CN104357585A - 同时检测猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的多重pcr引物组及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了同时检测猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的PCR引物组及检测试剂盒，属于猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的检测领域。本发明首先根据GenBank公开的猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的部分已知序列，设计多对引物，从中筛选出特异性强、敏感性高的引物组。所述引物组由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2组成的引物对1和由SEQ ID No.3、SEQ ID No.4组成的引物对2组成。本发明进一步公开了一种同时检测猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的多重PCR检测试剂盒，该多重PCR检测试剂盒能实现对猪伪狂犬病毒和猪细小病毒两种病毒的一次性同步检测，特异性强，敏感性高，检测程序简便、高效，检测成本低。
Description
技术领域
本发明涉及检测病毒的多重PCR引物组，尤其涉及检测猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)和猪细小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)2种DNA病毒的多重PCR引物组，本发明还涉及利用所述引物组制备得到的多重PCR检测试剂盒，属于猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的多重PCR检测领域。
背景技术
近年来，在养猪生产中多病原混合感染已是普遍现象。猪群发病，常常不是某种单一病原体引起，而是两种或多种病原体共同作用造成的，延误了诊断和防治，导致猪群高发病率和高死亡率，造成巨大的经济损失(Allan and Ellis,2000；Dorr et al.,2007；Ellis et al.,2000；Rodriguez-Arriojaet al.,1999；Segales et al.,2002,2004)。在存在多病原混合感染的猪场，病猪临床症状复杂，病理变化不典型，病情严重，现场难以确诊，一般防治措施也难以奏效。
对各种病毒的检测可采用传统的诊断方法，譬如病毒分离检测方法或血清学诊断方法。病毒分离检测存在操作方法繁琐，诊断时间长以及由于采集样本污染造成的结果不确定等问题；血清学诊断方法因病毒的变异株不断出现，导致该方法在实际应用中受到诸多限制(Izumida et al.,1988；Joo and Chu,1999；Kluge et al.,1999；Mengeling,1999；Prieto and Castro,2005；Takashima et al.,1988)；此外两种检测方法都存在灵敏度低的缺点。
商品化的PCR试剂盒多为单项PCR，1个试剂盒1次试验仅能检测一种病毒，对于混合感染3种病毒的同份猪病料要确诊其病原就需要3种试剂盒并且要进行3次PCR实验，不仅费时费力，检测成本也较高。因此，亟待开发一种能够实现多种病毒一次性同步检测且敏感性高的PCR引物组及多重PCR检测试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供同时检测猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)和猪细小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)的多重PCR引物组，采用该引物组能够准确的将猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒同时进行检测，特异性强、敏感性高；
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)的多重PCR检测试剂盒，达到2种病毒的一次性同步检测。
本发明所要解决的上述技术问题是通过以下技术方案实现的：
本发明首先公开了用于检测猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的多重PCR引物组，包括：
引物组1：由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的引物对1和由SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的引物对2组成；
引物组2：由SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示的核苷酸序列组成的引物对3和由SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示的核苷酸序列组成的引物对4组成。
优选的，所述PCR引物组是由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的引物对1和由SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的引物对2组成的引物组1。
本发明根据GenBank公开的PRV和PPV的部分已知序列，设计了多对PCR引物，本发明对设计的检测2种病毒的多对引物利用DNAstar进行引物二聚体分析，避免引物之间形成稳定的引物二聚体，并对每对引物扩增序列的同源性或互补性进行分析，避免它们之间有较高的同源性或互补性。
本发明分别以PPV、PRV基因组DNA，PPV和PRV混合基因组DNA为模板，以及分别以PRRSV、TGEV、PEDV、CSFV和BVDV的cDNA为模板，以引物对1和引物对2混合作为引物，或者以引物对3和引物对4混合作为引物，进行PCR扩增。多重PCR的检测结果表明，用引物对1和引物对2混合作为引物扩增后，PCR条带清晰，距离明显，特异性好；而用引物对3和引物对4混合作为引物扩增条带，PCR未能全部扩增出目的条带。因此，本发明用于检测猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的多重PCR引物组优选由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的引物对1和由SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的引物对2组成。
引物对的特异性检测结果表明，分别以PPV和PRV基因组DNA、分别以PRRSV、TGEV、PEDV、CSFV和BVDV的cDNA为模板，以PPV引物对(由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的引物对1)为引物进行扩增，只有以PPV基因组DNA为模板，扩增出768bp目的条带，未见其他特异性条带，说明PPV引物对特异性高；以PRV引物对(由SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的引物对2)为引物进行扩增，只有以PRV基因组DNA为模板，扩增出217bp目的条带，未见其他特异性条带，说明PRV引物对特异性高。
敏感性试验结果表明，应用本发明PCR引物组，当PPV和PRV混合基因组DNA的含量大于0.3ng，即可获得有效扩增，说明本发明多重PCR引物组敏感性高。
本发明所述多重PCR引物组能够应用于制备诊断猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的试剂。
本发明进一步公开了一种猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的多重PCR检测试剂盒，包括：10×PCR缓冲液，dNTPs混合溶液，检测引物组，rTaqDNA聚合酶和灭菌去离子水；其中，所述检测引物组由引物对1和引物对2组成；或者由引物对3和引物对4组成；
优选的，所述检测引物组为由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的引物对1和由SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的引物对2组成。
本发明还公开了应用所述多重PCR检测试剂盒检测宿主是否感染猪伪狂犬病病毒或猪细小病毒中的一种或两种的方法，包括以下步骤：
(1)提取待检测样品中病毒的基因组DNA；(2)以提取的DNA为模板，以所述引物对1和引物对2组成的PCR引物组为扩增引物建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；(3)如果从待检测的样品中仅扩增出217bp的条带，则待检测样品仅感染猪伪狂犬病病毒；如果从待检测的样品中仅扩增出768bp的条带，则待检测样品仅感染猪细小病毒；如果从待检测的样品中同时扩增出217bp和768bp的两条带，则待检测样品同时感染猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒；如果从待检测的样品中没有扩增出目的条带，则待检测样品没有感染猪伪狂犬病病毒或猪细小病毒。
其中，所述PCR扩增体系为：反应体系总体积为25μL，其中，10×PCR缓冲液2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2.5μL，10pmol/μL上下游引物各1μL，DNA模板1.0μL，5U/μL rTaq DNA聚合酶0.5μL，余量为灭菌去离子水。
PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸7min。
其中，所述的从待检测样品中提取病毒基因组DNA的方法，可以是现有技术中提取病毒基因组DNA的各种常用方法，例如可以是CTAB-NaCl法。
本发明所述多重PCR方法中，所述宿主为猪。
临床样本检测结果表明，本发明多重PCR方法从腹泻样本中检测到1例PPV感染，而采用之前报道的PCR方法(Hirohito Ogawa,Osamu Taira.Multiplex PCR and multiplex RT-PCR for inclusive detection of major swineDNA and RNA viruses in pigs with multiple infections.Journal of VirologicalMethods 160(2009),210–214.)从腹泻样本中未检测到PPV感染。这表明本发明的多重PCR方法针对临床样本的检测具有较高的敏感性。
本发明技术方案与现有技术相比具有以下有益效果：
本发明检测猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的PCR引物组扩增得到的多重PCR条带清晰，距离明显，特异性高，敏感性高，病毒基因组DNA的含量大于0.3ng即可获得有效扩增；本发明多重PCR检测试剂盒能实现对PPV和PRV两种病毒的一次性同步检测，敏感性高，检测程序简便、高效，检测成本低。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“引物”意指一小段单链DNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链。
术语“聚合酶链式反应”，简称PCR，意指一种分子生物学技术，用于放大扩增特定的DNA片段，PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温(经常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
术语“多重PCR”，又称多重引物PCR或复合PCR，是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
附图说明
图1为2种病毒的多重PCR电泳示意图；其中，M为Trans 2K DNAMarker；1为PPV和PRV两种病毒混合基因组DNA为模板的扩增片段；2为PRV基因组DNA为模板的扩增片段；3为PPV基因组DNA为模板的扩增片段；
图2为2种病毒的多重PCR电泳示意图；其中，M为Trans 2K DNAMarker；1为对照水；2为PPV和PRV两种病毒混合基因组DNA为模板的扩增片段；3为PRV基因组DNA为模板的扩增片段；4为PPV基因组DNA为模板的扩增片段；
图3为2对引物的特异性电泳图谱的结果；其中，A为PPV引物对的特异性检测结果；1为PPV基因组DNA；2为PRRSV的cDNA；3为PEDV的cDNA；4为CSFV的cDNA；5为PRV基因组DNA；6为TGEV的cDNA；7为BVDV的cDNA；B为PRV引物对的特异性检测结果；其中8为PRV基因组DNA；9为PRRSV的cDNA；10为PEDV的cDNA；11为CSFV的cDNA；12为TGEV的cDNA；13为PPV基因组DNA；14为BVDV的cDNA；M为Trans 2K DNA Marker；
图4为多重PCR的敏感性实验电泳图；其中，A中1-6分别表示以PPV和PRV混合基因组DNA为模板，稀释倍数依次为3×102ng、3×101ng、3×100ng、3×10-1ng、3×10-2ng、3×10-3ng；B是分别以PPV、PRV基因组DNA为模板进行扩增的结果；102、101、100、10-1、10-2、10-3分别表示PPV或PRV基因组DNA的稀释倍数为3×102ng、3×101ng、3×100ng、3×10-1ng、3×10-2ng、3×10-3ng；M为Trans 2K DNA Marker。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
1、菌株
猪伪狂犬病病毒(Bartha K61株)、猪细小病毒(京株)、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(Hun4F112株)、猪瘟病毒(石门株)、传染性胃肠炎病毒(华毒株)和猪流行性腹泻病毒(CV777株)、牛病毒性腹泻病毒(AV69株)由哈药集团生物疫苗有限公司保存。
实施例1多重PCR方法的建立
1、实验方法
1.1PCR引物设计
根据GenBank公开的PRV(Genbank号AF257079)和PPV(Genbank号AY502114)的部分已知序列，设计了多对引物见表1和表2。对设计出来的2种病毒引物利用DNAstar进行引物二聚体分析，以避免引物之间形成稳定的引物二聚体，并对每对引物扩增序列的同源性或互补性进行分析，避免它们之间有较高的同源性或互补性。
表1 多重PCR的引物设计
表2 多重PCR的引物设计
1.2PCR反应条件的建立
1.2.1病毒核酸的提取
1.2.1.1PPV与PRV DNA的提取(CTAB-NaCl法)
1)取0.5mL样品置于无菌微量离心管加入100μL NET缓冲液(1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-Cl)和50μL 2.6mol/L作为变性剂的NaOH混匀。
2)置于80℃水浴中10min。冷却至室温，加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)至终浓度650μg/mL，37℃水浴中作用1h。
3)加入100μL 5mol/L的NaCl和80μL的CTAB-NaCl溶液，充分混匀后65℃水浴中作用10min。
4)加等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，混匀后12000r/min离心4～5min，将上清移至新的离心管中。
5)加等体积的酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，混匀后12000r/min离心4～5min，将上清移至新的离心管中。
6)加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混合至有白色纤维状DNA沉淀。室温离心，弃上清，加70％乙醇洗涤两次。
7)室温12000r/min离心10min，沉淀溶于30μL TE，-20℃保存。
1.2.1.2PRRSV、TGEV、CSFV、PEDV和BVDV总RNA的提取
1)提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10×106个细胞加1mlTrizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；
2)将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中，在室温15～30℃下放置5分钟；
3)在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下(15℃～30℃)放置2～3分钟后，12000g(2℃～8℃)离心15分钟；
4)取上层水相置于新EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下(15℃～30℃)放置10分钟，12000g(2℃～8℃)离心10分钟；
5)弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75％乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g(2℃～8℃)离心5分钟，弃上清；
6)让沉淀的RNA在室温下自然干燥；
7)用Rnase-free water溶解RNA沉淀。
1.2.2cDNA的合成
反转录体系为25μL，RNA模板11.0μL，随机引物(50pmol/μL)2.0μL，70℃水浴5min，冰浴5min，再加入5×M-MLV RT Buffer 5.0μL，dNTP(2.5mmol/L)5.0μL，RNAase抑制剂1.0μL，鼠源反转录酶(M-MLV RT)1.0μL，42℃水浴90min，70℃水浴15min，-20℃保存备用。
1.2.3猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的多重PCR方法建立
分别以PPV、PRV基因组DNA和PPV与PRV的混合基因组DNA(体积比1：1)为模板，分别以PPV和PRV引物对(表1或表2)混合作为引物，按照如下体系进行PCR扩增：
反应体系25μL：10×PCR Buffer 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2.5μL，上下游引物(10pmol/μL)各1μL，模板1.0μL，5U/μL rTaq 0.5μL，灭菌去离子水补足。
优化后的反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸7min，4℃终止反应。
2、实验结果
多重PCR的检测结果见图1和图2。用表1引物扩增后条带(图1)中多重PCR条带清晰，距离明显，特异性好；而用表2引物扩增条带(图2)中多重PCR未能全部扩增出目的条带。因此，本发明优选表1中的引物(由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的引物对1和由SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的引物对2)作为多重PCR的引物。
实验例1引物组的特异性实验
1、实验方法
分别检测实施例1的多重PCR方法的引物对(由SEQ ID No.1、SEQID No.2所示的核苷酸序列组成的引物对1和由SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的引物对2)的特异性。
1.1PPV引物对的特异性
分别以PPV和PRV基因组DNA，分别以PRRSV、TGEV、PEDV、CSFV和BVDV的cDNA为模板，以PPV引物对(由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的引物对1)为引物，按照实施例1中的扩增体系和反应条件进行扩增，电泳检测扩增结果。
1.2PRV引物对的特异性
分别以PPV和PRV基因组DNA，分别以PRRSV、TGEV、PEDV、CSFV和BVDV的cDNA为模板，以PRV引物对(由SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的引物对2)为引物，按照实施例1中的扩增体系和反应条件进行扩增，电泳检测扩增结果。
2、实验结果
2.1PPV引物对的特异性检测结果
检测结果见图3A，从图中可以看出只有以PPV基因组DNA为模板，扩增出768bp目的条带，未见其他特异性条带，说明PPV引物对特异性高。2.2PRV引物对的特异性检测结果
检测结果见图3B，从图中可以看出只有以PRV基因组DNA为模板，扩有增出217bp目的条带，未见其他特异性条带，说明PRV引物对特异性高。
实验例2多重PCR的敏感性试验
通过分光光度计测OD，测得由实施例1得到的PPV基因组DNA的浓度为15000μg/μL，PRV基因组DNA的浓度为15000μg/μL。实验前均将浓度调整到3μg/μL。
PPV与PRV样品作10倍倍比稀释(从3×102ng到3×10-3ng)，以PPV和PRV混合基因组DNA为模板(体积比1:1)，或者分别以PPV、PRV基因组DNA为模板，按照实施例1的多重PCR的反应体系与扩增体系进行扩增，电泳检测扩增结果。
结果见图4，可见当PPV和PRV混合基因组DNA的含量大于3×10-1ng即可获得有效扩增。
实验例3多重PCR的临床样本的检测
本发明实施例1建立的多重PCR方法从腹泻样本中检测到1例PPV感染(表3)，而之前报道的PCR方法未从腹泻样本中检测到。结果表明，本发明的多重PCR方法针对临床样本的检测具有较高的敏感性，与之前报道的方法比较，具有明显的优势。
表3 临床样品的检测结果
注：前人的PCR方法为Hirohito Ogawa等人于2009年发表；
“-”表示未检测；
括号内为百分数。
Claims (3)
1.同时检测猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus)和猪细小病毒(Porcine Parvovirus)的多重PCR引物组，其特征在于，选自以下两组引物组中的任意一组：
引物组1：由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的引物对1和由SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的引物对2组成；
引物组2：由SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示的核苷酸序列组成的引物对3和由SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示的核苷酸序列组成的引物对4组成。
2.权利要求1所述的多重PCR引物组在制备诊断猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus)和猪细小病毒(Porcine Parvovirus)的诊断试剂或材料中的用途。
3.一种猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus)和猪细小病毒(PorcineParvovirus)的多重PCR检测试剂盒，包括：10×PCR缓冲液，dNTPs混合溶液，检测引物组，rTaq DNA聚合酶和灭菌去离子水；其特征在于：所述检测引物组为权利要求1所述的多重PCR引物组。
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| HIROHITO OGAWA等: "Multiplex PCR and multiplex RT-PCR for inclusive detection of major swine DNA and RNA viruses in pigs with multiple infections", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 * |
| 韩勇: "检测猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的二重PCR方法的建立", 《中国畜牧兽医》 * |
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