CN104592987B - 一种具有pH响应的恢复型近红外荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有pH响应的恢复型近红外荧光探针，化学结构式如式(Ⅰ)所示：式中，X为C(CH3)2、O、S或Se，Y为卤素，Z为NH、O或S，R1和R2分别独立地选自H、C1‑18烷基或SO3R5，R5为C1‑18烷基或苄基，R3和R4分别独立地选自C1‑18烷基或苄基。该pH响应的恢复型近红外荧光探针在pH5.0～7.5时，荧光强度随着pH的降低而逐渐增强，并且二者呈现很好的线性关系。其stocks位移较大、信噪比较低，毒性较小，对细胞和活体伤害较小，而且pKa为6.4，很适合用来进行肿瘤的检测，克服了现有技术荧光探针的缺陷。本发明还提供了该探针的制备方法，制备方法简单。
Description
技术领域
本发明涉及生物荧光分析技术领域，具体涉及一种具有pH响应的恢复型近红外荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
由于荧光光谱法具有灵敏度高、选择性好，获得的信息直观、准确，能科学表达复杂样品的结构、分布、含量及生理功能等诸多优点，所以其在生物分析及造影方面应用广泛。
许多生物体及其组织在可见光的激发下自身会发射荧光，严重干扰生物样品的荧光检测和造影，如血浆中血清蛋白的荧光波长范围为325～350nm，还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酶(NADPH)和胆红素的荧光波长范围为430～470nm，故使得可见光区荧光分析的灵敏度和准确性受到了很大的影响。近红外荧光探针的最大吸收波长和发射波长为600～900nm，可避免背景干扰。因此，近红外荧光检测在生物样品分析中有明显的优越性。
细胞内的pH在酶活性、细胞增殖和调亡、抗药性、离子传输、细胞内吞作用以及肌肉收缩等一系列组织活动中起着至关重要的作用。异常的pH值会影响细胞的功能，在一些常见的疾病如癌症和老年痴呆症的患者身上就可以很容易发现这些pH值异常的细胞。细胞功能和pH值的这种微妙关系意味着只要能掌握细胞内pH值的变化就可以为相关的生理和病理过程研究提供重要的信息。因此，如何精确地检测细胞内pH值的变化显得非常重要。
相比于其他pH的测定方法，使用荧光探针法进行pH检测具有灵敏度高、选择性好等优点，但目前大部分pH探针波长较短，不能避开组织自吸收和自荧光，背景干扰较强，部分stocks位移小，紫外吸收波谱和荧光光谱重叠较大，信噪比大，毒性较大，不能用于细胞和活体pH检测，部分荧光探针pKa偏大或偏小，在pH6.4的肿瘤环境中的几乎没有荧光变化，很难实现对肿瘤的检测。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种具有pH响应的恢复型近红外荧光探针及其制备方法和应用。所述具有pH响应的恢复型近红外荧光探针的stocks位移较大、信噪比较低，毒性较小，对细胞和活体伤害较小，而且pKa为6.4，很适合用来进行肿瘤的检测，本发明提供的恢复型近红外荧光探针的制备方法工艺简单。
本发明第一方面提供了一种具有pH响应的恢复型近红外荧光探针，化学结构式如式(Ⅰ)所示：
式中，X为C(CH3)2、O、S或Se，Y为卤素，Z为NH、O或S，R1和R2分别独立地选自H、C1-18烷基或SO3R5，R5为C1-18烷基或苄基，R3和R4分别独立地选自C1-18烷基或苄基。
优选地，所述X为C(CH3)2。
优选地，所述Y为碘。
优选地，所述所述Z为NH。
优选地，所述R1和所述R2均为H。
优选地，所述R3和所述R4均为乙基。
优选地，所述X为C(CH3)2，所述Y为碘，所述Z为NH，所述R1和所述R2均为H，所述R3和所述R4均为乙基。
所述具有pH响应的恢复型近红外荧光探针，以近红外荧光染料为母体，在中位修饰上对H+敏感的开关所述探针在碱性条件下，吡啶上的氮未被质子化，相应氮原子上的孤对电子可以发生光致电子转移(PET)而猝灭荧光团的荧光，该近红外荧光探针是没有荧光或显示很弱的荧光，当pH降低时，所述近红外荧光探针中的吡啶中的氮会被质子化，探针开关被触发，光致电子转移(PET)被阻断，导致荧光团荧光逐渐恢复，在pH5.0～7.5时，荧光强度随着pH的降低而逐渐增强，在pH5.9～6.9时，二者呈现很好的线性关系，从而实现对pH的检测。
所述具有pH响应的恢复型近红外荧光探针探针的最大发射波长在754nm，能有效避开组织自吸收和自荧光，最大激发波长为620nm，stocks位移高达134nm，信噪比较低。同时毒性较小，对细胞和活体伤害较小。由于所述探针带正电，在细胞膜负电的作用下能很快进入细胞内检测细胞内pH。另外，所述近红外荧光探针pKa为6.4，很适合用来进行肿瘤的检测。
本发明第一方面提供的所述具有pH响应的恢复型近红外荧光探针，stocks位移较大、信噪比较低，毒性较小，对细胞和活体伤害较小，而且pKa为6.4，很适合用来进行肿瘤的检测，克服了现有技术荧光探针的缺陷。
本发明第二方面提供了一种具有pH响应的恢复型近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)分别提供化学结构式如式(Ⅱ)和式(Ⅲ)所示的化合物；
式中，X为C(CH3)2、O、S或Se，Y为卤素，R1和R2分别独立地选自H、C1-18烷基或SO3R5，R5为C1-18烷基或苄基，R3和R4分别独立地选自C1-18烷基或苄基，R6为氨基、羟基或巯基；
(2)将化学结构式如式(Ⅱ)和式(Ⅲ)所示的化合物按照摩尔比为1:1.2-1:10的比例溶解在溶剂中，再加入缚酸剂，保护气体氛围下，在40℃-80℃反应4-10h，提纯后得到具有pH响应的恢复型近红外荧光探针，所述具有pH响应的恢复型近红外荧光探针化学结构式如式(Ⅰ)所示；
式中，X为C(CH3)2、O、S或Se，Y为卤素，Z为NH、O或S，R1和R2分别独立地选自H、C1-18烷基或SO3R5，R5为C1-18烷基或苄基，R3和R4分别独立地选自C1-18烷基或苄基。
步骤(2)的反应方程式为：
优选地，所述X为C(CH3)2。
优选地，所述Y为碘。
优选地，所述Z为NH。
优选地，所述R1和所述R2均为H。
优选地，所述R3和所述R4均为乙基。
优选地，所述X为C(CH3)2，所述Y为碘，所述Z为NH，所述R1和所述R2均为H，所述R3和所述R4均为乙基。
优选地，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈或乙醇。
优选地，所述缚酸剂为三乙胺、N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)或吡啶。
优选地，所述缚酸剂与所述化学结构式如式(Ⅱ)的化合物的摩尔比为1.2：1-4:1。
优选地，所述保护气体为氮气、氩气或氦气。
优选地，所述提纯的方法为：反应结束后旋蒸除去溶剂，真空干燥12h，过硅胶柱，用二氯甲烷和甲醇的混合溶液梯度洗脱，除去溶剂，即得所述具有pH响应的恢复型近红外荧光探针。
更优选地，所述二氯甲烷和所述甲醇的体积比为20:1。
优选地，所述化学结构式如式(Ⅲ)所示的化合物采用以下方法制得：
将化学式为化合物和4-甲醛吡啶按摩尔比为5:1-3:1的比例溶解在第二溶剂中，冰浴条件下，在保护气体下进行缩合反应0.5-2h，R6为氨基、羟基或巯基；然后加入硼氢化钠，进行还原反应2-3h，所述硼氢化钠与所述4-甲醛吡啶的摩尔比为1:1-2:1，提纯后制得化学式如式(Ⅲ)所示的化合物，反应方程式为：
当R6分别为氨基、羟基或巯基时，化学式为的化合物分别为乙二胺、2-羟基乙胺或巯基乙胺。
更优选地，所述第二溶剂为甲醇、水、乙醇或四氢呋喃(THF)。
更优选地，所述保护气体为氮气、氩气或氦气。
更优选地，所述提纯的方法为：旋蒸除去溶剂，真空干燥24h，再加入20mL蒸馏水，用50mL二氯甲烷分三次萃取，收集有机相，再旋蒸除去溶剂，用碱性氧化铝过柱，用二氯甲烷和甲醇的混合溶液进行梯度洗脱，浓缩，得到油状产品即化学结构式如式(Ⅲ)所示的化合物。
进一步优选地，所述二氯甲烷和所述甲醇的体积比为20:1。
化学结构式如式(Ⅱ)的化合物为花菁类荧光染料，其中位修饰的氯被化学结构式如式(Ⅲ)所示的开关分子取代，得到所述具有pH响应的恢复型近红外荧光探针，所述具有pH响应的恢复型近红外荧光探针性质稳定。
本发明第二方面提供的一种具有pH响应的恢复型近红外荧光探针的制备方法，该制备方法简单易操作，制得的所述具有pH响应的恢复型近红外荧光探针在pH大于9时，该近红外荧光探针是没有荧光或显示很弱的荧光，当pH5.0～7.5时，荧光恢复，且荧光强度随着pH的降低而逐渐增强，在pH5.9～6.9时，二者呈现很好的线性关系，从而实现对pH的检测。所述pH响应的恢复型近红外荧光探针探针的最大发射波长在754nm，能有效避开组织自吸收和自荧光，最大激发波长为620nm，stocks位移高达134nm，信噪比较低。同时毒性较小，对细胞和活体伤害较小。由于所述探针带正电，在细胞膜负电的作用下能很快进入细胞内检测细胞内pH。另外，所述近红外荧光探针pKa为6.4，很适合用来进行肿瘤的检测。
本发明第三方面提供了第一方面所述的具有pH响应的恢复型近红外荧光探针的应用，所述具有pH响应的恢复型近红外荧光探针应用于制备肿瘤的检测、诊断、治疗或诊疗药物。
优选地，所述具有pH响应的恢复型近红外荧光探针应用于制备溶酶体标记物或肿瘤部位成像的药物。
综上，本发明提供的一种具有pH响应的恢复型近红外荧光探针及其制备方法和应用的有益效果包括以下几个方面：
(1)、所述pH响应的恢复型近红外荧光探针探针的最大发射波长在754nm，能有效避开组织自吸收和自荧光，最大激发波长为620nm，stocks位移高达134nm，信噪比较低；
(2)、所述pH响应的恢复型近红外荧光探针在pH5.0～7.5时，荧光强度随着pH的降低而逐渐增强，在pH5.9～6.9时，二者呈现很好的线性关系；
(3)、所述具有pH响应的恢复型近红外荧光探针的制备方法简单易操作；
(4)、所述近红外荧光探针pKa为6.4，很适合用来进行肿瘤的检测。
附图说明
图1为实施例1制得的具有pH响应的恢复型近红外荧光探针的高分辨质谱图；
图2为实施例1制得的具有pH响应的恢复型近红外荧光探针的核磁共振氢谱图；
图3为实施例1制得的具有pH响应的恢复型近红外荧光探针的荧光随pH的变化曲线；
图4为实施例1制得的具有pH响应的恢复型近红外荧光探针在测试波长为754nm处不同pH下的荧光强度图；
图5为实施例1制得的具有pH响应的恢复型近红外荧光探针与pH的线性关系图；
图6为实施例1制得的具有pH响应的恢复型近红外荧光探针的可逆性测试结果图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例1：
一种具有pH响应的恢复型近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备化学式为的开关分子：
将2.6696mL的乙二胺用10mL甲醇溶解，加到50mL双口瓶，冰浴条件下快速搅拌并将844.3μL 4-甲醛吡啶溶解在10mL甲醇中逐滴滴加到上述溶液中，0℃下N2保护反应1h。
然后在双口瓶中分批加入0.57g硼氢化钠，反应2h，加入10mL蒸馏水搅拌20min终止反应。用旋蒸仪旋去溶剂，真空干燥24h。然后加20mL蒸馏水，用50mL二氯甲烷分三次萃取，收集有机相，旋去溶剂，用碱性氧化铝过柱，用二氯甲烷和甲醇的体积比为20:1的混合溶液梯度洗脱，浓缩，得化学式为的油状产品1.02g，收率为70％。
(2)制备具有pH响应的恢复型近红外荧光探针：
将化学式为的近红外荧光染料31.91mg与化学式为的开关分子18.73mg加入烧瓶中，加2mL无水DMF作溶剂，再加27.7μL三乙胺，氮气保护下，温度40℃反应5h。旋去溶剂，真空干燥12h，过硅胶柱，用二氯甲烷和甲醇的体积比为20:1的混合溶液二梯度洗脱，除去溶剂，得靛蓝色固体产品12.06mg即具有pH响应的恢复型近红外荧光探针收率32％。反应方程式为：
对实施例1得到的具有pH响应的恢复型近红外荧光探针进行质谱和核磁共振测试，测试结果分别如图1和图2所示，图1为实施例1制得的具有pH响应的恢复型近红外荧光探针的高分辨质谱图；从图1中可以看出，通过质谱测出的分子离子峰M+为626.4217，符合C42H52N5 +的理论分子量。
图2为实施例1制得的具有pH响应的恢复型近红外荧光探针的核磁共振氢谱图；从图2中可以看出1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.57(d,J＝5.5Hz,2H,CHCH),7.72(d,J＝13.1Hz,2H,吡啶-H),7.52(d,2H,吡啶-H),7.29(s,2H,Ar-H),7.25(s,2H,Ar-H),7.08(d,J＝7.2Hz,2H,Ar-H),6.85(d,J＝8.0Hz,2H,Ar-H),5.58(d,J＝13.0Hz,2H,CHCH),4.16(q,J＝6.2Hz,2H,CH2CH2N),4.01(s,2H,CH2N),3.88(q,J＝7.1Hz,4H,CH2CH3),3.15(q,2H,NCH2CH2),2.50(t,J＝6.2Hz,4H,环己烯-H),1.83(m,2H,环己烯-H),1.65(s,12H，CH3),1.34(t,J＝7.1Hz,6H,CH3CH2)。图2的核磁谱图结果表明，本实施例成功地制备得到具有pH响应的恢复型近红外荧光探针。
实施例2：
一种具有pH响应的恢复型近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备化学式为的开关分子：
将2.6696mL乙二胺用10mL甲醇溶解，加到50mL双口瓶，冰浴条件下快速搅拌并将844.3μL 4-甲醛吡啶溶解在10mL甲醇中逐滴滴加到上述溶液中，0℃下N2保护反应1h。
然后在双口瓶中分批加入0.57g硼氢化钠，反应2h，加10mL蒸馏水搅拌20min终止反应。用旋蒸仪旋去溶剂，真空干燥24h。然后加入20mL蒸馏水，用50mL二氯甲烷分三次萃取，收集有机相，旋去溶剂，用碱性氧化铝过柱，用二氯甲烷和甲醇的体积比为20:1的混合溶液梯度洗脱，浓缩，得化学式为的油状产品0.99g，收率为68％。
(2)制备具有pH响应的恢复型近红外荧光探针：
将化学式为的近红外荧光染料31.91mg与化学式为的开关分子18.73mg加入烧瓶中，加2mL无水DMF作溶剂，再加27.7μL三乙胺，氮气保护下，温度40℃反应5h。旋去溶剂，真空干燥12h，过硅胶柱，用二氯甲烷和甲醇的体积比为20:1的混合溶液梯度洗脱，除去溶剂，得靛蓝色固体产品9.80mg即具有pH响应的恢复型近红外荧光探针收率26％。
实施例3：
一种具有pH响应的恢复型近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备化学式为的开关分子：
将1.3348mL乙二胺用10mL甲醇溶解，加到50mL双口瓶，冰浴条件下快速搅拌并将422.15μL 4-甲醛吡啶溶解在10mL甲醇中逐滴滴加到上述溶液中，0℃下N2保护反应1h。
然后在双口瓶中分批加入0.29g硼氢化钠，反应2h，加10mL蒸馏水搅拌20min终止反应。用旋蒸仪旋去溶剂，真空干燥24h。然后加入20mL蒸馏水，用50mL二氯甲烷分三次萃取，收集有机相，旋去溶剂，用碱性氧化铝过柱，用二氯甲烷和甲醇的体积比为20:1的混合溶液梯度洗脱，浓缩，得化学式为的油状产品0.52g，收率为72％。
(2)制备具有pH响应的恢复型近红外荧光探针：
将化学式为的近红外荧光染料31.91mg与化学式为的开关分子18.73mg加入烧瓶中，加5mL无水DMF作溶剂，再加27.7μL三乙胺，氮气保护下，温度40℃反应5h。旋去溶剂，真空干燥12h，过硅胶柱，用二氯甲烷和甲醇的体积比为20:1的混合溶液梯度洗脱，除去溶剂，得靛蓝色固体产品11.27mg即具有pH响应的恢复型近红外荧光探针收率30％。
实施例4：
一种具有pH响应的恢复型近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备化学式为的开关分子：
将2.6696mL乙二胺用10mL甲醇溶解，加到50mL双口瓶，冰浴条件下快速搅拌并将844.3μL 4-甲醛吡啶溶解在10mL甲醇中逐滴滴加到上述溶液中，0℃下N2保护反应1h。
然后在双口瓶中分批加入0.57g硼氢化钠，反应2h，加10mL蒸馏水搅拌20min终止反应。用旋蒸仪旋去溶剂，真空干燥24h。然后加20mL蒸馏水，用50mL二氯甲烷分三次萃取，收集有机相，旋去溶剂，用碱性氧化铝过柱，用二氯甲烷和甲醇的体积比为20:1的混合溶液梯度洗脱，浓缩，得化学式为的油状产品0.88g，收率为60％。
(2)制备具有pH响应的恢复型近红外荧光探针：
将化学式为的近红外荧光染料63.82mg与化学式为的开关分子25mg加入烧瓶中，加3mL无水DMF作溶剂，再加27.7L三乙胺，氮气保护下，温度40℃反应5h。旋去溶剂，真空干燥12h，过硅胶柱，用二氯甲烷和甲醇的体积比为20:1的混合溶液梯度洗脱，除去溶剂，得靛蓝色固体产品17.28mg即具有pH响应的恢复型近红外荧光探针收率22％。
效果实施例
将实施例1制得的具有pH响应的恢复型近红外荧光探针置于pH为4.4～9.0的浓度为20mM的HEPES缓冲液(含10％的二甲基亚砜(DMSO))中测试其荧光强度，结果如图3所示，图3为实施例1制得的具有pH响应的恢复型近红外荧光探针的荧光随pH的变化曲线；从图3中可以看出，在pH5.0～7.5时，荧光强度随着pH的降低而逐渐增强。当pH大于9.0时，吡啶上的氮未中质子化，相应氮原子上的孤对电子可以发生光致电子转移(PET)而猝灭荧光团的荧光，该近红外荧光探针显示较弱的荧光，当pH逐渐降低时，吡啶逐渐发生质子化，相应的PET效应被抑制并导致荧光团荧光逐渐恢复，荧光强度逐渐增强，直至吡啶被完全质子化，PET效应被完全阻断，荧光达到最强。
图4为实施例1制得的具有pH响应的恢复型近红外荧光探针在不同pH下的荧光强度图；测试波长为754nm处。拟合发现，该pH响应的恢复型近红外荧光探针的pKa为6.4。
图5为实施例1制得的具有pH响应的恢复型近红外荧光探针与pH的线性关系图；从图中可以看出，在pH为5.9～6.9的范围内，荧光强度与pH值呈现良好的线性关系，相关系数R为0.99896。
由于细胞内pH值往往发生振荡变化，并且非均匀分布，因此pH探针具有可逆响应能力十分重要。因此我们还对本发明制得的具有pH响应的恢复型近红外荧光探针对pH响应的可逆性进行了测试。实验中循环调节测试溶液的pH，使其pH在5和9之间振荡，并反复测试其荧光光谱。结果如图6所示，图6为实施例1制得的具有pH响应的恢复型近红外荧光探针的可逆性测试结果图。结果表明，本发明制得的具有pH响应的恢复型近红外荧光探针的荧光至少在5个循环内在相同的pH下保持稳定，表明该探针具有较好的可逆响应pH的能力，可以实现对细胞内pH振荡变化的有效响应。
综上所述，本发明提供的具有pH响应的恢复型近红外荧光探针在近红外荧光染料中位修饰上对H+敏感的开关，该探针在碱性条件下是没有荧光的，当pH减低时，开关被触发，探针发出荧光，在pH5.0～7.5时，荧光强度随着pH的降低而逐渐增强，并且在pH5.9～6.9范围内二者呈现很好的线性关系，且具有较好的可逆响应pH的能力，可以实现对pH的有效检测。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (5)
1.一种具有pH响应的恢复型近红外荧光探针，其特征在于，化学结构式如式(Ⅰ)所示：
式中，X为C(CH3)2，Y为碘，Z为NH，R1和R2均为H，R3和R4均为乙基。
2.一种具有pH响应的恢复型近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分别提供化学结构式如式(Ⅱ)和式(Ⅲ)所示的化合物；
式中，X为C(CH3)2，Y为碘，R1和R2均为H，R3和R4均为乙基，R6为氨基；
(2)将所述化学结构式如式(Ⅱ)和式(Ⅲ)所示的化合物按照摩尔比为1:1.2-1:10的比例溶解在溶剂中，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、乙腈或乙醇，再加入缚酸剂，所述缚酸剂为三乙胺、N，N-二异丙基乙胺或吡啶，所述缚酸剂与所述化学结构式如式(Ⅱ)的化合物的摩尔比为1.2:1-4:1，保护气体氛围下，在40℃-80℃反应4-10h，提纯后得到具有pH响应的恢复型近红外荧光探针，所述具有pH响应的恢复型近红外荧光探针化学结构式如式(Ⅰ)所示；
式中，X为C(CH3)2，Y为碘，Z为NH，R1和R2均为H，R3和R4均为乙基。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述提纯的方法为：反应结束后旋蒸除去溶剂，真空干燥12h，过硅胶柱，用二氯甲烷和甲醇的混合溶液进行梯度洗脱，除去溶剂，即得所述具有pH响应的恢复型近红外荧光探针。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述化学结构式如式(Ⅲ)所示的化合物采用以下方法制得：
将化学式为化合物和4-甲醛吡啶按摩尔比为5:1-3:1的比例溶解在第二溶剂中，冰浴条件下，在保护气体下进行缩合反应0.5-2h，R6为氨基；然后加入硼氢化钠，进行还原反应2-3h，所述硼氢化钠与所述4-甲醛吡啶的摩尔比为1:1-2:1，提纯后制得化学式如式(Ⅲ)所示的化合物。
5.如权利要求1所述的具有pH响应的恢复型近红外荧光探针应用于制备肿瘤检测、诊断、治疗或诊疗的药物。
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