CN106546577B - 人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒及其使用方法和应用 - Google Patents

人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒及其使用方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒及其使用方法和应用。该试剂盒包括A液、B液、C液和质控标准品，所述A液为100mM磷酸盐缓冲液，pH＝5.5～10，优选pH6.5的缓冲体系；所述B液为0.1～10mM含有人羧酸酯酶1的特异性生物探针底物的溶液，溶剂为二甲基亚砜；所述C液为荧光素检测试剂；所述质控标准品为5mg/ml的hCE1的pH6.5的磷酸盐溶液。所述人羧酸酯酶1的特异性生物探针底物为4，5‑二氢‑2(6‑羟基‑2‑苯咪唑)4‑羧酸噻唑甲酯或4，5‑二氢‑2(6‑氨基‑2‑苯咪唑)4‑羧酸噻唑甲酯,该试剂盒可用于检测不同生物样本中hCE1的存在与否及其酶活的定量测定，还用于快速筛选hCE1的抑制剂/诱导剂。本发明的优点为操作简单、单位检测成本低、灵敏、快速、可高通量检测。

Description

人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒及其使用方法和应用
技术领域
本发明属医药生物技术领域，具体涉及一种人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒及其使用方法和应用。
背景技术
人羧酸酯酶1(hCE1)是人体内分布的一种重要功能蛋白，其在人群的肝脏中含量很高，其蛋白表达量在肝脏分布蛋白中排前十位。hCE1是一种膜结合蛋白，定位于细胞内质网中【CANCER RESEARCH 1998；58:3627-32&Drug Metab.Pharmacokinet.2006；21:173-85】，同时也会分泌到细胞外进入血液循环系统【Proteomics 2009；9:3989–99】。hCE1的基本代谢反应是催化含较小醇基和较大酰胺基底物的水解。虽然，在多种组织的中都检测到hCE1的蛋白表达，但其在人肝脏组织含量远高于其它组织。hCE1参与多种外源性物质的代谢清除，例如药物奥司他韦、哌醋甲酯等。同时，hCE1在维持人体正常生理功能功能发挥不可忽视的作用，参与人体内胆固醇酯和游离脂肪酸的运输和代谢过程，维持脂质代谢平衡【Chemistry&Biology,Vol.10,341–349,April,2003】。在正常健康人体中，hCE1除了以较高的含量分布在肝组织的细胞中，也有少量hCE1在血浆中被检测到，更重要的是，肝细胞肝癌患者血浆中的hCE1是健康人群的2-5倍，因此hCE1被认为是肝细胞肝癌早期诊断的一种良好的潜在血清学标志物【Proteomics 2009,9,3989–3999】。此外，肝细胞破损相关的肝脏疾病患者也会有hCE1释放入血，引起血浆中hCE1浓度发生变化，因此，血浆中hCE1可作为肝脏急性损伤的标志物。hCE1的分布存在很大的个体差异，hCE1酶的表达和功能本身会受到人体遗传、年龄、疾病、性别、环境和共服药物等多种因素的影响。因此，hCE1酶的活性检测方法具有广阔的临床应用前景，可用于评价人体肝脏功能异常、药物及毒物导致的肝毒性、肝细胞癌早期诊断、肝功能个体化评估、以及部分前体药物的个性化使用等。此外，hCE1作为维持人体脂质代谢平衡的重要蛋白，其抑制剂可作为降血脂药物使用，hCE1也被FDA批准为重要的药物作用靶点。hCE1活性的快速表征方法也可用于新药研发早期发现及评估hCE1新型高效抑制剂。因此，开发高效、超灵敏、高特异性的hCE1活性检测方法对于临床样本中hCE1活性的检测，以及新药高内涵高通量筛选至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒及其使用方法和应用。该试剂盒使用4，5-二氢-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯或4，5-二氢-2(6-氨基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯作为人羧酸酯酶1探针底物(图1)，探针经hCE1水解后可生成萤火虫荧光素酶的底物。基于单位时间产物的生成量来表示酶的活性。该酶促反应具有选择性高、代谢产物易检测、酶活及抑制活性评价快速高效等特点。
一种人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒，该试剂盒包括4种试剂：A液、B液、C液和质控标准品；
所述A液为：为100mM磷酸盐缓冲液，pH＝5.5～10，
所述B液为0.1～10mM的含有人羧酸酯酶1的特异性生物探针底物的溶液，溶剂为二甲基亚砜，
所述C液为荧光素酶检测试剂，含0.5mM的ATP，10mM的Mg2+及50g/ml的荧光素酶
所述质控标准品为5mg/ml的hCE1水溶液；
所述人羧酸酯酶1的特异性生物探针底物为4，5-二氢-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯或4，5-二氢-2(6-氨基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯，其结构通式如式为：
其中R为-OH或-NH2；
在pH 6.5的缓冲体系中，上述化合物的甲酯键可被hCE1特异性水解为相应水解产物4，5-二氢-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酸或4，5-二氢-2(6-氨基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酸。
所述A液优选pH为6.5。
一种人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒的使用方法，具体按下面步骤进行：
(1)预孵育：将待测样品与A液混匀，20～60度下孵育3～5分钟；混合液总体积为20μL，将待测样品的浓度为：0～0.5mg/ml。
(2)起始反应：加入B液后混匀，20～60度下孵育2～120分钟；B液的体积为30μL，终浓度3μM。
(3)检测：加入C液，混匀，37℃孵育20-30min，用酶标仪或化学发光分析仪测定样品，所述C液加入量为50μL。
所述待测样品重组表达的hCE1、含有hCE1的哺乳动物细胞/组织制备液、血浆或其他常见生物样本。
一种人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒的应用，该试剂盒可用于人羧酸酯酶1活性的快速定量检测，以及该酶抑制剂的快速筛选与评估。
所述试剂盒用于人羧酸酯酶1活性的快速定量检测的方法为：探针底物4，5-二氢-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯或4，5-二氢-2(6-氨基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯可被人羧酸酯酶1特异性水解为萤火虫荧光素酶的底物；按照试剂盒的使用方法，通过定量检测单位时间内样品中目标物的生物发光强度来表征水解产物的生成量，进而测定不同样本中人羧酸酯酶1的活性。
该试剂盒用于人羧酸酯酶1抑制剂的快速筛选与评估方法为：以人羧酸酯酶1的特异性生物探针底物的水解反应作为hCE1的特异性探针反应，按照试剂盒的使用方法，通过定量比较抑制剂存在与缺失状态下单位时间内水解产物的生成量评估该生物体系中hCE1的残余活性，进而实现hCE1抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。
该试剂盒检测原理是利用人羧酸酯酶1能催化水解酯键的特性，特异地识别与催化人羧酸酯酶1的特异性生物探针底物结构中的甲酯，在生理pH条件下水解生成萤火虫荧光素酶的底物。利用该探针反应可对多种生物体系中hCE1的分布和功能进行定量评价。其检测原理如图8所示。
本发明所述特异性检测人羧酸酯酶(hCE1)的试剂盒的应用领域，包括但不限于重组表达的hCE1酶、含有hCE1的细胞及组织制备物、血浆等生物样品中hCE1活性的定量测定。
本发明提供的检测人羧酸酯酶1(hCE1)的试剂盒的应用，需注意所述底物消除率或水解产物的生成率应介于0.1％～20％之间。
本发明所提供的检测人羧酸酯酶1(hCE1)的试剂盒，产物4，5-二氢-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酸或4，5-二氢-2(6-氨基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酸是萤火虫荧光素酶的底物，可采用化学发光检测器实现产物的快速灵敏检测。此外，该特异性探针底物及相应hCE1活性检测过程不会受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种生物体系中hCE1酶活的定量测定。
本发明中试剂盒可用于重组羧酸酯酶、细胞或组织制备液等多种生物体系中hCE1酶活的定量测定，还可用于快速筛选hCE1酶的抑制剂及抑制能力的定量评价。
选用本发明所述的人羧酸酯酶1检测试剂盒及其使用方法具有以下突出优势：
(1)高特异性：4，5-二氢-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯或4，5-二氢-2(6-氨基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯可被hCE1高特异性地代谢成一个代谢产物，即甲酯键断裂的水解产物；
(2)廉价易得：底物4，5-二氢-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯或4，5-二氢-2(6-氨基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯及其水解产物均可经化学合成获得，合成工艺简单易行；
(3)高灵敏度：水解产物为荧光素酶的底物，可用荧光素酶检测试剂进行高灵敏度的检测，最低定量下限为0.1nM。
(4)高通量检测：利用该类荧光探针底物可实现96,386孔板的快速检测，可实现每日2万个样品的高通量检测，具有单个测试成本低廉(<0.5元)的优势。
附图说明
图1.hCE1生物发光探针底物的结构式；
图2.4，5-二氢-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯的人重组单酶筛选试验结果；
图3.hCE1水解4，5-二氢-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯的线性反应浓度
图4.hCE1的活性化学抑制实验
图5.12例HLM对4，5-二氢-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯的水解速率差异；
图6.6种肿瘤细胞S9对4，5-二氢-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯的水解速率差异；
图7.8例健康人血浆对4，5-二氢-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯的水解速率差异；
图8.4，5-二氢-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯的代谢检测示意图。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。hCE1生物发光探针底物的结构式如图1所示，hCE1试剂盒的检测原理如图8所示。该试剂盒的具体应用如下所示。
实施例1
体外测定人重组单酶中hCE1的选择性
(1)预先准备20μl hCE1代谢反应体系，包括A液、人重组各单酶(5μg/mL)，于37℃条件下震荡预孵10分钟；
(2)向反应体系中加入30μl的B液(终浓度3μM)起始反应；
(3)10分钟后，加入50μl的C液，37℃孵育20min后，酶标仪检测发光。
重组人hCE1特异性参与其水解，其它酯酶均不参与其水解，证实该类化合物具有非常好的选择性(图2)。
实施例2
hCE1水解4，5-二氢-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯的线性反应浓度
(1)预先准备20μl hCE1代谢反应体系，包括A液、人重组单酶hCE1(系列浓度)，于37℃条件下震荡预孵10分钟；
(2)向反应体系中加入30μl的B液(终浓度3μM)起始反应；
(3)10分钟后，加入50μl的C液，37℃孵育20min后，酶标仪检测发光。
该试剂盒最低能检测到0.02ug/ml的hCE1(图3)。
实施例3
hCE1抑制剂的抑制能力表征
(1)准备hCE1代谢反应体系，包括A液、人肝微粒体、不同酯酶特异性抑制剂(100μM)于37℃条件下震荡预孵10分钟；
(2)向反应体系中加入30μl浓度为5μM的B液起始反应起始反应；
(3)10分钟后，加入50μl的C液，37℃孵育20min后，酶标仪检测发光。
4，5-二氢-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯在人肝微粒体中的水解活性能够被羧酸酯酶特异性抑制剂BNPP显著抑制，而其它酯酶抑制剂对其水解没有显著的抑制活性，证实4，5-二氢-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯能够特异性检测复杂生物样本的hCE1的活性(图4)。
实施例4
不同个体来源肝微粒体中hCE1的活性定量评估
(1)选取12例个体人肝微粒体(HLM)，准备hCE1代谢反应体系，包括A液、人肝微粒体、于37℃条件下震荡预孵3分钟；
(2)向反应体系中加入30μl的B液(终浓度3μM)起始反应；
(3)10分钟后，加入50μl的C液，37℃孵育20min后，酶标仪检测发光。
检测到的发光信号强度代入标准曲线后得到12例人肝微粒体(HLM)对4，5-二氢-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯的代谢速率(图5A)，该测定结果与氯吡格雷测定的hCE1活性呈良好的相关性(图5B)。
实施例5
肿瘤细胞中hCE1的活性定量评估
(1)选取6种肿瘤细胞系，准备hCE1代谢反应体系，包括A液、细胞匀浆(2μL)、于37℃条件下震荡预孵3分钟；
(2)向反应体系中加入30μl的B液(终浓度3μM)起始反应；
(3)10分钟后，加入50μl的C液，37℃孵育20min后，酶标仪检测发光。
检测到的发光信号强度代入标准曲线后得到6种细胞S9对4，5-二氢-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯的代谢速率(图6)。
实施例6
血浆中hCE1的活性定量评估
(1)选取8例健康人的血浆，准备hCE1代谢反应体系，包括A液、人血浆(2μL)、于37℃条件下震荡预孵3分钟；
(2)向反应体系中加入30μl的B液(终浓度3μM)起始反应；
(3)10分钟后，加入50μl的C液，37℃孵育20min后，酶标仪检测发光。
检测到的发光信号强度代入标准曲线后得到8例健康人血浆对4，5-二氢-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯的代谢速率(图7)。

Claims (7)

1.一种人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括如下四种试剂：A液、B液、C液和质控标准品；
其中所述A液为100mM磷酸盐缓冲液，pH＝5.5～10；
所述B液为0.1～10mM含有人羧酸酯酶1的特异性生物探针底物的溶液，溶剂为二甲基亚砜；
所述C液为荧光素检测试剂，含0.5mM的ATP，10mM的Mg2+及50g/ml的荧光素酶；
所述质控标准品为5mg/ml的hCE1的pH 6.5的磷酸盐溶液；
所述人羧酸酯酶1的特异性生物探针底物为4，5-二氢-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯或4，5-二氢-2(6-氨基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯，其结构通式如式为：
其中R为-OH或-NH2；
在缓冲体系中，上述化合物的甲酯键可被hCE1特异性水解为相应水解产物4，5-二氢-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酸或4，5-二氢-2(6-氨基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酸。
2.按照权利要求1所述的一种人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒，其特征在于所述A液优选pH为6.5。
3.一种权利要求1所述人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒的使用方法，其特征在于其检测步骤如下：
(1)预孵育：将待测样品与A液混匀，20～60度下孵育3～5分钟；
(2)起始反应：加入B液后混匀，20～60度下孵育2～120分钟；
(3)检测：加入C液，混匀，37℃孵育20-30min，用酶标仪或化学发光分析仪测定样品。
4.按照权利要求3所述人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒的使用方法，其特征在于所述待测样品为：重组表达的hCE1、含有hCE1的哺乳动物细胞/组织制备液、血浆。
5.按照权利要求1所述的人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒的应用，其特征在于，该试剂盒用于人羧酸酯酶1活性的快速定量检测，以及该酶抑制剂的快速筛选与评估。
6.按照权利要求5所述人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒的应用，其特征在于：该试剂盒用于人羧酸酯酶1活性的快速定量检测，方法为：按照试剂盒的使用方法，通过定量检测单位时间内样品中目标物的荧光强度来表征水解产物的生成量，进而测定不同样本中人羧酸酯酶1的活性。
7.按照权利要求5所述人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒的应用，其特征在于：该试剂盒用于人羧酸酯酶1抑制剂的快速筛选与评估，方法为：按照试剂盒的使用方法，通过定量比较抑制剂存在与缺失状态下单位时间内水解产物的生成量评估该生物体系中hCE1的残余活性，进而实现hCE1抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。
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Characterization of pyrethroid hydrolysis by the human liver carboxylesterases hCE-1 and hCE-2;Kosuke Nishi et al.;《Archives of Biochemistry and Biophysics》;20051129;第445卷;115-123 *

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