ES2895369T3 - Agonistas del receptor tipo toll 7 (TLR7) que tienen un resto tricíclico, conjugados de estos y métodos y usos de estos - Google Patents

Abstract

Un compuesto que tiene una estructura de acuerdo con la Fórmula (I) **(Ver fórmula)** en la que R1 es (C1-C5 alquil)O, (C1-C2 alquil)O(CH2)2-3O, (C1-C5 alquil)C(=O)O, (C1-C5 alquil)NH, (C1-C2 alquil)O(CH2)2-3NH o (C1-C5 alquil)C(=O)NH; R2 y R3 son, independientemente en cada caso, H, C1-C3 alquilo, halo, O(C1-C3 alquilo), CN o NO2, en donde un R3 se puede reemplazar por (CH2)xR4, en donde el subíndice x es 1, 2, 3 o 4; R4 es H, halo, OH, CN, NH2, NH(C1-C5 alquilo), N(C1-C5 alquilo)2, NH(C3-C6 cicloalquilo), NH(C4-C8 bicicloalquilo), NH(C6-C10 espirocicloalquilo), N(C3-C6 cicloalquilo)2, NH(CH2)1-3(arilo), N((CH2)1-3(arilo))2, un resto amina cíclica que tiene la estructura **(Ver fórmula)** , un resto aromático o heteroaromático de 6 miembros o un resto heteroaromático de 5 miembros; en donde un resto alquilo, cicloalquilo, bicicloalquilo, espirocicloalquilo, amina cíclica, aromática o heteroaromática de 6 miembros o heteroaromática de 5 miembros se sustituye opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados de OH, halo, CN, (C1-C3 alquilo), O(C1-C3 alquilo), C(=O)(Me), SO2(C1-C3 alquilo), C(=O)(Et), NH2, NH(Me), N(Me)2, NH(Et), N(Et)2 y N(C1-C3 alquilo)2; y un resto cicloalquilo, bicicloalquilo, espirocicloalquilo o amina cíclica puede tener un grupo CH2 reemplazado por O, S, NH, N(C1-C3 alquilo) o N(Boc); R5 es, independientemente en cada caso, O, S o NR6; R6 es H o C1-C3 alquilo; X1 es, independientemente en cada caso, CR2 o N; y X2 es, independientemente en cada caso, CR3 o N.

Description

DESCRIPCIÓN

Agonistas del receptor tipo toll 7 (TLR7) que tienen un resto tricíclico, conjugados de estos y métodos y usos de estos

Antecedentes de la invención

La presente divulgación se refiere a agonistas del receptor tipo toll 7 (“TLR7”) y conjugados de estos, y métodos para la preparación y el uso de tales agonistas y sus conjugados.

Los receptores tipo toll (“TLR”) son receptores de la superficie celular que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (“PAMP”). La activación de un TLR mediante la fijación de un PAMP correspondiente indica una posible infección por un patógeno y estimula el sistema inmunitario para combatir la infección. Los seres humanos tienen 11 TLR, denominados TLR1 a TLR11.

La activación de un TLR, en donde TLR7 es el más estudiado, por parte de un agonista puede tener un efecto adyuvante en la acción de las vacunas y los agentes inmunoterapéuticos para tratar varias afecciones que no sean la infección patógena real, estimulando la respuesta inmunitaria.

TLR7 reconoce PAMP asociados a virus de ARN monocatenario. Su activación induce la secreción de interferones de tipo I tales como IFNa e IFNp (Lund et al. 2004). Tiene dos sitios de fijación, uno para ligandos de ARN monocatenario tales como ssRNA40 (Berghofer et al. 2007) y uno para guanosina (Zhang et al. 2016).

TLR7 se puede fijar a, y se puede activar mediante, agonistas sintéticos tipo guanosina tales como imiquimod, resiquimod y gardiquimod, basados en una estructura de 1H-imidazo[4,5-c]quinolina.

Imiquimod Resiquimod Gardiquimod

Los agonistas de TLR7 sintéticos basados en una estructura molecular de pteridinona son también conocidos, como se ejemplifica con vesatolimod (Desai et al. 2015), que está presente en ensayos clínicos de fase 2. Se informa que la potencia de vesatolimod es 100X menor que la del compuesto de purin-8-ona correspondiente, según se midió mediante inducción de IFN-a (Roethle et al. 2013).

Otros agonistas de TLR7 sintéticos están basados en una estructura tipo purina, frecuentemente de acuerdo con la Fórmula (A):

en donde R, R' y R” son variables estructurales, en donde R” contiene generalmente un anillo aromático o heteroaromático sustituido o no sustituido. El documento EP2491035A1 describe moduladores de TLR que tienen una estructura de purina o deazapurina con R" que contiene arilo o heteroarilo. El documento WO2009005687A1 describe moduladores de TRL7 que tienen una estructura de purina con R" que contiene arilo o heteroarilo.

Las divulgaciones de moléculas bioactivas que tienen una estructura tipo purina y sus usos para tratar afecciones tales como fibrosis, trastornos inflamatorios, cáncer o infecciones patógenas incluyen: Akinbobuyi et al. 2015b y 2016; Barberis et al. 2012; Carson et al. 2014; Ding et al. 2016, 2017a y 2017b; Graupe et al. 2015; Hashimoto et al.

2009; Holldack et al. 2012; Isobe et al. 2009a y 2012; Jin et al. 2017a y 2017b; Peterson 2014; Pryde 2010; y Seifert 2015.

El grupo R” puede ser piridilo: Bonfanti et al. 2015a y 2015b; Halcomb et al. 2015; Hirota et al. 2000; Isobe et al.

2000, 2002, 2004, 2006, 2009a, 2011 y 2012; Kasibhatla et al. 2007; Koga-Yamakawa et al. 2013; Musmuca et al.

2009; Nakamura 2012; Ogita et al. 2007; y Yu et al. 2013.

Bonfanti et al. 2015b describen moduladores de TLR7 en donde los dos anillos de un resto purina están atravesados por un macrociclo:

Un agonista de TLR7 se puede conjugar con una molécula asociada, que puede ser, por ejemplo, un fosfolípido, un poli(etilenglicol) (“PEG”) u otro TLR (comúnmente TLR2). Las divulgaciones de ejemplo incluyen: Carson et al. 2013, 2015 y 2016, Chan et al. 2009 y 2011, Lioux et al. 2016, Maj et al. 2015, Ban et al. 2017; Vernejoul et al. 2014 y Zurawski et al. 2012. La conjugación con un anticuerpo se puede describir en: Akinbobuyi et al. 2013 y 2015a, y Gadd et al. 2015. Un sitio de conjugación frecuente es en el grupo R” de la Fórmula (A).

También se describieron agonistas de TLR7 basados en una estructura 5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina. Véase Cortez et al. 2017a y 2017b, McGowan et al. 2017, y Li et al. 2018.

Jensen et al. 2015 describen el uso de vehículos lipídicos catiónicos para la administración de agonistas de TLR7. Algunos agonistas de TLR7, que incluyen resiquimod son agonistas duales de TLR7/TLR8. Véase, por ejemplo, Beesu et al. 2017; Lioux et al. 2016; y Vernejoul et al. 2014.

También se describieron agonistas de TLR7 basados en una estructura 5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina. Véase Cortez et al. 2017a y 2017b, McGowan et al. 2017, y Li et al. 2018.

Las referencias completas de los documentos citados en la presente por primer autor o inventor y año se enumeran al final de la presente memoria descriptiva.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

En un aspecto, esta memoria descriptiva proporciona compuestos que tienen una estructura de acuerdo con la Fórmula (I), (II) o (III)

en donde

R1 es (C¹-C⁵ alquil)O, (C¹-C² alquil)O(CH²)²-aO, (C¹-C⁵ alquil)C(=O)O, (C¹-C⁵ alquil)NH, (C¹-C² alquil)O(CH²)²-aNH o (C¹-C⁵ alquil)C(=O)NH;

R2 y R3 son, independientemente en cada caso, H, C¹-C³ alquilo, halo, O(C-i-C³ alquilo), CN o NO² , en donde un R3 se puede reemplazar por (CH²)xR4, en donde el subíndice x es 1,2, 3 o 4;

R4 es H, halo, OH, CN, NH² , NH(Cr C⁵ alquilo), N(Ci-Ca alquilo)2, NH(Ca-C6 cicloalquilo), NH(C⁴-C⁸ bicicloalquilo), NH(C⁶-C¹⁰ espirocicloalquilo), N(C³-C⁶ cicloalquilo)² , NH(CH²)¹-³(arilo), N((CH²)¹-³(arilo))², un resto amina cíclica que tiene la estructura

b _i N0 _{\V , J(CC H 2)o-4}

un resto aromático o heteroaromático de 6 miembros o un resto heteroaromático de 5 miembros;

en donde

un resto alquilo, cicloalquilo, bicicloalquilo, espirocicloalquilo, amina cíclica, aromática o heteroaromática de 6 miembros o heteroaromática de 5 miembros se sustituye opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados de OH, halo, CN, (C¹-C³ alquilo), O(C¹-C³ alquilo), C(=O)(Me), SO²(C¹-C³ alquilo), C(=O)(Et), NH² , NH(Me), N(Me)², NH(Et), N(Et⁾² y N(C1-C3 alquilo)² ; y

un resto cicloalquilo, bicicloalquilo, espirocicloalquilo o amina cíclica puede tener un grupo CH² reemplazado por O, S, NH, n (c ¹-C³ alquilo) o N(Boc);

R5 es, independientemente en cada caso, O, S o NR6;

R6 es H o C¹-C³ alquilo;

X1 es, independientemente en cada caso, CR2 o N; y

X2 es, independientemente en cada caso, CR3 o N.

Los compuestos de acuerdo con la Fórmula (I) tienen actividad como agonistas de TLR7, y algunos de ellos se pueden conjugar para la administración dirigida a un tejido u órgano diana de acción prevista.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un esquema representativo para preparar compuestos de esta divulgación.

La Figura 2 y la Figura 3 muestran esquemas para la preparación de compuestos ligador-agonista.

La Figura 4 es un gráfico representativo que muestra la actividad agonista de TLR7 de un compuesto de la presente invención.

Descripción detallada de la invención

DEFINICIONES

“Anticuerpo” significa anticuerpos completos y cualquier fragmento de fijación al antígeno (es decir, “porción de fijación al antígeno”) o variantes monocatenarias de estos. Un anticuerpo completo es una proteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas livianas (L) interconectadas por puentes disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de la cadena pesada (V^h) y una región constante de la cadena pesada que comprende tres dominios, C^h1, C^h2 y C^h3. Cada cadena liviana comprende una región variable de la cadena liviana (V^l o Vk) y una región constante de la cadena liviana que comprende un dominio único, C^l. Las regiones V^h y V^l también se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones marco (FR) más conservadas. Cada V^h y V^l comprende tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el terminal amino al terminal carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las regiones variables contienen un dominio de fijación que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes pueden mediar la fijación del anticuerpo con los factores o tejidos huésped, que incluyen varias células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico. Se dice que un anticuerpo “se fija específicamente” a un antígeno X si el anticuerpo se fija al antígeno X con una K^d de 5 x 10-8 M o menos, con mayor preferencia, 1 x 10-8 M o menos, con mayor preferencia, 6 x 10-9 M o menos, con mayor preferencia, 3 x 10-9 M o menos, aun con mayor preferencia, 2 x 10-9 M o menos. El anticuerpo puede ser quimérico, humanizado o, preferentemente, humano. La región constante de la cadena pesada se puede modificar por ingeniería genética para afectar el tipo o el alcance de la glucosilación, para extender la semivida del anticuerpo, para mejorar o reducir las interacciones con las células efectoras o el sistema de complementos, o para modular otras propiedades. La modificación por ingeniería genética se puede lograr mediante reemplazo, adición o eliminación de uno o más aminoácidos o mediante el reemplazo de un dominio por otro dominio de otro tipo de inmunoglobulina, o una combinación de los anteriores.

“Fragmento de fijación al antígeno” y “porción de fijación al antígeno” de un anticuerpo (o simplemente “porción de anticuerpo” o “fragmento de anticuerpo”) significan uno o más fragmentos que retienen la capacidad de fijarse específicamente a un antígeno. Se demostró que la función de fijación al antígeno de un anticuerpo se puede realizar mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa, tal como (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios V^l, V^h, C^l y Cm; (ii) un fragmento F(ab')² , un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fab', que es esencialmente un Fab con parte de la región bisagra (véase, por ejemplo, Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6.a ed., Saunders Elsevier 2007); (iv) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y Cm; (v) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo, (vi) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio V^h; (vii) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada; y (viii) un nanocuerpo, una región variable de la cadena pesada que contiene un solo dominio variable y dos dominios constantes. Los fragmentos de fijación al antígeno preferidos son los fragmentos Fab, F(ab')², Fab', Fv y Fd. Además, si bien los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, son codificados por genes separados, se pueden unir, usando métodos recombinantes, mediante un ligador sintético que permite obtenerlos como una cadena proteica simple en donde las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como cadena simple Fv o scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.Uu . 85:5879-5883). La expresión "porción de fijación al antígeno" de un anticuerpo también abarca los anticuerpos monocatenarios.

A menos que se indique lo contrario, por ejemplo, con referencia a la numeración lineal en un listado de SEQ ID NO:, las referencias a la numeración de las posiciones de aminoácidos en una región variable de las cadenas pesada o liviana (V^h o V^l) del anticuerpo son de acuerdo con el sistema Kabat (Kabat et al., "Sequences of proteins of immunological interest, 5.a ed., Pub. N.° 91-3242, U.S. Dept. Health & Human Services, NIH, Bethesda, Md., 1991, en adelante “Kabat”), y las referencias a la numeración de las posiciones de aminoácidos en una región constante de las cadenas pesada y liviana (Ch¹, Ch² , Ch³ o Cl) del anticuerpo son de acuerdo con el índice EU como se indica en Kabat. Véase Lazar et al., US 2008/0248028 A1, para ejemplos de dicho uso. Además, el Sistema de información ImMunoGeneTics (IMGT) proporciona en su sitio web un cuadro titulado “Cuadro científico IMGT: Relación entre numeraciones C” que muestra la relación entre su sistema de numeración, la numeración EU y la numeración Kabat para la región constante de la cadena pesada.

Un “anticuerpo aislado” significa un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se fija específicamente al antígeno X está sustancialmente libre de anticuerpos que se fijan específicamente a antígenos que no son el antígeno X). Sin embargo, un anticuerpo aislado que se fija específicamente al antígeno X puede tener reactividad cruzada con otros antígenos, tal como las moléculas del antígeno X de otras especies. En ciertas formas de realización, un anticuerpo aislado se fija específicamente al antígeno X humano y no tiene reactividad cruzada con otros antígenos X (no humanos). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otros productos químicos y/o materiales celulares.

Las expresiones “anticuerpo monoclonal” o “composición de anticuerpos monoclonales” se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpos de una composición de moléculas simples, que exhibe una afinidad y especificidad de fijación simple para un epítopo particular.

La expresión “anticuerpo humano” significa un anticuerpo que tiene regiones variables en donde tanto las regiones marco como las regiones CDR (y la región constante, si está presente) derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir modificaciones tardías, que incluyen modificaciones naturales o sintéticas. Los anticuerpos humanos pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o mutación somática in vivo). Sin embargo, la expresión “anticuerpo humano” no incluye anticuerpos en los cuales las secuencias CDR que derivan de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se injertaron en secuencias de marco humanas.

La expresión "anticuerpo monoclonal humano” significa un anticuerpo que muestra especificidad de fijación simple, que tiene regiones variables en donde tanto las regiones marco como las regiones ^c D^r derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos monoclonales humanos pueden ser producidos mediante un hibridoma que incluye un linfocito B obtenido de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de la cadena pesada humana y un transgén de la cadena liviana fusionado a una célula inmortalizada.

El término “alifática” significa un resto hidrocarburo no aromático, saturado o insaturado, de cadena lineal o ramificada, que tiene la cantidad de átomos de carbono especificada (por ejemplo, como en “C³ alifática”, “C^1-5 alifática”, “C¹-C⁵ alifática” o “C¹ a C⁵ alifática”; las últimas tres frases son sinónimos de un resto alifático que tiene de 1 a 5 átomos de carbono) o, cuando la cantidad de átomos de carbono no se indica explícitamente, de 1 a 4 átomos de carbono (2 a 4 carbonos en el caso de restos alifáticos insaturados). Un conocimiento similar se aplica a la cantidad de carbonos en otros tipos, como en C^2-4 alqueno, C⁴-C⁷ cicloalifático, etc. De manera similar, un término como “(CH²)^1-3” debe entenderse como una forma breve de decir que el subíndice es 1, 2 o 3, de modo que ese término representa CH² , CH²CH² y CH²CH²CH².

El término “alquilo” significa un resto alifático saturado, y se aplica la misma convención para la designación de la cantidad de átomos de carbono. A modo ilustrativo, los restos C¹-C⁴ alquilo incluyen, entre otras, metilo, etilo, propilo, isopropilo, isobutilo, t-butilo, 1 -butilo, 2-butilo y similares. El término “alquileno” significa una contraparte divalente de un grupo alquilo, tal como CH²CH² , CH²CH²CH² y CH²CH²CH²CH².

El término “alquenilo” significa un resto alifático que tiene al menos un enlace doble carbono-carbono, con la misma convención para designar la cantidad de átomos de carbono. A modo ilustrativo, los restos C²-C⁴ alquenilo incluyen, entre otras, etenilo (vinilo), 2-propenilo (alilo o prop-2-enilo), cis-1-propenilo, frans-1-propenilo, E- (o Z-) 2-butenilo, 3-butenilo, 1,3-butadienilo (but-1,3-dienilo) y similares.

El término “alquinilo” significa un resto alifático que tiene al menos un enlace triple carbono-carbono, con la misma convención para designar la cantidad de átomos de carbono. A modo ilustrativo, los grupos C²-C⁴ alquinilo incluyen etinilo (acetilenilo), propargilo (prop-2-inilo), 1-propinilo, but-2-inilo y similares.

El término “cicloalifático” significa un resto de hidrocarburo no aromático saturado o insaturado que tiene de 1 a 3 anillos, en donde cada anillo tiene de 3 a 8 (preferentemente, de 3 a 6) átomos de carbono. El término “cicloalquilo” significa un resto cicloalifático en donde cada anillo está saturado. El término “cicloalquenilo” significa un resto cicloalifático en donde al menos un anillo tiene al menos un enlace doble carbono-carbono. El término “cicloalquinilo” significa un resto cicloalifático en donde al menos un anillo tiene al menos un enlace triple carbono-carbono. A modo ilustrativo, los restos cicloalifáticos incluyen, entre otras, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo, ciclooctilo y adamantilo. Los restos cicloalifáticos preferidas son cicloalquilo, en especial, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, y ciclohexilo. El término “cicloalquileno” significa una contraparte divalente de un grupo cicloalquilo.

El término “heterocicloalifática” significa un resto cicloalifático en donde, en al menos un anillo de esta, se reemplazaron hasta 3 (preferentemente de 1 a 2) carbonos por un heteroátomo seleccionado independientemente de N, O o S, en donde N y S se pueden oxidar opcionalmente, y N se puede cuaternizar opcionalmente. Los restos cicloalifáticos preferentes consisten en un anillo, con un tamaño de 5 a 6 miembros. De modo similar, los términos “heterocicloalquilo”, “heterocicloalquenilo” y “heterocicloalquinilo” significan un resto cicloalquilo, cicloalquenilo o cicloalquinilo, respectivamente, en donde se modificó al menos un anillo de aquella. Los restos heterocicloalifáticos de ejemplo incluyen aziridinilo, azetidinilo, 1,3-dioxanilo, oxetanilo, tetrahidrofurilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, tetrahidrotiopiranilsulfona, morfolinilo, tiomorfolinilo, sulfóxido de tiomorfolinilo, tiomorfolinilsulfona, 1,3-dioxolanilo, tetrahidro-1,1-dioxotienilo, 1,4-dioxanilo, tietanilo y similares. El término “heterocicloalquileno” significa una contraparte divalente de un grupo heterocicloalquilo.

Los términos “alcoxi”, “ariloxi”, “alquiltio” y “ariltio” significan -O(alquilo), -O(arilo), -S(alquilo) y -S(arilo), respectivamente. Los ejemplos son metoxi, fenoxi, metiltio y feniltio, respectivamente.

Los términos "halógeno" o “halo” significan flúor, cloro, bromo o yodo, a menos que se indique un significado más restrictivos

El término “arilo” significa un resto de hidrocarburos que tiene un sistema de anillos mono-, bi- o tricíclicos (preferentemente, monocíclicos), en donde cada anillo tiene de 3 a 7 átomos de carbono y al menos un anillo es aromático. Los anillos del sistema de anillos se pueden fusionar (como en naftilo) o unir (como en bifenilo) entre sí, y se pueden fusionar o unir a anillos no aromáticos (como en indanilo o ciclohexilfenilo). A modo ilustrativo, los restos arilo incluyen, entre otras, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, bifenilo, fenantrilo, antracenilo y acenaftilo. El término “arileno” significa una contraparte divalente de un grupo arilo, por ejemplo 1,2-fenileno, 1,3-fenileno o 1,4-fenileno.

El término “heteroarilo” significa un resto que tiene un sistema de anillos mono-, bi- o tricíclicos (preferentemente, monocíclico de 5 a 7 miembros), en donde cada anillo tiene de 3 a 7 átomos de carbono, y al menos un anillo es un anillo aromático que contiene de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O o S, en donde N y S se pueden oxidar opcionalmente, y N se puede cuaternizar opcionalmente. Dicho al menos un anillo aromático que contiene un heteroátomo se puede fusionar a otros tipos de anillos (como en benzofuranilo o tetrahidroisoquinolilo) o unir directamente a otros tipos de anillos (como en fenilpiridilo o 2-ciclopentilpiridilo). A modo ilustrativo, los restos heteroarilo incluyen pirrolilo, furanilo, tiofenilo (tienilo), imidazolilo, pirazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, triazolilo, tetrazolilo, piridilo, N-oxopiridilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, quinazolinilo, cinolinilo, quinozalinilo, naftiridinilo, benzofuranilo, indolilo, benzotiofenilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, fenotiazolilo, bencimidazolilo, benzotriazolilo, dibenzofuranilo, carbazolilo, dibenzotiofenilo, acridinilo y similares. El término “heteroarileno” significa una contraparte divalente de un grupo heteroarilo.

Cuando se indica que un resto se puede sustituir, por ejemplo, usando las frases “sustituido o no sustituido” u “opcionalmente sustituido” como en “C¹-C⁵ alquilo sustituido o no sustituido” o “heteroarilo opcionalmente sustituido”, ese resto puede tener uno o más sustituyentes seleccionados independientemente, con preferencia, de 1 a 5, con mayor preferencia, de 1 a 2. Una persona del oficio de nivel medio puede seleccionar sustituyentes y patrones de sustitución, teniendo en cuenta el resto al que se une el sustituyente, para obtener compuestos químicamente estables y que se puedan sintetizar mediante técnicas conocidas en el estado de la técnica y mediante los métodos indicados en la presente. Cuando un resto se identifica como “no sustituido o sustituido” u “opcionalmente sustituido”, en una forma de realización preferida, dicho resto es no sustituido.

Los términos “arilalquilo”, "(heterocicloalifático)alquilo”, “arilalquenilo”, “arilalquinilo”, “biarilalquilo” y similares significan un resto alquilo, alquenilo o alquinilo, según el caso, sustituido con un resto arilo, heterocicloalifática, biarilo, etc., según el caso, con la valencia abierta (no satisfecha) en el resto alquilo, alquenilo o alquinilo, por ejemplo, como en bencilo, fenetilo, N-imidazoiletilo, N-morfolinoetilo y similares. Por el contrario, los términos “alquilarilo”, “alquenilcicloalquilo” y similares significan un resto arilo, cicloalquilo, etc., según el caso, sustituido con un resto alquilo, alquenilo, etc., según el caso, por ejemplo, como en metilfenilo (tolilo) o alilciclohexilo. Los términos “hidroxialquilo”, “haloalquilo”, “alquilarilo”, “cianoarilo” y similares significan un resto alquilo, arilo, etc., según el caso, sustituido con uno o más de los sustituyentes identificados (hidroxilo, halo, etc., según el caso).

Por ejemplo, los sustituyentes permisibles incluyen, entre otros, alquilo (en especial, metilo o etilo), alquenilo (en especial, alilo), alquinilo, arilo, heteroarilo, cicloalifáticos, heterocicloalifáticos, halo (en especial, fluoro), haloalquilo (en especial, trifluorometilo), hidroxilo, hidroxialquilo (en especial, hidroxietilo), ciano, nitro, alcoxi, -O(hidroxialquilo), -O(haloalquilo) (en especial, -OCF³), -O(cicloalquilo), -O(heterocicloalquilo), -O(arilo), alquiltio, ariltio, =O, =Nh , =N(alquilo), =NOH, =NO(alquilo), -C(=O)(alquilo), -C(=O)H, -CO²H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(alquilo), -C(=O)O(hidroxialquilo), -C(=O)NH² , -C(=O)NH(alquilo), -C(=O)N(alquilo)², -OC(=O)(alquilo), -OC(=O)(hidroxialquilo), -OC(=O)O(alquilo), -OC(=O)O(hidr oxialquilo), -OC(=O)NH² , -OC(=O)NH(alquilo), -OC(=O)N(alquilo)², azido, -NH² , -NH(alquilo), -N(alquilo)² , -NH(arilo), -NH(hidroxialquilo), -NHC(=O)(alquilo), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH², -NHC(=O)NH(alquilo), -NHC(=O)N(alquilo)² , -NHC(=NH)NH², -OSO²(alquilo), -SH, -S(alquilo), -S(arilo), -S(cicloalquil o), -S(=O)alquilo, -SO²(alquilo), -SO²NH² , -SO²NH(alquilo), -SO²N(alquilo)² y similares.

Cuando el resto que está sustituido es un resto alifático, los sustituyentes preferidos son arilo, heteroarilo, cicloalifáticos, heterocicloalifáticos, halo, hidroxilo, ciano, nitro, alcoxi, -O(hidroxialquilo), -O(haloalquilo), -O(cicloalquilo), -O(heterocicloalquilo), -O(arilo), alquiltio, ariltio, =O, =NH, =N(alquilo), =NOH, =NO(alquilo), -CO²H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(alquilo), -C(=O)O(hidroxialquilo), -C(=O)NH² , -C(=O)NH(alquilo), -C(= O)N(alquilo)², -OC(=O)(alquilo), -OC(=O)(hidroxialquilo), -OC(=O)O(alquilo), -OC(=O)O(hidroxialquilo), -OC(=O)NH² , -OC(=O)NH(alquilo), -OC(=O)N(alquilo)², azido, -NH² , -NH(alquilo), -N(alquilo)² , -NH(arilo), -NH(hidroxialquilo), -NHC(=O)(alquilo), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH², -NHC(=O)NH(alquilo), -NHC(=O)N(alquilo)², -NHC(=NH)NH², -OSO²(alquilo), -SH, -S(alquilo), -S(arilo), -S(=O)alquil o, -S(cicloalquilo), -SO²(alquilo), -SO²NH², -SO²NH(alquilo) y -SO²N(alquilo)². Los sustituyentes de mayor preferencia son halo, hidroxilo, ciano, nitro, alcoxi, -O(arilo), =O, =nOh , =NO(alquilo), -OC(=O)(alquilo), -OC(=O)O(alquilo), -OC(=O)NH² , -OC(=O)NH(alquilo), -OC(=O)N(alquilo)², azido, -NH² , -NH(alquilo), -N(alquilo)², -NH(arilo), -NHC(=O)(alquilo), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH², -NHC(=O)NH(alquil o), -NHC(=O)N(alquilo)² y -NHC(=NH)NH². En especial, se prefieren fenilo, ciano, halo, hidroxilo, nitro, C rC ⁴alquioxi, O(C²-C⁴ alquilen)OH y O(C²-C⁴ alquilen)halo.

Cuando el resto que está sustituido es un resto cicloalifático, heterocicloalifático, arilo o heteroarilo, los sustituyentes preferidos son alquilo, alquenilo, alquinilo, halo, haloalquilo, hidroxilo, hidroxialquilo, ciano, nitro, alcoxi, -O(hidroxialquilo), -O(haloalquilo), -O(arilo), -O(cicloalquilo), -O(heterocicloalquilo), alquiltio, ariltio, -C(=O)(alquilo), -C(=O)H, -CO²H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(alquilo), -C(=O)O(hidroxialquilo), -C(=O)NH², -C(=O )NH(alquilo), -C(=O)N(alquilo)², -OC(=O)(alquilo), -OC(=O)(hidroxialquilo), -OC(=O)O(alquilo), -OC(=O)O(hidroxialqui lo), -OC(=O)NH², -OC(=O)NH(alquilo), -OC(=O)N(alquilo)², azido, -NH² , -NH(alquilo), -N(alquilo)² , -NH(arilo), -NH(hidroxialquilo), -NHC(=O)(alquilo), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH², -NHC(=O)NH(alquilo), -NHC(=O)N(alquilo)² , -NHC(=NH)NH², -OSO²(alquilo), -SH, -S(alquilo), -S(arilo), -S(cicloalquil o), -S(=O)alquilo, -SO²(alquilo), -SO²NH², -SO²NH(alquilo) y -SO²N(alquilo)². Los sustituyentes de mayor preferencia son alquilo, alquenilo, halo, haloalquilo, hidroxilo, hidroxialquilo, ciano, nitro, alcoxi, -O(hidroxialquilo), -C(=O)(alquilo), -C(=O)H, -CO²H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(alquilo), -C(=O)O(hidroxialquilo), -C(=O)NH², -C(=O)NH(alquilo), -C(=O)N(alquilo)², -OC(=O)(alquilo), -OC(=O)(hidroxialquilo), -OC(=O)O(alquilo), -OC (=O)O(hidroxialquilo), -OC(=O)NH², -OC(=O)NH(alquilo), -OC(=O)N(alquilo)² , -NH² , -NH(alquilo), -N(alquilo)² , -NH(ari lo), -NHC(=O)(alquilo), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH², -NHC(=O)NH(alquilo), -NHC(=O)N(alquilo)² y -NHC(=NH)NH². En especial, se prefieren C¹-C⁴ alquilo, ciano, nitro, halo y C rC ⁴alcoxi.

Cuando se indica un rango, como en “C¹-C⁵ alquilo” o “de 5 a 10 %”, el rango incluye los extremos del rango, como en C¹ y C⁵ en el primer caso, y 5 % y 10 % en el segundo caso.

A menos que se indiquen específicamente estereoisómeros particulares (por ejemplo, mediante un enlace en negrita o discontinuo en un estereocentro pertinente en una fórmula estructural, mediante la representación de un enlace doble que tiene una configuración E o Z en una fórmula estructural o mediante el uso de nomenclatura que designa la estereoquímica), todos los estereoisómeros están incluidos en el alcance de la invención, como compuestos puros y como sus mezclas. A menos que se indique lo contrario, la presente invención abarca los enantiómeros, diastereómeros e isómeros geométricos individuales, y las combinaciones y mezclas de estos.

Las personas del oficio de nivel medio comprenderán que los compuestos pueden tener formas tautoméricas (por ejemplo, formas ceto y enol), formas de resonancia y formas zwitteriónicas que son equivalentes a las representadas en las fórmulas estructurales que se usan en la presente, y que las fórmulas estructurales abarcan esas formas tautoméricas, de resonancia o zwitteriónicas.

La expresión “éster aceptable desde el punto de vista farmacéutico” significa una éster que se hidroliza in vivo (por ejemplo, en el cuerpo humano) para producir el compuesto de origen o una sal de este, o tiene per se actividad similar a la del compuesto de origen. Los ésteres adecuados incluyen ésteres de C¹-C⁵ alquilo, C²-C⁵ alquenilo o C²-C⁵ alquinilo, en especial, metilo, etilo o n-propilo.

La expresión “sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico” significa una sal de un compuesto adecuado para la formulación farmacéutica. Cuando un compuesto tiene uno o más grupos básicos, la sal puede ser una sal de adición ácida, tal como sulfato, bromhidrato, tartrato, mesilato, maleato, citrato, fosfato, acetato, pamoato (embonato), yodhidrato, nitrato, clorhidrato, lactato, metilsulfato, fumarato, benzoato, succinato, mesilato, lactobionato, suberato, tosilato y similares. Cuando un compuesto tiene uno o más grupos ácidos, la sal puede ser una sal de calcio, sal de potasio, sal de magnesio, sal de meglumina, sal de amonio, sal de zinc, sal de piperazina, sal de trometamina, sal de litio, sal de colina, sal de dietilamina, sal de 4-fenilciclohexilamina, sal de benzatina, sal de sodio, sal de tetrametilamonio y similares. La presente invención también abarca solvatos y formas cristalinas polimórficas.

En las fórmulas de la presente memoria descriptiva, una línea ondulada (—«*>») que atraviesa un enlace o un asterisco (*) en el extremo del enlace indica un sitio de unión covalente. Por ejemplo, una declaración de que R es

o que R es

en la Fórmula

significa

En las fórmulas de la presente memoria descriptiva, un enlace que atraviesa un anillo aromático entre dos carbonos de este significa que el grupo unido al enlace puede estar ubicado en cualquiera de las posiciones del anillo aromático que se volvieron disponibles mediante la eliminación del hidrógeno que está allí implícitamente. A modo ilustrativo, la Fórmula

representa

En otra ilustración,

Representa

En general, las estructuras tautoméricas se presentaron en la presente en la forma de enol, a los fines de consistencia y conveniencia.

Las personas del oficio de nivel medio comprenderán que también se podrían haber presentado en la forma ceto equivalente y que los dos tautómeros son equivalentes.

AGONISTAS DE TLR7

R1 en la Fórmula (I) es, preferentemente, n-BuO, n-BuNH, EtO, MeO o MeOCH²CH²O; con mayor preferencia, n-BuO o MeOCH²CH²O; y con máxima preferencia, n-BuO.

En la Fórmula (I), cada R2 es, preferentemente, H, un R3 se reemplaza por (CH²)xR4, y los otros R3 son, cada uno, H. En una forma de realización, un compuesto de acuerdo con la Fórmula (I) está representado por la Fórmula (Ia), en donde R1 es, preferentemente, n-BuO, y el subíndice x es, preferentemente, 1.

En las Fórmulas (I) y (Ia), R4 es, preferentemente, OH, NH(CHMe²), NHCH²C⁶H⁵ , NHMe, NHCH²CH²OH,

Los ejemplos de compuestos de acuerdo con la Fórmula (I) incluyen:

La Tabla A presenta datos de la actividad biológica de los compuestos descritos en la presente. Un conjunto de datos se refiere a la actividad agonista de TLR7 usando el ensayo indicador de TLR7 HEK-Blue™, como se describe más adelante en la presente. Otro conjunto de datos se refiere a la inducción de la interleucina 6 (IL-6), una citocina que tiene una función importante en la vía de TLR7. Para fines comparativos, también se presentan las actividades de resiquimod, vesatolimod, gardiquimod y compuesto B (CAS Reg. N.° 226906-84-9).

CONJUGADOS

General

Los agonistas de TLR7 descritos en la presente se pueden administrar en el sitio de acción prevista mediante administración localizada o mediante administración dirigida en un conjugado con una porción de direccionamiento. Preferentemente, la porción de direccionamiento es un anticuerpo o una porción de fijación al antígeno de este, y su antígeno se encuentra en el área de acción prevista, por ejemplo, un antígeno asociado al tumor si el sitio de previsto es en un tumor (cáncer). Preferentemente, el antígeno asociado al tumor esta expresado o sobrexpresado únicamente por la célula cancerosa, en comparación con una célula normal. El antígeno asociado al tumor puede estar ubicado en la superficie de la célula cancerosa o ser secretado por la célula cancerosa en sus proximidades. Otros aspectos de la divulgación incluyen lo siguiente.

En un aspecto de la divulgación, se proporciona un conjugado que comprende un compuesto de la presente invención y un ligando, representado por la Fórmula (IV)

[D(XD)a(C)c(XZ)b]mZ (IV)

en donde Z es una porción de direccionamiento, D es un agonista de la presente invención, y -(XD)aC(XZ)b- se denominan, en forma conjunta, “porción ligadora” o “ligador”, porque ligan Z y D. Dentro del ligador, C es un grupo escindible diseñado para escindirse en el sitio de acción biológica previsto de D, o cerca de este; XD y XZ son porciones espaciadoras (o “espaciadores”) que separan D y C, y C y Z, respectivamente; los subíndices a, b y c son independientemente 0 o 1 (es decir, la presencia de XD, XZ y C es opcional). El subíndice m es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (preferentemente, 1, 2, 3 o 4). D, XD, C, XZ y Z se describen en mayor detalle a continuación.

Al fijarse a un tejido o una célula diana donde se encuentra su antígeno o receptor, Z dirige el conjugado hacia allí. La escisión del grupo C en el tejido o la célula diana libera D para que ejerza su efecto localmente. De esta manera, el suministro preciso de D se logra en el sitio de acción prevista, lo cual reduce la dosificación necesaria. Además, en general, D es biológicamente inactivo (o considerablemente menos activo) en estado conjugado, por lo que se reducen sus efectos diana secundarios.

Como se indica con el subíndice m, cada Z se puede conjugar con más de un D, según la cantidad de sitios que Z tiene disponible para la conjugación y las condiciones experimentales que se usen. Las personas del oficio de nivel medio comprenderán que, si bien cada Z individual se conjuga con un número entero de D, se puede analizar una preparación del conjugado en una relación no de enteros de D con respecto a Z, para así reflejar un promedio estadístico. Esta relación se denomina relación de sustitución (“SR”) o relación fármaco-anticuerpo (DAR).

Porción de direccionamiento Z

Preferentemente, la porción de direccionamiento Z es un anticuerpo. Por razones de conveniencia y brevedad, pero no de modo limitativo, la descripción detallada en esta memoria descriptiva sobre Z y sus conjugados se realiza en el contexto de que es un anticuerpo, pero las personas del oficio de nivel medio comprenderán que se pueden conjugar otros tipos de Z, mutatis mutandis. Por ejemplo, los conjugados con ácido fólico como la porción de direccionamiento se pueden dirigir a células que tienen el receptor de folato en sus superficies (Leamon et al., Cancer Res. 2008, 68 (23), 9839). Por las mismas razones, la siguiente descripción detallada en esta memoria descriptiva se realiza en términos de una relación 1:1 de Z con respecto a D (m = 1).

Los anticuerpos que se pueden usar en los conjugados de la presente invención incluyen aquellos que reconocen los siguientes antígenos: mesotelina, antígeno membranal específico de la próstata (PSMA), CD19, CD22, CD30, CD70, B7H3, B7H4 (también conocido como O8E), proteína tirosina quinasa 7 (PTK7), glipicano-3, RG1, fucosil-GM1, CTLA-4 y CD44. El anticuerpo puede ser animal (por ejemplo, murino), quimérico, humanizado o, preferentemente, humano. Preferentemente, el anticuerpo es monoclonal, en especial, es un anticuerpo monoclonal humano. La preparación de anticuerpos monoclonales humanos contra algunos de los antígenos mencionados anteriormente se describe en Korman et al., US 8.609.816 B2 (2013; B7H4, también conocido como 08E; en particular, anticuerpos 2A7, 1G11 y 2F9); Rao-Naik et al., 8.097.703 B2 (2012; CD19; en particular, anticuerpos 5G7, 13F1, 46E8, 21D4, 21D4a, 47G4, 27F3 y 3C10); King et al., US 8.481.683 B2 (2013; CD22; en particular, anticuerpos 12C5, 19A3, 16F7 y 23C6); Keler et al., US 7.387.776 B2 (2008; CD30; en particular, anticuerpos 5F11, 2H9 y 17G1); Terrett et al., US 8.124.738 B2 (2012; CD70; en particular, anticuerpos 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 y 69A7); Korman et al., US 6.984.720 B1 (2006; CTLA-4; en particular, anticuerpos ^{1 0} D¹ , 4B6 y 1E2); Korman et al., US 8.008.449 B2 (2011; PD-1; en particular, anticuerpos 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4); Huang et al., US 2009/0297438 A1 (2009; PSMA, en particular, anticuerpos 1C3, 2A10, 2F5, 2C6); Cardarelli et al., US 7.875.278 B2 (2011; PSMA; en particular, anticuerpos 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 y 1C3); Terrett et al., US 8.222.375 B2 (2012; PTK7; en particular, anticuerpos 3G8, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8); Harkins et al., US 7.335.748 B2 (2008; RG1; en particular, anticuerpos A, B, C y D); Terrett et al., US 8.268.970 B2 (2012; mesotelina; en particular, anticuerpos 3C10, 6A4 y 7^b 1); Xu et al., U^s 2010/0092484 A1 (2010; CD44; en particular, anticuerpos 14G9.B8.B4, 2D1.A3.D12 y 1A9.A6.B9); Deshpande et al., US 8.258.266 B2 (2012; IP10; en particular, anticuerpos 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S y 13C4); Kuhne et al., US 8.450.464 B2 (2013; CXCR4; en particular, anticuerpos F7, F9, D1 y E2); y Korman et al., Us 7.943.743 B2 (2011; PD-L1; en particular, anticuerpos 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 y 13G4). Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo antimesotelina.

Además de ser un anticuerpo, Z también puede ser un fragmento de anticuerpo (tal como Fab, Fab', F(ab')² , Fd o Fv) o mimético del anticuerpo, tal como Affibody, anticuerpo de dominio (dAb), nanocuerpo, unicuerpo, DARPin, Anticalin, Versabody, Duocalin, lipocalina o avímero.

Cualquiera de los varios grupos reactivos diferentes en Z puede ser un sitio de conjugación, que incluyen grupos £-amino en los residuos de lisina, porciones de hidratos de carbono colgantes, grupos de ácidos carboxílicos en cadenas laterales de ácido aspártico o glutámico, grupos disulfuro cisteína-cisteína y grupos tiol cisteína. Para obtener reseñas sobre grupos reactivos de anticuerpos adecuados para la conjugación, véanse, por ejemplo, Garnett, Adv. Drug Delivery Rev. 2001, 53, 171-216 y Dubowchik and Walker, Pharmacology & Therapeutics 1999, 83, 67-123.

La mayoría de los anticuerpos tienen múltiples residuos de lisina, que se pueden conjugar a través de sus grupos £-amino mediante enlaces de amida, urea, tiourea o carbamato.

Un grupo tiol (-SH) en la cadena lateral de una cisteína se puede usar para formar un conjugado mediante varios métodos. Se puede usar para formar un puente disulfuro entre este y un grupo tiol en el ligador. Otro método es mediante su adición de Michael a un grupo maleimida en el ligador.

Por lo general, a pesar de que los anticuerpos tienen residuos de cisteína, carecen de grupos tiol libres ya que todas sus cisteínas están unidas en puentes disulfuro intra- o intercadena. Para generar un grupo tiol libre, se puede reducir un grupo disulfuro nativo. Véase, por ejemplo, Packard et al., Biochemistry 1986, 25, 3548; King et al., Cancer Res. 1994, 54, 6176; y Doronina et al., Nature Biotechnol. 2003, 21, 778. De manera alternativa, una cisteína que tiene un grupo -SH libre se puede introducir mutando el anticuerpo, sustituyendo una cisteína con otro aminoácido o insertando uno en la cadena de polipéptidos. Véanse, por ejemplo, Figenbrot et al., US 7.521.541 B2 (2009); Chilkoti et al., Bioconjugate Chem. 1994, 5, 504; Urnovitz et al., ^uS 4.698.420 (1987); Stimmel et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 30445; Bam et al., US 7.311.902 B2 (2007); Kuan et al., J. Biol. Chem. 1994, 269, 7610; Poon et al., J. Biol. Chem. 1995, 270, 8571; Junutula et al., Nature Biotechnology 2008, 26, 925 y Rajpal et al., solicitud provisional estadounidense N.° 62/270245, presentada el 21 de diciembre de 2015. Aun en otro enfoque, una cisteína se agrega al terminal C de las cadenas pesada o liviana. Véanse, por ejemplo, Liu et al., US 8.865.875 B2 (2014); Cumber et al., J. Immunol. 1992, 149, 120; King et al, Cancer Res. 1994, 54, 6176; Li et al., Bioconjugate Chem. 2002, 13, 985; Yang et al., Protein Engineering 2003, 16, 761; y Olafson et al., Protein Engineering Design & Selection 2004, 17, 21.

Ligadores y sus componentes

Como se indicó anteriormente, el ligador comprende hasta 3 elementos: un grupo escindible C y espaciadores opcionales XZ y XD.

El grupo C es escindible en condiciones fisiológicas. Preferentemente, es relativamente estable mientras el conjugado está en circulación en la sangre, pero es fácilmente escindible una vez que el conjugado alcanza su sitio de acción prevista.

Un grupo C preferido es un péptido que se escinde de manera selectiva por una proteasa dentro de la célula diana, en contraposición a una proteasa en el suero. Con frecuencia, el péptido comprende de 1 a 20 aminoácidos, preferentemente, de 1 a 6 aminoácidos, con mayor preferencia, de 2 a 3 aminoácidos. Los aminoácidos pueden ser a-aminoácidos naturales y/o no naturales. Los aminoácidos naturales son aquellos codificados por el código genético, así como los aminoácidos derivados de ellos, por ejemplo, hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, citrulina y O-fosfoserina. En esta memoria descriptiva, el término "aminoácido" también incluye análogos y miméticos de aminoácidos. Los análogos son compuestos que tienen la misma estructura H²N(R)CHCO²H general de un aminoácido natural, excepto que el grupo R no se encuentra en los aminoácidos naturales. Los ejemplos de análogos incluyen homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina y metionina metil sulfonio. Un aminoácido mimético es un compuesto que tiene una estructura diferente de la estructura química general de un a-aminoácido, pero funciona de manera similar a aquel. El aminoácido puede ser de estereoquímica “L” de los aminoácidos genéticamente codificados, así como de estereoquímica “D” enantiomérica.

Preferentemente, C contiene una secuencia de aminoácidos que es una secuencia de reconocimiento de escisión de una proteasa. En el estado de la técnica, se conocen diversas secuencias de reconocimiento de escisión. Véanse, por ejemplo, Matayoshi et al. Science 247: 954 (1990); Dunn et al. Meth. Enzymol. 241: 254 (1994); Seidah et al. Meth. Enzymol. 244: 175 (1994); Thornberry, Meth. Enzymol. 244: 615 (1994); Weber et al. Meth. Enzymol. 244: 595 (1994); Smith et al. Meth. Enzymol. 244: 412 (1994); y Bouvier et al. Meth. Enzymol. 248: 614 (1995).

Un grupo C de forma tal que sea escindido por una proteasa presente en la matriz extracelular cerca de un tipo de cáncer, por ejemplo, una proteasa liberada por células cancerosas moribundas cercanas o una proteasa asociada al tumor secretada por células cancerosas. Los ejemplos de proteasas extracelulares asociadas a un tumor son plasmina, metaloproteasas de matriz (MMP), thimet oligopeptidasa (TOP) y CD10. Véanse, por ejemplo, Trouet et al., US 7.402.556 B2 (2008); Dubois et al., US 7.425.541 B2 (2008); y Bebbington et al., US 6.897.034 B2 (2005). La catepsina D, generalmente una enzima lisosomal que se encuentra dentro de las células, se encuentra a veces en las proximidades de un tumor, posiblemente liberada por células cancerosas moribundas.

Para conjugados diseñados para ser [omisión en el texto fuente] por una enzima, C comprende, preferentemente, una secuencia de aminoácidos seleccionada para la escisión mediante proteasas tales como catepsinas B, C, D, H, L y S, en especial, catepsina B. Los ejemplos de péptidos escindibles mediante catepsina B incluyen Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Lys-Val-Ala, Asp-Val-Ala, Val-Ala, Lys-Val-Cit, Ala-Val-Cit, Val-Gly, Val-Gln y Asp-Val-Cit. (En la presente, las secuencias de aminoácidos se escriben en la dirección N a C, como en H²N-AA2-AA1-CO²H, a menos que el contexto indique claramente lo contrario). Véanse Dubowchik et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 1998, 8, 3341; Dubowchik et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998, 8, 3347; y Dubowchik et al., Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855. Otra enzima que se puede utilizar para la escisión de ligadores de peptidilo es legumaína, una cisteína proteasa lisosómica que se escinde, preferentemente, en Ala-Ala-Asn.

En un aspecto de la divulgación, el grupo C es un péptido que comprende una secuencia de dos aminoácidos -AA2-AA1-, en donde AA1 es lisina, arginina o citrulina, y AA2 es fenilalanina, valina, alanina, leucina o isoleucina. En otro aspecto, C consiste de una secuencia de 1 a 3 aminoácidos, seleccionados del grupo que consiste en Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Ala-Ala-Asn, Lys, Cit, Ser y Glu. Con mayor preferencia, es un péptido de 2 a 3 aminoácidos del grupo anterior.

La preparación y el diseño de grupos escindibles C que consisten en un solo aminoácido se describen en Chen et al., US 8.664.407 B2 (2014).

El grupo C se puede unir directamente a Z o D; es decir, los espaciadores XZ o XD, según el caso, pueden estar ausentes.

Cuando está presente, el espaciador XZ proporciona una separación espacial entre C y Z, para que el primero interfiera en forma estérica en la fijación al antígeno por parte del último o que el último interfiera en forma estérica en la escisión del primero. Además, el espaciador XZ se puede usar para conferir mayor solubilidad o menores propiedades de agregación a los conjugados. Un espaciador XZ puede comprender uno o más segmentos modulares, que se pueden ensamblar mediante diversas combinaciones. Los ejemplos de segmentos adecuados para un espaciador XZ son:

y combinaciones de estos, en donde el subíndice g es 0 o 1, y el subíndice h es 1 a 24, preferentemente, 2 a 4. Estos segmentos se pueden combinar, como se ilustra a continuación:

El espaciador XD, si está presente, proporciona una separación espacial entre C y D, para que el último interfiera en forma estérica o electrónica en la escisión del primero. El espaciador XD también puede cumplir con la función de introducir masa molecular y funcionalidad química adicionales en un conjugado. En general, la masa y la funcionalidad adicionales afectarán la semivida del suero y otras propiedades del conjugado. Por ende, a través de la selección prudente de grupos espaciadores, la semivida del suero de un conjugado se puede modular. El espaciador XD también se puede ensamblar de segmentos modulares, de manera análoga a la descripción anterior del espaciador XZ.

Los espaciadores XZ y/o XD, cuando están presentes, proporcionan preferentemente una separación lineal de 4 a 25 átomos, con mayor preferencia, de 4 a 20 átomos, entre Z y C o D y C, respectivamente.

El ligador puede cumplir otras funciones además de ligar de manera covalente el anticuerpo y el fármaco. Por ejemplo, el ligador puede contener un grupo poli(etilenglicol) (“PEG”). Dado que la etapa de conjugación habitualmente implica el acoplamiento de un fármaco-ligador con un anticuerpo en un medio acuoso, un grupo PEG puede mejorar la solubilidad acuosa del fármaco-ligador. Asimismo, un grupo PEG puede mejorar la solubilidad o reducir la agregación en el ADC resultante. Cuando un grupo PEG está presente, se puede incorporar en cualquiera de los espaciadores XZ o XD, o en ambos. La cantidad de unidades de repetición en un grupo PEG puede ser de 2 a 20, preferentemente, entre 4 y 10.

Cualquier espaciador XZ o XD, o ambos, pueden comprender una porción que se autoinmola. Una porción que se autoinmola es una porción que (1) se fija a C y a Z o D y (2) tiene una estructura tal que la escisión del grupo C inicia una secuencia de reacción que da como resultado que la porción que se autoinmola se desprende de Z o D, según el caso. En otras palabras, la reacción en sitio distal de Z o D (escisión del grupo C) también provoca la ruptura del enlace XZ-Z o XD-D. La presencia de una porción que se autoinmola es conveniente en el caso del espaciador XD porque, si después de la escisión del conjugado, el espaciador XD o una porción de este permanecen fijos a D, la actividad biológica de D puede verse perjudicada. El uso de una porción que se autoinmola es específicamente conveniente cuando el grupo escindible C es un polipéptido, en cuyo caso, la porción que se autoinmola se ubica, por lo general, de manera adyacente a este, con el fin de evitar que D interfiera en forma estérica o electrónica en la escisión peptídica.

Los ejemplos de porciones que se autoinmolan (i)-(v) unidas a un grupo hidroxilo o amino de D se muestran a continuación:

La porción que se autoinmola es la estructura entre las líneas punteadas a y b (o líneas punteadas b y c); se muestran características estructurales para proporcionar contexto. Las porciones que se autoinmolan (i) y (v) se fijan a un D-NH² (es decir, la conjugación es a través de un grupo amino), mientras que las porciones que se autoinmolan (ii), (iii) y (iv) se fijan a un D-OH (es decir, la conjugación es a través de un grupo hidroxilo o carboxilo). La escisión del enlace en la línea punteada b mediante una enzima - una peptidasa en el caso de las estructuras (i)-(v) y una pglucuronidasa en el caso de la estructura (vi) - inicia una secuencia de reacción que se autoinmola que da como resultado la escisión del enlace en la línea punteada a y la liberación resultante de D-OH o D-NH², según el caso. A modo ilustrativo, los mecanismos de autoinmolación para estructuras (i) y (iv) se muestran a continuación:

En otras palabras, la escisión de un primer enlace químico en una parte de un grupo que se autoinmola inicia una secuencia de etapas que da como resultado la escisión de un segundo enlace químico - el que conecta el grupo que se autoinmola al fármaco - en una parte diferente del grupo que se autoinmola, y así libera el fármaco.

En algunos casos, los grupos que se autoinmolan se pueden usar en tándem, como se muestra en la estructura (vii). En este caso, la escisión en la línea punteada c desencadena la autoinmolación de la porción entre las líneas punteadas b y c mediante una reacción de eliminación 1,6, seguida de la autoinmolación de la porción entre las líneas punteadas a y b mediante una reacción de ciclización-eliminación. Para obtener descripciones adicionales con respecto a porciones que se autoinmolan, véase Carl et al., J. Med. Chem. 1981, 24, 479; Carl et al., WO 81/01145 (1981); Dubowchik et al., Pharmacology & Therapeutics 1999, 83, 67; Firestone et al., US 6.214.345 B1 (2001); Toki et al., J. Org. Chem. 2002, 67, 1866; Doronina et al., Nature Biotechnology 2003, 21, 778 (erratum, p. 941); Boyd et al., US 7.691.962 B2; Boyd et al., US 2008/0279868 A1; Sufi et al., WO 2008/083312 A2; Feng, US 7.375.078 B2; Jeffrey et al., US 8.039.273; y Senter et al., US 2003/0096743 A1.

En otro caso, Z y D están ligados por un ligador no escindible, es decir, C está ausente. El metabolismo de D eventualmente reduce el ligador a una pequeña porción unida que no interfiere en la actividad biológica de D.

Técnicas de conjugación

Los conjugados de los agonistas de TLR7 descritos en la presente se realizan preferentemente al preparar primero un compuesto que comprende D y un ligador (XD)a(C)c(XZ)b (en donde XD, C, XZ, a, b y c son como se definen en la Fórmula (II)) para formar un compuesto fármaco-ligador representado por la Fórmula (V):

D-(XD)a(C)c(XZ)b-R31 (V)

en donde R31 es un grupo funcional adecuado para reaccionar con un grupo funcional complementario en Z para formar el conjugado. Los ejemplos de grupos R31 adecuados incluyen amino, azida, tiol, ciclooctino,

en donde R32 es Cl, Br, F, mesilato o tosilato, y R33 es Cl, Br, I, F, OH, -O-N-succinimidilo, -O-(4-nitrofenilo), -O-pentafluorofenilo, o -O-tetrafluorofenilo. La química que generalmente se puede usar para la preparación de restos adecuados D-(XD)aC(XZ)b-R31 se describe en Ng et al., US 7.087.600 B2 (2006); Ng et al., US 6.989.452 B2 (2006); Ng et al., US 7.129.261 B2 (2006); Ng et al., WO 02/096910 A1; Boyd et al., US 7,691,962 B2; Chen et al., US 7,517,903 B2 (2009); Gangwar et al., US 7,714,016 B2 (2010); Boyd et al., US 2008/0279868 A1; Gangwar et al., US 7,847,105 B2 (2010); Gangwar et al., US 7,968,586 B2 (2011); Sufi et al., US 8,461,117 B2 (2013); y Chen et al., US 8,664,407 B2 (2014).

Preferentemente, el grupo funcional reactivo -R31 es -NH² , -OH, -CO²H, -SH, maleimido, ciclooctino, azido (-N³), hidroxilamino (-ONH²) o N-hidroxisuccinimido. Los grupos funcionales -R31 de especial preferencia son los siguientes:

Un grupo -OH se puede esterificar con un grupo carboxi en el anticuerpo, por ejemplo, en una cadena lateral de ácido aspártico o glutámico.

Un grupo -CO ²H se puede esterificar con un grupo -OH o se puede amidar con un grupo amino (por ejemplo, en una cadena lateral de lisina) en el anticuerpo.

Un grupo N-hidroxisuccinimida es, funcionalmente, un grupo carboxilo activado y se puede amidar, en forma conveniente, mediante la reacción con un grupo amino (por ejemplo, de lisina).

Un grupo maleimida se puede conjugar con un grupo -SH en el anticuerpo (por ejemplo, de cisteína o de la modificación química del anticuerpo para introducir una funcionalidad de sulfhidrilo), en una reacción de adición de Michael.

Cuando un anticuerpo no tiene una cisteína -SH disponible para la conjugación, un grupo £-amino en la cadena lateral de un residuo de lisina se puede hacer reaccionar con 2-iminotiolano o N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato (“SPDP”) para introducir un grupo tiol (-SH) libre - y así se crea un sustituto de cisteína, por así decirlo. El grupo tiol se puede hacer reaccionar con una maleimida u otro grupo aceptor nucleófilo para producir la conjugación. El mecanismo se ilustra a continuación con 2-iminotiolano.

En general, se logra un nivel de tiolación de dos o tres tioles por anticuerpo. Para un procedimiento representativo, véase Cong et al., US 8.980.824 B2 (2015).

En una disposición inversa, un anticuerpo Z se puede modificar con N-succinimidil 4-(maleimidometil)-ciclohexancarboxilato (“SMCC”) o su variante sulfonada sulfo-SMCC, ambas disponibles de Sigma-Aldrich, para introducir un grupo de maleimida en este. Luego, la conjugación se puede realizar con un compuesto fármacoligador que tiene un grupo -SH en el ligador.

Un método de conjugación alternativa utiliza "química clic" libre de cobre, en donde un grupo azida agrega en ciclooctino con tensión anular para formar un anillo de 1,2,3-triazol. Véase, por ejemplo, Agard et al., J. Amer. Chem. Soc. 2004, 126, 15046; Best, Biochemistry 2009, 48, 6571. La azida se puede ubicar en el anticuerpo, y el ciclooctino, en la porción fármaco-ligador, o viceversa. Un grupo ciclooctino preferido es dibenzociclooctino (DlBo). Diversos reactivos que tienen un grupo DIBO se encuentran disponibles de Invitrogen/Molecular Probes, Eugene, Oregon. La siguiente reacción ilustra la conjugación por química clic para el caso en donde el grupo DIBO está unido al anticuerpo (Ab):

Incluso otra técnica de conjugación incluye introducir un aminoácido no natural en un anticuerpo, en donde el aminoácido no natural proporciona una funcionalidad para la conjugación con un grupo funcional reactivo en la porción fármaco. Por ejemplo, la p-acetilfenilalanina de aminoácidos no natural se puede incorporar en un anticuerpo u otro polipéptido, como se indica en Tian et al., WO 2008/030612 A2 (2008). El grupo cetona en la pacetilfenialanina puede ser un sitio de conjugación mediante la formación de una oxima con un grupo hidroxilamino en la porción ligador-fármaco. De manera alternativa, el aminoácido no natural p-azidofenilalanina se puede incorporar en un anticuerpo para proporcionar un grupo funcional azida para la conjugación mediante química clic, como se analizó anteriormente. Los aminoácidos no naturales también se pueden incorporar en un anticuerpo u otro polipéptido usando métodos libres de células, como se indica en Goerke et al., US 2010/0093024 A1 (2010) y Goerke et al., Biotechnol. Bioeng. 2009, 102 (2), 400-416. Por lo tanto, un anticuerpo que se usa para preparar un conjugado puede tener uno o más aminoácidos reemplazados por un aminoácido no natural, que, preferentemente, es p-acetilfenilalanina o p-azidofenilalanina, con mayor preferencia, p-acetilfenilalanina.

Otra técnica de conjugación usa la enzima transglutaminasa (preferentemente, transglutaminasa bacteriana de Streptomyces mobaraensis o BTG), por Jeger et al., Angew. Chem. ed. int. 2010, 49, 9995. La BTG forma un enlace de amida entre la carboxamida de la cadena lateral de una glutamina (el aceptor de amina) y un grupo alquilenamino (el donante de amina), que puede ser, por ejemplo, el grupo £-amino de una lisina o un grupo 5-amino-n-pentilo. En una reacción de conjugación típica, el residuo de glutamina se ubica en el anticuerpo, mientras que el grupo alquilenamino se ubica en la porción ligador-fármaco, como se muestra a continuación:

La posición de un residuo de glutamina en una cadena de polipéptidos tiene un efecto importante en su susceptibilidad a la transamidación mediada por BTG. Ninguno de los residuos de glutamina en un anticuerpo son normalmente sustratos de BTG. Sin embargo, si el anticuerpo se desglucosila - el sitio de glucosilación es asparagina 297 (N297; (numeración de acuerdo con el índice EU, según se establece en Kabat et al., “Sequences of proteins of immunological interest,” 5.a ed., Pub. N.° 91-3242, U.S. Dept. Health & Human Services, NIH, Bethesda, Md., 1991; en adelante “Kabat”) de la cadena pesada - la glutamina 295 (Q295) cercana se vuelve susceptible a BTG. Un anticuerpo se puede desglucosilar enzimáticamente mediante el tratamiento con PNGasa F (Péptido-N-Glucosidasa F). De manera alternativa, un anticuerpo se puede sintetizar libre de glucósido introduciendo una mutación N297A en la región constante para eliminar el sitio de glucosilación N297. Además, se demostró que una sustitución N297Q no solo elimina la glucosilación, sino que también introduce un segundo residuo de glutamina (en la posición 297) que también es un aceptor de amina. Por ende, el anticuerpo puede desglucosilarse. En otra forma de realización, el anticuerpo puede tener una sustitución N297Q. Las personas del oficio de nivel medio comprenderán que la desglucosilación mediante modificación posterior a la síntesis o mediante la introducción de una mutación N297A genera dos residuos de glutamina que reaccionan a BTG por anticuerpo (uno por cadena pesada, en la posición 295), mientras que un anticuerpo con una sustitución N297Q tendrá cuatro residuos de glutamina que reaccionan a BTG (dos por cadena pesada, en las posiciones 295 y 297).

Un anticuerpo también se puede volver susceptible a una conjugación mediada por BTG al introducir en este una glutamina que contiene péptido, o “etiqueta”, como se enseña, por ejemplo, en Pons et al., US 2013/0230543 A1 (2013) y Rao-Naik et al., WO 2016/144608 A1.

En un enfoque complementario, la especificidad del sustrato de BTG se puede alterar al variar su secuencia de aminoácidos, de manera que se vuelva capaz de reaccionar con glutamina 295 en un anticuerpo no modificado, como se enseña en Rao-Naik et al., WO 2017/059158 A1 (2017).

Si bien la transglutaminasa bacteriana más comúnmente disponible es la de S. mobaraensis, se puede considerar la transglutaminasa de otras bacterias, que tienen especificidades de sustrato un poco diferentes, tal como transglutaminasa de Streptoverticillium ladakanum (Hu et al., US 2009/0318349 A1 (2009), US 2010/0099610 A1 (2010) y US 2010/0087371 A1 (2010)).

Los agonistas de TLR7 de esta descripción que tienen una amina alquilo primaria o secundaria son particularmente adecuadas para usar en conjugados, debido a que la amina secundaria proporciona un grupo funcional para la unión del ligador. Un ejemplo de este tipo de compuesto agonista de TLR7-ligador es el compuesto 8, que contiene un ligador que se puede escindir en forma enzimática. La Figura 2 muestra un esquema de acuerdo con el que se puede preparar dicho compuesto 8.

Un ejemplo de un compuesto agonista de TLR7-ligador que contiene un ligador que no se puede escindir en forma enzimática es el compuesto 10. La Figura 3 muestra un esquema para sintetizar el compuesto 10.

Ambos compuestos 8 y 8 contienen un grupo alquilamino primario, que los vuelve susceptibles a la conjugación con transglutaminasa. Un proceso de conjugación adecuado se describe en los Ejemplos más adelante.

La conjugación también puede llevarse a cabo usando la enzima Sortasa A, como se explica en Levary et al., PLoS One 2011, 6(4), e18342; Proft, Biotechnol. Lett. 2010, 32, 1-10; Ploegh et al., WO 2010/087994 A2 (2010) y Mao et al., WO 2005/051976 A2 (2005). El motivo de reconocimiento de la Sortasa A (en general, LPXTG, en donde X es cualquier aminoácido natural) se puede ubicar en el ligando Z, y el motivo aceptor nucleofílico (en general, GGG) puede ser el grupo R31 en la Fórmula (NI), o viceversa.

Conjugados agonistas de TLR7

Mediante la aplicación de las técnicas descritas con anterioridad, se pueden preparar conjugados agonistas de TLR7 tales como los que se muestran a continuación:

en donde m es 1, 2, 3, o 4, y Ab es un anticuerpo.

PEGILACIÓN

La unión de una cadena de poli(etilenglicol) (PEG) a un fármaco (“pegilación”) puede mejorar las propiedades farmacocinéticas de este último. La semivida de circulación del fármaco se aumenta, a veces por encima de un orden de magnitud, reduciendo de manera concomitante la dosis necesaria para lograr un efecto terapéutico deseado. La pegilación también puede disminuir la degradación metabólica de un fármaco y reducir su inmunogenicidad. Para una reseña, véase Kolate et al., J. Controlled Release 2014, 192, 167.

Inicialmente, la pegilación se aplicó a fármacos biológicos. Desde 2016, se aprobaron más de 10 compuestos biológicos pegilados. Turecek et al., J. Pharmaceutical Sci. 2016, 105, 460. Más recientemente, estimulada por la aplicación exitosa del concepto a los compuestos biológicos, la atención se ha dirigido a su aplicación en fármacos de moléculas pequeñas. Además de los beneficios antes mencionados, los fármacos de moléculas pequeñas pegilados pueden tener mayor solubilidad y producir menos efectos tóxicos. Li et al. Prog. Polymer Sci. 2013, 38, 421.

Los compuestos descritos en la presente se pueden pegilar - es decir, pueden tener un resto poli(etilenglicol) unido de manera covalente. Cuando un compuesto tiene un hidroxilo alifático o una amina primaria o secundaria alifática, como en el caso del compuesto Ia-01 o Ia-04 (flechas), se puede pegilar mediante un grupo éster, amida, carbonato o carbamato con una molécula PEG que contiene carboxi utilizando técnicas convencionales tales como diciclohexilcarbodiimida, HATU, ésteres de N-hidroxisuccinimida, y similares. Otros métodos diversos para pegilar moléculas farmacéuticas se describen en Alconcel et al., Polymer Chem. 2011, 2, 1442.

Si se desea, un agonista de TLR7 descrito en la presente se puede pegilar mediante un ligador que se puede escindir en forma enzimática que comprende una porción que se autoinmola, para permitir la liberación del agonista no pegilado de una manera diseñada. Asimismo, la pegilación se puede combinar con conjugación con una proteína tal como un anticuerpo, si la molécula que contiene PEG tiene un grupo funcional adecuado tal como una amina para la unión a la proteína. La proteína puede proporcionar una función terapéutica adicional o, si es un anticuerpo, puede proporcionar una función de direccionamiento. Estos conceptos se ilustran en la siguiente secuencia de reacción, en donde TLR7-NH-R representa genéricamente un agonista de TLR7:

En la secuencia de reacción anterior, el dipéptido valina-citrulina (Val-Cit) se puede escindir mediante la enzima captesina B, con un grupo p-aminobencil oxicarbonilo (PABC) que funciona como un espaciador que se autoinmola. El grupo funcional para la conjugación es un grupo amina, que está temporalmente protegido por un grupo Fmoc. La conjugación se realiza mediante la enzima transglutaminasa, con una cadena lateral de glutamina (Gln) que actúa como aceptor de acilo. El subíndice x, que indica la cantidad de unidades de repetición de PEG, puede variar ampliamente, según el fin de la pegilación, como se analiza más adelante. Para algunos fines, x puede ser relativamente pequeño, tal como 2, 4, 8, 12 o 24. Para otros fines, x es grande, por ejemplo, entre alrededor de 45 y alrededor de 910.

Las personas del oficio de nivel medio entenderán que la secuencia es ilustrativa y que se pueden usar otros elementos - péptido, grupo que se autoinmola, método de conjugación, largo de PEG, etc. -, como se sabe en el estado de la técnica. También entenderán que, si bien la secuencia anterior combina pegilación and conjugación, la pegilación no require conjugación, y viceversa.

Cuando el compuesto no tiene hidroxilo alifático o amina primaria o secundaria alifática, como en el caso del compuesto Ia-09, aún se puede pegilar en la amina aromática (flecha). Un método para pegilar en esta posición fue descrito por Zarraga, US 2017/0166384 A1 (2007).

En algunas formas de realización, puede ser conveniente tener múltiples agonistas pegilados en una sola molécula. Por ejemplo, cuatro brazos pegilados se pueden construir en pentaeritritol (C(CH²OH)⁴), y un agonista de TLR7 se puede unir a cada brazo pegilado. Véase Gao et al., US 2013/0028857 A1 (2013).

Para modular la farmacocinética, generalmente se prefiere que la porción PEG tenga un peso de fórmula de alrededor de 2 kDa (que corresponden a alrededor de 45 unidades de repetición -(CH²CH²O)-) a alrededor de 40 kDa (que corresponden a alrededor de 910 unidades de repetición -(CH²CH²O)-), con mayor preferencia, de alrededor de 5 kDa a alrededor de 20 kDa. Es decir, el rango del subíndice x en las fórmulas anteriores es de alrededor de 45 a alrededor de 910. Cabe destacar que las composiciones PEG no son 100 % homogéneas, sino que exhiben una distribución de pesos moleculares. De este modo, una referencia a, por ejemplo, “PEG de 20kDa” significa PEG que tiene un peso molecular promedio de 20 kDa.

La pegilación también se puede usar para mejorar la solubilidad de un agonista. En tales casos, se puede usar una cadena PEG más corta, por ejemplo, que comprenda 2, 4, ⁸ , 12 o 24 unidades de repetición.

EJEMPLOS

La práctica de la presente invención también se puede comprender en relación con los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo ilustrativo y no son limitativos.

Ejemplo 1 - Síntesis de agonistas de TLR7

Este ejemplo y la Figura 1 se refieren a la síntesis de los compuestos de la presente invención.

Una suspensión de 10-metil-10H-fenotiazin-3,7-dicarbaldehído 1, que se preparó de acuerdo con Synthesis, 1998, 1107, (2,00 g, 7,43 mmol) en MeOH (30 ml) y THF (15 ml) se trató con NaBH⁴ (0,562 g, 14,85 mmol) en porciones a 0 °C y luego se agitó durante 45 min con enfriamiento continuo. La LCMS indicó que la reacción se había completado. La reacción se inactivó con agua y se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml). Los extractos orgánicos se secaron en Na²SO⁴, se filtraron y se concentraron para obtener dimetanol 2 (2,03 g, 94 % de rendimiento). LCMS ESI: calculado para C¹⁵H¹⁵NO²S = 274.1(M+H+), encontrado 274.0(M+H+).

Se disolvió dimetanol 2 (2,43 g, 8,89 mmol) en N.N-dimetilformamida (DMF, 30 ml). Se agregó imidazol (2,421 g, 35,6 mmol), y luego cloruro de t-butildimetilsililo (TBS-Cl, 0,804 g en 5 ml de DMF, 5,33 mmol) por goteo a 0 °C. Después de agitarse a 0 °C durante 3 h, la reacción estaba completa según LCMS. La reacción se inactivo con agua y se extrajo con EtOAc (4 x 50 ml). Los extractos orgánicos se secaron en Na²SO⁴, se filtraron y se concentraron. El producto crudo se purificó en una columna de sílice de 80 g, que se eluyó con EtOAc;hexano (0-100 % de gradiente) para obtener el compuesto 3 (1,57 g, 45,6% de rendimiento). LCMS ESI: calculado para C²-iH²gNO²SSi = 388.2(M+H+), encontrado 388.0(M+H+).

El compuesto 3 (510 mg, 1,316 mmol) se disolvió en diclorometano (DCM, 7,5 ml), luego se agregó diisopropiletilamina (DIPEA, 0,483 ml, 2,76 mmol), y luego cloruro de metansulfonilo (MsCl, 0,133 ml, 1,710 mmol) a 0 °C. Después de agitarse a 0 °C durante 1 h, la reacción estaba completa según LCMS. Se agregaron y se mezclaron DCM (10 ml) y agua (10 ml). Se retiró el agua, y la mezcla de reacción se lavó una vez más con agua. La capa orgánica se secó en Na²SO⁴ , se filtró y se concentró para obtener el compuesto de clorometilo crudo 4 (582 mg); el mesilato formado inicialmente se convirtió in situ en el compuesto de clorometilo.

El compuesto de clorometilo 4 se hizo reaccionar con el compuesto 5 (CAS Reg. N.° 866268-31-7) en presencia de carbonato de cesio para obtener el compuesto 6.

El tratamiento del compuesto 6 con HCl produjo hidroximetanol Ia-01, que luego se convirtió en el compuesto de clorometilo Ia-09 mediante tratamiento con cloruro de tionilo.

Por último, la reacción del compuesto Ia-09 con ciclobutanamina produjo el compuesto Ia-06. LCMS ESI: calculado para C²⁸H³³N⁷O²S = 532.2(M+H+), encontrado 532.0(M+H+). 1H NMR (DMSO-d⁶) 7.16-7.07 (m, 4 H), ^{6 .8 6} (dd, J = 12.5, 8.52 H), 6.56 (s, 2 H), 4.76 (s, 2 H), 4.18 (t, J = 6.5 Hz, 2 H), 3.51 (s, 2 H), 3.12 (p, J = 7.5 Hz, 1 H), 2.07-2.02 (m, 2 H), 1.70-1.50 (m, ⁶ H), 1.40 (h, J = 7.5 Hz, 2 H), 0.93 (t, J = 7.5 Hz, 3 H). La señal que corresponde a N-Me del anillo de fenotiazina estaba ausente debido a la supresión de agua.

En general, de acuerdo con los procedimientos anteriores, se prepararon los compuestos adicionales de acuerdo con la Fórmula (I), como se muestra en la Tabla B más adelante, usando aminas alternativas

(continuación)

Las personas del oficio comprenderán que otros compuestos de la presente memoria descriptiva se pueden realizar de acuerdo con los procedimientos anteriores, mutatis mutandis. Por ejemplo, el compuesto

(es decir, un caso en donde cada R2 y R3 en la Fórmula (I) es H) se puede realizar usando el monoaldehído como material de inicio (CAS Reg. N.° 4997-36-8):

El compuesto en donde un grupo R3 es Me se puede realizar mediante deshalogenación reductora del compuesto Ia-09:

Ejemplo 2 - Ensayo de actividad agonista de TLR7

Este ejemplo describe un método para evaluar la actividad agonista de TLR7 de los compuestos descritos en la presente memoria descriptiva.

Las células blue de riñón embrionario humano modificadas por ingeniería genética (células HEK-Blue™ TLR; Invivogen) que poseen un transgén indicador de fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) por TLR7 humano se suspendieron en un medio de cultivo no selectivo (DMEM con alta glucosa (Invitrogen), enriquecido con 10 % de suero bovino fetal (Sigma)). Las células HEK-Blue™ TLR7 se agregaron a cada cavidad de una placa de cultivo tisular de 384 cavidades (15.000 células por cavidad) y se incubaron 16-18 h a 37 °C, 5 % de CO². Los compuestos (100 nl) se distribuyeron en cavidades que contenían las células HEK-Blue™ TLR y las células tratadas se incubaron a 37 °C, 5 % de CO². Luego de 18 h de tratamiento, se agregaron 10 microlitros de reactivo Quanti-Blue™ recientemente preparado (Invivogen) a cada cavidad, se incubaron durante 30 min (37 °C, 5 % de CO²) y se midieron los niveles de SEAP usando un lector de placas Envision (OD = 620 nm). Se calcularon los valores de concentración efectiva máxima media (EC⁵⁰; concentración del compuesto que induce una respuesta intermedia entre el valor inicial y máximo del ensayo).

La Figura 4 es un gráfico representativo que muestra los datos así obtenidos para el compuesto Ia-04.

Ejemplo 3 - Conjugación mediada por transglutaminasa

El siguiente procedimiento se puede usar para la conjugación mediada por transglutaminasa de compuestos agonista-ligador, en donde el ligador tiene un grupo amina que puede actuar como un donante de amina. El anticuerpo puede ser uno que tiene una glutamina que reacciona a transglutaminasa, por ejemplo, uno con una sustitución N297A o N297Q. La transglutaminasa bacteriana recombinante con una relación molar de anticuerpo:enzima de 5:1 realiza la conjugación. La conjugación se realiza usando protocolos estándares en 50 mM de amortiguador Tris, pH 8,0, incubado durante la noche a 37 °C. El conjugado resultante se purifica en una columna de proteína A, equilibrada previamente con 50 mM de Tris, pH 8,0. El conjugado se eluye con amortiguador de citrato de sodio 0,1 M, pH 3,5. Las fracciones eluidas se neutralizan con Tris 1 M, pH 9,0. El conjugado se puede formular en 20 mg/ml de sorbitol, 10 mg/ml de glicina, pH 5,0.

Ejemplo 4 - Ensayo de inducción de interleucina 6

Este ejemplo describe un método para evaluar la inducción de interleucina 6 mediante los compuestos descritos en la presente memoria descriptiva.

Los compuestos diluidos en DMSO se transfirieron a cavidades individuales de una placa de 384 cavidades con fondo en forma de V transparente de Matrix Technologies usando tecnología de manipulación de líquidos acústica ECHO (25 nl por cavidad). Se agregaron muestras de sangre humana (25 ul) a cada cavidad usando un instrumento de manipulación de líquidos FeliX de CyBio. La placa se agitó en un agitador de placas durante 3 min antes de incu­ bar las mezclas de reacción a 37 °C durante 20 h. Luego, se agregó medio basal RPMI 1640 (enriquecido con L-glutamina) a cada cavidad (25 ul por cavidad) antes de liberar plasma de cada muestra mediante centrifugación (450 x g, 5 min, temperatura ambiente). Las muestras de plasma tratadas (3 ul) se transfirieron posteriormente a cavidades individuales de una placa ProxiPlate de 384 cavidades blanca con poca profundidad (Perkin Elmer) usando un instrumento de manipulación de líquidos FeliX, y sus niveles de interleucina 6 se midieron usando tecnología AlphaLISA como lo describe el fabricante, PerkinElmer. El software de análisis de datos se usó para determinar los valores de EC⁵⁰ del compuesto en donde el valor inicial se estableció usando valores de DMSO promedio y 100 % de inducción establecida usando valores de compuesto de referencia a la mayor concentración evaluada. La EC⁵⁰ se puede determinar con un software tal como Graphpad Prism™.

Las personas del oficio de nivel medio comprenderán que las condiciones y las metodologías en el presente ejemplo son ilustrativas y no limitativas, y que en el estado de la técnica se conocen variaciones de estas u otros enfoques de conjugación que se pueden utilizar en la presente invención.

La descripción detallada anterior de la invención incluye pases que se relacionan principal o exclusivamente con partes o aspectos particulares de la invención. Debe tenerse en cuenta que esto se realiza para una mayor claridad y conveniencia, que una característica particular puede ser relevante en más de un solo pase en el cual se describe y que la descripción de la presente incluye todas las combinaciones adecuadas de la información que se encuentra en los diferentes pases. De manera similar, si bien las distintas figuras y descripciones de la presente se relacionan con formas de realización específicas de la invención y aspectos de la divulgación, se debe tener en cuenta que cuando se describe una característica específica en el contexto de una figura o forma de realización particulares, la figura también se puede usar, con el alcance adecuado, en el contexto de otra figura o forma de realización, en combinación con otra figura o en la invención en general.

Asimismo, si bien la presente invención se ha descrito particularmente en términos de ciertas formas de realización preferidas, la invención no se limita a esas formas de realización preferidas. En cambio, el alcance de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas.

REFERENCIAS

A continuación se proporcionan las citas completas de las siguientes referencias citadas de manera abreviada por el primer autor (o inventor) y la fecha, en la presente memoria descriptiva.

Akinbobuyi et al., ACS 2013 69th Southwest Regional Meeting, Abstract SWRM-70, “Synthesis and evaluation of purine-based toll-like receptor 7 agonists and their antibody conjugates.”

Akinbobuyi et al., ACS 2015 Joint Southeastern/Southwest Regional Meeting, Abstract 392, “Synthesis of functionalized purine analogs for antibody conjugation” [2015a].

Akinbobuyi et al., Tetrahedron Lett. 2015, 56, 458, “Facile syntheses of functionalized toll-like receptor 7 agonists” [2015b].

Akinbobuyi et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2016, 26, 4246, “Synthesis and immunostimulatory activity of substituted TLR7 agonists.”

Barberis et al., US 2012/0003298 A1 (2012).

Beesu et al., J. Med. Chem. 2017, 60, 2084, “Identification of High-Potency Human TLR8 and Dual TLR7/TLR8 Agonists in Pyrimidine-2,4-diamines.”

Berghofer et al., J. Immunol. 2007, 178, 4072, “Natural and Synthetic TLR7 Ligands Inhibit CpG-A- and CpG-C-Oligodeoxynucleotide-Induced IFN-a Production.”

Bonfanti et al., US 2014/0323441 A1 (2015) [2015a].

Bonfanti et al., US 2015/0299221 A1 (2015) [2015b].

Carson et al., US 2013/0202629 A1 (2013).

Carson et al., US 8.729.088 B2 (2014).

Carson et al., US 9.050.376 B2 (2015).

Carson et al., US 2016/0199499 A1 (2016).

Chan et al., Bioconjugate Chem. 2009, 20, 1194, “Synthesis and Immunological Characterization of Toll-Like Receptor 7 Agonistic Conjugates.”

Chan et al., Bioconjugate Chem. 2011, 22, 445, “Synthesis and Characterization of PEGylated Toll Like Receptor 7 Ligands.”

Cortez et al., US 2017/0044168 A1 (2017). [2017a].

Cortez et al., US 2017/0121421 A1 (2017). [2017b].

Desai et al., US 9.127.006 B2 (2015).

Ding et al., WO 2016/107536 A1 (2016).

Ding et al., US 2017/0273983 A1 (2017) [2017a].

Ding et al., WO 2017/076346 A1 (2017) [2017b].

Gadd et al., Bioconjugate Chem. 2015, 26, 1743, “Targeted Activation of Toll-Like Receptors: Conjugation of a Toll-Like Receptor 7 Agonist to a Monoclonal Antibody Maintains Antigen Binding and Specificity.”

Graupe et al., US 8.993.755 B2 (2015).

Halcomb et al., US 9.161.934 B2 (2015).

Hashimoto et al., US 2009/0118263 A1 (2009).

Hirota et al., US 6.028.076 (2000).

Holldack et al., US 2012/0083473 A1 (2012).

Isobe et al., US 6.376.501 B1 (2002).

Isobe et al., JP 2004137157 (2004).

Isobe et al., J. Med. Chem. 2006, 49 (6), 2088, “Synthesis and Biological Evaluation of Novel 9-Substituted-8-Hydroxyadenine Derivatives as Potent Interferon Inducers.”

Isobe et al., US 7.521.454 B2 (2009) [2009a].

Isobe et al., US 2009/0105212 A1 (2009) [2009b].

Isobe et al., US 2011/0028715 A1 (2011).

Isobe et al., US 8.148.371 B2 (2012).

Jensen et al., WO 2015/036044 A1 (2015).

Kasibhatla et al., US 7.241.890 B2 (2007).

Koga-Yamakawa et al., Int. J. Cancer 2013, 132 (3), 580, “ Intratracheal and oral administration of SM-276001: A selective TLR7 agonist, leads to antitumor efficacy in primary and metastatic models of cancer.”

Li et al., US 9.902.730 B2 (2018).

Lioux et al., US 9.295.732 B2 (2016).

Lund et al., Proc. Nat’l Acad. Sci (USA) 2004, 101 (15), 5598, “Recognition of single-stranded RNA viruses by Tolllike receptor 7.”

Maj et al., US 9.173.935 B2 (2015).

McGowan et al., J. Med. Chem. 2017, 60, 6137, “Identification and Optimization of Pyrrolo[3,2-d]pyrimidine Toll-like Receptor 7 (TLR7) Selective Agonists for the Treatment of Hepatitis B.”

Musmuca et al., J. Chem. Information & Modeling 2009, 49 (7), 1777, “Small-Molecule Interferon Inducers. Toward the Comprehension of the MolecularDeterminants through Ligand-Based Approaches.”

Ogita et al., US 2007/0225303 A1 (2007).

Peterson, Rachel; Honor Program Thesis, “Synthesis of Sulfur and Amino-8-Substituted Adenine Derivatives as TLR7 Agonists,” Baylor University (2014).

Pryde, US 7.642.350 B2 (2010).

Roethle et al., J. Med. Chem 2013, 56, 7324, “Identification and Optimization of Pteridinone Toll-like Receptor 7 (TLR7) Agonists for the Oral Treatment of Viral Hepatitis.”

Seifert, Zacharie; Master of Science Thesis, “Synthesis and Evaluation of 8-Substituted Adenine Derivatives as Tolllike Receptor 7 Agonists,” Baylor University (2015).

Vernejoul et al., US 2014/0141033 A1 (2014).

Yu et al., PLoS One 2013, 8 (3), e56514, “Toll-Like Receptor 7 Agonists: Chemical Feature Based Pharmacophore Identification and Molecular Docking Studies.”

Zhang et al., Immunity 2016, 45, 737, “Structural Analysis Reveals that Toll-like Receptor 7 Is a Dual Receptor for Guanosine and Single-Stranded RNA.”

Zurawski et al., US 2012/0231023 A1 (2012).

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que tiene una estructura de acuerdo con la Fórmula (I)

en la que

R1 es (C¹-C⁵ alquil)O, (C¹-C² alquil)O(CH²)^2-3O, (C¹-C⁵ alquil)C(=O)O, (C¹-C⁵ alquil)NH, (C¹-C² alquil)O(CH²)^2-3NH o (C¹-C⁵ alquil)C(=O)NH;

R2 y R3 son, independientemente en cada caso, H, C¹-C³ alquilo, halo, O(C¹-C³ alquilo), CN o NO² , en donde un R3 se puede reemplazar por (CH²)xR4, en donde el subíndice x es 1,2, 3 o 4;

R4 es H, halo, OH, CN, NH² , NH(Cr C⁵ alquilo), N(Cr C5 alquilo)², NH(C3-Ca cicloalquilo), NH(C⁴-C⁸ bicicloalquilo), NH(Ca-C¹⁰ espirocicloalquilo), N(C³-Ca cicloalquilo)² , NH(CH²)^1-3(arilo), N((CH²)^1-3(arilo))², un resto amina cíclica que tiene la estructura

b _s N0 _{\V , J(CC H 2)o-4}

un resto aromático o heteroaromático de 6 miembros o un resto heteroaromático de 5 miembros;

en donde

un resto alquilo, cicloalquilo, bicicloalquilo, espirocicloalquilo, amina cíclica, aromática o heteroaromática de 6 miembros o heteroaromática de 5 miembros se sustituye opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados de OH, halo, CN, (C¹-C³ alquilo), O(C¹-C³ alquilo), C(=O)(Me), SO²(C¹-C³ alquilo), C(=O)(Et), NH² , NH(Me), N(Me)², NH(Et), N(Et)² y N(C1-C3 alquilo)² ; y

un resto cicloalquilo, bicicloalquilo, espirocicloalquilo o amina cíclica puede tener un grupo CH² reemplazado por O, S, NH, ⁿ (^{c 1}-C³ alquilo) o N(Boc);

R5 es, independientemente en cada caso, O, S o NRa;

Ra es H o C¹-C³ alquilo;

X1 es, independientemente en cada caso, CR2 o N; y

X2 es, independientemente en cada caso, CR3 o N.

2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde R4 es OH, NH(CHMe²), NHCH²CaH⁵, NHMe, NHCH2CH2OH,

3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una estructura representada por la Fórmula (la):

4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 3, en donde R4 es OH, NH(CHMe²), NHCH²C⁶H⁵, NHMe, NHCH2CH2OH,

5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 4, en donde R1 es n-Buü, y el subíndice x es 1.

6. Un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 3, que se selecciona del grupo que consiste en:

7. Un conjugado que comprende un compuesto de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que se conjuga con un anticuerpo.

8. Un derivado de un compuesto de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el compuesto está unido de manera covalente a un resto poli(etilenglicol) con un tamaño de 2 kDa a 40 kDa.

9. Un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1o 6, en donde el compuesto es

10. Un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 6, en donde el compuesto es