ES2894605T3

ES2894605T3 - Tratamiento combinado con un agonista de TLR7 y un inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB

Info

Publication number: ES2894605T3
Application number: ES17767788T
Authority: ES
Inventors: Lue Dai; Lu Gao
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2016-09-13
Filing date: 2017-09-11
Publication date: 2022-02-15
Anticipated expiration: 2037-09-11
Also published as: IL287545B; IL287545B2; WO2018050571A1; EP3512556A1; KR102497701B1; IL287545A; AU2017326400B2; CN109715214B; IL264926B; PL3512556T3; JP2022130672A; JP7101663B2; EP3512556B1; TW201811371A; BR112019004560A2; MX2021014771A; CA3034185A1; EP3970750A1; AU2017326400A1; KR20190053219A

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un agonista de TLR7 y un inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB, en un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que el agonista de TLR7 es un compuesto de fórmula (I): **(Ver fórmula)** en la que R1 es alquilo C1-6; R2 es bencilo, estando dicho bencilo no sustituido o sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno y alquilo C1-6; R3 es -NR4R5, en el que R4 es alquilo C1-6 o alcoxi C1-6-alquilo C1-6; R5 es (alquil C1-6)2NCOO-alquilo C1-6, alcoxi C1-6-alquilo C1-6, alcoxi C1-6-carbonil-(alquil C1-6)-aminoalquilo C1-6, alcoxi C1-6-carbonil-(fenil)-alquilo C1-6, alcoxi C1-6-carbonil-alquilo C1-6, alcoxi C1-6-carboniloxi-alquilo C1-6, alquilo C1- 6, alquil C1-6-carbonil-(alquil C1-6)-aminoalquilo C1-6 o pirrolidinilcarbamoiloxialquilo C1-6; o R4 y R5, conjuntamente con el nitrógeno al que están unidos, forman un heterociclilo; o una sal, enantiómero o diastereómero farmacéuticamente aceptable de los mismos; o en la que el agonista de TLR7 es un compuesto de fórmula (II): **(Ver fórmula)** en la que R4 es alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, cicloalquilo C3-7-alquilo C1-6, alcoxi C1-6-alquilo C1-6 o pirrolidinilalquilo C1-6; R5 es alquilo C1-6, fenilalquilo C1-6, piridinilalquilo C1-6 o pirimidinilalquilo C1-6, dicho fenilalquilo C1-6, piridinilalquilo C1-6 y pirimidinilalquilo C1-6 están no sustituidos o sustituidos con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, alcoxi C1-6, ciano, carboxi, carbamoílo, haloalquilo C1-6, alquil C1-6- sulfonilo, alcoxi C1-6-carbonilo, alcoxi C1-6-alquil C1-6-aminocarbonilo, pirrolidinilcarbonilo y piperidinilcarbonilo; R6 es H; o una sal, enantiómero o diastereómero farmacéuticamente aceptable de los mismos; en la que el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB es un compuesto de fórmula (III): **(Ver fórmula)** en la que R7 es hidrógeno, halógeno o alquilo C1-6; R8es hidrógeno o halógeno; R9es hidrógeno o halógeno; R10es alquilo C1-6; R11es hidrógeno, hidroxialquilo C1-6, aminocarbonilo, alcoxi C1-6-carbonilo o carboxi; es alquilo C1-6; R12es hidrógeno, alcoxi C1-6-carbonilo o carboxi-CmH2m-; X es carbonilo o sulfonilo; Y es -CH2-, -O- o -N(R13)-, en el que R13 es hidrógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, cicloalquil C3-7-CmH2m-, alcoxi C1-6-carbonil-CmH2m-, -CtH2t-COOH, -haloalquil C1-6-COOH, -(alcoxi C1-6)-alquil C1-6-COOH, -alquil C1-6-O-alquil C1-6-COOH, -cicloalquil C3-7-CmH2m-COOH, -CmH2m-cicloalquil C3-7-COOH, hidroxi-CtH2t-, carboxiespiro[3.3]heptilo o carboxifenil-CmH2m-, carboxipiridinil-CmH2m-; W es -CH2-, -C(alquilo C1-6)2-, -O- o carbonilo; n es 0 o 1; m es 0-7; t es 1-7; o una sal, enantiómero o diastereómero farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento combinado con un agonista de TLR7 y un inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB

La presente invención se dirige a composiciones y composiciones para su uso para tratar la infección por el virus de la hepatitis B. En particular, la presente invención se dirige a una politerapia que comprende la administración de un agonista de TLR7 y un inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB para su uso en el tratamiento de un paciente con hepatitis B crónica.

Campo de la invención

La infección crónica por el virus de la hepatitis B (VHB) es un grave problema de salud pública en todo el mundo, con más de 240 millones de personas infectadas de forma crónica en todo el mundo. El VHB pertenece a la familia de virus Hepadnaviridae. Tras la entrada en un hepatocito, su genoma vírico se envía al núcleo, donde se forma un ADN circular cerrado covalentemente (ADNccc) a través de la reparación del ADN del genoma vírico parcialmente bicatenario. El ADNccc sirve como molde para la transcripción de los ARN víricos. El ARN pregenómico vírico interactúa con otros dos componentes víricos, la proteína de la cápside y la polimerasa, para formar partículas de la cápside donde se produce la replicación del ADN vírico. El VHB tiene un centro icosaédrico que comprende 240 copias de la proteína de la cápside (o central). La función biológica predominante de la proteína de la cápside es actuar como una proteína estructural para encapsidar el ARN pregenómico y formar partículas de la cápside inmadura en el citoplasma. Esta etapa es un requisito previo para la replicación del ADN vírico. Cuando se forma un ADN circular relajado de longitud prácticamente completa a través de retrotranscripción del ARN pregenómico vírico, una cápside inmadura se convierte en una cápside madura. La mayoría de las copias del genoma encapsidado se asocian eficazmente con lípidos celulares y proteínas de la envoltura vírica (S, M y L) para el ensamblaje y la secreción del virión. Sin embargo, también se producen partículas no infecciosas que superan en gran medida a los viriones infecciosos. Estas partículas envueltas vacías se denominan partículas subvíricas (PSV). Las proteínas de la envoltura S, M y L se expresan a partir de un único ORF (marco abierto de lectura) que contiene tres codones de inicio diferentes. Las tres proteínas comparten una secuencia de 226 aa, el dominio S, en sus extremos C. El dominio S contiene el epítopo en HBsAg (Lambert, C. & R. Prange. Virol J, 2007, 4, 45).

Muchas observaciones mostraron que varias proteínas víricas del VHB podrían contrarrestar la respuesta celular del huésped inicial al interferir en el sistema de señalización de reconocimiento vírico y, posteriormente, en la actividad antivírica del interferón (IFN). Entre estas, la excesiva secreción de partículas subvíricas vacías del VHB puede participar en el mantenimiento del estado de tolerancia inmunológica observado en pacientes infectados de forma crónica (HBC). La constante exposición al HBsAg y otros antígenos víricos puede dar lugar a la deleción de linfocitos T específicos para el VHB o al deterioro funcional progresivo (Kondo et al. Journal of Immunology 1993, 150, 4659 4671; Kondo et al. Journal of Medical Virology 2004, 74, 425-433; Fisicaro et al. Gastroenterology, 2010, 138, 682 93;). Además, se ha informado de que el HBsAg suprime la función de las células inmunitarias, tales como monocitos, células dendríticas (CD) y linfocitos citolíticos naturales (NK) por interacción directa (Op den Brouw et al. Immunology, 2009b, 126, 280-9; Woltman et al. PLoS One, 2011,6, e15324; Shi et al. J Viral Hepat. 2012, 19, e26-33; Kondo et al. ISRN Gasteroenterology, 2013, ID del artículo 935295).

La cuantificación del HBsAg es un biomarcador para el pronóstico y la respuesta al tratamiento en la hepatitis B crónica. La pérdida y seroconversión de HBsAg es el objetivo para la curación clínica, pero rara vez se observa en pacientes infectados de forma crónica. El tratamiento actual, tal como los análogos de nucleós(t)idos que inhiben la síntesis de ADN del VHB, no afecta directamente al nivel de HBsAg. Los análogos de nucleós(t)idos, incluso con tratamiento prolongado, han demostrado tasas muy bajas de aclaramiento de HBsAg comparables a las observadas de forma natural (Janssen et al. Lancet, 2005, 365 , 123-9; Marcellin et al. N. Engl. J. Med., 2004, 351, 1206-17; Buster et al. Hepatology, 2007, 46, 388-94).

Los receptores de tipo Toll (TLR) detectan una amplia gama de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) conservados. Desempeñan un importante papel de detección de patógenos invasores y posterior inicio de respuestas inmunitarias innatas. Existen 10 miembros conocidos de la familia de TLR en los seres humanos, que son proteínas transmembranarias de tipo I que presentan un dominio rico en leucina extracelular y una cola citoplásmica que contiene un dominio de receptor Toll/interleucina (IL)-1 (TIR) conservado. Dentro de esta familia, TLR3, TLR7, TLR8 y TLR9 se localizan dentro de los endosomas. TLR7 se puede activar por unión a un ligando de molécula pequeña específico (es decir, un agonista de TLR7) o su ligando natural (es decir, ARN monocatenario, ARNmc). Tras la unión de ARNmc a TLR7, se cree que el receptor en su forma dimerizada experimenta un cambio estructural que da lugar al posterior reclutamiento de proteínas adaptadoras en su dominio citoplásmico, incluyendo el gen de respuesta principal de diferenciación mielógena 88 (MyD88). Tras el inicio de la cascada de señalización del receptor por medio de la vía de MyD88, se activan factores de transcripción citoplásmicos tales como el factor regulador de interferón 7 (IRF-7) y el factor nuclear kappa B (NF-kB). A continuación, estos factores de transcripción se translocan al núcleo e inician la transcripción de diversos genes, por ejemplo, IFN-a y otros genes de atocinas antivíricas. TLR7 se expresa predominantemente en células

plasmocitoides, y también en linfocitos B. La alteración en la reactividad de las células inmunitarias podría contribuir a las respuestas inmunitarias innatas reducidas durante las infecciones víricas crónicas. Por lo tanto, la activación inducida por agonista de TLR7 podría representar un enfoque novedoso para el tratamiento de las infecciones víricas crónicas. (D. J Connolly y L. AJ O'Neill, Current Opinión in Pharmacology 2012, 12:510-518, P. A. Roethle et al, J. Med. Chem. 2013, 56, 7324-7333).

El tratamiento con un agonista de TLR7 oral representa una solución prometedora para proporcionar mayor eficacia con mejor tolerabilidad. Actualmente se usa IFN-a pegilado (PEG-IFN-a) para tratar la VHB crónica y es una alternativa al tratamiento potencialmente de por vida con análogos de nucleós(t)idos antivíricos. En un subconjunto de pacientes con VHB crónica, el tratamiento con PEG-IFN-a puede inducir un control inmunológico mantenido del virus tras una duración limitada del tratamiento. Sin embargo, el porcentaje de pacientes con VHB que logran seroconversión con tratamiento con interferón es bajo (hasta un 27 % para pacientes positivos para HBeAg) y típicamente el tratamiento se tolera mal. Además, la curación funcional (definida como pérdida y seroconversión de HBsAg) también es muy infrecuente tanto con tratamiento con PEG-IFN-a como con nucleós(t)idos. Dadas estas limitaciones, existe una necesidad urgente de obtener opciones terapéuticas mejoradas para tratar e inducir una curación funcional para la VHB crónica. El tratamiento con un agonista de TLR7 de molécula pequeña oral es un enfoque prometedor que tiene el potencial de proporcionar una mayor eficacia y tolerabilidad (T. Asselah et al, Clin Liver Dis 2007, 11, 839-849).

La proteína de la cápside del VHB desempeña papeles esenciales en la replicación del VHB. Las heteroarildihidropirimidinas o HAP, incluyendo los compuestos denominados Bay 41-4109, Bay 38-7690 y Bay 39 5493, se descubrieron en un cribado basado en cultivo tisular (Deres K. et al. Science 2003, 893). Estos análogos de HAP actúan como activadores alostéricos sintéticos y pueden inducir una formación de la cápside anómala que da lugar a la degradación de la proteína central. Los análogos de HAP también reorganizaron la proteína central a partir de cápsides preensambladas en polímeros no capsídicos, supuestamente por la interacción de HAP con dímeros liberados durante la "respiración" de la cápside, la ruptura transitoria de enlaces entre subunidades individuales. Se administró Bay 41-4109 a modelos de ratones transgénicos o ratones humanizados infectados por el VHB y se demostró su eficacia in vivo con reducción del ADN del VHB (Deres K. et al. Science 2003, 893; Brezillon N. et al. PLoS ONE 2011, e25096). También se demostró que bis-ANS, una molécula pequeña, actúa como una "cuña" molecular e interfiere en la geometría de la proteína de la cápside normal y la formación de la cápside (Zlotnick A. et al. J. Virol. 2002, 4848-4854).

Ahora, el estándar de la curación clínica de la infección por el VHB es la pérdida y/o seroconversión de HBsAg. Aunque el PEG-IFN-a y los nucleós(t)idos están disponibles para pacientes con VHB, la mayoría (alrededor o más de un 90 %) de los pacientes tratados no logra este objetivo, lo que se debe principalmente al hecho de que los tratamientos actuales no pueden provocar la aparición de anticuerpos neutralizantes frente a1HBsAg (anti-HB), un signo de resolución de la infección por el VHB, en la mayoría de los pacientes infectados de forma crónica. De ahí que ciertamente exista una necesidad médica de disponer de tratamientos con una tasa de éxito mejorada de inducción de la pérdida y/o seroconversión de HBsAg y promoción de la producción de anti-HB.

Los documentos WO2016/146598, WO2013/096744, US2014/275167, WO2016/180695 y WO2015/132276 se refieren a compuestos/combinaciones para su uso en el tratamiento de la infección por el VHB.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un agonista de TLR7 y un inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El "agonista de TLR7" en el presente documento es un compuesto de fórmula (I) o (II), en particular, el "agonista de TLR7" en el presente documento es 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(S)-etilsulfonimidoil]-N-metil-8-oxo-N-propil-purin-7-carboxamida; 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(R)-etilsulfonimidoil]-N-metil-8-oxo-N-propil-purin-7-carboxamida; 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-N-etil-2[S(S)-etilsulfonimidoil]-N-metil-8-oxo-purin-7-carboxamida; 6-amino-2-[S(R)-etilsulfonimidoil]-N-metil-8-oxo-N-propil-9-(p-tolilmetil)purin-7-carboxamida; 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-(S(S)-etilsulfonimidoil)-7H-purin-8-ona; 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-(S(R)-etilsulfonimidoil)-7H-purin-8-ona; o 6-amino-2-(S(R)-etilsulfonimidoil)-9-(p-tolilmetil)-7H-purin-8-ona; o una sal, enantiómero o diastereómero farmacéuticamente aceptable de los mismos. El inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB en el presente documento es un compuesto de fórmula (III), en particular, el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB en el presente documento es ácido 3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-etoxicarbonil-4-(3-fluoro-2-metil-fenil)-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8a-tetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico; ácido 3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-cloro-3-fluoro-fenil)-5-etoxicarbonil-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8atetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico; o una sal, enantiómero o diastereómero farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Breve descripción de las figuras

Figura 1 Difracción de rayos X de monocristal del compuesto 1.

Figura 2 Difracción de rayos X de monocristal del compuesto 3.

Figura 3 Difracción de rayos X de monocristal del compuesto 4-a.

La figura 4 muestra el nivel de ADN del VHB (figura 4A), HBsAg (figura 4B) y anticuerpo anti-HB (figura 4C) de los ratones infectados por el VAA-VHB tratados con vehículo, 10 mg/kg de compuesto 4 una vez a la semana, 20 mg/kg de compuesto 5 una vez al día y politerapia durante 42 días seguida de un periodo sin tratamiento de 42 días. Los resultados se presentan como media ± EEM. LIC: límite inferior de cuantificación.

La figura 4-D muestra los bazos obtenidos el día 84 en el ejemplo 5 para identificar linfocitos B productores de anticuerpos anti-HB por ELISPOT. Las manchas en el grupo Combo representaron la presencia de linfocitos B que producían activamente anticuerpos anti-HB.

La figura 5 muestra el nivel de ADN del VHB (figura 5A), HBsAg (figura 5B) y anticuerpo anti-HB (figura 5C) de los ratones infectados por el VAA-VHB tratados con vehículo, 1 mg/kg de compuesto 3 una vez cada dos semanas, 20 mg/kg de compuesto 5 una vez al día y politerapia durante 42 días seguida de un periodo sin tratamiento de 45 días. Los resultados se presentan como media ± EEM. LIC: límite inferior de cuantificación.

Descripción detallada de la invención

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención.

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un agonista de TLR7 y un inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB, en un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que el agonista de TLR7 es un compuesto de fórmula (I):

en la que

R1 es alquilo C1-6;

R2 es bencilo, estando dicho bencilo no sustituido o sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno y alquilo C1-6;

R3 es -N R 4R5, en el que

R4 es alquilo C1-6 o alcoxi C1-6-alquilo C1-6;

R5 es (alquil C1-6)2NCOO-alquilo C1-6, alcoxi C1-6-alquilo C1-6, alcoxi C1-6-carbonil-(alquil C1-6)-aminoalquilo C1-6, alcoxi C1-6-carbonil-(fenil)-alquilo C1-6, alcoxi C1-6-carbonil-alquilo C1-6, alcoxi C1-6-carboniloxi-alquilo C1-6, alquilo C1-6, alquil C1-6-carbonil-(alquil C1-6)-aminoalquilo C1-6 o pirrolidinilcarbamoiloxialquilo C1-6; o

R4 y R5, conjuntamente con el nitrógeno al que están unidos, forman un heterociclilo;

o una sal, enantiómero o diastereómero farmacéuticamente aceptable de los mismos;

o en la que el agonista de TLR7 es un compuesto de fórmula (II):

en la que

R4 es alquilo Ci-6, haloalquilo Ci-6, cicloalquilo C3-7-alquilo Ci-6, alcoxi Ci-6-alquilo Ci-6 o pirrolidinilalquilo Ci-6; R5 es alquilo Ci-6, fenilalquilo Ci-6, piridinilalquilo Ci-6 o pirimidinilalquilo Ci-6, dicho fenilalquilo Ci-6, piridinilalquilo Ci-6 y pirimidinilalquilo Ci-6 están no sustituidos o sustituidos con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo Ci-6, alcoxi Ci-6, ciano, carboxi, carbamoílo, haloalquilo Ci-6, alquil Ci-6-sulfonilo, alcoxi Ci-6-carbonilo, alcoxi Ci-6-alquil Ci-6-aminocarbonilo, pirrolidinilcarbonilo y piperidinilcarbonilo; R6 es H;

en la que el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB es un compuesto de fórmula (III):

en la que

R⁷es hidrógeno, halógeno o alquilo C i ^-6;

R⁸es hidrógeno o halógeno;

R⁹es hidrógeno o halógeno;

Rⁱ⁰es alquilo Ci ^-6;

Ri i es hidrógeno, hidroxialquilo C i ^-6, aminocarbonilo, alcoxi C i ^-6-carbonilo o carboxi;

Rⁱ²es hidrógeno, alcoxi Ci ^-6-carbonilo o carboxi-CmH2m-;

X es carbonilo o sulfonilo;

Y es -CH 2-, -O - o -N(R13)-,

en el que R13 es hidrógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, cicloalquil C3-7-CmH2m-, alcoxi C1-6-carbonil-CmH2m-, -CtH2t-COOH, -haloalquil C1-6-COOH, -(alcoxi C1-6)-alquil C1-6-COOH, -alquil C1-6-O-alquil C1-6-COOH, -cicloalquil C3-7-CmH2m-COOH, -CmH2m-cicloalquil C3-7-COOH, hidroxi-CtH2t-, carboxiespiro[3.3]heptilo o carboxifenil-CmH2m-, carboxipiridinil-CmH2m-;

W es -CH 2-, -C(alquilo C1-6)2-, -O - o carbonilo;

n es 0 o 1;

m es 0-7;

t es 1-7;

o una sal, enantiómero o diastereómero farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Como se usa en el presente documento, el término "alquilo C1-6" se refiere a un grupo hidrocarburo saturado lineal 0 ramificado monovalente de 1 a 6 átomos de carbono. En modos de realización particulares, alquilo C1-6 tiene de 1 a 6 átomos de carbono, y, en modos de realización más particulares, de 1 a 4 átomos de carbono. Los ejemplos de alquilo C1-6 incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, /so-butilo, sec-butilo o ferc-butilo.

Como se usa en el presente documento, el término "alcoxi C1-6" se refiere a un grupo alquil C1-6-O-, en el que el "alquilo C1-6" es como se define anteriormente; por ejemplo metoxi, etoxi, propoxi, /so-propoxi, n-butoxi, /so-butoxi, 2-butoxi y ferc-butoxi. Los grupos "alcoxi C1-6" particulares son metoxi y etoxi.

Como se usa en el presente documento, el término "halo" o "halógeno" se usa de manera intercambiable en el presente documento y se refiere a flúor, cloro, bromo o yodo.

El término "haloalquilo C1-6" se refiere a un grupo alquilo en el que al menos uno de los átomos de hidrógeno del grupo alquilo se ha reemplazado por átomos de halógeno iguales o diferentes, en particular, átomos de flúor. Los ejemplos de haloalquilo C1-6 incluyen monofluoro-, difluoro- o trifluorometilo, -etilo o -propilo, por ejemplo, 3,3,3-trifluoropropilo, 2-fluoroetilo, 2,2,2-trifluoroetilo, fluorometilo, difluoroetilo o trifluorometilo.

El término "carbonilo", solo o en combinación, se refiere al grupo -C(O)-.

El término "alquil C1-6-carbonilo" se refiere a un grupo alquil C1-6-C(O)-, en el que el "alquilo C1-6" es como se define anteriormente. El grupo "alquil C1-6-carbonilo" particular es acetilo.

El término "alcoxi C1-6-carbonilo" se refiere a un grupo alcoxi C1-6-C(O)-, en el que el "alcoxi C1-6" es como se define anteriormente.

El término "cicloalquilo C3-7", solo o en combinación, se refiere a un anillo de carbono saturado que contiene de 3 a 7 átomos de carbono, en particular, de 3 a 6 átomos de carbono, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y cicloheptilo. Los grupos "cicloalquilo C3-7" particulares son ciclopropilo, ciclopentilo y ciclohexilo. El término "-CmH2m-", solo o en combinación, significa un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada saturado que contiene m (m t 0) átomos de carbono o un enlace (m = 0 ). En particular, "-CmH2m-", solo o en combinación, significa un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada saturado que contiene de 1 a 4 átomos de carbono. El término "carboxi-CmH2m-" se refiere a un grupo "-CmH2m-COOH", en el que el "-CmH2m-" es como se define anteriormente.

El término "cicloalquil C3-7-CmH2m-" se refiere a un grupo "cicloalquilo C3-7" como se define anteriormente, en el que uno de los átomos de hidrógeno del grupo "cicloalquilo C3-7" está reemplazado por un grupo "-CmH2m-".

El término "heterociclilo" indica un sistema de anillo mono- o bicíclico saturado o parcialmente insaturado monovalente de 3 a 10 átomos de anillo, que comprende de 1 a 5 heteroátomos de anillo seleccionados de N, O y S, siendo los átomos de anillo restantes carbono. En modos de realización particulares, heterociclilo es un sistema de anillo monocíclico saturado monovalente de 4 a 7 átomos de anillo, que comprende 1, 2, o 3 heteroátomos de anillo seleccionados de N, O y S, siendo los átomos de anillo restantes carbono. Los ejemplos para heterociclilo saturado monocíclico son aciridinilo, oxiranilo, acetidinilo, oxetanilo, pirrolidinilo, dimetilpirrolidinilo, etoxicarbonilpirrolidinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotienilo, pirazolidinilo, imidazolidinilo, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, tiazolidinilo, piperidinilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, piperacinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, dioxotiomorfolinilo, acepanilo, diacepanilo, homopiperacinilo u oxacepanilo. El heterociclilo saturado monocíclico puede estar sustituido además con de uno a tres sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6 y alcoxi C1-6-carbonilo. Los ejemplos para heterociclilo saturado monocíclico sustituido son 4-metilpiperacinilo, dimetilpirrolidinilo, etoxicarbonilpirrolidinilo, difluoropirrolidinilo, fluoro(metil)pirrolidinilo. Los ejemplos para heterociclilo saturado bicíclico son azabiciclo[3.2.1]octilo, quinuclidinilo, oxaazabiciclo[3.2.1]octilo, azabiciclo[3.3.1]nonilo, oxaazabiciclo[3.3.1]nonilo, tiaazabiciclo[3.3.1]nonilo, azaespiro[3.3]heptanilo y oxaazaespiro[3.3]heptanilo. Los ejemplos para heterociclilo parcialmente insaturado son dihidrofurilo, imidazolinilo, dihidrooxazolilo, tetrahidropiridinilo y dihidropiranilo.

Como se usa en el presente documento, el término "diastereómero" se refiere a un estereoisómero con dos o más centros de quiralidad, no siendo sus moléculas imágenes especulares entre sí. Los diastereómeros tienen diferentes propiedades físicas, por ejemplo, puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales, actividades y reactividades.

Como se usa en el presente documento, el término "enantiómeros" se refiere a dos estereoisómeros de un compuesto que son imágenes especulares no superponibles entre sí.

Como se usa en el presente documento, el término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales que no sean indeseables biológicamente o de otro modo. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adición tanto de ácido como de base.

Como se usa en el presente documento, el término "profármaco" se refiere a una forma o derivado de un compuesto que se metaboliza in vivo, por ejemplo, por fluidos biológicos o enzimas por un sujeto después de su administración, en una forma farmacológicamente activa del compuesto para producir el efecto farmacológico deseado. Se describen profármacos, por ejemplo, en Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action por Richard B. Silverman, Academic Press, San Diego, 2004, capítulo 8, Prodrugs and Drug Delivery Systems, pp. 497-558.

El término "sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable" se refiere a las sales farmacéuticamente aceptables formadas con ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido carbónico, ácido fosfórico, y ácidos orgánicos seleccionados de las clases alifática, cicloalifática, aromática, aralifática, heterocíclica, carboxílica y sulfónica de ácidos orgánicos, tales como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido glucónico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido aspártico, ácido ascórbico, ácido glutámico, ácido antranílico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido embónico, ácido fenilacético, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico y ácido salicíclico.

El término "sal de adición de base farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales farmacéuticamente aceptables formadas con una base orgánica o inorgánica. Los ejemplos de bases inorgánicas aceptables incluyen sales de sodio, potasio, amonio, calcio, magnesio, hierro, cinc, cobre, manganeso y aluminio. Las sales derivadas de bases no tóxicas orgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas, incluyendo aminas sustituidas naturales, aminas cíclicas y resinas de intercambio iónico básicas, tales como las resinas de isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2-dietilaminoetanol, trimetamina, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, etilendiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, pipericina, piperidina, /V-etilpiperidina y poliamina.

Los compuestos de fórmula general (I) que contienen uno o varios centros quirales pueden estar presentes como racematos, mezclas diaestereómeras o bien únicos isómeros ópticamente activos.

Como se usa en el presente documento, "combo" se refiere a combinación.

Como se usa en el presente documento, "RT-PCR" se refiere a la reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscripción.

Como se usa en el presente documento, "CLIA" se refiere a inmunoensayo de quimioluminiscencia.

Como se usa en el presente documento, "VAA" se refiere a virus adenoasociado.

Como se usa en el presente documento, "VAA-VHB" se refiere a un virus recombinante que tiene 1,3 copias del genoma del VHB empaquetado en cápsides del VAA. Se puede establecer un modelo de ratón con infección por el VHB crónica inyectando VAA-VHB a los ratones a través de inyección en la vena de la cola. En este modelo de ratón, la replicación del VHB activa da como resultado marcadores víricos persistentes del VHB (por ejemplo, ADN del VHB, HBsAg, HBeAg, etc.).

Como se usa en el presente documento, "HBsAg" se refiere al antígeno de superficie del virus de la hepatitis B.

Como se usa en el presente documento, "HBeAg" se refiere al antígeno e del virus de la hepatitis B.

Como se usa en el presente documento, "anti-HB" se refiere a anticuerpos frente a1HBsAg.

Como se usa en el presente documento, "cebadores específicos para el VHB" se refiere a un par de ácidos nucleicos monocatenarios que sirve como puntos de inicio y finalización para la amplificación específica de regiones de ADN del VHB.

Como se usa en el presente documento, "TLR7" se refiere al receptor 7 de tipo Toll de cualquier especie de origen (por ejemplo, humano, murino, marmota, etc.).

Como se usa en el presente documento, "agonista de TLR7" se refiere a un compuesto que actúa como agonista de TLR7. A menos que se indique de otro modo, un agonista de TLR7 puede incluir el compuesto en cualquier forma farmacéuticamente aceptable, incluyendo cualquier isómero (por ejemplo, diastereómero o enantiómero), sal, solvato y polimorfo. El agonismo de TLR para un compuesto particular se puede determinar de cualquier manera adecuada. Por ejemplo, se describen ensayos para detectar el agonismo de TLR de los compuestos de prueba, por ejemplo, en la solicitud de patente provisional de EE. UU. con n.° de serie 60/432.650, presentada el 11 de diciembre de 2002, y se describen líneas celulares recombinantes adecuadas para su uso en dichos ensayos, por ejemplo, en la solicitud de patente provisional de EE. UU. con n.° de serie 60/432.651, presentada el 11 de diciembre de 2002.

En un modo de realización de la presente invención, un "agonista de TLR7" es un compuesto de fórmula (I):

en la que

R¹es alquilo C1-6;

R²es bencilo, estando dicho bencilo no sustituido o sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno y alquilo C1-6;

R³es -N R ⁴R⁵, en el que

R⁴es alquilo C1-6 o alcoxi C1-6-alquilo C1-6;

R⁵es (alquil C1-6)2NCOO-alquilo C1-6, alcoxi C1-6-alquilo C1-6, alcoxi C1-6-carbonil-(alquil C1-6)-aminoalquilo C1-6, alcoxi C1-6-carbonil-(fenil)-alquilo C1-6, alcoxi C1-6-carbonil-alquilo C1-6, alcoxi C1-6-carboniloxi-alquilo C1-6, alquilo C1-⁶, alquil C1-6-carbonil-(alquil C1-6)-aminoalquilo C1-6 o pirrolidinilcarbamoiloxialquilo C1-6; o

R⁴y R⁵, conjuntamente con el nitrógeno al que están unidos, forman un heterociclilo;

En otro modo de realización de la presente invención, un "agonista de TLR7" es un compuesto de fórmula (II):

en la que

R⁴es alquilo C i ^-6, haloalquilo C i ^-6, cicloalquilo C^3-7-alquilo Ci ^-6, alcoxi C-i ^-6-alquilo C-1-6 o pirrolidinilalquilo C i ^-6;

R⁵es alquilo Ci ^-6, fenilalquilo C i ^-6, piridinilalquilo Ci ^-6o pirimidinilalquilo C i ^-6, dicho fenilalquilo Ci ^-6, piridinilalquilo Ci ^-6y pirimidinilalquilo Ci ^-6están no sustituidos o sustituidos con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo Ci ^-6, alcoxi Ci ^-6, ciano, carboxi, carbamoílo, haloalquilo C i ^-6, alquil Ci ^-6-sulfonilo, alcoxi Ci ^-6-carbonilo, alcoxi Ci ^-6-alquil C i ^-6-aminocarbonilo, pirrolidinilcarbonilo y piperidinilcarbonilo;

R⁶es H;

Más en particular, el agonista de TLR7 de acuerdo con la presente invención se refiere a 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(S)-etilsulfonimidoil]-W-metil-8-oxo-W-propil-purin-7-carboxamida; 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(R)-etilsulfonimidoil]-W-metil-8-oxo-W-propil-purin-7-carboxamida; 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-W-etil-2[S(S)-etilsulfonimidoil]-W-metil-8-oxo-purin-7-carboxamida; 6-amino-2-[S(R)-etilsulfonimidoil]-W-metil-8-oxo-W-propil-9-(p-tolilmetil)purin-7-carboxamida; o una sal, enantiómero o diastereómero farmacéuticamente aceptable de los mismos. Después de su administración los compuestos de fórmula (I) se metabolizan en sus formas activas, que son agonistas de TLR7 útiles.

Como se usa en el presente documento, "virus de la hepatitis B" o "VHB" se refiere a un miembro de la familia de Hepadnaviridae que tiene un pequeño genoma con ADN bicatenario de aproximadamente 3200 pares de bases y tropismo por las células hepáticas. "VHB" incluye el virus de la hepatitis B que infecta a cualquiera de una variedad de huéspedes mamíferos (por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, etc.) y aviares (patos, etc.). "VHB" incluye cualquier genotipo del VHB conocido, por ejemplo, serotipo A, B, C, D, E, F y G; cualquier serotipo del VHB o subtipo del VHB; cualquier cepa aislada del v HB; variantes del VHB, por ejemplo, variantes negativas para HBeAg, variantes del VHB resistentes a fármacos (por ejemplo, variantes resistentes a lamivudina; mutantes resistentes a adefovir; mutantes resistentes a tenofovir; mutantes resistentes a entecavir; etc.).

Como se usa en el presente documento, "inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB" se refiere a un compuesto que inhibe y/o altera y/o acelera y/o dificulta y/o retrasa y/o reduce y/o modifica el ensamblaje normal de la cápside del VHB (por ejemplo, durante la maduración) y/o desensamblaje normal de la cápside (por ejemplo, durante la infecciosidad) y/o perturba la estabilidad de la cápside, induciendo de este modo una morfología y función de la cápside anómalas.

En un modo de realización de la presente invención, el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB es un compuesto de fórmula (III):

en la que

R⁷es hidrógeno, halógeno o alquilo C i-a;

R⁸es hidrógeno o halógeno;

R⁹es hidrógeno o halógeno;

R¹⁰es alquilo Ci-a ;

R¹¹es hidrógeno, hidroxialquilo C i-a , aminocarbonilo, alcoxi C i-a-carbonilo o carboxi;

R¹²es hidrógeno, alcoxi C1-a-carbonilo o carboxi-CmH2m-;

X es carbonilo o sulfonilo;

Y es -CH 2-, -O - o -N(R ¹³)-,

en el que R¹³es hidrógeno, alquilo C1-a, haloalquilo C1-a, cicloalquil C^3-7-CmH²m-, alcoxi Ci-6 -carbonil-CmH2m-, -C tH2t-COOH, -haloalquil C1-a-COOH, -(alcoxi C1-a)-alquil C1-a-COOH, -alquil C1-a-O-alquil C1-a-COOH, -cicloalquil C^3-7-CmH²m-COOH, -C mH2m-cicloalquil C3-7-COOH, hidroxi-CtH2t-, carboxiespiro[3.3]heptilo o carboxifenil-CmH2m-, carboxipiridinil-CmH2m-;

W es -CH 2-, -C(alquilo C1-a)2-, -O - o carbonilo;

n es 0 o 1;

m es 0-7;

t es 1-7;

o sales o enantiómeros o diastereómeros farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Más en particular, el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB de acuerdo con la presente invención se refiere a ácido 3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-etoxicarbonil-4-(3-fluoro-2-metil-fenil)-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-a-il]metil]-3-oxo-5,a,8,8a-tetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico; ácido 3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-cloro-3-fluoro-fenil)-5-etoxicarbonil-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-a-il]metil]-3-oxo-5,a,8,8a-tetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico; o una sal, enantiómero o diastereómero farmacéuticamente aceptable de los mismos. En otro modo de realización, un "inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB" es uno cualquiera de los compuestos divulgados en las patentes WO2015/13227a, WO 2014/184328 y WO2014/037480.

En un modo de realización de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un agonista de TLR7 y un inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB, en la que el agonista de TLR7 y el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB se seleccionan independientemente de la tabla 1. (Los compuestos 5 y 6 se divulgaron en la patente WO2015/132276).

Tabla 1. Lista de agonistas de TLR7 y cápside del VHB

Más en particular, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un agonista de TLR7 y un inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB que se selecciona de una cualquiera de las siguientes combinaciones:

compuesto 1 y compuesto 5; compuesto 1 y compuesto 6;

compuesto 2 y compuesto 5; compuesto 2 y compuesto 6;

compuesto 3 y compuesto 5; compuesto 3 y compuesto 6;

compuesto 4 y compuesto 5; compuesto 4 y compuesto 6;

compuesto 1 e-A y compuesto 5; compuesto 1 e-A y compuesto 6;

compuesto 1e-B y compuesto 5; compuesto 1e-B y compuesto 6;

compuesto 4f-A y compuesto 5; y compuesto 4f-A y compuesto 6.

El compuesto 1 a 6, 1e-A, 1e-B y 4f-A de dicha combinación anterior se puede reemplazar por su correspondiente sal, enantiómero o diastereómero farmacéuticamente aceptable, que es otro aspecto de la presente invención. En un modo de realización de la presente invención, la composición farmacéutica consiste en un agonista de TLR7 y un inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Más en particular, la composición consiste en:

6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(S)-etilsulfonimidoil]-N-metil-8-oxo-N-propil-purin-7-carboxamida y ácido 3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-etoxicarbonil-4-(3-fluoro-2-metil-fenil)-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8atetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico;

6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(S)-etilsulfonimidoil]-N-metil-8-oxo-N-propil-purin-7-carboxamida y ácido 3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-cloro-3-fluoro-fenil)-5-etoxicarbonil-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8atetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico;

6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(R)-etilsulfonimidoil]-N-metil-8-oxo-N-propil-purin-7-carboxamida y ácido 3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-etoxicarbonil-4-(3-fluoro-2-metil-fenil)-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8atetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico;

6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(R)-etilsulfonimidoil]-N-metil-8-oxo-N-propil-purin-7-carboxamida y ácido 3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-cloro-3-fluoro-fenil)-5-etoxicarbonil-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8atetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico;

6- amino-9-[(4-clorofenil)metil]-N-etil-2[S(S)-etilsulfonimidoil]-N-metil-8-oxo-purin-7-carboxamida y ácido 3-[(8aS)-7- [[(4S)-5-etoxicarbonil-4-(3-fluoro-2-metil-fenil)-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8atetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico;

6- amino-9-[(4-clorofenil)metil]-N-etil-2[S(S)-etilsulfonimidoil]-N-metil-8-oxo-purin-7-carboxamida y ácido 3-[(8aS)-7- [[(4R)-4-(2-cloro-3-fluoro-fenil)-5-etoxicarbonil-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8atetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico;

6-amino-2-[S(R)-etilsulfonimidoil]-W-metil-8-oxo-W-propil-9-(p-tolilmetil)purin-7-carboxamida y ácido 3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-etoxicarbonil-4-(3-fluoro-2-metil-fenil)-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8a-tetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico;

6-amino-2-[S(R)-etilsulfonimidoil]-W-metil-8-oxo-W-propil-9-(p-tolilmetil)purin-7-carboxamida y ácido 3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-cloro-3-fluoro-fenil)-5-etoxicarbonil-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8a-tetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico;

6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-(S(S)-etilsulfonimidoil)-7H-purin-8-ona y ácido 3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-etoxicarbonil-4-(3-fluoro-2-metil-fenil)-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8a-tetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico;

6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-(S(S)-etilsulfonimidoil)-7H-purin-8-ona y ácido 3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-cloro-3-fluoro-fenil)-5-etoxicarbonil-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8a-tetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico;

6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-(S(R)-etilsulfonimidoil)-7H-purin-8-ona y ácido 3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-etoxicarbonil-4-(3-fluoro-2-metil-fenil)-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8a-tetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico;

6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-(S(R)-etilsulfonimidoil)-7H-purin-8-ona y ácido 3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-cloro-3-fluoro-fenil)-5-etoxicarbonil-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8a-tetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico;

6-amino-2-(S(R)-etilsulfonimidoil)-9-(p-tolilmetil)-7H-purin-8-ona y ácido 3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-etoxicarbonil-4-(3-fluoro-2-metil-fenil)-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8a-tetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico; o

6-amino-2-(S(R)-etilsulfonimidoil)-9-(p-tolilmetil)-7H-purin-8-ona y ácido 3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-cloro-3-fluoro-fenil)-5- etoxicarbonil-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8a-tetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico;

en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otro modo de realización de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que consiste en

6- amino-9-[(4-clorofenil)metil]-W-etil-2[S(S)-etilsulfonimidoil]-W-metil-8-oxo-purin-7-carboxamida y ácido 3-[(8aS)-7- [[(4S)-5-etoxicarbonil-4-(3-fluoro-2-metil-fenil)-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8atetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico; o

en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro modo de realización de la presente invención, la composición farmacéutica puede comprender adicionalmente uno o más de otros agentes antivíricos, que incluyen lamivudina, adefovir, tenofovir, telbivudina y entecavir.

Las dosificaciones típicas de un agonista de TLR7 y/o un inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB pueden estar en los intervalos recomendados por el fabricante y, cuando así lo indiquen las respuestas in vitro en modelos animales, se pueden reducir en hasta aproximadamente un orden de magnitud de concentración o cantidad. Por tanto, la dosificación real dependerá del criterio del médico, del estado del paciente y la eficacia del procedimiento terapéutico en base a la reactividad in vitro de los modelos animales apropiados.

Otro modo de realización de la presente solicitud se refiere a un procedimiento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de la infección por el virus de la hepatitis B, caracterizado por que en el medicamento se usan un agonista de TLR7 y un inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB.

Otro modo de realización de la presente solicitud se refiere al procedimiento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de la infección por el virus de la hepatitis B, caracterizado por que el agonista de TLR7 y el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB se administran conjuntamente en la misma formulación o en una formulación diferente.

Para los propósitos de la presente invención, "administrar conjuntamente" se refiere a cualquier administración del agonista de TLR7 y el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB como dos agentes activos, por separado o bien conjuntamente, donde los dos agentes activos se administran como parte de una pauta posológica apropiada diseñada para obtener el beneficio de la politerapia. Por tanto, los dos agentes activos se pueden administrar como parte de la misma composición farmacéutica o bien en composiciones farmacéuticas separadas. Además, los dos agentes activos se pueden administrar al mismo tiempo o bien de forma secuencial.

El agonista de TLR7 y el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB se pueden administrar con diversos vehículos inertes farmacéuticamente aceptables en forma de comprimidos, cápsulas, pastillas para chupar, trociscos, caramelos duros, polvos, pulverizaciones, cremas, bálsamos, supositorios, gelatinas, geles, pastas, lociones, pomadas, elixires y jarabes. La administración de dichas formas farmacéuticas se puede llevar a cabo en dosis únicas o múltiples. Los vehículos incluyen diluyentes sólidos de cargas, medios acuosos estériles y diversos disolventes orgánicos no tóxicos. La administración de dichas formas farmacéuticas se puede llevar a cabo a través de administración oral, administración parenteral, administración veterinaria.

Otro modo de realización de la presente solicitud se refiere al procedimiento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de la infección por el virus de la hepatitis B, caracterizado por que el agonista de TLR7 y el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB están destinados a su administración a un sujeto por la misma vía o vías diferentes.

Otro modo de realización de la presente solicitud se refiere al procedimiento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de la infección por el virus de la hepatitis B, caracterizado por que el agonista de TLR7 y el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB están destinados a su administración a un sujeto por administración parenteral u oral.

Otro modo de realización de la presente solicitud se refiere al procedimiento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de la infección por el virus de la hepatitis B, caracterizado por que la administración del agonista de TLR7 y el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB a un sujeto es simultánea o secuencial. En cualquiera de los procedimientos de la presente invención, se puede realizar la administración de agentes de forma simultánea administrando agentes por separado o de forma secuencial al mismo tiempo, o conjuntamente como una combinación fija. Además, en cualquiera de los procedimientos de la presente invención, la administración de agentes por separado o de forma secuencial puede ser en cualquier orden.

Otro modo de realización de la presente solicitud se refiere al procedimiento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de la infección por el virus de la hepatitis B, caracterizado por que el agonista de TLR7 del mismo es un compuesto de fórmula (I) o fórmula (II), o una sal, enantiómero o diastereómero de los mismos. En particular, el agonista de TLR7 es 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(S)-etilsulfonimidoil]-W-metil-8-oxo-W-propil-purin-7-carboxamida; 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(R)-etilsulfonimidoil]-W-metil-8-oxo-W-propilpurin-7-carboxamida; 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-W-etil-2[S(S)-etilsulfonimidoil]-W-metil-8-oxo-purin-7-carboxamida; 6-amino-2-[S(R)-etilsulfonimidoil]-W-metil-8-oxo-W-propil-9-(p-tolilmetil)purin-7-carboxamida; 6 amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-(S(S)-etilsulfonimidoil)-7H-purin-8-ona; 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-(S(R)-etilsulfonimidoil)-7H-purin-8-ona; o 6-amino-2-(S(R)-etilsulfonimidoil)-9-(p-tolilmetil)-7H-purin-8-ona; o una sal, enantiómero o diastereómero farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Otro modo de realización de la presente solicitud se refiere al procedimiento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de la infección por el virus de la hepatitis B, caracterizado por que el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB del mismo es un compuesto de fórmula (III), o una sal, enantiómero o diastereómero farmacéuticamente aceptable del mismo. En particular, el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB es ácido 3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-etoxicarbonil-4-(3-fluoro-2-metil-fenil)-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8a-tetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico; ácido 3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-cloro-3-fluoro-fenil)-5-etoxicarbonil-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8a-tetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico; o una sal, enantiómero o diastereómero farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Otro modo de realización de la presente solicitud se refiere al procedimiento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de la infección por el virus de la hepatitis B, caracterizado por que el medicamento comprende adicionalmente uno o más de otros agentes antivíricos, que incluyen lamivudina, adefovir, tenofovir, telbivudina y entecavir.

Otro modo de realización de la presente solicitud se refiere al procedimiento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de la infección por el virus de la hepatitis B, en el que el agonista de TLR7 y el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB usados en el medicamento son:

en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otro modo de realización de la presente invención se refiere a un kit que comprende un recipiente que comprende un agonista de TLR7 y un inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB, dicho kit puede comprender además un diluyente estéril.

Otro modo de realización de la presente invención se refiere a dicho kit, en el que el kit puede comprender además un prospecto del envase que comprende instrucciones impresas que dirigen el uso de un tratamiento combinado de un agonista de TLR7 y un inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB como procedimiento para el tratamiento o profilaxis de la infección por el virus de la hepatitis B.

Otro modo de realización de la presente invención se refiere a dicho kit, en el que el agonista de TLR7 es:

6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(S)-etilsulfonimidoil]-W-metil-8-oxo-W-propil-purin-7-carboxamida;

6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(R)-etilsulfonimidoil]-N-metil-8-oxo-N-propil-purin-7-carboxamida;

6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-N-etil-2[S(S)-etilsulfonimidoil]-N-metil-8-oxo-purin-7-carboxamida;

6-amino-2-[S(R)-etilsulfonimidoil]-N-metil-8-oxo-N-propil-9-(p-tolilmetil)purin-7-carboxamida;

6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-(S(S)-etilsulfonimidoil)-7H-purin-8-ona;

6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-(S(R)-etilsulfonimidoil)-7H-purin-8-ona; o

6-amino-2-(S(R)-etilsulfonimidoil)-9-(p-tolilmetil)-7H-purin-8-ona;

Otro modo de realización de la presente invención se refiere a dicho kit, en el que el agonista de TLR7 y el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB usados en el recipiente son:

6- amino-9-[(4-clorofenil)metil]-N-etil-2[S(S)-etilsulfonimidoil]-N-metil-8-oxo-purin-7-carboxamida y ácido 3-[(8aS)-7- [[(4S)-5-etoxicarbonil-4-(3-fluoro-2-metil-fenil)-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8atetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico; o

6- amino-2-[S(R)-etilsulfonimidoil]-N-metil-8-oxo-N-propil-9-(p-tolilmetil)purin-7-carboxamida y ácido 3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-etoxicarbonil-4-(3-fluoro-2-metil-fenil)-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8a-tetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico;

en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otro modo de realización de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o profilaxis de la infección por el virus de la hepatitis B, que comprende la administración a un sujeto de una primera cantidad eficaz de un agonista de TLR7, o una sal, enantiómero o diastereómero farmacéuticamente aceptable del mismo; y una segunda cantidad de inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB, o una sal, enantiómero o diastereómero farmacéuticamente aceptable del mismo; en la que el agonista de TLR7 es 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(S)-etilsulfonimidoil]-W-metil-8-oxo-W-propil-purin-7-carboxamida; 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(R)-etilsulfonimidoil]-W-metil-8-oxo-W-propil-purin-7-carboxamida; 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-W-etil-2[S(S)-etilsulfonimidoil]-W-metil-8-oxo-purin-7-carboxamida; 6-amino-2-[S(R)-etilsulfonimidoil]-W-metii-8-oxo-W-propil-9-(p-tolilmetil)purin-7-carboxamida; 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-(S(S)-etilsulfonimidoil)-7H-purin-8-ona; 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-(S(R)-etilsulfonimidoil)-7H-purin-8-ona; o 6-amino-2-(S(R)-etilsulfonimidoil)-9-(p-tolilmetil)-7H-purin-8-ona; o una sal, enantiómero o diastereómero farmacéuticamente aceptable de los mismos; y el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB es ácido 3-[(8aS)-7- [[(4S)-5-etoxicarbonil-4-(3-fluoro-2-metil-fenil)-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8atetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico; o ácido 3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-cloro-3-fluoro-fenil)-5- etoxicarbonil-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8a-tetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico; o una sal, enantiómero o diastereómero farmacéuticamente aceptable de los mismos. Otro modo de realización de la presente invención se refiere al uso de la composición farmacéutica mencionada anteriormente en el presente documento como un medicamento antivírico, en particular, como el medicamento para el tratamiento o profilaxis de la infección por el virus de la hepatitis B.

Otro modo de realización de la presente solicitud se refiere al uso de un agonista de TLR7 y un inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB para la fabricación de la composición farmacéutica mencionada anteriormente como un medicamento antivírico, en particular, el medicamento para el tratamiento o profilaxis de la infección por el virus de la hepatitis B.

La composición farmacéutica para su uso como se describe anteriormente, en la que el agonista de TLR7 es 6- amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(S)-etilsulfonimidoil]-N-metil-8-oxo-N-propil-purin-7-carboxamida;

6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]--N-etil-2-[S(S)-etilsulfonimidoil]-N-metil-8-oxo-purin-7-carboxamida;

6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-(S(S)-etilsulfonimidoil)-7H-purin-8-ona;

6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-(S(R)-etilsulfonimidoil)-7H-purin-8-ona; o

6-amino-2-(S(R)-etilsulfonimidoil)-9-(p-tolilmetil)-7H-purin-8-ona;

La composición farmacéutica para su uso como se describe anteriormente, en la que el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB es

ácido 3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-etoxicarbonil-4-(3-fluoro-2-metil-fenil)-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8a-tetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico; o

ácido 3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-cloro-3-fluoro-fenil)-5-etoxicarbonil-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8a-tetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico;

La composición farmacéutica para su uso como se describe anteriormente, en la que el agonista de TLR7 y el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB usados son:

6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-N-etil-2[S(S)-etilsulfonimidoil]-N-metil-8-oxo-purin-7-carboxamida y ácido 3-[(8aS) 7-[[(4S)-5-etoxicarbonil-4-(3-fluoro-2-metil-fenil)-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8atetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico; o

6-amino-2-[S(R)-etilsulfonimidoil]-N-metil-8-oxo-N-propil-9-(p-tolilmetil)purin-7-carboxamida y ácido 3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-etoxicarbonil-4-(3-fluoro-2-metil-fenil)-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8a-tetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico;

en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La composición farmacéutica para su uso como se describe anteriormente, en la que el agonista de TLR7 y el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB se administran conjuntamente en la misma formulación o en una formulación diferente.

La composición farmacéutica para su uso como se describe anteriormente, en la que el agonista de TLR7 y el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB están destinados a su administración a un sujeto por la misma vía o vías diferentes.

La composición farmacéutica para su uso como se describe anteriormente, en la que el agonista de TLR7 y el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB están destinados a su administración a un sujeto por administración parenteral u oral.

La composición farmacéutica para su uso como se describe anteriormente, en la que la administración es simultánea o secuencial.

Ejemplos

La invención se entenderá más completamente por referencia a los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

6-Amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(S)-etilsulfonimidoil]-W-metil-8-oxo-W-propil-purin-7-carboxamida (compuesto 1) y 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(R)-etilsulfonimidoil]-W-metil-8-oxo-W-propil-purin-7-carboxamida (compuesto 2)

A una solución de trifosgeno (5,9 g) en THF seco (40 ml) se le añadió (4-clorofenil)metilamina (8,5 g, Accela ChemBio Inc., número de catálogo: SY004062-25g) y DIPEA (12,4 g) en THF seco (80 ml) a -80 °C. Se agitó la solución a -80 °C durante 15 min. Se le añadió una solución de p-toluenosulfonato de aminomalononitrilo (15,2 g, TCI, número de catálogo: A1119-25G) y DIPEA (6,2 g) en THF seco (40 ml) a -80 °C. Después de agitar a temperatura ambiente durante 24 h, se concentró la reacción a vacío y se repartió el residuo entre EtOAc (300 ml) y agua (150 ml). Se lavó dos veces la fase orgánica separada con salmuera (50 ml) y se extrajo dos veces con solución de hidróxido de sodio (50 ml, 1 N). Se neutralizó la fase de solución de hidróxido de sodio combinada con solución de hidrogenosulfato de sodio al 10 % en peso y se extrajo dos veces con EtOAc (50 ml). Se lavó la fase orgánica combinada con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró a vacío. Se trituró el residuo con éter dietílico y se recogió y secó el precipitado resultante para dar 4-amino-3-[(4-clorofenil)metil]-2-oxo-1H-imidazol-5-carbonitrilo (8,0 g, compuesto 1A) como un sólido amarillo. EM obs. (ESI+) [(M+H)+]: 249.

Etapa 2: preparación de 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-sulfanil-7H-purin-8-ona

A una solución de 4-amino-3-[(4-clorofenil)metil]-2-oxo-1H-imidazol-5-carbonitrilo (8,0 g, 32,0 mmol, compuesto 1a) en THF (100 ml) se le añadió gota a gota benzoilisotiocianato (11,5 g, 70,4 mmol, TCI, número de catálogo: A11596-100G). Después de agitar a temperatura ambiente durante 12 h, se concentró la mezcla de reacción a vacío. Se trituró el residuo en éter dietílico (100 ml) y se recogió el precipitado resultante por filtración.

A una solución del precipitado obtenido en THF (300 ml) se le añadió hidróxido de sodio (30 ml, 2 N). Se sometió a reflujo la mezcla de reacción durante 50 h y, a continuación, se acidificó a pH 3 con solución acuosa de hidrogenosulfato de sodio al 10 % en peso. Se recogió el precipitado resultante por filtración para dar un producto bruto de 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-sulfanil-7H-purin-8-ona como un sólido amarillo (6,4 g, compuesto 1b), que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. EM obs. (ESI+) [(M+H)+]: 308.

Etapa 3: preparación de 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-etilsulfanil-7H-purin-8-ona

A una solución de 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-sulfanil-7H-purin-8-ona (4,40 g, compuesto 1 b) en DMF (50 ml) se le añadió carbonato de potasio (3,95 g, 28,59 mmol), seguido de yodoetano (2,68 g, 17,16 mmol) a 0 °C. Después de agitar a temperatura ambiente durante 12 h, se vertió la mezcla de reacción en agua (200 ml) y se acidificó con solución acuosa de hidrogenosulfato de sodio al 10 % en peso. Se recogió el precipitado resultante por filtración, y se secó para dar 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-etilsulfanil-7H-purin-8-ona (2,50 g, compuesto 1c) como un sólido blanco, que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. EM obs. (ESI+) [(M+H)+]: 336,0

Etapa 4: preparación de 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-etilsulfinil-7H-purin-8-ona

A una suspensión de 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-etilsulfanil-7H-purin-8-ona (2,2 g, compuesto 1c) en THF (100 ml) se le añadió m-CPBA (1,36 g, 7,86 mmol) a 0 °C. Después de que la mezcla de reacción se agitara a 0 °C durante 30 min, el volumen de la mezcla de reacción se redujo a vacío a aproximadamente 50 ml. Se recogió el precipitado resultante por filtración, se lavó con metanol y se secó para dar 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-etilsulfinil-7H-purin-8-ona (1,94 g, compuesto 1d) como un sólido blanco. EM obs. (ESI+) [(M+H)+]: 352,0

Etapa 5: preparación de 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-(etilsulfonimidoil)-7H-purin-8-ona

A una solución de 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-etilsulfinil-7H-purin-8-ona (1,94 g, 5,51 mmol) en reactivo de Eaton (30 ml) se le añadió NaN3 (1,08 g) en porciones a 60 °C y se agitó la mezcla a esta temperatura durante 30 min. Después de enfriar, se vertió la mezcla de reacción en una mezcla de hielo e hidróxido de amonio (100 ml, 1 M). Se recogió el precipitado resultante por filtración. Se purificó el residuo por HPLC prep. para dar 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-(etilsulfonimidoil)-7H-purin-8-ona (217 mg, compuesto 1e) como un sólido blanco. RMN de 1H (400 MHz, DMSO-de) 5 ppm: 10,61 (s, 1 H), 7,42 - 7,35 (m, 4 H), 6,98 (s, 2 H), 4,96 (s, 2 H), 4,05 (s, 1 H), 3,42 - 3,37 (m, 2 H), 1,16 (t, J = 7,4 Hz, 3 H). EM obs. (ESI+) [(M+H)+]: 367,0.

La separación del compuesto 1e (100 mg) por HPLC quiral dio el compuesto 1e-A (de elución más rápida, 31,8 mg) y el compuesto 1e-B (de elución más lenta, 10 mg) como un sólido blanco con metanol al 5 %-40 % (DEA al 0,05 %)/c O2 en columna ChiralPak IC-3.

6-Amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(S)-(etilsulfonimidoil)]-7H-purin-8-ona (compuesto 1e-A): RMN de 1H (400 MHz, DMSO-de) 5 ppm: 10,76 (s, 1 H), 7,45 - 7,33 (m, 4 H), 7,01 (s, 2 H), 4,96 (s, 2 H), 4,03 (s, 1 H), 3,40 -3,34 (m, 2 H), 1,17 (t, J = 7,4 Hz, 3 H). EM obs. (ESI+) [(M+H)+]: 367,0.

6-Amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(R)-etilsulfonimidoil)]-7H-purin-8-ona (compuesto 1e-B): RMN de 1H (400 MHz, DMSO-de) 5 ppm: 10,70 (s, 1 H), 7,46 -7,28 (m, 4 H), 7,01 (s, 2 H), 4,96 (s, 2 H), 4,03 (s, 1 H), 3,44 - 3,36 (m, 2 H), 1,17 (t, J = 7,4 Hz, 3 H). EM obs. (ESI+) [(M+H)+]: 367,0.

Etapa 6: preparación de 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(S)-etilsulfonimidoil]-W-metil-8-oxo-W-propilpurin-7-carboxamida (compuesto 1) y 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(R)-etilsulfonimidoil]-W-metiÍ-8-oxo-W-propil-purin-7-carboxamida (compuesto 2)

A una suspensión de 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(S)-(etilsulfonimidoil)]-7H-purin-8-ona (100 mg, compuesto 1e-A) en DIPEA/piridina (v/v, 1/12, 2,0 ml) se le añadió gota a gota una solución de cloruro de N-propil-N-metil-carbamoílo (148 mg, 1,09 mmol). Después de agitar a 25 °C durante 2 h, se desactivó la mezcla de reacción con MeOH (5 ml) y se concentró. Se purificó el residuo por HPLC prep. para dar 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(S)-etilsulfonimidoil]-N-metil-8-oxo-N-propil-purin-7-carboxamida (78,0 mg, compuesto 1) como un sólido blanco. EM obs. (ESI+) [(M+H)+]: 466,2

RMN de 1H (DMSO-de, 400 MHz) 5 ppm: 7,43 - 7,41 (m, 4 H), 6,90 (s, 2 H), 5,00 (s, 2 H), 4,20 (s, 1 H), 3,46 - 3,41 (m, 2 H), 3,40 - 3,39 (m, 2 H), 3,10 - 3,00 (m, 3 H), 1,69 - 1,50 (m, 2 H), 1,24 - 1,12 (m, 3 H), 0,93 - 0,73 (m, 3 H).

A una suspensión de 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(R)-(etilsulfonimidoil)]-7H-purin-8-ona (100 mg, compuesto 1e-B) en DIPEA/piridina (v/v, 1/12, 2,0 ml) se le añadió gota a gota una solución de cloruro de N-propil-N-metil-carbamoílo (148 mg, 1,09 mmol). Después de agitar a 25 °C durante 2 h, se desactivó la mezcla de reacción con MeOH (5 ml) y se concentró. Se purificó el residuo por HPLC prep. para dar 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(R)-etilsulfonimidoil]-W-metil-8-oxo-W-propil-purin-7-carboxamida (38,6 mg, compuesto 2) como un sólido blanco. EM obs. (ESI+) [(M+H)+]: 466,1

RMN de 1H (DMSO-de, 400 MHz) 5 ppm: 7,43 - 7,41 (m, 4 H), 6,90 (s, 2 H), 5,00 (s, 2 H), 4,19 (s, 1 H), 3,46-3,39 (m, 2 H), 3,39 - 3,38 (m, 2 H), 3,09-2,99 (m, 3 H), 1,69 - 1,52 (m, 2 H), 1,19 (t, J = 7,28 Hz, 3 H), 0,95 - 0,66 (m, 3 H).

Se determinó la estereoquímica del compuesto 1 por difracción de rayos X de monocristal mostrada en la figura 1.

Ejemplo 2

6-Amino-9-[(4-clorofenil)metil]-W-etil-2-[S(S)-(etilsulfonimidoil)]-W-metil-8-oxo-purin-7-carboxamida (compuesto 3)

A una suspensión de 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(S)-(etilsulfonimidoil)]-7H-purin-8-ona (100 mg, compuesto 1e-A) en DIPEA/piridina (v/v=1/12, 2,0 ml) se le añadió gota a gota una solución de cloruro de W-etil-W-metil-carbamoílo (132 mg, 1,09 mmol). Después de agitara a 25 °C durante 2 h, se desactivó la mezcla de reacción con MeOH (5 ml) y se concentró. Se purificó el residuo por HPLC prep. para dar 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(S)-etilsulfonimidoil]-W-etil-8-oxo-W-metil-purin-7-carboxamida (31,9 mg, compuesto 3). RMN de 1H (400 MHz, DMSO-de) 5 ppm: 7,43 - 7,41 (m, 4 H), 6,90 (s, 2 H), 4,99 (s, 2 H), 4,18 (s, 1 H), 3,48 - 3,40 (m, 2 H), 3,39 (s, 2 H), 3,05 - 3,01 (m, 3 H), 1,20 - 1,14 (m, 6 H). EM obs. (ESI+) [(M+H)+]: 452,2.

Se determinó la estereoquímica del compuesto 3 por la difracción de rayos X de monocristal mostrada en la figura 2.

Ejemplo 3

6-Amino-2-[S(R)-(etilsulfonimidoil)]-W-metil-8-oxo-W-propil-9-(p-tolilmetil)purin-7-carboxamida (compuesto 4)

Etapa 1: preparación de 1-(isocianatometil)-4-metilbenceno

A una solución de trifosgeno (40,5 g, 136,3 mmol) en DCM anhidro (1,2 l) se le añadió gota a gota una solución de p -tolilmetanamina (50,0 g, 413,2 mmol) y Et3N (83,4 g, 826,4 mmol) en DCM (800 ml) a -78 °C bajo nitrógeno. Después de agitar durante 1 h, se dejó que la mezcla de reacción alcanzara 20 °C y se agitó durante otras 12 h. Se diluyó la mezcla con DCM (2,0 l) y se retiraron los sólidos por filtración. Se concentró el filtrado a vacío. Se purificó el residuo por destilación (p.eb. 150 °C, 10 mmHg) para dar 1-(isocianatometil)-4-metilbenceno (30,0 g, compuesto 4a) como un aceite incoloro.

Etapa 2: preparación de 5-amino-1-(4-metilbencil)-2-oxo-2,3-dihidro-1H-imidazol-4-carbonitrilo

A una solución de 4-metilbencenosulfonato de aminomalononitrilo (32,7 g, 129,5 mmol) en THF seco (800 ml) se le añadió 1-(isocianatometil)-4-metilbenceno (20,0 g, compuesto 4a) y DIPEA (12,2 g, 94,2 mmol) a temperatura ambiente. Después de agitar a 20 °C durante 16 h, se concentró la reacción a vacío y se vertió el residuo en agua (500 ml) y se recogió el sólido gris resultante por filtración. Se extrajo tres veces el filtrado con EtOAc (300 ml). Se secó la fase orgánica separada sobre sulfato de sodio, se filtró y concentró. Se combinó el residuo con el sólido gris. Al sólido combinado se le añadió THF (200 ml) y una solución acuosa de hidróxido de sodio (300 ml, 1 N). Se agitó la mezcla a 50 °C durante 1 h, se enfrió a temperatura ambiente, se neutralizó con hidrogenosulfato de sodio al 15 % y se extrajo tres veces con EtOAc (500 ml), se lavó la fase orgánica separada con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y concentró a vacío para dar 5-amino-1-(4-metilbencil)-2-oxo-2,3-dihidro-1H-imidazol-4-carbonitrilo (26,6 g, compuesto 4b) como un sólido gris que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. EM obs. (ESI+) [(M+H)+]: 229,2.

Etapa 3: preparación de 6-amino-9-(p-tolilmetil)-2-sulfanil-7H-purin-8-ona

A una solución de 5-amino-1-(4-metilbencil)-2-oxo-2,3-dihidro-1H-imidazol-4-carbonitrilo (27,0 g, compuesto 4b) en THF (500 ml) se le añadió gota a gota isotiocianato de benzoílo (48,3 g). Después de agitar a 20 °C durante 16 h, se concentró la mezcla de reacción a vacío. Se trituró el residuo con THF (200 ml) y se recogió el precipitado resultante por filtración.

A una solución del precipitado obtenido en THF (200 ml) se le añadió hidróxido de sodio acuoso (70 ml, 2 N). Se sometió a reflujo la mezcla a 80 °C durante 20 h y, a continuación, se acidificó a pH 5 con hidrogenosulfato de potasio ac. al 15 % y se recogió el precipitado resultante por filtración para dar 6-amino-9-(p-tolilmetil)-2-sulfanil-7H-purin-8-ona (20,0 g, compuesto 4c) como un sólido amarillo. Se usó el producto en la siguiente etapa sin purificación adicional. EM obs. (ESI+) [(M+H)+]: 288.

Etapa 4: preparación de 6-amino-2-etilsulfanil-9-(p-tolilmetil)-7H-purin-8-ona

A una solución de 6-amino-9-(p-tolilmetil)-2-sulfanil-7H-purin-8-ona (19,0 g, compuesto 4c) en DMF (150 ml) se le añadió carbonato de potasio (13,7 g, 99,3 mmol), seguido de yodoetano (7,2 g, 46,3 mmol). Después de agitar a 25 °C durante 16 h, se vertió la mezcla en agua (800 ml). Se separó y secó el precipitado resultante para dar el producto bruto de 6-amino-2-etilsulfanil-9-(p-tolilmetil)-7H-purin-8-ona (13,0 g, compuesto 4d) como un sólido amarillo. EM obs. (ESI+) [(M+H)+]: 316,1.

Etapa 5: preparación de 6-amino-2-etilsulfinil-9-(p-tolilmetil)-7H-purin-8-ona

A una solución de 6-amino-2-etilsulfanil-9-(p-tolilmetil)-7H-purin-8-ona (8,8 g, compuesto 4d) en DMF (100 ml) se le añadió gota a gota m-CPBA (8,7 g, 50,0 mmol) en DMF (20,0 ml) a 0 °C. Después de agitar a esta temperatura durante 2 h, se vertió la mezcla de reacción en agua (400 ml). Se filtró el precipitado amarillo resultante, se lavó con MTBE (50 ml) y se secó para dar 6-amino-2-etilsulfinil-9-(p-tolilmetil)-7H-purin-8-ona (3,5 g, compuesto 4e) como un sólido amarillo. EM obs. (ESI+) [(M+H)+]: 332,2.

Etapa 6: preparación de 6-amino-2-(etilsulfonimidoil)-9-(p-tolilmetil)-7H-purin-8-ona

A una solución de 6-amino-2-etilsulfinil-9-(p-tolilmetil)-7H-purin-8-ona (4,3 g, compuesto 4e) en reactivo de Eaton (30,0 ml) se le añadió NaN3 (2,1 g, 32,0 mmol) en porciones a 55 °C. Después de agitar a 55 °C durante 30 min, se vertió la mezcla de reacción en una solución de hidróxido de amonio 2 M (200 ml) a 0 °C, se filtró el precipitado amarillo resultante. Se purificó el producto bruto por HPLC prep. para dar 6-amino-2-(etilsulfonimidoil)-9-(ptolilmetil)-7H-purin-8-ona (2,0 g, compuesto 4f) como un sólido blanco.

RMN de ¹H (400 MHz, DMSO-de) 5 ppm: 10,53 (s, 1 H), 7,24 (d, J = 8,03 Hz, 2 H), 7,13 (d, J = 8,03 Hz, 2 H), 6,94 (s. a., 2 H), 4,91 (s, 2 H), 4,03 (s, 1 H), 3,36 - 3,41 (m, 2 H), 2,26 (s, 3 H), 1,18 (t, J = 7,28 Hz, 3 H). EM obs. (ESI+) [(M+H)+]: 347.

La separación del compuesto 4f por HPLC quiral dio el compuesto 4f-A (de elución más rápida, 56,8 mg) y el compuesto 4f-B (de elución más lenta, 56,7 mg) como sólidos blancos con metanol al 5 %-40 % (DEA al 0,05 %)/CO2 en columna ChiralPak AD-3.

Compuesto 4f-A: RMN de 1H (400 MHz, DMSO-de) 5 ppm: 10,52 (s. a., 1 H), 7,23 (d, J = 8,0 Hz, 2 H), 7,13 (d, J = 7,9 Hz, 2 H), 6,94 (s. a., 2 H), 4,90 (s, 2 H), 4,03 (s, 1 H), 3,42 - 3,33 (m, 2 H), 2,25 (s, 3 H), 1,17 (t, J = 7,3 Hz, 3 H). EM obs. (ESI+) [(M+H)+]: 347.

Compuesto 4f-B: RMN de 1H (400 MHz, DMSO-de) 5 ppm: 10,56 (s. a., 1 H), 7,23 (d, J = 8,0 Hz, 2 H), 7,13 (d, J = 8,0 Hz, 2 H), 6,95 (s. a., 2 H), 4,90 (s, 2 H) 4,03 (s, 1 H), 3,44 - 3,29 (m, 2 H), 2,25 (s, 3 H), 1,17 (t, J = 7,3 Hz, 3 H). EM obs. (ESI+) [(M+H)+]: 347.

Etapa 6: preparación de 6-amino-2-[S(R)-etilsulfonimidoil]-W-metil-8-oxo-W-propil-9-(p-tolilmetil)purin-7-carboxamida

A una suspensión de (R)-6-amino-2-(etilsulfonimidoil)-9-(p-tolilmetil)-7H-purin-8-ona (200,0 mg, compuesto 4f-A) en DIPEA/Py (v/v=1/1,3,0 ml) se le añadió gota a gota cloruro de W-metil-W-propil-carbamoílo (308 mg, 2,28 mmol). Después de agitar a 25 °C durante 2 h, se diluyó la mezcla de reacción con agua, se extrajo tres veces con EtOAc (10 ml). Se secaron las fases orgánicas combinadas con sulfato de sodio, se filtraron y concentraron. Se purificó el residuo por HPLC prep. para dar metil(propil)carbamato de 6-amino-2-[S(R)-(etilsulfonimidoil)]-9-(4-metilbencil)-9H-purin-8-ilo (58,1 mg, compuesto 4) como un sólido blanco. RMN de 1H (400 MHz, DMSO-de) 5 ppm: 7,28 (d, J = 7,8 Hz, 2 H), 7,15 (d, J = 7,8 Hz, 2 H), 6,88 (s. a., 2 H), 5,03 - 4,87 (m, 2 H), 4,19 (s, 1 H), 3,61 - 3,36 (m, 4 H), 3,11 - 2,96 (m, 3 H), 2,26 (s, 3 H), 1,72 - 1,45 (m, 2 H), 1,20 (t, J = 7,2 Hz, 3 H), 0,97 - 0,65 (m, 3 H). EM obs. (ESI+) [(M+H)+]: 446.

Se preparó el compuesto 4-a de forma análoga al compuesto 4, etapa 6 usando 6-amino-2-(etilsulfonimidoil)-9-(p-tolilmetil)-7H-purin-8-ona (compuesto 4f-B) en lugar de ((R)-6-amino-2-(etilsulfonimidoil)-9-(p-tolilmetil)-7H-purin-8-ona (compuesto 4f-A). Se obtuvo 6-amino-2-[S(S)-etilsulfonimidoil]-W-metil-8-oxo-W-propil-9-(ptolilmetil)purin-7-carboxamida (compuesto 4-a, 40,1 mg) como un sólido blanco: r Mn de 1H (400 MHz, DMSO-de) 5 ppm: 7,28 (d, J = 7,5 Hz, 2 H), 7,15 (d, J = 7,5 Hz, 2 H), 6,89 (s. a., 2 H), 5,03 - 4,86 (m, 2 H), 4,19 (s, 1 H), 3,49 - 3,37 (m, 4 H), 3,08 - 3,00 (m, 3 H), 2,27 (s, 3 H), 1,70 - 1,48 (m, 2 H), 1,20 (t, J = 7,2 Hz, 3 H), 0,95 - 0,71 (m, 3 H). EM obs. (ESI+) [(M+H)+]: 446,3.

Se determinó la estereoquímica del compuesto 4-a por la difracción de rayos X de monocristal mostrada en la figura 3.

Ejemplo 4

Ensayo con células HEK293-Blue-hTLR-7:

Se adquirió una línea celular de HEK293-Blue-hTLR-7 estable de InvivoGen (n.° de cat.: hkb-htlr7, San Diego, California, EE. UU.). Se diseñaron estas células para estudiar la estimulación de TLR7 humano realizando un seguimiento de la activación de NF-kB. Se dispuso un gen indicador de fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) bajo el control del promotor mínimo de IFN-p fusionado a cinco sitios de unión a NF-kB y AP-1. Se indujo la SEAP por la activación de NF-kB y AP-1 al estimular las células HEK-Blue hTLR7 con ligandos para TLR7. Se determinó la actividad SEAP en el sobrenadante de cultivo celular usando el kit QUANTI-Blue™ (n.° de cat.: repqb1, Invivogen, San Diego, Ca, EE. UU.) a una longitud de onda de 640 nm. Se han usado ampliamente dichos ensayos informadores para la evaluación del agonismo de TLR7 (Tsuneyasu Kaisho y Takashi Tanaka, Trends in Immunology, volumen 29, número 7, julio de 2008, páginas 329, sci; Hiroaki Hemmi et al, Nature Immunology 3, 196 - 200 (2002).

Específicamente, se incubaron células HEK293-Blue-hTLR7 a una densidad de 250.000~450.000 células/ml en un volumen de 180 pl en una placa de 96 pocillos en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía 4,5 g/l de glucosa, 50 U/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 100 mg/ml de normocina, L-glutamina 2 mM, suero fetal bovino termoinactivado al 10 % (v/v) durante 24 h. A continuación, se incubaron las células con 20 pl de compuesto de prueba en una dilución en serie a 37 °C en una estufa de incubación de CO2 durante 20 horas. A continuación, se incubaron 20 pl del sobrenadante de cada pocillo con 180 pl de solución de sustrato Quantiblue a 37 °C durante 2 horas y se midió la absorbancia a 620~655 nm usando un espectrofotómetro. El compuesto 4 y el compuesto 3 se convierten eficazmente en los restos activos compuesto 4f-A y compuesto 1e-A, respectivamente. Como se muestra en la tabla 1, la potencia del compuesto 4f-A y el compuesto 1e-A para activar TLR7 en el ensayo con HEK293-hTLR7 fue de 0,11 pM y 0,071 pM, respectivamente. El compuesto 1 y el compuesto 2 se convierten eficazmente en los restos activos compuesto 1e-A y compuesto 1e-B, respectivamente, y la potencia del compuesto 1e-A y el compuesto 1e-B para activar TLR7 en el ensayo con HEK293-hTLR-7 fue de 0,071 pM y 0,085 pM, respectivamente. Puesto que el resto activo de los compuestos de ASIP requirió concentraciones menores que micromolares para activar hTLR7 in vitro, dicha potencia excepcionalmente alta permitió la evaluación y dio lugar a un hallazgo inesperado de eficacia antivírica in vivo de la administración semanal o quincenal de estos compuestos, solos o en combinación, con un inhibidor de la cápside.

Tabla 1: actividad de los compuestos (forma activa y profármacos) en el ensayo con HEK293-hTLR-7

Ejemplo 5

Una combinación de agonista de TLR7 (compuesto 4) e inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB (compuesto 5) redujo potencialmente el ADN del VHB y el HBsAg en el modelo de ratón con VAA-VHB

Modelo animal

Se adquirieron ratones C57BL/6 macho de 4 semanas de edad, libres de patógenos específicos, del Shanghai Laboratory Animal Center de Chinese Academy of Sciences (SLAC) y se alojaron en un animalario en jaulas ventiladas individualmente bajo condiciones de temperatura y luz controladas siguiendo las directrices de cuidado animal institucionales. Se adquirió el virus VAA-VHB del Beijing FivePlus Molecular Medicine Institute (Pekín, China). Este virus recombinante tiene 1,3 copias del genoma del VHB, que estaba empaquetado en cápsides de serotipo 8 del VAA (VAA8). A los ratones C57BL/6 se les inyectaron 200 pl de virus recombinante, diluido en tampón con solución salina, a través de inyección en la vena de la cola. Después de 3-4 semanas, se extrajo sangre de los animales para monitorizar el ADN genómico del VHB y el antígeno de superficie (HBsAg) en suero, y, a continuación, se agruparon aleatoriamente de acuerdo con estos biomarcadores del VHB.

Medición de biomarcadores del VHB

Se midió el HBsAg en suero usando los kits de CLIA (Autobio Diagnostics Co., Ltd., Zhengzhou, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El límite inferior de detección (LIC) para HBsAg fue de 0,05 Ul/ml. Se usó una dilución de suero de 500 veces para obtener valores dentro del intervalo lineal de las curvas estándar. Se extrajo ADN del VHB en suero usando un kit MagNA Pure 96 DNA y Viral NA Small Volume (Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se analizaron las muestras de ADN por PCR cuantitativa (qPCR) ultrarrápida usando un conjunto de cebadores específicos para el VHB y sonda para la amplificación específica y detección de una región del genoma del VHB de 128 pb desde el nucleótido 2969 hasta el 3096. Las secuencias de los cebadores y de la sonda se muestran a continuación:

Cebador directo: A A G A A A A A C C C C G C C T G T A A (SEQID1);

Cebador inverso: C CTG TTCTG A C T AC TG CCTCTCC (SEQ ID 2);

Sonda para el VHB: 5TAMRA-CCTGATGTGATGTTCTCCATGTTCAGC -BHQ2-3' (SEQ ID 3).

Se examinó el anticuerpo anti-HB en suero de ratón usando el kit de CLIA para anti-HB (Antobio, Zhengzhou, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con modificación. Se descongelaron ~15 pl de las muestras de suero de ratón diluido (1:3) a temperatura ambiente durante 10 min. Se diluyeron además 6 pl de muestra en 30 pl de PBS para preparar la dilución final 1:18 para la prueba de anticuerpos. Se prepararon curvas estándar con anticuerpo monoclonal de ratón contra el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (Ad/Ay) [S35] (Abcam ab20402) en suero diluido de ratón sin tratamiento previo (dilución 1:18 en PBS). Se añadió 1 pl de anticuerpo anti-HB 1 mg/ml en 500 pl de suero de ratón diluido para preparar el estándar 1 como concentración final de 2000 ng/ml. A continuación, se añadieron 50 pl de estándar 1 en 150 pl de suero de ratón diluido para preparar el estándar 2 (dilución 1:4). Se requirieron estándares de 7 puntos para la prueba. La concentración final del estándar 7 fue de (0,488 ng/ml). Se usó suero como blanco como control de fondo. Se transfirieron 25 pl de muestra de suero diluido/estándares/blanco a una placa de 96 pocillos. Se incubaron las muestras a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de lavado 3 veces con 300 pl de PBST. Se diluyeron 0,5 mg/ml de anti-IgG de ratón caprino biotinilado (Mabtech 3825-6-250) en PBS a una concentración final de 1 pg/ml (dilución 1:500). Se añadieron 50 pl de anti-IgG de ratón Bio diluido en la placa, se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de lavado 3 veces con 300 pl de PBST. Se diluyó estreptavidina-HRP (Mabtech 3310-9) en PBS (1:250). Se incubaron 50 pl de estreptavidina-HRP diluida a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de lavado 3 veces con 300 pl de PBST. Se mezclaron el sustrato A y el sustrato B (AntuBio). Se añadieron 50 pl de mezcla a placas y se incubaron durante 10 min antes de someterlas a lectura de luminiscencia con el lector de microplacas Envision. El límite inferior de detección para Ab anti-HB fue de 36 ng/ml. Se calcularon los resultados para Ab anti-HB a partir de datos sin procesar de luminiscencia que se ajustaban a la curva estándar para Ab anti-HB por el programa informático SoftMax Pro (v5.4.1).

Se realizó un ensayo ELISPOT para detectar linfocitos B secretores de anti-HB con esplenocitos usando un kit ELISPot Basic (HRP) para IgG de ratón (Mabtech 3825-2H). Se diluyeron 50 |jg (1 mg/ml) de HBsAg (AYW) (Abeam Ab7374) 100 veces en 10 jg/m l en PBS. Se trató la placa de PVDF (Millipore, de tipo MSIP) con 15 j l de etanol al 35 %/pocillo durante un máximo de 1 min, seguido de lavado 5 veces con 200 j l de ddH2O. Se añadieron 100 j l de HBsAg diluido a los pocillos y se incubaron durante la noche a 4-8 °C. Se lavó la placa con 200 j l de PBS estéril para retirar el anticuerpo en exceso. Se añadieron 200 j l de RPMI1640 que contenía FBS al 10 % y se incubó 2 horas a 37 °C para bloquear la placa. Se transfirió el bazo recién obtenido en PBS a los tubos C gentleMACS C (Milterny, 130-096-334) que contenían 5 ml de RPMI1640 al 2 %. A continuación, la muestra se sometió a un disociador gentleMacs en el programa m_spleen_03_02. A continuación, se filtró la mezcla disociada a través de un colador celular de 70 jm . Se usaron 15 ml de RPMI1640 al 2 % para lavar el colador celular. Las células se centrifugaron a 300xg durante 5 min a temperatura ambiente. Se añadió 1 ml de tampón de lisis ACK y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min para lisar los glóbulos rojos. Se añadieron 15 ml de RPMI1640 al 2 % para lavar las células. Las células se centrifugaron a 300xg durante 5 min a temperatura ambiente y, a continuación, se resuspendieron en 5 ml de RPMI1640 completo, seguido de filtración a través de un colador celular de 70 jm . Se contaron las células por un contador de células BioRad. Se añadieron 2x106 células/200 j l a los pocillos y se incubaron a 37 °C durante la noche. Se retiraron las células en la placa, seguido de lavado 5 veces con 200 j l de PBS. Se diluyeron 0,5 mg/ml de anti-IgG de ratón caprino biotinilado (Mabtech 3825-6-250) en PBS que contenía FBS al 0,5 % a una concentración final de 1 jg/m l (dilución 1:500). Se añadieron 100 j l de anti-IgG de ratón Bio diluido en la placa, se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas, seguido de lavado 5 veces con 200 j l de PBS. Se diluyó estreptavidina-HRP (Mabtech 3310-9) en PBS que contenía FBS al 0,5 % (1:200). Se incubaron 100 j l de estreptavidina-HRP diluida a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de lavado 5 veces con 300 j l de PBST. Se añadieron 100 j l de solución de sustrato AEC (BD 551951) a los pocillos y se desarrollaron hasta que aparecieron manchas nítidas (menos de 10 min). El desarrollo del color se detuvo lavando extensamente con ddH2O. La placa se dejó secar y se dibujaron y contaron las manchas con el microscopio AID ELISPOT.

Diseño y resultados experimentales

Como se muestra en la tabla 2, se estratificaron un total de 20 ratones en 4 grupos para el estudio. En el grupo 01, los animales se trataron con vehículo cada dos días (QOD) durante 42 días y sirvieron como control con placebo. En el grupo 02, el compuesto 4 se dosificó una vez a la semana (QW) a 10 mg/kg durante 42 días. El compuesto 5 se dosificó una vez al día (QD) a 20 mg/kg durante 42 días solo en el grupo 03, o en combinación con 10 mg/kg de compuesto 4 QW en el grupo 04. Todos los artículos de prueba se administraron por sonda gástrica por vía oral (p.o.) con un volumen de dosis total de 10 ml/kg. El tratamiento de 42 días estuvo seguido de un periodo sin tratamiento de 42 días. Una vez a la semana, se extrajo sangre de los animales por vía submandibular para la obtención de suero hasta el final del estudio. Las muestras de suero se sometieron al análisis de biomarcadores del VHB. Tras la finalización del estudio el día 84, también se obtuvieron bazos de ratón para el ensayo ELISPOT para detectar linfocitos B que producían anticuerpos anti-HB.

Tabla 2. Diseño del estudio de combinación en el modelo de ratón con VAA-VHB para los compuestos 4 y 5

Nota: grp. de tx = grupo de tratamiento; vol. = volumen; p.o. = sonda gástrica por vía oral; QD = una vez al día; QOD = cada dos días; QW = una vez a la semana; n.° an. = número de animales

Como se muestra en la figura 4, las monoterapias del compuesto 4 a 10 mg/kg QW y del compuesto 5 a 20 mg/kg QD por sí mismas dieron como resultado una reducción significativa del ADN del VHB y de HBsAg después de 42 días de tratamiento. Además, la combinación del compuesto 4 y el compuesto 5 demostró incluso más beneficio antivírico, con mayor reducción de HBsAg. En todos los animales que recibieron la politerapia, e1HBsAg en suero se redujo a un nivel indetectable por debajo del límite inferior de cuantificación (LIC) después de 42 días de tratamiento, y dicha pérdida de HBsAg se mantuvo durante el periodo sin tratamiento de 42 días. Junto con la reducción de HBsAg, todos estos animales desarrollaron niveles significativamente mayores de anticuerpo anti-HB que en otros grupos. Al final del periodo sin tratamiento, los linfocitos B que producían activamente anticuerpo anti-HB todavía eran detectables en los bazos (mostrado en la figura 4-D) de los animales que recibieron la politerapia. Por lo tanto, dicha politerapia tiene el potencial de lograr la pérdida de HBsAg y seroconversión a anti-HB en pacientes infectados por el VHB de forma crónica.

Ejemplo 6

Una combinación de agonista de TLR7 (compuesto 3) e inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB (compuesto 5) redujo potencialmente el ADN del VHB y el HBsAg en el modelo de ratón con VAA-VHB

La combinación del compuesto 3 y el compuesto 5 , junto con sus monoterapias, se evaluó usando el mismo modelo de ratón con VAA-VHB y los procedimientos para medir los biomarcadores del VHB como se describe en el ejemplo 5.

Como se muestra en la tabla 3, se estratificaron un total de 24 ratones en 4 grupos para el estudio. En el grupo 01, los animales se trataron con vehículo una vez al día (QD) durante 42 días y sirvieron como control con placebo. En el grupo 02, el compuesto 3 se dosificó una vez cada dos semanas (QOW) a 1 mg/kg durante 42 días. El compuesto 5 se dosificó una vez al día (QD) a 20 mg/kg durante 42 días solo en el grupo 03, o en combinación con 1 mg/kg de compuesto 3 QOW en el grupo 04. Todos los artículos de prueba se administraron por sonda gástrica por vía oral (p.o.) con un volumen de dosis total de 10 ml/kg. El tratamiento de 42 días estuvo seguido de un periodo sin tratamiento de 45 días. Una vez a la semana, se extrajo sangre de los animales por vía submandibular para la obtención de suero hasta el final del estudio. Las muestras de suero se sometieron al análisis de biomarcadores del VHB.

Tabla 3. Diseño del estudio de combinación en el modelo de ratón con VAA-VHB para los compuestos 3 y 5

Abreviaturas: grp. de tx = grupo de tratamiento; vol. = volumen; p.o. = sonda gástrica por vía oral; QD = una vez al día; QOD = cada dos días; QW = una vez a la semana; n.° an. = número de animales

Como se muestra en la figura 5, las monoterapias del compuesto 3 a 1 mg/kg QOW y del compuesto 5 a 20 mg/kg QD por sí mismas dieron como resultado una reducción significativa del ADN del v Hb y de HBsAg después de 42 días de tratamiento. La combinación del compuesto 3 y el compuesto 5 demostró incluso más beneficio antivírico, con mayor reducción de HBsAg. En el grupo de la politerapia, 4 de los 6 animales tuvieron niveles indetectables de HBsAg en suero (por debajo del LIC) después de 42 días de tratamiento, y dicha pérdida de HBsAg se mantuvo durante el periodo sin tratamiento de 45 días. Junto con la reducción de HBsAg, el grupo tratado con politerapia demostró niveles significativamente mayores de anticuerpo anti-HB que otros grupos. Por tanto, dicha politerapia tiene el potencial de lograr la pérdida de HBsAg y seroconversión a anti-HB en pacientes infectados por el VHB de forma crónica.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende un agonista de TLR7 y un inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB, en un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que el agonista de TLR7 es un compuesto de fórmula (I):

en la que

R1 es alquilo C1-6;

R3 es -N R 4R5, en el que

R4 es alquilo C1-6 o alcoxi C1-6-alquilo C1-6;

o en la que el agonista de TLR7 es un compuesto de fórmula (II):

en la que

R4 es alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, cicloalquilo C3-7-alquilo C1-6, alcoxi Ci-6-alquilo C1-6 o pirrolidinilalquilo C1-6; R5 es alquilo C1-6, fenilalquilo C1-6, piridinilalquilo C1-6 o pirimidinilalquilo C1-6, dicho fenilalquilo C1-6, piridinilalquilo C1-6 y pirimidinilalquilo C1-6 están no sustituidos o sustituidos con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, alcoxi C1-6, ciano, carboxi, carbamoílo, haloalquilo C1-6, alquil C1-6-sulfonilo, alcoxi C1-6-carbonilo, alcoxi C1-6-alquil C1-6-aminocarbonilo, pirrolidinilcarbonilo y piperidinilcarbonilo; R6 es H;

R⁷es hidrógeno, halógeno o alquilo C1-6;

R⁸es hidrógeno o halógeno;

R⁹es hidrógeno o halógeno;

R¹⁰es alquilo C1-6;

R¹¹es hidrógeno, hidroxialquilo C1-6, aminocarbonilo, alcoxi C1-6-carbonilo o carboxi;

R12 es hidrógeno, alcoxi C1-6-carbonilo o carboxi-CmH2m-;

X es carbonilo o sulfonilo;

Y es -CH 2-, -O - o -N (R ¹³)-,

en el que R¹³es hidrógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, cicloalquil C^3-7-CmH²m-, alcoxi C1-6-carbonil-CmH2m-, -C tH2t-COOH, -haloalquil C1-6-COOH, -(alcoxi C1-6)-alquil C1-6-COOH, -alquil C1-6-O-alquil C1-6-COOH, -cicloalquil C^3-7-CmH²m-COOH, -C mH2m-cicloalquil C3-7-COOH, hidroxi-CtH2t-, carboxiespiro[3.3]heptilo o carboxifenil-CmH2m-, carboxipiridinil-CmH2m-;

W es -CH 2-, -C(alquilo C1-6)2-, -O - o carbonilo;

n es 0 o 1;

m es 0-7;

t es 1-7;

2. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el agonista de TLR7 es

6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(R)-etilsulfonimidoil]-W-metil-8-oxo-W-propil-purin-7-carboxamida; 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-W-etil-2[S(S)-etilsulfonimidoil]-W-metil-8-oxo-purin-7-carboxamida; o 6-amino-2-[S(R)-etilsulfonimidoil]-W-metil-8-oxo-W-propil-9-(p-tolilmetil)purin-7-carboxamida;

3. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el agonista de TLR7 es 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-(S(S)-etilsulfonimidoil)-7H-purin-8-ona; 6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-(S(R)-etilsulfonimidoil)-7H-purin-8-ona; o 6-amino-2-(S(R)-etilsulfonimidoil)-9-(p-tolilmetil)-7H-purin-8-ona; o una sal, enantiómero o diastereómero farmacéuticamente aceptable de los mismos.

4. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB es ácido 3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-etoxicarbonil-4-(3-fluoro-2-metil-fenil)-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8a-tetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico; ácido 3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-cloro-3-fluoro-fenil)-5-etoxicarbonil-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8atetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico; o una sal, enantiómero o diastereómero farmacéuticamente aceptable de los mismos.

5. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la composición consiste en

6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-(S(R)-etilsulfonimidoil)-7H-purin-8-ona y ácido 3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-cloro-3fluoro-fenil)-5-etoxicarbonil-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8a-tetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico;

6-amino-2-(S(R)-etilsulfonimidoil)-9-(p-tolilmetil)-7H-purin-8-ona y ácido 3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-etoxicarbonil-4-(3-fluoro-2-metil-fenil)-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8a-tetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico;

o 6-amino-2-(S(R)-etilsulfonimidoil)-9-(p-tolilmetil)-7H-purin-8-ona y ácido 3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-cloro-3-fluorofenil)-5-etoxicarbonil-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidin-6-il]metil]-3-oxo-5,6,8,8a-tetrahidro-1H-imidazo[1,5-a]piracin-2-il]-2,2-dimetil-propanoico;

en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

6. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la composición consiste en

en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la composición comprende adicionalmente uno o más de otros agentes antivíricos.

8. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en la que dichos otros agentes antivíricos se seleccionan de lamivudina, adefovir, tenofovir, telbivudina y entecavir.

9. Un kit que comprende un recipiente que comprende un agonista de TLR7 y un inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB, en el que el agonista de TLR7 y el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB son los mismos que como se define en la reivindicación 1.

10. El kit de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende además un diluyente estéril.

11. El kit de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, que comprende además un prospecto del envase que comprende instrucciones impresas que dirigen el uso de un tratamiento combinado de un agonista de TLR7 y un inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB como procedimiento para el tratamiento o profilaxis de la infección por el virus de la hepatitis B.

12. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el agonista de TLR7 es

6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-[S(S)-etilsulfonimidoil]-N-metil-8-oxo-N-propil-purin-7-carboxamida;

6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-(S(S)-etilsulfonimidoil)-7H-purin-8-ona;

6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-(S(R)-etilsulfonimidoil)-7H-purin-8-ona; o

6-amino-2-(S(R)-etilsulfonimidoil)-9-(p-tolilmetil)-7H-purin-8-ona;

13. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB es

14. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que el agonista de TLR7 y el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB usados en el recipiente son:

en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento o profilaxis de la infección por el virus de la hepatitis B, que comprende la administración a un sujeto de una primera cantidad eficaz de un agonista de TLR7, o una sal, enantiómero o diastereómero farmacéuticamente aceptable del mismo; y una segunda cantidad de inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB, o una sal, enantiómero o diastereómero farmacéuticamente aceptable del mismo; o viceversa.

16. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 15, en la que el agonista de TLR7 es

6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-(S(S)-etilsulfonimidoil)-7H-purin-8-ona;

6-amino-9-[(4-clorofenil)metil]-2-(S(R)-etilsulfonimidoil)-7H-purin-8-ona; o

6-amino-2-(S(R)-etilsulfonimidoil)-9-(p-tolilmetil)-7H-purin-8-ona;

17. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 15 o 16, en la que el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB es

18. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en la que el agonista de TLR7 y el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB usados son:

en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en la que el agonista de TLR7 y el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB se administran conjuntamente en la misma formulación o en una formulación diferente.

20. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en la que el agonista de TLR7 y el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB están destinados a su administración a un sujeto por la misma vía o vías diferentes.

21. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en la que el agonista de TLR7 y el inhibidor del ensamblaje de la cápside del VHB están destinados a su administración a un sujeto por administración parenteral u oral.

22. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en la que la administración es simultánea o secuencial.