CN104341346B - 一种基于白蛋白假酯酶水解反应的特异性荧光探针及应用 - Google Patents

一种基于白蛋白假酯酶水解反应的特异性荧光探针及应用 Download PDF

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Abstract

一种基于白蛋白假酯酶水解反应的特异性荧光探针分子及应用，是基于人血清白蛋白（human serum albumin,HSA）特有的假酯酶活性，即在生理pH值条件下HSA能催化具有酯键结构的荧光探针分子（λex=342nm，λem=416nm）发生类水解反应，其自身的氨基酸与探针分子结构中的羧酸基团形成共价结合，同时释放出含有游离酚羟基的水解产物，该产物是荧光发射谱显著不同于底物分子的荧光母体分子（λex=452nm，λem=564nm），根据检测到荧光母体分子的浓度可以检测体系中对应的HSA的含量。该探针分子可用于测定生物样品中白蛋白的绝对含量。该探针分子的优点在于准确度高，检测灵敏，受环境干扰小，可与各种内源性物质、外源性药物及表面活性剂等兼容。

Description

一种基于白蛋白假酯酶水解反应的特异性荧光探针及应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种基于白蛋白假酯酶水解反应的特异性荧光探针及应用。
背景技术
人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是血浆中含量最丰富的蛋白质，约占到血浆中蛋白总量的50-60%【Biochem Pharmacol.2005Nov25;70(11):1673-84.】。在体液中人血清白蛋白可以运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多治疗分子等，同时能维持血液正常的渗透压。人血清中白蛋白的正常值范围为34-54g/L【Nlm.nih.gov.Retrieved2010-05-12.】。但多种疾病，比如肝病（尤其是肝硬化）、肾病综合症、肿瘤、蛋白丢失性肠病、烧伤以及营养不良等会导致血清白蛋白的水平下降，而高蛋白饮食以及慢性脱水则会造成白蛋白水平升高。因此人血中白蛋白含量的定量测定已被临床用于疾病相关诊断，如果人体白蛋白的含量较正常范围值低很多时就需要给患者注射人血清白蛋白。大量临床实践已证实，监测血清白蛋白水平对于肝病或肾病患者的早期诊断以及疾病的愈后都有十分重要的诊断参考价值。更为重要的是，尿液中出现微量白蛋白一般可作为肾脏疾病（像是糖尿病、高血压、链球菌感染后的肾小球肾炎）、血管内皮功能障碍、心脏疾病以及静脉血栓栓塞的标志物及诊断指标。下表1给出了人体微量蛋白尿诊断值的正常范围。
表1微量蛋白尿诊断值
目前，白蛋白的检测和定量方法包括：电泳法、免疫法和染料结合法等方法。其中电泳法耗时耗力，特异性较差，易造成白蛋白浓度的高估【Clinical Chemistry:Theory,Analysis,Correlation,Mosby,5th edition,2009.】。而免疫法虽然其特异性较好，但成本较高，因此目前临床应用较少。染料结合显色法应用相对较为广泛，但该方法是基于染料小分子与白蛋白部分区域的结合作用或个别氨基酸的修饰作用，机体部分组织蛋白也可与染料小分子发生类似作用，因而其特异性无法保障。溴甲酚绿和溴甲酚紫作为简单、便宜且特异性相对较好的两种染料分子，在临床上被较多的用来定量白蛋白。但由于其灵敏度较低【Clinical Chemistry:Theory,Analysis,Correlation,Mosby,5th edition,2009.】、无法保证定量的准确性，常出现高估【J Clin Pathol.2003,56,780.】或低估现象【Clin ChimActa.1986,155,83.】，且不可避免受到生物样品中的非特异性干扰【Clin Chem.,2009,55,583.】。因而，开发一种简单易操作、特异性高、准确可靠的白蛋白定量方法十分必要。
近年来，国内外学者发现白蛋白还具有催化功能，其可催化具有酯键结构的化合物发生类水解反应（Biochem Pharmacol2010;79(5):784-91&J Biol Chem2008;283(33):22582-90），反应后其自身部分游离氨基酸与酯类分子结构中的羧酸基团形成共价键，同时释放出含有游离酚羟基的一分子水解产物。葛广波等人也发现部分小分子可被白蛋白特异性催化发生类酯酶水解反应，如GLP-1受体激动剂Boc5在人体内仅可被白蛋白催化，而人体其它酯酶并不参与该化合物的水解(Eur.J.Pharm.Sci.2013;48:360–9)。以上国内外新近研究提示我们可针对白蛋白的类酯酶活性设计并开发其特异性的荧光探针底物分子，用于白蛋白的活性评估及定量分析。
本发明提供了一种N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺母体C-4位羟基取代的联苯甲酰酯类衍生物作为人血清白蛋白荧光探针底物的应用，其经白蛋白的假酯酶活性水解后可生成荧光发射波谱不同于原型的水解产物。该水解反应具有选择性高、代谢产物易检测等特点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于白蛋白假酯酶水解反应的特异性荧光探针分子及应用；利用该探针分子，检测人血清、血浆或尿液中白蛋白含量，通过检测样本中的荧光强度值来计算其中的白蛋白浓度；其原型和水解产物的荧光发射波长具有明显差异，且产物更易检测。
本发明提供了一种基于白蛋白假酯酶水解反应的特异性荧光探针，该特异性荧光探针的酯键可被人血清白蛋白特异性水解为与分子荧光发射波谱显著不同的荧光产物，借助体系中产物的含量来确定白蛋白的含量及功能；该特异性荧光探针为N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺母体C-4位羟基被取代的联苯甲酰酯类衍生物，其结构通式如式（1）所示，其中R1为-H、-CH3、-OCH3、-OC2H5中的任意一种，R2为C2-C8烷基，卤代烷基或其衍生物中的任意一种。
式（1）
本发明还提供了所述特异性荧光探针在定量测定不同样本中人血清白蛋白含量的应用，采用上述式（1）化合物作为白蛋白特异性的水解代谢底物，进行水解反应，通过定量检测单位时间内底物的消除量以及水解产物的生成量来测定不同样本（包括重组表达的白蛋白单酶、人组织制备液、各类组织细胞等生物体系）中白蛋白的含量；具体测定方法为：
——体系中以N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺母体C-4位羟基取代的联苯甲酰酯类衍生物作为特异性探针底物；底物浓度选择1/10-10Km；单点测定时底物浓度优选Km；（Km为米氏动力学常数）
——在磷酸缓冲液等常用缓冲液中，反应温度为20-60℃之间（优选反应温度为37℃）；孵育体系pH值介于5.5-10.5之间（优选pH值为7.4）；
——反应时间为5-120分钟，在确保以上底物相应的水解产物达到定量限；
——测定单位时间内底物减少量或水解产物生成量作为白蛋白活性的评价指标。
本发明提供的特异性荧光探针在定量测定不同样本中人血清白蛋白含量的应用，探针底物及其水解产物均具有荧光属性，采用荧光检测器实现底物及产物的快速灵敏检测；荧光检测条件为：激发波长300-500nm，发射波长410-600nm。
本发明提供的所述特异性荧光探针底物的应用，该特异性探针底物用于人血清、血浆或尿液中白蛋白的定量测定。
采用重组表达的人血清白蛋白孵育体系进行考察，通过特异性抑制实验，重组单酶代谢反应，以及酶反应动力学几方面的证据，证明N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺母体C-4位羟基取代的联苯甲酰酯类衍生物可特异性的经白蛋白水解代谢（如图4所示），生成C-4位酯键断裂的水解产物。
选用本发明所述白蛋白的特异性探针检测白蛋白具有以下突出优势：
(1)高特异性：N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺母体C-4位羟基取代的联苯甲酰酯类衍生物可被白蛋白高特异性地代谢成一个代谢产物，即C-4位酯键断裂的水解产物；
(2)廉价易得：N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺母体C-4位羟基取代的联苯甲酰酯类衍生物及其水解产物均可经化学合成获得，合成工艺简单易行；
(3)高灵敏度：具有N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺母体结构的化合物均具有良好的荧光发射光谱特性（410–600nm），该底物及其水解代谢产物具有不同的荧光发射光谱特征，能较好的进行区分检测，同时可经比率法通过绘制标准曲线进行定量测定。
附图说明
图1.N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺C-4羟基被取代的联苯甲酰酯类衍生物的结构式；其中，A为荧光探针分子A，B荧光探针分子B，C为荧光探针分子C，D为荧光探针分子D；
图2.N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺母体C-4位羟基取代的联苯甲酰酯的1H-NMR谱图；
图3.N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺母体C-4位羟基取代的联苯甲酰酯的13C-NMR谱图；
图4.N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺母体C-4位羟基取代的联苯甲酰酯类衍生物的人重组单酶筛选试验结果；
图5.N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺母体C-4位羟基取代的联苯甲酰酯类衍生物及其脱联苯甲酰代谢产物的荧光发射光谱图（分别在342nm或452nm进行激发）；
图6.脱联苯甲酰水解代谢产物的生成量随白蛋白浓度变化的线性拟合。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1.N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺母体C-4位羟基取代的联苯甲酰酯（荧光探针分子A）的化学合成
（1）向10mL含有0.5mmol的N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺和0.625mmol三乙胺的四氢呋喃溶液中，缓慢滴加0.6mM的4-联苯基甲酰氯（溶于10mL二氯甲烷中），控制温度在0℃；
（2）冰浴下搅拌1h后，反应体系放置在室温过夜反应；
（3）反应液经过减压除去溶剂，残留的固体采用硅胶色谱法进行纯化，采用乙酸乙酯-正己烷（1:3,v/v）作为洗脱液，得113mg白色固体A；
（4）对所得白色固体A化合物进行结构确证，其核磁氢谱和碳谱见图2和图3。
实施例2.N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺母体C-4位羟基取代的4-对甲基联苯甲酰酯（荧光探针分子B）的化学合成
（1）向10mL含有0.5mmol的N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺和0.625mmol三乙胺的四氢呋喃溶液中，缓慢滴加0.6mM的4-对甲基联苯基甲酰氯（溶于10mL二氯甲烷中），控制温度在0℃；
（2）冰浴下搅拌1h后，反应体系放置在室温过夜反应；
（3）反应液经过减压除去溶剂，残留的固体采用硅胶色谱法进行纯化，采用乙酸乙酯-正己烷（1:3,v/v）作为洗脱液，得241mg白色固体B；
实施例3.N-正丁酸-4-羟基-1,8-萘酰亚胺母体C-4位羟基取代的4-对甲基联苯甲酰酯（荧光探针分子C）的化学合成
（1）向10mL含有0.5mmol的N-正丁酸-4-羟基-1,8-萘酰亚胺和0.625mmol三乙胺的四氢呋喃溶液中，缓慢滴加0.6mM的4-对甲基联苯基甲酰氯（溶于10mL二氯甲烷中），控制温度在0℃；
（2）冰浴下搅拌1h后，反应体系放置在室温过夜反应；
（3）反应液经过减压除去溶剂，残留的固体采用硅胶色谱法进行纯化，采用乙酸乙酯-正己烷（1:3,v/v）作为洗脱液，得95mg白色固体C；
实施例4.N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺母体C-4位羟基取代的4-甲氧基联苯甲酰酯（荧光探针分子D）的化学合成
（1）向10mL含有0.5mmol的N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺和0.625mmol三乙胺的四氢呋喃溶液中，缓慢滴加0.6mM的4-甲氧基联苯基甲酰氯（溶于10mL二氯甲烷中），控制温度在0℃；
（2）冰浴下搅拌1h后，反应体系放置在室温过夜反应；
（3）反应液经过减压除去溶剂，残留的固体采用硅胶色谱法进行纯化，采用乙酸乙酯-正己烷（1:3,v/v）作为洗脱液，得143mg白色固体D；
实施例5.荧光探针分子A水解代谢的选择性
（1）含有CES1b、CES1c、CES2（5μg/mL）、乙酰胆碱酯酶（0.1U/L）、丁酰胆碱酯酶（20U/L）、血浆（1%）、人血清白蛋白（0.5mg/mL）、小牛血清白蛋白（0.5mg/mL）的pH=6.0的磷酸缓冲液（10mM）196μL，于37℃条件下震荡预孵10分钟；
（2）加入4μL浓度为0.5mM的荧光探针分子A起始反应，以使待测样品中的荧光探针分子的终浓度为10μM；37℃震荡孵育；
（3）30分钟后，加入200μL冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
（4）分别检测探针分子A（λex=342nm，λem=416nm）和水解产物A1（λex=452nm，λem=564nm）在采集波长处的荧光强度值，计算A1与A的荧光强度比值（见图4和图5）。
实施例6.白蛋白定量标准曲线的绘制
（1）采用5mg/mL的人血清白蛋白（HSA）的标准溶液，采用磷酸缓冲液稀释成不同浓度的标准曲线工作液（0,10,20,50,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000mg/L）（见表2），37℃下预孵育10min；
（2）向每个所述溶液样本（980μL）中加入20μL浓度为0.5mM的荧光探针分子B，使其终浓度为10μM；37℃震荡孵育30min，加入1mL的冰乙腈剧烈震荡15秒钟终止反应；
表2制备系列浓度的HSA标准液
（3）分别检测探针分子B（λex=342nm，λem=416nm）和水解产物B1（λex=452nm，λem=564nm）在采集波长处的荧光强度值，将B1与B的荧光强度比值对HSA浓度进行线性拟合作图，建立白蛋白的定量标准曲线；曲线方程为Y=0.005578×X+0.04533，相关系数平方为0.9992（见图6）。
实施例7.人血浆样本中白蛋白的定量分析
（1）吸取1μL（约1小滴）人血浆样本，采用pH=7.4的磷酸缓冲液（10mM）稀释200倍，于45℃条件下震荡预孵10分钟；
（2）加入加入4μL浓度为0.5mM的荧光探针分子B起始反应，以使待测样品中的荧光探针分子的终浓度为10μM；45℃震荡孵育；
（3）30分钟后，加入200μL冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
（4）分别检测探针分子B（λex=342nm，λem=416nm）和水解产物B1（λex=452nm，λem=564nm）在采集波长处的荧光强度值，计算B1与B的荧光强度比值；将荧光比值代入实施例2中的标准曲线中，求得血浆中的白蛋白浓度为46.2mg/mL。
实施例8.人尿液样本中白蛋白的定量分析
（1）吸取490μL人尿液样本，采用pH=7.4的磷酸缓冲液490μL进行稀释，37℃下预孵育10min；
（2）加入20μL的荧光探针分子C（0.5mM），以使待测样品中的荧光探针分子的终浓度为10μM；37℃震荡孵育30min，加入1mL的冰乙腈剧烈震荡15秒钟终止反应；
（3）分别检测探针分子C（λex=342nm，λem=416nm）和水解产物C1（λex=452nm，λem=564nm）在采集波长处的荧光强度值，计算C1与C的荧光强度比值；
（4）在标准曲线中找到对应的白蛋白浓度值，计算出待测样品中的白蛋白浓度为48mg/L。
实施例9.重组表达体系中人白蛋白的定量分析
（1）称取10mg重组表达的人白蛋白样品，用pH=7.4的磷酸缓冲液对其溶解，37℃下配置成1mg/mL白蛋白溶液；
（2）加入20μL的荧光探针分子D（0.5mM），以使待测样品中的荧光探针分子的终浓度为10μM；37℃震荡孵育30min后，加入1mL的冰乙腈剧烈震荡15秒钟终止反应；
（3）分别检测探针分子D（λex=342nm，λem=416nm）和水解产物D1（λex=452nm，λem=564nm）在采集波长处的荧光强度值，计算D1与D的荧光强度比值；
（4）基于白蛋白标准曲线计算出该样品（1mg/mL重组表达白蛋白溶液）中白蛋白的含量为14.9μM。

Claims (5)

1.一种基于白蛋白假酯酶水解反应的特异性荧光探针，其特征在于：该特异性荧光探针的酯键可被人血清白蛋白特异性水解为与分子荧光发射波谱显著不同的荧光产物，借助体系中产物的含量来确定白蛋白的含量及功能；
该特异性荧光探针为N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺母体C-4位羟基被取代的联苯甲酰酯类衍生物，其结构式如式(1)A、B、C、D所示，
2.一种权利要求1所述特异性荧光探针在定量测定不同样本中人血清白蛋白含量的应用，其特征在于：采用上述式(1)化合物作为白蛋白特异性的水解代谢底物，进行水解反应，通过定量检测单位时间内底物的消除量以及水解产物的生成量来测定不同样本中白蛋白的含量。
3.按照权利要求2所述特异性荧光探针在定量测定不同样本中人血清白蛋白含量的应用，其特征在于：所述样本为重组表达的白蛋白单酶、人组织制备液或各类组织细胞。
4.按照权利要求2所述特异性荧光探针在定量测定不同样本中人血清白蛋白含量的应用，其特征在于：所述水解反应条件为：体系为磷酸缓冲液；探针底物的浓度介于1/10-10Km之间；孵育体系pH值介于5.5-10.5之间；反应温度介于20-60℃之间。
5.按照权利要求2所述特异性荧光探针在定量测定不同样本中人血清白蛋白含量的应用，其特征在于：探针底物及其水解产物均具有荧光属性，采用荧光检测器实现底物及产物的快速灵敏检测；荧光检测条件为：激发波长300-500nm，发射波长410-600nm。
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CN106867512B (zh) * 2015-12-11 2019-01-04 中国科学院大连化学物理研究所 一种检测抗生物素蛋白的比率型荧光探针及其合成方法和应用
CN107022349B (zh) * 2016-01-29 2019-10-11 中国科学院大连化学物理研究所 细胞色素氧化酶cyp1a1特异性荧光探针及其制备方法与应用
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CN111187208B (zh) * 2020-01-08 2022-08-12 大连理工大学 一种用于检测胃蛋白酶的荧光探针及其在诊断胃食管反流中的应用
KR102382462B1 (ko) * 2020-07-17 2022-04-05 광주과학기술원 신규한 부티릴콜린에스테라아제 검출용 형광 탐침
CN113358528B (zh) * 2021-06-08 2022-06-17 山东大学 一种基于悬滴法检测乙酰胆碱酯酶及其抑制剂的方法

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CN101942211B (zh) * 2010-09-21 2013-08-14 大连理工大学 一类含芳香酯基的萘酰亚胺类荧光二向性染料及其应用

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