JP2023536945A - 動力学的に作用するアジュバントアンサンブル - Google Patents

Abstract

本発明は、多様な免疫細胞活性化を誘導する２つ以上の免疫活性化物質を組み合わせたアジュバントアンサンブルに関し、免疫活性化メカニズムにおいて互いに異なるシグナル伝達系を有している免疫活性化物質を組み合わせるときに、その処理順序および時間間隔を調節することによって、最終的に現れるシナジー免疫活性化反応を最大化できる新しい概念の動力学的に作用するアジュバントアンサンブルおよびその用途に関する。動力学的作用は、第２の免疫活性化物質が免疫細胞内の内因性要因（酵素、酸化還元電位、ＧＳＨおよびｐＨ）および外因性要因（酸化還元、ｐＨ、温度、ｐｈｏｔｏ／光、磁性、超音波および電気的応答）に反応して、結合部位の化学的結合が切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）され、活性化部位が露出して動力学的に機能が回復したり、２つ以上の免疫活性化物質を伝達体から一定の時間間隔をおいて順次に放出されて免疫活性を誘導することを特徴とする。【選択図】図３

Description

本発明は、作用時間が動力学的に調節される、免疫細胞を活性化させる２つ以上の免疫活性化物質を含む新規のアジュバントアンサンブルに関し、より詳細には、注入後に、第１の免疫活性化物質が受容体と最初に結合して免疫反応を一次的に誘導し、その後、第２の免疫活性化物質が受容体と結合して順次に（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ）免疫反応が誘導されるように設計されたアジュバントアンサンブルに関する。

免疫反応は、活性化した免疫細胞が外来性および内因性物質、すなわち、抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）に対して起こす一連の反応であり、細菌、ウイルスなどを含む微生物、生体の異物などが生体内に流入すると、免疫細胞がこれを認識し、活性化して、サイトカインなどの因子を分泌して、炎症反応を誘発する。最近、感染初期に非特異的に作用する先天性免疫反応段階での機序に関する研究が活発に行われており、そのうち、トール様受容体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＬＲ）は、炎症初期の病原体を認識できる受容体であり、病原体の原形質膜構成物、核酸構成物などを認識して免疫反応を誘導することが知られており、これを用いて、免疫細胞を活性化させるための多様なトール様受容体リガンド（Ｔｏｌｌ Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ；ＴＬＲ ｌｉｇａｎｄ）に関する研究が活発に行われている（米国特許公開２０１２－０２９４８８５号）。

トール様受容体アゴニストは、エンドソーム内のトール様受容体のアゴニストであり、体液性免疫だけでなく、細胞性免疫をも効果的に誘導することが知られている。しかしながら、このような多機能性トール様受容体アゴニストは、その分子構造によって水溶液への分散が困難である。また、ＤＭＳＯ、メタノールなどのような特殊有機溶媒にのみ溶解し、一般的に使用されている有機溶剤には溶解しないので、多様な剤形の免疫活性化薬剤を製造するのに限界がある。したがって、多様な界面活性剤を混合したクリーム形態の剤形（例えば、Ａｌｄａｒａ ｃｒｅａｍなど）に商用化されている。一部の研究では、このような問題点を克服するために、塩（ｓａｌｔ）の形態で製造し、水溶液に溶解させることができるようにしたが、塩の形態で製造されたトール様受容体アゴニストは、体内で血管に吸収されて、血管内の免疫反応（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を誘導することによって、多くの副作用（例えば、サイトカインストーム（ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔｏｒｍ）、様々な非特異的過敏免疫反応など）を誘発するので、使用が容易でないのが現状である。また、このような副作用の問題に起因して、実質的に治療に使用するためには、有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）より少ない濃度を処理しなければならないので、効能低下の要因となる。一部の製薬企業では、このような問題点を克服するために、親油性特性を示す脂質を導入したり、巨大なサイズを有する高分子鎖に直接化学的に結合させることによって、血管に直接吸収されるのを防止するための試みも行われている。しかしながら、このような方法によって製造されたトール様受容体アゴニストは、その活性部位が依然として外部に露出しているので、体内で非特異的免疫反応を誘導することによって、毒性を誘発しうる可能性を依然として有している。

このようなトール様受容体アゴニストを含んで、多様な先天性免疫誘導物質は、混合して使用する場合、先天性免疫反応の効果が増大することが持続的に報告されている。特に、免疫活性化機序で互いに異なるシグナル伝達系を有しているトール様受容体リガンドは、単独で使用したときより、２つ以上組み合わせて使用するとき、免疫細胞活性化能力が２０～５０倍以上増加することが報告されている。しかしながら、互いに異なるシグナル伝達系を有している先天性免疫誘導物質は、その機序が互いに異なっているので、処理する順序および／または処理の時間間隔によって免疫活性化反応の効果が非常に異なっている。しかしながら、複数個の先天性免疫誘導物質、すなわち、アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）を体内に一定の時間間隔で個別投与することは、非実用的だけでなく、個別投与された複数個のアジュバントが同一免疫細胞を刺激して免疫活性化効果を増加させる確率が、非常に低いので、実質的に医療分野において、互いに異なる時間に互いに異なる種類の先天性免疫誘導物質を投与すること（ａｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は容易でない。

したがって、複数個のアジュバントを同時に投与するか（ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、体内に注入されたそれぞれのアジュバントが一定の時間間隔でそれぞれの受容体と結合して免疫活性化のための時間間隔（ｔｉｍｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ）を最適化することによって、免疫活性化効果を最大化できるアジュバントアンサンブルが開発されれば、これを用いることによってワクチンの効果を顕著に向上させることができるので、次世代ワクチン市場において非常に大きな波及効果をもたらすことが期待される。

本発明は、前述のような従来技術上の問題点を解決するためになされたものであって、互いに異なるアジュバント、例えば、トール様受容体アゴニスト、サポニン、抗ウイルス性ペプチド、インフラマソームインデューサ（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ｉｎｄｕｃｅｒ）、ＮＯＤリガンド（ＮＯＤ ｌｉｇａｎｄ）、ＣＤＳリガンド（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ＤＮＡ ｓｅｎｓｏｒ ｌｉｇａｎｄ）、ＳＴＩＮＧ（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇｅｎｅｓ）リガンドなどが定められた順序と一定の時間間隔で作用することができるように設計された動力学的作用アジュバントアンサンブル、その用途などを提供することをその目的とする。

しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は、下記の記載から当該技術分野における通常の技術者が明確に理解することができる。

本発明は、動力学的に作用するアジュバントアンサンブル組成物であって、前記組成物は、２種以上のアジュバントを含んでおり、第１アジュバントは、免疫細胞受容体と最初に結合して一次免疫反応を誘導することであり、第２アジュバントは、活性化部位に切断可能なリンカー（ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）が結合している結合体で順次に免疫細胞受容体と結合して二次免疫反応を誘導することを特徴とするアジュバントアンサンブル組成物を提供する。

本発明の一具体例において、前記動力学的作用は、第２アジュバントの活性化部位に切断可能なリンカーが結合されていて、不活性化（ｉｎａｃｔｉｖｅ）状態が維持され、２～１２時間以内に、より好ましくは、３～９時間以内に活性化部位をブロッキングしていた切断可能なリンカーが切断されて、免疫活性化物質の活性が時間的に遅延して現れることを特徴とする。本発明のアジュバントアンサンブル組成物は、２種以上の免疫活性化物質が同時に投与されたとき、一定の時間間隔をおいて作用する動力学的アンサンブルを提供することによって、免疫学的反応のシナジー効果を最大化することができる。前記動力学的アンサンブルは、分子スケール（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｃａｌｅ）および／またはマクロスケール（ｍａｃｒｏ ｓｃａｌｅ）で作用することができる。

本発明の他の具体例において、前記切断可能なリンカーは、好ましくは、ジスルフィド（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）、カルバメート（ｃａｒｂａｍａｔｅ）、ヒドラジン（ｈｙｄｒａｚｉｎｅ）、エステル（ｅｓｔｅｒ）、ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｅ）、アミド（ａｍｉｄｅ）、ヒドラゾン（ｈｙｄｒａｚｏｎｅ）、チオエーテル（ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ）、ホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）、チオケタール（ｔｈｉｏｋｅｔａｌ）およびこれらの組み合わせからなる群から選ばれるいずれか１つ以上の結合を含んでいることを特徴とする。しかしながら、生体の内因性要因（酵素、酸化還元電位、ＧＳＨ、ｐＨなど）および／または外因性要因（酸化還元、ｐＨ、温度、ｐｈｏｔｏ／光、磁性、超音波、電気的応答性（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）など）によって結合が切断され得る形態であれば、これに限定されない。

本発明のさらに他の具体例において、前記切断可能なリンカーは、酵素、ｐＨ、酸化還元電位（ｒｅｄｏｘ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、温度、超音波、磁性、および光源からなる群から選ばれるいずれか１つ以上の要因によって結合部位の化学的結合が切断されることを特徴とする。

本発明のさらに他の具体例において、前記切断可能なリンカーは、両方の末端または一方の末端にエチレンオキシド（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）またはエチレングリコール（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）などのアルキル誘導体をさらに含むことによって、結合体の水溶液における溶解度および柔軟性を高めることを特徴とする。

本発明のさらに他の具体例において、前記切断可能なリンカーの末端には、コレステロール、脂質、タンパク質、アミノ酸、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれるいずれか１つ以上の物質が結合していることを特徴とし、前記物質は、 第２アジュバントの活性化部分をブロッキングする役割をし、親水または親油グループを有している多様な物質でありうる。

本発明のさらに他の具体例において、前記第２アジュバントは、ナノリポソーム、ナノエマルジョン、ナノミセル、ヒドロゲル、スキャフォールド、固形ナノ粒子および高分子ナノ粒子からなる群から選ばれるいずれか１つ以上の薬物伝達体にローディングされていることを特徴とする。前記ローディングは、結合と関係なく、単純に内包されている形態であってもよく、またはナノ粒子構造の間に挟まれた形態であるか、結合している形態であってもよいが、本発明のｍＲＮＡ抗原と免疫活性化物質を含んでいる形態であれば、これに限定されない。

本発明のさらに他の具体例において、前記薬物伝達体は、第１アジュバントをさらに含むことを特徴とする。

本発明のさらに他の具体例において、前記薬物伝達体は、免疫細胞の表面、またはエンドソームまたはサイトゾル内に存在する受容体と反応するリガンドをさらに含むことを特徴とする。

本発明のさらに他の具体例において、前記薬物伝達体は、トール様受容体アゴニスト、サポニン、抗ウイルス性ペプチド、インフラマソームインデューサ（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ｉｎｄｕｃｅｒ）、ＮＯＤリガンド（ＮＯＤ ｌｉｇａｎｄ）、ＣＤＳリガンド（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ＤＮＡ ｓｅｎｓｏｒ ｌｉｇａｎｄ）、ＳＴＩＮＧ（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇｅｎｅｓ）リガンド、病原菌の外壁成分、アラム（ａｌｕｍ）、脂質（ｌｉｐｉｄｓ）、これらの組み合わせおよびこれらの類似体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）からなる群から選ばれるいずれか１つ以上の免疫活性化物質をさらに含むことを特徴とする。

本発明のさらに他の具体例において、前記第２アジュバントは、好ましくは、トール様受容体アゴニスト（ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔ）であってもよく、より好ましくは、トール様受容体１アゴニスト、トール様受容体２アゴニスト、トール様受容体３アゴニスト、トール様受容体４アゴニスト、トール様受容体５アゴニスト、トール様受容体６アゴニスト、トール様受容体７または８アゴニスト、およびトール様受容体９アゴニストからなる群から選ばれるいずれか１つ以上であることを特徴とする。

本発明のさらに他の具体例において、前記第１アジュバントは、トール様受容体アゴニスト、サポニン、抗ウイルス性ペプチド、インフラマソームインデューサ、ＮＯＤリガンド、ＣＤＳリガンド、ＳＴＩＮＧリガンド、病原菌の外壁成分、アラム、脂質、これらの組み合わせおよびこれらの類似体からなる群から選ばれるいずれか１つ以上の免疫活性化物質でありうる。

本発明のさらに他の具体例において、前記免疫細胞は、抗原提示細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ ｃｅｌｌ）、Ｔ細胞、Ｂ細胞、制御性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ）、ＭＤＳＣ（ｍｙｅｏｌｏｉｄ ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｃｅｌｌｓ）、およびＭ２マクロファージからなる群から選ばれるいずれか１つ以上であることを特徴とする。

本発明のさらに他の具体例において、前記薬物伝達体は、２種以上のアジュバントが順次に放出（ｒｅｌｅａｓｅ）されるように設計されたアンサンブルであってもよく、リポソーム、ミセル、エマルジョン、自己組織化粒子、高分子ナノ粒子など２つ以上の層状構造（ｌａｙｅｒｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を有するコア－セル（Ｃｏｒｅ－ｓｈｅｌｌ）を含む構造であり、一次的に速く放出されるアジュバント（Ｆｉｒｓｔｌｙ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｐａｙｌｏａｄ）と二次的に放出されるアジュバント（Ｓｅｃｏｎｄｌｙ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｐａｙｌｏａｄ）を含んでもよい。

本発明のさらに他の具体例において、前記薬物伝達体は、刺激応答性（ｓｔｉｍｕｌｉ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）ブロックを含んでもよいし、前記刺激は、細胞内の内因性要因（酵素、酸化還元電位、ＧＳＨ、ｐＨ、細胞内タンパク質など）、外因性要因（酸化還元、ｐＨ、温度、ｐｈｏｔｏ／光、磁性、超音波、電気的応答（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）など）および生体内の多様な生理的環境／免疫因子などを含んでもよい。また、前記刺激応答性ブロックは、２種以上の刺激応答性ブロックを含んでもよいし、互いに異なる刺激によって順次に反応することができる。または、刺激の強度によって順次に反応することもできる。

また、本発明は、前記アジュバントアンサンブル組成物を有効成分として含む、感染性疾患（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、がん（ｃａｎｃｅｒ）、代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）または希少疾患（ｒａｒｅ ｄｉｓｅａｓｅ）の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

本発明の一具体例において、前記薬学的組成物は、抗原、化学抗がん剤、または免疫チェックポイント阻害剤などをさらに含んでもよい。

本発明の他の具体例において、前記抗原は、タンパク質、組換えタンパク質、糖タンパク質、遺伝子、ペプチド、多糖類、脂質多糖類、ポリヌクレオチド、細胞、細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅ）、バクテリアおよびウイルスからなる群から選ばれる１つ以上であることを特徴とする。

本発明のさらに他の具体例において、前記薬学的組成物は、がんの増殖、転移、再発または抗がん治療療法に対する耐性を抑制することを特徴とする。

また、本発明は、前記アジュバントアンサンブル組成物を有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む、感染性疾患（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、がん（ｃａｎｃｅｒ）、代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）または希少疾患（ｒａｒｅ ｄｉｓｅａｓｅ）の予防または治療方法を提供する。

また、本発明は、前記アジュバントアンサンブル組成物を有効成分として含む組成物の感染性疾患（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、がん（ｃａｎｃｅｒ）、代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）または希少疾患（ｒａｒｅ ｄｉｓｅａｓｅ）の予防または治療用途を提供する。

また、本発明は、前記アジュバントアンサンブル組成物の感染性疾患（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、がん（ｃａｎｃｅｒ）、代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）または希少疾患（ｒａｒｅ ｄｉｓｅａｓｅ）の予防または治療に用いられる薬剤を生産するための用途を提供する。

本発明においてアジュバントの作用時間が動力学的に調節された新規アジュバントには、従来、２つの物質を同時に投与することに比べて、シナジー効果を増大させるだけでなく、アジュバントの潜在的毒性問題を最小化することができる。特に、オーダーメード型で選ばれる２種以上の免疫活性化物質を組み合わせたアンサンブルは、向上した免疫増強効果によって抗がんワクチンおよび感染性疾患など多様な疾患の効果的な予防および治療剤として幅広く活用され得ることが期待される。

図１は、マクロスケールにおける動力学的免疫機能制御のためのアジュバントアンサンブルの概念図を示した概念図である。 図２は、分子スケールにおける動力学的免疫機能制御のためのアジュバント（トール様受容体７／８アゴニスト）の一例を示す図である。上段は、動力学的に作動するトール様受容体７／８アゴニストの概念図であり、下段は、切断可能なリンカーの特性を示す図である。 図３は、動力学的制御が可能なコレステロール－トール様受容体７または８作用自己免疫細胞（樹状細胞）に作用後、従来の免疫機能調節剤と相異する作用をもたらすメカニズムを図式化した図である。 図４は、本発明の一実施例によるコレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームの細胞内移入をＩＬ－１２の量で確認した結果を示す図である。 図５は、本発明の一実施例による抗原提示細胞においてＧＩＬＴを発現するかをＲＴ－ＰＣＲで確認した結果を示す図である。 図６は、本発明の一実施例によるコレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームがＧＩＬＴによって化学的結合が切断されるかどうかを確認した結果を示す図である。 図７は、本発明の一実施例によるコレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームの免疫細胞調節を確認した結果を示す図である。 図８は、本発明の一実施例によるコレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームの樹状細胞の成熟度に及ぼす影響を確認した結果を示す図である。 図９は、本発明の一実施例によるコレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームの持続的な免疫反応誘導効果を確認した結果を示す図である。 図１０は、本発明の一実施例によるコレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームのＣＤ４^＋ Ｔ細胞のＴｈ１反応への分化誘導効果を確認した結果を示す図である。 図１１は、本発明の一実施例によるトール様受容体３アゴニストとトール様受容体７または８アゴニストとの複合投与効果をＩＬ－１２の分泌量で確認した結果を示す図である。 図１２は、本発明の一実施例によるトール様受容体４アゴニストとトール様受容体７または８アゴニストとの複合投与効果をＩＬ－１２の分泌量で確認した結果を示す図である。 図１３は、本発明の一実施例によるアジュバントアンサンブルによる免疫活性化効能をＴＮＦ－αとＩＬ－６の分泌量で確認した結果を示す図である。 図１４は、本発明の一実施例によるアジュバントアンサンブルによる細胞の成熟度を共刺激分子の発現量で確認した結果を示す図である。 図１５は、本発明の一実施例によるアジュバントアンサンブルによる持続的免疫反応誘導効果を確認した結果を示す図である。 図１６は、本発明の一実施例によるアジュバント複合体の安定化程度をＥＭＳＡで確認した結果を示す図である。 図１７は、本発明の一実施例によるアジュバント複合体の細胞内での安定性を確認した結果を示す図である。 図１８は、本発明の一実施例によるアジュバント複合体の持続的な免疫反応誘導効能をｉｎ ｖｉｖｏで確認した結果を示す図である。 図１９は、本発明の一実施例によるアジュバント複合体の抗腫瘍効果をｉｎ ｖｉｖｏで確認した結果を示す図である。 図２０は、本発明の一実施例によるアジュバント複合体による腫瘍組織およびリンパ節に集めた免疫細胞を分析した結果を示す図である。 図２１は、本発明の一実施例によるアジュバント複合体による腫瘍組織およびリンパ節に集めた免疫細胞を分析した結果を示す図である。 図２２は、本発明の一実施例によるアジュバント複合体による腫瘍組織およびリンパ節に集めた免疫細胞を分析した結果を示す図である。 図２３は、本発明の一実施例によるアジュバント複合体による腫瘍組織およびリンパ節に集めた免疫細胞を分析した結果を示す図である。 図２４は、本発明の一実施例によるアジュバント複合体によるリンパ節における免疫反応誘導効果をサイトカイン分泌能で確認した結果を示す図である。 図２５は、本発明の一実施例によるアジュバント複合体による腫瘍組織における免疫反応誘導効果をサイトカイン分泌能で確認した結果を示す図である。 図２６は、本発明の一実施例によるＩＬ－１２がアジュバント複合体の免疫活性化効能に及ぼす影響を確認した結果を示す図である。 図２７は、本発明の一実施例によるアジュバント複合体の局所接種を介した転移がんに対する抗腫瘍効能を確認した結果を示す図である。 図２８は、本発明の一実施例によるアジュバント複合体の局所接種を介した肺転移抑制効果を確認した結果を示す図である。 図２９は、本発明の一実施例によるアジュバント複合体の局所接種を介した同所腫瘍に対する抗腫瘍効能を確認した結果を示す図である。 図３０は、本発明の一実施例によるアジュバント複合体と免疫チェックポイント阻害剤療法の組み合わせを介した抗腫瘍効能を確認した結果を示す図である。 図３１は、本発明の一実施例によるアジュバント複合体と化学療法の組み合わせを介した抗腫瘍効能を確認した結果を示す図である。

［発明を実施するための最良の形態］
本発明者らは、２種以上のアジュバントを複合的に使用するとき、アジュバントのシナジー効果には、順序と時間差が重要な要因として作用することを確認し、複合アジュバントを使用して免疫活性化を誘導するとき、その効果を最大限増加させるために、それぞれのアジュバントの活性化時点を調節できる動力学的制御（ｋｉｎｅｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）が可能なアジュバントアンサンブルシステムについて鋭意研究した結果、第１アジュバントが一次的に作動し、第２アジュバントは、活性化部位に切断可能なリンカーを連結して一時的に活性が阻害された状態で維持され、体内投与後、目標とする組織、または細胞に到達した後、すなわち、２～１２時間以内にリンカーが切断されて、二次的にアジュバントの活性が現れる動力学的制御が可能なアジュバントアンサンブル組成物を発明した。

図１および図２に示されたように、本発明のアジュバントアンサンブル組成物は、分子スケール（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｃａｌｅ）とマクロスケール（ｍａｃｒｏ ｓｃａｌｅ）の両方において調節が可能であり、第２アジュバントの活性化部位に切断可能なリンカーが結合されており、不活性化（ｉｎａｃｔｉｖｅ）状態が維持され、２～１２時間以内に、より好ましくは、３～９時間以内に活性化部位をブロッキングしていた切断可能なリンカーが切断されて、免疫活性化物質の活性が時間的に遅延して現れるシステムであり、免疫学的反応のシナジー効果を最大化することができる。

また、図３に示されたように、本発明のアジュバントアンサンブル組成物は、樹状細胞を枯渇状態（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）、すなわち、免疫反応を誘導しない状態でなく、成熟状態（ｍａｔｕｒｉｎｇ）、すなわち、免疫反応を誘導できる状態に長期間維持させて、持続的な免疫反応を誘導することができる。また、リンパ節でナイーブＴ細胞に出会うと、抗原を提示する過程でＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ作用と共に、強い免疫活性化誘導を通じて、ＩＬ－１２のようなＴｈ１免疫反応誘導サイトカインを効果的に誘導することができる。

本明細書において、「アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）」とは、免疫活性化物質（ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）であり、免疫系の正常な免疫機能を活性化させたり、誘導したり、回復させる役割をする物質を総称する。前記アジュバントとは、免疫反応を向上させるために、抗原と共に使用される物質を意味し、抗原と共に使用することによって抗体の生成を増加させ、体液性免疫および／または細胞性免疫を増加させることができる。前記免疫活性化物質としては、好ましくは、トール様受容体アゴニスト（ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔ）、サポニン、抗ウイルス性ペプチド、インフラマソームインデューサ（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ｉｎｄｕｃｅｒ）、ＮＯＤリガンド（ＮＯＤ ｌｉｇａｎｄ）、ＣＤＳリガンド（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ＤＮＡ ｓｅｎｓｏｒ ｌｉｇａｎｄ）、ＳＴＩＮＧ（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇｅｎｅｓ）リガンド、エマルジョン（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）、アラム（ａｌｕｍ）、不完全フロイントアジュバント、フロイントアジュバント、またはこれらの組み合わせを含んでもよいし、より好ましくは、トール様受容体アゴニストを含んでもよい。

本明細書において、「トール様受容体アゴニスト（ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔ）」とは、先天性免疫に関与する膜タンパク質であるトール様受容体に直接または間接作用するリガンドであり、内因性または外因性リガンドの生成によりシグナル伝達経路を介したシグナル伝達反応を引き起こすことができる成分を意味し得る。本明細書において、トール様受容体アゴニストは、天然トール様受容体アゴニストまたは合成トール様受容体アゴニストであってもよく、トール様受容体１アゴニスト、トール様受容体２アゴニスト、トール様受容体３アゴニスト、トール様受容体４アゴニスト、トール様受容体５アゴニスト、トール様受容体６アゴニスト、トール様受容体７または８アゴニスト、トール様受容体９アゴニストなどであってもよい。

前記トール様受容体１アゴニストは、ＴＬＲ－１を介してシグナル伝達反応を誘導できるリガンドを意味し、一例として、トリアシル化脂質ペプチド（ＬＰ）；フェノール可溶性モデュリン（ｍｏｄｕｌｉｎ）；マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質ペプチド；Ｓ－（２，３－ビス（パルミトイルオキシ）－（２－ＲＳ）－プロピル）－Ｎ－パルミトイル－（Ｒ）－Ｃｙｓ－（Ｓ）－Ｓｅｒ－（Ｓ）－Ｌｙｓ（４）－ＯＨ；ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅrｉ）の脂質ペプチド；ＯｓｐＡ脂質ペプチドのアセチル化アミノ末端を模倣するトリヒドロクロリド（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）脂質ペプチドなどであってもよいが、これに限定されない。

前記トール様受容体２アゴニストは、ＴＬＲ－２を介してシグナル伝達反応を誘導できるリガンドを意味し、一例として、ペプチドグリカン（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ）、ザイモサン（ｚｙｍｏｓａｎ）、ＨＳＰ７０、ＨＭＧＢ１、ＨＡ、ｂａｍ３Ｃｙｓ－Ｌｉｐなどであってもよいが、これに限定されない。

前記トール様受容体３アゴニストは、ＴＬＲ－３を介してシグナル伝達反応を誘導できるリガンドを意味し、一例として、ポリＩＣ系としてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、Ｐｏｌｙ（ＩＣＬＣ）、Ｐｏｌｙ（ＩＣ１２Ｕ）、ａｍｐｌｉｇｅｎなどであってもよいが、これに限定されない。

前記トール様受容体４アゴニストは、ＴＬＲ－４を介してシグナル伝達反応を誘導できるリガンドを意味し、一例として、シゲラ・フレキシネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）の外膜タンパク質製造物、ＡＧＰ、ＣＲＸ－５２７、ＭＰＬＡ、ＰＨＡＤ、３Ｄ－ＰＨＡＤ、ＧＬＡ、ＬＰＳなどであってもよいが、これに限定されない。

前記トール様受容体５アゴニストは、ＴＬＲ－５を介してシグナル伝達反応を誘導できるリガンドを意味し、一例として、フラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）などであってもよいが、これに限定されない。

前記トール様受容体６アゴニストは、ＴＬＲ－６を介してシグナル伝達反応を誘導できるリガンドを意味し、一例として、ジアシルリポペプチド（Ｄｉａｃｙｌ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ）、リポタイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ）などであってもよいが、これに限定されない。

前記トール様受容体７または８アゴニストは、ＴＬＲ－７または８を介してシグナル伝達反応を誘導できるリガンドを意味し、一例として、イミダゾキノリン系アゴニスト（ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｏｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｇｏｎｉｓｔ）、ヒドロキシアデニン系アゴニスト（８－ｈｙｄｒｏｘｙａｄｅｎｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｇｏｎｉｓｔ）、プテリドン系アゴニスト（ｐｔｅｒｉｄｏｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｇｏｎｉｓｔ）、アミノピリミジン系アゴニスト（２－ａｍｉｎｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｇｏｎｉｓｔ）、ベンゾアゼピン系アゴニスト（ｂｅｎｚｏａｚｅｐｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｇｏｎｉｓｔ）、チアオキソグアノシン系アゴニスト（７－ｔｈｉａ－８－ｏｘｏｇｕａｎｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｇｏｎｉｓｔ）などであってもよく、前記イミダゾキノリン系化合物は、ＷＯ２０１８ １９６８２３、ＷＯ２０１１ ０４９６７７、ＷＯ２０１１ ０２７０２２、ＷＯ２０１７ １０２６５２、ＷＯ２０１９ ０４０４９１などに記述された類型の化合物または製薬上許容可能な塩を含むが、これに限定されない。また、前記ヒドロキシアデニン系化合物は、ＷＯ２０１２ ０８０７３０、ＷＯ２０１３ ０６８４３８、ＷＯ２０１９ ０３６０２３、ＷＯ２０１９ ０３５９６９、ＷＯ２０１９ ０３５９７０、ＷＯ２０１９ ０３５９７１、ＷＯ２０１９ ０３５９６８、ＣＮ １０８９４８０１６、ＵＳ ２０１４ ８８４６６９７、ＷＯ２０１６ ０２３５１１、ＷＯ２０１７ １３３６８３、ＷＯ２０１７ １３３６８６、ＷＯ２０１７ １３３６８４、ＷＯ２０１７ １３３６８７、ＷＯ２０１７ ０７６３４６、ＷＯ２０１８ ２１０２９８、ＷＯ２０１８ ０９５４２６、ＷＯ２０１８ ０６８５９３、ＷＯ２０１８ ０７８１４９、ＷＯ２０１８ ０４１７６３などに記述された類型の化合物または製薬上許容可能な塩を含むが、これに限定されない。前記プテリドン系化合物は、ＵＳ ２０１０ ０１４３３０１、ＷＯ２０１６ ００７７６５、ＷＯ２０１６ ０４４１８２、ＷＯ２０１７ ０３５２３０、ＷＯ２０１７ ２１９９３１、ＷＯ２０１１ ０５７１４８、ＣＮ １０８７ ９４４８６などに記述された類型の化合物または製薬上許容可能な塩を含むが、これに限定されない。前記アミノピリミジン系化合物は、ＷＯ２０１０ １３３８８５、ＷＯ２０１２０６６３３５、ＷＯ２０１２ ０６６３３６、ＷＯ２０１２ ０６７２６８、ＷＯ２０１３ １７２４７９、ＷＯ２０１２ １３６８３４、ＷＯ２０１４ ０５３５１６、ＷＯ２０１４ ０５３５９５、ＵＳ ２０１８ ０２１５７２０、ＷＯ２０１２ １５６４９８、ＷＯ２０１４ ０７６２２１、ＷＯ２０１６ １４１０９２、ＷＯ２０１８ ０４５１４４、ＷＯ２０１５ ０１４８１５、ＷＯ２０１８ ２３３６４８、ＷＯ２０１４ ２０７０８２、ＷＯ２０１４ ０５６５９３、ＷＯ２０１８ ００２３１９、ＷＯ２０１３ １１７６１５などに記述された類型の化合物または製薬上許容可能な塩を含むが、これに限定されない。前記ベンゾアゼピン系化合物は、ＷＯ２００７ ０２４６１２、ＷＯ２０１０ ０１４９１３、ＷＯ２０１０ ０５４２１５、ＷＯ２０１１ ０２２５０８、ＷＯ２０１１ ０２２５０９、ＷＯ２０１２ ０９７１７７、ＷＯ２０１２ ０９７１７３、ＷＯ２０１６ ０９６７７８、ＷＯ２０１６ １４２２５０、ＷＯ２０１７ ２０２７０４、ＷＯ２０１７ ２０２７０３、ＷＯ２０１７ ２１６０５４、ＷＯ２０１７ ０４６１１２、ＷＯ２０１７ １９７６２４などに記述された類型の化合物または製薬上許容可能な塩を含むが、これに限定されない。前記チアオキソグアノシン系化合物は、ＷＯ２０１６ １８０６９１、ＷＯ２０１６ ０５５５５３、ＷＯ２０１６ １８０７４３、ＷＯ２０１６ ０９１６９８などに記述された類型の化合物または製薬上許容可能な塩を含むが、これに限定されない。その他にも、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３５５６３、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２８２６４、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２０４９９、ＷＯ２０１５ ０２３５９８、ＰＣＴ／ＵＳ ２０１５／０３９７７６などに記述されたトール様受容体７または８化合物または製薬上許容可能な塩を含んでもよい。また、イミキモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）、レシキモド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）、ダクトリシブ（Ｄａｃｔｏｌｉｓｉｂ）、ガーディキモド（Ｇａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ）、スマニロール（Ｓｕｍａｎｉｒｏｌｅ）、モトリモド（Ｍｏｔｏｌｉｍｏｄ）、ベサトリモド（ｖｅｓａｔｏｌｉｍｏｄ）、ロキソリビン（ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）、ＳＭ３６０３２０、ＣＬ２６４、３Ｍ－００３、ＩＭＤＱ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ５４などであってもよいが、これに限定されず、当業界に従事する者が容易に推測して使用できるトール様受容体７または８アゴニストの場合を全て含む。

前記トール様受容体９アゴニストは、ＴＬＲ－９を介してシグナル伝達反応を誘導できるリガンドを意味し、一例として、免疫刺激性オリゴヌクレオチドなどであってもよく、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１つ以上のＣｐＧモチーフを含んでもよいが、これに限定されない。

本明細書において、「サポニン（ｓａｐｏｎｉｎ）」とは、両親媒性配糖体であり、界面活性剤として作用する。一例として、ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ７、ＱＳ１７、β－エスシン、ジギトニンなどであってもよいが、これに限定されない。

本明細書において、「抗ウイルス性ペプチド（ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）」とは、抗ウイルス効果を示すペプチドを総称し、一例として、ケイエルケイ（ＫＬＫ）などであってもよいが、これに限定されない。

本明細書において、「インフラマソームインデューサ（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ｉｎｄｕｃｅｒ）」とは、真核細胞の細胞質内で危険信号を認識し活性化するタンパク質複合体であるインフラマソーム（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）を誘導する物質を総称し、一例として、ＴＤＢ（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ－６，６－ｄｉｂｅｈｅｎａｔｅ）などであってもよいが、これに限定されない。

本明細書において、「ＮＯＤリガンド（ＮＯＤ ｌｉｇａｎｄ）」とは、Ｎｏｄ－ｌｉｋｅ受容体を活性化させるリガンドを総称し、一例として、Ｍ－ＴｒｉＬＹＳ、Ｎ－グリコシル化ムラミルジペプチド（ｇｌｙｃｏｌｙｌａｔｅｄ ｍｕｒａｍｙｌｄｉｐｅｐｔｉｄ）などであってもよいが、これに限定されない。

本明細書において、「ＣＤＳリガンド（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ＤＮＡ ｓｅｎｓｏｒ ｌｉｇａｎｄ）」とは、ＤＮＡセンサーであるｃＧＡＳを活性化させるリガンドを総称し、一例として、Ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）などであってもよいが、これに限定されない。

本明細書において、「ＳＴＩＮＧリガンド（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇｅｎｅｓ ｌｉｇａｎｄ）」とは、免疫細胞ががんを探知するのに使用するセンサーであるＳＴＩＮＧを活性化させるリガンドを総称し、一例として、ｃＧＡＭＰ、ｄｉ－ＡＭＰ、ｄｉ－ＧＭＰなどであってもよいが、これに限定されない。

本明細書において、「コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）」とは、脂質（ｌｉｐｉｄ）の一種であり、疎水性性質を有するステロイド系の有機物質を総称し、前記コレステロールは、コレステロール構造を基盤とする多様な類似体、コレステロールの一部を化学的に変化させて獲得できる化合物を全て含んでもよい。好ましくは、胆汁酸（コール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、ケノデオキシコール酸）、ビタミンＤ、ステロイドホルモン（テストステロン、エストラジオール、コルチゾール、アルドステロン、プレドニゾロン、プレドニゾン）などを含んでもよいが、これに限定されない。また、前記コレステロールは、トール様受容体７または８アゴニストを多様な形態のナノ粒子の表面および内部に位置するように助ける物質であり、これと類似の機能をする脂質物質、例えば、リン脂質のような天然脂質（ｎａｔｕｒｅａｌ ｌｉｐｉｄ）、合成脂質（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｐｉｄ）などに代替されることもでき、トール様受容体７または８アゴニストの活性化部位に結合して不活性化状態に作ると共に、トール様受容体７または８アゴニストが体内で血管に吸収されないようにする用途であるから、公知の脂質の種類であれば、制限がない。

本明細書において、「切断可能なリンカー（ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）」とは、切断可能な結合を含んでおり、腫瘍微小環境、細胞内のエンドソームおよびリソソームの生理学的環境など体内の低ｐＨ、酵素、グルタチオンなどの条件；または外部の刺激、すなわち、温度、酸化還元電位、超音波、磁場、近赤外光などの特定刺激によって切断が起こり得るリンカーを総称し、好ましくは、カルバメート（ｃａｒｂａｍａｔｅ）、ジスルフィド（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）、エステル（ｅｓｔｅｒ）、ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｅ）などの結合を含んでいるリンカーを意味するか、切断可能な形態であれば、これに限定されない。切断可能なリンカーの一例として、酵素により切断可能なリンカーグループは、ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ ｖｉｒｕｓプロテアーゼ（ＴＥＶ）、トリプシン、トロンビン、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＫ、カスパーゼ１、マトリックスメタ炉プロテイナーゼ配列、ホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）、リン脂質、エステル、β－ガラクトース（ｂｅｔａ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ）などがあり、求核／塩基剤により切断可能なリンカーグループは、ジアルキルジアルコキシシラン、シアノエチル基、スルホン（ｓｕｌｆｏｎｅ）、エチレングリコリルジスクシネート（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌｙｌ ｄｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、２－Ｎ－アシルニトロベンゼンスルホンアミド（２－Ｎ－ａｃｙｌ ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）、ａ－チオフェニルエステル（ａ－ｔｈｉｏｐｈｅｎｙｌｅｓｔｅｒ）、不飽和ビニルスルフィド（ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｖｉｎｙｌ ｓｕｌｆｉｄｅ）、活性化後のスルホンアミド（ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ ａｆｔｅｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、マロン時アルデヒド（ＭＤＡ）－インドール誘導体、レブリノイルエステル（ｌｅｖｕｌｉｎｏｙｌ ｅｓｔｅｒ）、ヒドラゾン（ｈｙｄｒａｚｏｎｅ）、アシルヒドラゾン（ａｃｙｌｈｙｄｒａｚｏｎｅ）、アルキルチオエステル（ａｌｋｙｌ ｔｈｉｏｅｓｔｅｒ）などがある。また、還元剤により切断可能なリンカーグループは、ジスルフィド架橋、アゾ化合物などがあり、酸化剤により切断可能なリンカーグループは、隣接ジオール（ｖｉｃｉｎａｌ ｄｉｏｌｓ）、セレン化合物などがあり、有機金属又は金属触媒（ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃまたはｍｅｔａｌ ｃａｔａｌｙｓｔ）により切断可能なリンカーグループは、ジスルフィド架橋、アゾ化合物などがある。また、求電子／酸性剤により切断可能なリンカーグループは、パラメトキシベンジル誘導体（Ｐａｒａｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｙｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、ｔｅｒｔ－ブチルカルバメートアナログ（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｃａｒｂａｍａｔｅ ａｎａｌｏｇｕｅ）、ジアルキルシラン又はジアルコキシシラン（ｄｉａｌｋｙｌ ｏｒ ｄｉａｒｙｌ ｄｉａｌｋｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、オルトエステル（ｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒ）、アセタール（ａｃｅｔａｌ）、アコニチル（ａｃｏｎｉｔｙｌ）、ヒドラゾン（ｈｙｄｒａｚｏｎｅ）、ｂ－チオプロピオン酸（ｂ－ｔｈｉｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ホスホロアミダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、イミン（ｉｍｉｎｅ）、トリチル（ｔｒｉｔｙｌ）、ビニルエーテル（ｖｉｎｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ポリケタル（ｐｏｌｙｋｅｔａｌ）、アルキル２－（ジフェニルホスフィノ）ベンゾエート誘導体（ａｌｋｙｌ ２－（ｄｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｏ）ｂｅｎｚｏａｔｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）などがあり、光照射により切断可能なリンカーグループは、２－ニトロベンジル誘導体（２－Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）、フェナシルエステル（ｐｈｅｎａｃｙｌ ｅｓｔｅｒ）、８－キノリニルベンゼンスルホン酸（８－ｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌ ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、クマリン（ｃｏｕｍａｒｉｎ）、リン酸トリエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ）、ビス－アリールヒドラゾン（ｂｉｓ－ａｒｙｌｈｙｄｒａｚｏｎｅ）、ビマン ビチオプロピオン酸誘導体（ｂｉｍａｎｅ ｂｉ－ｔｈｉｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）などがある。

本明細書において、「併用投与」とは、トール様受容体７または８アゴニストとコレステロールの結合体と抗原、免疫チェックポイント阻害剤、免疫抗原補強剤、免疫活性化物質、化学抗がん剤など多様な物質と共に投与することであり、その種類および形態には制限がない。

本明細書において、「化学抗がん剤」とは、当業者に知られているがんの治療に使用されている化合物であれば、制限がなく、その一例として、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ、５－Ｆｌｕｒｏｕｒａｃｉｌ、Ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ、Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ、Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ、Ｈｙｄｒａｚｉｎｏｃｕｒｃｕｍｉｎ、Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ、Ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ、Ｒｉｆａｂｕｔｉｎ、Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ、Ｅｆａｖｉｒｅｎｚ、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、Ｔｈｅｏｐｈｙｌｉｎｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｏｔｏｘｉｎ Ａ、Ｚｏｌｅｄｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ、Ｔｒａｂｅｃｔｅｄｉｎ、Ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ、Ｄａｓａｔｉｎｉｂ、Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ、Ａｐａｔｉｎｉｂ、５、６－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｅｎｏｎｅ－４－ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、Ｓｉｌｉｂｉｎｉｎ、ＰＦ－０４１３６３０９、Ｔｒａｂｅｃｔｅｄｉｎ、Ｃａｒｌｕｍａｂ、ＢＬＺ９４５、ＰＬＸ３３９７、Ｅｍａｃｔｕｚｕｍａｂ、ＡＭＧ－８２０、ＩＭＣ－ＣＳ４、ＧＷ３５８０、ＰＬＸ６１３４、Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎ、Ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ、ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ、ａｓｐｉｒｉｎ、ｓａｌｉｃｙｌａｔｅｓ、Ｉｎｄｏｌｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ、ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ、Ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ、ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ、２ＭＥ２、１７－ＡＡＧ、Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ、Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ、Ｐｌｅｕｒｏｔｉｎ、１－ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌ、２－ｉｍｉｄａｚｏｌｙｌ ｄｉｓｓｕｌｐｈｉｄｅ、Ｔａｄａｌａｆｉｌ、Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ、Ｌ－ＡＭＥ、Ｎｉｔｒｏａｓｐｉｒｉｎ、Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ、ＮＯＨＡ、Ｂａｒｄｏｘｏｌｏｎｅ ｍｅｔｈｙｌ、Ｄ、Ｌ－１－ｍｅｔｈｙｌ－ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ、Ａｘｉｔｉｎｉｂ、Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｉｎ Ｂ、ＪＳＩ－１２４、Ａｎｔｉ ＩＬ－１７ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａｎｔｉ－ｇｌｙｃａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、Ａｎｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ、Ｔａｓｑｕｉｎｉｍｏｄ、Ｉｍａｔｉｎｉｂ、ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅなどがあるが、これに限定されない。

本明細書において、「免疫チェックポイント阻害剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」とは、人体が有している免疫細胞の免疫機能を活性化がん細胞と戦わせるがん治療方法を総称し、その一例としてａｎｔｉ－ＰＤ－１、ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１、ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４、ａｎｔｉ－ＫＩＲ、ａｎｔｉ－ＬＡＧ３、ａｎｔｉ－ＣＤ１３７、ａｎｔｉ－ＯＸ４０、ａｎｔｉ－ＣＤ２７６、ａｎｔｉ－ＣＤ２７、ａｎｔｉ－ＧＩＴＲ、ａｎｔｉ－ＴＩＭ３、ａｎｔｉ－４１ＢＢ、ａｎｔｉ－ＣＤ２２６、ａｎｔｉ－ＣＤ４０、ａｎｔｉ－ＣＤ７０、ａｎｔｉ－ＩＣＯＳ、ａｎｔｉ－ＣＤ４０Ｌ、ａｎｔｉ－ＢＴＬＡ、ａｎｔｉ－ＴＣＲ、ａｎｔｉ－ＴＩＧＩＴなどがあるが、これに限定されない。

本明細書において、「抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）」とは、体内で免疫反応を起こすすべての物質を総称し、好ましくは、病原菌（バクテリア、ウイルスなど）、化学物質、花粉、がん細胞、エビなどまたはこれらの一部ペプチドまたはタンパク質であり、より好ましくは、がん抗原ペプチドであるが、体内で免疫反応を起こすことができる物質であれば、これに限定されない。前記抗原は、好ましくは、タンパク質、組換えタンパク質、糖タンパク質、遺伝子、ペプチド、多糖類、脂質多糖類、ポリヌクレオチド、細胞、細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅ）、バクテリア、ウイルスなどであってもよく、より好ましくは、がん抗原ペプチドでありうる。前記糖タンパク質は、抗体、抗体の断片、構造タンパク質、調節タンパク質、転写因子、毒素タンパク質、ホルモン、ホルモン類似体、酵素、酵素の断片、輸送タンパク質、受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、受容体の断片、生体防御誘導物質、貯蔵タンパク質、移動タンパク質（ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、エックスプロイティブタンパク質（ｅｘｐｌｏｉｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、レポータタンパク質などでありうる。しかしながら、生体で抗原として作用して免疫反応を誘導できる物質であれば、これに限定されない。

本明細書において、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」とは、本発明による組成物の投与によって感染性疾患、がん、代謝症候群、自己免疫疾患、希少疾患などの疾患を抑制させたり発病を遅延させるすべての行為を意味する。

本明細書において、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、本発明による組成物の投与によって感染性疾患、がん、代謝症候群、自己免疫疾患、希少疾患などの症状が好転したり有益に変更されるすべての行為を意味する。

本明細書において、「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌまたはｓｕｂｊｅｃｔ）」とは、本発明の組成物が投与され得る対象を言い、その対象には、制限がない。

本明細書において、「感染性疾患（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ）」とは、ウイルス、細菌、真菌など異種の生命体による感染によって誘導された疾患を総称する。

本明細書において、「がん（ｃａｎｃｅｒ）」とは、浸潤により局部的におよび転移により体系的に拡張できる各種血液がん、悪性固形腫瘍などを総称する。特にこれに限定されないが、がんの具体的な例としては、大腸がん、副腎がん、骨がん、脳がん、乳がん、気管支がん、結腸がんおよび／または直腸がん、胆のうがん、消化管がん、頭頸部がん、腎臓がん、喉頭がん、肝がん、肺がん、神経組織がん、膵臓がん、前立腺がん、副甲状腺がん、皮膚がん、胃がん、甲状腺がんなどが含まれる。がんの他の例としては、腺がん、腺腫、基底細胞がん、子宮頸部異形成および上皮内がん、ユーイング（Ｅｗｉｎｇ）肉腫、扁平上皮がん腫、液腺細胞がん、悪性脳腫瘍、母細胞がん、腸の神経節細胞腫、過形成角膜神経がん、島細胞がん、カポジ（Ｋａｐｏｓｉ）肉腫、平滑筋腫、白血病、リンパ腫、悪性がん様腫、悪性黒色腫、悪性高カルシウム血症、マルファン体型（ｍａｒｆａｎｏｉｄ ｈａｂｉｔｕｓ）がん、髄様がん、転移性皮膚がん、粘膜神経腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、菌状息肉症、神経芽細胞腫、骨肉腫、骨原性およびその他肉腫、卵巣がん、クロム親和性細胞腫、真性赤血球増加症、原発性脳腫瘍、小細胞性肺がん、潰瘍性および乳頭状扁平上皮がん、精上皮腫、軟組織肉腫、網膜芽腫、腎細胞腫瘍または腎細胞がん（ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＲＣＣ）、網状細胞性肉腫、およびウィルムス腫瘍が含まれる。また、星細胞腫、消化管間質腫瘍（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｔｕｍｏｒ，ＧＩＳＴ）、神経膠腫または神経膠芽腫、肝細胞がん（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＨＣＣ）、膵臓内分泌がんなどが含まれる。

本明細書において、「代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）」とは、心臓疾患、糖尿病、脳卒中をはじめとして健康問題の危険性を増加させる５つの危険要素（高血圧、高血糖、高トリグリセリド血症、低い高比重リポタンパクコレステロール、および中心性肥満）のうち３つ以上を一人の個人が有していることを意味し、一例として、肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、心臓病、痛風などの代謝性疾患（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）を含むが、代謝症候群によって発病するすべての疾患を総称する。

本明細書において、「自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）」とは、自己抗原に対する病的反応による疾患を総称し、全身性紅斑性狼瘡（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ；ＳＬＥ）、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ＲＡ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＭＳ）などのような全身性自己免疫疾患、インスリン依存性糖尿（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ；ＩＤＤＭ）、グレーブス病（ｇｒａｖｅ’s ｄｉｓｅａｓｅ）、アレルギー（ａｌｌｅｒｇｙ）などが含まれる。

本明細書において、「希少疾患（ｒａｒｅ ｄｉｓｅａｓｅ）」とは、人口のうち少ない比重にのみ影響を及ぼすすべての疾患を総称し、一般的に遺伝性を有していて、疾患の発病率や有病率が非常に低いため、診断が難しく、適切な治療法がない場合を意味する。国ごとに定義が少しずつ異なるが、韓国は、希少疾患管理法第２条に基づいて「希少疾患とは、有病人口が２万以下であるか、診断が難しくて有病人口が分からない疾患であり、保健福祉部令で定めた手続きと基準によって定めた疾患をいう」と定義している。ＷＨＯ（世界保健機関）は、有病率が人口１，０００人当たり約０．６５～１人以下の場合、米国は、全体患者数が２０万人未満の場合、ヨーロッパ（ＥＵ）は、１０，０００人当たり５人以下の場合と希少疾患を指定している。

本明細書において、「薬学的組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」とは、カプセル、錠剤、顆粒、注射剤、軟膏剤、粉末または飲料の形態であることを特徴とし、前記薬学的組成物は、ヒトを対象とすることを特徴とする。前記薬学的組成物は、これらに限定されるものではないが、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、カプセル、錠剤、水性懸濁液などの経口型剤形、外用剤、坐剤および滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用されてもよい。本発明の薬学的組成物は、製薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。薬剤学的に許容される担体は、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩解剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。本発明の薬学的組成物の剤形は、上述したような薬剤学的に許容される担体と混合して多様に製造することができる。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル（ｅｌｉｘｉｒ）、サスペンション、シロップ、ウェハーなどの形態で製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多回投薬形態で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、徐放性製剤などで剤形化することができる。

一方、製剤化に適した担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、マグネシウムステアレートまたは鉱物油などが使用されてもよい。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含んでもよい。

本発明による薬学的組成物の投与経路は、これらに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれる。経口または非経口投下が望ましい。本願に使用されるような「非経口」という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、硬膜内、病巣内および頭蓋骨内注射または注入技術を含む。本発明の薬学的組成物は、また、直腸投与のための坐剤の形態で投与することができる。

本発明の薬学的組成物は、使用された特定化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、食事、投与時間、投与経路、排出率、薬物配合および予防または治療される特定疾患の重症を含む様々な要因によって多様に変わることができ、前記薬学的組成物の投与量は、患者の状態、体重、病気の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なるが、当業者が適切に選択することができ、１日に０．０００１～５００ｍｇ／ｋｇまたは０．００１～５００ｍｇ／ｋｇで投与することができる。投与は、一日に１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。前記投与量は、いかなる面でも、本発明の範囲を限定するものではない。本発明による薬学組成物またはワクチン組成物は、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤に剤形化することができる。

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、ただ下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。

［実施例１：動力学的に作用するコレステロール－トール様受容体アゴニストの合成法］
初期には、不活性化状態（ｉｎａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）で存在しているが、体内の腫瘍微小環境、免疫細胞など標的する細胞内に伝達された後に、生理学的環境（低ｐＨ、酵素、グルタチオンなど）によって活性化状態に転換されて、免疫活性化効能を示すことができる動力学的に活性の制御が可能な（ｋｉｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ）トール様受容体アゴニスト（ＴＬＲ ａｇｏｎｉｓｔ）を製作するために、多様なトール様受容体７または８アゴニスト（イミダゾキノリン系アゴニスト（ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｏｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｇｏｎｉｓｔ）、ヒドロキシアデニン系アゴニスト（８－ｈｙｄｒｏｘｙａｄｅｎｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｇｏｎｉｓｔ）、プテリドン系アゴニスト（ｐｔｅｒｉｄｏｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｇｏｎｉｓｔ）、アミノピリミジン系アゴニスト（２－ａｍｉｎｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｇｏｎｉｓｔ）、ベンゾアゼピン系アゴニスト（ｂｅｎｚｏａｚｅｐｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｇｏｎｉｓｔ）、チアオキソグアノシン系アゴニスト（７－ｔｈｉａ－８－ｏｘｏｇｕａｎｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｇｏｎｉｓｔ）など）の活性化部位（ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ）、すなわち、アミン基（ＮＨ_２）部位にコレステロールを結合させた結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を下記反応式１または２の化学反応によって作製した。トール様受容体７または８アゴニストとコレステロールの結合は、切断可能な結合（ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｂｏｎｄ）のカルバメート（ｃａｒｂａｍａｔｅ）、ジスルフィド（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）、エステル（ｅｓｔｅｒ）、ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）、またはアジド（ａｚｉｄｅ）結合を介してコレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と結合させた。

前記Ｒは、脂肪族基または芳香族基を含む側鎖であり、－ＮＨ－、－ＣＯ－、－ＣＯＮＨ－、－ＣＳＮＨ－、－ＣＯＯ－、－ＣＳＯ－、－ＳＯ_２ＮＨ－、－ＳＯ_２－、－ＳＯ－、－Ｏ－などを含んでもよい。

前記Ｒは、脂肪族基または芳香族基を含む側鎖であり、－ＮＨ－、－ＣＯ－、－ＣＯＮＨ－、－ＣＳＮＨ－、－ＣＯＯ－、－ＣＳＯ－、－ＳＯ_２ＮＨ－、－ＳＯ_２－、－ＳＯ－、－Ｏ－などを含んでもよい。

［実施例２：２－メチル－１－（３－ニトロキノリン－４－イルアミノ）プロパン－２－オールの合成］
下記反応式３の方法を用いて２－メチル－１－（３－ニトロキノリン－４－イルアミノ）プロパン－２－オール（化合物２）を合成した。より詳細には、１０～２０℃で化合物１（３０ｇ）が添加されたジクロロメタン（４５０ｍｌ）に１－アミノ－２－メチルプロパン－２－オール（１４ｇ）およびテトラエチルアミン（９．６ｇ）を添加し、２時間撹拌させて、混合物を製造した。次に、真空状態で溶媒を蒸発させて混合物を濃縮させた後に、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１５０ｍｌ）を用いて再懸濁した。再懸濁した混合物は、フィルターを用いて分離した後、低圧状態で濃縮させて、化合物２（３２ｇ、８５．２％、黄色固体）を獲得した。獲得した化合物２の構造は、^１Ｈ ＮＭＲを用いて検証した。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ９．９１（ｂｒｓ、１Ｈ）、９．１８（ｓ、１Ｈ））、８．４６（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．８３－７．９２（ｍ、２Ｈ）、７．５６－７．６０（ｍ、１Ｈ）、５．１５（ｓ、１Ｈ）、３．８６（ｄ、Ｊ＝４．８Ｈｚ、２Ｈ）、１．１５（ｓ、６Ｈ）。

［実施例３：１－（３－アミノキノリン－４－イルアミノ）－２－メチルプロパン－２－オールの合成］
下記反応式４の方法を用いて１－（３－アミノキノリン－４－イルアミノ）－２－メチルプロパン－２－オール（化合物３）を合成した。より詳細には、１０～２０℃のリアクターに化合物２（３２ｇ）、メタノール（５００ｍｌ）、およびＰｄ／Ｃ触媒（３．２ｇ）を混合した後、混合物は、水素を用いて３回脱ガス（ｄｅｇａｓｓｉｎｇ）およびフラッシング（ｆｌｕｓｈｉｎｇ）した。水素が気体化して、１ ａｔｍを維持するようにした後、室温で５時間撹拌させた。その後、混合物は、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１００ｍｌ）を用いて再懸濁した。再懸濁した混合物は、フィルターを用いて分離した後、低圧状態で濃縮させて、化合物３（２７ｇ、９５．４％、黄色固体）を獲得した。獲得した化合物３の構造は、^１Ｈ ＮＭＲを用いて検証した。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ８．３７（ｓ、１Ｈ））、７．９９－８．０１（ｍ、１Ｈ）、７．７２－７．７４（ｍ、１Ｈ）、７．３２－７．３９（ｍ、２Ｈ）、５．０４（ｓ、２Ｈ）、４．７７（ｂｒｓ、１Ｈ）、４．６７－４．７０（ｍ、１Ｈ）、４．１２（ｂｒｓ、２Ｈ）、１．１５（ｓ、６Ｈ）。

［実施例４：１－（２－エトキシメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）－２－メチルプロパン－２－オールの合成］
下記反応式５の方法を用いて１－（２－エトキシメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）－２－メチルプロパン－２－オール（化合物４）を合成した。より詳細には、１０～２０℃のリアクターに化合物３（２７ｇ）および２－エトキシ酢酸（３０ｍｌ）を添加した後、５時間１２０～１３０℃で５時間撹拌させた。その後、混合物を２０～２５℃で冷却させ、飽和炭酸ナトリウム（１５０ｍｌ）を添加した。次に、ジクロロメタンとメタノール（１０／１、ｖ／ｖ）の混合溶液を用いて反応物を抽出した。抽出した有機溶液層を塩水（ｂｒｉｎｅ）で洗浄した後、硫酸ナトリウム（１０ｇ）を用いて水分を除去した。次に、水分が除去された有機溶液層は、フィルターを用いてろ過した後、低圧状態で濃縮させて、化合物４（３０ｇ、８５．８％、黄色ゲル）を獲得した。獲得した化合物４の構造は、^１Ｈ ＮＭＲを用いて検証した。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ＿ｄ６ ４００ＭＨｚ）：δ９．１８（ｓ、１Ｈ））、８．６３（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．１３（ｄｄ、Ｊ＝１．６、８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．６３－７．７１（ｍ、２Ｈ）、４．９１（ｓ、２Ｈ）、４．７８（ｂｒｓ、２Ｈ）、３．５４（ｑ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、１．１０－１．１８（ｍ、９Ｈ）。

［実施例５：２－（エトキシメチル）－１－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロピル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン５－オキシドの合成］
下記反応式６の方法を用いて２－（エトキシメチル）－１－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロピル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン５－オキシド（化合物５）を合成した。より詳細には、１０～２０℃のリアクターに化合物４（３０ｇ）、ジクロロメタン（３５０ｍｌ）、およびメタクロロペルオキシ安息香酸（２６ｇ）を添加した後、室温で４時間撹拌させた。次に、撹拌した混合物に飽和炭酸ナトリウム溶液（１５０ｍｌ）と硫酸ナトリウム溶液（１５０ｍｌ）を添加した後、ジクロロメタンとメタノール（１０／１、ｖ／ｖ）の混合溶液を用いて反応物を抽出した。抽出した有機溶液層の水分は、硫酸ナトリウム（３０ｇ）を用いて除去した後、フィルターを用いてろ過した後、低圧状態で濃縮させた。その後、濃縮させた反応物をエチルアセテート（５０ｍｌ）を用いて再懸濁し、フィルターを用いて分離した後、低圧状態で乾燥させて、化合物５（３０ｇ、９４．９％、黄色固体）を獲得した。獲得した化合物５の構造は、^１Ｈ ＮＭＲを用いて検証した。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ＿ｄ６ ４００ＭＨｚ）：δ９．０４（ｓ、１Ｈ））、８．７９（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、８．７１（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．７７－７．８０（ｍ、２Ｈ）、４．９３（ｓ、２Ｈ）、４．７３（ｂｒｓ、２Ｈ）、３．５４（ｑ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、１．１２－１．１８（ｍ、９Ｈ）。

［実施例６：１－（４－アミノ－２－エトキシメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４．５－ｃ］キノリン－１－イル）－２－メチルプロパン－２－オールの合成］
下記反応式７の方法を用いて１－（４－アミノ－２－エトキシメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４．５－ｃ］キノリン－１－イル）－２－メチルプロパン－２－オール（化合物６）を合成した。より詳細には、１０～２０℃のリアクターに化合物５（３０ｇ）、ＤＣＭ（６００ｍｌ）、４－メチルベンゼン－１－スルホニルクロリド（１８．２ｇ）、およびアンモニア水（ＮＨ_３・Ｈ_２Ｏ、１８０ｍｌ）を添加した後、室温で１６時間撹拌させた。次に、撹拌した混合物に蒸留水を添加した後、ジクロロメタンとメタノール（１０／１、ｖ／ｖ）の混合溶液を用いて混合物を分離した。分離した有機溶液層は、塩水（ｂｒｉｎｅ）を用いて洗浄した後、無水硫酸ナトリウム（５０ｇ）を用いて水分を除去した。水分が除去された有機溶液層は、フィルターを用いてろ過した後、低圧状態で濃縮させ、濃縮させた反応物をメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルとメタノール（１５／１、ｖ／ｖ）の混合溶液を用いて３０分間再懸濁した。その後、フィルターを用いて分離した後、低圧状態で乾燥させて、化合物６（１８ｇ、６０％、黄色固体）を獲得した。獲得した化合物６の構造は、^１Ｈ ＮＭＲを用いて検証した。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ＿ｄ６ ４００ＭＨｚ）：δ８．２７（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．５９（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．４０（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．２１（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、６．５７（ｂｒｓ、２Ｈ）、４．８９（ｓ、２Ｈ）、４．６８（ｂｒｓ、２Ｈ）、３．５２（ｑ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、１．１１－１．１７（ｍ、９Ｈ）。

［実施例７：１０，１３－ジメチル－１７－（６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロ［ａ］フェナントレン－３－イル２－（エトキシメチル）－１－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロピル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－イルカルバメートの合成］
下記反応式８の方法を用いて１０，１３－ジメチル－１７－（６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロ［ａ］フェナントレン－３－イル２－（エトキシメチル）－１－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロピル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－イルカルバメート（化合物８）を合成した。まず、化合物７（ＴＣＩ、５０ｇ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）を２５０ｇのシリカゲルが充填されたカラムクロマトグラフィー（０％～２０％酢酸エチルｉｎ ｎ－ヘキサン）を用いて純粋な化合物７（３０ｇ）を獲得した。次に、１０～２０℃のリアクターに化合物６（１５ｇ）とジクロロメタン（１９８．９ｇ）を添加した後、純粋な化合物７（３０ｇ）とテトラエチルアミン（９．６ｇ）を順に添加し、２０～２５℃で１６時間撹拌させた。撹拌した混合物に水を添加した後、ジクロロメタンを添加して反応物を抽出した。抽出した有機溶液層は、塩水を用いて洗浄した後、無水硫酸ナトリウム（１９５ｇ）を用いて水分を除去した。水分が除去された有機溶液層は、フィルターを用いてろ過した後、低圧状態で濃縮させた。次に、濃縮させた反応物は、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルとメタノール（１０／１、ｖ／ｖ）の混合溶液を用いて再懸濁した。その後、フィルターを用いて分離した後、低圧状態で乾燥させて、化合物８（１０．２ｇ、５５．１％、白色固体）を獲得した。獲得した化合物８の構造は、^１Ｈ ＮＭＲを用いて検証した。^１Ｈ ＮＭＲ結果を通じて、レシキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ；Ｒ８４８）とコレステロールがカルバメート結合で連結された結合体が製造されたことを確認した。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３ ４００ＭＨｚ）：δ８．１３－８．１９（ｍ、２Ｈ）、７．５９－７．６３（ｍ、１Ｈ））、７．４６－７．５０（ｍ、１Ｈ）、５．４２－５．４３（ｍ、１Ｈ）、４．９２（ｂｒｓ、２Ｈ）、４．７２－４．８０（ｍ、３Ｈ）、３．６８（ｑ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、３．２４（ｓ、１Ｈ）、２．５１－２．５９（ｍ、１Ｈ）、２．３６－２．４７（ｍ、１Ｈ）、１．９６－２．１１（ｍ、３Ｈ）、１．８１－１．９５（ｍ、２Ｈ）、１．４５－１．７５（ｍ、９Ｈ）、１．０２－１．３５（ｍ、２７Ｈ）、０．９４（ｄ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、３Ｈ）、０．８９（ｄ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、６Ｈ）、０．７１（ｓ、３Ｈ）。

［実施例８：ビス（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）２，２’－ジスルファンジイルビス（エタン－２，１－ジイル）ジカーボネートの合成］
下記反応式９の方法を用いてビス（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）２，２’－ジスルファンジイルビス（エタン－２，１－ジイル）ジカーボネート（化合物９）を合成した。まず、化合物７（ＴＣＩ、７０ｇ）を３５０ｇのシリカゲルが充填されたカラムクロマトグラフィー（０％～２０％酢酸エチルｉｎ ｎ－ヘキサン）を用いて純粋な化合物７（４０ｇ）を獲得した。次に、１０～１５℃のリアクターに純粋な化合物７（４０ｇ）およびジクロロメタン（１００ｍｌ）を添加した後、ビス（２－ヒドロキシエチル）ジスルフィドが添加されているジクロロメタン（２５０ｍｌ）溶液とピリジン（２１ｇ）を順に添加した。混合物を２時間室温で撹拌させた後、蒸留水（２００ｍｌ）を添加した。次いで、ジクロロメタン（１５０ｍｌ）を３回添加して反応物を抽出した。抽出した有機溶液層は、塩水を用いて洗浄した後、無水硫酸ナトリウム（２０ｇ）を用いて水分を除去した。水分が除去された反応物は、フィルターを用いてろ過した後、低圧状態で濃縮させた。その後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、３００ｇ、１０％～３０％酢酸エチルｉｎ ｎ－ヘキサン）を用いて化合物９（２０ｇ、３９．６％、黄色ゲル）を獲得した。獲得した化合物９の構造は、^１Ｈ ＮＭＲを用いて検証した。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３ ４００ＭＨｚ）：δ５．４１－５．４２（ｍ、１Ｈ）、４．４６－４．５６（ｍ、１Ｈ）、４．４１（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、３．９１（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．９８（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、２．９１（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．３５－２．４７（ｍ、２Ｈ）、１．７９－２．０８（ｍ、６Ｈ）、１．４３－１．７３（ｍ、７Ｈ）、１．２５－１．４２（ｍ、５Ｈ）、１．０６－１．２２（ｍ、７Ｈ）、０．９７－１．０３（ｍ、５Ｈ）、０．９３（ｄ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、３Ｈ）、０．８８（ｄｄ，Ｊ＝１．６，６．８Ｈｚ、６Ｈ）、０．６９（ｓ、３Ｈ）。

［実施例９：化合物１０の合成］
下記反応式１０の方法を用いて化合物１０を合成した。より詳細には、１０～１５℃のリアクターに化合物９（２０ｇ）とジクロロメタン（２００ｍｌ）を添加した後、ビス（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）カーボネート（１８ｇ）とテトラエチルアミン（１０．７ｇ）を順に添加した。混合物は、３時間室温で撹拌させた後、蒸留水（３００ｍｌ）を添加し、次いで、ジクロロメタン（１５０ｍｌ）を３回添加して反応物を抽出した。抽出した有機溶液層は、塩水を用いて洗浄した後、無水硫酸ナトリウム（２０ｇ）を用いて水分を除去した。水分が除去された反応物は、フィルターを用いてろ過した後、濾過物を低圧状態で濃縮させた。その後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、２００ｇ、５％～２０％酢酸エチルｉｎ ｎ－ヘキサン）を用いて化合物１０（１８ｇ、７２％、黄色ゲル）を獲得した。獲得した化合物１０の構造は、^１Ｈ ＮＭＲを用いて検証した。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３ ４００ＭＨｚ）：δ５．３９－５．４０（ｍ、１Ｈ）、４．５７（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、４．４３－４．５２（ｍ、１Ｈ）、４．３７（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．９６－３．０３（ｍ、４Ｈ）、２．８４（ｓ、４Ｈ）、２．３４－２．４４（ｍ、２Ｈ）、１．７８－２．０４（ｍ、５Ｈ）、１．４２－１．７３（ｍ、７Ｈ）、１．２２－１．４０（ｍ、５Ｈ）、１．０６－１．２０（ｍ、７Ｈ）、０．９５－１．０４（ｍ、５Ｈ）、０．９１（ｄ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、３Ｈ）、０．８６（ｄ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、６Ｈ）、０．６７（ｓ、３Ｈ）。

［実施例１０：２－（（２－（（１０，１３－ジメチル－１７－（６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロ［ａ］フェナントレン－３－イルオキシ）カルボニルオキシ）エチル）ジスルファニル）エチル２－（エトキシメチル）－１－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロピル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－イルカルバメートの合成］
下記反応式１１の方法を用いて２－（（２－（（１０，１３－ジメチル－１７－（６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロ［ａ］フェナントレン－３－イルオキシ）カルボニルオキシ）エチル）ジスルファニル）エチル２－（エトキシメチル）－１－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロピル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－イルカルバメート（化合物１１）を合成した。より詳細には、１０～２０℃のリアクターに化合物６（１５ｇ）とジクロロメタン（１９８．９ｇ）を添加した後、化合物１０（４０．５ｇ）とテトラエチルアミン（９．６ｇ）を順に添加した。混合物は、２０～２５℃で１６時間撹拌させた後、蒸留水（２２５ｍｌ）を添加した。次いで、ジクロロメタン（９９．４５ｇ）を５回添加して反応物を抽出した。抽出した有機溶液層は、塩水を用いて洗浄した後、無水硫酸ナトリウム（１９５ｇ）を用いて水分を除去した。次に、水分が除去された反応物は、フィルターを用いてろ過した後、ろ過物を低圧状態で濃縮させた。その後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１００ｇ、１０％～５０％酢酸エチルｉｎ ｎ－ヘキサン）を用いて化合物１１（１０．８ｇ、３７．４％、白色固体）を獲得した。獲得した化合物１１の構造は、^１Ｈ ＮＭＲを用いて検証した。^１Ｈ ＮＭＲ結果を通じて、Ｒ８４８とコレステロールがジスルフィドで交差結合された結合体が製造されたことを確認した。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３ ４００ＭＨｚ）：δ８．１５－８．１７（ｍ、２Ｈ）、７．６０－７．６４（ｍ、１Ｈ））、７．４７－７．５１（ｍ、１Ｈ）、５．３９－５．４０（ｍ、１Ｈ）、４．９３（ｓ、２Ｈ）、４．８１（ｓ、２Ｈ）、４．５６（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、４．４５－４．５４（ｍ、１Ｈ）、４．４１（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．６８（ｑ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、３．１３（ｓ、１Ｈ）、３．０９（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．０１（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．３４－２．４７（ｍ、２Ｈ）、１．９２－２．０６（ｍ、３Ｈ）、１．７９－１．９０（ｍ、２Ｈ）、１．２３－１．７２（ｍ、２１Ｈ）、１．０６－１．２１（ｍ、７Ｈ）、０．９６－１．０５（ｍ、５Ｈ）、０．９３（ｄ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、３Ｈ）、０．８８（ｄｄ，Ｊ＝１．６，６．４Ｈｚ、６Ｈ）、０．６９（ｓ、３Ｈ）。

［実施例１１：コレステロール－トール様受容体７または８アゴニストの結合体を含むナノ粒子の製造］
コレステロール－トール様受容体７または８アゴニストの結合体は、コレステロールを含んでいるので、多様なナノ粒子の形態で容易に製造することができ、これによって、免疫細胞との相互作用を最大化することができる。

（１１．１．コレステロールが結合したトール様受容体７または８アゴニストを含むナノリポソームの製造）
コレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソーム（ｎａｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅ）を製造するために、実施例１と同じ方法で製造したコレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体の１つであるコレステロール－レシキモド結合体を用いてナノリポソームを製造した。より詳細には、０．５ｍｌのクロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）に５ｍｇのＤＯＰＣ（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，Ａｖａｎｔｉ）、１．５ｍｇのＤＤＡＢ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、Ａｖａｎｔｉ）、および、１ｍｇのコレステロール－レシキモド結合体を溶解させて混合物を製造した。前記混合物をロータリーエバポレーター（ｒｏｔａｒｙ ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ、３０分）を用いてクロロホルムを蒸発させて、複数層のの薄いフィルム形態で製造し、そこへ２ｍｌのリン酸塩緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）を添加し、常温で２時間撹拌させた。次に、チップ超音波破砕機（Ｔｉｐ ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ、ａｍｐｌｉｔｕｄｅ：２０％、２分）を用いて均質化段階を経て単層のリポソームを獲得した後に、ナノリポソームの均質化のために小型押し出し機（ｍｉｎｉ ｅｘｔｒｕｄｅｒ）を経て安定したコレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームを製造した。製造されたナノリポソームは、紫外線および可視光線分光分析法（ＵＶ－Ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて内部に含まれているコレステロール－トール様受容体７または８アゴニストの量を定量した。

（１１．２．コレステロールが結合したトール様受容体７または８アゴニストを含むナノエマルジョンの製造）
コレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノエマルジョン（ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ）を製造するために、実施例１と同じ方法で製造したコレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体の１つであるコレステロール－レシキモド結合体を用いてナノエマルジョンを製造した。より詳細には、１ｍｌのクロロホルムに１ｍｇのＤＯＰＣ、２４０μｇのコレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、および２４０μｇのコレステロール－レシキモド結合体を添加した後、溶解させて、混合物を製造した。次に、前記混合物を丸底フラスコに移して入れた後に、ロータリーエバポレーター（ｒｏｔａｒｙ ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）を用いてクロロホルムを完全に蒸発させて、薄い脂質膜（ｔｈｉｎ－ｆｉｌｍ）形態を製造した。次に、リン酸塩緩衝溶液２ｍｌにＳｑｕａｌｅｎｅ（５％ｖ／ｖ）、Ｔｗｅｅｎ ８０（０．５％ｖ／ｖ）、およびＳｐａｎ ８５（０．５％ｖ／ｖ）を添加して溶解させた後に、前記溶液を脂質膜上に添加し、超音波分散機（Ｔｉｐ ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて１分間分散させ、回転装置（ｔｕｂｅ ｒｅｖｏｌｖｅ）を用いて２時間程度撹拌させて、コレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノエマルジョンを製造した後に、使用前まで４℃冷蔵庫に保管した。

（１１．３．コレステロールが結合したトール様受容体７または８アゴニストおよびサポニンで構成されたナノミセルの製造）
コレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体およびサポニンで構成されるナノミセル（ｎａｎｏｍｉｃｅｌｌｅ）を製造するために、実施例１と同じ方法で製造したコレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体の１つであるコレステロール－レシキモド結合体を用いてナノミセルを製造した。より詳細には、ホスファチジルコリン：サポニン：コレステロール－レシキモド結合体を５：３：２の重量比で混合した後に、１４ｍｇ／ｍｌの濃度となるようにエーテルに添加し、溶解させて、脂質を含むエーテル溶液を製造した。次に、サポニンは、１．５ｍｇ／ｍｌの濃度で４ｍｌの蒸留水に溶解させた後に、２０ｍｌのガラス瓶に入れ、ゴム栓でガラス瓶を塞いだ後に、５５℃のウォータージャケットに保管した。次に、１ｍｌの脂質を含むエーテル溶液を注射器ポンプを用いて０．２ｍｌ／ｍｉｎの速度でサポニンが含んでいるガラス瓶に添加し、２時間撹拌させた。この際、注射器針の端部は、サポニンを含む水溶液の表面より下方に位置させ、換気のために二番目の針は、ゴム栓にさしておいた。次に、常温にガラス瓶を移し、３日間撹拌させて安定化させる段階を経て、コレステロールが結合したレシキモドおよびサポニンで構成されたナノミセルを製造した。

（１１．４．コレステロールが結合したトール様受容体７または８アゴニストで構成された高分子ナノ粒子の製造）
コレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体で構成された高分子ナノ粒子を製造するために、実施例１と同じ方法で製造したコレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体の１つであるコレステロール－レシキモド結合体を用いて高分子ナノ粒子を製造した。より詳細には、ラクチド（Ｌａｃｔｉｄｅ）とグリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）組成比が５０：５０のＰＬＧＡ高分子（Ｅｕｄｒａｇｉｔ）６０ｍｇを１ｍｌのクロロホルム溶媒に溶かした。次に、５ｍｇのコレステロール－レシキモド結合体を溶媒に添加し、超音波洗浄器（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｂａｔｈ、Ｅｍｅｒｓｏｎ Ｍｏｄｅｌ ＣＰＸ５８００Ｈ－Ｅ）を用いてコレステロール－レシキモド結合体と高分子を溶解させた。次に、２．５％ ＰＶＡ水溶液１０ｍｌに前記溶解させた溶液を２００μｌずつ添加しつつ、超音波分散機（Ｔｉｐ ｓｏｎｉｃａｔｏｒ、Ｓｏｎｉｃｓ＆Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｍｏｄｅｌ ＶＣＸ ７５０）を用いて１分間分散させた。この際、分散機の出力は、７５０ワットであり、振動強度は、２０ｋＨｚであり、Ａｍｐｌｉｔｕｄｅは、２０％に設定した。次に、ＰＬＧＡが溶解した有機溶媒を完全に蒸発させるために製造された水溶液を６００ｒｐｍで室温で８時間以上撹拌した。反応しない高分子とコレステロール－レシキモド結合体を除去するために、遠心分離機（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、Ｈａｎｉｌ、Ｃｏｍｂｉ－５１４Ｒ）を用いて１２，０００ｒｐｍ、１２分の条件で遠心分離を実施し、上清液を除去した後、超純水１０ｍｌを添加し、超音波分散機に３０秒間分散させた。前記過程を３回繰り返した後、凍結乾燥方法を使用して乾燥させた後、－２０℃で保管した。

［実施例１２：エンドリソソーム（ｅｎｄｏｌｙｓｏｓｏｍｅ）に存在するγ－インターフェロン誘導性リソソームチオール還元酵素による動力学的に作用するコレステロール－トール様受容体７または８アゴニストの化学的結合切断効果の確認］
（１２．１．動力学的に作用するコレステロール－トール様受容体７または８アゴニストを含むナノリポソームの細胞内移入）
前記実施例１１．１と同じ方法で製造したコレステロールとレシキモドがジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）で結合した結合体を含むナノリポソームが細胞内移入（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を介して細胞内に移動するかを確認するために、骨髄由来樹状細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ；ＢＭＤＣ）を用いて実験を行った。より詳細には、ＢＭＤＣに細胞内移入を抑制するＤｙｎａｓｏｒｅ（４０μｇ）を処理し、１時間培養した。次に、コレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームを処理し、４、８、１２、および２４時間後にそれぞれ細胞培養液を獲得した。次に、獲得した細胞培養液は、１，５００ｒｐｍで３分間遠心分離して細胞と上清液を分離した後に、上清液内に含まれているインターロイキン１２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２；ＩＬ－１２）の量を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定した。その後、すべての実験は、最小３回以上繰り返し、結果は、平均値±標準偏差で示した。統計的有意性は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔにより確認し、Ｐ＜０．０５なら、統計的に有意性があると判断した。その結果を図４に示した。

図４に示されたように、細胞内移入抑制剤を処理したグループでは、非常に低い量のＩＬ－１２を分泌することを確認した。前記結果を通じて、コレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームは、細胞内に正常に移動して免疫活性化反応を示すことを確認することができた。

（１２．２．ＢＭＤＣとマクロファージにおけるガンマインターフェロン誘導性リソソームチオール還元酵素の発現の有無の確認）
ＢＭＤＣとマクロファージにおいてγ－インターフェロン誘導性リソソームチオール還元酵素（Ｇａｍｍａ－ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｔｈｉｏｌ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ；ＧＩＬＴ）を発現するかを確認するために、ＢＭＤＣとマクロファージであるＲＡＷ ２６４．７細胞を用いて実験を行った。より詳細には、ＢＭＤＣおよびＲＡＷ ２６４．７細胞の総リボ核酸（ＲＮＡ）をＴｒｉｚｏｌ試薬を用いて分離した。次に、分離したＲＮＡを鋳型として相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）をＭａｘｉｍｅ ＲＴ ＰｒｅＭｉｘ ｔｏｏｌを使用して合成した。次に、合成されたｃＤＮＡを用いてリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を実施し、ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）してＧＩＬＴの発現量を確認した。その結果を図５に示した。

図５に示されたように、抗原提示細胞（Ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）としての樹状細胞とマクロファージにおいてＧＩＬＴが発現することを確認した。

（１２．３．ＧＩＬＴによる動力学的に作用するコレステロール－トール様受容体７または８アゴニストの化学的結合切断の有無の確認）
コレステロールとトール様受容体７または８アゴニストの化学的結合であるジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）がエンドリソソームに存在するＧＩＬＴにより切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）されるかを確認するために、前記実施例１１．１と同じ方法で製造したコレステロールとレシキモドがジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）で結合した結合体を含むナノリポソーム５０μｌを５ｍｌのチューブに収納した。次に、ＧＩＬＴを含むかまたは含まないＰＢＳにそれぞれ溶解させたシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）をナノリポソームと混合し、３７℃振とう培養器で培養しつつ、時間別に試料を獲得した。次に、獲得した試料は、液体窒素を用いて急速冷凍させ、－２０℃冷凍庫で保管した。１２時間後に獲得したすべての試料を真空凍結乾燥器で１０パスカル、および、－８０℃条件で２４時間凍結乾燥した。次に、凍結乾燥した試料を液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）で分析して、コレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体から分離したレシキモド（Ｒ８４８）の量を定量した。その結果を図６に示した。

図６に示されたように、コレステロールとＲ８４８のジスルフィド結合がＧＩＬＴにより切断されて、Ｒ８４８が分離した形態で検出されることを確認した。

前記結果を通じて、コレステロールとトール様受容体７または８アゴニストがジスルフィド結合で連結された結合体を含むナノリポソームは、細胞内移入を介して細胞内に移動し、細胞内のエンドリソソームに存在するＧＩＬＴにより結合が切断されて、コレステロールとトール様受容体７または８アゴニストが分離して免疫活性化作用を示すことを確認することができた。

［実施例１３：動力学的に作用するコレステロール－トール様受容体７または８アゴニストによる免疫反応誘導効果の確認］
（１３．１．コレステロール－トール様受容体７または８アゴニストを含むナノリポソームによる動力学的に制御される免疫細胞の活性化の確認）
前記実施例１１．１と同じ方法で製造したコレステロールとレシキモドがジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）で結合した結合体を含むナノリポソームが免疫細胞の免疫機能調節に及ぼす影響を確認するために、ＢＭＤＣにナノリポソームを処理した後、時間に応じたサイトカイン分泌量と共刺激分子（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の発現を確認した。より詳細には、トール様受容体７または８アゴニストの濃度が１μｇ／ｍｌになるようにナノリポソームまたはＲ８４８をそれぞれ１×１０^６個のＢＭＤＣ細胞に処理し、４時間後から、４時間間隔で細胞培養液を獲得した。獲得した細胞培養液は、１，５００ｒｐｍで３分間遠心分離して細胞と上清液を分離した後、上清液内に含まれているインターロイキン－１０（ＩＬ－１０）とインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）の分泌量をＥＬＩＳＡを用いて測定した。その結果を図７に示した。
また、獲得した細胞は、細胞の成熟度を確認するために、蛍光付き抗体を用いて細胞を染色した後、ＢＤ ＣａｎｔｏＩＩ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを用いて樹状細胞の共刺激分子の発現を確認した。その結果を図８に示した。

図７に示されたように、Ｒ８４８を単独で処理した実験群に比べてコレステロール－Ｒ８４８結合体を含むナノリポソームを処理した実験群（ｔ－ＴＬＲ７／８ａ）においてでＩＬ－１０が分泌される時点が４時間程度遅くなったことを確認した。また、サイトカインの量は、２４時間後にも、持続的に増加することを確認した。

図８に示されたように、樹状細胞の成熟度を意味する共刺激分子、すなわち、ＣＤ８０とＣＤ８６の発現を確認した結果、Ｒ８４８を単独で処理した実験群は、成熟度を意味する共刺激分子の発現量が、時間が経過しても、増加しないが、コレステロール－Ｒ８４８結合体を含むナノリポソーム（ｔ－ＴＬＲ７／８ａ）を処理した実験群は、共刺激分子の発現量が、時間の経過につれて増加することを確認した。

前記結果を通じて、コレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体は、動力学的制御が可能な免疫機能調節剤であり、従来のトール様受容体７または８アゴニストであるＲ８４８と比較して、４時間程度の時間が経過した後に、免疫反応を誘導できるだけでなく、持続的な免疫反応を誘導できることを確認した。また、これによって、コレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体が樹状細胞を枯渇状態（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）、すなわち、免疫反応を誘導しない状態でなく、成熟状態（ｍａｔｕｒｉｎｇ）、すなわち、免疫反応を誘導できる状態に長期間維持させることができることを確認した。

（１３．２．動力学的に作用するコレステロール－トール様受容体７または８アゴニストを含むナノリポソームによる持続的な免疫反応誘導効果の確認）
前記実施例１１．１と同じ方法で製造したコレステロールとレシキモドがジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）で結合した結合体を含むナノリポソームが持続的に免疫反応を誘導するかを確認するために、トール様受容体７または８アゴニストの濃度が１μｇ／ｍｌになるようにナノリポソームまたはＲ８４８をそれぞれ１×１０^６個のＢＭＤＣ細胞に処理し、１２時間後に細胞培養液を獲得した。獲得した細胞培養液は、１，５００ｒｐｍで３分間遠心分離して細胞と上清液を分離した後、獲得した上清液を用いてＩＬ－１２の分泌量を測定した。次に、獲得した細胞は、新しい培地にさらに分注し、４時間間隔で細胞上清液を獲得して、ＩＬ－１２の分泌量をＥＬＩＳＡを用いて確認した。その結果を図９に示した。

図９に示されたように、新しい培地に交替してさらに培養した後（Ａｆｔｅｒ）の結果を見ると、Ｒ８４８を処理した対照群では、ＩＬ－１２がこれ以上観察されなかったが、ナノリポソームを処理した実験群（ｔ－ＴＬＲ７／８ａ）では、１６時間までＩＬ－１２の分泌が持続することを確認した。前記結果を通じて、トール様受容体７または８アゴニストを単独で処理した場合には、樹状細胞の枯渇状態を速く誘導するが、コレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体は、樹状細胞の成熟状態を長期間維持させて、持続的な免疫反応を誘導することを確認することができた。

（１３．３．動力学的に作用するコレステロールとトール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームによるＣＤ４陽性Ｔ細胞のＴｈ１反応への分化誘導効果の確認）
コレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームによる持続的免疫反応がＣＤ４^＋ Ｔ細胞のＴｈ１反応への分化を誘導するかを確認するために、一次的にＣ５７ＢＬ／６マウスから脾臓を採取し、単一細胞に作った後に、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞分離キットを使用してＣＤ４^＋ Ｔ細胞を分離した。次に、ＯＶＡ（１０μｇ／ｍｌ）とともに、トール様受容体７または８アゴニストの濃度が１μｇ／ｍｌになるようにナノリポソームまたはＲ８４８をそれぞれ１×１０^６個のＢＭＤＣ細胞に処理し、１２時間培養した。その後、９６－ウェルプレートにＢＭＤＣとＣＤ４^＋ Ｔ細胞の割合が１：１０になるように分注し、共に培養した。培養５日後で培養上清液を獲得し、ＥＬＩＳＡを用いてインターロイキン４（ＩＬ－４）とインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）の分泌量を測定した。その結果を図１０に示した。

図１０に示されたように、ＩＦＮ－γの分泌量は、Ｒ８４８およびＯＶＡを処理した対照群（Ｒ８４８）とナノリポソームおよびＯＶＡを処理した実験群（ｔ－ＴＬＲ７／８ａ）と比較して有意差を示さないが、ＩＬ－４の分泌量は、ナノリポソームおよびＯＶＡを処理した実験群（ｔ－ＴＬＲ７／８ａ）において減少したことを確認した。前記結果を通じて、コレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームが処理されたＢＭＤＣでＩＬ－１２の分泌が促進され、これによって、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞をＴｈ１に分化させることによって、ＩＦＮ－γ／ＩＬ－４の割合が増加することを確認することができた。

［実施例１４：アジュバント複合投与によるシナジー効果の確認］
（１４．１．トール様受容体３アゴニストおよび動力学的に作用するコレステロール－トール様受容体７または８アゴニストを含むナノリポソームの組み合わせによるシナジー効果の確認）
複合アジュバント投与によるシナジー効果を確認するために、アジュバントと知られているトール様受容体３アゴニストであるｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）とＲ８４８をＢＭＤＣに処理した。より詳細には、ＢＭＤＣにｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を最初に処理し、時間間隔をおいてトール様受容体７または８アゴニストであるＲ８４８を処理した実験群（Ｒ８４８ ａｆｔｅｒ ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））、また、Ｒ８４８を最初に処理し、時間間隔をおいてｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を処理した実験群（ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））ａｆｔｅｒ Ｒ８４８）、すなわち、非同期処理（ａｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を実施した。非同期処理の対照群としては、Ｒ８４８とｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を同時に処理した細胞を用い、同時処理時に分泌されたＩＬ－１２の量を基準点１００として、相対的な値を換算した。また、同期処理（ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）グループとしては、対照群としてＲ８４８とｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をそれぞれ単独で処理した対照群とＲ８４８とｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を同時に処理した対照群（Ｒ８４８＋ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））を使用し、コレステロール－レシキモド結合体を含むナノリポソームとｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を処理した実験群（ｔ－ＴＬＲ７／８ａ＋ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））を準備した。次に、処理が完了した後、３６時間培養し、細胞培養液を獲得した。獲得した細胞培養液は、１，５００ｒｐｍで３分間遠心分離して細胞と上清液を分離した後、上清液内に含まれているＩＬ－１２の分泌量をＥＬＩＳＡを用いて測定した。その結果を図１１に示した。

図１１に示されたように、Ｒ８４８を最初に処理し、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を処理した実験群では、同時処理した対照群と比較して、ＩＬ－１２の分泌量が減少することを確認した。すなわち、トール様受容体３アゴニストとトール様受容体７または８アゴニスト間のシナジー効果がないことを確認した。しかしながら、反対に、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を最初に処理し、Ｒ８４８を処理した実験群では、２時間～４時間隔をおいてＲ８４８を処理した実験群においてＩＬ－１２の分泌が増加し、これは、同時に処理した対照群と比較して、１３０％程度上昇した値であることを確認した。前記結果を通じて、第１アジュバントを処理し、第１アジュバントが作動した後に、２時間～４時間の時間差をもって第２アジュバントが作動する場合、免疫活性化作用が最大化されることを確認することができた。

また、同時処理実験では、ナノリポソームとｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を同時に処理した実験群において最も高いＩＬ－２の発現量を示すことを確認した。これは、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）が最初に作動し、その後、コレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームが細胞内に移動して、ＧＩＬＴによりコレステロールが分離することによってレシキモドが不活性化状態から活性化状態に転換され、活性を示すことによって時間間隔をおいて処理した実験群と同じ結果を示すことを確認することができた。

（１４．２．トール様受容体４アゴニストおよび動力学的に作用するコレステロール－トール様受容体７または８アゴニストを含むナノリポソームの組み合わせによるシナジー効果の確認）
複合アジュバントの投与によるシナジー効果を確認するために、トール様受容体４アゴニストであるＬＰＳ、トール様受容体７または８アゴニストであるレシキモド、および、コレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームを用いて実施例１４．１と同じ方法で実験を行った。その結果を図１２に示した。

図１２に示されたように、ＬＰＳを処理し、４時間程度の時間間隔をおいてＲ８４８を処理した実験群において、最も高いＩＬ－１２の分泌量を示し、同時処理実験でも、ＬＰＳと動力学的に作用するコレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームを同時に処理した実験群において最も高いＩＬ－１２の分泌量を示すことを確認した。

前記結果を通じて、アジュバントのシナジー効果には、順序と時間差が重要な要因として作用することを確認することができた。すなわち、複合アジュバントを使用して免疫活性化を誘導するとき、その効果を増加させるためには、それぞれのアジュバントの活性化時点を調節できる動力学的制御（ｋｉｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌ）が重要であることを確認した。

［実施例１５：アジュバントアンサンブルによる免疫活性化効能確認］
（１５．１．動力学的に作用するコレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームとトール様受容体３アゴニストまたはトール様受容体４アゴニストの組み合わせによる免疫活性化効能の確認）
第１アジュバントと動力学的に作用する第２アジュバントの複合投与による免疫活性化効能を確認するために、第１アジュバントとしては、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）またはＬＰＳを使用し、第２アジュバントとしては、コレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームを用いて実験を行った。ＢＭＤＣにＬＰＳ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、Ｒ８４８、コレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームをそれぞれ単独投与した対照群とＬＰＳおよびＲ８４８を同時投与した実験群、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）およびＲ８４８を同時投与した実験群、ＬＰＳおよびコレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームを同時投与した実験群、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）およびコレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームを同時投与した実験群をそれぞれ準備した後、３６時間培養し、細胞培養液を獲得した。獲得した細胞培養液は、１，５００ｒｐｍで３分間遠心分離して細胞と上清液に分離した後、上清液を用いて上清液内に含まれている腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α）とＩＬ－６の分泌量を測定し、細胞は、蛍光付き抗体を用いて標識した後、ＢＤ ＣａｎｔｏＩＩ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを用いて樹状細胞の共刺激分子の発現を確認して細胞の成熟度を確認した。その結果を図１３および図１４に示した。

図１３に示されたように、それぞれを単独投与した対照群と比較して、それぞれを同時投与した実験群では、ＴＮＦ－αとＩＬ－６の分泌量が増加したが、動力学的に作用するコレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームとアジュバントを複合投与した実験群では、顕著に高いＴＮＦ－αとＩＬ－６の分泌量を示すことを確認した。

また、図１４に示されたように、動力学的に作用するコレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームとアジュバントを複合投与した実験群において最も高い共刺激分子の発現量を示すことを確認した。

前記結果を通じて、投与直後には、不活性化状態を維持し、２～４時間程度後に、遅延した免疫反応を誘導する動力学的制御が可能なアジュバントと一般アジュバントを複合投与することによって、単純にそれぞれのアジュバントを複合投与した場合と比較して、顕著に増加した免疫活性化効果を示すことができることを確認した。

（１５．２．動力学的に作用するコレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームとトール様受容体３アゴニストまたはトール様受容体４アゴニストの組み合わせによる持続的免疫反応誘導効果の確認）
第１アジュバントと動力学的に作用する第２アジュバントの複合投与による免疫活性化効能を確認するために、第１アジュバントとしては、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）またはＬＰＳを使用し、第２アジュバントとしては、コレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームを用いて実験を行った。より詳細には、ＢＭＤＣにＬＰＳおよびＲ８４８、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）およびＲ８４８、ＬＰＳおよびコレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソーム、またはｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）およびコレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームを処理し、２４時間および３６時間後に細胞培養液を獲得した。獲得した細胞培養液は、１，５００ｒｐｍで３分間遠心分離して細胞と上清液に分離した後、上清液内に含まれているＩＬ－１２、ＩＬ－６、およびＴＮＦ－αの分泌量をＥＬＩＳＡを用いて確認した。その結果を図１５に示した。

図１５に示されたように、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）またはＬＰＳとＲ８４８を同時に処理した実験群は、すべての試料において２４時間と３６時間に分泌されたサイトカインの量が類似しているか、減少したが、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）またはＬＰＳとレステロル－トール様受容体７または８アゴニストを含んだナノリポソームを同時に処理した実験群は、すべての試料において３６時間後に分泌されたサイトカインの量が２４時間後に分泌されたサイトカインの量より増加したことを確認した。前記結果を通じて、動力学的に作用する第２アジュバントと第１アジュバントの複合投与を介して、持続的な免疫反応を誘導できることを確認することができた。

［実施例１６：アジュバントアンサンブルシステムの製造］
（１６．１．トール様受容体３アゴニストと動力学的に作用するコレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームで構成されたアジュバント複合体の製造）
前記実施例１１．１と同じ方法で製造したコレステロールとレシキモドがジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）で結合した結合体を含むナノリポソームとｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を質量比４：１で混合し、ボルテックスミキサー（ｖｏｒｔｅｘ ｍｉｘｅｒ、３秒）を用いて安定したパーティクル形態のアジュバント複合体を製造した。本明細書において、ナノリポソームの質量は、ナノリポソーム内に含まれているトール様受容体７または８アゴニストの質量に換算して計算した。

（１６．２．アジュバント複合体の安定化程度の確認）
実施例１６．１と同じ方法で製造したアジュバント複合体が電気的引力によって安定した複合体を形成したかを確認するために、混合体を形成しないｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）が周辺に残っているかを電気泳動移動性変化分析（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ；ＥＭＳＡ）を用いて確認した。より詳細には、ＴＡＥ ｂｕｆｆｅｒにａｇａｒｏｓｅ（１ｇ）を添加し、熱を加えて溶かした後に、モールドに注いで３０分程度固化して、アガロースゲルを製造した。次に、サイズ マーカー（１００ｂｐ）、コレステロール－レシキモド結合体を含むナノリポソーム、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、複合体（Ｋ－ｎａｎｏａｄｊｕｖａｎｔ）を順に処理した後、１時間電気泳動した。その結果を図１６に示した。

図１６に示されたように、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）とコレステロール－レシキモド結合体を含むナノリポソームで構成された動力学的に作用するアジュバント複合体では、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）が全部結合されて、安定した複合体を形成していることを確認することができた。

（１６．３．アジュバント複合体の細胞内安定性の確認）
アジュバント複合体が細胞内でも安定した複合体状態を維持するかを確認するために、Ｒ８４８、ＦＩＴＣが結合したコレステロール（ｃｈｏｌ－ＦＩＴＣ）、および、ローダミンが結合したｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ－ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））を用いて、実施例１６．１と同じ方法でアジュバント複合体を製造した。次に、ｉｂｉｄｉμ－ｓｌｉｄｅ－８－ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｃｈａｍｂｅｒにＢＭＤＣ（４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を分注し、アジュバント複合体を処理した。その後、３７℃で４時間培養し、ＰＢＳを用いて洗浄した後、エンドリソソームは、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ ＤｅｅｐＲｅｄで、核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色した。次に、Ｄｅｌｔａｖｉｏｓｉｏｎ ＰＤを用いて細胞イメージを獲得した。その結果を図１７に示した。

図１７に示されたように、ｃｈｏｌ－ＦＩＴＣを含むナノリポソームの蛍光とＲｈｏｄａｍｉｎｅ－ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の蛍光が同じ位置で確認されることから、細胞内でも安定した複合体を維持していることを確認した。

［実施例１７：アジュバント複合体の効能の確認］
（１７．１．アジュバント複合体の腫瘍排出リンパ節における持続的な免疫反応誘導効能の確認）
実施例１６．１と同じ方法で製造したアジュバント複合体が腫瘍排出リンパ節における免疫反応誘導効能を確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＲ８４８（２５μｇ）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（６．２５μｇ）、または同量のＲ８４８およびｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含むアジュバント複合体をＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原と混合して、皮下に単一接種した。次に、接種後６、１２、２４、４８、および７２時間後にリンパ節を摘出し、摘出したリンパ節は、細胞溶解緩衝液（ＣｅｌｌＬｙｔｉｃ ＭＴ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ）に懸濁した後、機械的に破砕した。細胞が破砕された溶液は、４℃で１０，０００ｘｇで１０分間遠心分離して、不純物が除去された上清液を獲得した。次に、獲得した上清液内に含まれているＩＬ－１２ｐ７０の量をＥＬＩＳＡを用いて確認した。その結果を図１８に示した。

図１８に示されたように、Ｒ８４８とｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を同時に処理した対照群は、リンパ節でＩＬ－１２ｐ７０の分泌が１２時間後に減少するアジュバント複合体を処理した実験群は、４８時間まで持続的にＩＬ－１２ｐ７０を分泌していることを確認した。前記結果を通じて、動力学的に作用するアジュバント複合体は、第１アジュバントと第２アジュバントの作用時点が異なるので、体内で持続的に免疫反応を誘導していることを確認することができた。

（１７．２．アジュバント複合体の抗腫瘍効能の確認）
実施例１６．１と同じ方法で製造したアジュバント複合体の抗腫瘍効能を確認するために、一次的にＢ１６ＯＶＡ黒色腫細胞５×１０^５ ｃｅｌｌｓをマウスの右脇腹に皮下接種して、がん動物モデルを製作した。次に、がん動物モデルにＲ８４８（２５μｇ）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（６．２５μｇ）、または同量のＲ８４８およびｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含むアジュバント複合体をＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原と混合して、３日に１回ずつ皮下に単一接種した。次に、腫瘍サイズおよび生存の有無を持続的に確認した。腫瘍体積は、「長軸直径Ｘ短軸直径^２／２」で計算した。その結果を図１９に示した。

図１９に示されたように、アジュバント複合体を投与した５匹のマウスのうち２匹が３６日まで生存し、腫瘍体積も効果的に抑制されることを確認した。前記結果を通じて、動力学的に作用するアジュバント複合体を用いることによって、抗がん効果を顕著に増加させることができることを確認することができた。

（１７．３．アジュバント複合体の腫瘍排出リンパ節と腫瘍微小環境における免疫反応誘導効能の確認）
実施例１６．１と同じ方法で製造したアジュバント複合体の腫瘍排出リンパ節（ＴＤＬＮ）と腫瘍微小環境（ＴＭＥ）における免疫反応誘導効能を確認するために、一次的にＢ１６ＯＶＡ黒色腫細胞５×１０^５ ｃｅｌｌｓをマウスの右脇腹に皮下接種して、がん動物モデルを製作した。次に、がん動物モデルにＲ８４８（２５μｇ）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（６．２５μｇ）、または同量のＲ８４８およびｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含むアジュバント複合体をＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原と混合して、３日間隔で３回皮下に単一接種した。次に、最後の接種後３日後に、腫瘍組織および腫瘍排出リンパ節を摘出した。次に、腫瘍組織およびリンパ節に集めた免疫細胞を分析するために、腫瘍組織とリンパ節を機械的に破砕した後、コラーゲナーゼＤ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｄ、１ｍｇ／ｍｌ）が添加された培地に再懸濁し、３７℃で４０分間振とう培養器で培養した。その後、７０μｍ細胞ろ過器（ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ）を用いてろ過し、ＰＢＳを用いて２回洗浄して、単一細胞を獲得した。獲得した単一細胞は、蛍光が結合している多様な抗体を用いて染色した後、ＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを用いて分析した。その結果を図２０～図２３に示した。

図２０～図２３に示されたように、動力学的に作用するアジュバント複合体は、腫瘍排出リンパ節で成熟した樹状細胞を生成することを確認した。より詳細には、アジュバント複合体を投与したマウスの腫瘍組織と腫瘍排出リンパ節では、Ｒ８４８とｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を同時に投与した実験群と比較して、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞で非常に高い頻度で多作用性ＩＦＮ－γ^＋グランザイム－Ｂ^＋およびＣＤ６９を誘導することを確認した。また、Ｒ８４８とｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を同時に処理した実験群のＣＤ８^＋ Ｔ細胞では、Ｔ ｃｅｌｌの枯渇状態を意味するＰＤ－１、ＴＩＭ－３、および、ＬＡＧ－３の発現レベルが増加したが、アジュバント複合体を処理した実験群では、対照群（ＰＢＳ処理）と類似していることを確認した。また、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ；ＮＫ ｃｅｌｌ）、および、ナチュラルキラーＴ細胞（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ）では、ＣＤ６９の発現を誘導し、免疫阻害細胞を代表する骨髄由来抑制細胞（Ｍｙｅｌｏｉｄ ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｃｅｌｌ；ＭＤＳＣ）の生成は抑制することを確認した。前記結果を通じて、本発明のアジュバント複合体は、ｉｎ ｖｉｖｏでもＴ細胞の枯渇状態を抑制し、免疫活性化効果を増進させるだけでなく、免疫反応の持続期間を延長させることによって、単純にアジュバントを複合投与することと比較して、顕著に高い免疫調節効果を示すことを確認することができた。

また、腫瘍組織およびリンパ節組織で分泌されたサイトカインを確認するために、獲得した腫瘍組織は、細胞溶解緩衝液（ＣｅｌｌＬｙｔｉｃ ＭＴ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ）を用いて懸濁させた後、機械的に破砕した。次に、４℃で１０，０００ｘｇで１０分間遠心分離して、上清液を獲得した。次に、リンパ節組織は、機械的に破砕し、コラーゲナーゼＤ（１ｍｇ／ｍｌ）が添加されている培地に再懸濁させた。次に、再懸濁させた溶液は、３７℃で４０分間振とう培養器で培養した後に、７０μｍ細胞ろ過器（ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ）を用いてろ過した。次に、ＰＢＳを用いて２回洗浄した後、１，５００ｒｐｍで３分間遠心分離して、単一細胞を獲得した後に、プレートに分注し、３７℃で２４時間培養し、細胞培養液を遠心分離して、上清液を獲得した。次に、獲得した上清液に含まれているＩＬ－１２ｐ７０およびＩＦＮ－γの分泌量をＥＬＩＳＡを用いて確認した。その結果を図２４および図２５に示した。

図２４および図２５に示されたように、アジュバント複合体は、腫瘍組織および腫瘍排出リンパ節の両方でＩＬ－１２ｐ７０およびＩＦＮ－γの分泌を効果的に誘導することを確認した。

前記結果を通じて、動力学的に作用するアジュバント複合体は、多様な免疫細胞の増殖能力の向上、サイトカイン生産量の増加、および、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の枯渇状態を誘導することなく、溶解顆粒生産を増加させることによって、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の効果因子（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）の機能を向上させることを確認することができた。

［実施例１８：ＩＬ－１２中和抗体を用いたアジュバント複合体の効能の確認］
アジュバント複合体によって向上した免疫細胞の増殖および免疫活性化能がＩＬ－１２ｐ７０の持続的な生産によって媒介されるかを確認するために、一次的にＢ１６ＯＶＡ黒色腫細胞５×１０^５細胞をマウスの右脇腹に皮下接種して、がん動物モデルを作製した。次に、がん動物モデルにアジュバント複合体を接種する前に、抗マウスＩＬ－１２ｐ７５（３００μｇ）を３日間隔で５回腹腔内投与した。次に、５回投与し、３日後にアジュバント複合体をＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原と混合して、３日間隔で３回皮下に単一接種した。次に、腫瘍サイズおよび生存の有無を持続的に確認した。その結果を図２６に示した。

図２６に示されたように、抗ＩＬ－１２を処理した実験群では、アジュバント複合体の抗腫瘍効果が減少することを確認した。前記結果を通じて、ＩＬ－１２がトール様受容体３アゴニストおよびコレステロール－トール様受容体７または８アゴニスト結合体を含むナノリポソームで構成された、動力学的に作用するアジュバント複合体の先天性免疫刺激および適応免疫反応の間に重要な役割をすることを確認することができた。

［実施例１９：アジュバント複合体の局所接種を介した抗腫瘍免疫反応誘導効果の確認］
（１９．１．アジュバント複合体の局所接種を介した転移がんに対する抗腫瘍効能の確認）
アジュバント複合体の局所接種を介して、転移がんに対する抗腫瘍効能を示すかを確認するために、ＴＣ－１細胞５×１０^５細胞をマウスの右脇腹に皮下接種して、がん動物モデルを作製した。次に、４日後に、二次的にＴＣ－１細胞２．５×１０^５細胞をマウスの左脇腹に皮下接種した。次に、がん動物モデルにアジュバント複合体をＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原と混合して、３日間隔で４回皮下に単一接種した。次に、最後の接種後３日後に、腫瘍組織および腫瘍排出リンパ節を摘出した。腫瘍サイズおよび生存の有無を持続的に確認した。その結果を図２７に示した。

図２７に示されたように、アジュバント複合体を接種した実験群では、一次腫瘍だけでなく、二次腫瘍の成長も効果的に抑制することを確認した。

（１９．２．アジュバント複合体の局所接種を介した肺転移抑制効果の確認）
アジュバント複合体の局所接種ががんの転移を抑制するかを確認するために、一次的に４Ｔ１細胞５×１０^５細胞をマウスの右脇腹に皮下接種して、がん動物モデルを製作した。次に、５日後に腫瘍溶解物（ｔｕｍｏｒ ｌｙｓａｔｅ、１０μｇ）とアジュバント複合体を混合して、３日間隔で４回皮下に単一接種した。次に、３０日後にマウスを安楽死させた後に、インディアインク（４７ｍｌ）とＰＢＳ（３ｍｌ）を混合した溶液を器官内注射して、肺を染色した。染色された肺は摘出し、ＰＢＳで洗浄した後、固定溶液（７０％エタン（４０ｍｌ）、４％ホルムアルデヒド（１ｍｌ）および酢酸（０．５ ｍｌ））に浸漬して固定させ、肺転移性結節は、目視観察で計数した。その結果を図２８に示した。

図２８に示されたように、対照群では、肺転移性腫瘍結節が多数確認されたが、アジュバント複合体を投与した実験群では、肺の転移が観察されないことを確認した。

（１９．３．アジュバント複合体の局所接種を介した転移がんに対する同所腫瘍に対する抗腫瘍効能の確認）
アジュバント複合体の局所接種を介して、同所（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）腫瘍に対する抗腫瘍効能を示すかを確認するために、一次的にＣ５７ＢＬ／６マウスを呼吸器麻酔で麻酔した。次に、胸部皮膚の右側を切開した後、肺葉の右側にＴＣ－１細胞５×１０^５細胞を接種した。次に、３日後にアジュバント複合体をＬｏｎｇ－Ｅ７ペプチドとともに混合して、３日間隔で４回皮下単一接種した。次に、最後の接種３日後にマウスを安楽死させた後、肺を摘出し、摘出された肺は、切片して、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。その結果を図２９に示した。

図２９に示されたように、肺に直接接種された腫瘍細胞は、何も処理しない対照群では、攻撃的に成長したが、アジュバント複合体を投与した実験群では、腫瘍の成長が完全に阻害されたことを確認した。

前記結果を通じて、動力学的に作用アジュバント複合体の局所投与方式でも全身抗腫瘍免疫反応を生成して、効果的に抗腫瘍効果を示すことを確認することができた。

［実施例２０：アジュバント複合体と免疫チェックポイント阻害剤療法または化学療法との組み合わせを介した抗腫瘍効能の確認］
アジュバント複合体の免疫活性化作用を介して、多様な抗がん治療に対する治療効果を向上させることができるかを確認するために、実験を行った。

（２０．１．アジュバント複合体と免疫チェックポイント阻害剤療法の組み合わせを介した抗腫瘍効能の確認）
アジュバント複合体と免疫チェックポイント阻害剤療法（ＩＣＢＴ ｔｈｅｒａｐｙ）の組み合わせを介した抗腫瘍効能を確認するために、一次的にＴＣ－１細胞５×１０^５細胞をマウスの右脇腹に皮下接種して、がん動物モデルを作製した。次に、４日後に、アジュバント複合体とＬｏｎｇ－Ｅ７ペプチドを混合して、３日間隔で６回皮下に単一接種した。次に、抗ＰＤ－Ｌ１は、２日間隔で８回腹腔内投与した。最後の投与３日後に、腫瘍組織内のＰＤ－Ｌ１の発現程度を確認し、腫瘍サイズおよび生存の有無は、持続的に確認した。その結果を図３０に示した。

図３０に示されたように、アジュバント複合体と免疫チェックポイント阻害剤療法を組み合わせた場合に、ＰＤ－Ｌ１の発現が顕著に増加し、がんの成長も、効果的に抑制されることを確認した。また、アジュバント複合体と免疫チェックポイント阻害剤療法を組み合わせた場合には、１２０日以上生存することを確認した。前記結果を通じて、アジュバント複合体は、腫瘍微小環境で細胞毒性リンパ球の活性増加とＩＦＮ－γ分泌増加を誘導することによって、ＰＤ－Ｌ１の発現を増加させ、腫瘍微小環境内で免疫反応を調節することによって、免疫チェックポイント阻害剤療法による抗がん効果をさらに増加させることを確認することができた。

（２０．２．アジュバント複合体と化学療法の組み合わせを介した抗腫瘍効能の確認）
アジュバント複合体と化学療法（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）の組み合わせを介した抗腫瘍効能を確認するために、一次的にＴＣ－１細胞５×１０^５細胞をマウスの右脇腹に皮下接種して、がん動物モデルを作製した。次に、４日後に、アジュバント複合体とＬｏｎｇ－Ｅ７ペプチドを混合して３日間隔で５回皮下に単一接種した。次に、ドキソルビシンリポソーム剤形（８０μｇ）は、６日間隔で２回静脈注射した。次に、腫瘍サイズおよび生存の有無を持続的に確認した。その結果を図３１に示した。

図３１に示されたように、アジュバント複合体と化学療法を組み合わせた場合に、がんの成長が効果的に抑制されることを確認した。また、アジュバント複合体と免疫チェックポイント阻害剤療法を組み合わせた場合には、１６０日以上生存することを確認した。前記結果を通じて、アジュバント複合体と化学療法との併用療法を介して効果的にがんを治療できることを確認することができた。

前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を持った者は、本発明の技術的思想でも必須の特徴を変更しなくて他の具体的な形態で容易に変形が可能だということを理解できるはずである。
したがって以上で記述した実施例は、すべての点で例示的なものであり限定的ではないと理解すべきである。

本発明の動力学的に作用するアジュバントアンサンブル組成物は、２種以上の免疫活性化物質が同時に投与された時、一定の時間間隔をおいて作用する動力学的アンサンブルを提供することによって、免疫学的反応のシナジー効果を最大化することができるだけでなく、薬物伝達体に多様な機能性薬物を容易に含ませて順次に分泌されるように調節することによって、アジュバントを用いて治療できる多様な疾患に適用が可能であるだけでなく、治療効果を顕著に増加させることができる。

Claims (20)

1. 動力学的に作用するアジュバントアンサンブル組成物であって、
   前記組成物が、２種以上のアジュバントを含んでおり、
   第１アジュバントが、免疫細胞受容体と最初に結合して一次免疫反応を誘導し、
   第２アジュバントが、活性化部位に切断可能なリンカー（ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）が結合している結合体であり、順次に免疫細胞受容体と結合して二次免疫反応を誘導することを特徴とする、
   アジュバントアンサンブル組成物。
2. 前記動力学的作用が、
   第２アジュバントの活性化部位に切断可能なリンカーが結合されており、不活性化（ｉｎａｃｔｉｖｅ）状態が維持され、２～１２時間以内に活性化部位をブロッキングしていた切断可能なリンカーが切断されて、免疫活性化物質の活性が時間的に遅延して現れることを特徴とする、
   請求項１に記載のアジュバントアンサンブル組成物。
3. 前記切断可能なリンカーが、ジスルフィド（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）、カルバメート（ｃａｒｂａｍａｔｅ）、ヒドラジン（ｈｙｄｒａｚｉｎｅ）、エステル（ｅｓｔｅｒ）、ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｅ）、アミド（ａｍｉｄｅ）、ヒドラゾン（ｈｙｄｒａｚｏｎｅ）、チオエーテル（ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ）、ホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）、チオケタール（ｔｈｉｏｋｅｔａｌ）およびこれらの組み合わせからなる群から選ばれるいずれか１つ以上の結合を含んでいることを特徴とする、請求項１に記載のアジュバントアンサンブル組成物。
4. 前記切断可能なリンカーが、両方の末端または一方の末端にエチレンオキシド（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）またはエチレングリコール（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のアジュバントアンサンブル組成物。
5. 前記切断可能なリンカーが、酵素、ｐＨ、酸化還元電位（ｒｅｄｏｘ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、温度、超音波、磁性、および光源からなる群から選ばれるいずれか１つ以上の要因によって結合部位の化学的結合が切断されることを特徴とする、請求項１に記載のアジュバントアンサンブル組成物。
6. 前記切断可能なリンカーの末端に、コレステロール、脂質、タンパク質、アミノ酸、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれるいずれか１つ以上の物質が結合していることを特徴とする、請求項１に記載のアジュバントアンサンブル組成物。
7. 前記第２アジュバントが、ナノリポソーム、ナノエマルジョン、ナノミセル、ヒドロゲル、スキャフォールド、固形ナノ粒子および高分子ナノ粒子からなる群から選ばれるいずれか１つ以上の薬物伝達体にローディングされていることを特徴とする、請求項１に記載のアジュバントアンサンブル組成物。
8. 前記薬物伝達体が、第１アジュバントをさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載のアジュバントアンサンブル組成物。
9. 前記薬物伝達体が、免疫細胞の表面またはエンドソームまたはサイトゾル内に存在する受容体と反応するリガンドをさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載のアジュバントアンサンブル組成物。
10. 前記薬物伝達体が、
    トール様受容体アゴニスト、サポニン、抗ウイルス性ペプチド、インフラマソームインデューサ（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ｉｎｄｕｃｅｒ）、ＮＯＤリガンド（ＮＯＤ ｌｉｇａｎｄ）、ＣＤＳリガンド（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ＤＮＡ ｓｅｎｓｏｒ ｌｉｇａｎｄ）、ＳＴＩＮＧ（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇｅｎｅｓ）リガンド、病原菌の外壁成分、アラム（ａｌｕｍ）、脂質（ｌｉｐｉｄｓ）、これらの組み合わせおよびこれらの類似体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）からなる群から選ばれるいずれか１つ以上の免疫活性化物質をさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載のアジュバントアンサンブル組成物。
11. 前記第２アジュバントが、トール様受容体アゴニスト（ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔ）であることを特徴とする、請求項１に記載のアジュバントアンサンブル組成物。
12. 前記第１アジュバントが、トール様受容体アゴニスト、サポニン、抗ウイルス性ペプチド、インフラマソームインデューサ（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ｉｎｄｕｃｅｒ）、ＮＯＤリガンド（ＮＯＤ ｌｉｇａｎｄ）、ＣＤＳリガンド（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ＤＮＡ ｓｅｎｓｏｒ ｌｉｇａｎｄ）、ＳＴＩＮＧ（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇｅｎｅｓ）リガンド、病原菌の外壁成分、アラム（ａｌｕｍ）、脂質（ｌｉｐｉｄｓ）、これらの組み合わせおよびこれらの類似体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）からなる群から選ばれるいずれか１つ以上の免疫活性化物質であることを特徴とする、請求項１に記載のアジュバントアンサンブル組成物。
13. 前記免疫細胞が、抗原提示細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ ｃｅｌｌ）、Ｔ細胞、Ｂ細胞、制御性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ）、ＭＤＳＣ（ｍｙｅｏｌｏｉｄ ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｃｅｌｌｓ）、およびＭ２マクロファージからなる群から選ばれるいずれか１つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載のアジュバントアンサンブル組成物。
14. 請求項１に記載のアジュバントアンサンブル組成物を有効成分として含む、感染性疾患（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、がん（ｃａｎｃｅｒ）、代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）または希少疾患（ｒａｒｅ ｄｉｓｅａｓｅ）の予防または治療用薬学的組成物。
15. 前記薬学的組成物が、抗原、化学抗がん剤、または免疫チェックポイント阻害剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１４に記載の薬学的組成物。
16. 前記抗原が、タンパク質、組換えタンパク質、糖タンパク質、遺伝子、ペプチド、多糖類、脂質多糖類、ポリヌクレオチド、細胞、細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅ）、バクテリアおよびウイルスからなる群から選ばれる１つ以上であることを特徴とする、請求項１５に記載の薬学的組成物。
17. 前記薬学的組成物が、がんの増殖、転移、再発または抗がん治療療法に対する耐性を抑制することを特徴とする、請求項１４に記載の薬学的組成物。
18. 請求項１に記載のアジュバントアンサンブル組成物を有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む、感染性疾患（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、がん（ｃａｎｃｅｒ）、代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）または希少疾患（ｒａｒｅ ｄｉｓｅａｓｅ）の予防または治療方法。
19. 請求項１に記載のアジュバントアンサンブル組成物を有効成分として含む組成物の感染性疾患（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、がん（ｃａｎｃｅｒ）、代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）または希少疾患（ｒａｒｅ ｄｉｓｅａｓｅ）の予防または治療用途。
20. 請求項１に記載のアジュバントアンサンブル組成物の感染性疾患（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、がん（ｃａｎｃｅｒ）、代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）または希少疾患（ｒａｒｅ ｄｉｓｅａｓｅ）の予防または治療に用いられる薬剤を生産するための用途。