CN114317234B - 基于模块结构的多重病原快速检测体式微流控系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于模块结构的多重病原快速检测体式微流控系统，针对PCR核酸检测污染、通量低、检测慢与荧光串扰等问题，并面向现场快检需求，开发了模块化集成体式微流控检测系统，实现多样本、多重病原的高通量、集成化现场快检。采用3D打印在模块中构建多个(可扩展)并行空间交叉的微流道，检测过程均在微流道中完成，提高通量并降低污染。利用高特异性、灵敏度的CRISPR/Cas13a技术，样本进到结果出只需1小时。光纤激发检测结果，CMOS传感器采集检测结果，将降低荧光串扰的可能性。本发明能够实现高灵敏度、特异性、高通量与集成化的多样本、多重病原的快速检测，对于生物医学研究领域以及便携式病原体核酸现场快检系统的开发具有非常重要的实际应用价值。

Description

基于模块结构的多重病原快速检测体式微流控系统

技术领域

本发明属于多重病原快速检测系统开发领域，涉及基于模块结构的体式微流控检测系统设计方法。

背景技术

自新冠疫情爆发以来，对重大传染病的预防与检测在世界范围内得到了重视。突发传染病的爆发存在发病急、极大危害实验人员健康、病原复杂的急、危、难三类典型特点。对实现突发传染病预防与早期发现，构建具有快速排除、精准靶向的高通量检测方法，具有重大意义。

在传染病应急防控中，核酸检测技术作为分子水平的生物诊断方法，目前已成为新冠等重大传染病的检验金标准。在实验室条件下，典型的核酸检测方法包括基因测序技术、荧光PCR检测技术。基因检测技术具有高通量、高特异性的优点，然而其需要较长的检测时间，无法满足实验动物应急防控的需求，而荧光PCR技术，同样具有高特异性的优点，然而由于其存在的荧光串扰、核酸变温扩增条件难以控制、检测时间长且需要专业技术人员等问题，限制了多重病原快检技术的发展。为了满足现场快检的需求，新型的便携式检测方法相继出现，如检测试纸，微流控芯片，具有操作方便、现场快检的优势。故此面向应急防控的迫切需求，应同时具备实验室方法的高通量、高特异性以及便携系统的现场快检优势，因此基于先进的CRISPR/Cas13a分子学检测方法，我们设计开发了多重病原快速检测体式微流控系统。

发明内容

本发明为了克服核酸检测耗时长、荧光串扰等问题，同时满足应急防控中的现场快速检测要求，提出了基于模块结构的多重病原快速检测体式微流控系统，采用先进的CRISPR/Cas13a技术作为病原检测技术，以实现病原的快速检测，检测全过程大约需要一小时。同时采用3D打印技术，打印出病原检测各个步骤所需的组合检测模块、供液模块以及用于固定与采集检测结果的底座，组合成体式微流控系统。该系统能够实现“样本进-结果出”的多个样本的多重病原的高通量现场快速检测，从而有望为突发传染病预防与早期发现，构建具有快速排除、精准靶向的高通量检测方法。

本发明一种基于模块结构的多重病原快速检测体式微流控系统主要包括组合检测模块、组合供液模块与检测底座，供液模块为检测模块提供检测各步骤所需要的试剂，检测模块与供液模块组合后放置于检测底座上，用于固定与检测。其中一组组合检测模块可以同时实现两个样本的检测，一个样本可以实现十种不同传染病病原的检测，一组组合供液模块可以为三组组合检测模块提供反应所需要的试剂，组成一个检测—供液模块组合，四个检测—供液模块组合构成整个检测系统的检测与供液部分。检测底座的立柱用于检测模块以及供液模块的定位，在立柱底部正对组合供液模块中检测结果激发模块的位置设置有光纤引入端，用于接入光纤来激发荧光结果显示，对应CRISPR/Cas13a分析模块的位置布置有CMOS芯片。

所述每组检测模块可实现的样本与病原体检测的数量、组合检测模块的数量、组合供液模块的数量、一组组合供液模块所匹配的组合检测模块的数量均可根据需求与空间条件进行调整。

组合检测模块包括四部分，分别是样本预处理模块、核酸裂解模块、预扩增模块、CRISPR/Cas13a分析模块，各个模块外形完全一致，内部结构不同。四个模块按照样本预处理模块、核酸裂解模块、预扩增模块、CRISPR/Cas13a分析模块的顺序，空间上由上往下放置，上一模块的下表面与下一模块的上表面接触，并通过上一模块的微流道出口与下一模块的微流道入口对准实现定位。其中样本预处理模块的入口与出口均为两个圆柱直微流道，中间连接螺旋形微流道，再连接出口圆柱直微流道，流入核酸裂解模块。核酸裂解模块入口与出口均为两个圆柱直微流道，中间为圆柱体空腔，空腔周围布置有螺旋加热电阻丝，裂解后由出口流入预扩增模块。预扩增模块的一个入口分成十个并行竖直布置的圆柱空腔直微流道，总共二十个竖直布置的微流道流入CRISPR/Cas13a分析模块。CRISPR/Cas13a分析模块的二十个微流道根据检测样本来源分为两组，每组十个，设计为倾斜交叉的位置关系。

组合供液模块分为四个模块，分别是缓冲液模块、裂解液模块、扩增液模块、检测结果激发模块，各个模块外形完全一致，内部结构不同。四个模块按照缓冲液模块、裂解液模块、扩增液模块、检测结果激发模块的顺序，空间上由上往下放置，上一模块的下表面与下一模块的上表面接触，并通过上一模块的微流道出口与下一模块的微流道入口对准实现定位。所有模块所需的试剂均从最上方的缓冲液模块的入口注入。其中缓冲液模块与裂解液模块均在缓冲液模块上表面设有试剂入口，向下设置直微流道贯穿所经过的模块，到达各自模块位置后弯曲90°，分三路横向连接所对应的三个样本预处理模块与核酸裂解模块。扩增液模块与检测结果激发模块均在缓冲液模块上表面设有十个试剂入口，向下设置直微流道贯穿所经过的模块，到达各自模块位置后弯曲90°，分三路横向连接所对应的三个预扩增模块与CRISPR/Cas13a分析模块，其中检测结果激发模块设计有与检测底座的光线引入口相匹配的孔。

检测底座包含立柱、光纤引出端、CMOS芯片与底盘。

本检测系统的样本可以是血液、血清、鼻拭子、咽拭子等可用于核酸检测的任何样本。病原种类可以是各种能够用于核酸检测的病原体。

其中病毒核酸预扩增所需的全部试剂包括RPA反应液、RPA上下游引物、反转录酶、无核酸酶水、醋酸镁。其中RPA上下游引物，每种病毒所需的引物均不同。

其中用于CRISPR/Cas13a分析所需的全部试剂包括CRISPR/Cas13abuffer、无核酸酶水、Cas13a蛋白酶、gRNA、报告分子、RNase抑制剂、T7RNA聚合酶、核糖核苷酸溶液、氯化镁。用于病毒核酸预扩增所需的gRNA，每种病毒所需的gRNA均不同。

本发明实现多重病原、高通量的集成化、便携式与快速现场检测目标。

(1)通过设计模块化结构，并在模块内布置并行流道，可以实现多个样本、多重病原体的集成化、高通量检测。(2)供液模块分多路为组合检测模块供液，可以达到供液模块液路复用、高通量检测的效果。(3)在检测底座设置光纤引入端引入激发光纤，并在底座表面布置CMOS传感器，可以降低检测结果荧光串扰现象发生的可能性。(4)采用先进的CRISPR/Cas13a检测技术，将组合检测模块与供液模块按照CRISPR/Cas13a检测流程设计，检测过程密闭，不会暴露检测样本，该系统可以实现现场快速检测、降低污染性的效果。

附图说明

图1左侧为微流控检测系统整体结构示意图，右侧为微流控检测系统俯视图，其中：1-组合检测模块，2-组合供液模块，3-检测底座，4-样品注入口；

图2左侧为检测-供液模块组合示意图，右侧为组合的俯视图，与图1右侧俯视图的虚线框中结构对应，本发明设计为一组组合供液模块为三组组合检测模块提供检测所需的试剂，四个检测-供液模块组合构成整个检测系统的检测与供液部分，其中1-组合检测模块，2-组合供液模块，4-样品注入口，13-检测结果激发模块，14-缓冲液入口，15-扩增试剂入口，16-裂解液入口；

图3为组合检测模块结构示意图，其中：5-样本预处理模块，6-核酸裂解模块，7-预扩增模块，8-CRISPR/Cas13a分析模块；

图4为组合供液模块结构示意图，总共分为四个模块，其中：9-缓冲液模块，10-裂解液模块，11-扩增液模块，12-检测结果激发模块，13-缓冲液入口，14-扩增试剂入口，15-裂解液入口，16-CRISPR/Cas13a分析试剂入口；

图5为检测底座结构示意图，其中：17-立柱，18-光纤引出端，19-CMOS芯片，20-底盘；

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行详细的说明：

本发明公开了基于模块结构的多重病原快速检测体式微流控系统，参照图1所示微流控检测系统整体结构示意图，该系统整体分为三部分：1-组合检测模块，2-组合供液模块，3-检测底座。参照图2所示一组组合供液模块为三组组合检测模块提供CRISPR/Cas13a检测所需的试剂，组成一个检测-供液模块组合，四个检测-供液模块组合构成整个检测系统的检测与供液部分，本系统总计有十二组组合检测模块，四组组合供液模块，且一组组合检测模块可以实现两个样本的检测，因此该检测系统可实现4×3×2×10＝240通量的检测。样本由样本预处理模块顶部的样品注入口4注入，依次进入各个模块进行不同阶段的反应，同时组合供液模块为检测模块提供反应各个阶段所需的试剂。

参照图3与图4所示，图3展示了组合检测模块的结构，图4展示了组合供液模块的结构，样本如血液、血清、咽拭子或鼻拭子等样本由图2的样本注入口4注入，图4的缓冲液模块9为其提供用于样本稀释的缓冲液，实现样本的稀释。随后进入图3的核酸裂解模块6，进入该模块后，图4的裂解液模块10为其提供用于病毒裂解的裂解液，并设有螺旋加热结构，保证95℃下反应5～10min，将病毒核酸完全释放。然后进入图3的预扩增模块7，由于不同病毒在预扩增和CRISPR/Cas13a分析两阶段所用的部分试剂有所不用，因此在预扩增模块3便将同一样本分为十个反应管道，图4的扩增液模块11通过扩增试剂入口14将每种病毒各自所匹配的RPA上下游引物与除醋酸镁以外的其他溶液混合先加入，再通入醋酸镁溶液，保证37～42℃下反应20min。最后进入图3的CRISPR/Cas13a分析模块8，图4的检测结果激发模块12通过16CRISPR/Cas13a分析试剂入口将每种病毒各自所匹配的gRNA与其他所有试剂混合加入相应的反应通道，保证37℃下反应15～30min。

参照图5所示，图5展示了检测底座的结构，立柱1位于检测底座的中心，用于系统定位，供液模块可通过与立柱17直接接触以及光纤引出端18的配合来实现模块的定位，供液模块与检测模块有定位关系，因此可以实现供液模块与检测模块的共同定位。CMOS芯片19，片状的CMOS芯片置于底座上表面、CRISPR/Cas13a分析模块8正下方，可以采集检测结果的荧光信息，随后传入计算机进行检测结果的读取。光纤引出端18，检测模块中8CRISPR/Cas13a分析模块需要有激光激发才能读取结果，因此在检测底座底部穿入光纤束，由光纤引出端引出插入到各个CRISPR/Cas13a分析模块，对检测结果进行激发。底盘20用于布置所有的CMOS芯片、光纤导入以及检测系统安置。

本检测系统应用方法与步骤如下：

(1)在组合检测模块顶部的样本注入口4注入样本，在组合供液模块顶部的缓冲液入口13注入样本缓冲液。

(2)经过样本预处理模块5后的样本进入核酸裂解模块6，在组合供液模块顶部的裂解液入口15注入裂解液，裂解液流经缓冲液模块9和裂解液模块10后进入核酸裂解模块6，利用螺旋加热结构，保证样本在95℃下与裂解液反应5～10min。

(3)经过核酸裂解模块6后的反应液进入预扩增模块7，组合供液模块的扩增液模块11为预扩增提供所需的试剂，由于预扩增所用的RPA上下游引物不同，所以对于单一病毒预扩增的试剂除醋酸镁以外其他试剂混合由扩增试剂入口14先加入，醋酸镁后加入，十种病毒所对应的试剂分十个管道加入，保证37～42℃下反应20min。

(4)经过预扩增模块7后的反应液进入CRISPR/Cas13a分析模块8，组合供液模块的检测结果激发模块12为CRISPR/Cas13a分析提供所需的试剂，由于CRISPR/Cas13a分析所用的gRNA不同，所以对于单一病毒CRISPR/Cas13a分析的全部试剂混合由CRISPR/Cas13a分析试剂入口16加入，十种病毒所对应的试剂分十个管道加入，保证37℃下反应15～30min。

(5)反应结束后，由引入的光纤束激发CRISPR/Cas13a分析模块8，荧光结果由CMOS芯片19采集，并传入计算机，操作人员进行下一步的读取判断。

Claims (6)

1.基于模块结构的多重病原快速检测体式微流控系统，包括组合检测模块、组合供液模块与检测底座，其特征在于：三个组合检测模块与一个组合供液模块通过微流道对准并保证相对位置关系，组成一组供液-检测模块，共四组供液-检测模块均布于正方形检测底座上，四个供液模块的倒角面贴合在检测底座中间长方体立柱的四个面实现定位，检测底座设计有四个光纤引出端，与供液模块底部孔相配合，将光纤引入实现检测结果的测量；其中组合检测模块包含四个外形一致、内部结构不同的模块，分别是样本预处理模块、核酸裂解模块、预扩增模块、CRISPR/Cas13a分析模块；组合供液模块包含四个外形一致、内部结构不同的模块，分别是缓冲液模块、裂解液模块、扩增液模块、检测结果激发模块；组合检测模块与组合供液模块分别按照上述模块顺序自上往下竖直排列，前一模块的底面与后一模块的顶面贴合，各个模块通过上一模块的微流道出口与下一模块的微流道入口对准实现定位，组合检测模块的样本预处理模块、核酸裂解模块、预扩增模块、CRISPR/Cas13a分析模块与组合供液模块的缓冲液模块、裂解液模块、扩增液模块、检测结果激发模块一一对应，并通过供液模块的供液流道与检测模块试剂入口流道对准实现定位；检测液由组合供液模块顶部注入，缓冲液模块、裂解液模块、扩增液模块均由组合供液模块顶部缓冲液顶部的入口加入相应的样本缓冲液、核酸裂解液、核酸扩增液，通过微流道分别注入样本预处理模块、核酸裂解模块、预扩增模块，从而实现样本的稀释缓冲、病原体核酸裂解、病原体核酸扩增；所有的模块与检测底座均在三维建模软件中建模，将模型导入3D打印机进行打印获得实体结构。

2.根据权利要求1所述的基于模块结构的多重病原快速检测体式微流控系统，其特征在于：一个组合检测模块实现多个样本的检测，一个样本实现多种不同传染病病原的检测，组合供液模块为组合检测模块提供各阶段反应所需的试剂，且组合供液模块匹配的组合检测模块的数量根据具体检测需要来设计，供液-检测模块的数量根据具体检测需要来设计，本发明设计十二个组合检测模块，四个组合供液模块，共同组成四组供液-检测模块，一个组合检测模块实现两个样本的检测，一个样本实现十种不同传染病病原的检测。

3.根据权利要求1所述的基于模块结构的多重病原快速检测体式微流控系统，其特征在于：在组合检测模块中，样本预处理模块的入口与出口均为2个圆柱直微流道，中间连接螺旋形微流道，再连接出口圆柱直微流道，流入核酸裂解模块。

4.根据权利要求1或3所述的基于模块结构的多重病原快速检测体式微流控系统，其特征在于：核酸裂解模块入口与出口均为2个圆柱直微流道，中间为圆柱体空腔，空腔周围布置有螺旋加热电阻丝，裂解后由出口流入预扩增模块，预扩增模块的1个入口分成10个并行竖直布置的圆柱空腔直微流道，总共二十个竖直布置的微流道流入CRISPR/Cas13a分析模块，CRISPR/Cas13a分析模块的二十个微流道根据检测样本来源分为两组，每组十个，为倾斜交叉的位置关系。

5.根据权利要求1所述的基于模块结构的多重病原快速检测体式微流控系统，其特征在于：在组合供液模块中，缓冲液模块与裂解液模块均在缓冲液模块上表面设有试剂入口，向下设置直微流道贯穿所经过的模块，到达各自模块位置后弯曲90°，分三路横向连接所对应的三个样本预处理模块与核酸裂解模块，扩增液模块与检测结果激发模块均在缓冲液模块上表面设有十个试剂入口，向下设置直微流道贯穿所经过的模块，到达各自模块位置后弯曲90°，分三路横向连接所对应的三个预扩增模块与CRISPR/Cas13a分析模块，其中检测结果激发模块设置有与检测底座的光线引入口相匹配的孔。

6.根据权利要求1所述的基于模块结构的多重病原快速检测体式微流控系统，其特征在于：所述的检测底座包含立柱、光纤引出端、CMOS芯片与底盘，立柱用于供液模块的定位，光纤引出端将激发光纤引入，CMOS芯片用来采集检测结果，后接微型电路系统将检测结果读入计算机，底盘是整个检测系统的底部。

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