CN108220390A - 一种邻位连接技术用于定量检测Cys C含量的试剂盒、制备及使用方法 - Google Patents
一种邻位连接技术用于定量检测Cys C含量的试剂盒、制备及使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108220390A CN108220390A CN201711272734.5A CN201711272734A CN108220390A CN 108220390 A CN108220390 A CN 108220390A CN 201711272734 A CN201711272734 A CN 201711272734A CN 108220390 A CN108220390 A CN 108220390A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cys
- kit
- probes
- preparation
- detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种邻位连接技术用于定量检测Cys C含量的试剂盒。所述试剂盒包括：Cys C探针A、Cys C探针B、连接缓冲液、qPCR反应液；本发明还公开了所述的一种邻位连接技术用于定量检测Cys C含量试剂盒的制备方法，该方法包括：Cys C探针A的制备、Cys C探针B的制备；最后还公开了该试剂盒的使用方法；本明首次将邻位连接技术方法应用在Cys C的定量检测上，与现有技术方法相比，具有灵敏性高、特异性强、高通量等优点，可提高肾功能早期受损评价的准确性，具有极大的市场价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种邻位连接技术用于体外免疫诊断检测人体内Cys C的含量，属于疾病诊断检测领域。
背景技术
胱抑素C(Cys C)是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，也被称为γ-微量蛋白及γ-后球蛋白，广泛存在于各种组织的有核细胞和体液中，是一种低分子量、碱性非糖化蛋白质，分子量为 13.3KD，由122个氨基酸残基组成，可由机体所有有核细胞产生，产生率恒定。循环中的Cys C仅经肾小球滤过而被清除，是一种反映肾小球滤过率变化的内源性标志物，并在近曲小管重吸收，但重吸收后被完全代谢分解，不返回血液，因此，其血中浓度由肾小球滤过决定，而不依赖任何外来因素，如性别、年龄、饮食的影响，是一种反映肾小球滤过率变化的理想同源性标志物。
正常情况下，Cys C在血清和血浆中的浓度为0.51mg/L～1.09mg/L(参考范围)。当肾功能受损时，Cys C在血液中的浓度随肾小球滤过率变化而变化。肾衰时，肾小球滤过率下降，Cys C在血液中浓度可增加10多倍，血清中的Cys C的浓度就由肾小球滤过率决定，Cys C也就成为反应肾小球滤过率的一个非常好的标志物。Cys C的测定用于肾功能早期受损的评价。
目前检测血、尿中Cys C含量的常用方法包括有酶联免疫吸附试验法和免疫比浊法等。这些方法均存在相应的缺点，酶联免疫吸附试验法的检测灵敏度较低，免疫比浊法存在液态的胶乳试剂稳定性不佳，检测结果精准性不佳。而本发明提出的基于一种邻位连接技术检测 Cys C含量的免疫诊断检测方法，具有检测灵敏度高、检测特异性强、样品损耗低、操作简单、检测设备常见等优势，将其应用于肾小球滤过率变化的监测，可以提高肾功能早期受损诊断的准确率，具有极大的市场价值。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种可用于定量检测Cys C的检测试剂盒、其制备及使用方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一种制备基于邻位连接技术定量检测Cys C含量的试剂盒的方法，包括如下步骤：
1)抗Cys C抗体偶联寡聚核苷酸的Cys C探针A；
2)抗Cys C抗体偶联寡聚核苷酸的Cys C探针B；
在上述技术方案中，所述抗Cys C抗体为针对Cys C不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。
根据以上任一技术方案所述所制备的基于邻位连接技术的Cys C检测试剂盒。其主要组成包括：
1)Cys C探针A；
2)Cys C探针B；
3)连接缓冲液；
4)qPCR反应液。
以上任一技术方案所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)将待测样本加入到反应孔中，再加入Cys C探针A和Cys C探针B，孵育5-30min后加入到连接缓冲液反应5-30min，最后与qPCR反应液进行混合；
2)对上述1)中的最终反应液进行qPCR，测量计算每个反应孔的Ct值。
此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。
附图说明
图1是本发明实施例提供的一种邻位连接技术用于定量检测Cys C含量的试剂盒原理示意图，其中，1-寡聚脱氧核苷酸，2-偶联剂，3-抗Cys C抗体，4-待测物(Cys C)，5-寡聚脱氧核苷酸，6-偶联剂，7-抗Cys C抗体，8-Taqman荧光探针，9-Taq酶
图2是本发明实施例提供的一种邻位连接技术用于定量检测Cys C含量的试剂盒检测线性范围图。
图3是本发明实施例提供的一种邻位连接技术用于定量检测Cys C含量的试剂盒结果相关性比较。
具体实施方式
以下参考附图对本发明的一种邻位连接技术用于定量检测Cys C含量的试剂盒、制备及其使用方法进行详细说明。
实施例1
Cys C探针A的制备：
1)取0.1mg抗Cys C抗体与DBCO-sulfo-NHS试剂进行共孵育5-30min；
2)反应结束后，加入10μL 0.5mol/L Tris-HCl，孵育5-10min以终止反应；
3)将上述被修饰的抗体加入寡聚脱氧核苷酸a，4℃过夜孵育，即得到Cys C探针A。
实施例2
Cys C探针B的制备：
1)取0.1mg抗Cys C抗体与DBCO-sulfo-NHS试剂进行共孵育5-30min；
2)反应结束后，加入10μL 0.5mol/L Tris-HCl，孵育5-10min以终止反应；
3)将上述被修饰的抗体加入寡聚脱氧核苷酸b，4℃过夜孵育，即得到Cys C探针B。
实施例3
试剂盒主要组成：
1)Cys C探针A；
2)Cys C探针B；
3)连接缓冲液；
4)qPCR反应液。
实施例4
试剂盒使用方法，包括如下步骤：
1)将待测样本加入到反应孔中，再加入Cys C探针A和Cys C探针B，孵育5-30min后加入到连接缓冲液反应5-30min，最后与qPCR反应液进行混合；
2)对上述1)中的最终反应液进行qPCR，测量计算每个反应孔的Ct值。
此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。
实施例5
本发明试剂盒方法学评价：
1.线性
配制浓度为0μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、4μg/mL、8μg/mL 的Cys C标准品溶液。在反应孔中分别加入10μL标准品、加入100μL Cys C探针A，加入 100μLCys C探针B，37℃温育10分钟。温育后，加入20μL连接缓冲液反应10min后，再加入20μLqPCR反应液进行qPCR反应，测量计算每个反应孔的Ct值。
以Ct值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准工作曲线(见附图2)。
2.准确度
相关性比对：如图3所示，与北京九强Cys C试剂盒的相关性为：y＝1.028x-0.078，R2＝0.997。
本发明与现有方法和产品相比，具有检测灵敏度高、特异性好、成本较低，对检测仪器要求低的优点。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种邻位连接技术用于定量检测Cys C含量的试剂盒、制备及使用方法，其特征在于：
1)试剂盒主要组成：Cys C探针A、Cys C探针B、连接缓冲液、qPCR反应液；
2)使用方法：将待测样本加入到反应孔中，再加入Cys C探针A和Cys C探针B，孵育5-30min后加入到连接缓冲液反应5-30min，最后与qPCR反应液进行混合；
3)检测方法：对上述2)中的最终反应液进行qPCR，测量计算每个反应孔的Ct值。
2.一种邻位连接技术用于定量检测Cys C含量的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)Cys C探针A的制备；
2)Cys C探针B的制备。
3.根据权利要求1所述的Cys C探针A和探针B均为抗Cys C抗体偶联的寡聚脱氧核苷酸。
4.根据权利要求3所述的抗Cys C抗体为针对Cys C不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。
5.根据权利要求3所述的Cys C探针A上的寡聚脱氧核苷酸a序列为：5’-GCATTGATCTAGTCATTCTAGTTATGTAGGGCCAACGACGACTGCAGATGAATTAATGAGGA-3’。
6.根据权利要求3所述的Cys C探针B上的寡聚脱氧核苷酸b序列为：5’-CGTAGCCGGCATATGGTACGACGACATGTACAGATACGACTGACGATCAGTACGTTTAAGGATAC-3’。
7.根据权利要求1所述的一种邻位连接技术用于定量检测Cys C含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的连接缓冲液为0.02％BSA，20mmol/L Tris，50mmol/L KCl，20mmol/LMgCl2，0.03U/μL DNA连接酶，100mmol/L寡核苷酸桥链。
8.根据权利要求7所述寡聚核苷酸桥链的序列为5’-TCGTACCATATGCCGGCTACGTCCTCATTAATTCATCTG-3’。
9.根据权利要求1所述的一种邻位连接技术用于定量检测Cys C含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的qPCR反应液包含PCR正向引物、PCR反向引物、TaqMan probe、Taq DNA聚合酶。
10.根据权利要求9所述的PCR正向引物序列为5’-ATTGATCTAGTCATTCTAGTTATG-3’、PCR反向引物序列为5’-ATCCTTAAACGTACTGATCGTCAGTCG-3’、TaqMan probe序列为5’-TGAATTAATGAGGACGTAGCCGGCATATGGTAC-3’。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711272734.5A CN108220390A (zh) | 2017-11-27 | 2017-11-27 | 一种邻位连接技术用于定量检测Cys C含量的试剂盒、制备及使用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711272734.5A CN108220390A (zh) | 2017-11-27 | 2017-11-27 | 一种邻位连接技术用于定量检测Cys C含量的试剂盒、制备及使用方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108220390A true CN108220390A (zh) | 2018-06-29 |
Family
ID=62653227
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711272734.5A Pending CN108220390A (zh) | 2017-11-27 | 2017-11-27 | 一种邻位连接技术用于定量检测Cys C含量的试剂盒、制备及使用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108220390A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104119440A (zh) * | 2013-04-27 | 2014-10-29 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 针对胱抑素c的单克隆抗体、杂交瘤细胞株制备及其用途 |
| CN105779649A (zh) * | 2016-03-29 | 2016-07-20 | 扬州大学 | 一种检测禽白血病病毒的免疫pcr试剂盒 |
| CN106591436A (zh) * | 2016-11-24 | 2017-04-26 | 湖南大学 | 用于检测人体内低丰度抗体的邻位连接核酸探针与试剂盒及其制备方法 |
-
2017
- 2017-11-27 CN CN201711272734.5A patent/CN108220390A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104119440A (zh) * | 2013-04-27 | 2014-10-29 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 针对胱抑素c的单克隆抗体、杂交瘤细胞株制备及其用途 |
| CN105779649A (zh) * | 2016-03-29 | 2016-07-20 | 扬州大学 | 一种检测禽白血病病毒的免疫pcr试剂盒 |
| CN106591436A (zh) * | 2016-11-24 | 2017-04-26 | 湖南大学 | 用于检测人体内低丰度抗体的邻位连接核酸探针与试剂盒及其制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rufai et al. | Performance of Xpert MTB/RIF on ascitic fluid samples for detection of abdominal tuberculosis | |
| US10788493B2 (en) | Composition for diagnosing infectious diseases or infectious complications by using tryptophanyl-tRNA synthetase and method for detecting diagnostic marker | |
| CN110804669B (zh) | 用于肺炎支原体的crispr检测引物组及其用途 | |
| KR20170027313A (ko) | 트립토파닐 티알엔에이 합성효소를 이용한 감염 질환 또는 감염 합병증의 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법 | |
| CN110331209A (zh) | 生物标志物在肺腺癌诊断中的应用 | |
| JP2019507594A (ja) | 大腸がん診断用組成物と診断マーカー検出方法 | |
| CN104105791A (zh) | 诊断和预示肠癌的标志物 | |
| CN108220390A (zh) | 一种邻位连接技术用于定量检测Cys C含量的试剂盒、制备及使用方法 | |
| WO2003069349A3 (en) | Method for diagnosis of inflammatory diseases using mrp8/mrp14 | |
| CN110438232A (zh) | 一种肺腺癌诊断组合物及其应用 | |
| KR101878974B1 (ko) | 신장암 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법 | |
| CN108459163A (zh) | 一种邻位连接技术用于定量检测crp含量的试剂盒、制备及使用方法 | |
| US20070166709A1 (en) | Immuno-pcr method | |
| CN108226530A (zh) | 一种邻位连接技术用于定量检测Myo含量的试剂盒、制备及使用方法 | |
| CN110331208A (zh) | 分子靶标在肺腺癌联合诊断中的应用 | |
| CN108267596A (zh) | 一种邻位连接技术用于定量检测rbp含量的试剂盒、制备及使用方法 | |
| CN112553332A (zh) | 多个基因在肝癌诊断中的联合应用 | |
| CN112680514A (zh) | 一种肝癌诊断的标志物及其应用 | |
| CN111647690A (zh) | 用于检测covid-19病毒的rt-raa引物对和诊断试剂盒 | |
| CN108387737A (zh) | 一种邻位连接技术用于定量检测h-fabp含量的试剂盒、制备及使用方法 | |
| KR101815253B1 (ko) | 간 섬유화 진단용 바이오마커 cxcl14 | |
| CN103789416A (zh) | 检测fgfr3 g380r位点突变的方法和寡核苷酸 | |
| US20220235399A1 (en) | Use of p44 as marker for diagnosing anaplasmosis | |
| CN108342450A (zh) | 一种邻位连接技术用于定量检测NT-proBNP含量的试剂盒、制备及使用方法 | |
| CN113549688B (zh) | 一组诊断冠状动脉疾病的分子标志物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20180629 |