JP2016533735A - アルブミンの偽エステラーゼ加水分解反応に基づく特異的蛍光プローブおよび応用 - Google Patents
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Abstract
Description
――系中でN−n−ブチル−4−ヒドロキシ−1,8−ナフタルイミド骨格のC−4位のヒドロキシ基を置換したジベンゾイルエステル類誘導体を特異的プローブの基質とする。基質濃度は1/10〜10Kmを選択し、一点測定時の基質濃度は好ましくはKmである(Kmはミカエリス定数である)。
――リン酸緩衝液など常用される緩衝液中で、反応温度20〜60℃の間(好ましい反応温度は37℃である)、培養系のpH値5.5〜10.5の間(好ましいpH値は7.4)である。
――反応時間は5〜120分間であり、上の基質に相応する加水分解生成物が定量限界に達することを確保する。
――単位時間内の基質の減少量または加水分解生成物の生成量を測定し、アルブミン活性の評価指標とする。
(1)高特異性:N−n−ブチル−4−ヒドロキシ−1,8−ナフタルイミド骨格のC−4位のヒドロキシ基を置換したジベンゾイルエステル類誘導体は、アルブミンにより高特異的に1つの代謝生成物、すなわちC−4位のエステル結合が切断された加水分解生成物に代謝されることができる。
(2)廉価で入手しやすい:N−n−ブチル−4−ヒドロキシ−1,8−ナフタルイミド骨格のC−4位のヒドロキシ基を置換したジベンゾイルエステル類誘導体およびその加水分解生成物は、いずれも化学合成により得ることができ、合成工程は簡単で実行しやすい。
(3)高感度:N−n−ブチル−4−ヒドロキシ−1,8−ナフタルイミド骨格構造を有する化合物は、いずれも良好な蛍光放射スペクトル特性(410〜600nm)を有し、該基質およびその加水分解代謝生成物は、異なる蛍光放射スペクトル特性を有し、より良好に識別、測定を行うことができる。さらに比率法により、検量線を作成して定量、測定を行うことができる。
(1)0.5mmolのN−n−ブチル−4−ヒドロキシ−1,8−ナフタルイミドおよび0.625mmolのトリエチルアミンを含有する10mLのテトラヒドロフラン溶液に、0.6mMの4−ビフェニルカルボニルクロリド(ジクロロメタン10mLに溶解)をゆっくりと滴加し、温度を0℃に制御する。
(2)氷浴で1時間撹拌した後、反応系を室温に置いて一晩反応させる。
(3)反応液の溶媒を減圧除去し、残った固体をシリカゲルクロマトグラフィで精製する。酢酸エチル−n−ヘキサン(1:3、v/v)を溶離液とし、113mgの白色固体Aを得る。
(4)得られた白色固体A化合物に対して構造同定を行う。そのプロトン核磁気共鳴スペクトルおよびカーボン13核磁気共鳴スペクトルは、図2および図3を参照のこと。
(1)0.5mmolのN−n−ブチル−4−ヒドロキシ−1,8−ナフタルイミドおよび0.625mmolのトリエチルアミンを含有する10mLのテトラヒドロフラン溶液に、0.6mMの4−パラメチルビフェニルカルボニルクロリド(ジクロロメタン10mLに溶解)をゆっくりと滴加し、温度を0℃に制御する。
(2)氷浴で1時間撹拌した後、反応系を室温に置いて一晩反応させる。
(3)反応液の溶媒を減圧除去し、残った固体をシリカゲルクロマトグラフィで精製する。酢酸エチル−n−ヘキサン(1:3、v/v)を溶離液とし、241mgの白色固体Bを得る。
(1)0.5mmolのN−n−酪酸−4−ヒドロキシ−1,8−ナフタルイミドおよび0.625mmolのトリエチルアミンを含有する10mLのテトラヒドロフラン溶液に、0.6mMの4−パラメチルビフェニルカルボニルクロリド(ジクロロメタン10mLに溶解)をゆっくりと滴加し、温度を0℃に制御する。
(2)氷浴で1時間撹拌した後、反応系を室温に置いて一晩反応させる。
(3)反応液の溶媒を減圧除去し、残った固体をシリカゲルクロマトグラフィで精製する。酢酸エチル−n−ヘキサン(1:3、v/v)を溶離液とし、95mgの白色固体Cを得る。
(1)0.5mmolのN−n−ブチル−4−ヒドロキシ−1,8−ナフタルイミドおよび0.625mmolのトリエチルアミンを含有する10mLのテトラヒドロフラン溶液に、0.6mMの4−メトキシビフェニルカルボニルクロリド(ジクロロメタン10mLに溶解)をゆっくりと滴加し、温度を0℃に制御する。
(2)氷浴で1時間撹拌した後、反応系を室温に置いて一晩反応させる。
(3)反応液の溶媒を減圧除去し、残った固体をシリカゲルクロマトグラフィで精製する。酢酸エチル−n−ヘキサン(1:3、v/v)を溶離液とし、143mgの白色固体Dを得る。
(1)CES1b、CES1c、CES2(5μg/mL)、アセチルコリンエステラーゼ(0.1U/L)、ブチリルコリンエステラーゼ(20U/L)、血漿(1%)、ヒト血清アルブミン(0.5mg/mL)、子牛血清アルブミン(0.5mg/mL)を含有するpH=6.0のリン酸緩衝液(10mM)196μLを、37℃の条件下で振盪して10分間プレインキュベートする。
(2)濃度が0.5mMの蛍光プローブ分子Aを4μL加えて反応を開始する。試験サンプル中の蛍光プローブ分子の終濃度を10μMにし、37℃で振盪培養する。
(3)30分後、200μLの冷アセトニトリルを添加して、激しく振盪した後、反応を止める。
(4)プローブ分子A(λex=342nm、λem=416nm)および加水分解生成物A1(λex=452nm、λem=564nm)の収集波長部分の蛍光強度値をそれぞれ測定し、A1およびAの蛍光強度比を計算する(図4および図5を参照)。
(1)5mg/mLのヒト血清アルブミン(HSA)の標準溶液を使用し、リン酸緩衝液で様々な濃度の検量線標準液(0、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000mg/mL)に希釈し(表2を参照のこと)、37℃で10分間プレインキュベートする。
(2)それぞれの前記溶液サンプル(980μL)に濃度が0.5mMの蛍光プローブ分子Bを20μL添加し、その終濃度を10μMにする。37℃で30分間振盪培養し、1mLの冷アセトニトリルを添加して15秒間激しく振盪し、反応を止める。
(1)ヒト血漿サンプルを1μL(約1滴)取り、pH=7.4のリン酸緩衝液(10mM)で200倍に希釈し、45℃の条件下で振盪して10分間プレインキュベートする。
(2)濃度が0.5mMの蛍光プローブBを4μL添加して反応を開始する。試験サンプル中の蛍光プローブ分子の終濃度を10μMにし、45℃で振盪培養する。
(3)30分後、200μLの冷アセトニトリルを添加し、激しく振盪した後、反応を止める。
(4)プローブ分子B(λex=342nm、λem=416nm)および加水分解生成物B1(λex=452nm、λem=564nm)の収集波長部分の蛍光強度値をそれぞれ測定し、B1およびBの蛍光強度比を計算する。蛍光比を実施例2の検量線に当てはめ、血漿中のアルブミン濃度46.2mg/mLが得られる。
(1)ヒト尿サンプルを490μL取り、pH=7.4のリン酸緩衝液490μLで希釈し、37℃下で10分間プレインキュベートする。
(2)20μLの蛍光プローブ分子C(0.5mM)を添加し、試験サンプル中の蛍光プローブ分子の終濃度を10μMにする。37℃で30分間振盪培養し、1mLの冷アセトニトリルを添加して15秒間激しく振盪し、反応を止める。
(3)プローブ分子C(λex=342nm、λem=416nm)および加水分解生成物C1(λex=452nm、λem=564nm)の収集波長部分の蛍光強度値をそれぞれ測定し、C1およびCの蛍光強度比を計算する。
(4)検量線で対応するアルブミン濃度値を求め、試料サンプル中のアルブミン濃度48mg/Lが算出される。
(1)組換発現したヒトアルブミンサンプルを10mg秤取し、pH=7.4のリン酸緩衝液でこれを溶解し、37℃下で1mg/mLのアルブミン溶液を調製する。
(2)20μLの蛍光プローブ分子D(0.5mM)を添加し、試料サンプル中の蛍光プローブ分子の終濃度を10μMにする。37℃で30分間振盪培養した後、1mLの冷アセトニトリルを添加して15秒間激しく振盪し、反応を止める。
(3)プローブ分子D(λex=342nm、λem=416nm)および加水分解生成物D1(λex=452nm、λem=564nm)の収集波長部分の蛍光強度値をそれぞれ測定し、D1およびDの蛍光強度比を計算する。
(4)アルブミンの検量線に基づいて該サンプル(1mg/mL組換発現アルブミン溶液)中のアルブミン含量14.9μMが算出される。
Claims (5)
- アルブミンの偽エステラーゼ加水分解反応に基づく特異的蛍光プローブであって、該特異的蛍光プローブのエステル結合が、ヒト血清アルブミンにより特異的に分解されて、分子蛍光放射スペクトルが顕著に異なる蛍光生成物を生成することができ、系中の生成物の含量により、アルブミンの含量および機能を確定し、
該特異的蛍光プローブは、N−n−ブチル−4−ヒドロキシ−1,8−ナフタルイミド骨格のC−4位のヒドロキシ基が置換されたジベンゾイルエステル類誘導体であり、その構造式は式(1)に示す通りであり、式中、R1は−H、−CH3、−OCH3、−OC2H5のうちいずれか1種であり、R2はC2〜C8アルキル基、ハロゲン化アルキル基またはその誘導体のうちいずれか1種であることを特徴とする、特異的蛍光プローブ。
- 上記式(1)の化合物をアルブミン特異的加水分解の代謝基質として使用し、加水分解反応を行い、単位時間内の基質の除去量および加水分解生成物の生成量を定量、測定することにより、様々なサンプル中のアルブミン含量を測定することを特徴とする、請求項1に記載の様々なサンプル中のヒト血清アルブミン含量の定量、測定における特異的蛍光プローブの応用。
- 前記サンプルが組換発現したアルブミン単一酵素、ヒト組織調製液または各種組織細胞であることを特徴とする、請求項2に記載の様々なサンプル中のヒト血清アルブミン含量の定量、測定における特異的蛍光プローブの応用。
- 前記加水分解反応の条件として、系がリン酸緩衝液であり、プローブ基質の濃度が1/10〜10Kmの間であり、培養系のpH値が5.5〜10.5の間であり、反応温度が20〜60℃の間であることを特徴とする、請求項2に記載の様々なサンプル中のヒト血清アルブミン含量の定量、測定における特異的蛍光プローブの応用。
- プローブ基質およびその加水分解生成物がいずれも蛍光特性を有し、蛍光検出器で基質および生成物の迅速、高感度な測定を実現し、蛍光測定の条件は、励起波長300〜500nm、放射波長410〜600nmであることを特徴とする、請求項2に記載の様々なサンプル中のヒト血清アルブミン含量の定量、測定における特異的蛍光プローブの応用。
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