikasjon WO 02/43478.
HuMab og KM-immuniseringer:
For å fremstille fullstendige humane monoklonale antistoffer mot IP10, ble HuMab-mus og KM-mus immunisert med renset rekombinant IP10 avledet fra E.coli eller IP10-KLH konjugat som antigen. Generelle immuniseringsplaner for HuMab-mus er beskrevet i Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 og PCT-publikasjon WO 98/24884. Musenene var 6-16 uker gamle ved den første infusjonen av antigen. En renset rekombinant fremstilling (5-50 µg) av IP10-antigen (f. eks., renset fra transfekterte E. coli-celler som uttrykker IP10) ble anvendt for å immunisere HuMab-musene og KM-musene intraperitonealt, subkutant (Sc) eller via footpad injeksjon.
Transgene mus ble immunisert to ganger med antigen i complete Freund’s adjuvant eller Ribi adjuvans enten intraperitonealt (IP), subkutant (Sc) eller via footpad (FP), etterfulgt av 3-21 dager IP, Sc eller FP-immunisering (opptil totalt 11 immuniseringer) med antigenet i uncomplete Freund’s eller Ribi-adjuvans. Immunresponsen ble overvåket ved retroorbitale tappinger. Plasmaet ble screenet ved ELISA (som beskrevet nedenfor) og mus med tilstrekkelig titere av anti-IP10 humant immunglobulin ble anvendt for fusjoner. Mus ble boostet intravenøst med antigen 3 og 2 dager før avliving og fjerning av milten. Typisk ble 10-35 fusjoner utført for hvert antigen. Flere dusin mus ble immunisert for hvert antigen. Totalt ble 82 mus av HCo7, HCo12, HCo17 og KM musestammer immunisert med IP10.
Seleksjon av HuMab eller KM-mus som produserer anti-IP10-antistoffer:
For å selektere HuMab eller KM-mus som produserer antistoffer som binder IP10, ble sera fra immuniserte mus testet ved ELISA som beskrevet av Fishwild, D. et al. (1996). I korthet ble mikrotiterplater belagt med renset rekombinant IP10 fra E. coli ved 1-2 µg /ml i PBS, 50 µl/brønner inkubert 4 ºC natten over og deretter blokkert med 200 µl/brønn med 5% kyllingserum i PBS/Tween (0,05%). Fortynninger av plasma fra IP10-immuniserte mus ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 1-2 timer ved omgivelsestemperatur. Platene ble vasket med PBS/Tween og deretter inkubert med et geit-anti-human IgG Fc polyklonalt antistoff konjugert med pepperrot peroksydase (HRP) i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking ble platene utviklet med ABTS-substrat (Sigma, A-1888, 0,22 mg/ml) og analysert ved spektrofotometer ved OD 415-495. Mus som utviklet de høyeste titere av anti-IP10-antistoffer ble anvendt for fusjoner. Fusjoner ble utført som beskrevet nedenfor og hybridom supernatanter ble testet for anti-IP10-aktivitet ved ELISA.
Fremstilling av hybridomer som produserer humane monoklonale antistoffer mot IP10: Mus-splenocyttene, isolert fra HuMab-mus og KM-mus, ble fusjonert med PEG til en mus myelom-cellelinje basert på standard protokoller. De resulterende hybridomene ble deretter screenet for fremstilling av antigenspesifikke antistoffer. Enkeltcellesuspensjoner av milt lymfocytter fra immuniserte mus ble fusjonert til en fjerdedel av antallet SP2/0 ikke-sekreterende mus myelomceller (ATCC, CRL 1581) med 50% PEG (Sigma). Celler ble platet ut ved omtrent 1x10<5>/brønn i flatbunnet mikrotiterplate, etterfulgt av inkubering i omtrent to uker i selektivt medium inneholdende 10% føtalt bovint serum, 10% P388D1 (ATCC, CRL TIB-63) kondisjonert medium, 3-5% origen (IGEN) i DMEM (Mediatech, CRL 10013, med høy glukose, L-glutamin og natriumpyruvat) samt 5 mM HEPES, 0,055 mM 2-merkaptoetanol, 50 mg/ml gentamycin og 1x HAT (Sigma, CRL P-7185). Etter 1-2 uker ble celler dyrket i medium hvor HAT ble erstattet med HT. Individuelle brønner ble deretter screenet ved ELISA (beskrevet ovenfor) for humane anti-IP10 monoklonale IgG-antistoffer. Straks omfattende hybridom vekst oppsto, ble medium overvåket vanligvis etter 10-14 dager. De antistoff-sekreterende hybridomene ble platet ut på nytt, screenet igjen og, dersom fortsatt positive for human IgG, ble anti-IP10 monoklonale antistoffer subklonet minst to ganger med ”begrensende fortynning”. De stabile subklonene ble deretter dyrket in vitro for å fremstille små mengder av antistoff i vevskulturmedium for ytterligere karakterisering.
Hybridom klonene 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 og 13C4 ble selektert for videre analyse.
Eksempel 2: Strukturell karakterisering av humane monoklonale antistoffer mot IP-10
cDNA-sekvensene som koder for de tung og lett kjede variable regionene av de monoklonale antistoffene 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 og 13C4 ble oppnådd fra de tilsvarende hybridomene ved anvendelse av standard PCR-teknikker og ble sekvensert ved anvendelse av standard DNA-sekvenseringsteknikker. I tilfeller hvor DNA-sekvensering alene ikke var tilstrekkelig til å bestemme antistoffstrukturen entydig, ble også proteinanalyse (f. eks., N-terminal aminosyreanalyse og massespektroskopi) utført og resultatene sammenlignet med DNA-sekvensanalyse for derved å bestemme den korrekte antistoffstrukturen. Resultatene av den strukturelle analysen er som følger:
Nukleotid og aminosyresekvensene av tung kjede variabel region av 1D4 er vist i Figur 1A og i SEKV ID NR: 99 og 35, henholdsvis. Nukleotid og aminosyresekvensene av lett kjede variabel region av 1D4 er vist i Figur 1B og i SEKV ID NR: 110 og 84, henholdsvis.
Nukleotid og aminosyresekvensene av tung kjede variabel region av 1E1 er vist i Figur 2A og i SEKV ID NR: 100 og 36, henholdsvis. Nukleotid og aminosyresekvensene av lett kjede variabel region av 1E1 er vist i Figur 2B og i SEKV ID NR: 111 og 85, henholdsvis.
Nukleotid og aminosyresekvensene av tung kjede variabel region av 2G1 er vist i Figur 3A og i SEKV ID NR: 101 og 37, henholdsvis. Nukleotid og aminosyresekvensene av lett kjede variabel region av 2G1 er vist i Figur 3B og i SEKV ID NR: 112 og 86, henholdsvis.
Nukleotid og aminosyresekvensene av tung kjede variabel region av 3C4 er vist i Figur 4A og i SEKV ID NR: 102 og 38, henholdsvis. Nukleotid og aminosyresekvensene av lett kjede variabel region av 3C4 er vist i Figur 4B og i SEKV ID NR: 113 og 87, henholdsvis.
Nukleotid og aminosyresekvensene av tung kjede variabel region av 6A5 er vist i Figur 5A og i SEKV ID NR: 103 og 39, henholdsvis. Nukleotid og aminosyresekvensene av lett kjede variabel region av 6A5 er vist i Figur 5B og i SEKV ID NR: 114 og 88, henholdsvis.
Nukleotid og aminosyresekvensene av tung kjede variabel region av 6A8 er vist i Figur 6A og i SEKV ID NR: 104 og 40, henholdsvis. Nukleotid og aminosyresekvensene av lett kjede variabel region av 6A8 er vist i Figur 6B og i SEKV ID NR: 115 og 89, henholdsvis.
Nukleotid og aminosyresekvensene av tung kjede variabel region av 6B10 er vist i Figur 7A og i SEKV ID NR: 105 og 41, henholdsvis. Nukleotid og aminosyresekvensene av lett kjede variabel region av 6B10 er vist i Figur 7B og i SEKV ID NR: 116 og 90, henholdsvis.
Nukleotid og aminosyresekvensene av tung kjede variabel region av 7C10 er vist i Figur 8A og i SEKV ID NR: 106 og 42, henholdsvis. Nukleotid og aminosyresekvensene av lett kjede variabel region av 7C10 er vist i Figur 8B og i SEKV ID NR: 117 og 91, henholdsvis.
Nukleotid og aminosyresekvensene av tung kjede variabel region av 8F6 er vist i Figur 9A og i SEKV ID NR: 107 og 43, henholdsvis. Nukleotid og aminosyresekvensene av lett kjede variabel region av 8F6 er vist i Figur 9B og i SEKV ID NR: 118 og 92, henholdsvis.
Nukleotid og aminosyresekvensene av tung kjede variabel region av 10A12 er vist i Figur 10A og i SEKV ID NR: 108 og 44, henholdsvis. Nukleotid og aminosyresekvensene av lett kjede variabel region av 10A12 er vist i Figur 10B og i SEKV ID NR: 119 og 93, henholdsvis.
Nukleotid og aminosyresekvensene av tung kjede variabel region av 13C4 er vist i Figur 11A og i SEKV ID NR: 109 og 46, henholdsvis. Nukleotid og aminosyresekvensene av lett kjede variabel region av 13C4 er vist i Figur 11B og i SEKV ID NR: 120 og 94, henholdsvis.
Sammenligning av 1D4, 1E1, 2G1, 6A5, 6A8, 7C10 og 10A12 tung kjede immunglobulinsekvensene med de kjente human kjønnscelle immunglobulin tung kjede sekvensene viste at disse antistoff tunge kjedene anvender et VH-segment fra human kjønnscelle VH3-33. Sammenstilling av 1D4, 1E1, 2G1, 6A5, 6A8, 7C10 og 10A12 VH-sekvensene av kjønnscelle VH3-33-sekvensen (SEKV ID NR: 47) er vist i Figur 12.
Ytterligere analyse av 1D4, 1E1, 2G1, 6A5, 6A8, 7C10 og 10A12 VH-sekvensene ved anvendelse av Kabat-systemet for CDR region-bestemmelse førte til beskrivelse av tung kjede CDR1, CDR2 og CD3-regionene som vist i Figurene 1A, 2A, 3A, 5A, 6A, 8A og 10A, henholdsvis.
Sammenligning av 6B10 og 8F6 tung kjede immunglobulinsekvensene med de kjente humane kjønnscelle immunglobulin tung kjede-sekvensene viste at disse antistoff tunge kjedene anvender et VH-segment fra human kjønnscelle VH3-30,3. Sammenstilling av 6B10 og 8F6 VH-sekvensene med kjønnscelle VH3-33-sekvens (SEKV ID NR: 48) er vist i Figur 13. Videre analyse av 6B10 og 8F6 VH-sekvensene ved anvendelse av Kabatsystemet for CDR region-bestemmelse førte til beskrivelse av tung kjede CDR1, CDR2 og CD3-regionene som vist i Figurene 7A og 9A, henholdsvis.
Sammenligning av 3C4 tung kjede immunglobulinsekvensen med de kjente humane kjønnscelle immunglobulin tung kjede-sekvensene viste at denne antistoff tunge kjeden anvender et VH-segment fra human kjønnscelle VH5-51. Sammenstilling av 3C4 VH-sekvens med kjønnscelle VH5-51-sekvensen (SEKV ID NR: 49) er vist i Figur 14. Videre analyse av 3C4 VH-sekvensen ved anvendelse av Kabat-systemet for CDR regionbestemmelse førte til beskrivelse av tung kjede CDR1, CDR2 og CD3-regionene som vist i Figur 4A.
Sammenligning av 13C4 tung kjede immunglobulinsekvensen med de kjente humane kjønnscelle immunglobulin tung kjede-sekvensene viste at denne antistoff tunge kjeden anvender et VH-segment fra human kjønnscelle VH4-61. Sammenstilling av 13C4 VH-sekvensen med kjønnscelle VH4-61-sekvensen (SEKV ID NR: 50) er vist i Figur 15. Videre analyse av 13C4 VH-sekvens ved anvendelse av Kabat-systemet for CDR regionbestemmelse førte til beskrivelse av den tunge kjeden av CDR1, CDR2 og CD3-regionene som vist i Figur 11A.
Sammenligning av 1D4, 2G1, 6A5, 6A8, 10A12 og 13C4 lett kjede immunglobulin sekvensene med de kjente humane kjønnscelle immunglobulin lett kjede-sekvensene viste at disse antistoff lette kjedene anvender et VL-segment fra human kjønnscelle VkA27. Sammenstilling av 1D4, 2G1, 6A5, 6A8, 10A12 og 13C4 VL-sekvenser med kjønnscelle VKA27-sekvensen (SEKV ID NR: 95) er vist i Figur 16. Ytterligere analyse av 1D4, 2G1, 6A5, 6A8, 10A12 og 13C4 VL-sekvensene ved anvendelse av Kabat-systemet for CDR region-bestemmelse førte til beskrivelse av lett kjede CDR1, CDR2 og CD3-regionene som vist i Figurene 1B, 3B, 5B, 6B, 10B og 11B, henholdsvis.
Sammenligning av 1E1, 6B10 og 8F6 lett kjede immunglobulinsekvensene med de kjente humane kjønnscelle immunglobulin lett kjede-sekvensene viste at disse antistoff lette kjedene anvender et VL-segment fra human kjønnscelle VkL6. Sammenstilling av 1E1, 6B10 og 8F6 VL-sekvensene med kjønnscelle VKL6-sekvensen (SEKV ID NR: 96) er vist i Figur 17. Videre analyse av 1E1, 6B10 og 8F6 VL-sekvensene ved anvendelse av Kabat-systemet for CDR region-bestemmelse førte til beskrivelse av lett kjede CDR1, CDR2 og CD3-regionene som vist i Figurene 2B, 7B og 9B, henholdsvis.
Sammenligning av 3C4 lett kjede immunglobulinsekvensen med de kjente humane kjønnscelle immunglobulin lett kjede-sekvensene viste at 3C4 lett kjede anvender et VL-segment fra human kjønnscelle VkL18. Sammenstilling av 3C4 VL-sekvensen med kjønnscelle VkL18-sekvens (SEKV ID NR: 97) er vist i Figur 18. Videre analyse av 3C4 VL-sekvensen ved anvendelse av Kabat-systemet for CDR region-bestemmelse førte til beskrivelse av lett kjede CDR1, CDR2 og CD3-regionene som vist i Figur 4B.
Sammenligning av 7C10 lett kjede immunglobulinsekvensen med de kjente humane kjønnscelle immunglobulin lett kjede-sekvensene viste at 7C10 lett kjede anvender et VL-segment fra human kjønnscelle VkL15. Sammenstilling av 7C10 VL-sekvensen med kjønnscelle VkL15-sekvensen (SEKV ID NR: 98) er vist i Figur 19. Videre analyse av 7C10 VL-sekvensen ved anvendelse av Kabat-systemet for CDR region-bestemmelse førte til beskrivelse av lett kjede CDR1, CDR2 og CD3-regionene som vist i Figur 8B.
Eksempel 3: Karakterisering av bindingsspesifisitet og bindingskinetikk for anti-IP-10 humane monoklonale antistoffer
I dette eksemplet ble bindingsaffinitet, bindingskinetikk og bindingsspesifisitet for anti-IP-10-antistoffer undersøkt ved Biacore analyse. Bindingsspesifisitet og kryss konkurranse ble også undersøkt ved ELISA.
Biacore analyse
Anti-IP-10-antistoffer ble karakterisert for affiniteter og bindingskinetikk ved Biacore analyse (Biacore AB, Uppsala, Sverige). E. coli-uttrykt, renset rekombinant humant IP-10 (R& D Systems) ble koblet til CM5 sensor chip ved 97 RU ved anvendelse av EDC/NHS koblingsmetoden gitt av Biacore AB. Binding ble målt ved strøming av antistoffet i HBS EP-buffer (gitt ved Biacore AB) i konsentrasjoner fra 33-267 nM ved en strømningshastighet på 40 μl/min. Antigen-antistoff assosiasjonskinetikken ble fulgt i 5 minutter og dissosiasjonskinetikken ble fulgt i 8 minutter. Assosiasjons- og dissosiasjonskurver ble tilpasset til en 1:1 Langmuir bindingsmodell ved anvendelse av BIAevaluation programvare (Biacore AB). Data svarende til de innledende dusin sekunder for assosiasjon og dissosiasjonsfaser alene ble betraktet for kurvetilpasning for å begrense effekten av aviditet. Forsøkene ble utført ved både 25ºC og 37º C. KD, konog koff-verdier som ble bestemt er vist i Tabell 1 for binding ved 25º C og i Tabell 2 for binding ved 37º C:
Tabell 1: Karakterisering av binding ved 25º C med human IP-10
* 6A5 Batch 2 er en uavhengig prøve av renset antistoff fra 6A5-hybridomsupernatanten sammenlignet med prøve 6A5.
Tabell 2: Karakterisering av binding ved 37º C med human IP-10
Halveringstiden for antistoffene (i timer), som definert ved tiden tatt for dissosiasjon av halvparten av antistoff-antigen-komplekset under dissosiasjonsfasen, ble målt ved 25ºC og 37º C. Verdiene ble bestemt ved utvidelse av dissosiering kurvene for å få tiden som er nødvendig for 50% reduksjon av Y-aksen for dissosiasjons-sensogrammet. Resultatene er vist nedenfor i Tabell 3:
Tabell 3: Halveringstid for antistoffer ved 25º C og 37º C
Kryssreaktivitet av antistoffene, ved 25º C, med rhesusape IP-10, human MIG, human ITAC og mus IP-10 ble bestemt ved Biacore analyse ved anvendelse av samme metoder som beskrevet ovenfor for human IP-10. Human MIG, human IP-10 og mus IP-10 ble oppnådd kommersielt (PeproTech, Rocky Hill, NJ), mens rhesusape IP-10 ble fremstilt ved rekombinant ekspresjon og renset ved standardmetoder. Antigenene ble konjugert til CM5 sensor chip ved 140 RUs (rhesusape IP-10), 457 RUs (human MIG), 206 RUs (human ITAC) og 150 RUs (mus IP-10). Assosiering sensogrammer ble oppnådd ved strøming av antistoffer i HBS EP-buffer i en konsentrasjon på 133 nM i 5 minutter.
Strømmen ble deretter stanset og dissosiasjon ble overvåket i 5 minutter. Assosiasjon og dissosiasjonskurvene ble tilpasset til en Langmuir bindingsmodell ved anvendelse av BIAevaluation programvare (Biacore AB). Resultatene av kryssreaktivitetsforsøket er oppsummert nedenfor i Tabell 4:
Tabell 4: Anti-IP-10 kryssreaktivitet med forskjellige CXCR3-ligander
ELISA-analyse
Ytterligere forsøk ble utført ved anvendelse av en ELISA-analyse for å undersøke antigen kryssreaktiviteten av anti-IP-10-antistoffene for human MIG, rhesusape IP-10 eller mus IP-10. Metodene anvendt for ELISA var som beskrevet ovenfor i Eksempel 1 bortsett fra at mikrotiterplatene ble belagt med 1 μg/ml enten rekombinant human IP-10, human MIG (PeproTech, kat. nr.300-26), mus IP-10 (PeproTech, katt. nr 250-16) eller rekombinant rhesusape IP-10. Resultatene, uttrykt som EC50-verdier (i ng/ml) er oppsummert nedenfor i Tabell 5:
Tabell 5: Anti-IP-10 Kryssreaktivitet ved ELISA med forskjellige CXCR3-ligander
Kryss konkurranse-studier mellom de forskjellige anti-IP-10-antistoffene ble også utført ved ELISA ved anvendelse av biotinylerte former av 6A5 og 2G1 for å bestemme hvorvidt antistoffene gjenkjenner forskjellig epitoper på IP-10. Metoden for konkurranse ELISA’er var lik ELISA’en beskrevet ovenfor i Eksempel 1. I korthet ble mikrotiterplater belagt med renset rekombinant IP-10 fra E. coli ved 0,2 µg /ml i PBS, 50 µl/brønn og inkubert 4 ºC natten over. Brønnene ble deretter blokkert med 200 µl/brønn av 5% kyllingserum i PBS/Tween (0,05%). Fortynninger av rensede humane anti-human IP-10-antistoffer (fra 2 μg/ml til 3,91 ng/ml) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 30 minutter ved omgivelsestemperatur. Platene ble vasket med PBS/Tween og deretter inkubert med 0,1 μg/ml biotin-6A5 eller biotin-2G1 i 30 minutter. Platene ble deretter vasket tre ganger med PBS/Tween. Etter vasking ble fosfatasemerket streptavidin (KPL, Kat nr: 15-30-00) tilsatt ved 1:2000 fortynning i 5% kyllingserum til hver brønn og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking ble platene utviklet med p-NPP-substrat (Moss, Inc, lot 10274021) og analysert ved spektrofotometer ved OD 405. Som forventet kunne umerket 2G1 konkurrere med biotin-2 G1 om binding til IP-10 og, videre, var umerket 6A5, 7C10, 10A12, 10A12S, 6B10, 8F6 og 1D4 hver i stand til konkurrerende binding av biotin-2G1 til human IP-10. Tilsvarende kunne umerket 6A5 konkurrere med biotin-6A5 om binding til IP-10 og, videre, var umerket 2G1, 7C10, 10A12, 10A12S, 6B10, 8F6 og 1D4 hver i stand til konkurrerende bindingen av biotin-6A5 til human IP-10. Disse resultatene indikerer at hvert av disse antistoffene har en bindingsspesifisitet for samme epitop (eller epitopgruppe) av human IP-10.
Eksempel 4: Hemning av IP-10-binding til CXCR3
I dette eksemplet ble evnen for anti-IP-10-antistoffer til å hemme bindingen av human IP-10 til dens reseptor, CXCR3, på reseptor-uttrykkende celler undersøkt. Først ble en Scatchard-analyse utført for<125>I-IP-10-binding til 300,19 celler transfektert til å uttrykke CXCR3. Cellene ble dyrket i RPMI-medium inneholdende 10% FCS og G418 seleksjon. Før anvendelse ble cellene vasket to ganger med Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) ved 4º C og justert til 4 x 10<7>celler/ml. Glassfiberplater (Millipore MultiScreen®, Kat. nr. MAFBN0B50) ble blokkert med 200 μl av en 0,1% polyetyleniminløsning én dag før forsøket. På dagen for undersøkelsen, ble blokkeringsbufferen aspirert ved anvendelse av en Millipore manifold. Platene ble vasket tre ganger med 200 μl bindingsbuffer (50 mM HEPES, pH 7,2, 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, 0,5% BSA). Tjuefem mikroliter bindingsbuffer ble tilsatt til hver brønn fulgt av enten 25 μl av 1000 ganger overskudd av umerket IP-10 eller bindingsbuffer. Tjuefem mikroliter<125>I-IP-10 (Amersham, Kat. nr. IM332-25 μCi) ved økende konsentrasjoner ble tilsatt, fulgt av 25 μl celler med en tetthet på 1 x 10<6>celler pr. brønn. Platene ble inkubert på en platerister i 60 minutter ved romtemperatur og vasket tre ganger med vaskebuffer (10 mM HEPES, pH 7,2, 0,5 M NaCl, 0,5% BSA) ved et volum på 200 μl pr. vask. Platene ble tørket, 25 μl scintillant ble tilsatt og platene ble tellet på en Wallac Mikrobeta Counter. Data ble analysert ved anvendelse av Prisme programvare og en KDble beregnet. En gjennomsnittlig KDpå 0,231 nM ble bestemt for reseptorbinding.
Deretter ble anti-IP-10 antistoffenes evne til å hemme bindingen av 100 pM<125>I-hIP-10 til de CXCR3-uttrykkende cellene undersøkt. Konkurranse forsøk ble utført på lignende måte som forsøket beskrevet ovenfor. I korthet ble 25 μl bindingsbuffer tilsatt til glassfiber filterplatene, fulgt av 25 μl av økende konsentrasjoner av anti-IP-10-antistoffer. Tjuefem mikroliter<125>I-IP-10 ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 0,100 nM. Til sist ble 25 μl celler med en tetthet på 1 x 10<6>celler pr. brønn tilsatt og platene ble inkubert i en platerister i 60 minutter ved romtemperatur, vasket og tellet som beskrevet ovenfor. EC50-verdier ble beregnet ved anvendelse av Prisme programvare. Ki-verdier (i nM) ble bestemt ved anvendelse av formelen:
Ki= EC50
1 [L]/KD
Resultatene er oppsummert nedenfor i Tabell 6:
Tabell 6: Hemning av IP-10-binding til CXCR3
Eksempel 5: Hemming av IP-10-indusert kalsiumstrøm
I dette eksemplet ble anti-IP-10-antistoffenes evne til å hemme IP-10-indusert kalsiumstrøm undersøkt ved anvendelse av enten 300,19 celler transfektert til å uttrykke CXCR3 eller anti-CD3 aktiverte humant perifert blod-lymfocytter (PBLs) som uttrykker CXCR3. For å fremstille PBL’ene, ble normalt humant blod renset ved standard Ficoll separering. De rensede humane PBL’ene ble stimulert ved å tilsette cellene til plater belagt med 3 μg/ml anti-CD3-antistoff og dyrket i RPMI med 10% FBS. Etter inkubasjon i tre dager ble cellene opprettholdt i vekstmedium inneholdende 500 U/ml IL-2. På dagen for undersøkelsen, ble cellene vasket og resuspendert i medium med en tethet på 2,5 x 10<7>celler/ml. De 300,19 cellene transfektert til å uttrykke CXCR3 ble dyrket i RPMI inneholdende 10% FBS. De 300,19 cellene ble resuspendert i vekstmedium ved 2 x 10<6>celler/ml.
For å utføre forsøket, ble 100 μl cellesuspensjon tilsatt til en svartsidet 96-brønners plate med klar bunn som var belagt med Poly-D-Lysin (Corning/Costar, kat. nr 3667) .100 mikroliter ”Calsium 3 kit loading dye” (FlexStation ™, Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA) ble tilsatt til hver brønn, platene ble spunnet ved 1100 RPM i 4 minutter og inkubert ved 37º C i 30 minutter. Ved anvendelse av en 96-brønners reagensplate, ble human IP-10 (Peprotech, kat. nr 300-12) fortynnet i Hank’s Balanced Salt Solution med 20 mM HEPES og 1% FBS (800 pM i 300,19 celler og 1200 pM for humane PBL’er).
Antistoffer ble seriefortynnet i reagensplatene inneholdende IP-10. Kontrollbrønner inneholdende kun buffer eller kun IP-10 ble inkludert. Tjueto mikroliter IP-10/antistoffløsning ble tilsatt pr. brønn til platene inneholdende cellene merket med farge og kalsiumstrøm ble bestemt ved å overvåke Kalsium 3-fluorescens ved anvendelse av FlexStation ™-instrumentet i henhold til produsentens instruksjoner, over en tidsperiode på 200 sekunder. Arealet under kurven (AUC) ble beregnet ved integrering av kalsiumstrømmen mellom 20-100 sekunder i henhold til standard metoder (se f. eks., Smart D. et al. (1999) Br. J. Pharmacol. 128:1-3). Dataene ble analysert ved anvendelse av Prisme ™ programvare (Molecular Devices, Inc.) og IC50-verdier (i nM) ble bestemt.
Resultatene er oppsummert nedenfor i Tabell 7:
Tabell 7: Hemning av IP-10-indusert kalsiumstrøm
Eksempel 6: Hemning av IP-10-indusert cellemigrering
Anti-IP-10-antistoffenes evne til å hemme cellemigrering indusert av IP-10 ble undersøkt i en in vitro kjemotaksi-analyse. I disse forsøkene ble CXCR3-uttrykkende 300,19 celler anvendt og ble stimulert med enten: (i) 100 ng/ml rekombinant human IP-10 (rhIP-10); (ii) supernatant av THP-1-celler stimulert med IFN gamma (som induserer sekresjon av native IP-10 og MIG), hvor THP-1-avledet IP-10 var i en konsentrasjon på 16 ng/ml og MIG-aktivitet ble blokkert ved tilsetning av anti-MIG (R&D Systems) ved 2,5 μg/ml; eller (iii) 100 ng/ml rekombinant rhesus makake IP-10 (rrmIP-10). Hemming av cellemigrering ble bedømt ved anvendelse av forskjellige konsentrasjoner av antistoffer og en kjemotaktisk indeks ble bestemt.
Spesielt ble hemming av kjemotaksi bedømt ved anvendelse av en standard 96-brønners plate-analyse (Multiscreen MIC-plater (Millipore)). Et 5μm filter ble anvendt for transfekterte cellelinjer; og 3μm filter ble anvendt for primære celler. Responderende celler (300,19 CXCR3+; MBP-spesifikke humane PBMC-celler) ble resuspendert i kjemotaksibuffer (RPMI 1% BSA eller FBS) ved 1x10<6>celler/ml.100 μl cellesuspensjon ble tilsatt til den øvre brønnen og ble inkubert i 30 minutter ved 37<o>C.5% CO2ble anvendt før tilsetning til den nederste brønnen.
Human og rhesus makake IP-10 ble fremstilt ved 100ng/ml; for THP-1-avledet IP-10, ble THP-1-celler stimulert med IFN-γ (0,2ng/ml) og supernatant ble oppsamlet; MS CSF-avledet IP-10 ble anvendt ublandet. Ligand ble fremstilt i 150µl kjemotaksi-buffer og plassert i det nedre kammeret.
For kjemotaksihemming-analyser ble ligand pre-inkubert med varierende konsentrasjoner av det angitte anti-IP-10-antistoffet (5μg/ml, 2,5μg/ml, 1,25μg/ml, 0,613μg/ml, 0,3μg/ml, 0,015μg/ml) i 30 minutter ved 37<o>C i 5% CO2 før analyse. Det øvre kammeret ble plassert over brønner og brønnene ble inkubert i 2 timer ved 37<o>C i 5% CO2. Ved slutten av inkuberingen, ble responerende celler aspirert fra det øvre kammeret. Den øvre kammeret ble forsiktig fjernet. Celler ble tellet i 4 tilfeldige felt/brønn ved 400x forstørrelse. Gjennomsnitt for data ble beregnet over tre brønner og presentert som en kjemotaksi indeks (dvs. ganger migrering i respons til ligand over media alene).
Resultatene, uttrykt som IC50-verdier, er oppsummert nedenfor i Tabell 8:
Tabell 8: Hemming av IP-10-indusert cellemigrering
Anti-IP-10 antistoffenes evne til å hemme CXCR3-uttrykkende 300,19 cellemigrering i respons til cerebrospinalvæske (CSF) fra pasienter med multippel sklerose (MS) ble også undersøkt. Igjen ble anti-MIG-antistoff ved 2,5 μg/ml tilsatt til CSF-prøven for å nøytralisere MIG-aktivitet. Resultatene fra to forsøk, uttrykt som IC50-verdier, er oppsummert nedenfor i Tabell 9:
Tabell 9: Hemming av MS-CSF-indusert cellemigrering
Cellemigreringsstudier ble også utført ved anvendelse av CXCR3-uttrykkende 300,19 celler og rekombinant human MIG (R&D Systems), ved 200 ng/ml, for å undersøke anti-IP-10 antistoffenes evne til å hemme MIG-indusert cellemigrering. Anti-IP-10 antistoffene 6B10, 8F6, 1D4, 6A5 batch 2, 10A12 og 10A12S ble individuelt testet ved 1 μg/ml og ble funnet å ikke hemme den MIG-induserte cellemigreringen.
Eksempel 7: Binding av antistoffer til hjernesnitt fra MS-pasienter
I dette eksemplet, ble anti-IP-10 antistoffenes evne til å farge hjernesnitt fra en pasient med multippel sklerose (MS) undersøkt. Hjernesnitt fra en 57 år gammel kvinnelig MS-pasient ble oppnådd 19,8 timer post-mortem og viste et uregelmessig formet periventrikulært plaque (1,3 cm x 1,0 cm) med en rekke ytterligere mindre plaque til stede gjennom hele den gjenværende hvite substansen. LFB-merking viste fullstendig demyelinering. Immunohistokjemi ble utført på snittene ved anvendelse av 6A5 (batch 2) og 10A12S anti-IP-10-antistoffene, så vel som anti-GFAP og anti-CD68, som positive kontroller og et negativt kontrollantistoff.
En standard immunohistokjemi-metode ble anvendt for anti-IP-10-merking av snittene. Snitt ble blokkert ved anvendelse av 2%-10% serum. 100 μl/snitt av primært antistoff (f. eks., 6A5) fortynnet 1:100 i 2% serum ble tilsatt, deretter inkubert 1 time ved romtemperatur. Eventuelt ble snitt inkubert over natten ved 4°C og vasket. Det sekundære anti-humane biotinylerte antistoffet (fortynnet i 2% serum (100 μl/snit)) ble deretter tilsatt og inkubert 30-60 minutter ved romtemperatur. Endogene peroksidaser ble fjernet ved tilsetning av fortynnet H202i MeOH. Deretter ble ABC Solution (Vector Labs) tilsatt, 100μl/snitt og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. DAB-substratløsning ble fremstilt umiddelbart før anvendelse. 100μl pr. snitt ble påført på slider før inkubering i mørke i 10-20 minutter (som nødvendig for utvikling). Slides ble deretter counterstained med Hematoxylin nuclear stain i 3 min (progress kontrollert etter 1 min). Til slutt ble slides inkubert i 2% natriumbikarbonat i 45 sekunder for å få frem fargen.
Resultatene viste at både 6A5 og 10A12S kunne binde til IP-10 in situ i hjernsnittene fra MS-pasienten, hvor 6A5-farging er mer intens enn 10A12S-farging.
Eksempel 8: Konstruksjon av HCo17-stamme av transgene mus
Den transgene musestammen HCo17 ble dannet ved koinjeksjon av den 80 kb insersjonen av pHC2 (Taylor et al. (1994) Int. Immunol., 6: 579-591), den 25 Kb insersjon av pVX6 og et ~460 kb gjær kunstig kromosom-fragment fra yIgH24-kromosomet. pHC2-konstruksjonen alene er fullt i stand til bli rearrangert in vivo for å danne funksjonelle human tung kjede immunglobulin loki; pVX6 og yIgH24 ble tilsatt for å bidra til ytterligere kjønnscelle VH-mangfold. De individuelle komponentene av DNA-blandingen anvendt for å fremstile HCo17 er beskrevet nedenfor.
pHC2-insersjonen beskrevet ovenfor inneholder fire funksjonelle humane kjønnscelle VH-gensegmenter: 1-69 (DP-10), 5-51 (DP-73), 4-34 (DP-63) og 3-30,3 (DP-46). I tillegg inneholder denne konstruksjonen også humane genomiske sekvenser omfattende 15 funksjonelle D-segmenter, alle 6 J-segmentene, så vel som μ og γ1 konstant region-segmenter og en funksjonell μ- γ1 switch region..
pVX6-insersjonen inneholder 3 humane kjønnscelle VH-segmenter, VH1-18 (DP-14), VH5-51 (DP-73) og VH3-23 (DP-47). Et 8,5 kb HindIII/SalI DNA-fragment, omfattende kjønnscelle human VH1-18 (DP-14)-genet, sammen med omtrent 2,5 kb av 5'-flankerende og 5 kb av 3' flankerende genomisk sekvens, ble subklonet inn i plasmidvektoren pSP72 (Promega, Madison, Wis.) for å danne plasmidet p343,7,16. Et 7 kb BamHI/HindIII DNA-fragment, omfattende kjønnscelle human VH5-51 (DP-73)-genet, sammen med omtrent 5 kb av 5' flankerende og 1 kb av 3' flankerende genomisk sekvens, ble klonet inn i den pBR322-baserte plasmid-kloningsvektoren pGP1f (Taylor et al. (1992) Nucleic Acids Res.20: 6287-6295), for å danne plasmidet p251f. En ny kloningsvektor avledet fra pGP1f , pGP1k, ble kløyvet med EcoRV/BamHI og ligert til et 10 kb EcoRV/BamHI DNA-fragment, omfattende kjønnscelle human VH3-23 (DP47)-genet, sammen med omtrent 4 kb av 5' flankerende og 5 kb av 3' flankerende genomisk sekvens. Det resulterende plasmidet, p112,2RR,7, ble kløyvet med BamHI/SalI og ligert med den 7 kb rensede BamHI/SalI-insersjonen av p251f. Det resulterende plasmidet, pVx4, ble kløyvet med XhoI og ligert med den 8,5 kb XhoI/SalI-insersjonen av p343,7,16. En klon ble oppnådd med VH1-18-genet i samme orientering som de andre to V-genene. Denne klonen, betegnet pVx6, ble deretter kløyvet med NotI for bearbeiding av insert.
”Yeast artificial chromosome” (”YAC”) yIgH24 ble opprinnelig identifisert ved PCR-screening ved anvendelse av VH3 og VH4-familiespesifikke primere og er kartlagt til det humane kromosom 14 ved VH-innhold. Det ble stadfestet at yIgH24 inneholder VH-segmenter omfattende medlemmer av VH-familiene VH1, VH2, VH3, VH4 og VH5 og spesielt i det minste VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH2-26, VH3-30, V 3-30,5, VH3-30,3, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH4-28, VH4-30, VH4-30,4, VH4-30,3, VH4-31, VH4-34, 4-39 og VH5-51.
Rensede inserts fra pVX6 (26 kb), pHC2 (80 kb) og yIgH24 (~460 kb) ble kombinert i et 1:1:1 molart forhold og mikroinjisert inn i pronuklei på en halv dag gamle (C57BL/6J x DBA/2J) F2-embryoer som beskrevet av Hogan et al. (B. Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, 2. Ed., 1994, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.). En grunnlegger (”founder”)-linje av transgene mus, omfattende sekvenser fra pVx6, HC2 og yIgH24, ble etablert fra mus som utviklet seg fra de injiserte embryoene. Denne linjen ble betegnet (HCo17) 25950.
(HCo17) 25950-linjen ble deretter frembrakt med mus omfattende CMD-mutasjonen (beskrevet i Eksempel 1 i PCT-publikasjon WO 01/09187), JKD-mutasjonen (Chen et al. (1993) EMBO J.12: 811-820) og (KCo5)9272-transgenet (Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851). Den resulterende musen uttrykker humane immunglobulin tung og kappa lett kjede transgener i en bakgrunn homozygot for splittelse av de endogene mus tung og kappa lett kjede loki.
OPPSUMMERING OF SEKVENSLISTER
SEKV ID NR: SEKVENS SEKV ID NR: SEKVENS

Claims (15)

Patentkrav
1. Isolert human monoklonalt antistoff eller en antigen-bindende del derav, k a r a k t e r i s e r t v e d a t antistoffet spesifikt bindes til human IP-10 og kryssreagerer ikke med human MIG og kryssreagerer ikke med human ITAC.
2. Antistoffet ifølge krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d a t det er et full-lengde antistoff av en IgG1 eller IgG4 isotype eller er et antistoffragment.
3. Antistoff eller antigen-bindende del ifølge krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d a t det omfatter en tungkjede variabel region som omfatter CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser og en lettkjede variabel region som omfatter CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser, idet:
(a) tungkjedevariable region CDR3 sekvensen omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR: 32 og lettkjedvariable region CDR3 sekvensen omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR: 81;
(b) tungkjedevariable region CDR3 sekvensen omfatter aminosyresekvensene ifølge SEKV ID NR: 24 og lettkjedevariable region CDR3 sekvensen omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR: 73; eller
(c) tungkjedevariable region CDR3 sekvensen omfatter aminosyresekvensene ifølge SEKV ID NR: 28 og lettkjedevariable region CDR3 sekvensen omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR: 77.
4. Antistoff eller antigen-bindende del ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 3, k a r a k t e r i s e r t v e d a t det omfatter:
(a) en tungkjede variabel region CDR1 omfattende SEKV ID NR: 9, en tungkjede variabel region CDR2 omfattende SEKV ID NR: 21, en tungkjede variabel region CDR3 omfattende SEKV ID NR: 32, en lettkjede variabel region CDR1 omfattende SEKV ID NR: 59, en lettkjede variabel region CDR2 omfattende SEKV ID NR: 70 og en lettkjede variabel region CDR3 omfattende SEKV ID NR: 81;
(b) en tungkjede variabel region CDR1 omfattende SEKV ID NR: 1, en tungkjede variabel region CDR2 omfattende SEKV ID NR: 13, en tungkjede variabel region CDR3 omfattende SEKV ID NR: 24, en lettkjede variabel region CDR1 omfattende SEKV ID NR: 51, en lettkjede variabel region CDR2 omfattende SEKV ID NR: 62 og en lettkjede variabel region CDR3 omfattende SEKV ID NR: 73; eller
(c) en tungkjede variabel region CDR1 omfattende SEKV ID NR: 5, en tungkjede variabel region CDR2 omfattende SEKV ID NR: 17, en tungkjede variabel region CDR3 omfattende SEKV ID NR: 28, en lettkjede variabel region CDR1 omfattende SEKV ID NR: 55, en lettkjede variabel region CDR2 omfattende SEKV ID NR: 66 og en lettkjede variabel region CDR3 omfattende SEKV ID NR: 77.
5. Antistoff eller antigen-bindende del ifølge krav 1 eller 2,
k a r a k t e r i s e r t v e d a t det konkurrerer for binding til IP-10 med antistoffet ifølge krav 4 eller som bindes til den samme epitopen på IP-10 som antistoffet ifølge krav 4.
6. Immunokonjugat, k a r a k t e r i s e r t v e d a t det omfatter antistoffet eller antigen-bindende del ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4 koblet til et terapeutisk middel så som et cytotoksin eller radioaktiv isotop.
7. Bispesifikt molekyl, k a r a k t e r i s e r t v e d a t det omfatter antistoffet eller den antigen-bindende delen ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, koblet til en andre funksjonell del som har en annen bindingsspesifisitet enn nevnte antistoff eller antigen-bindende del.
8. Sammensetning, k a r a k t e r i s e r t v e d a t den omfatter antistoffet eller antigen-bindende del ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, immunokonjugatet ifølge krav 6 eller bispesifikt molekyl ifølge krav 7, og en farmasøytisk akseptabel bærer.
9. Isolert nukleinsyremolekyl, k a r a k t e r i s e r t v e d a t det koder for antistoffet eller antigen-bindende del ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, eller en ekspresjonsvektor omfattende nevnte nukleinsyre, eller en vertscelle omfattende nevnte ekspresjonsvektor.
10. Transgen mus, k a r a k t e r i s e r t v e d a t den omfatter humane immunoglobulin tung og lettkjede transgener, idet musen uttrykker antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, eller en hybridom dannet fra nevnte mus hvor hybridomet produserer nevnte antistoff.
11. Antistoff eller antigen-bindende del ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4 for anvendelse i en metode for behandling av en inflammatorisk eller autoimmun sykdom.
12. Antistoff eller antigen-bindende del ifølge krav 11 for anvendelse i en metode for behandling ifølge krav 11, idet sykdommen er valgt fra multippel sklerose, revmatoid artritt, inflammatorisk tarmsykdom (f.eks. ulcerativ kolitt, Crohns sykdom), systemisk lupus erythematosus, Type I diabetes, inflammatoriske hudlidelser (f.eks. psoriasis, lichen planus), autoimmun thyroid sykdom (f.eks. Graves sykdom, Hashimotos thyroiditt), Sjøgrens syndrom, inflammasjon i lungene(f.eks. astma, kronisk obstruktiv lungesykdom, sarkoidose i lungene, lymfocytisk alveolitt), avstøtning av transplantat, ryggmargskade, hjerneskade (f.eks. slag), neurodegenerativ sykdom (f.eks. Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom), gingivitt, genterapi-indusert inflammasjon, angiogenesesykdom, inflammatorisk nyresykdom (f.eks. IgA nefropati, memranproliferativ glomerulonefritt, hurtig progressiv glomerulonefritt) og aterosklerose.
13. Antistoff eller antigen-bindende del ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4 for anvendelse i en metode for behandling av en viral eller bakteriell infeksjon som involverer uønsket IP-10 aktivitet.
14. Antistoff eller antigen-bindende del ifølge krav 13 for anvendelse i en metode for behandling ifølge krav 13, idet den virale infeksjonen er mediert av humant immunsviktvirus (HIV), hepatitt C virus (HCV), herpes simplex virus type I (HSV-1) eller alvorlig akutt luftveissyndrom (SARS) virus.
15. Fremgangsmåte for fremstilling av antistoffet eller antigen-bindende del som definert i krav 1 k a r a k t e r i s e r t v e d a t den omfatter :
(a) tilveiebringing av:
(i) en tungkjede variabel region antistoffsekvens omfattende en CDR1 sekvens som er valgt fra SEKV ID NR: 5, 9 og 1, en CDR2 sekvens som er valgt fra SEKV ID NR: 17, 21 og 13; og en CDR3 sekvens som er valgt fra SEKV ID NR: 28, 32 og 24; eller
(ii) en lettkjede variabel region antistoffsekvens omfattende en CDR1 sekvens som er valgt fra SEKV ID NR: 55, 59 og 51, en CDR2 sekvens som er valgt fra SEKV ID NR: 66, 70 og 62 og en CDR3 sekvens som er valgt fra SEKV ID NR: 77, 81 og 73;
(b) endring av minst en aminosyrerest innenfor minst en variabel region antistoffsekvens, hvor nevnte sekvens er valgt fra tungkjedevariabel region antistoffsekvensen og lettkjede variabel region antistoffsekvensen, for å danne minst en endret antistoffsekvens; og
(c) uttrykke den endrede antistoffsekvensen som et protein.
NO20062630A 2003-12-10 2006-06-08 Isolert humant monoklonalt antistoff eller en antigen-bindende del derav og fremgangsmåte for fremstilling og anvendelse derav for behandling, transgen mus, isolert nukleinsyremolekyl, sammensetning, bispesifikt molekyl, samt immunokonjugat. NO342278B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US52918003P 2003-12-10 2003-12-10
PCT/US2004/041506 WO2005058815A2 (en) 2003-12-10 2004-12-10 Ip-10 antibodies and their uses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20062630L NO20062630L (no) 2006-09-07
NO342278B1 true NO342278B1 (no) 2018-04-30

Family

ID=34699950

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20062630A NO342278B1 (no) 2003-12-10 2006-06-08 Isolert humant monoklonalt antistoff eller en antigen-bindende del derav og fremgangsmåte for fremstilling og anvendelse derav for behandling, transgen mus, isolert nukleinsyremolekyl, sammensetning, bispesifikt molekyl, samt immunokonjugat.

Country Status (25)

Country Link
US (4) US20050191293A1 (no)
EP (3) EP1691837B1 (no)
JP (2) JP4942487B2 (no)
KR (4) KR101374514B1 (no)
CN (2) CN102838675B (no)
AU (1) AU2004298492B2 (no)
BR (1) BRPI0417429A (no)
CA (1) CA2548338C (no)
CY (2) CY1113096T1 (no)
DK (2) DK1691837T3 (no)
ES (2) ES2388435T3 (no)
HK (3) HK1087644A1 (no)
HR (2) HRP20120702T1 (no)
HU (1) HUE025328T2 (no)
IL (1) IL175855A (no)
MX (1) MXPA06005941A (no)
NO (1) NO342278B1 (no)
NZ (1) NZ547499A (no)
PL (2) PL1691837T3 (no)
PT (2) PT1691837E (no)
RS (1) RS53984B1 (no)
RU (1) RU2486199C2 (no)
SI (2) SI2383295T1 (no)
WO (1) WO2005058815A2 (no)
ZA (1) ZA200604620B (no)

Families Citing this family (114)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
JP4794301B2 (ja) * 2003-06-11 2011-10-19 中外製薬株式会社 抗体の製造方法
AR045563A1 (es) 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
CN102838675B (zh) * 2003-12-10 2014-07-30 梅达雷克斯有限责任公司 Ip-10抗体及其用途
DK1766093T3 (da) * 2004-02-06 2011-10-03 Univ Massachusetts Antistoffer mod clostridium difficile-toksiner og anvendelse deraf
TW200714610A (en) 2005-02-16 2007-04-16 Univ Maryland CXCR3 is a gliadin receptor
AU2006232287B2 (en) 2005-03-31 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
CA2623236A1 (en) 2005-09-26 2007-04-05 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to cd70
KR20180058863A (ko) 2005-11-30 2018-06-01 애브비 인코포레이티드 아밀로이드 베타 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 이의 용도
US8691224B2 (en) 2005-11-30 2014-04-08 Abbvie Inc. Anti-Aβ globulomer 5F7 antibodies
AU2013200177B2 (en) * 2005-11-30 2014-10-02 Abbvie Deutschland Gmbh & Co Kg Monoclonal antibodies against amyloid beta protein and uses thereof
EP4342995A2 (en) * 2006-03-31 2024-03-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
JP5144499B2 (ja) 2006-03-31 2013-02-13 中外製薬株式会社 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法
CN101627055A (zh) 2006-09-05 2010-01-13 梅达雷克斯公司 骨形成蛋白及其受体的抗体以及它们的使用方法
US8178100B2 (en) 2006-10-13 2012-05-15 Seoul National University Industry Foundation Antibodies to IP-10 for treating bone diseases with bone destruction
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
NZ578354A (en) * 2006-12-14 2012-01-12 Medarex Inc Antibody-partner molecule conjugates that bind cd70 and uses thereof
US20110044945A1 (en) * 2007-02-08 2011-02-24 Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences Agents for the treatment of multiple sclerosis and methods of using same
US20100311767A1 (en) 2007-02-27 2010-12-09 Abbott Gmbh & Co. Kg Method for the treatment of amyloidoses
AU2008219570B2 (en) 2007-02-28 2013-08-22 Novimmune Sa Human anti-IP-10 antibodies and uses thereof
EP2164508B1 (en) 2007-06-04 2014-01-08 Rappaport Family Institute for Research in the Medical Sciences Agents for the treatment of inflammatory diseases and methods of using same
EP3255144A1 (en) * 2007-08-10 2017-12-13 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Recombineering construct for preparing transgenic mice capable of producing human immunoglobulin
JP2010536388A (ja) * 2007-08-30 2010-12-02 ザ ウォルター アンド エリザ ホール インスティテュート オブ メディカル リサーチ 樹状細胞マーカーおよびその使用法
MX2010003450A (es) * 2007-09-26 2010-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Region constante de anticuerpo modificada.
EP3127921A1 (en) * 2007-09-26 2017-02-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substition in cdr
EP2195017B1 (en) * 2007-10-01 2014-10-22 Bristol-Myers Squibb Company Human antibodies that bind mesothelin, and uses thereof
AU2008338591B8 (en) * 2007-12-14 2014-02-20 Bristol-Myers Squibb Company Binding molecules to the human OX40 receptor
WO2009083009A2 (en) 2008-01-03 2009-07-09 Genmab A/S Monoclonal antibodies against cd32b
KR102269708B1 (ko) 2008-04-11 2021-06-25 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
WO2010039900A2 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Aliva Biopharmaceuticals, Inc. Non-human mammals for the production of chimeric antibodies
UA109633C2 (uk) 2008-12-09 2015-09-25 Антитіло людини проти тканинного фактора
WO2010103517A1 (en) 2009-03-12 2010-09-16 Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences Soluble compositions for the treatment of cxcr3-ligand associated diseases
TWI646193B (zh) 2009-03-19 2019-01-01 中外製藥股份有限公司 抗體恆定區域改變體
WO2010107110A1 (ja) 2009-03-19 2010-09-23 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
WO2010129351A1 (en) 2009-04-28 2010-11-11 Schepens Eye Research Institute Method to identify and treat age-related macular degeneration
DK2248825T3 (da) * 2009-05-04 2013-01-02 Ribovax Biotechnologies Sa Antigenbindingsfragment af et antistof til anvendelse i behandling og diagnosticering af okulare sygdomme
EP3871498A1 (en) 2009-07-08 2021-09-01 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US20120204278A1 (en) 2009-07-08 2012-08-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US10150808B2 (en) 2009-09-24 2018-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
US10435458B2 (en) 2010-03-04 2019-10-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variants with reduced Fcgammar binding
EP3511342B1 (en) 2010-03-10 2024-01-17 Genmab A/S Monoclonal antibodies against c-met
KR102117771B1 (ko) 2010-03-31 2020-06-02 아블렉시스, 엘엘씨 키메라 항체의 제조를 위한 비-인간 동물의 유전적 조작
US8987419B2 (en) 2010-04-15 2015-03-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
RS56599B1 (sr) 2010-06-15 2018-02-28 Genmab As Konjugati humanog antitela sa lekom protiv tkivnog faktora
CN103298833B (zh) 2010-08-14 2015-12-16 Abbvie公司 β淀粉样蛋白结合蛋白
MX355060B (es) 2010-11-17 2018-04-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula multiespecifica de union a antigeno que tiene funcion alternativa a la funcion del factor viii de coagulacion sanguinea.
AU2011337704B2 (en) 2010-11-30 2017-06-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
US11066483B2 (en) 2010-11-30 2021-07-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
CN102161982B (zh) * 2011-03-09 2012-12-26 苏州大学 抗人cxcr3分子单抗及其应用
MX2013012284A (es) 2011-04-29 2013-11-21 Bristol Myers Squibb Co Regimenes de elevacion de dosis del anticuerpo de proteina 10 inducible por interferon gamma (ip-10).
JP5813880B2 (ja) 2011-09-19 2015-11-17 カイマブ・リミテッド ヒトへの使用に合わせて作製された抗体、可変ドメインおよび鎖
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
JP5963233B2 (ja) * 2011-12-07 2016-08-03 学校法人 聖マリアンナ医科大学 Ｈｔｌｖ−１関連脊髄症を治療または予防するための医薬および前記医薬を用いた抗体療法の治療効果の確認方法
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
CN103417967B (zh) * 2012-05-15 2017-05-10 中国医学科学院基础医学研究所 Cxcl‑10抑制剂在制备治疗和/或预防肺损伤的药物中的用途
KR102134088B1 (ko) 2012-08-24 2020-07-14 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 Ror1 암을 치료하고 전이를 저해하는데 이용을 위한 항체와 백신
KR101452865B1 (ko) * 2012-09-17 2014-10-21 서울대학교산학협력단 신규한 ｉｐ－１０ 에피토프 및 이에 대한 항체
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
JP6534615B2 (ja) 2013-09-27 2019-06-26 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
WO2015049517A2 (en) 2013-10-01 2015-04-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
LT3227339T (lt) * 2014-12-05 2022-01-10 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Chimeriniai antigeno receptoriai, nukreipti į receptorių su prijungtu g baltymu ir jų naudojimo būdai
ES2747386T3 (es) 2015-01-14 2020-03-10 Bristol Myers Squibb Co Dímeros de benzodiacepina unidos por heteroarileno, conjugados de los mismos y métodos de preparación y uso
US11142587B2 (en) 2015-04-01 2021-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide hetero-oligomer
US11401509B2 (en) 2015-11-09 2022-08-02 Bristol-Myers Squibb Company Methods of minimizing glycoprotein agregation in CHO cell production
EP3383903A1 (en) * 2015-11-30 2018-10-10 Bristol-Myers Squibb Company Anti human ip-10 antibodies and their uses
EP3394096A1 (en) 2015-12-21 2018-10-31 Bristol-Myers Squibb Company Variant antibodies for site-specific conjugation
SG11201803989WA (en) 2015-12-28 2018-06-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for promoting efficiency of purification of fc region-containing polypeptide
EP3454909A1 (en) 2016-05-10 2019-03-20 Bristol-Myers Squibb Company Antibody-drug conjugates of tubulysin analogs with enhanced stability
WO2017220989A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Kymab Limited Anti-pd-l1 and il-2 cytokines
EP3474854A4 (en) 2016-06-27 2020-02-19 The Regents of The University of California DRUG ASSOCIATIONS FOR THE TREATMENT OF CANCER
KR102493853B1 (ko) 2016-08-19 2023-01-30 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 세코-시클로프로파피롤로인돌 화합물, 그의 항체-약물 접합체, 및 제조 및 사용 방법
BR112019004873A2 (pt) * 2016-09-14 2019-06-11 Teneobio Inc anticorpos de ligação a cd3
WO2018075842A1 (en) 2016-10-20 2018-04-26 Bristol-Myers Squibb Company Condensed benzodiazepine derivatives and conjugates made therefrom
US10610104B2 (en) 2016-12-07 2020-04-07 Progenity, Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
CA3045310A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a chemokine/chemokine receptor inhibitor
US11819517B2 (en) 2017-06-05 2023-11-21 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of using tumor infiltrating lymphocytes in double-refractory melanoma
US10457681B2 (en) 2017-08-16 2019-10-29 Bristol_Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a tricyclic moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10472361B2 (en) 2017-08-16 2019-11-12 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a benzotriazole moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10487084B2 (en) 2017-08-16 2019-11-26 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a heterobiaryl moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10494370B2 (en) 2017-08-16 2019-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a pyridine or pyrazine moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10508115B2 (en) 2017-08-16 2019-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having heteroatom-linked aromatic moieties, conjugates thereof, and methods and uses therefor
EP3679364A1 (en) 2017-09-07 2020-07-15 Bristol-Myers Squibb Company Method of purity determination by capillary electrophoresis
CN107656067B (zh) * 2017-09-18 2019-11-15 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 一种评估sle患儿总体疾病活动度和肾脏疾病活动度的检测方法及其应用
GB201803892D0 (en) * 2018-03-12 2018-04-25 Ultrahuman Six Ltd C-met binding agents
CN108531460B (zh) * 2018-03-30 2020-07-14 四川迈克生物新材料技术有限公司 抗人IgM单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用
US11485741B2 (en) 2018-04-24 2022-11-01 Bristol-Myers Squibb Company Macrocyclic toll-like receptor 7 (TLR7) agonists
AU2019266205A1 (en) 2018-05-07 2020-10-22 Genmab A/S Methods of treating cancer with a combination of an anti-PD-1 antibody and an anti-tissue factor antibody-drug conjugate
JP7460608B2 (ja) 2018-05-07 2024-04-02 ジェンマブ エー／エス 抗ｐｄ－１抗体と抗組織因子抗体－薬物コンジュゲートとの組み合わせを用いるがんの治療方法
EA202092747A1 (ru) 2018-05-29 2021-03-16 Бристол-Маерс Сквибб Компани Модифицированные саморазрушающиеся фрагменты для применения в пролекарствах и конъюгатах и способы применения и изготовления
US11554120B2 (en) 2018-08-03 2023-01-17 Bristol-Myers Squibb Company 1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidine compounds as toll-like receptor 7 (TLR7) agonists and methods and uses therefor
TW202034958A (zh) 2018-10-30 2020-10-01 丹麥商珍美寶股份有限公司 使用抗血管內皮生長因子（ｖｅｇｆ）抗體與抗組織因子（ｔｆ）抗體－藥物共軛體之組合以治療癌症之方法
WO2020106750A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Progenity, Inc. Methods and devices for treating a disease with biotherapeutics
CN111228491B (zh) * 2018-11-29 2022-07-01 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 Ip-10抑制剂在预防和/或治疗寨卡病毒感染中的应用
PL3886914T3 (pl) 2018-11-30 2023-05-08 Bristol-Myers Squibb Company Przeciwciało zawierające c-końcowe rozszerzenie łańcucha lekkiego zawierające glutaminę, jego koniugaty oraz metody i zastosowania
KR20210102334A (ko) 2018-12-12 2021-08-19 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 트랜스글루타미나제 접합을 위해 변형된 항체, 그의 접합체, 및 방법 및 용도
GB201820554D0 (en) * 2018-12-17 2019-01-30 Univ Oxford Innovation Ltd BTLA antibodies
CN114206927A (zh) 2019-06-14 2022-03-18 特尼奥生物股份有限公司 与cd22和cd3结合的多特异性重链抗体
WO2021055306A1 (en) 2019-09-16 2021-03-25 Bristol-Myers Squibb Company Dual capture method for analysis of antibody-drug conjugates
JP2022554356A (ja) 2019-11-04 2022-12-28 シージェン インコーポレイテッド 抗ｃｄ３０抗体薬物コンジュゲート及びｈｉｖ感染の処置のためのその使用
JP2023500888A (ja) 2019-11-07 2023-01-11 ジェンマブ エー／エス 抗ｐｄ－１抗体と抗組織因子抗体－薬物コンジュゲートとの組み合わせを用いるがんの治療方法
TW202131954A (zh) 2019-11-07 2021-09-01 丹麥商珍美寶股份有限公司 利用鉑類劑與抗組織因子抗體－藥物共軛體之組合來治療癌症之方法
CN115666704A (zh) 2019-12-13 2023-01-31 比奥拉治疗股份有限公司 用于将治疗剂递送至胃肠道的可摄取装置
BR112022025105A2 (pt) 2020-06-29 2023-01-17 Genmab As Método para o tratamento de câncer cervical em um indivíduo, conjugado anticorpo-fármaco, e, uso de um conjugado anticorpo-fármaco
JP2023549581A (ja) 2020-11-17 2023-11-27 シージェン インコーポレイテッド ツカチニブ及び抗ｐｄ－１／抗ｐｄ－ｌ１抗体の組み合わせによりがんを治療する方法
CN113603773B (zh) * 2021-08-17 2023-05-09 中国医科大学附属第一医院 靶向淀粉样蛋白的单克隆抗体7b8、分泌该抗体的杂交瘤细胞株及应用
WO2023076989A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Seagen Inc. Methods of treating cancer with a combination of an anti-pd-1 antibody and an anti-cd30 antibody-drug conjugate
CN114656561B (zh) * 2022-03-05 2023-06-09 南京鼓楼医院 一种抗ip-10单克隆抗体
WO2023213960A1 (en) 2022-05-06 2023-11-09 Genmab A/S Methods of treating cancer with anti-tissue factor antibody-drug conjugates

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001009187A2 (en) * 1999-07-29 2001-02-08 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to her2/neu
WO2002015932A1 (en) * 2000-08-18 2002-02-28 The Regents Of The University Of California Methods for treating demyelinating diseases
US20030166589A1 (en) * 2001-06-05 2003-09-04 Nathan Karin Method and pharmaceutical composition for the treatment of multiple sclerosis

Family Cites Families (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
EP0623679B1 (en) 1987-05-21 2003-06-25 Micromet AG Targeted multifunctional proteins
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
JP2989002B2 (ja) 1988-12-22 1999-12-13 キリン―アムジエン・インコーポレーテツド 化学修飾顆粒球コロニー刺激因子
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
AU640400B2 (en) * 1989-08-07 1993-08-26 Peptide Technology Ltd. Tumour necrosis factor binding ligands
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69133566T2 (de) 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US7084260B1 (en) * 1996-10-10 2006-08-01 Genpharm International, Inc. High affinity human antibodies and human antibodies against human antigens
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
JPH07503132A (ja) 1991-12-17 1995-04-06 ジェンファーム　インターナショナル，インコーポレイティド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
CA2118508A1 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Elizabeth S. Ward Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
GB9621295D0 (en) * 1995-12-07 1996-11-27 Cambridge Antibody Tech Specific binding members,materials and methods
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
EP0983303B1 (en) 1997-05-21 2006-03-08 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
US6177545B1 (en) * 1997-09-02 2001-01-23 Insight Strategy & Marketing Ltd. Heparanase specific molecular probes and their use in research and medical applications
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
EP2261229A3 (en) 1998-04-20 2011-03-23 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
NZ539776A (en) 1999-01-15 2006-12-22 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
WO2000044790A1 (en) * 1999-01-29 2000-08-03 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-ccr1 antibodies and methods of use therefor
EP2270148A3 (en) 1999-04-09 2011-06-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
JP3585399B2 (ja) * 1999-07-30 2004-11-04 独立行政法人 科学技術振興機構 抗マウスｔｒａｉｌモノクローナル抗体
KR100942863B1 (ko) 1999-08-24 2010-02-17 메다렉스, 인코포레이티드 인간 씨티엘에이-4 항체 및 그의 용도
US6652854B2 (en) * 2000-08-08 2003-11-25 Immunex Corporation Methods for treating autoimmune and chronic inflammatory conditions using antagonists of CD30 or CD30L
ES2295228T3 (es) 2000-11-30 2008-04-16 Medarex, Inc. Roedores transcromosomicos transgenicos para la preparacion de anticuerpos humanos.
WO2002092780A2 (en) 2001-05-17 2002-11-21 Diversa Corporation Novel antigen binding molecules for therapeutic, diagnostic, prophylactic, enzymatic, industrial, and agricultural applications, and methods for generating and screening thereof
AU2002316674B2 (en) 2001-07-12 2007-09-13 The Regents Of The University Of California CXCL10 treatment of secondary tissue degeneration
US20040096446A1 (en) 2001-08-17 2004-05-20 Lane Thomas E. Methods for treating demyelinating diseases
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US7442512B2 (en) * 2001-11-30 2008-10-28 Chemocentryx, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diseases and conditions related to chemokine receptors
JP2005518789A (ja) * 2002-01-28 2005-06-30 メダレックス， インク． 前立腺特異性膜抗原（ｐｓｍａ）に対するヒトモノクローナル抗体
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
CA2478169C (en) * 2002-03-04 2013-04-16 Imclone Systems Incorporated Human antibodies specific to kdr and uses thereof
WO2004045525A2 (en) * 2002-11-15 2004-06-03 Morehouse School Of Medicine Anti-chemokine and associated receptor antibodies and uses for inhibition of inflammation.
WO2004101511A2 (en) * 2003-05-09 2004-11-25 Protein Design Labs, Inc Anti-ip-10 antibodies and methods of using thereof for the treatment of inflamatory bowel diseases
DE602004031772D1 (de) * 2003-12-04 2011-04-21 Abbott Biotherapeutics Corp Anti-ip-10-antikörper
CN102838675B (zh) * 2003-12-10 2014-07-30 梅达雷克斯有限责任公司 Ip-10抗体及其用途
AU2008219570B2 (en) * 2007-02-28 2013-08-22 Novimmune Sa Human anti-IP-10 antibodies and uses thereof
MX2013012284A (es) 2011-04-29 2013-11-21 Bristol Myers Squibb Co Regimenes de elevacion de dosis del anticuerpo de proteina 10 inducible por interferon gamma (ip-10).

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001009187A2 (en) * 1999-07-29 2001-02-08 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to her2/neu
WO2002015932A1 (en) * 2000-08-18 2002-02-28 The Regents Of The University Of California Methods for treating demyelinating diseases
US20030166589A1 (en) * 2001-06-05 2003-09-04 Nathan Karin Method and pharmaceutical composition for the treatment of multiple sclerosis

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Carr DJ. et al. Effect of anti-CXCL10 monoclonal antibody on herpes simplex virus type 1 keratitis and retinal infection. J Virol. 2003, vol. 77, no. 18, side10037-10046. , Dated: 01.01.0001 *
CARR DJ. et al. Neutralizing antibody to the chemokine CXCL10 reduces ocular inflammation and delays viral spread following corneal HSV-1 infection. ARVO Annual Meeting abstract search and program planner. 2003, vol. 05, abstract no. 4183. , Dated: 01.01.0001 *
Kolb SA. et al. Identification of a T cell chemotactic factor in the cerebrospinal fluid of HIV-1-infected individuals as interferon-gamma inducible protein 10. J Neuroimmunol. 1999, vol. 93, no. 1-2, side 172-181. , Dated: 01.01.0001 *
Liu MT. et al. Neutralization of the chemokine CXCL10 reduces inflammatory cell invasion and demyelination and improves neurological function in a viral model of multiple sclerosis. J Immunol. 2001, vol. 167, no. 7, side 4091-4097 , Dated: 01.01.0001 *
Reff ME. et al. A review of modifications to recombinant antibodies: attempt to increase efficacy in oncology applications. Crit Rev Oncol Hematol. 2001, vol. 40, no. 1, side 25-35. Review. , Dated: 01.01.0001 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN1889979B (zh) 2012-09-19
AU2004298492A1 (en) 2005-06-30
EP2383295B1 (en) 2015-03-11
RS53984B1 (en) 2015-10-30
ZA200604620B (en) 2007-10-31
SI2383295T1 (sl) 2015-07-31
HK1087644A1 (en) 2006-10-20
HUE025328T2 (en) 2016-03-29
EP1691837A4 (en) 2009-02-11
PT2383295E (pt) 2015-06-16
WO2005058815A2 (en) 2005-06-30
BRPI0417429A (pt) 2007-04-03
WO2005058815A3 (en) 2006-02-23
CA2548338C (en) 2015-06-23
CN102838675B (zh) 2014-07-30
CN1889979A (zh) 2007-01-03
MXPA06005941A (es) 2006-08-23
KR20060135690A (ko) 2006-12-29
US9994633B2 (en) 2018-06-12
CA2548338A1 (en) 2005-06-30
US20120230998A1 (en) 2012-09-13
HK1163707A1 (en) 2012-09-14
SI1691837T1 (sl) 2012-11-30
CN102838675A (zh) 2012-12-26
RU2486199C2 (ru) 2013-06-27
DK1691837T3 (da) 2012-10-01
EP1691837A2 (en) 2006-08-23
CY1113096T1 (el) 2016-04-13
PL1691837T3 (pl) 2012-11-30
US8258266B2 (en) 2012-09-04
JP2007514419A (ja) 2007-06-07
HRP20150429T1 (hr) 2015-05-22
KR101374514B1 (ko) 2014-03-13
EP2383295A1 (en) 2011-11-02
KR20120030602A (ko) 2012-03-28
JP4942487B2 (ja) 2012-05-30
US20150104866A1 (en) 2015-04-16
EP1691837B1 (en) 2012-06-20
KR101333449B1 (ko) 2013-11-26
JP5466691B2 (ja) 2014-04-09
IL175855A (en) 2013-03-24
PT1691837E (pt) 2012-08-27
ES2388435T3 (es) 2012-10-15
PL2383295T3 (pl) 2015-08-31
NZ547499A (en) 2009-04-30
DK2383295T3 (en) 2015-06-15
AU2004298492B2 (en) 2011-08-18
IL175855A0 (en) 2006-10-05
US8945546B2 (en) 2015-02-03
US20050191293A1 (en) 2005-09-01
ES2537163T3 (es) 2015-06-03
HRP20120702T1 (hr) 2012-09-30
RU2006124611A (ru) 2008-01-20
JP2012100667A (ja) 2012-05-31
NO20062630L (no) 2006-09-07
CY1116364T1 (el) 2017-02-08
KR20130133302A (ko) 2013-12-06
HK1209759A1 (en) 2016-04-08
KR20130006542A (ko) 2013-01-16
US20100077497A1 (en) 2010-03-25
EP2865687A1 (en) 2015-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9994633B2 (en) IP-10 antibodies and their uses
CA2570823C (en) Interferon alpha receptor 1 antibodies and their uses
KR102630475B1 (ko) 항 인간 ip-10 항체 및 이의 용도
AU2011250741B2 (en) IP-10 antibodies and their uses
TW201805303A (zh) Ip-10抗體及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
CHAD Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften)

Owner name: MEDAREX LLC, US

CHAD Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften)

Owner name: E.R. SQUIBB & SONS, US

MM1K Lapsed by not paying the annual fees