TWI649091B

TWI649091B - 用以偵測類澱粉沈積蛋白之探針及方法

Info

Publication number: TWI649091B
Application number: TW106120656A
Authority: TW
Inventors: 黃人則; 李賢明; 何瑞玉
Original assignee: 中央研究院
Priority date: 2016-07-22
Filing date: 2017-06-21
Publication date: 2019-02-01
Also published as: US20180021460A1; TW201803585A

Abstract

本揭示內容是關於新穎之光控探針及用以誘發及偵測一活體之細胞、組織或器官中聚集形式之類澱粉沉積蛋白的方法。偵測結果可用以預斷該個體是否罹患神經退化性疾病及/或糖尿病。

Description

用以偵測類澱粉沉積蛋白之探針及方法

本揭示內容是關於用以評估聚集形式之類澱粉蛋白(amyloid)多肽的方法及套組。更具體來說，本揭示內容是關於經光解反應(photolysis)後，可快速誘發活體外或活體內之類澱粉蛋白沉積的光控探針。本揭示內容亦有關於利用該光控探針來偵測一個體之細胞、組織及/或器官中是否包含類澱粉沉積蛋白(amyloidogenic protein)的方法，以及用以預測該個體是否罹患與類澱粉蛋白沉積相關之疾病及/或病症的方法。

已知在多種神經退化性疾病的病患體內皆可觀察到因可溶性蛋白的錯誤折疊及堆積，所形成的不可溶的蛋白膠聚集體。這些蛋白包含阿茲海默症(Alzheimer disease, AD)之類澱粉蛋白-β胜肽(amyloid-β peptide, Aβ)、帕金森氏症(Parkinson disease, PD)之α-突觸核蛋白(α-synuclein)、亨丁頓氏舞蹈病(Huntington disease, HD)之突變亨丁頓蛋白(mutant huntingtin)，以及肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)之TAR-DNA結合蛋白43 (TAR-DNA binding protein, TDP-43)。

活體外及活體內實驗常利用具聚集傾向的蛋白/胜肽來監測類澱粉蛋白的形成過程及確認由類澱粉蛋白造成的細胞毒性。然而，該些蛋白/胜肽往往會自發性地聚合，阻礙其中分子機制的檢測。為解決此問題，相關領域已研發不同的化學及合成策略，藉以增加該些蛋白/胜肽的可溶性，及暫時性地抑制聚集反應。一般活體外及活體內實驗是以誘發子(例如酵素切割、改變pH值、干擾氧化還原電位及光照射等)來引發類澱粉沉積反應(amyloidogenesis)。然而，基於不易控制生物環境中酵素切割、生理pH值及/或氧化還原潛力，該些已知方法皆無法用以監測活細胞中的類澱粉沉積反應。

有鑑於此，相關領域亟需一種可用以探測活細胞中類澱粉沉積反應的探針及方法。

本揭示內容提供了一種光控探針，經光解反應後可快速誘發活體外及活體內的類澱粉蛋白沉積。據此，該光控探針可用以評估聚集形式之類澱粉蛋白多肽，偵測一個體之細胞、組織及/或器官中是否包含類澱粉沉積蛋白，及/或預斷該個體是否罹患與聚集性類澱粉沉積蛋白(例如類澱粉蛋白沉積)相關之疾病及/或病症。

因此，本揭示內容的第一態樣是關於一種光控探針，其結構至少包含一細胞穿透部(cell penetrating moiety)、一類澱粉沉積部(amyloidogenic moiety)及一光裂解部(photocleavable moiety)；其中該光裂解部是介於該細胞穿透部及該類澱粉沉積部之間，並與二者連接；其中該光裂解部可經一波長介於250到1,000奈米之間的光照射而裂解。

依據某些實施方式，該細胞穿透部包含至少2個帶電的胺基酸殘基，其係選自由精胺酸、離胺酸、組胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸及其組合所組成的群組。

在一較佳實施方式中，該細胞穿透部是由8個精胺酸殘基所組成。

依據其他實施方式，該細胞穿透部是一細胞穿透胜肽(cell penetrating peptide, CPP)，其係選自由Tat胜肽、穿透素(penetratin)、pVEC、運輸蛋白(transportan)、MPG、Rep-1、MAP及R6W3所組成的群組。

依據某些實施方式，該類澱粉沉積部是一源自類澱粉蛋白-β (amyloid-β, Aβ)、類澱粉胰島蛋白(amyloid islet protein)、α-突觸核蛋白(α-synuclein)、突變亨丁頓蛋白(mutant huntingtin)、染色體9之開放閱讀框架72 (C9orf72)雙肽重複蛋白(dipeptide repeat protein, DRP)或TAR-DNA結合蛋白43 (TAR-DNA binding protein 43, TDP-43)的類澱粉沉積胜肽。

在一較佳實施方式中，該類澱粉沉積胜肽是源自TDP-43，且具有與序列編號：2 (MGGGMNFGAFSINPAM)至少90%相似性的序列。

在另一較佳實施方式中，該類澱粉沉積胜肽是源自C9orf72 DRP，且可以是一聚(甘胺酸-丙胺酸)(poly-GA)片段、一聚(甘胺酸-脯胺酸)(poly-GP)片段或一聚(甘胺酸-精胺酸)(poly-GR)片段。

在另一實施方式中，該類澱粉沉積胜肽是源自突變亨丁頓蛋白，且可以是一聚麩醯胺酸(PolyQ)片段。

在非必要性之實施方式中，該類澱粉沉積胜肽更可與聚乙烯亞胺(polyethylenimine, PEI)共軛鍵結。

依據某些實施方式，該光裂解部包含一官能基，其係選自由芳羰基(arylcabonyl)、硝芳基(nitroaryl)、香豆素-4-基-甲基(coumarin-4-yl-methyl)、芳甲基(arylmethyl)、一包含金屬之基團(a metal-containing group)、芳磺醯基(arylsulfonyl)及一與矽相關之基團(silicon based group)所組成的群組。

在某些實施方式中，該包含金屬之基團是[M(bpy)_n ]²⁺ ，其中M是Fe²⁺ 、Ru²⁺ 或Co²⁺ ；n是2或3；且bpy是2,2’-聯砒啶(2,2’-bipyridine)。

在其他實施方式中，該光裂解部具有孟加拉玫紅(rose Bengal)、核黃素(riboflavin)或鈷胺素(cobalamin)的結構。

在一較佳實施方式中，該光裂解部包含該硝芳基，且經波長為365奈米之光照射後會裂解。

依據非必要性之實施方式，該光控探針可更包含一螢光團連接部(fluorophore linking moiety)，其係位於該類澱粉沉積部的末端，藉此螢光團連接部而使一螢光團能連接至該類澱粉沉積部。在某些實施方式中，該螢光團連接部是半胱胺酸殘基。

例示性之可連接至光控探針的螢光團包含，但不限於，胺基香豆素(aminocoumarin)、異藻藍蛋白(allophycocyanin, APC)、Alexa 488、Alexa 568、CY3、CY5、CY7、APC-CY7共軛物、螢光素(fluorescein)、FluorX、羥香豆素( hydroxycoumarin)、螢光黃(lucifer yellow)、甲氧香豆素(methoxycoumarin)、[2-(4-硝-2,1,3-苯並二唑-7-基) 胺乙基]三甲銨([2-(4-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-7-yl)aminoethyl]trimethylammonium, NBD-TMA)、藻紅素(phycoerythrin, PE)、PE-CY5共軛物、PE-CY7共軛物、羅丹明(rhodamine)、四甲基羅丹明異硫氰酸酯(tetramethylrhodamine isothiocyanate, TRITC)-胺類及德州紅(Texas Red)胺類。

本揭示內容的第二態樣提供了一種用以偵測一個體之細胞、組織及/或器官中是否包含類澱粉沉積蛋白的套組。該套組包含一第一容器，其係包含本發明光控探針，其中該光控探針在結構上包含一螢光團連接部；以及一包含一螢光團之第二容器；其中一旦將第一容器之光控探針與第二容器之螢光團混合後，該螢光團會連接至該光控探針的螢光團連接部。

本揭示內容的第三態樣是關於一種用以偵測一個體之組織或器官中是否包含一類澱粉沉積蛋白的方法。該方法包含以下步驟： (a)以本揭示內容之套組來處理該個體之組織或器官； (b)以一波長介於250到1,000奈米之間的光照射步驟(a)之經套組處理的組織或器官；以及 (c)對步驟(b)之經照射的組織或器官進行影像分析；其中，若於步驟(c)之影像分析過程中，在該經照射的組織或器官中觀察到類澱粉纖維(amyloid fibril)，則該個體之組織或器官包含該類澱粉沉積蛋白。

依據某些實施方式，在步驟(b)中，是以波長為365奈米的光照射該組織、器官或動物。

依據某些實施方式，該類澱粉沉積蛋白可以是類澱粉蛋白-β、類澱粉胰島蛋白、α-突觸核蛋白、突變亨丁頓蛋白、C9orf72 DRP或TDP-43。

本揭示內容的第四態樣是關於一種預斷一個體是否罹患神經退化性疾病或糖尿病的方法，其係基於該個體之生物檢體來進行預斷。該方法包含以下步驟： (a)以本揭示內容之套組來處理該個體之生物檢體； (b)以一波長介於250到1,000奈米之間的光照射步驟(a)之經套組處理的生物檢體；以及 (c)對步驟(b)之經照射的生物檢體進行影像分析；其中，若於步驟(c)之影像分析過程中，在該經照射的生物檢體中觀察到類澱粉纖維，則該個體罹患神經退化性疾病或糖尿病。

依據某些實施方式，該生物檢體可以是腦脊髓液、血液、血漿或口腔黏膜。在一較佳實施方式中，該生物檢體是口腔黏膜。

依據某些實施方式，在步驟(b)中，是以波長為365奈米的光照射該生物檢體。

依據某些實施方式，該神經退化性疾病是騷癢症(scrapie)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)、帕金森氏症(Parkinson disease, PD)、阿茲海默症(Alzheimer disease, AD)、路易體病(Lewy body disease)、亨丁頓氏舞蹈病(Huntington disease, HD)、第三型小腦脊髓運動失調症候群(Machado-Joseph disease)、狀紅核蒼白球肌萎縮症(dentatorubral pallidoluysian atrophy, DRPLA)、脊髓及延髓肌肉萎縮症(spinal and bulbar muscular atrophy)、脊髓小腦性失調症(spinocerebellar ataxia)或X染色體脆折症運動失調症候群(fragile X-associated tremor/ataxia syndrome)。

依據某些實施方式，該糖尿病是第II型糖尿病。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

1. 定義

除非另有所指，否則「多肽」(polypeptide)一詞在本揭示內容是指以肽鍵連接之胺基酸殘基的聚合物，包含天然產生或活體外合成的產物。本揭示內容將長度少於50個胺基酸殘基的多肽稱為「胜肽」(peptides)。「多肽」(polypeptide)一詞在本揭示內容是指天然產生的多肽、先驅物或前蛋白(pro-protein)。多肽可經成熟化反應或轉譯後修飾過程，其包含，但不限於，醣化(glycosylation)、蛋白切割(proteolytic cleavage)、脂質化(lipidization)、訊息肽切割(signal peptide cleavage)、前胜肽切割(pro-peptide cleavage)及磷酸化(phosphorylation)等。「蛋白」(protein)一詞在本揭示內容是指包含一或多條多肽鏈的大多肽分子及巨分子。

本發明及本說明書亦包含蛋白／胜肽中胺基酸序列的微小變異，使胺基酸序列的變異維持至少70%序列相似性，例如至少70%、71%、72%、73%、75%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%序列相似性。可對本揭示內容之胜肽或多肽進行專一性修飾，藉以改變與胜肽之生理活性不相關的特徵。舉例來說，改變及/或刪除某些胺基酸而不影響胜肽的生理活性(即其治療發炎相關疾病及/或病症之能力)。特別是，保留性胺基酸取代亦包含於其中。保留性取代為具有相似/相關側鏈之胺基酸間的相互取代。一般來說，由基因編碼的胺基酸可分為四大類：(1) 酸性胺基酸，即天門冬胺酸(aspartate)、麩胺酸(glutamate)；(2)鹼性胺基酸，即離胺酸(lysine)、精胺酸(arginine)、組胺酸(histidine)；(3)非極性胺基酸，即丙胺酸(alanine)、纈胺酸(valine)、白胺酸(leucine)、異白胺酸(isoleucine)、脯胺酸(proline)、苯丙胺酸(phenylalanine)、甲硫胺酸(methionine)、色胺酸(tryptophan)；以及(4)非帶電極性胺基酸，即甘胺酸(glycine)、天門冬醯胺(asparagine)、麩醯胺酸(glutamine)、半胱胺酸(cysteine)、絲胺酸(serine)、蘇胺酸(threonine)、酪胺酸(tyrosine)。較佳的分類是：絲胺酸及蘇胺酸係屬脂肪羥基（aliphatic-hydroxy）類；天冬醯胺酸及麩醯胺係屬含醯胺（amide-containing）類；丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸係屬脂肪類；而苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸則屬芳香（aromatic）類。舉例來說，當可想見若以異白胺酸或纈胺酸取代白胺酸、以麩胺酸取代天門冬胺酸、以絲胺酸取代蘇胺酸，或是以一結構相似的胺基酸取代另一胺基酸時，並不會造成分子結合或蛋白特性的顯著改變，特別是當該取代位置不是位於骨架區域時，胺基酸之間的取代更不會影響上述特性。可藉由檢測胜肽衍生物之特定活性來了解一胺基酸的改變是否可形成一具功能性的胜肽。可利用相關領域習知技藝人士所熟知的方法來製備蛋白/胜肽的片段或其異構物。蛋白/胜肽的片段或其異構物之較佳的胺基末端及羧基末端是位於功能性區域附近。在一實施例中，是對本發明合成胜肽之一胺基酸殘基(例如，纈胺酸)進行保留性取代(例如，以白胺酸進行取代)。在其他實施例中，是以其他適當的胺基酸殘基保留性取代本發明合成胜肽中的二個胺基酸殘基，舉例來說，可以胺基酸對取代纈胺酸(V)及精胺酸(R)，該胺基酸對包含，但不限於，甲硫胺酸(M)與離胺酸(K)、離胺酸(K)與脯胺酸(P)、色胺酸(W)與異白胺酸(I)、異白胺酸(I)與脯胺酸(P)、天門冬醯胺(N)與纈胺酸(V)，以及麩醯胺酸(G)與離胺酸(K)。

「胺基酸序列相同度百分比」（Percentage (%) amino acid sequence identity）一詞在本說明書是指在將一候選胜肽序列（candidate sequence）與一特定胜肽序列進行比對後，二序列間胺基酸殘基的相同百分比；在比對時，是將二序列排比，且若有必要，加入適當的間隙（gap），藉以達到最大的相同度百分比，且不將保留性置換（conservative substitution）視為序列相同的一部份。可利用各式相關領域習知技藝人士所熟知的方法來進行比對，並決定二序列的相同百分比；舉例來說，可以利用諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign （DNASTAR）等電腦軟體來進行比對分析。相關領域習知技藝人士可使用適當的參數（包含各式演算法）來測量比對，以於胺基酸全長序列中產生最大的比對序列。在本說明書中，二胺基酸序列間的序列比對是利用國家生物技術訊息中心（Nation Center for Biotechnology Information, NCBI）線上提供的Blastp （蛋白－蛋白BLAST）電腦軟體來進行分析。具體來說，一特定胺基酸序列A與一特定胺基酸序列B之間的胺基酸序列相同百分比（亦可表述為一特定胺基酸序列A與一特定胺基酸序列B具有某百分比的胺基酸序列相同度）是利用下列公式來計算：其中X是經比對程式BLAST評比後，A與B序列間相互吻合的胺基酸殘基數量，Y則是A或B序列中（取較短者）胺基酸殘基的總數量。

在本揭示內容中，是由胜肽的N端來編號胜肽中特定胺基酸的位置。除非本揭示內容指出特定的異構物，否則在未標示胺基酸為D-或L-胺基酸時，該胺基酸可以是L-胺基酸，或可以是D-或L-胺基酸。

除非另有所指，否則「類澱粉沉積胜肽」(amyloidogenic peptide)一詞是指一長度約為10-100胺基酸之胜肽，其可誘發特定蛋白的折疊、造成蛋白聚集及形成類澱粉蛋白沉積，其中類澱粉蛋白沉積為神經退化性疾病及糖尿病等不同疾病發生時的重要關鍵步驟。

「類澱粉蛋白沉積」(amyloid deposit)、「類澱粉纖維」(amyloid fibril)或「類澱粉蛋白」(amyloid)在本揭示內容為可互換的詞彙，是指具有特定生理特性的不溶性蛋白膠基質，該生理特性與蛋白組合物或基質中其他分子無關。可藉由無定形結構、嗜伊紅染色或硫代黃素螢光的改變來確認類澱粉纖維。將類澱粉纖維的蛋白或胜肽成分稱為「類澱粉沉積蛋白」(amyloidogenic protein)或「類澱粉沉積多肽」(amyloidogenic polypeptide)，其包含，但不限於，類澱粉蛋白-β、類澱粉胰島蛋白、α-突觸核蛋白、突變亨丁頓蛋白、C9orf72 DRP及TDP-43等。

除非另有所指，否則「病患」(patient)及「個體」(subject)在本揭示內容為可互換的詞彙，且可以是一動物或一人類個體。

在本揭示內容中，「組織」(tissue)一詞是指特定類型之細胞的聚集物，可形成一動物的結構性材料，例如皮膚或黏膜。「器官」(organ)一詞在本揭示內容是指一群組織，其中部分組織可與其他組織不同，可將該些組織視為單一結構單元，其相互作用可產生一較為複雜的功能。因此，「器官」(organ)一詞在本揭示內容是指血管化器官，例如大腦、心臟、肝臟及腎臟等。一例示性及較佳的器官為大腦。

除非另有所指，否則「治療」(treat、treating或treatment)一詞是指一動作，當一個體罹患特定疾病或病狀時，該動作可減少該疾病或病狀的嚴重程度、一或多種病徵，或是延緩或降低該疾病或病狀的進程。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。

2. 本發明之光控探針

類澱粉多肽的聚集會導致不同的類澱粉蛋白疾病。即使相關領域對確認錯誤折疊之疾病蛋白方面已有重大進展，關於活細胞內類澱粉蛋白沉積的形成仍有待進一步釐清。據此，本發明之發明人設計並合成了一種光控探針，當穿透細胞膜並以一適當波長照射後可釋放出類澱粉沉積胜肽，其可於細胞內誘導異常蛋白聚集體的形成；較佳地，該光控探針是與一螢光團連接，藉以監測活細胞內類澱粉沉積反應。據此，本發明探針可作為一種工具，據以決定一個體之細胞、組織及/或器官中是否包含一類澱粉沉積蛋白；以及基於組織檢體的分析結果來預斷該個體之細胞、組織或器官是否罹患一神經退化性疾病或糖尿病。

因此，本揭示內容的第一態樣是關於一種光控探針，其結構至少包含一細胞穿透部、一類澱粉沉積部，及一光裂解部；其中該光裂解部是介於該細胞穿透部及該類澱粉沉積部之間，並與二者連接；其中該光裂解部經一波長介於250到1,000奈米之間的光照射後會裂解。

依據本揭示內容之實施方式，該細胞穿透部可以是一包含至少2個帶電胺基酸殘基的胜肽，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30個帶電胺基酸殘基。該些帶電胺基酸殘基可以2到16個連續延伸之殘基的形式存在；或者是，該些帶電胺基酸殘基延伸具有非帶電胺基酸殘基分散於其中。例示性之帶電胺基酸殘基包含，但不限於，精胺酸(R)、離胺酸(K)、組胺酸(H)、天門冬胺酸(D)、麩胺酸(Q)及組合。在一較佳實施例中，該細胞穿透部是由8個精胺酸殘基所組成(序列編號：1，RRRRRRRR)。在另一實施例中，該細胞穿透部是本發明所屬領域具有通常知識者所熟知的細胞穿透胜肽(cell penetrating peptide, CPP)。該CPP可以選自由Tat胜肽(序列編號：3，GRKKRRQRRRPPQ) 、穿透素(序列編號：4，RQIKIWFQNRRMKWKK)、pVEC (序列編號：5，LLIILRRRIRKQAHAHSK)、運輸蛋白(序列編號：6，GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL)、MPG (序列編號：7，GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV)、Rep-1 (序列編號：8，KETWWETWWTEWSQPKKKRKV)、MAP (序列編號：9，KLALKLALKALKAALKLA)及R₆ W₃ (序列編號：10，RRWWRRWWRR)所組成的群組。

依據本揭示內容之實施方式，該類澱粉沉積部可以是一源自類澱粉蛋白-β、類澱粉胰島蛋白、α-突觸核蛋白、突變亨丁頓蛋白、C9orf72 DRP或TDP-43的片段。在某些實施方式中，該類澱粉沉積部是一源自TDP-43的類澱粉沉積胜肽，且具有與序列編號：2 (MGGGMNFGAFSINPAM)至少70%相似性的序列，例如與序列編號：2具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列相似性；較佳地，該源自TDP-43的類澱粉沉積胜肽具有與序列編號：2 (MGGGMNFGAFSINPAM)至少80%相似性的胺基酸序列，例如與序列編號：2具有80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列相似性；更佳地，該源自TDP-43的類澱粉沉積胜肽具有與序列編號：2 (MGGGMNFGAFSINPAM)至少90%相似性的胺基酸序列，例如與序列編號：2具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列相似性。在一較佳實施方式中，該類澱粉沉積部具有序列編號：2的胺基酸序列。在其他實施方式中，該類澱粉沉積部是一源自C9orf72 DRP的類澱粉沉積胜肽，且可以是一聚(甘胺酸-丙胺酸)片段、一聚(甘胺酸-脯胺酸)片段、或一聚(甘胺酸-精胺酸)片段。在再另一實施方式中，該類澱粉沉積部是一源自突變亨丁頓蛋白的類澱粉沉積胜肽。較佳地，該源自突變亨丁頓蛋白的類澱粉沉積胜肽是一聚麩醯胺酸片段。依據非必要之實施方式，上述任一種類澱粉沉積胜肽可更與聚乙烯亞胺共軛鍵結。

依據本揭示內容之實施方式，光控探針的細胞穿透部及類澱粉沉積部分別與一光裂解部連接，其經一波長介於250到1,000奈米的光照射後會裂解，例如250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、505、510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995及1,000奈米。在某些實施方式中，以一波長介於250到400奈米的光照射後，光裂解部會裂解，例如250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395及400奈米。在其他實施方式中，以一波長介於700到1,000奈米的光照射後，光裂解部會裂解，例如700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995及1,000奈米。依據本揭示內容實施方式，光裂解部包含一官能基，其係選自由芳羰基、硝芳基、香豆素-4-基-甲基、芳甲基、一包含金屬之基團、芳磺醯基及一與矽相關之基團所組成的群組。在某些實施方式中，該包含金屬之基團是[M(bpy)_n ]²⁺ ，其中M是Fe²⁺ 、Ru²⁺ 或Co²⁺ ；n是2或3；且bpy是2,2’-聯砒啶。在其他實施方式中，光裂解部具有孟加拉玫紅、核黃素或鈷胺素的結構。在一較佳實施方式中，光裂解部包含硝芳基，且以波長為365奈米之光照射後會裂解。

非必要性地，本發明光控探針更包含一螢光團連接部，其係位於類澱粉沉積部的末端且與其連接。該螢光團連接部可為一胺基酸殘基，其具有適合與一螢光團結合的反應側鏈，藉以於活細胞內原位觀察由本發明探針之類澱粉沉積部誘發產生的類澱粉沉積反應。在一較佳實施例中，該螢光團連接部為半胱胺酸殘基，其中半胱胺酸殘基的硫氫基(-SH)會藉由硫氫基-順丁烯二醯亞胺反應(sulfhydryl-maleimide reaction)與一螢光團(例如一螢光染劑)反應，藉以與該螢光團共軛鍵結。例示性之適用於本發明的螢光團包含，但不限於，胺基香豆素、異藻藍蛋白、Alexa 488、Alexa 568、CY3、CY5、CY7、APC-CY7共軛物、螢光素、FluorX、羥香豆素、螢光黃、甲氧香豆素、NBD-TMA、PE、PE-CY5共軛物、PE-CY7共軛物、羅丹明、TRITC-胺類及Texas Red胺類。依據較佳的實施方式，Alexa 560是與位於類澱粉沉積胜肽末端的半胱胺酸殘基連接。

本揭示內容亦包含一用以偵測一生物檢體(例如腦脊髓液、血液、血漿或口腔黏膜)是否包含類澱粉沉積蛋白的套組。該套組包含第一容器，其係包含本發明光控探針，特別是具有螢光團連接部的探針；以及一第二容器，其係包含一螢光團；其中一旦將第一容器之光控探針與第二容器之螢光團混合後，該螢光團會連接至該光控探針的螢光團連接部，方便使用者觀察原位類澱粉沉積反應。該套組可更包含一隨附於第一及第二容器的使用說明，藉以告知使用者如何利用本發明套組來偵測生物檢體中類澱粉沉積蛋白的存在與否。該使用說明可以是一手冊、磁帶CD、VCD或DVD。該套組可更包含一負對照組，其指出健康個體體內類澱粉沉積蛋白的正常含量。

3. 使用方法

本發明包含一種用以偵測一個體之組織或器官中是否包含類澱粉沉積蛋白的方法。該方法包含以下步驟， (a)以本揭示內容之套組來處理該個體之組織或器官； (b)以一波長高於250奈米的光照射步驟(a)之經套組處理的組織或器官；以及 (c)對步驟(b)之經照射的組織或器官進行影像分析；其中，若於步驟(c)之影像分析過程中，在該經照射的組織或器官中觀察到類澱粉纖維，則該個體之組織或器官包含該類澱粉沉積蛋白。

依據某些實施方式，在步驟(b)中，是以波長為365奈米的光照射該經套組處理的組織或器官。

依據某些實施方式，類澱粉沉積蛋白可以是類澱粉蛋白-β、類澱粉胰島蛋白、α-突觸核蛋白、突變亨丁頓蛋白、C9orf72 DRP或TDP-43。

本揭示內容亦提供了一種用以預斷一個體是否罹患神經退化性疾病或糖尿病的方法。該方法是對該個體之生物檢體(例如，腦脊髓液、血液、血漿或口腔黏膜)來進行預斷。該方法包含以下步驟： (a)以本揭示內容之套組來處理該個體之生物檢體； (b)以一波長介於250到1,000奈米之間的光來照射步驟(a)之經套組處理的生物檢體；以及 (c)對步驟(b)之經照射的生物檢體進行影像分析；其中，若於步驟(c)之影像分析過程中，在該經照射的生物檢體中觀察到類澱粉纖維，則該個體罹患神經退化性疾病或糖尿病。

依據某些實施方式，在步驟(b)中，是以波長為365奈米的光來照射該經該生物檢體。

依據某些實施方式，神經退化性疾病是神經退化性疾病是騷癢症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、帕金森氏症、阿茲海默症、路易體病、亨丁頓氏舞蹈病、第三型小腦脊髓運動失調症候群、狀紅核蒼白球肌萎縮症、脊髓及延髓肌肉萎縮症、脊髓小腦性失調症或X染色體脆折症運動失調症候群。在較佳的實施方式中，本發明方法可用以預斷一個體是否罹患或疑似罹患AD。

依據某些實施方式，糖尿病是第II型糖尿病。在某些實施方式中，本發明方法可用以預斷一個體是否罹患或疑似罹患第II型糖尿病。

下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。實施例

材料及方法

合成多肽

由Advanced ChemTech購買胺基酸及4-{4-[1-(9-芴甲氧基羰基胺)乙基]-2-甲氧基-5-硝基苯}正丁酸(4-{4-[1-(9-fluorenylmethyloxycarbonylamino)ethyl]-2-methoxy-5-nitrophenoxy}nbut-anoic acid，一種Fmoc-光不穩定連接子)。利用胜肽合成器(PS3, Rainin Instrument, USA)，以標準FMOC聚醯胺化學於Rink胺AM樹脂合成胜肽。由樹脂分離後，利用配有C18逆相色譜柱(Shiseido, Japan)的高效率液相層析儀(high-performance liquid chromatography (HPLC)，1260 Infinity LC system, Agilent, USA)來純化粗製多肽。混合緩衝液A (5 % 乙腈/0.1 % TFA/94.9 %水)及緩衝液B (0.1 % TFA/99.9 % 乙腈)來進行梯度分離。將流速設定每分鐘3毫升。以 RP-HPLC及分析管柱(C18)來確認多肽的純度，並以基質輔助激光解吸/電離(matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)，Applied Biosystem, USA)質譜儀確認分析。

穿透式電子顯微鏡

以PBS緩衝液(14 mM KCl，10 mM磷酸鈉，pH = 7.5)製備JHR1及JHR2 (5或50 μM)，投予或不投予UV照射(365奈米UV LED，每平方公分32 mW，60秒)後，於37°C培養24小時。利用發光充電之300網目及經1 %醋酸鈾醯(uranyl acetate)染色之具有聚乙烯醇縮甲醛(formvar)及碳塗佈的格柵來處理胜肽溶液(5微升)。乾燥至隔日後，以JEM-2011電子顯微鏡(JEOL, Japan)分析所有檢體。

動態光散射 (dynamic light scattering, DLS)

以Stokes–Einstein公式依據顆粒的布朗運動來計算粒徑大小。該方法可得到一水合直徑(hydrodynamic diameter)，其為一球體經計算後的顆粒直徑，在溶質中與實際顆粒具有相同的測量運動。以H₂ O且未投予UV照射的情況下製備JHR1 (5 μM)。利用zetasizer (Malvern Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, Worcestershire, UK)進行動態光散射分析，藉以測量JHR1微泡的體積。藉由He-Ne雷射(633奈米)於25⁰ C以175⁰ 的散射角進行分析。對各檢體重複三次測量分析。

低溫冷凍電子顯微鏡

在進行冷凍-EM時，是以H₂ O、在未以UV照射的情況下製備JHR1 (5 μM)。將4微升之檢體置於發光充電之200-網目Quantifoil中空碳格柵(1.2 x 1.3微米之孔徑大小，Quantifoil Micro Tools)上。利用Vitrobot (FEI)使格柵於液態乙烷中快速冷凍。

檢測圓偏光二色性

依據上述方法以PBS製備胜肽溶液(50 μM)，以365奈米 UV LED照明點固化硬碟(UVATA，China，每平方公分32 mW，60秒)進行UV照射。利用1毫米石英比色管及J-815 CD分光光度計(JASCO, Japan)來測量胜肽溶液的CD光譜。以每分鐘100奈米的掃描速度收集195到260奈米的數據。平均各檢體掃描三次的結果。

UV- 可見光分光光度測定法

依據上述方法以PBS製備胜肽溶液(50 μM)，利用1公分石英比色管以DU800分光光度計(Beckman, America)記錄數據。收集600奈米時的混濁度。

硫代黃素 T 結合試驗

新鮮配製ThT操作溶液(200 μM ThT於PBS)，以 0.22微米之Millipore過濾器予以過濾。取40微升之經UV照射處理(365奈米UV LED，UVATA，China，每平方公分32 mW，60秒)或未照射處理的胜肽溶液(200 μM JHR1於PBS緩衝液)與40微升之ThT操作溶液混合，於室溫反應5分鐘。利用F-4500螢光分光光度計(HITACHI, Japan)記錄以442奈米激發後，3毫米之路徑方形螢光石英比色管於480奈米的螢光發散光譜。

合成以 Alexa Fluor 568 標記之胜肽 (JHR2)

將2微升之溶於PBS緩衝液的參(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP))溶液(0.5 M)加入JHR1 (100 μM於PBS緩衝液中)，於室溫反應30分鐘以移除Cys側鏈(Stbu)保護基團。之後，加入1等分之溶於DMSO的Alexa Fluor 568^® 標記，反應90分鐘，藉以標記螢光團。

活體外類澱粉沉積反應的曠時 TIFR 影像

利用Nikon TiE顯微鏡收集曠時TIRF及螢光影像，其中是以超高壓130 W汞燈照射檢體產生光解反應，而以405奈米的雷射光源照射檢體以激發ThT。在進行ThT染色時，將10 mM HCl及10 %六氟異丙醇(hexafluoroisopropanol (HFIP)，體積/體積)與同體積之ThT (200 μM於PBS緩衝液中)溶液均勻混合，據以製備JHR1 (6 μM)。將200微升之產物固定於35毫米玻璃底盤(Ibidi, Germany)上，再予以封蓋，避免液體蒸散。光解反應(以汞燈照射，335-379奈米，每平方公分8.24 mW，5分鐘)後，利用配有405奈米雷射之曠時TIRF顯微鏡，以5分鐘的間隔時間連續記錄6小時的影像。以ECFP方塊(Chroma)過濾ThT訊號，並利用Andor iXon3 888背照光式高靈敏度EMCCD相機收集ThT訊號。藉由Nikon NIS元件軟體決定纖維的長度，以對應的生長時間除以長度來計算其生長速度。

細胞維持、胜肽處理及光解反應

將小鼠神經母細胞瘤N2A細胞(取自中研究Dr. Yijuang Chern)培養於包含 2 mM 麩醯胺酸、10%經熱去活化之胎牛血清及每毫升100 U之青黴素-鏈黴素(Invitrogen)的DMEM細胞培養(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)中，並置於37°C之包含5% CO₂ 的潮溼環境中培養。在投予胜肽前，以5-胺咪唑-4-羧醯胺-1-β-D-核呋喃糖苷(5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D-ribofuranoside (AICAR))處理細胞，藉以誘發TDP-43於細胞內的錯位表現。將冷凍乾燥粉末溶解於細胞培養液中，據以製備JHR2。以包含多肽之培養液養液細胞3小時，洗滌後，以UV照射(具有345-385奈米帶通過濾器的汞燈，平均功率為每平方公分8.24 mW)細胞。

具有 Airy Scan 的共軛焦及超解析度螢光顯微鏡

為表現EGFP-TDP-43，將2x10⁵ 之N2A細胞種植於30毫米的玻片上，並依據使用操作說明，以TurboFect轉染試劑(Thermo Scientific)將1微克之全長TDP-43-EGFP質體轉染至細胞內。以上述步驟投予胜肽及光解反應處理後，培養細胞24小時，再以4%三聚甲醛固定細胞。利用Airy Scan (Zeiss, Germany)以LSM 880及超解析度影像技術拍攝共軛焦影像。分別以抗-TDP-43抗體(Abcam, ab104223)及抗-Ran抗體(Abcam, ab155103)進行免疫染色。

曠時活螢光細胞顯微鏡及 Annexin V 染色

將1微克之全長TDP-43-EGFP於無菌35毫米μ-細胞盤(Ibidi, Martinsried, Germany)轉染至N2A細胞(5x10⁴ )。以配有Tokai-hit恆定潮溼室(37°C, 5% CO₂ )的Nikon TiE倒置顯微鏡拍攝活細胞25小時。利用Hoechst、EGFP、Aleax Fluor 568及Cy5方塊過濾器收集產生的螢光發散。藉由Andor iXon3 888背照光式高靈敏度EMCCD相機拍攝細胞影像。以Nikon NIS元件軟體分析影像。投予胜肽處理24小時後，以PBS洗滌細胞2次，以1倍Annexin V結合緩衝液洗滌細胞1次，再以Annexin V-Cy5 (BioVision, USA)於室溫培養後進行觀察。

顯微注射

以PC-10毛細管拖拉器(Narishige, Japan)拖拉用以顯微注射的玻璃微針頭(1B100-F4, World Precision Instruments, USA)。在進行顯微注射前，將溶於PBS之JHR1胜肽溶液(10 μM)裝載至微針頭中。利用Picospriterzer III顯微注射系統及固定於顯微鏡(IX-71, Olympus, Japan)操作台側的操控桿顯微操作器(Narishige, Japan)將胜肽溶液傳送至 N2A細胞內。顯微注射(注射壓力為80 hPa；注射時間為100毫秒；補償氣壓為20 hPa)後，以2毫升之包含10% FBS的L-15培養液沖洗細胞1小時，使其回復應有狀態。

於活細胞內空間活化多肽

為進行空間解析度分析，將針孔(直徑為1毫米)置於金屬鹵化燈之光導後方，藉以使視野中UV (335-379奈米)光點的直徑限定約為50微米。在空間限定UV光解反應後，如上述方法以細胞培養液於37°C培養細胞24小時後，進行固定。

以 JHR2 處理小鼠皮質神經元

依據先前方法(Chen et al., Neurosci Res 70, 118-123 (2011))初代培養小鼠的皮質神經元。將JHR2胜肽(最終濃度為1 μM)溶解於預平衡的神經元培養液中，其包含一半體積之舊有細胞培養液。以不含或包含JHR2之培養液培養21天之活體外(21DIV)皮質神經元8小時。為完全移除培養液中未結合的JHR2，以500微升之新鮮預平衡神經培養液洗滌2次。經UV照射(380奈米UV，平均功率為每平方公分18 mW，2分鐘汞燈) 24小時後，固定皮質神經元。以3.7%之溶於1倍PBS的甲醛於37°C固定海馬迴神經元15分鐘，之後利用0.25% Triton X-100於室溫處理5分鐘，藉以穿透細胞膜。接著，加入10% BSA於37°C阻斷30分鐘。將溶於2% BSA之抗-TDP-43抗體 (1:1000, Abcam, ab104223)或抗-β-III-微管蛋白體(1:200, Abcam, ab18207)加入神經元後，於37°C反應1小時。加入以Alexa Fluor 488標記之二級抗體(抗-小鼠)及以680標記之二級抗體(抗-兔子)(1:1000, Life Technologies)，於37°C避光反應1小時。以配有Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD相機之Nikon Eclipse-Ti倒置顯微鏡檢測螢光影像。

統計分析

以Student’st -test利用單向變異分析來統計分析各數據。當p ＜ 0.05時，視為具有統計顯著性。

實施例 1 合成光控探針

依據「材料及方法」所述之步驟合成並純化JHR1及JHR2探針。具體來說，JHR1及JHR2的結構皆包含一段八聚精胺酸(8R)序列(序列編號：1，RRRRRRRR)、一段源自TDP-43的類澱粉沉積序列(序列編號：2，MGGGMNFGAFSINPAM，其為TDP-43之第307到322個胺基酸殘基)，以及一段o -硝芐基(o -nitrobenzyl)光裂解部，其係介於8R胜肽(序列編號：1)及類澱粉沉積序列(序列編號：2)之間。此外，JHR1及JHR2分別包含一叔丁基硫醇基(ter t-butyl thiol)及一螢光團(即Alexa568)，其係與TDP-43之類澱粉沉積序列的半胱胺酸殘基相連接(第 1(a) 圖 )。利用逆相HPLC純化，並以 ESI及MALDI質譜儀分析確認JHR1 and JHR2 (結果未顯示)。

實施例 2 確認實施例 1 的光控探針

2.1 活體外確認 JHR1 的體積

TEM結果顯示，JHR1探針 (5 μM)在進行光解反應前，可自我聚集形成球形微泡(第 1(b) 圖，箭頭所指位置)，其平均微泡體積約為48 ± 20奈米。推測JHR1的兩親特性(amphiphilic property，例如庫侖排斥(Columbic repulsion)及疏水性/p-p反應)可穩定該微泡結構(第 1(a) 圖 )。利用低溫冷凍電子顯微鏡來確認微泡的雙層結構(第 1(c) 圖 )。DLS的分析結果顯示，JHR1的平均水合直徑(平均微泡體積)為80±21奈米，且具有低多分散性指數(polydispersity index, ＞0.3)；該結果指出單分散性之奈米微泡的形成( 第 1(d) 圖 ) 。相較於TEM，於脫水、真空環境下進行DSL所得之水合直徑更能反應JHR1的微泡體積。

2.2 光照射可促進具強類澱粉蛋白特性之奈米纖維形成

照射(波長：365奈米，功率密度：每平方公分32 mW，時間：60秒)後，於24小時的TEM影像可觀察到JHR1探針(50 μM)奈米纖維的形成(第 2(a) 圖 )。除了纖維化外，類澱粉蛋白的另一特徵為富含β-褶板的二級結構，該特徵可以圓偏光二色性光譜進行分析確認。如預期地，JHR1於黑暗中主要仍具有隨機線圈的構型；該實驗持續觀察24小時，而僅收集第 2(b) 圖所示之0、2及24小時的數據。然而，一旦於PBS中照射2小時，於200奈米的莫耳橢圓率會急劇增加，並於218奈米時降低(第 2(c) 圖 )，該結果指出，JHR1的結構會由隨機線圈轉變為β-褶板的構型。基於光活化後CD光譜或TEM皆無進一步的改變，照射會加速形成富含β-褶板的奈米纖維，且快速達到平衡。相似地，JHR1在黑暗中主要仍為可溶性，而在光活化48小時後，會隨著時間的增加而增加其可見混濁度(第 2(d) 圖 )。該些結果顯示光活化後，JHR1具有極短的成核反應/停滯期(nucleation/lag phase)，及中等的延伸期(elongation phase，約為10小時)。最後，利用硫代黃素T來確認類澱粉蛋白的形成，硫代黃素T是一種探針，可嵌入類澱粉蛋白的交叉-β結構(cross-β structure)，據以增加螢光值(Liu et al., Chemical Communications 49, 11212-11214 (2013))。已知ThT會偏好與TDP-43_307-322 聚集體結合，進而增加螢光發散。在本實施例中，發明人觀察到在投予ThT 2小時後，經UV照射之JHR1會發散顯著之因聚集誘導產生的螢光量(第 2(e) 圖 )。

整體來看，本實施例的數據證實「光」可遠程且有效地於活體外控制及促進本發明經化學修飾之胜肽的類澱粉沉積反應。

2.3 活體外觀察光控類澱粉沉積反應

本實施例將利用全內反射螢光(total internal reflection fluorescence, TIRF)顯微鏡直接觀察JHR1光解後的纖維化動力學。簡單來說，將JHR1與ThT共同培養後，可以442奈米的激發波長及485奈米的發散波長觀察到類澱粉蛋白的生成。第 3 圖闡述了該些結果。

一般認為類澱粉蛋白生成的動力學包含停滯期(成核反應)、延伸期(纖維化)及最終的平台期；如第 3(a) 圖照片所示，在以UV照射後，JHR1會立即產生螢光「核」，接著形成類澱粉蛋白纖維，而於300分鐘後到達平台期。在以更高倍數觀察時，可將纖維的生長模式分為單向生長端延伸(箭頭所指位置，第 3(b) 圖 )，出芽末端多向的多向分支(第 3(c) 圖 )，二生長端的連接及融合(第 3(d) 圖 )，及迂迴纖維端的會合(第 3(e) 圖 )。此外，2小時(綠色)及5小時(紅色)的重疊影像指出，既有的纖維(黃色，重疊影像)會在3小時內新生形成纖維網(紅色)(第 3(f) 圖 )。在平台期，成熟的纖維長度(N = 141)約為1-9微米(第 3(g) 圖 g )，整個過程的平均生長速度則約為每秒3.7奈米(第 3(h) 圖 )。與先前報導不同(該報導指出成核反應通常需要預成之纖維作為「核」，Ogi H et al., Scientific reports 4, 6960 (2014))，本發明JHR1在光激發後會自發性地形成「核」，促使更多的單體快速「晶種化」(seeding)至類澱粉蛋白。

實施例 3 JHR2 會與細胞內 TDP-43 聚集體共同表現

本實施例是藉由將實施例1之JHR2 (其包含一與TDP-43_307-322 之C端半胱胺酸側鏈連接的螢光團-Alexa568)(第 1(a) 圖 ) 轉入N2A細胞中，據以檢測活細胞中的類澱粉沉積反應。

經照射(波長：335-379奈米，功率密度：每平方公分8.24 mW，期間：3分鐘)後，可於4小時內觀察到大量的纖維，且於較晚的時間點觀察到成熟纖維的延伸網(第 4(a) 圖 )。以磺化螢光團 (Alexa 568)來確認聚集前後具有相同的螢光發散光譜(結果未顯示)。N2A細胞為小鼠的神經母細胞瘤細胞株，常作為研究神經退化性疾病時的細胞模式。為最佳化N2A細胞實驗的照射條件，本研究亦藉由DIC形態觀察及Annexin V染色實驗發現非聚焦光(波長：335-379奈米，功率密度：≤每平方公分8.24 mW，期間：≤ 10分鐘)不會造成顯著的細胞死亡(結果未顯示)。另一方面，聚焦光(波長：335-379奈米，功率密度：每平方公分31.5 mW，期間：≥1分鐘)則會造成顯著的細胞死亡，於該處理條件下可觀察到細胞形態萎縮及強烈的Annexin V反應(結果未顯示)。

本實施例的結果指出螢光JHR2可快速穿透細胞(第 4(b) 圖 )。有鑑於活化之與AMP相關的蛋白激酶(AMP-dependent protein kinase, AMPK))會快速引發TDP-43錯位表現，本實驗亦利用AMPK活化劑-5-胺咪唑-4-羧醯胺-1-β-D-核呋喃糖苷(5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide, AICAR)來誘發TDP-43轉位至細胞質，藉以模擬早期的ALS病理學。與AICAR及JHR2避光培養至隔日後，表現的EGFP-TDP-43會由原主要分布的細胞核重新分布至整個細胞(第 4(b) 圖 )。須注意的是，以非聚焦光(波長：335-379奈米，功率密度：每平方公分8.24 mW，期間：3分鐘)短暫照射24小時後，JHR2及EGFP-TDP-43會劇烈形成明顯、主要共表現於細胞質的聚集體及/或包涵體(inclusion bodies)(第 4(c) 圖 )，該結果顯示光活化的JHR2會誘發可溶性TDP-43形成不溶物質。

實施例 4 經照射後，光控探針 「晶種化」 內源性 TDP-43 及造成原發性皮質神經元退化

本實施例將探討活細胞內「內源性TDP-43」的空間分布。據此，於光照射後，以對TDP-43具有專一性之抗體來免疫染色內源性TDP-43 (第 5(a) 圖 )。當投予胜肽及照射處理時，可於N2A細胞的細胞質觀察到內源性TDP-43聚集體(白色箭號所指位置)(第 5(a) 、 (b) 圖 )。利用旋轉盤共軛焦顯微鏡(Spinning disk confocal microscopy)來準確計算誘發之細胞內TDP-43聚集體。經光及JHR1處理之各細胞中，內源性TDP-43聚集體的平均數量會顯著高於其他組別(第 5(b) 圖 )。

為證實本平台的細胞內空間解析度，將針孔架設於光路中，藉由限定UV的照射區域(第 5(c) 圖的白色圓圈)來選擇性地活化光點中的JHR2。僅能於該區域中觀察到Hoechst的螢光。在光點中，本發明以空間控制照射區域來選擇性地誘發JHR2類澱粉蛋白「晶種化」不同細胞之內源性TDP-43細胞內聚集(第 5(d) 圖 )。為詳細且即時地觀察整體動態反應過程，將會表現EGFP-TDP-43的細胞與JHR2共同培養，再利用時間進程螢光影像進行分析。結果發現EGFP-TDP-43及JHR2於早期培養階段主要會在細胞內呈現漫射狀(1-15小時)(第 5(e) 圖 )。照射20小時後可偵測到EGFP-TDP-43點狀結構，該結構於24小時後會更佳明顯(第 5(e) 圖 )。於時間點末期(25小時)，Annexin V染色發現於細胞質具有EGFP-TDP-43包涵體的N2A細胞是處在細胞凋亡的邊緣(第 5(f) 圖 )，該結果與ALS的病理模式一致。

為確認細胞中EGFP-TDP-43的聚集是否與JHR2的類澱粉沉積反應相關，將JHR2顯微注射至N2A細胞後，投予照射。數據重現相似的結果，即光誘導EGFP-TDP-43聚集會隨著時間的增加而增加，且伴隨著反應時間較短的細胞死亡；該結果顯示，八聚精胺酸導向的胜肽傳送功效與直接顯微注射相當(結果未顯示)。值得注意的是，EGFP-TDP43的聚集(4小時)總晚於JHR2的聚集(2小時)(結果未顯示)。

已知相較於細胞核，人工蛋白堆積於細胞質會干擾核質蛋白及RNA的運送，進而誘發細胞死亡。僅管已有報導指出錯誤折疊的蛋白聚集體會螯隔調控細胞核進出的多種因子，其詳細的假設機制仍有待進一步釐清。基於本發明平台可選擇性地誘發細胞質中的「光控晶種化」，造成內源性TDP-43聚集，本揭示內容之探針將可用以驗證上述假設。據此，本實驗接著將探討有或無投予「光」處理之經JHR2處理或對照組細胞中Ran (RAS-related nuclear protein；一種與細胞核轉入及轉出相關的25 kDa蛋白)的分布位置。結果指出，在未經處理(-JHR2-光)、僅以UV照射(-JHR2+光)及僅投予JHR2處理(+JHR2-光)的細胞中，Ran主要位於細胞核中(第 6(a) 圖 )。然而，一旦照射後(+JHR2+光)，漫射狀JHR2會形成顯著的小點狀結構，且超過90%的Ran會錯誤分布至細胞質中(第 6 圖之圖 a )；該結果顯示，JHR2聚集會干擾核的轉運。除了Ran之外，本實驗亦分析活體內類澱粉沉積反應對內輸蛋白-α1的影響。內輸蛋白-α1是Ran的結合伴侶，且可運送包含核定位序列(nuclear localization sequence, NLS)的蛋白。實驗結果發現在未經處理(-JHR2-光)、僅以UV照射(-JHR2+光)及僅投予JHR2處理(+JHR2-光)的細胞中，內輸蛋白-α1 主要會位於細胞核內(第 6(b) 圖 )。相較之下，在投予JHR2處理及光活化的情況下(+JHR2+光)，TDP-43及內輸蛋白-α1會由細胞核轉位至細胞質中，並形成聚集體。此外，亦於觀察期間發現內輸蛋白-α1主要會位於細胞核的周邊(第 6(b) 圖 )。整體來說，該些結果指出，JHR2聚集體會誘發Ran的錯位表現，使內輸蛋白-α1轉位至細胞核周邊表現，以及內輸蛋白-α1的聚集，該些結果暗示著細胞質的聚集會損害細胞核-細胞質的運送。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第 1 圖：光控探針的設計及生物物理特性。 (a)經化學修飾之胜肽探針，其中JHR1及JHR2之R分別為叔丁基(tert-butyl)及ALEXA568。一旦以UV光照射後，八聚精胺酸序列(octaarginine sequence)會由類澱粉沉積序列TDP-43_307-322 分離，快速產生類澱粉沉積反應。(b)穿透式電子顯微鏡(transmission electron microscopy, TEM)之分析結果顯示JHR1 (5 μM)於光活化前是以球形微泡(白色箭號所指位置)形式存在。(c)低溫冷凍電子顯微鏡(Cryo-electron microscopy, Cryo-EM)顯示JHR1於光活化前的雙層微泡結構。(d) JHR1於光活化前的平均微泡體積。以TEM及動態雷射光散射(dynamic laser light scattering, DLS)來測量體積大小。(b)及(c)之比例尺為100奈米。第 2 圖：光控探針的化學特性。 (a)以光活化 JHR1 (50 μM)後，TEM於24小時內的分析結果。代表性照片分析為第0、4及24小時之結果。比例尺為200奈米。以圓偏光二色性(circular dichroism)比對分析無(b)或有(c)光活化之JHR1 (50 μM)的二級結構。收集第0、2、4、6、9及24小時的數據，僅顯示第0、2及24小時之結果。(d)以UV-可見光吸收來決定光活化前(■)及光活化後(●)之JHR1 (50 μM)於48小時內的混濁度。分別收集第0、2、4、6、9、24及48小時的數據(s.d., n = 3)。(e)在投予光活化前(黑色柱體)及光活化後(陰影柱體)之JHR1 (200 μM)的處理下，硫代黃素T (thioflavin T, ThT)的螢光訊號(a.u.)。第 3 圖：即時影像分析光控奈米纖維 (nanofibril) 於活體外的形成。 (a) UV照射JHR1 (335-379奈米，每平方公分8.24 mW，3分鐘)，並以ThT染色5小時後，利用曠時TIRF顯微鏡記錄分析(間隔為5分鐘)。代表性照片為50分鐘間隔的影像。以包含10 mM HCl、10% HFIP (體積/體積)及ThT (100 μM)的溶液製備JHR1 (3 μM)。在所有影像中，將四種代表性奈米纖維形成模式總結為(b)單向延伸及生長，(c)出芽末端多向的多向分支，(d)二生長端的連接及融合，以及(e)迂迴纖維端的會合。以白色箭頭標示新生成的細胞核、端點及接合處。(f)將第120分鐘(綠色)及第300分鐘(紅色)的影像疊加後可發現既存之奈米纖維(黃色，疊加)會在5小時內形成新延伸的奈米纖維網(紅色)。比例尺為1微米。總結觀察時間內之(g)纖維長度及(h)生長速度的分布。以NIS-Elements AR (Nikon)軟體來決定奈米纖維的長度及生長速度。第 4 圖：光控探針 「晶種」 (seeds) 會與細胞內 EGFP-TDP-43 聚集體共同表現。 (a)以TEM分析比對特定時間之光解JHR2。代表性照片分別為第0、4及24小時的結果。比例尺為200奈米。分析及比對以JHR2 (紅色)處理後，在無(b)或有(c)光解反應的情況下，EGFP-TDP-43 (綠色)於細胞內的分布狀況。依序以AICAR (1 mM，至隔日)及JHR2 (1 μM，3小時)處理具EGFP-TDP-43的N2A細胞後，以UV照射並培養24小時。以Hoechst (藍色)染色細胞核，並以DIC通道觀察細胞形態。插圖為(c)之EGFP-TDP-43 (綠色)、JHR2 (紅色)及二者(黃色)之聚集體(箭頭所指位置)的放大圖。比例尺為10微米。第 5 圖：光控探針可時間及空間性地觀察類澱粉沉積反應、誘發 TDP-43 聚集。 (a)經AICAR (1 mM，24小時)預處理後，以JHR1處理之細胞(上二圖)或對照組細胞(下二圖)在無或有光活化時內源性TDP-43 (綠色)的分布。以JHR1處理及UV照射後，將細胞培養24小時，固定後以抗-TDP-43抗體進行免疫染色。插圖：點狀結構為經JHR1處理及照射(+JHR1+光)後，細胞內TDP-43聚集體(箭頭)。在未經處理的細胞(-JHR1-光)、僅以UV照射之細胞(-JHR1+光)及僅投予JHR1處理之細胞(+JHR1-光)中，可觀察到少量或無法觀察到內源性TDP-43聚集體。以Hoechst (藍色)染色細胞核。(b)以高含量篩選分析(high content screening analysis, Yokogawa)量化(a)圖中細胞內的點狀結構。**表示p ＜ 0.01。(c)利用經Hoechst染色的細胞來闡述於光路中以針孔遮蔽之圖形化(因此具細胞選擇性)光活化。當未以針孔遮蔽時(上圖：無光遮蔽照射)，所有的細胞皆發散螢光。當以針孔限定照射區域時，僅位於該區域之細胞(以白色虛線界定)可接受光照射，並發散螢光(下圖)。(d)分析比對於照射區域外(虛線的左側)及區域內(虛線的右側)經JHR2處理之細胞。插圖：點狀結構為內源性TDP-43 (綠色)、JHR2 (紅色)或二者(黃色)形成的聚集體(箭頭)。比例尺為10微米。(e)曠時監測N2A細胞於JHR2處理及進行光解反應後，EGFP-TDP-43 (綠色)的異位表現。插圖：點狀結構為光解反應後第20及24小時的EGFP-TDP-43 (綠色)聚集體(箭頭)。(f)為(e)之時間末點(t =第25小時)。基於EGFP-TDP-43 (綠色)及JHR2 (紅色)於(f)皆形成聚集體，Annexin V染色結果顯示該些細胞為走向死亡的細胞(橘色)。以Hoechst (藍色)染色細胞核，並以DIC通道觀察細胞形態。(b-f)使用之JHR2的濃度及光解反應條件皆與(a)所述內容相同。比例尺：10微米。第 6 圖： JHR2 聚集會造成內源性 Ran 、 TDP-43 及內輸蛋白 -α1 (importin-α1) 的錯位表現。 (a)有或無光活化之以JHR2 (橘色)處理的細胞(上二圖)或對照組細胞(下二圖)中，內源性Ran (綠色)的分布狀況。須注意經照射後(+JHR2+光)，Ran會伴隨著細胞內 JHR2聚集體的形成而重新分布至細胞質中。在未經處理的細胞(-JHR2-光)、僅以UV照射之細胞(-JHR2+光)及僅投予JHR2處理之細胞(+JHR2-光)中，不會觀察到內源性Ran的重新分布。(b)有或無光活化之以JHR2 (橘色)處理的細胞(上二圖)或對照組細胞(下二圖)中，內源性TDP-43 (綠色)及內輸蛋白-α1 (紫色)的分布狀況。在未經處理的細胞(-JHR2-光)、僅以UV照射之細胞(-JHR2+光)及僅投予JHR2處理之細胞(+JHR2-光)中，TDP-43及內輸蛋白-α1主要仍會表現於細胞核中。在投予JHR2處理及光活化後(+JHR2+光)，TDP-43及內輸蛋白-α1會由細胞核轉移至細胞質中，並與JHR2 聚集體(以箭頭標示)共同表現。比例尺為10微米。

＜110＞中央研究院＜120＞用以偵測類澱粉沉積蛋白之探針及方法＜130＞ P2941-TW ＜150＞ US62/365,433 ＜151＞ 2016-07-22 ＜160＞ 10 ＜170＞ BiSSAP 1.3 ＜210＞ 1 ＜211＞ 8 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞細胞穿透序列＜400＞ 1 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 ＜210＞ 2 ＜211＞ 16 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ TDP-43之胺基酸殘基307到322 ＜400＞ 2 Met Gly Gly Gly Met Asn Phe Gly Ala Phe Ser Ile Asn Pro Ala Met 1 5 10 15 ＜210＞ 3 ＜211＞ 13 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ Tat胜肽＜400＞ 3 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 ＜210＞ 4 ＜211＞ 16 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞穿透素＜400＞ 4 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 ＜210＞ 5 ＜211＞ 18 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ pVEC ＜400＞ 5 Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His 1 5 10 15 Ser Lys ＜210＞ 6 ＜211＞ 27 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞運輸蛋白＜400＞ 6 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 ＜210＞ 7 ＜211＞ 27 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ MPG ＜400＞ 7 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 ＜210＞ 8 ＜211＞ 21 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ Rep-1 ＜400＞ 8 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 ＜210＞ 9 ＜211＞ 18 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ MAP ＜400＞ 9 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ala ＜210＞ 10 ＜211＞ 10 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ R6W3 ＜400＞ 10 Arg Arg Trp Trp Arg Arg Trp Trp Arg Arg 1 5 10

Claims

一種光控探針，依序包含：一細胞穿透部、一光裂解部、一類澱粉沉積部、一螢光團連接部及一螢光團，其中該光裂解部經一波長介於250到1,000奈米之間的光照射後會裂解，且該細胞穿透部包含至少2個帶電的胺基酸殘基，其係選自由精胺酸、離胺酸、組胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸及其組合所組成的群組。
如請求項1所述之光控探針，其中該螢光團連接部是一半胱胺酸殘基。
如請求項1所述之光控探針，其中該螢光團是一螢光染劑，其係選自由胺基香豆素、異藻藍蛋白、Alexa 488、Alexa 568、CY3、CY5、CY7、APC-CY7共軛物、螢光素、FluorX、羥香豆素、螢光黃、甲氧香豆素、NBD-TMA、PE、PE-CY5共軛物、PE-CY7共軛物、羅丹明、TRITC-胺類及德州紅-胺類所組成的群組。
如請求項1所述之光控探針，其中該細胞穿透部是由8個精胺酸殘基所組成。
如請求項1所述之光控探針，其中該細胞穿透部是一細胞穿透胜肽，其係選自由Tat胜肽、穿透素、pVEC、運輸蛋白、MPG、Rep-1、MAP及R₆W₃所組成的群組。
如請求項1所述之光控探針，其中該類澱粉沉積部是一源自類澱粉蛋白-β、類澱粉胰島蛋白、α-突觸核蛋白、突變亨丁頓蛋白、C9orf72 DRP或TDP-43的類澱粉沉積胜肽。
如請求項6所述之光控探針，其中該類澱粉沉積胜肽是源自TDP-43，且具有與序列編號：2至少90%相似性的序列。
如請求項6所述之光控探針，其中該類澱粉沉積胜肽是源自C9orf72 DRP。
如請求項8所述之光控探針，其中該源自C9orf72 DRP的類澱粉沉積胜肽是一聚(甘胺酸-丙胺酸)片段、一聚(甘胺酸-脯胺酸)片段或一聚(甘胺酸-精胺酸)片段。
如請求項6所述之光控探針，其中該類澱粉沉積胜肽是源自突變亨丁頓蛋白。
如請求項10所述之光控探針，其中該源自突變亨丁頓蛋白之類澱粉沉積胜肽是一聚麩醯胺酸片段。
如請求項6所述之光控探針，其中該類澱粉沉積胜肽更與聚乙烯亞胺共軛鍵結。
如請求項1所述之光控探針，其中該光裂解部包含一官能基，其係選自由芳羰基、硝芳基、香豆素-4-基-甲基、芳甲基、一包含金屬之基團、芳磺醯基及一與矽相關之基團所組成的群組。
如請求項13所述之光控探針，其中該包含金屬之基團是[M(bpy)_n]²⁺，其中M是Fe²⁺、Ru²⁺或Co²⁺；n是2或3；且bpy是2,2’-聯砒啶。
如請求項13所述之光控探針，其中該與矽相關之基團是三(三甲矽烷基)(tris(trimethylsilyl))基團。
如請求項13所述之光控探針，其中該光裂解部具有孟加拉玫紅、核黃素或鈷胺素的結構。
如請求項13所述之光控探針，其中該光裂解部包含該硝芳基，且以波長為365奈米之光照射後會裂解。
一種用以決定一生物檢體是否包含一類澱粉沉積蛋白的方法，包含：(a)以請求項1之光控探針處理該生物檢體；(b)以一波長介於250到1,000奈米之間的光照射步驟(a)之經光控探針處理的生物檢體；以及(c)對步驟(b)之經照射的生物檢體進行影像分析；其中，若於步驟(c)之影像分析過程中，在該經照射的生物檢體中觀察到類澱粉纖維，則該生物檢體包含該類澱粉沉積蛋白。
如請求項18所述之方法，其中在步驟(b)中，是以波長為365奈米的光照射該經該光控探針處理的生物檢體。
如請求項18所述之方法，其中該類澱粉沉積蛋白是類澱粉蛋白-β、類澱粉胰島蛋白、α-突觸核蛋白、突變亨丁頓蛋白、C9orf72 DRP或TDP-43。
如請求項18所述之方法，其中該生物檢體是腦脊髓液、血液、血漿或口腔黏膜。
如請求項18所述之方法，其中該生物檢體中的類澱粉沉積蛋白是由一神經退化性疾病或糖尿病所造成。
如請求項22所述之方法，其中該神經退化性疾病是神經退化性疾病是騷癢症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、帕金森氏症、阿茲海默症、路易體病、亨丁頓氏舞蹈病、第三型小腦脊髓運動失調症候群、狀紅核蒼白球肌萎縮症、脊髓及延髓肌肉萎縮症、脊髓小腦性失調症或X染色體脆折症運動失調症候群
如請求項22所述之方法，其中該糖尿病是第II型糖尿病。