CN104334579A - 抗c-met抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

一种抗c-Met抗体或抗体片段和包含其的药物组合物，以及一种用于通过对受试者施用该抗体来预防和治疗癌症的方法。

Description

抗C-MET抗体及其用途
发明领域
本公开涉及一种抗c-Met抗体和包含其的、用于预防和治疗癌症的药物组合物。
发明背景
c-Met是肝细胞生长因子(HGF)的受体，该细胞因子是一种结合c-Met受体酪氨酸激酶的胞外区以诱导各种正常细胞和肿瘤细胞的细胞分裂、移动、形态发生和血管发生的细胞因子。c-Met是存在于细胞表面上的一种代表性的受体酪氨酸激酶，其本身是原癌基因，且有时独立于配体HGF而牵涉到与癌症有关的多种机制如癌症形成、转移、迁移、侵入和血管发生中。因此，c-Met最近显现为抗癌疗法的新靶物。
具体而言，已知c-Met涉及诱导针对普遍使用的抗癌药物的抗性，如此被视为对于个性化治疗是重要的。靶向表皮生长因子受体EGFR(ERBB1)的代表性抗癌治疗药物，即爱必妥(Erbitux)或特罗凯(Tarceva)，通过阻断与癌症形成有关的信号传导来起作用。另外，作为乳腺癌治疗药物而众所周知的赫塞汀(Herceptin)靶向ERBB2(HER2)且通过阻断细胞增殖所需的信号转导来起作用。在对上述药物有抗性的患者中，诱导细胞增殖的信号转导途径由于c-Met的过表达而未受阻断。因此，c-met已成为许多药物公司的感兴趣的靶物。但仍需要另外的抗c-Met抗体和相关方法和组合物。
发明概述
本发明提供一种抗c-Met抗体或其抗原结合片段。在一个方面，所述抗c-Met抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其包含至少一种选自下组的重链互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-H2、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H3；还包含轻链可变区，其包含至少一种选自下组的轻链CDR：具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L2、和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L3，其中SEQ ID NO:4至9分别由本文中描述的式I至VI代表。在另一个方面，所述抗c-Met抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其包含至少一种选自下组的重链互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H2、和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3；还包含轻链可变区，其包含至少一种选自下组的轻链CDR：具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L2、和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L3，其中SEQ ID NO:7至9分别由本文中描述的式IV至VI代表。本发明还提供编码所述抗体和抗体片段的核酸。
本发明还提供包含抗c-Met抗体或其抗原结合片段的药物组合物，通过施用所述抗体或其抗原结合片段来预防或治疗癌症的方法，以及相关方法和组合物。
附图简述
这些和/或其他方面将从对以下实施方案的描述连同伴随的附图变得更加明显和更容易领会，附图中：
图1显示使用重叠延伸PCR来获得huAbF46抗体的scFv基因库，其中目标CDR已突变；
图2是BrdU(％)对抗体浓度所绘的图，其显示BrdU测定法中huAbF46-H4-A1、huAbF46-H4-A2、huAbF46-H4-A3和huAbF46-H4-A5抗体的c-Met激动(agonistic)效果；
图3是相对细胞活力(％)对抗体浓度所绘的图，其显示huAbF46-H4-A1、huAbF46-H4-A2、huAbF46-H4-A3和huAbF46-H4-A5抗体对体外细胞增殖的影响；
图4是Akt磷酸化(％)对治疗抗体所绘的图，其显示huAbF46-H4-A1、huAbF46-H4-A2、huAbF46-H4-A3和huAbF46-H4-A5抗体的激动作用程度；
图5例示huAbF46-H4-A1、huAbF46-H4-A2、huAbF46-H4-A3和huAbF46-H4-A5抗体的抗癌效果，如通过c-Met的降解程度测量的；
图6A和6B是肿瘤体积对时间(天数)所绘的图，其显示各种浓度的huAbF46-H4-A1抗体在U87MG脑癌小鼠异种移植模型或MKN45胃癌小鼠异种移植模型中的体内抗癌效果；
图7是相对细胞活力(％)对抗体浓度所绘的图，其显示huAbF46-H4-A1(U6-HC7)、huAbF46-H4-A1(IgG2铰链)和huAbF46-H4-A1(IgG2Fc)抗体对体外细胞增殖的影响；
图8A和8B是Akt磷酸化(％)对治疗抗体所绘的图，其显示这些抗体的激动作用程度。图8A显示huAbF46-H4-A1(U6-HC7)、huAbF46-H4-A1(IgG2铰链)和huAbF46-H4-A1(IgG2Fc)抗体所致的Akt磷酸化程度，而图8B显示huAbF46-H4-A1(IgG2Fc)和L3-11Y抗体所致的Akt磷酸化程度；
图9A和9B例示抗体的抗癌效果，如通过c-Met的降解程度测量的。图9A显示huAbF46-H4-A1(U6-HC7)、huAbF46-H4-A1(IgG2铰链)和huAbF46-H4-A1(IgG2Fc)抗体所致的c-Met降解程度，而图9B显示huAbF46-H4-A1(IgG2Fc)和L3-11Y抗体所致的c-Met降解程度；和
图10A和10B是肿瘤体积对时间(天数)所绘的图，其显示huAbF46-H4-A1(U6-HC7)、huAbF46-H4-A1(IgG2铰链)和huAbF46-H4-A1(IgG2Fc)抗体在U87MG脑癌小鼠异种移植模型或MKN45胃癌小鼠异种移植模型中的体内抗癌效果。
发明详述
现将对实施方案进行详细提述，其例子例示在伴随的附图中，其中同样的参照编号始终指同样的要素。在此方面，本申请实施方案可以具有不同的形式且不应理解为限制本文中所述的说明。因此，参照附图在下文对实施方案的描述仅为解释本说明书的各方面。如本文中使用的，术语“和/或”包括一种或多种所列关联项目的任意和所有组合。表述如“至少一个/种”在要素列表之前时，修饰整个要素列表而并非修饰该列表中的单个要素。
依照一个实施方案，提供一种抗c-Met抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：重链可变区，其包含至少一种选自下组的重链互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-H2、和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变区，其包含至少一种选自下组的轻链CDR：具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L2、和具有SEQ IDNO:9的氨基酸序列的CDR-L3，其中SEQ ID NO:4至9分别由下式I至VI代表：
式I
Xaa1-Xaa2-Tyr-Tyr-Met-Ser(SEQ ID NO:4)
式II
Arg-Asn-Xaa3-Xaa4-Asn-Gly-Xaa5-Thr(SEQ ID NO:5)
式III
Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa6-Tyr(SEQ ID NO:6)
式IV
Lys-Ser-Ser-Xaa7-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa8-Gly-Asn-Xaa9-Xaa10-Asn-Tyr-Leu-Ala(SEQ ID NO:7)
式V
Trp-Xaa11-Ser-Xaa12-Arg-Val-Xaa13(SEQ ID NO:8)
式VI
Xaa14-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa15-Pro-Xaa16-Thr(SEQ ID NO:9)
在式I中，Xaa1是Pro或Ser或不存在，而Xaa2是Glu或Asp。
在式II中，Xaa3是Asn或Lys，Xaa4是Ala或Val，而Xaa5是Asn或Thr。
在式III中，Xaa6是Ser或Thr。
在式IV中，Xaa7是His、Arg、Gln或Lys，Xaa8是Ser或Trp，Xaa9是His或Gln，而Xaa10是Lys或Asn。
在式V中，Xaa11是Ala或Gly，Xaa12是Thr或Lys，而Xaa13是Ser或Pro。
在式VI中，Xaa14是Gly、Ala或Gln，Xaa15是Arg、His、Ser、Ala、Gly或Lys，而Xaa16是Leu、Tyr、Phe或Met。
例如，CDR-H1可以是具有选自由SEQ ID NO:22至24的氨基酸序列组成的组的一种氨基酸序列的多肽，CDR-H2可以是具有SEQ ID NO:25或26的氨基酸序列的多肽，而CDR-H3可以是具有SEQ ID NO:27或28的氨基酸序列的多肽。
还有，CDR-L1可以是具有选自由SEQ ID NO:29-33和71的氨基酸序列组成的组的一种氨基酸序列的多肽，CDR-L2可以是具有选自由SEQ ID NO:34-36的氨基酸序列组成的组的一种氨基酸序列的多肽，而CDR-L3可以是具有选自由SEQ ID NO:13-16的氨基酸序列组成的组的一种氨基酸序列的多肽或具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的多肽。
依照另一个实施方案，提供一种抗c-Met抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变区，其包含至少一种选自下组的重链互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H2、和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变区，其包含至少一种选自下组的轻链CDR：具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L2、和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L3，其中SEQ ID NO:7至9分别由下式IV至VI代表：
式IV
Lys-Ser-Ser-Xaa7-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa8-Gly-Asn-Xaa9-Xaa10-Asn-Tyr-Leu-Ala(SEQ ID NO:7)
式V
Trp-Xaa11-Ser-Xaa12-Arg-Val-Xaa13(SEQ ID NO:8)
式VI
Xaa14-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa15-Pro-Xaa16-Thr(SEQ ID NO:9)
在式IV中，Xaa7是His、Arg、Gln或Lys，Xaa8是Ser或Trp，Xaa9是His或Gln，而Xaa10是Lys或Asn。
在式V中，Xaa11是Ala或Gly，Xaa12是Thr或Lys，而Xaa13是Ser或Pro。
在式VI中，Xaa14是Gly、Ala或Gln，Xaa15是Arg、His、Ser、Ala、Gly或Lys，而Xaa16是Leu、Tyr、Phe或Met。
例如，所述轻链可变区可具有至少一种选自下组的轻链互补性决定区：具有SEQ ID NO:10或71的氨基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-L2、和具有选自由SEQ ID NO:13-16的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列的CDR-L3。
再举个例子，所述重链可变区可具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列，而所述轻链可变区具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-21和72的氨基酸序列。
术语“c-Met”或“c-Met蛋白”可以指结合肝细胞生长因子(HGF)的受体酪氨酸激酶(RTK)。c-Met可以是来自任何物种，特别是哺乳动物或灵长类的c-Met蛋白，例如人c-Met(例如NP_000236)、或猴c-Met(例如猕猴(Macacamulatta)，NP_001162100)、或啮齿动物如小鼠c-Met(例如NP_032617.2)、大鼠c-Met(例如NP_113705.1)等。c-Met蛋白可包括由标识为GenBank登录号NM_000245的核苷酸序列编码的多肽，具有标识为GenBank登录号NP_000236的氨基酸序列的多肽或其胞外域。受体酪氨酸激酶c-Met参与各种机制，如癌症形成、转移、癌细胞的迁移、癌细胞的侵入和血管发生。
通过用目标抗原给无免疫性动物免疫所产生的动物来源的抗体在注射于人以用于医学治疗时一般引起免疫原性，因此已开发出嵌合抗体来抑制此类免疫原性。嵌合抗体通过将导致抗同种型应答的动物来源抗体的恒定区经由遗传工程而用人抗体的恒定区替换来制备。嵌合抗体在抗同种型应答中相比于动物来源的抗体有相当大的改进，但动物来源的氨基酸仍然占有可变区，因此嵌合抗体在潜在的抗同种型应答方面具有副作用。开发了人源化抗体来减少这类副作用。人源化抗体通过将互补性决定区(CDR)嫁接到人抗体框架中来产生，所述互补性决定区在嵌合抗体的可变区的抗原结合中起着重要作用。
在CDR嫁接以产生人源化抗体中最重要的事是选择优化的人抗体来接受动物来源抗体的CDR。抗体数据库、晶体结构分析和分子建模技术都被采用。然而，即使将动物来源抗体的CDR嫁接到最优化的人抗体框架，仍存在位于动物来源CDR的框架中的影响抗原结合的氨基酸。因此，在许多情况中，抗原结合亲和力不能维持，故需要应用另外的抗体工程技术来恢复抗原结合亲和力。
所述抗c-Met抗体可以是小鼠来源的抗体、小鼠-人嵌合抗体、或人源化抗体。所述抗体或其抗原结合片段可以是从活体分离的抗体。
所述抗体可以是单克隆抗体。
完整的抗体包含两条全长轻链和两条全长重链，其中每条轻链通过二硫键连接至一条重链。抗体具有重链恒定区和轻链恒定区。重链恒定区有gamma(γ)、mu(μ)、alpha(α)、delta(δ)、或epsilon(ε)型，其可进一步分类为gamma1(γ1)、gamma2(γ2)、gamma3(γ3)、gamma4(γ4)、alpha1(α1)、或alpha2(α2)。轻链恒定区为kappa(κ)或lambda(λ)型。
术语“重链”指全长重链及其片段，其包含可变区VH(包含足以提供对抗原的特异性的氨基酸序列)和3个恒定区CH1、CH2和CH3，以及铰链。术语“轻链”指全长轻链及其片段，其包含可变区VL(包含足以提供对抗原的特异性的氨基酸序列)和恒定区CL。
术语“互补性决定区(CDR)”指见于免疫球蛋白重链或轻链的高可变区中的氨基酸序列。所述重链和轻链可分别包含3个CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3；和CDRL1、CDRL2和CDRL3)。CDR可提供在抗体对抗原或表位结合中起着重要作用的接触残基。术语“特异性结合”或“特异性识别”是本领域普通技术人员公知的，且指示抗体和抗原彼此特异性地相互作用以引起免疫学活性。
依照一个实施方案，所述抗体可以是选自下组的抗原结合片段：scFv、(scFv)2、Fab、Fab'和F(ab')2。
术语“抗原结合片段”用于本文指完整免疫球蛋白的片段，其包括包含具有特异性结合抗原的抗原结合区的多肽的部分。例如，抗原结合片段可以是scFv、(scFv)2、Fab、Fab’、或F(ab’)2，但不限于此。在各种抗原结合片段中，Fab包含轻链和重链可变区、轻链恒定区、和第一重链恒定区CH1，具有一个抗原结合位点。Fab'片段与Fab片段不同之处在于Fab'包含铰链区，在CH1的C末端具有至少一个半胱氨酸残基。F(ab')2抗体经由Fab'片段铰链区中的半胱氨酸残基进行二硫键桥联而形成。Fv是最小的抗体片段，仅具有重链可变区和轻链可变区。生成Fv片段的重组技术是本领域中公知的。双链Fv包含重链可变区和轻链区，它们通过非共价键连接。单链Fv一般包含重链可变区和轻链可变区，它们通过共价键经由肽接头连接，或在C末端连接以具有类似双链Fv的二聚体结构。抗原结合片段可使用蛋白酶得到(例如，Fab片段可通过用木瓜蛋白酶对整个抗体的限制性切割获得，而F(ab')2片段可通过用胃蛋白酶切割获得)，或者可通过使用遗传重组技术来制备。
再举一个例子，所述抗c-Met抗体或抗体片段可包含具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列(其中从第1至17位的氨基酸序列为信号肽)或SEQ ID NO:62的第18至462位的氨基酸序列的重链，和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列(其中从第1至20位的氨基酸序列是信号肽)或SEQ ID NO:68的第21至240位的氨基酸序列的轻链；或具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列(其中从第1至17位的氨基酸序列为信号肽)或SEQ ID NO:64的第18至461位的氨基酸序列的重链，和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列或SEQ ID NO:68的第21至240位的氨基酸序列的轻链；或具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列(其中从第1至17位的氨基酸序列为信号肽)或SEQ ID NO:66的第18至460位的氨基酸序列的重链，和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列或SEQ ID NO:68的第21至240位的氨基酸序列的轻链。
抗c-Met抗体的另外的例子包括，其中抗c-Met抗体包含具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列或SEQ ID NO:62的第18至462位的氨基酸序列的重链，和具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列(其中从第1至20位的氨基酸序列是信号肽)或SEQ ID NO:70的第21至240位的氨基酸序列的轻链；具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列或SEQ ID NO:64的第18至461位的氨基酸序列的重链，和具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列或SEQ ID NO:70的第21至240位的氨基酸序列的轻链；或具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列或SEQ ID NO:66的第18至460位的氨基酸序列的重链，和具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列或SEQ ID NO:70的第21至240位的氨基酸序列的轻链。
在其他例子中，所述抗c-Met抗体可包含具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列或SEQ ID NO:62的第18至462位的氨基酸序列的重链，和具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的轻链；具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列或SEQ ID NO:64的第18至461位的氨基酸序列的重链，和具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的轻链；或具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列或SEQ ID NO:66的第18至460位的氨基酸序列的重链，和具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的轻链。
在一个实施方案中，所述抗c-Met抗体可包含具有SEQ ID NO:66的第18至460位的氨基酸序列的重链，和具有SEQ ID NO:68的第21至240位的氨基酸序列的轻链；或具有SEQ ID NO:66的第18至460位的氨基酸序列的重链，和具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的轻链。
在上文氨基酸序列中使用的信号肽仅用于例示，且信号肽的氨基酸序列可由本领域技术人员适宜地确定或修饰。
本文中还提供包含SEQ ID NO:68或73的氨基酸序列的多肽。具有SEQID NO:70的氨基酸序列的多肽是包含人kappa(κ)恒定区的轻链，而具有SEQID NO:68的氨基酸序列的多肽是通过将具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的多肽在位置62处(依照kabat编号为位置36)的组氨酸用酪氨酸替换获得的多肽。抗体的生产产率可通过该替换而增加。具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的多肽是通过将具有SEQ ID NO:68的第21至240位的氨基酸序列的多肽位置32处(依照kabat编号为位置27e；位于CDR-L1内)的丝氨酸用色氨酸替换获得的多肽。通过此类替换，包含这类序列的抗体和抗体片段展现出增加的活性，如c-Met结合亲和力、c-Met降解活性、Akt磷酸化活性等。
另一个实施方案提供一种具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的多肽，其可用作轻链互补性决定区(CDR-L1)。另一个实施方案提供抗c-Met抗体或其抗原结合片段，包含具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链互补性决定区、具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的轻链可变区、或具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的轻链，任选地与如本文中描述的重链可变区或重链或提供抗c-Met抗体或抗体片段的其他重链组合。所述抗体或其抗原结合片段展现出增加的c-Met降解活性和Akt磷酸化活性，如图8B和9B中显示的。
依照另一个实施方案，提供包含所述抗c-Met抗体或抗原结合片段作为活性成分的药物组合物。所述药物组合物可用于预防或治疗癌症，并且可包含药学有效量的抗c-Met抗体或抗原结合片段；和药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
所述癌症可以是任何与c-Met活性有关的癌症。所述癌症可选自下组：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞状细胞癌、腹膜癌、皮肤癌、皮肤或眼内黑素瘤、结直肠癌、肛门附近的癌、食道癌、小肠肿瘤、内分泌腺的癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、肝细胞瘤、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞腺瘤、乳腺癌、结肠癌、大肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺肿瘤、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、或头和颈部的癌。
所述药物组合物可包含药学可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。包含在组合物中的药学可接受的载体可包括通常使用的乳糖、右旋糖(dextrose)、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶(gum acacia)、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆剂、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸盐/酯、丙基羟基苯甲酸盐/酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。所述药物组合物还可包括滑润剂、加湿剂、增甜剂、增味剂(flavor enhancer)、乳化剂、混悬剂和防腐剂。
所述药物组合物可口服或胃肠外施用。胃肠外施用可包括静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜内注射、内皮施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用、和直肠施用。由于口服施用导致蛋白质或肽的消化，因此必须将活性成分包裹或配制在药物组合物中，阻止其消化。另外，可通过使用任何能够将活性材料移向靶细胞的装置来施用药物组合物。
药物组合物的合适剂量可能取决于许多因素，如配制方法、施用方法、患者的年龄、体重、性别和病理状况、饮食、施用时间、施用路径、排泄速度和反应敏感性。期望的药物组合物剂量对于成人可以在约0.001至100mg/kg的范围内。术语“药学有效量”或“治疗有效量”用于本文指用于预防或治疗癌症和/或血管发生相关疾病的量。
所述药物组合物可与药学可接受的载体和/或添加剂通过本领域公知的方法配制成单位剂量或多剂量形式。在此方面，制剂可以是油或水性介质中的溶液、或者是混悬剂、糖浆剂、乳化溶液、提取物、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊，且可进一步包含分散剂或稳定剂。另外，所述药物组合物可施用为单独的药物，或与其他药物一起施用，且可以与先前存在的药物序贯或同时施用。所述药物组合物包含抗体或其抗原结合片段，如此可配制成免疫脂质体。含有抗体的脂质体可使用本领域中公知的方法制备。所述免疫脂质体是包括卵磷脂、胆固醇、和聚乙二醇衍生的磷脂酰乙醇胺的脂质组合物，且可以通过逆相蒸发方法制备。例如，Fab'片段可经由二硫键交换反应附接于脂质体。脂质体中还可包含化学药物如多柔比星(doxorubicin)。
依照一个实施方案，所述抗体或抗体片段可充当抗c-Met蛋白的拮抗剂。
术语“拮抗剂”理解为包括部分或完全阻断、抑制和/或中和其靶物(例如c-Met)的至少一种生物学活性的所有分子。例如，术语“拮抗剂抗体”指抑制或降低抗体结合的抗原(例如c-Met)的生物学活性的抗体。拮抗剂由于将受体结合至配体，促进降解，而降低受体磷酸化，或者可以使配体所活化的细胞失能或将其破坏。还有，拮抗剂可完全阻断受体和配体之间的相互作用，或者由于受体的三级结构变化或受体的下调而可以实际上减少相互作用。
依照另一个实施方案，提供一种预防和/或治疗癌症的方法，所述方法包括对需要预防和/或治疗癌症的受试者施用所述抗c-Met抗体或抗原结合片段。所述抗体或抗体片段可以药学有效量施用，且可作为与如本文中描述的药学可接的载体、稀释剂或赋形剂一起配制的药物组合物来施用。所述方法还可包括在施用步骤之前鉴定出需要预防和/或治疗癌症的受试者。
依照另一个实施方案，提供抗c-Met抗体或抗原结合片段，其用于预防和/或治疗癌症，或制备用于预防和/或治疗癌症的药物。
可施用抗c-Met抗体或抗原结合片段或药物组合物来预防或治疗癌症的受试者包括动物，如哺乳动物。例如，所述动物可以是人、犬、猫或小鼠。
依照本发明的另一个实施方案，提供编码如本文中描述的抗体或其抗原结合片段的核酸，以及编码任一种前述多肽或氨基酸序列的核酸。编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸可以是例如DNA或RNA，且任选地可以纳入载体如表达载体中。
依照本发明的另一个实施方案，提供包含编码如本文中描述的抗体或其抗原结合片段的核酸，以及编码任一种前述多肽或氨基酸序列的核酸的细胞。
依照本发明的另一个实施方案，提供一种制备如本文中描述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在细胞中表达编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸。
现将参照以下实施例对本发明的一个或多个实施方案进行更详细地描述。然而，这些实施例仅用于例示目的且不意图限制本发明的范围。
实施例
实施例1：制备抗c-Met的小鼠抗体AbF46
小鼠的免疫
为了获得形成杂交瘤细胞系所需的免疫小鼠，将100ug人c-Met/Fc融合蛋白(R&D Systems)和相同量的完全弗氏佐剂混合，并经由腹膜内注射将混合物施用到5只4至6周龄BALB/c小鼠(Japan SLC,Inc.)的每一只中。2周后，使用与上文所述相同的方法将抗原(先前注射量的一半)与不完全弗氏佐剂混合，并经由腹膜内注射将混合物施用到每只小鼠中。1周后，实施末次加强注射，并在3天后从每只小鼠的尾部收集血液以获得血清。然后，将血清以1/1000用PBS稀释，并进行酶联免疫吸附测定法(ELISA)来分析识别c-Met的抗体的滴度是否提高。之后，选出其中获得充足量抗体的小鼠，并在选出的小鼠上进行细胞融合过程。
(2)细胞融合和杂交瘤细胞的制备
在细胞融合实验之3天前，经由腹膜内注射将50ug PBS与人c-Met/Fc融合蛋白的混合物施用给每只小鼠(BALB/c小鼠；Japan SLC,Inc.)。将每只免疫后小鼠麻醉，然后提取其位于身体左侧的脾并用网磨碎(ground with a mesh)以分离细胞，将其与培养基(DMEM,GIBCO,Invitrogen)混合来制备脾细胞悬浮液。将该悬浮液离心以收集细胞层。将获得的1x108个脾细胞与1x108个骨髓瘤细胞(Sp2/0)混合，并将混合物离心以将细胞沉淀。将沉淀物缓慢分散，用1ml45％(w/v)聚乙二醇(PEG)的DMEM溶液处理，并在37℃维持1分钟，接着添加1ml DMEM。在引入另外的10ml DMEM达1分钟后，将所得物在37℃水浴中维持5分钟。使其总量达到50ml，并将所得物离心。将所得细胞沉淀物以1×105个细胞/ml至2×105个细胞/ml的浓度重悬于分离培养基(HAT培养基，即次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷培养基)。然后，将所得物分布于96孔板(0.1ml每孔)，将其在37℃二氧化碳培养箱中温育以制备杂交瘤细胞。
(3)选择产生抗c-Met蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞
为了从上述操作(2)中制备的杂交瘤细胞中选出特异性结合c-Met的杂交瘤细胞，实施ELISA来筛选出产生有效抗人c-Met/Fc融合蛋白和人Fc蛋白的抗体的细胞。
将50ul(2ug/ml)人c-Met/Fc融合蛋白在微滴定板的每个孔上包被，并通过清洗除去未反应的抗原。为了排除抗体对Fc而非对c-Met的结合，使用与上文相同的方法将人Fc蛋白在一个不同微滴定板的每个孔上包被。然后，将50ul的杂交瘤细胞悬浮液添加到微滴定板的每个孔以反应1小时。接着，将微滴定板用磷酸盐缓冲液-tween20(TBST)溶液清洗以除去未反应的培养基。向其添加山羊抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶(IgG-HRP)，并允许反应在室温进行1小时，用TBST溶液进行清洗。之后，向每个孔添加过氧化物酶的底物溶液(OPD)，并通过使用ELISA读数器测量在450nm处的吸收来评估反应程度。经由此方法，重复地选择能产生对人c-Met蛋白而非对人Fc蛋白高度特异性的抗体的杂交瘤细胞系。在获得的杂交瘤细胞系上进行有限稀释以获得产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系的单个克隆。选出的产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系在Korean Cell Line Bank以登录号KCLRF-BP-00220登记。
(4)单克隆抗体的产生和纯化
将在上文描述的操作(3)中获得的杂交瘤细胞在无血清培养基中培养以产生单克隆抗体，并将该单克隆抗体纯化。
首先，将在有10％(w/v)FBS的50ml培养基(DMEM)中培养的杂交瘤细胞离心以获得细胞沉淀物，将其用20ml PBS清洗超过2次以除去FBS。然后，引入50ml DMEM以将细胞沉淀物重悬，并将所得物在37℃二氧化碳培养箱中温育3天。在离心以移出产生抗体的细胞之后，将包含抗体的细胞培养物分离并储存于4℃，或直接使用。使用装备有亲和柱(蛋白G琼脂糖柱；Pharmacia,USA)的AKTA纯化装置(GE Health)从50至300ml培养物中纯化出抗体，并通过使用用于蛋白质聚集的滤器(Amicon)将上清液用PBS替换来存储纯化的抗体。
实施例2：制备抗c-Met的嵌合抗体chAbF46
一般地，当将小鼠抗体注射到人中用于医学目的时，经常可能发生免疫原性。因此，为了降低免疫原性，从实施例1所得小鼠抗体AbF46来制备嵌合抗体chAbF46，其中恒定区被人IgG1抗体的氨基酸序列取代。
合成多个基因，使得对应于重链的核酸序列为EcoRI-信号序列-VH-Nhel-CH-TGA-Xhol(SEQ ID NO:38)，而对应于轻链的核酸序列为EcoRI-信号序列-VL-BsiWI-CL-TGA-XhoI(SEQ ID NO:39)。然后，构建表达嵌合抗体的载体，方法是，用限制酶EcoRI(NEB,R0101S)和XhoI(NEB,R0146S)，分别将具有与重链对应的核酸序列的DNA片段(SEQ ID NO:38)克隆到包含在Invitrogen的OptiCHOTM抗体表达试剂盒(目录号12762-019)中的pOptiVECTM-TOPO TA克隆试剂盒中，并将具有与轻链对应的核酸序列的DNA片段(SEQ ID NO:39)克隆到pcDNATM3.3-TOPO TA克隆试剂盒(目录号8300-01)中。
构建的载体用Qiagen Maxiprep试剂盒(目录号12662)扩增，并将包含重链的载体和包含轻链的载体以约4:1(约80ug:20ug)的比率与360ul2M CaCl2一起添加到293T细胞(2.5x107)中进行转染。接着，将混合物在有10％(w/v)FBS的DMEM培养基中于37℃在5％(v/v)CO2条件中培养5小时，然后在没有FBS的DMEM培养基中于37℃在5％(v/v)CO2条件中培养48小时。
将培养的细胞离心，并使用AKTA Prime(GE healthcare)将100ml的每种上清液纯化。将蛋白A柱(GE healthcare,17-0405-03)置于AKTA Prime中，并使培养的溶液以5ml/分钟的流速流动，用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)洗脱。将缓冲液用PBS缓冲液替换，如此纯化出最终的嵌合抗体(下文中chAbF46)。
实施例3：从嵌合抗体chAbF46制备人源化抗体huAbF46
重链人源化
对于H1-重链和H3-重链，使用NCBI Ig Blast鉴定与小鼠抗体AbF46的VH基因最同源的人种系基因。确认VH3-71在氨基酸水平具有83％同源性。使用Kabat编号方式对小鼠抗体AbF46的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3编号，并将小鼠抗体AbF46的一个CDR部分引入VH3-71的框架中。将位置30(S→T)、位置48(V→L)、位置73(D→N)和位置78(T→L)的氨基酸回复突变为初始的小鼠AbF46抗体的氨基酸序列，其中依照Kabat编号来对氨基酸的数目编号，因此，该编号对于VH3-71和小鼠AbF46抗体是通用的。然后，在H1-重链中，另外突变位置83(R→K)和位置84(A→T)的氨基酸，由此完成H1-重链(SEQID NO:40)和H3-重链(SEQ ID NO:41)的构建。
对于H4-重链，获得人抗体的框架序列，并将VH3亚型(已知具有类似于AbF46抗体的小鼠框架序列的序列且稳定)用于引入使用Kabat编号定义的小鼠抗体AbF46的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。因此，构建H4-重链(SEQ IDNO:42)。
(2)轻链人源化
对于H1-轻链(SEQ ID NO:43)和H2-轻链(SEQ ID NO:44)，使用NCBI IgBlast鉴定与小鼠抗体AbF46的VL基因最同源的人种系基因。确认VK4-1在氨基酸水平具有75％同源性。使用Kabat编号定义小鼠抗体AbF46的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，并将小鼠抗体AbF46的一个CDR部分引入VK4-1的框架中。在H1-轻链中，将位置36(Y→H)、位置46(L→M)和位置49(Y→I)的3个氨基酸回复突变。在H2-轻链中，仅位置49(Y→I)的1个氨基酸回复突变。
对于H3-轻链(SEQ ID NO:45)，使用NCBI Ig Blast鉴定与小鼠抗体AbF46的VL基因最同源的人种系基因。结果，除了VK4-1(上文提述)以外还选择VK2-40。确认小鼠抗体AbF46VL和VK2-40在氨基酸水平具有61％同源性。使用Kabat编号定义小鼠抗体AbF46的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，并将小鼠抗体AbF46的一个CDR部分引入VK4-1的框架中。在H3-轻链中，将位置36(Y→H)、位置46(L→M)和位置49(Y→I)的3个氨基酸回复突变。
对于H4-轻链(SEQ ID NO:46)，获得人抗体的框架序列，并将VK1亚型(常规已知为稳定)用于引入使用Kabat编号定义的小鼠抗体AbF46的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在H4-轻链中，将位置36(Y→H)、位置46(L→M)和位置49(Y→I)的3个氨基酸另外回复突变。
然后构建用于表达人源化抗体的载体，方法是，用限制酶EcoRI(NEB,R0101S)和XhoI(NEB,R0146S)，分别将具有与重链对应的核酸序列的第一组DNA片段(H1-重链；SEQ ID NO:47，H3-重链；SEQ ID NO:48，和H4-重链；SEQ ID NO:49)克隆到包含在Invitrogen的OptiCHOTM抗体表达试剂盒(目录号12762-019)中的pOptiVECTM-TOPO TA克隆试剂盒中，将具有与轻链对应的核酸序列的第二组DNA片段(H1-轻链；SEQ ID NO:50，H2-轻链；SEQ IDNO:51，H3-轻链；SEQ ID NO:52，和H4-轻链；SEQ ID NO:53)克隆到pcDNATM3.3-TOPO TA克隆试剂盒(目录号8300-01)中。
构建的载体用Qiagen Maxiprep试剂盒(目录号12662)扩增，并将包含重链的载体和包含轻链的载体以约4:1(约80ug:20ug)的比率与360ul2M CaCl2一起添加到293T细胞(2.5x107)中进行转染。接着，将混合物在添加有10％(w/v)FBS的DMEM培养基中于37℃在5％(v/v)CO2条件中培养5小时，然后在没有FBS的DMEM培养基中于37℃在5％(v/v)CO2条件中培养48小时。
将培养的细胞离心，并使用AKTA Prime(GE healthcare)将100ml的每种上清液纯化。将蛋白A柱(GE healthcare,17-0405-03)置于AKTA Prime中，并使培养液以5ml/分钟的流速流动，用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)洗脱。将缓冲液与PBS缓冲液交换，如此纯化最终的人源化抗体(下文中huAbF46)。下文中使用人源化huAbF46的H4-重链和H4-轻链的组合。
实施例4：制备huAbF46抗体的scFv库
用huAbF46抗体的重链可变区和轻链可变区来设计用于制备huAbF46抗体的scFv的基因。重链可变区和轻链可变区每一个都设计为具有'VH-接头-VL'形式，其中接头设计为具有氨基酸序列'GLGGLGGGGSGGGGSGGSSGVGS'(SEQ ID NO:54)。合成(Bioneer,Inc.)如上述设计的编码huAbF46抗体的scFv的多核苷酸(SEQ ID NO:55)，而用于表达该多核苷酸的载体表示为SEQ ID NO:56。
然后，分析由所述载体表达的所得物，鉴定c-Met特异性结合。
实施例5：制备用于亲和力成熟的库基因
靶CDR的选择和引物的制备
对于huAbF46抗体的亲和力成熟，通过'Kabat编号'从制备的小鼠抗体AbF46定义6个互补性决定区(CDR)。CDR显示于表1中。
表1
CDR 氨基酸序列
CDR-H1 DYYMS(SEQ ID NO:1)
CDR-H2 FIRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ ID NO:2)
CDR-H3 DNWFAY(SEQ ID NO:3)
CDR-L1 KSSQSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:10)
CDR-L2 WASTRVS(SEQ ID NO:11)
CDR-L3 QQSYSAPLT(SEQ ID NO:12)
如下制备引物以随机引入抗体的CDR序列。依照随机引入序列的现有方法，使用N密码子从而可将碱基以相同比率(25％A、25％G、25％C和25％T)引入要突变的位点。然而，依照当前的实施方案，为了将碱基随机引入huAbF46抗体的CDR中，85％的第一和第二核苷酸在编码每个CDR的氨基酸的3种野生型核苷酸之间为保守的，其它3种碱基中每一种的5％是引入的。另外，将引物设计为使得3种碱基能引入到第三个核苷酸中(33％G、33％C和33％T)。
(2)huAbF46抗体库的制备和对c-Met结合亲和力的鉴定
用上述操作(1)中制备的引物，通过将序列随机引入CDR中，来构建抗体基因库。将包含编码huAbF46抗体的scFv的核酸序列的多核苷酸用作模板。如图1所示制备两种PCR片段，用重叠延伸PCR构建分别靶向6种CDR的6个库。
鉴定野生型抗体(huAb46)和源自这些库的每种抗体对c-Met的结合亲和力。当源自这些库的大多数抗体对c-Met的结合亲和力低于野生型抗体的时，鉴定出其中对c-Met的结合亲和力未降低的突变体。
实施例6：从所述库选择具有改进的亲和力的抗体
如果源自所述库的抗体对c-Met的结合亲和力得到改进，那么分析来自该单个克隆的scFv基因序列。将获得的如表2所示的CDR序列转化成IgG。在下面列出的克隆中，选出从L3-1、L3-2、L3-3和L3-5产生的4种类型的抗体并使用这些抗体实施后续实验。
表2
克隆名称 库 CDR序列
H11-4 CDR-H1 PEYYMS(SEQ ID NO:22)
YC151 CDR-H1 PDYYMS(SEQ ID NO:23)
YC193 CDR-H1 SDYYMS(SEQ ID NO:24)
YC244 CDR-H2 RNNANGNT(SEQ ID NO:25)
YC321 CDR-H2 RNKVNGYT(SEQ ID NO:26)
YC354 CDR-H3 DNWLSY(SEQ ID NO:27)
YC374 CDR-H3 DNWLTY(SEQ ID NO:28)
L1-1 CDR-L1 KSSHSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:29)
L1-3 CDR-L1 KSSRSLLSSGNHKNYLA(SEQ ID NO:30)
L1-4 CDR-L1 KSSKSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:31)
L1-12 CDR-L1 KSSRSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:32)
L1-22 CDR-L1 KSSHSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:33)
L2-9 CDR-L2 WASKRVS(SEQ ID NO:34)
L2-12 CDR-L2 WGSTRVS(SEQ ID NO:35)
L2-16 CDR-L2 WGSTRVP(SEQ ID NO:36)
L3-1 CDR-L3 QQSYSRPYT(SEQ ID NO:13)
L3-2 CDR-L3 GQSYSRPLT(SEQ ID NO:14)
L3-3 CDR-L3 AQSYSHPFS(SEQ ID NO:15)
L3-5 CDR-L3 QQSYSRPFT(SEQ ID NO:16)
L3-32 CDR-L3 QQSYSKPFT(SEQ ID NO:37)
实施例7：将选定的抗体转化为IgG
编码选定的4种类型抗体的重链的多核苷酸为'EcoRI-信号序列-VH-NheI-CH-XhoI'(SEQ ID NO:38)。该重链的氨基酸在亲和力成熟后未经修饰，因此使用huAbF46抗体的重链。将铰链区用U6-HC7铰链区(SEQ ID NO:57)替换，而非用人IgG1的铰链区替换。轻链的基因设计为具有'EcoRI-信号序列-VL-BsiWI-CL-XhoI'，并由Bioneer,Inc.合成编码选定的4种类型抗体的轻链可变区的多核苷酸(SEQ ID NO:58至61)。然后构建用于表达该抗体的载体，方法是，用限制酶EcoRI(NEB,R0101S)和XhoI(NEB,R0146S)，分别将具有与重链对应的核酸序列的DNA片段(SEQ ID NO:38)克隆到包含在Invitrogen的OptiCHOTM抗体表达试剂盒(目录号12762-019)中的pOptiVECTM-TOPO TA克隆试剂盒中，将具有与轻链对应的核酸序列的另一组多个DNA片段：包含L3-1来源的CDR-L3的DNA片段(SEQ ID NO:58)、包含L3-2来源的CDR-L3的DNA片段(SEQ ID NO:39)、包含L3-3来源的CDR-L3的DNA片段(SEQ ID NO:60)、和包含L3-5来源的CDR-L3的DNA片段(SEQID NO:61)，克隆到pcDNATM3.3-TOPO TA克隆试剂盒(目录号8300-01)中。
构建的载体用Qiagen Maxiprep试剂盒(目录号12662)扩增，并将包含重链的载体和包含轻链的载体以约4:1(约80ug:20ug)的比率与360ul2M CaCl2一起添加到293T细胞(2.5x107)中进行转染。接着，将混合物在添加有10％(w/v)FBS的DMEM培养基中于37℃在5％(v/v)CO2条件中培养5小时，然后在没有FBS的DMEM培养基中于37℃在5％(v/v)CO2条件中培养48小时。
将培养的细胞离心，并使用AKTA Prime(GE healthcare)将100ml的每种上清液纯化。将蛋白A柱(GE healthcare,17-0405-03)置于AKTA Prime中，使培养液以5ml/分钟的流速流动，用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)洗脱。将缓冲液与PBS缓冲液交换，如此纯化具有改进的亲和力的4种类型的抗体(下文中huAbF46-H4-A1、huAbF46-H4-A2、huAbF46-H4-A3和huAbF46-H4-A5)。
实施例8：分析选出的抗体的结合亲和力
通过使用Biacore(GE healthcare)来测量实施例7中制备的4种类型抗体对c-Met抗原的亲和力。将约80至110RU的每种抗体固定化在CM5芯片上，将范围从0.39nM至100nM的9种不同浓度的人c-Met蛋白作为抗原以30ul/分钟的速率注射以获得如表3中显示的k结合值和k解离值。然后，基于其来计算KD值。huAbF46对c-Met抗原的结合亲和力为约2.19nM，而具有改进的亲和力的4种类型抗体的结合亲和力在0.06nM至0.50nM的范围内(表3)。这表明抗体亲和力在scFv形式中改进后，进一步在转化成IgG后再改进约5倍至约37倍。
表3
抗体 k结合(1/Ms) k解离(1/s) KD(nM)
huAbF46 3.29x105 7.23x10-4 2.19
huAbF46-H4-A1 7.39x105 4.53x10-5 0.06
huAbF46-H4-A2 5.02x105 2.53x10-4 0.50
huAbF46-H4-A3 4.19x105 1.43x10-4 0.34
huAbF46-H4-A5 5.72x105 2.40x10-4 0.42
实施例9：分析具有改进亲和力的选定抗体的体外生物学活性
BrdU测定法
使用具有改进亲和力的抗体实施BrdU测定法以评估这些抗体的安全性。将NCI-H441(ATCC目录号HTB-174)，人肺癌细胞，悬浮于RPMI1640培养基(Gibco)(2x105个细胞/ml)以制备悬浮液，并将约100ul的该悬浮液引入96孔组织培养板(Corning,Lowell,MA)的每个孔中。将悬浮液于37℃在5％(v/v)CO2条件中温育24小时，然后完全除去培养基并用经所述抗体稀释的RPMI1640替换。在将悬浮液于37℃在5％(v/v)CO2条件中温育21小时后，添加5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)并在再温育3小时后实施BrdU测定法(Roche,Indianapolis,IN)。在将板上细胞变性/固定后，向其添加抗BrdU抗体并在1小时后添加底物以使用ELISA spectraMax读数器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)在370nm处测量颜色反应。将培养基用作阴性对照，并将公知为激动剂的抗体5D5(ATCC目录号HB11895，从杂交瘤细胞分离并纯化)用作阳性对照。
结果是，参照图2，在具有改进亲和力的4种类型的抗体中，4种类型抗体的激动作用副作用降低。因此，鉴定出在10ug/ml的浓度其安全性分别改进25％(huAbF46-H4-A1)、28％(huAbF46-H4-A2)、13％(huAbF46-H4-A3)和21％(huAbF46-H4-A5)。
(2)体外细胞增殖分析
为了鉴定如实施例5中制备的具有改进亲和力的4种类型抗体的抗癌效果，使用表面表达c-Met的MKN45胃癌细胞(Japanese Cancer Research Bank,JCRB,Tokyo,Japan)来实施体外细胞增殖分析。
将悬浮于50ul5％(w/v)FBS/DMEM培养基的1x104个MKN45细胞引入96孔板的每个孔中。然后，细胞或者不处理，或者用浓度为0.008、0.04、0.2、或1ug/ml的50ul4种类型的抗体处理。在温育72小时后，通过使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay试剂盒(Promega,G7570)和鲁米诺仪(PerkinElmer,2104Multilabel reader)对细胞数目定量。
如图3中显示的，亲和力未改进的抗体(huAbF46)的相对细胞活力在0.008ug/ml的最低浓度为77％，而具有改进亲和力的抗体即huAbF46-H4-A1、huAbF46-H4-A2和huAbF46-H4-A5的相对细胞活力分别为74、73和72％，彼此相似。huAbF46-H4-A3的相对细胞活力在66％，是大大降低了。另外，在对细胞活力影响最大的0.04ug/ml,，所有4种类型抗体的相对细胞活力均等于或低于抗体5D5的(53％)。因此，作为改进亲和力的结果，功效和安全性相比于对照均显著改进。
(3)Akt磷酸化
由Akt调节的细胞过程包括细胞增殖、细胞存活、细胞大小控制、和对营养可获性的应答、中间代谢、血管发生和组织侵入。所有这些过程代表癌症的特征，且许多癌蛋白和肿瘤阻遏物在Akt途径中交汇，精细地调节处在信号转导和经典代谢调节接口处的细胞功能。因此，当作为活性形式的磷酸化Akt的含量增加时，癌细胞的活性增加。在此，评估了具有改进亲和力的4种类型抗体抑制Akt磷酸化的程度。
为了比较如实施例5中制备的具有改进亲和力的4种类型抗体的激动作用，将Caki-1细胞(Korean Cell Line Bank)用于确认Akt磷酸化的程度。将小鼠IgG用作阴性对照，并将抗体5D5(已知的激动剂)用作阳性对照。
将2x105个细胞/ml的Caki-1细胞引入96孔板，并在24小时后，将5ug/ml的每种抗体在无血清培养基中处理30分钟。使经所述抗体处理的细胞裂解并使用PathScan phospho-AKT1(Ser473)Chemiluminoscent Sandwich ELISA试剂盒(Cell Signaling,目录号7134S)测量Akt磷酸化程度。
如图4中显示的，鉴定出所有4种类型的抗体抑制Akt磷酸化的程度得到改进。具体地，huAbF46-H4-A1和huAbF46-H4-A2的Akt磷酸化程度分别为15.27％和15.71％，是亲和力改进前(huAbF46)的程度(29.06％)的约49％。因此，鉴定出亲和力成熟后的抗体的安全性得到相当大的改进。相比之下，抗体5D5展现出非常高的相对Akt磷酸化水平(100％)，指示抗体5D5显示非常高的激动作用和非常低的安全性。
(4)鉴定c-Met的降解程度
为了鉴定如实施例5中制备的具有改进亲和力的4种类型抗体的抗癌效果，评估了结合所述抗体的c-Met的降解程度。在抗体结合c-Met以经由内在化作用降解c-Met后，测量c-Met总量中的变化，获得c-Met的相对总量，以此评估抗体的功效。
将MKN45细胞(2x105个细胞/ml)和每种抗体(5ug/ml)同时引入96孔板并温育24小时。然后，实施用抗体处理的细胞的裂解，使用人总HGF R/c-MetELISA试剂盒(R&D systems,DYC358)测量c-Met总量中的变化并分析。
结果发现，如图5所示，用具有改进亲和力的4种类型抗体处理的细胞，相比于用huAbF46抗体处理的细胞而言，c-Met的降解程度得到改进。在用huAbF46-H4-A1处理的细胞中c-Met的降解程度相比于用huAbF46处理的细胞增加约37％。在用huAbF46-H4-A2、huAbF46-H4-A3和huAbF46-H4-A5处理的细胞中c-Met的降解程度相比于用huAbF46处理的细胞增加约28％。如图4和5中显示的，经过亲和力成熟的抗体显示与抗体5D5相比相等或更高的c-Met降解程度以及高得多的安全性。
实施例10：分析选出的具有改进亲和力的抗体的体内生物学活性
为了鉴定如实施例5中制备的具有改进亲和力的4种类型抗体的抗癌效果，在移植有U87MG脑癌细胞(Korean Cell Line Bank)或MKN45胃癌细胞(Japanese Cancer Research Bank,JCRB,Tokyo,Japan)的脑癌或胃癌小鼠异种移植模型中，体内施用具有改进亲和力的抗体，观察到肿瘤细胞的大小减小。
将5x106个U87MG脑癌细胞或MKN45胃癌细胞的50ul悬液经由皮下注射施用给6周龄的雄性BALB/C裸鼠(Orient Bio Corp.)。1周后，随机选出每组12只患有癌症的小鼠。在形成肿瘤细胞后，每周一次地将浓度为10mg/kg、具有改进亲和力的4种类型的抗体经由静脉内注射施用给这些小鼠。而且，作为对照，每周两次地将浓度为10mg/kg和20mg/kg的小鼠AbF46抗体施用给其他小鼠。
参照图6A和6B，在U87MG脑癌和MKN45胃癌小鼠模型中，均鉴定出肿瘤生长抑制效果。
实施例11：制备具有替换的恒定区和/或铰链区的huAbF46-H4-A1
在选出的4种类型的抗体中，测定huAbF46-H4-A1具有对c-Met的最高结合亲和力和最低程度的Akt磷酸化和c-Met分化。替换huAbF46-H4-A1的铰链区，或恒定区加铰链区。
将包含重链(包含huAbF46-H4-A1的重链可变区、U6-HC7铰链、人IgG1恒定区)和轻链(包含huAbF46-H4-A1的轻链可变区和人kappa恒定区)的抗体称为huAbF46-H4-A1(U6-HC7)，将包含重链(包含huAbF46-H4-A1的重链可变区、人IgG2铰链和人IgG1恒定区)和轻链(包含huAbF46-H4-A1的轻链可变区和人kappa恒定区)的抗体称为huAbF46-H4-A1(IgG2铰链)，而将包含重链(包含huAbF46-H4-A1的重链可变区、人IgG2铰链和人IgG2恒定区)和轻链(包含huAbF46-H4-A1的轻链可变区和人kappa恒定区)的抗体称为huAbF46-H4-A1(IgG2Fc)。另外，为了增加这3种抗体的生产力，将包含人kappa恒定区的轻链中位置36处的组氨酸都用酪氨酸替换。
为了制备这3种类型的抗体，由Bioneer,Inc.合成多核苷酸(SEQ ID NO:63)、多核苷酸(SEQ ID NO:65)、多核苷酸(SEQ ID NO:67)、以及多核苷酸(SEQ ID NO:69)，其中，多核苷酸(SEQ ID NO:63)编码多肽(SEQ ID NO:62，其包含huAbF46-H4-A1的重链可变区、U6-HC7铰链区和人IgG1恒定区)，多核苷酸(SEQ ID NO:65)编码多核苷酸(SEQ ID NO:65)，其包含huAbF46-H4-A1的重链可变区、人IgG2铰链区和人IgG1恒定区)，多核苷酸(SEQ ID NO:67)编码多肽(SEQ ID NO:66，其包含huAbF46-H4-A1的重链可变区、人IgG2铰链区和人IgG2恒定区)，多核苷酸(SEQ ID NO:69)编码多肽(SEQ ID NO:68，其包含huAbF46-H4-A1的轻链可变区(其中位置36处的组氨酸被酪氨酸替换)和人kappa恒定区)。
然后，将具有与重链对应的核酸序列的DNA片段克隆到包含在Invitrogen的OptiCHOTM抗体表达试剂盒(目录号12762-019)中的pOptiVECTM-TOPO TA克隆试剂盒中，并将具有与轻链对应的核酸序列的DNA片段克隆到pcDNATM3.3-TOPO TA克隆试剂盒(目录号8300-01)中，来构建用于表达所述抗体的载体。
使用Qiagen Maxiprep试剂盒(目录号12662)扩增构建的载体，并将包含重链的载体和包含轻链的载体以约4:1(约80ug:20ug)的比率与360ul2MCaCl2一起添加到293T细胞(2.5x107)并转染。接着，将混合物在添加有10％(w/v)FBS的DMEM培养基中于37℃在5％(v/v)CO2条件中培养5小时，然后在没有FBS的DMEM培养基中于37℃在5％(v/v)CO2条件中培养48小时。
将培养的细胞离心，并使用AKTA Prime(GE healthcare)将100ml的每份上清液纯化。将蛋白A柱(GE healthcare,17-0405-03)置于AKTA Prime中，并将培养的溶液以5ml/分钟的流速流动，用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)洗脱。将缓冲液与PBS缓冲液交换，并纯化3种类型的抗体(huAbF46-H4-A1(U6-HC7)、huAbF46-H4-A1(IgG2铰链)和huAbF46-H4-A1(IgG2Fc))。
另外，通过将huAbF46-H4-A1轻链可变区的位置27e处(依照kabat编号)的氨基酸残基丝氨酸用色氨酸替换来制备另一种轻链(SEQ ID NO:73)。然后，如上文描述的制备包含制备的轻链和huAbF46-H4-A1(IgG2Fc)重链的抗体，并称之为L3-11Y。依照实施例8中描述的方法测量L3-11Y抗体的结合亲和力，且测量的结合亲和力(KD(nM))低于0.01(<0.01)。
实施例12：分析具有经替换的恒定区和/或铰链区的huAbF46-H4-A1的体外生物学活性
体外细胞增殖分析
为了鉴定实施例11中制备的3种类型抗体的抗癌效果，使用在细胞膜上具有c-Met的MKN45胃癌细胞(Japanese Cancer Research Bank,JCRB,Tokyo,Japan)来实施体外细胞增殖分析。
将悬浮于50ul5％(w/v)FBS/DMEM培养基的1x104个MKN45细胞引入96孔板的每个孔中。然后，细胞或者不处理，或者用浓度为0.008、0.04、0.2、或1ug/ml的50ul3种类型的抗体处理。在温育72小时后，通过使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay试剂盒(Promega,G7570)和leuminometer(PerkinElmer,2104Multilabel读数器)来对细胞数目定量。
如图7中显示的，当以0.04ug/ml或更低浓度的3种类型的抗体huAbF46-H4-A1(U6-HC7)、huAbF46-H4-A1(IgG2铰链)和huAbF46-H4-A1(IgG2Fc)处理时，相对细胞存活性为约60％。
(2)Akt磷酸化
为了比较如实施例11中制备的具有改进亲和力的3种类型抗体的激动作用，将Caki-1细胞(Korean Cell Line Bank)用于确认Akt磷酸化的程度。将小鼠IgG用作阴性对照，并将抗体5D5(已知的激动剂)用作阳性对照。
将2x105个细胞/ml的Caki-1细胞引入96孔板，并在24小时后，将5ug/ml的每种抗体在无血清培养基中处理30分钟。实施用抗体处理的细胞的裂解并使用PathScan phospho-AKT1(Ser473)化学发光Sandwich ELISA试剂盒(CellSignaling,cat.no#7134S)测量Akt磷酸化程度。
获得的结果显示于图8A。如图8A中显示的，所有3种类型抗体抑制Akt磷酸化的程度为18％或更低。因此，鉴定出安全性得到相当大的改进。
另外，还依照上述方法测量huAbF46-H4-A1(IgG2Fc)和L3-11Y对Akt磷酸化的抑制程度。获得的结果显示于图8B。如图8B中显示的，L3-11Y展现出与huAbF46-H4-A1(IgG2Fc)的相比相等或更高的Akt磷酸化抑制活性。
(3)鉴定c-Met的降解程度
为了鉴定如实施例11中制备的具有改进亲和力的3种类型抗体的抗癌效果，评估结合抗体的c-Met的降解程度。将MKN45细胞(2x105个细胞/ml)和每种抗体(5ug/ml)同时引入96孔板并温育24小时。然后，实施用抗体处理的细胞的裂解，使用人总HGF R/c-Met ELISA试剂盒(R&D systems,DYC358)测量c-Met总量中的变化并分析。
获得的结果显示于图9A。如图9A中显示的，鉴定出c-Met的降解程度在用具有改进亲和力的3种类型的抗体处理的细胞中相比于用huAbF46抗体处理的细胞得到改进。
另外，还依照上述方法测量huAbF46-H4-A1(IgG2Fc)和L3-11Y的c-Met降解程度。获得的结果显示于图9B。如图9B中显示的，L3-11Y展现出与huAbF46-H4-A1(IgG2Fc)的相比大约相等的c-Met降解活性。
实施例13：分析具有经替换的恒定区和/或铰链区的huAbF46-H4-A1的体内生物学活性
为了鉴定实施例11中制备的3种类型抗体的抗癌效果，在体内施用具有改进亲和力的所述抗体时，观察到移植有U87MG脑癌细胞(Korean Cell LineBank)或MKN45胃癌细胞(Japanese Cancer Research Bank,JCRB,Tokyo,Japan)的脑癌或胃癌小鼠异种移植物模型中肿瘤细胞大小中的降低。
将50ul的5x106个U87MG脑癌细胞或MKN45胃癌细胞悬液经由皮下注射施用给6周龄的雄性BALB/C裸鼠(Orient Bio Corp.)。1周后，随机选出每组12只患有癌症的小鼠。在形成肿瘤细胞后，每周一次地将浓度为10mg/kg、具有改进亲和力的3种类型的抗体经由静脉内注射施用给这些小鼠。而且，作为对照，每周两次地将浓度为10mg/kg和20mg/kg的小鼠AbF46抗体施用给其他小鼠。
参照图10A和10B，在U87MG脑癌和MKN45胃癌小鼠模型中，均鉴定出肿瘤生长抑制性效果。
如上文描述的，依照本发明一个或多个实施方案，所述抗c-Met抗体和用于预防或治疗癌症的包含其的药物组合物，可有效预防或治疗癌症。
本文中引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利通过提述并入本文，其程度如同单独且明确指示每篇参考文献通过提述纳入并在本文中完整列出的。
除非本文中另外指示或上下文清楚地冲突，术语“一个/一种”和“该”和“至少一个/一种”及类似指代物在描述本发明的背景中(特别是在所附权利要求的背景中)应理解为涵盖单数和复数。除非本文中另外指示或上下文清楚地冲突，术语“至少一个/一种”继之以一项或多项列表(例如，“A和B的至少一个/一种”)的使用应理解为意指选自所列项的一项(A或B)或所列项中两项或更多项的任意组合(A和B)。除非另外记载，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应理解为开放端的术语(即意指“包括但不限于”)。除非本文中另外指示，本文中记载的值的范围仅意图充当分别指示落入该范围内的每个单独值的速记(shorthand)方法，且每个单独的值如其在本文中分别记载的纳入本说明书。除非本文中另外指示或上下文清楚地冲突，本文中描述的所有方法可以任何适宜的次序实施。除非另外主张，本文中提供的任何和所有例子或例示性语言(例如“如”)的使用仅意图更好的阐明本发明而不对本发明的范围施加限制。本说明书中没有任何语句应理解为指示任何未要求保护的要素是实践本发明所必要的。
本文中描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。在阅读前述发明时，对那些优选实施方案的变化对于本领域普通技术人员可以是明显的。发明人预期熟练技术人员如适宜地采用这类变化，且发明人意图除了本文中具体描述的以外来实践本发明。因此，本发明包括所附权利要求中记载的主题的所有修改和等同物，如适用法律所允许的。而且，除非本文中另外指示或上下文清楚地冲突，上文描述的要素在其所有可能变化中的任意组合均涵盖在本发明中。

Claims (24)

1.一种抗c-Met抗体或其抗原结合片段，包含：
重链可变区，其包含至少一种选自下组的重链互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-H2、和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H3；和
轻链可变区，其包含至少一种选自下组的轻链CDR：具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L2、和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L3，其中SEQ ID NO:4至9分别由下式I至VI代表：
式I
Xaa1-Xaa2-Tyr-Tyr-Met-Ser(SEQ ID NO:4)，其中Xaa1是Pro或Ser或不存在，而Xaa2是Glu或Asp；
式II
Arg-Asn-Xaa3-Xaa4-Asn-Gly-Xaa5-Thr(SEQ ID NO:5)，其中Xaa3是Asn或Lys，Xaa4是Ala或Val，而Xaa5是Asn或Thr；
式III
Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa6-Tyr(SEQ ID NO:6)；其中Xaa6是Ser或Thr；
式IV
Lys-Ser-Ser-Xaa7-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa8-Gly-Asn-Xaa9-Xaa10-Asn-Tyr-Leu-Ala(SEQ ID NO:7)，其中Xaa7是His、Arg、Gln或Lys，Xaa8是Ser或Trp，Xaa9是His或Gln，而Xaa10是Lys或Asn；
式V
Trp-Xaa11-Ser-Xaa12-Arg-Val-Xaa13(SEQ ID NO:8)，其中Xaa11是Ala或Gly，Xaa12是Thr或Lys，而Xaa13是Ser或Pro；和
式VI
Xaa14-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa15-Pro-Xaa16-Thr(SEQ ID NO:9)，其中Xaa14是Gly、Ala或Gln，Xaa15是Arg、His、Ser、Ala、Gly或Lys，而Xaa16是Leu、Tyr、Phe或Met。
2.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其中CDR-H1是具有SEQ ID NO:22、23、或24的氨基酸序列的多肽。
3.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其中CDR-H2是具有SEQ ID NO:25或26的氨基酸序列的多肽。
4.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其中CDR-H3是具有SEQ ID NO:27或28的氨基酸序列的多肽。
5.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其中CDR-L1是具有SEQ ID NO:29、30、31、32、33、或71的氨基酸序列的多肽。
6.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其中CDR-L2是具有SEQ ID NO:34、35、或36的氨基酸序列的多肽。
7.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其中CDR-L3是具有SEQ ID NO:13、14、15、16、或37的氨基酸序列的多肽。
8.一种抗c-Met抗体或其抗原结合片段，包含：
重链可变区，其包含至少一种选自下组的重链互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H2、和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3；和
轻链可变区，其包含至少一种选自下组的轻链CDR：具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L2、和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L3，其中SEQ ID NO:7至9分别由下式IV至VI代表：
式IV
Lys-Ser-Ser-Xaa7-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa8-Gly-Asn-Xaa9-Xaa10-Asn-Tyr-Leu-Ala(SEQ ID NO:7)，其中Xaa7是His、Arg、Gln或Lys，Xaa8是Ser或Trp，Xaa9是His或Gln，而Xaa10是Lys或Asn；
式V
Trp-Xaa11-Ser-Xaa12-Arg-Val-Xaa13(SEQ ID NO:8)，其中Xaa11是Ala或Gly，Xaa12是Thr或Lys，而Xaa13是Ser或Pro；而
式VI
Xaa14-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa15-Pro-Xaa16-Thr(SEQ ID NO:9)，其中Xaa14是Gly、Ala或Gln，Xaa15是Arg、His、Ser、Ala、Gly或Lys，而Xaa16是Leu、Tyr、Phe或Met。
9.权利要求8的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含至少一种选自下组的轻链CDR：具有SEQ ID NO:10或71的氨基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-L2、和具有SEQ ID NO:13、14、15、或16的氨基酸序列的CDR-L3。
10.权利要求8的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变区具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列，而所述轻链可变区具有SEQ ID NO:18、19、20、21、或72的氨基酸序列。
11.权利要求8的抗体或抗原结合片段，其包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:62的第18至462位的氨基酸序列、SEQ ID NO:64的第18至461位的氨基酸序列、或SEQ ID NO:66的第18至460位的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:68的第21至220位的氨基酸序列。
12.权利要求8的抗体或抗原结合片段，其包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:62的第18至462位的氨基酸序列、SEQ ID NO:64的第18至461位的氨基酸序列、或SEQ ID NO:66的第18至460位的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:70的第21至220位的氨基酸序列。
13.权利要求8的抗体或抗原结合片段，其包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:62的第18至462位的氨基酸序列、SEQ ID NO:64的第18至461位的氨基酸序列、或SEQ ID NO:66的第18至460位的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。
14.一种抗c-Met抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:71、72、或73的氨基酸序列。
15.权利要求1-14中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是单克隆抗体、小鼠来源的抗体、小鼠-人嵌合抗体、人源化抗体。
16.权利要求1-15中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是scFv、(scFv)2、Fab、Fab'、或F(ab')2。
17.权利要求1-16中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述c-Met是人c-Met、猴c-Met、小鼠c-Met、或大鼠c-Met。
18.一种药物组合物，其包含权利要求1-17中任一项的抗c-Met抗体或抗原结合片段和药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
19.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含权利要求1-18中任一项的抗体或抗原结合片段和药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
20.权利要求19的药物组合物，其中所述癌症是鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞状细胞癌、腹膜癌、皮肤癌、皮肤或眼内黑素瘤、结直肠癌、肛门附近的癌、食道癌、小肠肿瘤、内分泌腺的癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、肝细胞瘤、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞腺瘤、乳腺癌、结肠癌、大肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺肿瘤、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、或者头或颈部的癌。
21.权利要求1-17中任一项的抗体或抗原结合片段，其用于预防或治疗癌症。
22.一种具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的多肽。
23.一种编码权利要求1-17中任一项的抗体或抗体片段的多核苷酸，任选地在载体中。
24.一种包含权利要求23的多核苷酸的细胞。
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