CN102041312A - 利用核酸酶反应进行dna单碱基突变颜色检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利用核酸酶反应进行DNA单碱基突变颜色检测的方法。其特征在于利用结构专一的核酸酶(以单链DNA专一的S1核酸酶和双链DNA专一的DSN核酸酶为例)，选择性地将单链或者双链DNA降解为能够更好稳定纳米金的单核苷酸(dNMP)和短链DNA，从而方便地实现单碱基突变的颜色检测，无需通过精确控温、水解或者超声处理。本发明提供的检测方法可以高选择性地检测16bp合成靶标中任意位置的单碱基突变，可以检测的靶标长度超过80bp，具有广阔的应用前景。

Description

利用核酸酶反应进行DNA单碱基突变颜色检测的方法

技术领域

本发明涉及一种利用核酸酶反应进行DNA单碱基突变颜色检测的方法，属于纳米生物技术领域。

背景技术

研究表明单碱基突变(SNP)与多种疾病的发生和药物反应具有直接的相关性。在数量庞大的DNA碱基序列中准确检测极少数基因的变异对重大疾病的预防、早期诊断、基因损坏研究以及制药等重要领域都非常重要。迫切需要能够进行SNP灵敏检测的技术，单碱基突变检测的选择性(也就是完全互补靶标与单碱基突变靶标的检测信号的差异)是SNP检测技术最重要的指标。该技术对单碱基突变的选择性越高，出现假阴性或假阳性的几率就越低，在复杂生物样本和低浓度样本中检出目标基因的可能性就越高。因此，提高和设计具有高单基因突变选择性的基因检测技术一直以来都是生物检测技术研究最重要研究领域之一。

目前提高单碱基突变检测的选择性的方法可以大致可划分为两大类：基于选择性酶反应的SNP检测方法和基于探针工程化设计的SNP检测方法。

基于选择性酶反应的SNP检测方法主要依靠核酸消化酶(Nucleases)或连接酶(Ligases)对DNA结构的选择性来实现单碱基突变的检测。这类方法的SNP选择性比较高，缺点是检测操作相对复杂，一般是多步操作，经常还需要分离与纯化的步骤。

基于探针工程化设计的SNP检测方法通过设计具有不同结构的探针来提高普通单条直线型探针的SNP选择性，虽这类方法不需要使用酶，但操作和设计上仍然不够简单，需要大量的条件优化。比如基于毗邻杂交技术(Stacking Hybridization)的二元探针(Fu，D.J.；et al Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1995，92，10162-10166.)，这一技术利用了短探针在通常杂交条件下不能够与靶标杂交形成双链DNA，但是如果其杂交的位置与双链DNA结构相邻，就可以在优化的条件下与靶标杂交，但是存在单碱基突变的短探针仍然不能与靶标杂交。由于使用短探针，这种方法可以大大减少高通量SNP检测中检测探针的数量，从而减少DNA检测芯片的探针密度。缺点是操作步骤仍然不够简单，包括两次甚至多次的需要严格控温的杂交过程(由于短链探针在室温下不能有效杂交)，每次杂交过程前后都需要严格控制条件(盐浓度、温度、时间、成份等)的清洗步骤。

再如化学修饰的探针，例如噻唑橙(thiazole orange)修饰的FIT(Forced Intercalation)探针(ChemBioChem，2005，6，69-77)和BDF(Base Discriminating Fluorescent)探针(J.Am.Chem.Soc.2004，126，4820-4827)，这些探针在没有靶标存在的时候产生微弱的荧光，但是在靶标存在的时候发射出强的荧光信号。但是这类探针SNP检测的专一性极大地依赖于错配碱基对的序列、共轭位置和链接DNA链的长度，这就限制了方法的通用性，也为定量检测带来了困难。构相受限的探针是近年来发展起来的另一类探针，比如Pseudoknot结构和具有三段双链DNA(triple-stem DNA)结构的探针(Yi Xiao，et al.Angew.Chem.Intl.Ed.2009，48，1-6)。这类探针检测SNP时操作简单，SNP的选择性也可以与利用酶检测SNP的选择性相当，缺点是探针需要人为设计和优化，很难推广使用。

就信号输出的方式而言，目前荧光检测和电化学检测是最主要的信号输出方式，这就要求对探针进行荧光或电化学基团的修饰，探针的价格贵，而且需要昂贵的荧光检测设备或电化学检测设备。其中电化学检测还需要将探针组装在电极上，步骤繁琐，重复性差。这些方法不能够满足基础设施简单的场合使用，因此非常需要研发不需要标记探针，也不需要复杂检测设备，而且操作简单的SNP检测方法。

近些年来，纳米金被广泛用于生物传感技术中，实现快速、灵敏、方便和经济的颜色检测。这些技术利用纳米金表面等离子共振的光学性能，独立存在的纳米金是红色的，而聚集在一起的纳米金是蓝灰色或紫色的。这种颜色变化可以使可见光的吸收波长产生高达300nm的移动。这种颜色变化可以直接用肉眼观察，无需任何复杂设备，也可以使用光谱仪进行定量检测。

现有的引起纳米金的聚集的方法可以分为两大类。第一类方法是检测物作为交联剂将纳米颗粒联结在一起，从而引起聚集。如DNA诱导的通过颗粒间交联造成的聚集方法。这类方法需要将单链DNA，DNA酶，RNA酶或核酸适配体连接到纳米材料的表面。实验步骤相对繁琐，DNA，DNA酶，RNA酶或核酸适配体的用量大。第二类方法是非交联的纳米颗粒聚集方法，这种方法利用纳米颗粒在加入检测物后稳定性的降低。这种稳定性的降低是由于纳米颗粒表面用于提高纳米金稳定性的DNA分子或ATP的破坏，取代或消耗；或者由于与未修饰纳米颗粒相互作用的溶液中可以稳定纳米颗粒的ATP或单链DNA的减少。这类方法大多使用未修饰的纳米金颗粒。

使用未修饰纳米金进行检测的方法是目前所有检测技术中最为简单、便宜和快速的检测技术，目前该方法已经用于包括对DNA、小分子和重金属离子在内的多类生物分子的检测。这类方法多是基于双链DNA结构比单链DNA稳定纳米金差这一现象。所报道的使用未修饰纳米金对DNA进行检测的方法就是利用互补靶标可以与探针形成双链DNA，而双链DNA不能够很好地稳定纳米金，加入适量的盐溶液之后，纳米金聚集为蓝色，当靶标不能够与探针杂交形成双链DNA的，单链DNA能够很好地稳定纳米金，加入相同量的盐溶液之后，纳米金仍然保持红色。因此可以用于DNA的检测。(Huixiang Li，Lewis Rothberg Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2004，vol101，14036-14039.)上述采用未修饰纳米金进行DNA检测的方法存在着以下不足：

1)这种方法需要通过精确控温、水解或者超声处理，才能实现对单碱基突变的颜色检测。操作不够简单。

2)从本质上说还是利用完全互补靶标与单碱基突变靶标的解链温度(Tm)的微小差异(一般小于几个摄氏度)来进行单碱基突变的检测。这与传统的依靠精确控温和梯度洗脱进行SNP检测的方法类似，单碱基突变检测的选择性不高。尤其是对偏离中心位置的突变位点，不易检出。而且只能用于检测较短长度的靶标，通常短于20bp。

发明内容

本发明针对现有技术中的问题，其目的在于提供一种利用核酸酶反应进行DNA单碱基突变颜色检测的方法。

本发明所述的一种进行DNA单碱基突变颜色检测的方法，其特征在于：利用结构专一的核酸酶(以单链DNA专一的S1核酸酶和双链DNA专一的DSN核酸酶为例)，选择性地将单链或者双链DNA降解为能够更好稳定纳米金的单核苷酸(dNMP)和短链DNA，从而方便地实现单碱基突变的颜色检测，无需通过精确控温、水解或者超声处理。

本发明的DNA单碱基突变颜色检测方法，其特征在于：

该方法，如图2所示，包括如下步骤：(1)将完全互补靶标、单碱基突变靶标或不互补靶标与探针按照等摩尔比混合在杂交缓冲溶液中，混合后的浓度在0.1μM-50μM的范围内；(2)加入适量的核酸酶(比如1-10U/10μL)，比如图2(A)所示S 1核酸酶，或者图2(B)所示DSN核酸酶，并在合适的温度下保持一段时间(比如5-60min)；(3)将反应溶液与纳米金溶液混合；反应溶液中核酸探针与纳米金的摩尔比一般应大于100∶1；(4)加入适量的盐溶液(比如含氯化钠的磷酸盐溶液)，通过溶液颜色变化来半定量进行DNA检测，也可以由紫外可见吸收(520nm和650nm)定量分析。比如，当使用单链DNA专一的S1核酸酶时(图2(A))，完全互补的双链DNA不能够被S1核酸酶分解，而存在单碱基突变的双链DNA能够被S1核酸酶分解，生成能够很好稳定纳米金的单核苷酸dNMP，因此，在加入相同盐溶液时，含有完全互补双链DNA的纳米金溶液聚集成蓝色，而含有单碱基突变DNA的纳米金溶液保持红色。相反地，当使用双链DNA专一的DSN核酸酶(图2(B))时，完全互补的双链DNA能够被DSN核酸酶分解，生成能够很好稳定纳米金的单核苷酸dNMP，而存在单碱基突变的双链DNA不能够被DSN核酸酶分解，因此，在加入相同盐溶液时，含有完全互补双链DNA的纳米金溶液保持红色，而含有单碱基突变DNA的纳米金溶液聚集成蓝色。

本发明利用核酸酶反应进行DNA单碱基突变颜色检测的方法，具有如下的技术效果：

1、利用核酸酶反应进行DNA单碱基突变颜色检测，无需通过精确控温、水解或者超声处理，可以直接观察到完全互补靶标与单碱基突变靶标和不互补靶标之间的明显颜色差别。

2、利用核酸酶反应进行DNA单碱基突变颜色检测，由于核酸酶的高度的结构选择性，以及单核苷酸(dNMP)和短链DNA更好的稳定纳米金的能力，将DNA单碱基突变的纳米金颜色检测方法的选择性大幅提高。以S1核酸酶为例可以检测靶标中任何突变位点。

3、在现有技术中，利用单链DNA能够比双链DNA更好地稳定未修饰纳米金，实现对具体DNA序列的颜色检测。能够与探针杂交形成双链DNA的，不能够很好地稳定纳米金，加入适量的盐溶液之后，纳米金聚集为蓝色，而不能够与探针杂交形成双链DNA的，单链DNA能够很好地稳定纳米金，加入相同量的盐溶液之后，纳米金仍然保持红色。这种进行DNA检测的方法需要通过精确控温、水解或者超声处理，利用完全互补靶标与单碱基突变靶标较小的解链温度(Tm)差异，实现对单碱基突变的颜色检测，因此对单碱基突变检测的选择性差，仅能检测某些对Tm影响较大的突变位点，而且靶标的长度较短(一般小于20bp)。利用核酸酶反应进行DNA单碱基突变颜色检测，可以检测出较长靶标(比如80bp)中的单碱基突变，而且突变的位置既可以在接近端部，也可以在中间位置(详见实施例8)。

本发明涉及一种利用核酸酶反应进行DNA单碱基突变颜色检测的方法。在该方法中，当互补靶标或者单碱基突变靶标存在的时候，这些靶标与探针杂交形成双链DNA。当不互补靶标存在的时候，靶标与探针都保持单链DNA状态。随后加入体系中的具有结构选择性的核酸酶，可以选择性地降解双链DNA、存在错配的双链DNA或者单链DNA，所产生的单核苷酸或者短链DNA能够比未降解的双链或单链DNA更好地稳定未修饰纳米金，在加入等量的盐溶液后，纳米金呈现不同的稳定性(颜色)，从而实现对单碱基突变的颜色检测。本发明的这种将结构选择性酶和未修饰纳米金相结合的便捷的颜色检测方法，还可以用来检测蛋白质，酶，小分子，金属离子和细菌等。本发明的其它特点和优点可以通过下面的实施例来体现。需要指出的是，以下实施例仅用来举例说明，在本发明的范围内可以进行各种各样的变化和修改。

附图说明

图1(A)和(B)是本发明所使用的未修饰13nm金颗粒的不同放大倍数的透射电镜(TEM)图像，(C)为紫外可见吸收谱。样品在测量紫外可见吸收前稀释10倍，特征吸收峰在519nm。

图2(A)和(B)是利用S1核酸酶和DSN核酸酶反应进行DNA单碱基突变颜色检测的原理图。

图3(A)和(B)是纳米金溶液与双链DNA，单链DNA和dNMP混合后加入盐溶液后的紫外可见吸收光谱图和纳米金颜色反应的照片。

图4(A)和(B)分别是本发明一个实施例中使用S1核酸酶进行碱基突变的纳米金颜色检测的紫外可见吸收光谱图和纳米金颜色反应的照片。纳米金溶液与盐孵育5min后测定吸收光谱及拍摄照片。

图5(A)～图5(H)分别是本发明一个实施例中使用0.1(A)，0.2(B)，0.3(C)，0.4(D)，0.5(E)，0.75(F)，及1UμL^-1(G)的S1核酸酶进行单碱基突变(1M-AC)的纳米金颜色检测的紫外可见吸收谱图及鉴别因子与酶浓度的关系(H)。纳米金溶液与盐孵育2min后测定吸收光谱。

图6(A)～图6(G)分别是本发明一个实施例中使用不同S1核酸酶的反应时间进行单碱基突变(1M-AC)的纳米金颜色检测的紫外可见吸收谱图：10min(A)，20min(B)，25min(C)，30min(D)，35min(E)，45min(F)及鉴别因子与酶反应时间的关系图(G)。纳米金溶液与盐孵育2min后测定吸收光谱。

图7是本发明一个实施例中使用S1核酸酶进行不同类型与不同位点单碱基突变的纳米金颜色检测的紫外可见吸收谱图。纳米金溶液与盐孵育2min后测定吸收光谱。

图8(A)和(B)是本发明一个实施例中使用S1核酸酶进行不同类型与不同位点单碱基突变的纳米金颜色检测的紫外可见吸收谱图和纳米金颜色反应的照片。纳米金溶液与盐孵育5min后测定吸收光谱及拍摄照片。

图9(A)和(B)本发明一个实施例中使用DSN进行碱基突变的纳米金颜色检测的紫外可见吸收谱图和纳米金颜色反应的照片。纳米金溶液与盐孵育2min后测定吸收光谱及拍摄照片。

图中：

″AuNP″or″AuNPs″指金纳米颗粒，通常是球形的，典型的尺寸为直径1-100nm.

“A”代表吸光值，“λ”代表波长。

PM代表完全互补靶标，1MM代表单碱基突变靶标，N代表完全不互补靶标。

dNMP是单核苷酸dAMP，dGMP，dCMP和dTMP的混合物。

具体实施方式

下面通过实施例的描述，进一步阐述本发明的实质性特点和显著的进步。

在具体描述实施例前先描述使用的材料、来源及制备方法：

HAuCl4从ACROS ORGANIC购买。柠檬酸三钠从国药集团化学试剂公司购买。AMP，TMP，CMP，GMP从上海楷洋生物技术有限公司购买。DNS核酸酶从Evrogen JSC(Moscow，Russia)购买。S1核酸酶从TaKaRa生物技术公司(大连)购买。所有DNA从TaKaRa(大连)购买。13纳米的金颗粒(AuNP)按照经典的柠檬酸钠还原法制，最终的浓度大约是12±1nM。直接用于实施例2-9中。

为叙述方便特将实施例2-9涉及的表1-4集中列出。

本发明中使用的部分核酸探针序列列于表1，单碱基突变靶标的序列见

表2-4    表1

表2

^a三次实验的平均值±标准差。下划线强调的碱基是突变的碱基。

表3

^a三次实验的平均值±标准差。下划线强调的碱基是突变的碱基。

表4

^a三次实验的平均值±标准差。下划线强调的碱基是突变的碱基。

以上，表2是实施例6和9中使用S1核酸酶进行不同类型与不同位点单碱基突变的纳米金颜色检测的鉴别因子数据。纳米金溶液与盐孵育2min后测定吸收光谱所计算的鉴别因子。

表3是实施例7中使用S1核酸酶进行不同类型与不同位点单碱基突变的纳米金颜色检测的鉴别因子数据。纳米金溶液与盐孵育5min后测定吸收光谱所计算的鉴别因子。

表4是实施例8中使用S1核酸酶进行不同长度靶标中不同位点单碱基突变的纳米金颜色检测的鉴别因子数据。纳米金溶液与盐孵育2min后测定吸收光谱所计算的鉴别因子。

实施例1：未修饰的纳米金的制备。

柠檬酸三钠的水溶液(25ml，38.8mM)快速加入沸腾的金氯酸HAuCl4溶液中(250ml，1mM)。几分钟后，溶液的颜色从浅黄色变成深红色。溶液继续回流搅拌15min使反应完全。然后慢慢地地冷却到室温。4℃保存。按照纳米金在520nm的紫外吸收强度(图1(C))，所制备的纳米金的的浓度是12±1nM，尺寸是13nm(见图1(A)和(B))。

实施例2：dNMP，单链DNA和双链DNA对未修饰纳米金的稳定影响的差异

本实施例的目的是证实核酸的核酸酶降解产物dNMP能够比单链和双链DNA更好地稳定纳米金，这是本发明的基础。

双链DNA样品PM/A：由0.25微升100μM的单链DNA探针A(见表1)，0.25微升100μM与单链DNA探针A完全互补的靶标DNA PM(见表1)，1微升的缓冲液(0.6M NaCl，10mM磷酸盐，pH 7.4)，和0.5微升的水组成，并在室温下保存10分钟。

单链DNA样品PM：由0.25微升100μM单链DNA探针PM，1微升的缓冲液(0.6M NaCl，10mM磷酸盐，pH 7.4)，和0.75微升的水组成，并在室温下保存10分钟。

单链DNA样品A：由0.25微升100μM单链DNA探针A，1微升的缓冲液(0.6M NaCl，10mM磷酸盐，pH 7.4)，和0.75微升的水组成，并在室温下保存10分钟。

dNMP样品：dNMP样品与单链DNA样品A具有相同的碱基摩尔浓度。由1.75微升的100μM的dCMP，1微升的100μM的dGMP，1微升的100μM的dAMP，0.25微升的100μM的dTMP，和1微升的缓冲液(0.6M NaCl，10mM磷酸盐，pH 7.4)组成，并在室温下保存10分钟。

在以上样品中分别加入100微升的12.7nM的纳米金，然后立即加入10微升的0.6M NaCl磷酸盐溶液。双链，单链DNA样品立即产生聚集，而dNMP样品保持稳定的红色(图3B)。然后进行了UV-Vis吸收测量(图3A)。dNMP由于较小的空间位阻和较小的分子尺寸，以及较小的电负性，dNMPs能够比具有相同碱基浓度的单链和双链DNA更好地稳定纳米金。由于dNMPs和DNA都可以不同程度上稳定纳米金AuNPs，在特定的盐浓度下dNMP/AuNP保持稳定，而DNA/AuNP聚集。

实施例3：使用S1核酸酶进行单碱基突变的纳米金颜色检测。

试剂的配制：用超纯水分别配制探针A(表1)、靶标PM(表1)、靶标AC(表2)、靶标N(表1)的溶液，同时用紫外-可见光分光光度计校准探针及各个靶标溶液的浓度为100μM。用超纯水配制5U μL^-1的S1核酸酶溶液。

探针A、靶标PM、AC或N各取1μL，与1μL 10×酶反应缓冲液(含有300mM CH₃COONa，2800mM NaCl，和10mM ZnSO₄，pH 4.6)及6μL超纯水混合，室温反应5min。取1μL 5U μL^-1的S1核酸酶溶液加入上述混合液中，混匀，30℃反应30min。取2.5μL上述酶反应混合液，分别加入50μL浓度为12±1nM的纳米金溶液，立即加入40μL的0.5M NaCl磷酸盐溶液。室温孵育5min后，进行UV-vis吸收测量(图4A)，和拍照(图4B)。完全互补双链DNA没有被S1核酸酶剪切消化，双链DNA稳定纳米金的能力差，加入盐后纳米金立即聚集。含单个碱基错配的双链DNA被S1核酸酶在错配位点剪切，并将链降解成dNMP和短链片段，dNMP和短链片段稳定纳米金的能力强，加盐后纳米金溶液仍保持红色。完全不互补的靶标反应体系中，探针A和靶标N均被S1核酸酶降解成dNMP，dNMP稳定纳米金的能力强，加盐后纳米金溶液仍保持原有的红色。

结果表明本方法结合S1核酸酶的结构专一性与纳米金的光谱特性能简单的、有效的、直观的鉴别核酸序列中碱基的突变。甚至核酸序列中只含有一个碱基的突变也能在30min中内准确的检测出来。并且核酸序列中含有的碱基突变的数目越多，检测的效率越高。

实施例4：探索S1核酸酶的浓度对单碱基突变检测选择性的影响。

试剂的配制：用超纯水分别配制探针A(表1)、靶标PM(表1)、靶标AC(表2)、靶标N(表1)的溶液，同时用紫外-可见光分光光度计校准探针及各个靶标溶液的浓度为100μM。用超纯水配制1、2、3、4、5、7.5、10U μL^-1的S1核酸酶溶液。

探针A、靶标PM或AC或N各取1μL，与1μL 10×酶反应缓冲液(含有300mM CH₃COONa，2800mM NaCl，和10mM ZnSO₄，pH 4.6)及6μL超纯水混合，室温反应5min。分别取1μL各种浓度的S1核酸酶溶液加入上述混合液中，混匀，30℃反应30min。取2.5μL上述酶反应混合液，分别加入50μL浓度为12±1nM的纳米金溶液，立即加入0.5M NaCl磷酸盐溶液。室温孵育2min后，进行UV-vis吸收测量(图5A-G)。纳米金在520nm与650nm的光吸收值的比值可用来监测纳米金的聚集程度。为了定量地描述S 1核酸酶的底物特异性，我们将含碱基错配的双链DNA反应体系的纳米金在520nm与650nm的光吸收值的比值与完全互补双链DNA反应体系的纳米金在520nm与650nm的光吸收值的比值的比定义为鉴别因子。S1核酸酶的浓度与鉴别因子的关系如图5H。

结果表明S1核酸酶在低浓度(＜0.5U μL^-1)时，随着酶浓度的增加，本方法鉴别单碱基突变的能力逐渐增大，在0.5U μL^-1时，鉴别单碱基突变的能力达到最大。再增加酶的浓度，鉴别单碱基突变的能力变弱，主要由于高浓度的S1核酸酶开始降解完全互补的双链DNA。

实施例5：探索S1核酸酶的孵育时间对单碱基突变检测选择性的影响。

试剂的配制：用超纯水分别配制探针A(表1)、靶标PM(表1)、靶标AC(表2)、靶标N(表1)的溶液，同时用紫外-可见光分光光度计校准探针及各个靶标溶液的浓度为100μM。用超纯水配制5U μL^-1的S1核酸酶溶液。

探针A、靶标PM或1M-AC或N各取2μL，与2μL 10×酶反应缓冲液(含有300mM CH₃COONa，2800mM NaCl，和10mM ZnSO₄，pH 4.6)及12μL超纯水混合，室温反应5min。取2μL 5U μL^-1的S1核酸酶溶液加入上述混合液中，混匀。30℃反应10、20、25、30、35、45min后取2.5μL上述酶反应混合液，分别加入50μL浓度为12±1nM的纳米金溶液，立即加入0.5MNaCl磷酸盐溶液。室温孵育2min后，进行UV-vis吸收测量(图6A-F)。纳米金在520nm与650nm的光吸收值的比值可用来监测纳米金的聚集程度。为了定量地描述S1核酸酶的底物特异性，将含碱基错配的双链DNA反应体系的纳米金在520nm与650nm的光吸收值的比值与完全互补双链DNA反应体系的纳米金在520nm与650nm的光吸收值的比值的比定义为鉴别因子。S1核酸酶的反应时间与鉴别因子的关系如图6G。

结果表明在30℃条件下，S1核酸酶反应30min时，鉴别单碱基突变的能力达到最大。说明本方法在30min内就能准确地鉴别双链DNA中单个碱基的突变。

实施例6：考察使用S1核酸酶进行单碱基突变的纳米金颜色检测方法的通用性。

为考察本方法的通用性，我们设计了11种包含各种不同类型及不同位点单碱基突变的靶标(表2)。各种靶标用超纯水配制成溶液，并用紫外-可见光分光光度计校准各个靶标溶液的浓度为100μM。用超纯水配制5UμL^-1的S1核酸酶溶液。

探针A(表1)、靶标PM(表1)或各种含单碱基突变的靶标各取1μL，与1μL 10×酶反应缓冲液(含有300mM CH₃COONa，2800mM NaCl，和10mM ZnSO₄，pH 4.6)及6μL超纯水混合，室温反应5min。取1μL 5U μL^-1的S1核酸酶溶液加入上述混合液中，混匀，30℃反应30min。取2.5μL上述酶反应混合液，分别加入50μL浓度为12±1nM的纳米金溶液，立即加入40μL的0.5M NaCl磷酸盐溶液。室温孵育2min后，进行UV-vis吸收测量(图7)。并根据UV-vis吸收测量的结果计算出本方法检测不同类型及不同位点的单碱基突变的鉴别因子(表2)。

结果表明本方法可以准确地检测出各种不同类型及不同位点的单碱基突变，鉴别因子从4.42到12.29。说明本方法对单碱基突变的检测具有通用性。

实施例7：考察延长盐与纳米金孵育时间，使用S1核酸酶进行各种单碱基突变的纳米金颜色检测方法的影响。

我们设计了11种包含各种不同类型及不同位点单碱基突变的靶标(表3)。各种靶标用超纯水配制成溶液，并用紫外-可见光分光光度计校准各个靶标溶液的浓度为100μM。用超纯水配制5U μL^-1的S1核酸酶溶液。

探针A(表1)、靶标PM(表1)或各种含单碱基突变的靶标各取1μL，与1μL 10×酶反应缓冲液(含有300mM CH₃COONa，2800mM NaCl，和10mM ZnSO₄，pH 4.6)及6μL超纯水混合，室温反应5min。取1μL 5U μL^-1的S1核酸酶溶液加入上述混合液中，混匀，30℃反应30min。取2.5μL上述酶反应混合液，分别加入50μL浓度为12±1nM的纳米金溶液，立即加入40μL的0.5M NaCl磷酸盐溶液。室温孵育5min后，进行UV-vis吸收测量(图8A)和拍照(图8B)。并根据UV-vis吸收测量的结果计算出本方法检测不同类型及不同位点的单碱基突变的鉴别因子(表3)。

结果表明0.5M NaCl磷酸盐溶液与纳米金-酶反应液混合液孵育5min后，本方法对临近靶标序列中间位置的单碱基突变的鉴别能力更强，鉴别因子达到31.86。对位于靶标序列端位的单碱基突变的鉴别能力减弱。说明本方法对临近靶标序列中间位置的单碱基突变的鉴别能力强于接近靶标序列端位的单碱基突变。

实施例8：使用S1核酸酶检测不同长度靶标中的单碱基突变。

为了考察本发明的方法对不同长度靶标的适用性，本发明测试了不同长度的靶标(表4)。不同长度(30bp，45bp，60bp，80bp)的靶标(100pmol，10μM)分别与相同摩尔量的探针(表1)混合在9μL的缓冲溶液中(30mMCH₃COONa，280mM NaCI，and 1mM ZnSO₄，pH 4.6)。该混合物在室温下保存5分钟，然后加入1μL含有5unit μL^-1 S1核酸酶的溶液。该混合物在30℃孵育30min。取出2.5μL反应溶液，与50μL的纳米金溶液混合，立即加入0.5M NaCl磷酸盐溶液。1.2min后进行UV-vis吸收测量，并根据UV-vis吸收测量的结果计算出本方法检测不同长度靶标中不同位点的单碱基突变的鉴别因子(表4)。

结果表明，利用本发明的方法可以准确检测长达80bp的靶标中的单碱基突变，且可以检出的突变的位置可以在中间位置，也可以在端位。

实施例9：使用DSN进行单碱基突变的纳米金颜色检测。

试剂的配制：用超纯水分别配制探针A(表1)、靶标PM(表1)、靶标AC(表2)的溶液，同时用紫外-可见光分光光度计校准探针及各个靶标溶液的浓度为100μM。用超纯水配制1U μL^-1的DSN核酸酶溶液。

探针A、靶标PM或AC各取1μL，与1μL 10×酶反应缓冲液(含有0.5MTris-HCl，50mM MgCl₂，and 10mM dithiothreitol(DTT)，pH 8.0)及6μL超纯水混合，室温反应5min。取1μL 1U μL^-1的DSN核酸酶溶液加入上述混合液中，混匀，65℃反应15min。取5μL上述酶反应混合液，分别加入100μL浓度为12±1nM的纳米金溶液，立即加入10μL的2M NaCl磷酸盐溶液。室温孵育2min后，进行UV-vis吸收测量(图9A)，和拍照(图9B)。完全互补双链DNA被DSN核酸酶降解成dNMP，dNMP稳定纳米金的能力强，加盐后纳米金溶液仍保持红色。含碱基错配的双链DNA没有被DSN核酸酶剪切消化，DNA链稳定纳米金的能力差，加入盐后纳米金立即聚集。

结果表明，本检测体系使用其他的结构或序列特异性的核酸酶，如DSN核酸酶，也可以进行单碱基突变的纳米金颜色检测。

Claims (9)

1.一种利用核酸酶反应进行DNA单碱基突变颜色检测的方法，其特征在于利用结构专一的核酸酶，选择性地将单链或者双链DNA降解为结构稳定纳米金的单核苷酸和短链DNA，从而实现单碱基突变的颜色检测，无需通过精确控温、水解或者超声处理；所述的专一的核酸酶是指单链DNA的S1核酸酶或双链DNA的DSN核酸酶。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将完全互补靶标、单碱基突变靶标或不互补靶标与探针按照等摩尔比混合在杂交缓冲溶液中，混合后的浓度在0.1μM-50μM的范围内；

(2)加入浓度为1-10U/10μL的核酸酶，并在30℃温度下保持5-60min时间；

(3)将反应溶液与纳米金溶液混合；反应溶液中核酸探针与纳米金的摩尔比大于100∶1；

(4)加入含氯化钠的磷酸盐溶液，通过溶液颜色变化来半定量进行DNA检测，或由520nm和650nm紫外可见吸收定量分析。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于当使用单链DNA专一的S1核酸酶时，在加入相同盐溶液时，含有互补双链DNA的纳米金溶液为蓝色，而含有单碱基突变的DNA的纳米金溶液为红色。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于当使用双链DNA专一的DSN核酸酶时，在加入相同盐溶液时，含有完全互补双链DNA的纳米金溶液为红色，而含有单碱基突变DNA的纳米金溶液为蓝色。

5.按权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的纳米金溶液中纳米金呈球形，直径为1-100nm。

6.按权利要求1或2所述的方法，其特征在于可选择性地检测合成靶标中任意位置的单碱基突变。

7.按权利要求1或2所述的方法，其特征在于可以检测出长达80bp的靶标中的单碱基突变。

8.按权利要求7所述的方法，其特征在于所述单碱基突变的位置接近端部或在中间。

9.按权利2所述的方法，其特征在于步骤2中所保持的时间为30min。

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