CN103319599A

CN103319599A - 一种抗人ErbB2抗体—美登木素偶联物及其应用

Info

Publication number: CN103319599A
Application number: CN2013102024400A
Authority: CN
Inventors: 刘彦君
Original assignee: SHANGHAI JIAOLIAN PHARMACEUTICAL RESEARCH DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI JIAOLIAN PHARMACEUTICAL RESEARCH DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date: 2013-05-27
Filing date: 2013-05-27
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2033-05-27
Also published as: CN103319599B

Abstract

本发明属于生物医药技术领域。本发明提供一种抗人ErbB2抗体与美登木素偶联物，是用亲水氨基酸替换曲妥珠单抗的重链可变区30或/和65位的赖氨酸之后再与美登木素（DM1）偶联，本发明在保持偶联药物活性的基础上降低了偶联药物中美登木素的比例，进而降低了该偶联药物的毒副作用。本发明还提供了该抗人ErbB2抗体与美登木素偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。

Description

一种抗人ErbB2抗体—美登木素偶联物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗人ErbB2抗体与美登木素偶联物及其在医药方面的应用。

背景技术

ErbB族受体酪氨酸激酶是细胞生长、分化和存活的重要介质。该家族包括4个不同的成员：商品生长因子受体（EGFR或ErbB1），Her2（ErbB2），Her3（ErbB3）和Her4（ErbB4）。

Hudziak等在分子细胞生物学9（3）：1165-1172（1989）中描述了一组抗ErbB2抗体的产生，这种方法的特征在于使用人乳腺癌细胞SK-BR-3.在SK-BR-3细胞与抗体接触72小时后，通过细胞单层结晶紫染色测定了细胞的相对增值率。用该试验，最多一只来自被称为4D5的抗体，该抗体可以一直56%的细胞增殖。通过对该抗体的人源化改造获得了曲妥珠单抗（Trastuzumab），临床上用抗ErbB2抗体曲妥珠单抗治疗ErbB2高表达的乳腺癌。临床试验中，曲妥珠单抗对15%的具有2+以上水平的乳腺癌患者产生了临床反应，反应持续中值为9.1个月。（Cobleigh等，临床肿瘤学杂志1996，14:737-744）。1998年9月25日，曲妥珠单抗（商品名Herceptin）被美国食品与药品管理委员会批准上市用于治疗过量表达ErbB2蛋白的恶性乳腺癌患者。曲妥珠单抗虽然挽救了许多乳腺癌患者或延长了患者的生存期。然而，曲妥珠单抗仅对ErbB2高表达的患者才有效果，且临床反应率仅有15%，还需要有更多的患者需要更佳的治疗药物。

为了提高治疗指数，目前将曲妥珠单抗与美登木素偶联，制成trastuzumabemtansine（T-DM1，Kadcyla），用于先前使用曲妥珠单抗、其它抗-HER2治疗药物及常用的乳腺癌治疗一线化疗药物紫杉烷类治疗无效的患者。T-DM1输送药物至肿瘤部位，可以缩小肿瘤，减慢疾病进展并延长生存期。该药物现已成为FDA批准的第四个以HER2蛋白为靶点的药物。通过临床试验，T-DM1的安全性和有效性得到了评价，在该项991名患者参与的临床试验中，患者被随机配给T-DM1，或者配给拉帕替尼加另一种化疗药物卡培他滨。试验中，患者要么在癌症进展以后接受治疗，要么在副作用无法忍受的情况下接受治疗。该临床研究的目的是检测患者的无进展生存期和总生存期。研究结果显示，Kadcyla治疗患者中位无进展生存期为9.6个月，而拉帕替尼+卡培他滨治疗患者中位无进展生存期为6.4个月。Kadcyla治疗组中位总生存期为30.9个月，而拉帕替尼+卡培他滨治疗组中位总生存期为25.1个月。T-DM1在批准时有一项黑框警告，提醒患者与卫生保健专业人员该药物可导致肝毒性，心脏毒性和死亡。这主要是脱落的DM1以及T-DM1进入体内降解释放出的含DM1小分子引起的，因此有必要在保持偶联药物的活性的基础上降低偶联药物中DM1的比例。

T-DM1的制备方法中利用曲妥珠单抗上的赖氨酸的侧链氨基与SMCC偶联然后再与美登木素DM1偶联，每分子曲妥珠单抗上偶联的DM1分子平均为3.5个。曲妥珠单抗上具有88个赖氨酸位点，因此，实际的T-DM1为曲妥珠单抗偶联了不同数目DM1和多种偶联位点的偶联物组合，然而，每种组分的药效、药代动力学属性和安全性都各有不同。通常情况，载药量高的抗体具有更强的体外生物活性，然而，载药量的提高也会带来多聚体成分增加、稳定性下降、毒性增加、免疫原性高、体内清除速度快、半衰期短而实际治疗指数并不高等诸多问题。此外，抗体互补决定簇（complementarity－determining regions，CDR）或其附近的赖氨酸被偶联也会影响抗体与抗原的结合，从而降低了该偶联物的药效。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗人ErbB2抗体与美登木素偶联物，该偶联物在保持偶联药物活性的基础上降低了偶联药物中美登木素（DM1）的比例，进而降低了该偶联药物的毒副作用。

本发明的另一目的在于提供该抗人ErbB2抗体与美登木素偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明意在降低曲妥珠抗体与DM1偶联过程对ErbB2抗原结合的影响，并提高曲妥珠单抗偶联美登木素DM1产品的均质性。

从曲妥珠单抗与ErbB2的晶体结构（蛋白质数据库编号1N8Z）分析，曲妥珠单抗的重链和轻链可变区的赖氨酸与ErbB2并没有直接的强相互作用，然而由于重链30位和65位的赖氨酸侧链靠近ErbB2，且侧链向ErbB2方向伸展，这2个赖氨酸的侧链氨基偶联上DM1后，会形成非常巨大的侧链伸展，从而影响到抗体与抗原的结合。曲妥珠单抗的重链可变区30和65位的赖氨酸，都处在抗体蛋白分子表面，且非抗体框架结构，用亲水氨基酸替换并不会使蛋白的骨架结构发生变化，进而影响结构的稳定性和对ErbB2的结合活性。

美登木素“DM1”的化学结构式如下：

本发明的主要技术方案是：用亲水氨基酸替换曲妥珠单抗的重链可变区30或/和65位的赖氨酸，包括电荷性质相对保守的精氨酸，电荷性质相反的天冬氨酸和谷氨酸，弱电荷的组氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺，也包括不带电荷的丝氨酸等。

更优选方案是由曲妥珠单抗的重链可变区的30位的赖氨酸被精氨酸、谷氨酸替换，同时，第65位的赖氨酸被天冬氨酸、谷氨酰胺或丝氨酸替换。消除了抗体被DM1偶联对结合抗原的影响，同时偶联物的均质性有了一定程度的提高。

本发明首先制备得到曲妥珠抗体突变体，之后再制备得到曲妥珠抗体突变体与美登木素（DM1）的偶联物，优选的曲妥珠抗体突变体与DM1的偶联，每分子抗体平均偶联的DM1为1-4，更优选的方案是每分子抗体平均偶联的DM1为2.5-3.5分子。

曲妥珠抗体突变体与DM1的偶联物的化学结构式如下：

本发明的第一方面，是提供了一种抗人ErbB2抗体—美登木素偶联物（即抗人ErbB2抗体与美登木素偶联的偶联物），所述的抗人ErbB2抗体，是含有30和/或65位的赖氨酸被亲水氨基酸替换的曲妥珠单抗的重链可变区，

所述的亲水氨基酸包括但不限于，谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸和丝氨酸。

较优的，所述的抗人ErbB2抗体，是曲妥珠单抗的重链可变区的30位的赖氨酸被精氨酸或谷氨酸替换；

较优的，所述的抗人ErbB2抗体，是曲妥珠单抗的重链可变区的65位的赖氨酸被天冬氨酸、谷氨酰胺或丝氨酸替换。

最优的，所述的抗人ErbB2抗体，是曲妥珠单抗的重链可变区的30位的赖氨酸被谷氨酸替换；且曲妥珠单抗的重链可变区的65位的赖氨酸被丝氨酸替换，氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

所述的一种抗人ErbB2抗体—美登木素偶联物，其中的抗人ErbB2抗体:美登木素的摩尔比为1:1.5～1:4，较优的为1:2.5～1:3.5。

本发明的第二方面，是提供了一种抗人ErbB2抗体—美登木素偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。

该应用具体是指，制备治疗ErbB2阳性(ErbB2靶向)的肿瘤的药物。

本发明的有益效果是消除了抗体被DM1偶联对结合抗原的影响，同时偶联物的均质性有了一定程度的提高。

本发明经表面等离子共振技术表明曲妥珠单抗重链的30和65位的赖氨酸被替换为其他亲水氨基酸并不会改变其与Her2受体的结合力，但是这2个位点突变后将失去与DM1偶联的机会，进而减少这2个位点被DM1偶联形成的异构体，产品的均质性得到一定程度的提高；经体外生物活性实验表明，曲妥珠单抗突变体JL-06（K30D-K65S）平均偶联3.2个DM1分子的抗体药物偶联物比曲妥珠单抗平均偶联3.5分子DM1的抗体药物偶联物（T-DM1）的抑制SK-BR-3细胞增殖的作用更强。药效学动物实验中，JL-06（K30E-K65S）的15mg/kg体重剂量组抑制裸鼠SK-BR-3细胞的增殖作用强于T-DM1的15mg/kg体重剂量组。体外、体内试验都证明了突变曲妥珠单抗重链上的30和65位赖氨酸有助于提高了其与药物偶联后生物活性。

本发明的详细描述：

除非另作说明，本文中科学术语的意义与本领域的常规理解相同。Singleton等，微生物学和分子生物学词典，第二版，J.Wiley&Sons(New York,NY1994)。本领域技术人员将会看出，还有许多鱼本文所述相似或等效的方法和材料可用于本发明。实际上本发明并不局限于后文所述的方法和材料。本发明中术语的含义如下：

“ErbB”指的是属于ErbB受体家族的酪氨酸激酶受体蛋白，包括ErbB1（EGFR），ErbB2，ErbB3和ErbB4。该定义特别包括相应的ErbB癌基因剪接形式所编码的ErbB受体，包括但不限于ErbB2缺失突变体。ErbB受体一般包括一个结合ErbB的胞外区；亲脂性跨膜区；保守的胞内酪氨酸激酶区；和包含数个可磷酸化酪氨酸残基的羧基末端信号区。所述的ErbB受体可以是天然的ErbB受体或其功能性衍生物，例如氨基酸序列突变体，优选的是天然的人ErbB受体。

ErbB2或Her2在本文中通用，都标示天然序列的人Her2蛋白，间Semba等，PNAS82:6497-6501（1985）和Yamamoto等，自然319:230-234（1986）（Genebank登录号X03363），及其功能性衍生物。

天然或者天然序列的ErbB2可以分离自大自然，也可以用重组DNA技术、化学合成法，或以上及类似技术的联合制得。

曲妥珠单抗，即Trastuzumab，为鼠源的抗人HER2抗体4D5的重组人源化型式，如美国专利5,821,337。

功能性衍生物包括氨基酸序列突变体，以及天然多肽的共价衍生物，条件是保留了与天然多肽相当的生物活性。氨基酸序列突变体与天然氨基酸序列的差异一般在于天然氨基酸序列中的一个活多个氨基酸被取代或在多肽序列中缺失和/或插入一个或多个氨基酸。缺失突变体包括天然多肽的片段和N端和/或C端截短突变体。通常氨基酸序列突变体与天然序列相比至少具有70%以上的同源性。

同源性指氨基酸序列排列比对后相同氨基酸残基的百分比。用于序列排列比对的方法和程序都是本领域所熟知的。如BLAST，Fasta。

ErbB的过量表达是指癌细胞表面的ErbB受体（例如Her2）水平明显高于同类组织费癌性细胞。这样的过量表达可能是因为基因扩增或转录和翻译的增强所致。ErbB受体过量表达可以在诊断或预后试验中通过测定（例如通过免疫组化实验IHC）细胞表面ErbB蛋白质水平升高来判断，也可以通过测定细胞中ErbB编码核酸的水平，或通过测定血清等生物液中脱落的抗原来研究ErbB的过量表达。

可以根据每个细胞表达的Her2分子拷贝数将过量表达的Her2的肿瘤进行免疫组化评分并进行生物化学分级：0=1-10000拷贝/细胞，1+=至少约200000拷贝/细胞。2+=至少约500000拷贝/细胞，3+=至少约2000000拷贝/细胞。3+水平的Her2过量表达可引起酪氨酸激酶的非配体依赖性激活，可见于30%的乳腺癌，这些患者的存活率低，复发率高。

抗体在此取其最广义的解释，具体包括完整的单克隆抗体，多克隆抗体，双特异抗体以及抗体片段，只要他们具有所需的生物活性。

单克隆抗体或单抗指的是该抗体来自一群基本均已抗体，即构成该集群的各抗体完全相同，出了可能存在的少量天然突变或在抗体表达制备过程中产生的异构体。单克隆抗体具有针对单一抗原的高度特异性。而多克隆抗体则包含了针对不同决定簇的不同抗体，每个单克隆抗体只针对抗原的一个决定簇。

本发明中，单克隆抗体还特别包含嵌合抗体及其片段，即抗体的重链和/或轻链的一部分来自于某种、某类或某亚类，其余部分则与另一种、类或亚类。抗体片段包括抗体的一部分，最佳的是抗原结合区或可变区。如Fab，Fab的一部分，Fab2或者Fab的一部分的二聚体形式，甚至是Fv片段。

本文中的偶联或交联，源于conjugate一词，指通过一步或多步化学反应使小分子化合物与抗体氨基酸残基上特定基团进行共价结合。

附图说明

图1是Trastuzumab、T-DM1和JL-06-DM1对SK-BR-3细胞生长抑制曲线；

图2是人乳腺癌BT-474裸小鼠移植瘤的实验治疗作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的应用范围。

实施例1：抗Her2抗体Trastuzumab构建表达

全基因合成编码Trastuzumab重链和轻链的DNA片段，分别克隆至抗体重轻链表达载体PL101（刘彦君等，中国专利CN200610117245.8，发明名称为“抗Her2/ErbB2抗原的单克隆抗体及其制备方法和药物组合物”，公告号为CN101165068B）上，酶切和连接的操作按商业提供的试剂盒说明书进行。

Trastuzumab抗体重链氨基酸序列1-449如SEQ ID NO:1所示；

Trastuzumab抗体重链氨基酸序列1-214如SEQ ID NO:2所示。

将上述构建好的Trastuzumab重链和轻链表达载体分别转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆接种于500ml LB培养基中扩增。利用Qiagen公司超纯质粒纯化试剂盒（Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit），按照生产商说明书抽提纯化DNA。采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒将上述含重链和轻链编码序列的质粒DNA以一定比例共转染入CHO-K1（中国仓鼠卵巢细胞，购自ATCC），操作方法按照生产商说明书进行。

转染后24-48小时将细胞培养基更换为含筛选药物的筛选培养基，每3-4天更换筛选培养基一次直至细胞克隆形成。待细胞克隆直径达1-2mm时用克隆环从平板上挑取单克隆转接入24孔板中。单细胞克隆在24孔板中长至50-70%满层时，取各克隆的培养上清进行ELISA检测，选取表达量高的细胞克隆进行药物加压扩增筛选。待筛选药物的浓度上升至最高时检测各克隆单细胞的表达量，选取表达量高且细胞生长状态良好的细胞进行扩增培养。收集重组细胞培养上清，用protein A亲合层析的方法纯化后用于功能评价。

将包板抗体（抗人IgG1重链的特异性单克隆抗体）用包被液(pH9.6CBS)稀释到一定浓度（0.5ug/ml）后包被于96孔板上，100ul/孔，于2～8℃放置过夜。弃去孔中液体，用PBST洗3次，甩干后加入400μl/孔的封闭液(1%BSAPBST)，室温2hr，再用PBST洗3次，甩干。用稀释液稀释标准品至一定浓度，表达上清根据情况适当稀释，以100μl/孔复孔加样至96孔板中，37℃孵育1hr，弃液，洗板3次，甩干。用稀释液稀释酶联抗体（HRP-抗人IgG k轻链特异性抗体）至一定浓度(1：2000)，以100μl/孔加至96孔板中，37℃下反应1hr，弃液，洗板3-6次，甩干。配制底物混合液，以100μl/孔加入到96孔板中，37℃孵育20min。加入终止液50μl/孔，终止反应。在490nm处读取吸收值OD，根据标准曲线计算样品的含量。

实施例2：Trastuzumab突变体重链K30R（JL-01）

利用常规分子生物学技术对全基因合成编码Trastuzumab重链的DNA片段进行定点突变，将Trastuzumab突变体重链K30R克隆至抗体重链表达载体上，酶切和连接的操作按商业提供的试剂盒说明书进行。

Trastuzumab突变体重链K30R（JL-01）氨基酸序列1-449如SEQ ID NO:3所示；

将上述构建好的Trastuzumab突变体重链K30R表达载体转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆接种于500ml LB培养基中扩增。利用Qiagen公司超纯质粒纯化试剂盒（Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit），按照生产商说明书抽提纯化DNA。采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒将上述含Trastuzumab突变体重链K30R和野生型轻链编码序列的质粒DNA以一定比例共转染入CHO-K1（中国仓鼠卵巢细胞，购自ATCC），操作方法按照生产商说明书进行。

实施例3：Trastuzumab突变体重链K65D（JL-02）

利用常规分子生物学技术对全基因合成编码Trastuzumab重链的DNA片段进行定点突变，将Trastuzumab突变体重链K65D克隆至抗体重链表达载体上，酶切和连接的操作按商业提供的试剂盒说明书进行。

Trastuzumab突变体重链K65D（JL-02）氨基酸序列1-449如SEQ ID NO:4所示；

将上述构建好的Trastuzumab突变体重链K65D表达载体转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆接种于500ml LB培养基中扩增。利用Qiagen公司超纯质粒纯化试剂盒（Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit），按照生产商说明书抽提纯化DNA。采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒将上述含Trastuzumab突变体重链K65D和野生型轻链编码序列的质粒DNA以一定比例共转染入CHO-K1（中国仓鼠卵巢细胞，购自ATCC），操作方法按照生产商说明书进行。

实施例4：Trastuzumab突变体（重链K30E）（JL-03）

利用常规分子生物学技术对全基因合成编码Trastuzumab重链的DNA片段进行定点突变，将Trastuzumab突变体重链K30E克隆至抗体重链表达载体上，酶切和连接的操作按商业提供的试剂盒说明书进行。

Trastuzumab突变体重链K30E（JL-03）氨基酸序列1-449如SEQ ID NO:5所示；

将上述构建好的Trastuzumab突变体重链K30E表达载体转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆接种于500ml LB培养基中扩增。利用Qiagen公司超纯质粒纯化试剂盒（Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit），按照生产商说明书抽提纯化DNA。采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒将上述含Trastuzumab突变体重链K30E和野生型轻链编码序列的质粒DNA以一定比例共转染入CHO-K1（中国仓鼠卵巢细胞，购自ATCC），操作方法按照生产商说明书进行。

实施例5：Trastuzumab突变体（重链K65Q）（JL-04）

利用常规分子生物学技术对全基因合成编码Trastuzumab重链的DNA片段进行定点突变，将Trastuzumab突变体重链K65Q克隆至抗体重链表达载体上，酶切和连接的操作按商业提供的试剂盒说明书进行。

Trastuzumab突变体重链K65Q（JL-04）氨基酸序列1-449如SEQ ID NO:6所示；

将上述构建好的Trastuzumab突变体重链K65Q表达载体转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆接种于500ml LB培养基中扩增。利用Qiagen公司超纯质粒纯化试剂盒（Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit），按照生产商说明书抽提纯化DNA。采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒将上述含Trastuzumab突变体重链K65Q和野生型轻链编码序列的质粒DNA以一定比例共转染入CHO-K1（中国仓鼠卵巢细胞，购自ATCC），操作方法按照生产商说明书进行。

实施例6：Trastuzumab突变体（重链K30R-K65D）（JL-05）

利用常规分子生物学技术对Trastuzumab突变体重链K30R（实施例2）的DNA片段进行定点突变，将Trastuzumab突变体重链K30R-K65D克隆至抗体重链表达载体上，酶切和连接的操作按商业提供的试剂盒说明书进行。

Trastuzumab突变体重链K30R-K65D（JL-05）氨基酸序列1-449如SEQ IDNO:7所示；

将上述构建好的Trastuzumab突变体重链K30R-K65D表达载体转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆接种于500ml LB培养基中扩增。利用Qiagen公司超纯质粒纯化试剂盒（Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit），按照生产商说明书抽提纯化DNA。采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒将上述含Trastuzumab突变体重链K30R-K65D和野生型轻链编码序列的质粒DNA以一定比例共转染入CHO-K1（中国仓鼠卵巢细胞，购自ATCC），操作方法按照生产商说明书进行。

实施例7：Trastuzumab突变体（重链K30E-K65S）（JL-06）

利用常规分子生物学技术对Trastuzumab突变体重链K30E（实施例4）的DNA片段进行定点突变，将Trastuzumab突变体重链K30E-K65S克隆至抗体重链表达载体上，酶切和连接的操作按商业提供的试剂盒说明书进行。

Trastuzumab突变体重链K30E-K65S（JL-06）氨基酸序列1-449如SEQ IDNO:8所示；

将上述构建好的Trastuzumab突变体重链K30E-K65S表达载体转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆接种于500ml LB培养基中扩增。利用Qiagen公司超纯质粒纯化试剂盒（Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit），按照生产商说明书抽提纯化DNA。采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒将上述含Trastuzumab突变体重链K30E-K65S和野生型轻链编码序列的质粒DNA以一定比例共转染入CHO-K1（中国仓鼠卵巢细胞，购自ATCC），操作方法按照生产商说明书进行。

实施例8：抗Her2抗体Trastuzumab及其突变体与Her2亲和力测定

用Biacore3000控制软件Wizard中的氨基偶联方法将Her2膜外区蛋白偶联到CM5芯片上。分别用HBS-P缓冲液（10mM HEPES,150mM NaCl,3mMEDTA,0.005%(v/v)surfactant P20,pH7.4）稀释抗体到浓度为10、5.0、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156nM进样，检测不同浓度her2抗体与Her2的结合活性。得到的数据根据Biacore3000分析软件中的1∶1Langmuir结合模型进行拟合，得到确切的动力学常数。

表1：Her2抗体biacore测定亲和常数

根据表1的测定结果可见，抗体突变后对Her2抗原的结合没有发生变化。

实施例9：抗Her2抗体Trastuzumab交联DM1

抗体用缓冲液A经10倍体积超滤换液，缓冲液A：50mM磷酸氢二钾-磷酸二氢钾，50mM的NaCl，2mM的EDTA，pH6.5，抗体最终浓度为10mg/mL，加入氩气充满保护。用1.5ml的20mM浓度的smcc（溶于DMSO或DMA），加入到20ml的抗her2抗体溶液中，室温，反应4小时。用Sephadex G25凝胶柱过滤反应混合物，该柱先用缓冲液A以5倍柱体积平衡。

抗Her2抗体-SMCC与DM1的偶联：

用前述的SMCC修饰后抗体以缓冲液A稀释到3mg/ml最终浓度，62ml。然后在抗体稀释液中加入1.7ml的DMA溶解的DM1溶液（4.0mM）。在氩气保护下、室温反应16小时。将反应液经Superdex200层析，收集主峰。通过测定252nm和280nm处的吸光度来测定每个抗体分子平均连接的DM1个数，发现每个抗体分子平均连接药物约3.5个。

实施例10：抗Her2抗体JL-01、JL-02、JL-03、JL-04、JL-05、JL-06交联DM1

抗体用缓冲液A经10倍体积超滤换液，缓冲液A：50mM磷酸氢二钾-磷酸二氢钾，50mM的NaCl，2mM的EDTA，品H6.5，抗体最终浓度为10mg/mL，加入氩气充满保护。用1.2ml的20mM浓度的smcc（溶于DMSO或DMA），加入到20ml的抗her2抗体溶液中，室温，反应2-4小时。用Sephadex G25凝胶柱过滤反应混合物，该柱先用缓冲液A以5倍柱体积平衡。SMCC修饰后抗体以缓冲液A稀释到3mg/ml最终浓度，共61ml。然后在抗体稀释液中加入1.5ml的DMA溶解的DM1溶液（浓度为4mM）。在氩气保护下、室温反应16小时。将反应液经Superdex200层析，收集主峰。通过测定252nm和280nm处的吸光度来测定每个抗体分子平均连接的DM1个数，发现每个抗体分子平均连接药物约3.2个。

实施例11：抗体偶联药物测活

SK-BR-3细胞以1×10⁵cells/ml种板，100ul/孔，过夜。交联药物对照品和样品均以200ug/ml为起始浓度，4倍比稀释度，共10个浓度梯度，每孔加入100ul。在37℃，5％CO₂培养。5天后，每孔分别加入15ul Alamar Blue染色，37℃，5％CO₂染色6hr读值（顶读）。荧光读数：530nm（激发）/590nm（发射）波长读数。利用计算机四参数方程软件进行拟合计算抑制半效浓度EC50值。

测活结果如图1所示，Trastuzumab没有显示出明显的细胞增长抑制，Trastuzumab-DM1（T-DM1）和JL-06-DM1均表现出较强的细胞杀伤作用，EC50值分别为0.0273ug/ml和0.0234ug/ml，JL-06-DM1的载药量仅为3.2，而T-DM1的载药量为3.5，在降低载药量的同时实现了活性提高15%，减少药物的用量非常有利于减轻抗体偶联药物的毒副作用，同时还提高了对肿瘤细胞的抑制率，是非常有潜力的抗Her2抗体交联药物。

实施例12：Her2抗体交联药物对人乳腺癌BT-474裸小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用

BALB/cA裸小鼠，雌性，4-5周龄，体重19±2g，每组动物数：阴性对照组12只，给药组6只。人乳腺癌BT-474细胞株接种裸小鼠右侧腋窝皮下，细胞接种量为5×10⁶/只，形成移植瘤后再在裸小鼠体内传2代后使用。取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm³左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠皮下移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm³后将动物随机分组。15mg/kg的Trastuzumab、15mg/kg的Trastuzumab-DM1和15mg/kg的JL-06-DM1，各组均每周静脉给药两次，连续给药3周。溶剂对照组则给等量生理盐水。整个实验过程中，每周2次测量移植瘤直径，同时称量小鼠体重。肿瘤体积(tumor volume,TV)的计算公式为：TV=1/2×a×b²，其中a、b分别表示长、宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积（relative tumor volume，RTV），计算公式为：RTV=V_t/V₀。其中V₀为分笼给药时(即d₀)测量所得肿瘤体积，V_t为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为肿瘤抑制率，计算公式如下：肿瘤抑制率%=(V0-Vt)/V0×100%；

实验结果如图2所示，Trastuzumab单用15mg/kg组，每周静脉给药两次，连续给药三周，对人乳腺癌BT-474裸小鼠移植瘤有较好的抑制作用，第21天所得肿瘤抑制率42.35%。Trastuzumab-DM1和JL-06-DM1以15mg/kg剂量，每周静脉给药两次，连续给药三周，对人乳腺癌BT-474裸小鼠移植瘤都有显著抑制作用，第21天肿瘤抑制率分别为86.50%和95.71%。给药期间，各给药组小鼠状态较好，无小鼠死亡。

小鼠移植肿瘤模型试验表明JL-06-DM1相比Trastuzumab-DM1虽然偶联了较少的活性分子DM1，但却有着更强的对Her2阳性乳腺癌肿瘤细胞杀伤活性。

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