CN105968157B - 一种具有光激活性能的适配子探针及检测癌症部位的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于癌症的分子诊断领域,具体涉及一种检测癌症部位的方法和试剂盒:向含有癌细胞或者癌组织的体系中加入光激活适配子荧光探针,探针与癌细胞上的靶标特异性地结合,孵育一段时间后,将多余探针洗去,使用激光共聚焦荧光显微镜对待测样品进行扫描并拍照,得到光激活前的荧光图像;随后,使用一定波长的激发光照射待测样品,使探针被光激活,使用激光共聚焦荧光显微镜对待测样品进行扫描并拍照,得到光激活后的荧光图像;最后,将光激发前后的信号图像进行比较,荧光增强的部位即为癌症部位。具有很高的灵敏度;另外,荧光小分子只有在光激活后才会转变成荧光很强的结构,这一定程度上克服了光漂白的问题。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断领域,具体涉及一种具有光激活性能的适配子探针及利用该探针检测癌症部位的方法。
背景技术
癌症被认为是世界范围内发病和死亡的主要原因之一。恶性肿瘤能够不受控制地增长,进而干预到消化系统、神经系统和循环系统。更糟糕的是,它们能释放出激素来改变身体的功能。癌症难以检测,因为它生长于器官本身,人体的免疫系统不能将其识别和清除。大部分癌症患者在发病前,并没有明显的临床症状。然而一旦恶性肿瘤形成,病人的身体状况会急剧恶化。
传统的癌症检测手段包括计算机断层扫描(CT)、核磁造影(MRI)和正电子放射层造影术等方法,这些方法均需要从肿瘤形态学变化上来观察,不能满足癌症早期检测的要求。发展从分子水平上区分癌症部位与正常部位的方法,对于癌症的早期诊断和及时治疗都有着非常重要的意义。
目前,与癌症相关的肿瘤标识物已经逐渐被看作是衡量和评估癌症早期诊断的标准。例如,人类表皮生长因子受体2(HER2)已被视为重要的乳腺癌预后因子而用于乳腺癌的诊断治疗过程中。
核酸适配子是人工合成的单链寡核苷酸(DNA或RNA),它们能够与非核苷酸靶目标物质进行高亲和力、高特异性的结合。由于能够特异性地识别特定的目标分子,且具有易于合成、化学稳定性高和生物相容性好等优点,适配子被视为是癌症检测中抗体的可靠替代品。
光激活技术最初起源于光激活的荧光蛋白。近期,研究人员设计合成出光激活的有机小分子,可以通过光激发来改变化合物的结构,进而使其荧光大幅度增强。由于通过光激活能够使原先荧光很弱的位置的荧光变强,该方法可以被应用于成像领域中。
发明内容
为了区分癌症部位与正常部位,本发明提供一种具有光激活性能的适配子探针,所述探针是与癌细胞特异性结合的适配子DNA序列,其5’端修饰有光激活荧光基团,光激活荧光基团是具有光敏性能的荧光小分子,在外源激发光激发后,荧光基团的荧光强度会增强。
进一步地本发明提供的光激活性能的适配子探针的结构式如式(II)所示:
式(II)中的DNA序列如SEQ NO.1所示。
本发明的另一个目的是提供一种将上述具有光激活性能的适配子探针用于定位癌症部位的方法,其包括如下步骤:
(1)向待测体系中加入具有光激活性能的适配子探针,37℃孵育30-120分钟,使用PBS缓冲溶液洗脱2遍,得到待测样品;
(2)将待测样品置于激光共聚焦显微镜下扫描,得到的光激发前的荧光信号图;
(3)使用365nm~488nm范围内的激发光照射待测样品,使适配子DNA序列末端的小分子荧光增强;
(4)将光激发后的待测样品再次放到激光共聚焦显微镜下扫描,得到的光激发后的荧光信号图;
(5)将光激发前后的信号图进行比较,荧光增强的部位即为癌症部位。
进一步地,本发明提供上述具有光激活性能的适配子探针在制备靶向定位癌细胞的试剂盒中的应用。
所述具有光激活性能的适配子探针在制备靶向杀灭癌细胞的药物中的应用。
所述的具有光激活性能的适配子探针在制备癌细胞体外识别、分离和鉴定的试剂盒中的应用。
所述的具有光激活性能的适配子探针在制备分离或鉴定癌症生物标记物的试剂盒中的应用。
本发明具有以下优点和有益效果:
本发明的检测癌症部位的方法中,设计的每一个适配子探针都针对一个特定的癌症相关的肿瘤标识物,可以有效地靶向癌症部位,具有良好的选择性和普适性;使用了光激活前后的信号差减法,可以达到很高的图像信噪比,具有很高的灵敏度,可以用来检测微量的肿瘤标识物;另外,荧光小分子只有在光激活后才会转变成荧光很强的结构,这一定程度上克服了光漂白的问题。因此,利用光激活适配子荧光检测来作为信号输出具有真实可靠的特点。
附图说明
图1为光激活适配子荧光探针的合成示意图
图2为光激活适配子荧光检测癌细胞的示意图。
图3为光激活前后适配子探针结构变化的结构示意图。
图4为光激活前后适配子探针的荧光变化图。
图5为探针对MCF-7乳腺癌细胞和CHO正常细胞(对照)成像的荧光图。
图6为探针对癌腺癌组织和乳腺增生组织成像的荧光图。
图7为光激活荧光探针与普通荧光探针组织成像的荧光对比实验。图a为荧光图;图b为光激活适配子探针光激活时的荧光变化;图c为相同适配子序列的普通荧光探针光激活时的荧光变化。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明,而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。若无特别说明,本发明中所涉及到的实验均为本领域技术人员所熟知的常规操作。
【实施例1】光激活适配子荧光检测体系的设计
(1)叠氮修饰的适配子N3-AS1411序列合成
如图1所示,叠氮修饰的DNA序列来自上海生工公司合成,探针是参考适配子AS1411序列合成的,该DNA的序列为:GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG(SEQ NO.1),3’端为叠氮修饰。
(2)光激活荧光基团——TokyoGreen小分子的合成
含有羧基的TokyoGreen小分子化合物的合成参考了以下文献:
T.Kobayashi,Y.Urano,M.Kamiya,T.Ueno,H.Kojima and T.Nagano,J.Am.Chem.Soc.,2007,129,6696-6697.
得到以下荧光分子:
(3)带有炔基的化合物ACTG的合成——TokyoGreen的衍生化
合成方法为:
将化合物(I)(52.6mg,0.1mmol)、EDCI(20mg,0.1mmol)和HOAT(7mg,0.05mmol)溶于5mL DMF中,再在室温搅拌的情况下,将溶有炔丙胺(11mg,0.2mmol)的DMF溶液(1mL)滴加入体系中,氩气保护,室温反应12h。反应结束后,将溶液真空离心浓缩,硅胶柱层析分离,用二氯甲烷和甲醇(V/V=97:3)为淋洗剂,收集第一条带,旋干溶剂,得到橙色固体ACTG39mg,产率70%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.75(s,3H,J=4.2Hz),2.02(d,3H),2.29(s,1H),4.19(d,2H,J=2.1Hz),4.58(s,1H),6.18(q,1H,J=6Hz),6.40(s,1H),6.53(d,1H,J=9.9Hz),6.71(t,1H,J=8.1Hz),6.80-6.96(m,4H),7.07(d,1H,J=8.4Hz),7.26(s,1H),7.48(t,1H,J=7.5Hz),7.63(t,1H,J=6Hz),7.71(d,1H,J=6.9Hz),8.06(d,1H,J=8.1Hz);13C NMR(75MHz,CDCl3):δ19.9,23.3,28.7,67.2,71.7,71.8,72.3,78.9,102.5,102.7,105.7,105.7,112.2,113.4,113.6,114.8,114.9,116.7,118.8,125.0,126.1,127.0,128.8,129.4,130.3,134.2,137.6,138.4,147.2,148.5,154.0,154.2,157.7,158.6,161.7,167.4,185.7.HRMS(ESI):calcd for C33H26N2O7[M+H]+:563.18128,found:563.18228.
(4)光激活适配子荧光探针CTG-AS1411的合成——光激活荧光基团标记到DNA链上的过程
合成示意图如图1所示,具体合成步骤为:
①称取5.62mg化合物ACTG,溶于100μLDMSO中,配制浓度为100mM母液。
②取1个体积为2mL的EP管,分别向其中加入140μL DMSO、50μL异丁醇和10μL100mM化合物ACTG母液,使化合物ACTG浓度稀释为5mM。
③称取19.8mg抗坏血酸钠固体,溶于10mL超纯水中,配制浓度为10mM母液。
④称取25mg硫酸铜固体,溶于10mL超纯水中,配制浓度为10mM的母液。
⑤称取21.5mg BTTAA固体,溶于2.5mL磷酸缓冲溶液(500mM,pH 7.0)中,配制浓度为20mM的母液。
⑥取1个体积为2mL的EP管,分别向其中加入20μL 10mM CuSO4溶液、60μL 20mMBTTAA溶液和120μL超纯水,配制成200μL的1mM CuSO4/6mM BTTAA溶液。
⑦取1个体积为2mL的EP管,依次加入200μL 100μM N3-AS1411溶液、200μL 500mM磷酸缓冲溶液(pH=7.0)、200μL 10mM新配制的抗坏血酸钠溶液、200μL 1mM CuSO4/6mMBTTAA溶液和200μL 5mM ACTG的DMSO/异丁醇(v/v=3:1)溶液,37℃反应12小时。
⑧反应结束后,使用有机相滤膜过滤溶液,然后将过滤后的溶液放入离心浓缩仪中离心浓缩。待离心浓缩为固体后,加入400μL超纯水溶解,再使用水相滤膜过滤溶液。
⑨将过滤后得到的液体通过HPLC分离,HPLC的分离条件为:
色谱柱:Hisep ODS-A 4.6×250mm,5μm
淋洗剂:A泵:50mM三乙胺—二氧化碳(TEBA)缓冲溶液(pH=6.5)
B泵:HPLC级别的乙腈溶液
B泵的浓度梯度:10%/10min,10-50%/40min
检测荧光波长:488nm激发,525nm发射
流速:1.0mL/min
柱温:37℃
进样体积:100μL/次
通过HPLC分离,产品在21-22.5分钟被收集。
⑩将产品溶液放入离心浓缩仪中离心浓缩,待溶剂除去后,得到纯的探针CTG-AS1411,其结构式如式(II):
所需达到的检测目标:对于需要检测的癌症的相应蛋白能产生很好信号响应。
如图2、3所示,本发明方法的检测原理是:向待测体系中加入探针,由于适配子序列与目标分子特异性结合,37℃孵育一段时间后,洗脱掉多余的探针。然后通过激光共聚焦显微镜得到光激活前的荧光信号图像。随后,使用特定的激发光激活探针上的荧光分子。再使用激光共聚焦显微镜得到光激活之后的荧光信号图像。通过比较光激活前后的信号图像,图像中荧光增强的位置即为癌症部位。
【实施例2】验证探针的灵敏度及选择性
(1)光激活前后适配子探针的荧光强度变化
此反应在10mM PBS缓冲溶液中进行,体系中未激活探针的浓度为100nM。在37℃条件下,使用激发波长为365nm的紫外灯对样品进行照射,分别使用荧光检测器检测0min、1min、2min、5min、10min、20min、30min、40min、50min和60min时溶液体系的荧光强度。以荧光发射波长为横坐标,荧光强度为纵坐标,绘制出不同紫外光照时间时,探针的荧光发射光谱,如图4所示。
通过观察图4可以得知,随着365nm的紫外光照的进行,探针CTG-AS1411的荧光强度大大增强。对于100nM的样品,在PBS缓冲溶液中,光照60min后,最大荧光发射波长处的荧光强度增强了19倍。
(2)探针对MCF-7乳腺癌细胞和CHO正常细胞的成像
首先,MCF-7和CHO细胞在35mm的confocal皿中培养24个小时,在实验之前,细胞长到30%的丰度。使用PBS缓冲液将细胞洗3次后,加入300nM未激活探针,在温度为37℃、5%的CO2环境中孵育40min。然后使用PBS缓冲液洗3次,洗去多余的探针,将细胞浸润于1mLPBS缓冲液中。然后使用confocal荧光显微镜拍照,激发波长为488nm,得到光激活前的细胞图像。然后利用confocal仪器上488nm或408nm激发光扫描图像,得到光激活后的细胞图像。
由图5可以得知,对于上排的MCF-7乳腺癌细胞,在光激活前,探针CTG-AS1411在MCF-7中没有明显荧光信号,随着激发光光照的逐渐进行,MCF-7细胞的荧光信号逐渐增强,并且在第4次408nm光激发后,绿色荧光信号变得非常明显。这说明探针CTG-AS1411与MCF-7细胞有很好的结合力,但是由于在光激活前,探针荧光非常弱,没有观察到明显的荧光信号;光激活后,探针的荧光强度大大增强,与光激活前呈现出明显的差异。通过对比光激活前后的荧光图像,可以清楚观察到该适配子探针靶向的细胞。同时,对于下排的CHO正常细胞,在光激活前,探针CTG-AS1411在CHO中没有明显荧光信号,随着激发光光照的逐渐进行,CHO中仍然没有明显的荧光信号,这说明探针CTG-AS1411没有与CHO细胞结合,被洗脱掉了。
因此,我们可以得知,探针CTG-AS1411对细胞表面核仁素高表达的MCF-7细胞具有良好的选择性,而我们通过光激活技术,可以得到光激活前后2张对比差异明显的荧光图像,这将为我们之后更为准确地检测生物荧光背景干扰较为严重的实际样品带来帮助。
(3)探针对乳腺癌组织和良性组织的成像
首先,依次将切片放入二甲苯中洗2遍,每遍15min;再用无水乙醇洗2遍,每遍5min;再依次用85%酒精和75%酒精各洗一遍,每遍5min;最后用蒸馏水洗一遍,5min。再将组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(pH 9.0)进行抗原修复。自然冷却后将玻片置于PBS缓冲液(pH 7.4)中在脱色摇床上洗涤3次,每次5min。切片放入3%过氧化氢溶液,室温避光孵育25min,将玻片置于PBS缓冲液(pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后滴加3%BSA均匀覆盖组织,室温封闭30min。轻轻甩掉封闭液,在切片上滴加300nM未激活探针,37℃孵育40min。洗去多余的探针后,将组织切片置于confocal荧光显微镜下拍照,激发波长为488nm,得到光激活前的组织切片图像。然后利用confocal仪器上488nm或408nm激发光扫描图像,得到光激活后的组织切片图像。
由图6可以发现,对于上排的乳腺癌组织切片,在光激活前,探针在乳腺癌组织中荧光信号非常微弱,随着激发光光照的逐渐进行,乳腺癌组织的荧光信号逐渐增强,并且在第2次408nm光激发后,绿色荧光信号变得非常明显。这说明探针与乳腺癌组织有很好的结合力,但是由于在光激活前,探针荧光非常弱,没有观察到明显的荧光信号;光激活后,探针的荧光强度大大增强,与光激活前呈现出明显的差异。通过对比光激活前后的荧光图像,可以清楚观察到该适配子探针在乳腺癌组织中靶向的癌细胞。同时,对于下排的良性乳腺组织,在光激活前,探针在良性组织中没有明显荧光信号,随着激发光光照的逐渐进行,组织中仍然没有明显的荧光信号,这说明探针没有与良性乳腺组织中的正常细胞结合,被洗脱掉了。
因此,我们可以得知,探针对乳腺癌组织中的癌细胞具有良好的选择性,而我们通过光激活技术,可以得到光激活前后2张对比差异明显的荧光图像,这说明我们这种光激活适配子探针荧光成像方法同样可以以对石蜡包埋组织切片成像的方式应用到乳腺癌的诊断之中。
(4)光激活荧光适配子探针和传统的荧光标记的适配子探针在乳腺癌组织成像方面的比较
我们在这里选取了我们自己合成的光激活适配子荧光探针和具有相同适配子序列的荧光素标记的探针,通过石蜡包埋的乳腺癌组织切片实验来对两者的荧光成像能力进行比较,每种探针使用了4张石蜡包埋的乳腺癌切片进行实验,以确保实验结果的可靠性。具体的实验操作步骤与(3)相同。组织切片实验的图像,如图7a所示,荧光强度统计分析的数据结果如图7b和图7c所示。
由图7a可以发现,在对乳腺癌组织切片进行光激活实验的过程中,对于上排的光激活荧光探针,在光激活前,探针在乳腺癌组织中荧光信号非常微弱,随着激发光光照的逐渐进行,乳腺癌组织的荧光信号逐渐增强,并且在第2次408nm光激发后,绿色荧光信号变得非常明显。这说明探针与乳腺癌组织有很好的结合力,且随着光激活过程的进行,探针的荧光强度大大增强,与光激活前呈现出明显的差异。同时,对于下排的荧光素标记的探针,在光激活前,探针在乳腺癌组织中已经呈现出很强的荧光信号,随着激发光光照的逐渐进行,组织中的荧光信号逐渐减弱,这说明探针同样与乳腺癌组织结合了,但在光激活的过程中,传统的荧光素染料由于光漂白作用,荧光强度逐渐减弱。
除此之外,由图7b和图7c的统计结果可以发现,随着激活光光照的进行,光激活探针的荧光信号逐渐增强,在经过了一系列光激活实验后,荧光强度增加了8.6倍,而传统荧光探针的荧光信号则逐渐减弱,经过光激活实验后荧光强度减弱了30%,这也进一步说明了光激活探针对乳腺癌组织进行光激活荧光成像实验时,通过荧光增强能够清楚地找到癌细胞的位置,而传统荧光探针不具备这一特性。
综上所述,我们可以得知,相对于传统的荧光成像方法,光激活荧光成像技术能够通过激发光光照使靶标位置的荧光强度逐渐增强,通过对比光激活前后的荧光图像可以清晰准确地了解靶标位置。除此之外,相对于传统荧光染料会经历光漂白过程而言,光激活荧光染料会呈现一个光激活荧光逐步增强到光漂白荧光逐步减弱的过程,在光照条件下样品荧光信号会更加持久,这有利于长期观测生物体内动态的过程。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉大学
<120> 一种具有光激活性能的适配子探针及检测癌症部位的方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 1
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtgg 26
Claims (4)
1.一种具有光激活性能的适配子探针,其特征在于,所述探针是与癌细胞特异性结合的适配子DNA序列,其5’端修饰有光激活荧光基团,光激活荧光基团是具有光敏性能的荧光小分子,在外源激发光激发后,荧光基团的荧光强度会增强,所述的光激活性能的适配子探针的结构式如式(II)所示:
式(II)中的DNA序列如SEQ NO.1所示。
2.权利要求1所述的具有光激活性能的适配子探针在制备靶向定位乳腺癌细胞的试剂盒中的应用。
3.权利要求1所述的具有光激活性能的适配子探针在制备靶向杀灭乳腺癌细胞的药物中的应用。
4.权利要求1所述的具有光激活性能的适配子探针在制备乳腺癌细胞体外识别、分离和鉴定的试剂盒中的应用。
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