CN112552272A - 香豆素类化合物及其制备方法和应用、药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了香豆素类化合物及其制备方法和应用、药物组合物，属于医药技术领域。本发明提供的香豆素类化合物与α‑突触核蛋白聚合物具有高亲和力和高选择性，能够有效区分α‑突触核蛋白聚合物和其他具有β‑折叠结构的蛋白聚合物，可用于制备检测α‑突触核蛋白聚合物的诊断试剂，尤其可用于制备荧光检测α‑突触核蛋白聚合物的诊断试剂或显像α‑突触核蛋白聚合物的荧光显影剂，当所述香豆素类化合物上标记有放射性核素时，还可用于制备核医学显像α‑突触核蛋白聚合物的放射诊断药物。

Description

香豆素类化合物及其制备方法和应用、药物组合物
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及香豆素类化合物及其制备方法和应用、药物组合物。
背景技术
α-突触核蛋白(α-synuclein，α-syn)病是一类以α-突触核蛋白沉积为主要病理标志的神经退行性疾病，包括帕金森病、路易体痴呆、多系统萎缩以及单纯自主神经功能衰竭。研究发现α-突触核蛋白聚合物可以呈现类似阮病毒一样的性质，诱导正常α-突触核蛋白异常β-折叠，形成α-突触核蛋白阳性包涵体，并从一个细胞扩散蔓延到另一个细胞，提示α-突触核蛋白聚合物在神经系统的沉积及扩散，这是α-突触核蛋白病共同的核心病理机制。因此，开发以α-突触核蛋白聚合物为靶标的检测试剂，对α-突触核蛋白病的早期诊断、病程监测以及治疗药物的研究等具有重要意义。
同时，研发对α-突触核蛋白聚合物具有高亲和力和选择性的小分子化合物，并直接应用于制备检测体液(如血液、脑脊液等)中α-突触核蛋白聚合物的体外诊断试剂以及制备显像α-突触核蛋白病体内α-突触核蛋白聚合物的诊断药物，将具有非常重要的科学意义和实际价值。然而，目前急缺与α-突触核蛋白聚合物具有亲和力和选择性的小分子化合物，且难于有效区分α-突触核蛋白聚合物和其他具有β-折叠结构的蛋白聚合物。此外，在保证与α-突触核蛋白聚合物具有较高亲和力和选择性的基础之上，小分子化合物如何释放特异性α-突触核蛋白聚合物检测信号，也是目前亟待解决的关键问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种香豆素类化合物及其制备方法和应用、药物组合物，本发明提供的香豆素类化合物与α-突触核蛋白聚合物具有高亲和力，且能够释放特异性α-突触核蛋白聚合物检测信号，能够有效区分α-突触核蛋白聚合物和其他具有β-折叠结构的蛋白聚合物，可用于制备检测α-突触核蛋白聚合物的诊断试剂，尤其可用于制备荧光检测α-突触核蛋白聚合物的诊断试剂或显像α-突触核蛋白聚合物的荧光显影剂，当所述香豆素类化合物上标记有放射性核素时，还可用于制备核医学显像α-突触核蛋白聚合物的放射诊断药物。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种香豆素类化合物，具有式I所示结构：
Figure BDA0002850871040000021
式I中，n为0、1、2或3，
X为
Figure BDA0002850871040000022
Y为-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2、-N(CH2CH2CH3)2、-19F、-OCH2CH2 19F、
Figure BDA0002850871040000023
-OCH2CH2 18F、
Figure BDA0002850871040000024
-127I、-125I、-123I或-131I；
其中，当n为0且X为
Figure BDA0002850871040000025
时，Y不为-N(CH3)2。
优选地，当n为1、2或3，且X为
Figure BDA0002850871040000026
时，Y为-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2或-N(CH2CH2CH3)2。
优选地，当n为0或1，且X为
Figure BDA0002850871040000027
时，Y为-OCH2CH2 19F、
Figure BDA0002850871040000028
-OCH2CH2 18F、
Figure BDA0002850871040000029
-127I、-125I、-123I或-131I。
本发明提供了上述技术方案所述香豆素类化合物的制备方法，
(a)当Y为-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2、-N(CH2CH2CH3)2、-19F、-OCH2CH2 19F、
Figure BDA0002850871040000031
或-127I时，所述制备方法包括以下步骤：
将6-氨基香豆素、第一醛类化合物和有机溶剂混合，进行第一席夫碱反应，得到具有式I所示结构的香豆素类化合物；
所述第一醛类化合物具有式a所示结构：
Figure BDA0002850871040000032
(b)当Y为-OCH2CH2 18F、
Figure BDA0002850871040000033
时，所述制备方法包括以下步骤：
将6-氨基香豆素、第二醛类化合物和有机溶剂混合，进行第二席夫碱反应，得到第一中间体；所述第二醛类化合物具有式b所示结构：
Figure BDA0002850871040000034
将所述第一中间体、氯代物、有机溶剂和碳酸钾混合，进行第一取代反应，得到第二中间体；所述氯代物为ClCH2CH2OH、ClCH2CH2-O-CH2CH2OH或ClCH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2OH；
将所述第二中间体、4-甲苯磺酰氯和有机溶剂混合，进行第二取代反应，得到第三中间体；
将Kryptofix 222/K2CO3混合液和[18F]KF溶液混合，去除溶剂后将所得剩余物与第三中间体、有机溶剂混合，在无水条件下进行标记反应，得到具有式I所示结构的香豆素类化合物；所述Kryptofix 222/K2CO3混合液由4,7,13,16,21,24-六氧-1,10-二氮双环[8.8.8]二十六烷、K2CO3和有机溶剂混合得到；
(c)当Y为-125I、-123I或-131I时，所述制备方法包括以下步骤：
将6-氨基香豆素、第三醛类化合物和有机溶剂混合，进行第三席夫碱反应，得到第四中间体；所述第三醛类化合物具有式c所示结构：
Figure BDA0002850871040000041
将所述第四中间体、六正丁基二锡、四三苯基膦钯和有机溶剂混合后进行反应，得到第五中间体；
将所述第五中间体、过氧化氢溶液、碘标记物溶液、盐酸和有机溶剂混合，依次进行第一阶段反应和第二阶段反应，得到具有式I所示结构的香豆素类化合物；所述碘标记物溶液中含有125I-、123I-或131I-。
本发明提供了上述技术方案所述具有式I所示结构的香豆素类化合物在制备检测α-突触核蛋白聚合物的诊断试剂中的应用。
在本发明中，当所述式I中n为1、2或3，X为
Figure BDA0002850871040000042
Y为-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2或-N(CH2CH2CH3)2时，本发明提供了所述香豆素类化合物在制备荧光检测α-突触核蛋白聚合物的诊断试剂中的应用。
优选地，所述荧光检测α-突触核蛋白聚合物的诊断试剂包括显像α-突触核蛋白聚合物的荧光显影剂。
在本发明中，当所述式I中n为0或1，X为
Figure BDA0002850871040000043
Y为-OCH2CH2 19F、
Figure BDA0002850871040000044
-OCH2CH2 18F、
Figure BDA0002850871040000045
-127I、-125I、-123I或-131I时，本发明提供了所述香豆素类化合物在制备核医学显像α-突触核蛋白聚合物的放射诊断药物中的应用，其中核医学显像模式为正电子发射断层扫描成像或单光子发射断层扫描成像。
本发明提供了一种药物组合物，包括上述技术方案所述具有式I所示结构的香豆素类化合物和药学上可接受的载体。
本发明提供了一种香豆素类化合物，本发明提供的香豆素类化合物具有平面柔性结构，其结构中的香豆素侧链氮原子能够选择性亲和α-突触核蛋白聚合物的C末端酸性蛋白，且本发明提供的香豆素类化合物整体嵌合入α-突触核蛋白聚合物的β-折叠空间结构中，从而使得其与α-突触核蛋白聚合物具有高亲和力和选择性，且能够释放特异性α-突触核蛋白聚合物检测信号，从而实现与其他具有β-折叠结构的蛋白聚合物的有效区分；本发明提供的香豆素类化合物与α-突触核蛋白聚合物结合(即本发明提供的香豆素类化合物整体嵌合入α-突触核蛋白聚合物的β-折叠的空间结构中)后，香豆素类化合物所处微环境的极性降低，会产生特异荧光增强，荧光增强倍数可达73.82～323.7，可以用于制备检测α-突触核蛋白聚合物的诊断试剂，尤其可以用于制备荧光检测α-突触核蛋白聚合物的诊断试剂，当所述香豆素类化合物上标记有放射性核素时，还可以用于制备显像α-突触核蛋白聚合物的放射诊断药物，具体可以检测体液中α-突触核蛋白聚合物或显像α-突触核蛋白病脑内α-突触核蛋白聚合物。
附图说明
图1为测试例3中化合物NBC-2对脑匀浆中不同具有β-折叠结构的蛋白聚合物和蛋白单体的荧光检测结果图；
图2为测试例4中化合物NBC-2对细胞内α-突触核蛋白聚合物的染色结果图；
图3为测试例5中正常小鼠注射化合物NBC-2后30min脑内荧光成像图；
图4为测试例6中帕金森病(PD)转基因老龄小鼠和正常老龄小鼠注射化合物NBC-2后60min脑内荧光成像图；
图5为测试例7中PD转基因老龄小鼠脑切片的放射标记图。
具体实施方式
本发明提供了一种香豆素类化合物，具有式I所示结构：
Figure BDA0002850871040000061
式I中，n为0、1、2或3，
X为
Figure BDA0002850871040000062
Y为-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2、-N(CH2CH2CH3)2、-19F、-OCH2CH2 19F、
Figure BDA0002850871040000063
-OCH2CH2 18F、
Figure BDA0002850871040000064
-127I、-125I、-123I或-131I；
其中，当n为0且X为
Figure BDA0002850871040000065
时，Y不为-N(CH3)2。
在本发明中，当n为1、2或3，且X为
Figure BDA0002850871040000066
时，Y优选为-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2或-N(CH2CH2CH3)2。
在本发明中，当n为0或1，且X为
Figure BDA0002850871040000067
时，Y优选为-OCH2CH2 19F、
Figure BDA0002850871040000068
-OCH2CH2 18F、
Figure BDA0002850871040000069
-127I、-125I、-123I或-131I。
在本发明中，所述香豆素类化合物具体可以为以下化合物中的任一种：
Figure BDA00028508710400000610
记为化合物NBC-2；
Figure BDA0002850871040000071
记为化合物NBC-3；
Figure BDA0002850871040000072
记为化合物NBC-4；
Figure BDA0002850871040000073
记为化合物NBC-5；
Figure BDA0002850871040000074
记为化合物NBC-6；
Figure BDA0002850871040000075
记为化合物NBC-7；
Figure BDA0002850871040000076
记为化合物NBC-8；
Figure BDA0002850871040000077
记为化合物NBC-9；
Figure BDA0002850871040000078
记为化合物NBC-10。
本发明提供了上述技术方案所述香豆素类化合物的制备方法，具体是根据式I中Y的种类选择相应的制备方法，下面详细说明。
在本发明中，当Y为-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2、-N(CH2CH2CH3)2、-19F、-OCH2CH2 19F、
Figure BDA0002850871040000081
Figure BDA0002850871040000082
或-127I时，香豆素类化合物的制备方法包括以下步骤：
将6-氨基香豆素、第一醛类化合物和有机溶剂混合，进行第一席夫碱反应，得到具有式I所示结构的香豆素类化合物；
所述第一醛类化合物具有式a所示结构：
Figure BDA0002850871040000083
本发明上述反应的反应流程式为：
Figure BDA0002850871040000084
下面结合上述反应流程式进行具体说明。
本发明对所述6-氨基香豆素的来源没有特殊限定，可以为市售商品，也可以采用本领域技术人员熟知的方法制备得到；在本发明中，所述6-氨基香豆素的制备方法优选包括以下步骤：
将6-硝基香豆素、溶剂、还原剂和盐酸混合，进行还原反应，得到6-氨基香豆素。
在本发明中，所述还原反应用溶剂优选为醇类化合物-水混合液，所述醇类化合物优选为甲醇或乙醇，所述醇类化合物与水的体积比优选为1：(1～5)，更优选为1：3；所述溶剂与6-硝基香豆素的用量比优选为(180～220)mL：7mmol，更优选为200mL：7mmol。在本发明中，所述还原剂优选为还原性铁粉，所述还原剂与6-硝基香豆素的摩尔比优选为(20～24)：7，更优选为22：7。在本发明中，所述盐酸的浓度优选为31～32mol/L，所述盐酸与6-硝基香豆素的用量比优选为(1.3～1.5)mL：7mmol，更优选为1.4mL：7mmol。
本发明优选将6-硝基香豆素溶于溶剂中，在搅拌条件下将所得混合液加热至回流状态，然后向体系中加入还原剂，之后再逐滴加入盐酸，进行还原反应。在本发明中，所述还原反应优选在回流条件下进行，所述还原反应的时间优选为8～10h，更优选为9h。
所述还原反应后，本发明优选将所得反应液趁热过滤除去还原剂(具体如还原性铁粉)，用二氯甲烷萃取所得滤液，分离出二氯甲烷层，加入无水硫酸钠进行干燥，之后过滤，旋干所得滤液，得到6-氨基香豆素；所述醇类化合物优选为甲醇或乙醇。
得到6-氨基香豆素后，本发明将6-氨基香豆素、第一醛类化合物和有机溶剂混合，进行第一席夫碱反应，得到具有式I所示结构的香豆素类化合物。在本发明中，6-氨基香豆素和第一醛类化合物的摩尔比优选为1：(1～1.2)，更优选为1：1.1。在本发明中，所述第一席夫碱反应用有机溶剂优选为乙醇、乙腈或四氢呋喃，更优选为无水乙醇，所述有机溶剂与6-氨基香豆素的用量比优选为(3.5～4.5)mL：1mmol，更优选为4mL：1mmol。本发明对6-氨基香豆素、第一醛类化合物和有机溶剂混合的方式没有特殊限定，保证各组分混合均匀即可。在本发明中，所述第一席夫碱反应优选在回流条件下进行，所述第一席夫碱反应的时间优选为1～6h，更优选为3～6h。
所述第一席夫碱反应后，本发明优选将所得反应液冷却至室温，之后采用乙醇进行重结晶，得到具有式I所示结构的香豆素类化合物。
在本发明中，当Y为-OCH2CH2 18F、
Figure BDA0002850871040000091
Figure BDA0002850871040000092
时，香豆素类化合物的制备方法包括以下步骤：
将6-氨基香豆素、第二醛类化合物和有机溶剂混合，进行第二席夫碱反应，得到第一中间体；所述第二醛类化合物具有式b所示结构：
Figure BDA0002850871040000093
将所述第一中间体、氯代物、有机溶剂和碳酸钾混合，进行第一取代反应，得到第二中间体；所述氯代物为Cl-CH2CH2-OH、ClCH2CH2-O-CH2CH2OH或ClCH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2OH；
将所述第二中间体、4-甲苯磺酰氯和有机溶剂混合，进行第二取代反应，得到第三中间体；
将Kryptofix 222/K2CO3混合液和[18F]KF溶液混合，去除溶剂后将所得剩余物与第三中间体、有机溶剂混合，在无水条件下进行标记反应，得到具有式I所示结构的香豆素类化合物；所述Kryptofix 222/K2CO3混合液由4,7,13,16,21,24-六氧-1,10-二氮双环[8.8.8]二十六烷、K2CO3和有机溶剂混合得到。
本发明上述反应的反应流程式为：
Figure BDA0002850871040000101
其中，所述氯代物为Cl-CH2CH2-OH、ClCH2CH2-O-CH2CH2OH或ClCH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2OH，m为1、2或3；
下面结合上述反应流程式进行具体说明。
本发明将6-氨基香豆素、第二醛类化合物和有机溶剂混合，进行第二席夫碱反应，得到第一中间体。在本发明中，6-氨基香豆素和第二醛类化合物的摩尔比优选为1：(1～1.2)，更优选为1：1.1。在本发明中，所述第二席夫碱反应用有机溶剂优选为乙醇、乙腈或四氢呋喃，更优选为无水乙醇，所述有机溶剂与6-氨基香豆素的用量比优选为(4.5～5.5)mL：1mmol，更优选为5mL：1mmol。本发明对6-氨基香豆素、第二醛类化合物和有机溶剂混合的方式没有特殊限定，保证各组分混合均匀即可。在本发明中，所述第二席夫碱反应优选在回流条件下进行，所述第二席夫碱反应的时间优选为1～6h，更优选为3～5h。
所述第二席夫碱反应后，本发明优选将所得反应液冷却至室温，之后采用乙醇进行重结晶或柱层析纯化，得到得到第一中间体。在本发明中，所述柱层析纯化用试剂优选为二氯甲烷-甲醇混合液，所述二氯甲烷和甲醇的体积比优选为(8～12)：1，更优选为10：1。
得到第一中间体后，本发明将所述第一中间体、氯代物、有机溶剂和碳酸钾混合，进行第一取代反应，得到第二中间体。在本发明中，所述第一中间体、氯代物和碳酸钾的摩尔比优选为1：(1～1.2)：(0.9～1.1)，更优选为1：1.1：1。在本发明中，所述第一取代反应用有机溶剂优选为二甲基甲酰胺(DMF)，所述有机溶剂与第一中间体的用量比优选为(2.5～3.5)mL：1mmol，更优选为3mL：1mmol。本发明对第一中间体、氯代物、有机溶剂和碳酸钾混合的方式没有特殊限定，保证各组分混合均匀即可。在本发明中，所述第一取代反应的温度优选为95～105℃，更优选为100℃；时间优选为8～24h，更优选为10～15h。
所述第一取代反应结束后，本发明优选将所得反应液冷却至室温，之后与水混合，用氯仿萃取所得混合物，分离出氯仿层，加入无水硫酸钠进行干燥，之后过滤，旋干所得滤液，残余物经柱层析纯化，得到第二中间体；所述柱层析纯化用试剂优选为乙酸乙酯-石油醚混合液，所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为4：1。
得到第二中间体后，本发明将所述第二中间体、4-甲苯磺酰氯和有机溶剂混合，进行第二取代反应，得到第三中间体。在本发明中，所述第二中间体和4-甲苯磺酰氯的摩尔比优选为1：(1～1.2)，更优选为1：1.1。在本发明中，所述第二取代反应用有机溶剂优选为吡啶，所述有机溶剂与第二中间体的摩尔比优选为1：(0.45～0.55)，更优选为1：0.5。本发明对第二中间体、4-甲苯磺酰氯和有机溶剂混合的方式没有特殊限定，保证各组分混合均匀即可。在本发明中，所述第二取代反应的温度优选为室温，所述第二取代反应的时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h。
所述第二取代反应后，本发明优选用氯仿萃取所得反应液，分离出氯仿层，加入无水硫酸钠进行干燥，之后过滤，旋干所得滤液，残余物经柱层析纯化，得到第三中间体；所述柱层析纯化用试剂优选为乙酸乙酯-石油醚混合液，所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1：2。
本发明4,7,13,16,21,24-六氧-1,10-二氮双环[8.8.8]二十六烷(Kryptofix222)、K2CO3和有机溶剂混合，得到Kryptofix 222/K2CO3混合液；所述Kryptofix222/K2CO3混合液中Kryptofix 222的浓度优选为9.5mg/mL，K2CO3的浓度优选为1.7mg/mL。
本发明提供[18F]KF溶液；本发明对所述[18F]KF溶液的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方法制备得到即可；本发明优选通过加速器制备[18F]KF溶液。
得到Kryptofix 222/K2CO3混合液和[18F]KF溶液后，本发明将Kryptofix222/K2CO3混合液和[18F]KF溶液混合，去除溶剂后将所得剩余物与第三中间体、有机溶剂混合，在无水条件下进行标记反应，得到具有式I所示结构的香豆素类化合物。在本发明中，具体是将18F]KF溶液置于反应瓶中，向反应瓶中加入1.0mL的Kryptofix 222/K2CO3混合液，混合均匀后，加热除去溶剂，得到第一剩余物；向所述第一剩余物中加入1mL无水乙腈，加热除去溶剂，得到第二剩余物，以保证充分去除体系中水分，所述加热的温度优选为115～125℃，更优选为120℃；之后将所述第二剩余物与第三中间体、有机溶剂混合，在无水条件下进行标记反应。在本发明中，以1.0mL的Kryptofix222/K2CO3混合液计，所述第三中间体的用量优选为0.9～1.1mg，更优选为1mg。在本发明中，所述标记反应用有机溶剂优选为乙腈，所述有机溶剂与第三中间体的用量比优选为(190～210)μL：1mg，更优选为200μL：1mg。在本发明中，所述标记反应的温度优选为95～105℃，更优选为110℃；所述标记反应的时间优选为8～12min，更优选为10min；本发明优选通过加水终止所述标记反应。
所述标记反应后，本发明优选将所得反应液注入固相萃取柱(Oasis HLB固相萃取柱，规格优选为3cm3)中，先用水冲洗去除未反应的18F-，再用乙腈洗脱，得到含有18F标记物的洗脱液；将所述洗脱液经HPLC分离，得到得到具有式I所示结构的香豆素类化合物；所述HPLC分离的条件优选包括：YMC-Pack Pro C18柱，规格为20mm×150mm；流动相为乙腈和水，乙腈和水的体积比为95：5；流速为2.0mL/min。
在本发明中，当Y为-125I、-123I或-131I时，香豆素类化合物的制备方法包括以下步骤：
将6-氨基香豆素、第三醛类化合物和有机溶剂混合，进行第三席夫碱反应，得到第四中间体；所述第三醛类化合物具有式c所示结构：
Figure BDA0002850871040000131
将所述第四中间体、六正丁基二锡、四三苯基膦钯和有机溶剂混合，进行反应，得到第五中间体；
将所述第五中间体、过氧化氢溶液、碘标记物溶液、盐酸和有机溶剂混合，依次进行第一阶段反应和第二阶段反应，得到具有式I所示结构的香豆素类化合物；所述碘标记物溶液中含有125I-、123I-或131I-。
本发明上述反应的反应流程式为：
Figure BDA0002850871040000132
下面结合上述反应流程式进行具体说明。
本发明将6-氨基香豆素、第三醛类化合物和有机溶剂混合，进行第三席夫碱反应，得到第四中间体。在本发明中，6-氨基香豆素和第三醛类化合物的摩尔比优选为1：(1～1.2)，更优选为1：1.1。在本发明中，所述第三席夫碱反应用有机溶剂优选为乙醇、乙腈或四氢呋喃，更优选为无水乙醇，所述有机溶剂与6-氨基香豆素的用量比优选为(4.5～5.5)mL：1mmol，更优选为5mL：1mmol。本发明对6-氨基香豆素、第三醛类化合物和有机溶剂混合的方式没有特殊限定，保证各组分混合均匀即可。在本发明中，所述第三席夫碱反应优选在回流条件下进行，所述第三席夫碱反应的时间优选为1～6h，更优选为3～5h。
所述第三席夫碱反应后，本发明优选将所得反应液冷却至室温，之后采用乙醇进行重结晶或柱层析纯化，得到得到第四中间体。在本发明中，所述柱层析纯化用试剂优选为二氯甲烷-甲醇混合液，所述二氯甲烷和甲醇的体积比优选为(8～12)：1，更优选为10：1。
得到第四中间体后，本发明将所述第四中间体、六正丁基二锡、四三苯基膦钯和有机溶剂混合后进行反应，得到第五中间体。在本发明中，所述第四中间体、六正丁基二锡和四三苯基膦钯的摩尔比优选为1：(0.9～1.1)：(0.9～1.1)，更优选为1：1：1。在本发明中，所述反应用有机溶剂优选为二氧六环-三乙胺混合液，所述二氧六环-三乙胺混合液中二氧六环和三乙胺的体积比优选为(2.5～3.5)：1，更优选为3：1。本发明对第四中间体、六正丁基二锡、四三苯基膦钯和有机溶剂混合的方式没有特殊限定，保证各组分混合均匀即可。在本发明中，所述反应优选在回流条件下进行，所述反应的时间优选为10～24h，更优选为12～15h。
上述反应后，本发明优选将所得反应液冷却至室温，过滤，滤液经柱层析纯化，得到第五中间体；所述柱层析纯化用试剂优选为乙酸乙酯-石油醚混合液，所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为(0.8～1.2)：1，更优选为1：1。
得到第五中间体后，本发明将所述第五中间体、过氧化氢溶液、碘标记物溶液、盐酸和有机溶剂混合，依次进行第一阶段反应和第二阶段反应，得到具有式I所示结构的香豆素类化合物。在本发明中，所述过氧化氢溶液的浓度优选为3wt％；所述第五中间体和过氧化氢溶液的用量比优选为0.5mg：(95～105)μL，更优选为0.5mg：100μL。在本发明中，所述碘标记物溶液优选为[125I]NaI溶液、[123I]NaI溶液或[131I]NaI溶液；所述碘标记物溶液的放射性强度优选为0.74MBq。在本发明中，所述盐酸的浓度优选为1mol/L，所述盐酸与第五中间体的用量优选为(95～105)μL：0.5mg，更优选为100μL：0.5mg。在本发明中，所述第一阶段反应和第二阶段反应用有机溶剂优选为乙醇，所述有机溶剂与第五中间体的用量优选为(95～105)μL：0.5mg，更优选为100μL：0.5mg。本发明优选将第五中间体溶于有机溶剂中，将所得溶液置于反应瓶中，之后依次加入过氧化氢溶液、碘标记物溶液和盐酸，立即密封反应瓶进行第一阶段反应。
在本发明中，所述第一阶段反应优选在室温条件下进行，所述第一阶段反应的时间优选为8～12min，更优选为10min；本发明优选通过向体系中加入NaHSO3终止第一阶段反应。
在本发明中，所述第一阶段反应后，所得体系无需进行其它后处理，直接进行第二阶段反应；所述第二阶段反应的温度优选为95～105℃，更优选为100℃，所述第二阶段反应的时间优选为8～12min，更优选为10min，本发明优选通过向体系中加入水终止第二阶段反应。
所述第二阶段反应后，本发明优选将所得反应液经碳酸氢钠中和至pH值为7后，经乙酸乙酯萃取，分离出乙酸乙酯层，用氮气去除所述乙酸乙酯层中乙酸乙酸，所得残余物经HPLC分离，得到具有式I所示结构的香豆素类化合物；所述HPLC分离的条件优选包括：YMC-Pack Pro C18柱，规格为5mm×150mm；流动相为乙腈和水，乙腈和水的体积比为60：40；流速为1.0mL/min。
本发明提供了具有式I所示结构的香豆素类化合物在制备检测α-突触核蛋白聚合物的诊断试剂中的应用。在本发明中，所述检测α-突触核蛋白聚合物的诊断试剂可以用于检测动物活体、人体或离体组织内α-突触核蛋白聚合物。本发明对所述检测α-突触核蛋白聚合物的诊断试剂的应用方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可；在本发明的实施例中，具体可以采用以下三种方式中的任一种：
方式一：将可检测量的香豆素类化合物引入体内，在足以使该香豆素类化合物与α-突触核蛋白聚合物结合的时间之后，非创伤性地检测体内的香豆素类化合物；在本发明中，将香豆素类化合物引入体内的方式优选为注射、滴眼或口服；所述香豆素类化合物与α-突触核蛋白聚合物结合的时间优选为0.5～3h；非创伤性检测体内香豆素类化合物的方式优选为给药后直接用活体显像仪成像机体脑部或眼底。
方式二：将可检测量的香豆素类化合物引入体内，在足以使该香豆素类化合物与α-突触核蛋白聚合物结合的时间之后，取组织样品，并脱离体内检测组织样品中的香豆素类化合物；在本发明中，将香豆素类化合物引入体内的方式优选为注射、滴眼或口服；所述香豆素类化合物与α-突触核蛋白聚合物结合的时间优选为0.5～3h；所述组织样品优选为动物脑部或动物眼球。
方式三：自体内取组织样品，将可检测量的香豆素类化合物引入该组织样品，在足以使该香豆素类化合物与α-突触核蛋白聚合物结合的时间之后，检测组织样品中的香豆素类化合物；在本发明中，所述组织样品优选为动物或患者的脑、脑脊液或眼球；将所述香豆素类化合物引入所述组织样品的方式优选为将所述香豆素类化合物与所述组织样品直接混合；所述香豆素类化合物与α-突触核蛋白聚合物结合的时间优选为5min～1h。
在本发明中，当所述式I中n为1、2或3，X为
Figure BDA0002850871040000161
Y为-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2或-N(CH2CH2CH3)2时，本发明提供了所述香豆素类化合物在制备荧光检测α-突触核蛋白聚合物的诊断试剂中的应用。本发明对所述荧光检测α-突触核蛋白聚合物的诊断试剂的应用方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可，具体可以采用上述三种方式中的任一种。本发明中荧光检测α-突触核蛋白聚合物的诊断试剂可以用于体外荧光检测α-突触核蛋白聚合物，具体可以用于荧光检测体液(如血液、脑脊液或尿液)中α-突触核蛋白聚合物。在本发明的实施例中，具体是将可检测量的香豆素类化合物加入体液中，在足以使该香豆素类化合物结合至α-突触核蛋白聚合物的时间(优选为0.5～3h)之后，在一定的激发和发射波长下检测荧光强度。
在本发明中，所述荧光检测α-突触核蛋白聚合物的诊断试剂优选包括显像α-突触核蛋白聚合物的荧光显影剂，本发明对所述显像α-突触核蛋白聚合物的荧光显影剂的应用方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可，具体可以采用上述三种方式中的任一种。本发明中显像α-突触核蛋白聚合物的荧光显影剂可以用于显像α-突触核蛋白聚合物，具体可以用于显像动物活体、人体或离体组织内α-突触核蛋白聚合物。
在本发明中，当所述式I中n为0或1，X为
Figure BDA0002850871040000171
Y为-OCH2CH2 19F、
Figure BDA0002850871040000172
-OCH2CH2 18F、
Figure BDA0002850871040000173
-127I、-125I、-123I或-131I时，本发明提供了所述香豆素类化合物在制备核医学显像α-突触核蛋白聚合物的放射诊断药物中的应用，其中核医学显像模式为正电子发射断层扫描成像或单光子发射断层扫描成像。本发明在香豆素类化合物的苯环或吡啶环对位侧链引入放射标记核素，该放射标记的香豆素类化合物可直接应用于制备核医学显像α-突触核蛋白聚合物的放射诊断药物，具体可以用于显像动物活体、人体或离体组织内α-突触核蛋白聚合物。本发明对所述核医学显像α-突触核蛋白聚合物的放射诊断药物的应用方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可；在本发明的实施例中，具体可以采用上述三种方式中的任一种。
本发明提供了一种药物组合物，包括具有式I所示结构的香豆素类化合物和药学上可接受的载体。在本发明中，所述药学上可接受的载体例如可以为生理盐水、甘油或乙醇。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
制备6-氨基香豆素中间体，包括以下步骤：
将7mmol的6-硝基香豆素与200mL甲醇-水混合液(甲醇与水的体积比为1：3)混合，在搅拌条件下加热至回流状态，加入22mmol还原性铁粉，然后逐滴加入1.4mL浓盐酸(44mmol)，继续加热，使体系在回流状态下反应9h；反应结束后，将所得反应液冷却至室温(25℃)，过滤除去还原性铁粉，将滤液与100mL甲醇混合，用二氯甲烷萃取所得混合物，分离出二氯甲烷层，加入无水硫酸钠进行干燥，之后过滤，旋干所得滤液，得到6-氨基香豆素。
所述6-氨基香豆素的结构式如下所示：
Figure BDA0002850871040000181
所述6-氨基香豆素的核磁数据如下：1HNMR(400MHz,CDCl3)：δ9.42(s,1H),7.41(d,J＝4.4Hz,1H),5.86(d,J＝4.4Hz,1H),3.03(s,6H)。
实施例2
制备化合物NBC-2，包括以下步骤：
将1mmol的6-氨基香豆素与1.1mmol的4-(二甲基氨基)肉桂醛溶于5mL无水乙醇中，加热，使体系在回流状态下反应5h；反应结束后，将所得反应液冷却至室温，之后采用乙醇进行重结晶，得到黄色固体，即为化合物NBC-2。
所述化合物NBC-2的核磁数据如下：1HNMR(400MHz,CDCl3)：δ8.24(d,J＝9.0Hz,1H),7.71(d,J＝9.5Hz,1H),7.45(d,J＝8.6Hz,2H),7.37(d,J＝8.7Hz,1H),7.33(d,J＝8.7Hz,1H),7.26(d,J＝6.2Hz,1H),7.12(d,J＝15.7Hz,1H),6.93(dd,J＝15.7,9.0Hz,1H),6.70(d,J＝8.6Hz,2H),6.44(d,J＝9.5Hz,1H),3.04(s,6H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ163.26(s),160.97(s),152.04(s),151.63(s),148.84(s),146.17(s),143.57(s),129.40(s),125.05(s),123.42(d,J＝3.2Hz),119.32(s),117.69(s),117.10(s),112.08(s),40.29(s)。
实施例3
制备化合物NBC-3，包括以下步骤：
将1mmol的6-氨基香豆素与1.1mmol的5-(二甲氨基)-2-噻吩甲醛溶于5mL无水乙醇中，加热，使体系在回流状态下反应4h；反应结束后，将所得反应液冷却至室温，之后采用乙醇进行重结晶，得到黄色固体，即为化合物NBC-3。
所述化合物NBC-3的核磁数据如下：1HNMR(400MHz,CDCl3)：δ8.34(s,1H),7.69(d,J＝9.5Hz,1H),7.38(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),7.30(d,J＝8.8Hz,1H),7.24(d,J＝4.6Hz,1H),6.42(d,J＝9.5Hz,1H),5.88(d,J＝4.2Hz,1H),3.08(s,6H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.15(s),153.49(s),151.54(s),143.69(s),125.19(s),119.27(s),117.55(s),116.95(s),102.48(s),42.25(s)。
实施例4
制备化合物NBC-4，包括以下步骤：
将1mmol的6-氨基香豆素与1.1mmol的6-(二甲基氨基)烟碱醛溶于5mL无水乙醇中，加热，使体系在回流状态下反应5h；反应结束后，将所得反应液冷却至室温，之后采用乙醇进行重结晶，得到黄色固体，即为化合物NBC-4。
所述化合物NBC-4的核磁数据如下：1HNMR(400MHz,CDCl3)：δ8.45(s,1H),8.35(s,1H),8.12(d,J＝9.0Hz,1H),7.72(d,J＝9.5Hz,1H),7.39(d,J＝8.8Hz,1H),7.34(d,J＝8.7Hz,1H),7.27(s,1H),6.61(d,J＝9.0Hz,1H),6.45(d,J＝9.5Hz,1H),3.20(s,6H)。13CNMR(101MHz,CDCl3)δ160.98(s),160.60(s),158.74(s),152.17(s),151.93(s),149.21(s),143.53(s),135.54(s),125.18(s),120.45(s),119.24(d,J＝13.8Hz),117.64(s),117.11(s),106.21(s),38.29(s)。
实施例5
制备化合物NBC-5，包括以下步骤：
将1mmol的6-氨基香豆素与1.1mmol的4-(二乙基氨基)肉桂醛溶于5mL无水乙醇中，加热至，使体系在回流状态下反应6h；反应结束后，将所得反应液冷却至室温，之后采用乙醇进行重结晶，得到黄色固体，即为化合物NBC-5。
所述化合物NBC-5的核磁数据如下：1HNMR(400MHz,CDCl3)：δ8.14(d,J＝9.0Hz,1H),7.71(d,J＝9.5Hz,1H),7.45(d,J＝8.6Hz,2H),7.37(d,J＝8.7Hz,1H),7.33(d,J＝8.7Hz,1H),7.26(d,J＝6.2Hz,1H),7.12(d,J＝15.7Hz,1H),6.93(dd,J＝15.7,9.0Hz,1H),6.70(d,J＝8.6Hz,2H),6.44(d,J＝9.5Hz,1H),3.04(s,4H)，1.19(s,6H)。
实施例6
制备化合物NBC-6，包括以下步骤：
将1mmol的6-氨基香豆素与1.1mmol的对氟苯甲醛溶于6mL无水乙醇中，加热，使体系在回流状态下反应6h；反应结束后，将所得反应液冷却至室温，之后采用乙醇进行重结晶，得到淡黄色固体，即为化合物NBC-6。
所述化合物NBC-6的核磁数据如下：1HNMR(400MHz,CDCl3)：δ8.65(s,1H),8.12(d,J＝9.6Hz,1H),8.02(d,J＝8.7Hz,2H),7.36(d,J＝6.1Hz,2H),7.28(d,J＝9.4Hz,1H),7.09(d,J＝8.7Hz,2H),6.50(d,J＝9.6Hz,1H)。
实施例7
制备化合物NBC-7，包括以下步骤：
将1mmol的6-氨基香豆素与1.1mmol的对碘苯甲醛溶于6mL无水乙醇中，加热，使体系在回流状态下反应6h；反应结束后，将所得反应液冷却至室温，之后采用乙醇进行重结晶，得到白色固体，即为化合物NBC-7。
所述化合物NBC-7的核磁数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ8.65(s,1H),8.14(d,J＝9.6Hz,1H),7.68(d,J＝8.7Hz,2H),7.58(d,J＝6.1Hz,2H),7.31(d,J＝9.4Hz,1H),7.09(d,J＝8.7Hz,2H),6.50(d,J＝9.6Hz,1H)。
实施例8
制备化合物NBC-8，包括以下步骤：
将1mmol的6-氨基香豆素与1.1mmol的
Figure BDA0002850871040000211
溶于5mL无水乙醇中，加热，使体系在回流状态下反应3h；反应结束后，将所得反应液冷却至室温，之后采用乙醇进行重结晶，得到淡黄色固体，即为化合物NBC-8。
所述化合物NBC-8的核磁数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ8.65(s,1H),8.14(d,J＝9.6Hz,1H),7.87(d,J＝8.7Hz,2H),7.33(d,J＝6.1Hz,2H),7.28(d,J＝9.4Hz,1H),7.03(d,J＝8.7Hz,2H),4.55(d,J＝8.7Hz,2H),4.14(d,J＝9.6Hz,2H)。
实施例9
制备化合物NBC-9，包括以下步骤：
将1mmol的6-氨基香豆素与1.1mmol对羟基苯甲醛溶于5mL无水乙醇中，加热，使体系在回流状态下反应5h；反应结束后，将所得反应液冷却至室温，过滤，滤液经乙醇重结晶，得到第一中间体；
所述第一中间体的结构如下：
Figure BDA0002850871040000212
将1mmol第一中间体与1.1mmol的CH2ClCH2OH溶于3mL二甲基甲酰胺(DMF)中，加入1mmol碳酸钾，加热至100℃反应10h；反应结束后将所得反应液冷却至室温，之后与50mL水混合，用氯仿萃取所得混合物，分离出氯仿层，加入无水硫酸钠进行干燥，之后过滤，旋干所得滤液，残余物经柱层析纯化(纯化用试剂为乙酸乙酯-石油醚混合液，所述乙酸乙酯和石油醚的体积比为4：1)，得到第二中间体；
所述第二中间体的结构如下：
Figure BDA0002850871040000221
在0℃条件下，将1mmol第二中间体、1.1mmol的4-甲苯磺酰氯和0.5mmol吡啶混合，在室温条件下进行取代反应2h；反应结束后，用氯仿萃取所得反应液，分离出氯仿层，加入无水硫酸钠进行干燥，之后过滤，旋干所得滤液，残余物经柱层析纯化(纯化用试剂为乙酸乙酯-石油醚混合液，所述乙酸乙酯和石油醚的体积比为1：2)，得到第三中间体；
所述第三中间体的结构如下：
Figure BDA0002850871040000222
将4,7,13,16,21,24-六氧-1,10-二氮双环[8.8.8]二十六烷(Kryptofix 222)和K2CO3溶于乙腈中，得到Kryptofix 222/K2CO3混合液，所述Kryptofix222/K2CO3混合液中Kryptofix 222的浓度为9.5mg/mL，K2CO3的浓度为1.7mg/mL；
通过加速器制备[18F]KF溶液，将所述[18F]KF溶液置于反应瓶中，向反应瓶中加入1.0mL的Kryptofix 222/K2CO3混合液，涡旋混合后，于120℃条件下加热除去溶剂，得到第一剩余物；向所述第一剩余物中加入1mL无水乙腈，于120℃条件下加热除去溶剂，得到第二剩余物；
将所述第二剩余物与200μL第三中间体的乙腈溶液(第三中间体的质量为1.0mg)混合，在100℃条件下反应10min，之后加水5mL终止反应；将所得反应液注入固相萃取柱(Oasis HLB固相萃取柱，规格为3cm3)中，先用10mL水冲洗去除未反应的18F-，再用2mL乙腈洗脱，得到含有18F标记物的洗脱液；将所述洗脱液经HPLC分离(YMC-Pack Pro C18柱，规格为20mm×150mm；流动相为乙腈和水，乙腈和水的体积比为95：5；流速为2.0mL/min)，得到化合物NBC-9。
经HPLC比对，所述化合物NBC-9与化合物NBC-8的谱图保留时间一致。
实施例10
制备化合物NBC-10，包括以下步骤：
将1mmol的6-氨基香豆素与1.1mmol对溴苯甲醛溶于5mL无水乙醇中，加热，使体系在回流状态下反应5h；反应结束后，将所得反应液冷却至室温，过滤，滤液经乙醇重结晶，得到第四中间体；
所述第四中间体的结构如下：
Figure BDA0002850871040000231
将1mmol第四中间体、1mmol六正丁基二锡和1mmol四三苯基膦钯溶于40mL二氧六环-三乙胺混合液(二氧六环和三乙胺的体积比为3：1)中，加热，使体系在回流状态下反应12h；反应结束后将所得反应液冷却至室温，过滤，滤液经柱层析纯化(纯化用试剂为乙酸乙酯-石油醚混合液，所述乙酸乙酯和石油醚的体积比为1：1)，得到第五中间体；
所述第五中间体的结构如下：
Figure BDA0002850871040000232
将100μL第五中间体的乙醇溶液(第五中间体的质量为0.5mg)置于反应瓶中，依次加入100μL过氧化氢溶液(浓度为3wt％)和0.74MBq[125I]NaI溶液，之后加入100μL浓度为1mol/L的盐酸，立即密封反应瓶，在室温条件下反应10min，之后加入100mg的NaHSO3终止反应；将所得反应液在100℃条件下反应10min，之后加入5mL水终止反应；将所得反应液经碳酸氢钠中和至pH值为7后，经乙酸乙酯萃取，分离出乙酸乙酯层，用氮气去除所述乙酸乙酯层中乙酸乙酸，得到含有125I标记物的残余物，之后经HPLC分离(YMC-PackPro C18柱，规格为5mm×150mm；流动相为乙腈和水，乙腈和水的体积比为60：40；流速为1.0mL/min)，得到化合物NBC-10。
经HPLC比对，所述化合物NBC-10与化合物NBC-7的谱图保留时间一致。
测试例1
1、吸收波长与摩尔吸收系数的测定
精密称取适量实施例2～5中香豆素类化合物，溶于DMSO(二甲基亚砜)或PBS缓冲液(pH值为7.4)中，分别配制一定浓度梯度的溶液，浓度为1μM、5μM、10μM、20μM和25μM，用紫外-可见分光光度计扫描紫外吸收光谱，记录最大吸收波长(λabs)和吸光度，并计算摩尔吸收系数ε(M-1cm-1)。本发明实施例2～5中香豆素类化合物在DMSO和PBS缓冲液中的最大吸收波长与摩尔吸收系数见表1。
2、荧光激发波长与荧光发射波长的测定
精密称取适量实施例2～5中香豆素类化合物，溶于DMSO或PBS缓冲液，并用二氯甲烷稀释至浓度为1μmol·L-1，采用荧光分光光度计进行荧光检测，固定激发/发射波长(Ex/Em)，并在300～750nm范围连续扫描发射/激发波长，绘制波形图像。本发明实施例2～5中香豆素类化合物在DMSO和PBS缓冲液中的最大激发波长与最大发射波长见表1。
由表1可知，本发明提供的香豆素类化合物具有良好的荧光性质。
表1实施例2～5中香豆素类化合物的光学性质
Figure BDA0002850871040000241
Figure BDA0002850871040000251
测试例2
精密称取适量实施例2～5中香豆素类化合物，溶于DMSO，并用PBS缓冲液稀释至1μmol·L-1，应用荧光分光光度计对所得溶液进行荧光检测；之后在溶液中加入α-突触核蛋白聚合物，在室温条件下放置30min，采用荧光分光光度计对所得溶液进行荧光检测；绘制波形图像，记录最大荧光强度，计算实施例2～5中香豆素类化合物与α-突触核蛋白聚合物混合前后的荧光增强倍数。按照上述方法分别考察实施例2～5中香豆素类化合物与α-突触核蛋白单体以及其它结构类似的蛋白单体和聚合物混合前后的荧光变化，同时考察实施例2～5中香豆素类化合物对α-突触核蛋白单体以及其它结构类似的蛋白单体和聚合物的选择性。测试结果见表2。由表2可知，本发明提供的香豆素类化合物对α-突触核蛋白聚合物具有特异和选择性的荧光增强性质。通过本发明提供的香豆素类化合物对α-突触核蛋白聚合物选择性的荧光增强，通过直接读取检测信号，就能够有效区分α-突触核蛋白聚合物和其他具有β-折叠结构的蛋白聚合物和蛋白单体。
表2实施例2～5中香豆素类化合物的蛋白结合荧光增强倍数
Figure BDA0002850871040000252
测试例3
精密称取适量实施例2中香豆素类化合物(NBC-2)，溶于DMSO，并用PBS缓冲液稀释至1μmol·L-1，加入含有不同蛋白聚合物或单体的脑匀浆，在室温条件下放置30min，之后转移至96孔板中，应用酶标仪进行荧光检测，结果见图1，图1中从左到右依次为化合物NBC-2、α-突触核蛋白聚合物+化合物NBC-2、Aβ聚合物+化合物NBC-2、tau聚合物+化合物NBC-2、Aβ单体+化合物NBC-2、α-突触核蛋白单体+化合物NBC-2、tau单体+化合物NBC-2。由图1可知，本发明提供的香豆素类化合物对脑匀浆中α-突触核蛋白聚合物具有特异的荧光增强性质。通过本发明提供的香豆素类化合物对生物样本中α-突触核蛋白聚合物选择性的荧光增强，通过直接读取检测信号，就能够有效区分α-突触核蛋白聚合物和其他具有β-折叠结构的蛋白聚合物和蛋白单体。
测试例4
精密称取适量实施例2中香豆素类化合物(NBC-2)，溶于DMSO，加入DMEM/F-12培养基稀释至化合物NBC-2的浓度为5μM，将所得溶液加入含SHSY-5Y人神经母细胞瘤细胞的培养皿中，将细胞板置于37℃、5％CO2培养箱中孵育1h后，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，置于激光共聚焦显微镜上观察，结果如图2所示，图2中从左到右依次为荧光成像、明场成像以及荧光-明场叠加成像。由图2可知，本发明提供的香豆素类化合物可透过细胞膜并荧光标记细胞内α-突触核蛋白聚合物。
测试例5
将实施例2中香豆素类化合物(NBC-2)与DMSO和PBS缓冲液混合，所得混合液中化合物NBC-2的含量为1.0mg/kg，DMSO和PBS缓冲液的体积比为1：9；将所述混合液经尾静脉注射入正常小鼠体内，注射后30min心脏灌流PBS缓冲液10mL，断头取脑；脑组织在小动物活体成像仪中观察，结果如图3所示。由图3可知，本发明提供的香豆素类化合物能够有效地穿过血脑屏障，且具有良好的脑摄取量。
测试例6
将实施例2中香豆素类化合物(NBC-2)与DMSO和PBS缓冲液混合，所得混合液中化合物NBC-2的含量为1.0mg/kg，DMSO和PBS缓冲液的体积比为1：9；将所述混合液经尾静脉注射入PD转基因老龄(12月龄)小鼠和正常老龄(12月龄)小鼠体内，注射后60min心脏灌流PBS缓冲液10mL，断头取脑；脑组织在小动物活体成像仪中观察，结果如图4所示。由图4可知，与正常老龄小鼠脑相比，PD转基因老龄小鼠脑内显示强荧光信号，说明本发明提供的香豆素类化合物能够有效地穿过血脑屏障与脑内α-突触核蛋白聚合物结合，并释放透过特异检测信号，从而有效地成像PD转基因老龄小鼠脑内α-突触核蛋白聚合物。
测试例7
将实施例9中香豆素类化合物(NBC-9)溶于PBS溶液中，所得混合液中化合物NBC-9的含量为5μmol/L；用移液枪滴加100～500μL所述混合液覆盖PD转基因老龄(12月龄)小鼠脑切片(15μm)，在室温条件下培育60min；之后依次按照40％乙醇水溶液(1min)、40％乙醇水溶液(1min)、纯水(30s)的顺序对切片进行漂洗，风干后覆盖透明薄膜，放置于磷屏表面，避光保存，应用磷屏自显影仪扫描观察，结果如图5所示。由图5可知，本发明提供的放射标记物能够清晰有效地标记脑切片α-突触核蛋白聚合物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种香豆素类化合物，具有式I所示结构：
Figure FDA0002850871030000011
式I中，n为0、1、2或3，
X为
Figure FDA0002850871030000012
Y为-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2、-N(CH2CH2CH3)2、-19F、-OCH2CH2 19F、
Figure FDA0002850871030000013
-OCH2CH2 18F、
Figure FDA0002850871030000014
-127I、-125I、-123I或-131I；
其中，当n为0且X为
Figure FDA0002850871030000015
时，Y不为-N(CH3)2。
2.根据权利要求1所述的香豆素类化合物，其特征在于，当n为1、2或3，且X为
Figure FDA0002850871030000016
时，Y为-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2或-N(CH2CH2CH3)2。
3.根据权利要求1所述的香豆素类化合物，其特征在于，当n为0或1，且X为
Figure FDA0002850871030000017
时，Y为-OCH2CH2 19F、
Figure FDA0002850871030000018
Figure FDA0002850871030000019
-OCH2CH2 18F、
Figure FDA00028508710300000110
Figure FDA00028508710300000111
-127I、-125I、-123I或-131I。
4.权利要求1～3任一项所述香豆素类化合物的制备方法，
(a)当Y为-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2、-N(CH2CH2CH3)2、-19F、-OCH2CH2 19F、
Figure FDA0002850871030000021
或-127I时，所述制备方法包括以下步骤：
将6-氨基香豆素、第一醛类化合物和有机溶剂混合，进行第一席夫碱反应，得到具有式I所示结构的香豆素类化合物；
所述第一醛类化合物具有式a所示结构：
Figure FDA0002850871030000022
(b)当Y为-OCH2CH2 18F、
Figure FDA0002850871030000023
时，所述制备方法包括以下步骤：
将6-氨基香豆素、第二醛类化合物和有机溶剂混合，进行第二席夫碱反应，得到第一中间体；所述第二醛类化合物具有式b所示结构：
Figure FDA0002850871030000024
将所述第一中间体、氯代物、有机溶剂和碳酸钾混合，进行第一取代反应，得到第二中间体；所述氯代物为ClCH2CH2OH、ClCH2CH2-O-CH2CH2OH或ClCH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2OH；
将所述第二中间体、4-甲苯磺酰氯和有机溶剂混合，进行第二取代反应，得到第三中间体；
将Kryptofix 222/K2CO3混合液和[18F]KF溶液混合，去除溶剂后将所得剩余物与第三中间体、有机溶剂混合，在无水条件下进行标记反应，得到具有式I所示结构的香豆素类化合物；所述Kryptofix 222/K2CO3混合液由4,7,13,16,21,24-六氧-1,10-二氮双环[8.8.8]二十六烷、K2CO3和有机溶剂混合得到；
(c)当Y为-125I、-123I或-131I时，所述制备方法包括以下步骤：
将6-氨基香豆素、第三醛类化合物和有机溶剂混合，进行第三席夫碱反应，得到第四中间体；所述第三醛类化合物具有式c所示结构：
Figure FDA0002850871030000031
将所述第四中间体、六正丁基二锡、四三苯基膦钯和有机溶剂混合后进行反应，得到第五中间体；
将所述第五中间体、过氧化氢溶液、碘标记物溶液、盐酸和有机溶剂混合，依次进行第一阶段反应和第二阶段反应，得到具有式I所示结构的香豆素类化合物；所述碘标记物溶液中含有125I-、123I-或131I-。
5.权利要求1所述香豆素类化合物在制备检测α-突触核蛋白聚合物的诊断试剂中的应用。
6.权利要求2所述香豆素类化合物在制备荧光检测α-突触核蛋白聚合物的诊断试剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述荧光检测α-突触核蛋白聚合物的诊断试剂包括显像α-突触核蛋白聚合物的荧光显影剂。
8.权利要求3所述香豆素类化合物在制备核医学显像α-突触核蛋白聚合物的放射诊断药物中的应用，其中核医学显像模式为正电子发射断层扫描成像或单光子发射断层扫描成像。
9.一种药物组合物，包括权利要求1～3任一项所述香豆素类化合物和药学上可接受的载体。
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