CN106929004B - 一种信号增强型近红外荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种信号增强型近红外荧光探针，化学结构式如式(Ⅰ)所示：(Ⅰ)，式(Ⅰ)中，X1为‑S‑或‑Se‑，R'为C1‑12的亚烷基，X2为‑C(CH3)2‑、‑O‑、‑S‑或‑Se‑，R1和R2分别独立地选自H原子、C1‑18烷基或如SO3R5所示的基团，其中，R5为C1‑18烷基或苄基，R3和R4分别独立地选自C1‑18烷基或苄基，Y为氟、氯、溴或碘。该探针的激发、发射光均在近红外光区，stocks位移较大、背景干扰少，对硫醇有较高的灵敏度、高选择性，同时探针的毒性低，对细胞和活体伤害较小，很适合用来进行生物体内硫醇的检测。本发明还提供了该探针的制备方法及应用。

Description

一种信号增强型近红外荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及有机探针分子技术领域，具体涉及一种信号增强型近红外荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
硫醇(即，含巯基的化合物)在生命系统中起到非常重要的作用，例如，谷胱甘肽(GSH)可以维持细胞内的氧化还原、细胞内的信号转换等，半胱氨酸(Cys)可以作为细胞外的还原剂，合成蛋白质的决定性底物等。某些硫醇的水平与许多疾病(如牛皮癣、肝脏损伤、艾滋病)和癌症有直接关联，由于硫醇的作用很重要，开发和研究检测硫醇的探针具有重要的意义。
荧光探针是有效检测生命体内硫醇的手段之一，相对于其他检测方法，使用荧光探针法进行硫醇检测具有灵敏度高、选择性好等优点，但目前大部分pH探针波长较短，不能避开组织自吸收和自荧光，背景干扰较强，部分stocks位移小，紫外吸收波谱和荧光光谱重叠较大，信噪比低，毒性较大，不能用于细胞和活体pH检测。而近红外荧光探针的最大吸收波长和发射波长为600～900nm，可避免背景干扰。因此，近红外荧光检测在生物样品分析中有明显的优越性。
因此，设计合成具有大的Stokes位移、背景干扰少、能快速检测硫醇的近红外荧光探针非常有必要。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种信号增强型近红外荧光探针及其制备方法和应用。在硫醇存在下，所述信号增强型近红外荧光探针的激发、发射均在近红外光区，stocks位移较大、背景干扰少，对硫醇有较高的灵敏度、高选择性，同时探针的毒性低，对细胞和活体伤害较小，很适合用来进行生物体内硫醇的检测。
本发明第一方面提供了一种信号增强型近红外荧光探针，其化学结构式如式(Ⅰ)所示：
式(Ⅰ)中，X1为-S-或-Se-，R'为C1-12的亚烷基，X2为-C(CH3)2-、-O-、-S-或-Se-，R1和R2分别独立地选自H原子、C1-18烷基或如SO3R5所示的基团，其中，R5为C1-18烷基或苄基，R3和R4分别独立地选自C1-18烷基或苄基，Y为氟、氯、溴或碘。
优选地，所述X1为-S-。
优选地，所述R'为-CH2CH2-。
优选地，所述X2为-C(CH3)2-。
优选地，所述R1和所述R2均为H原子。
优选地，所述R3和所述R4均为乙基。
优选地，所述Y为碘。
进一步优选地，所述X1为-S-，所述R'为-CH2CH2-，所述X2为-C(CH3)2-，所述R1和所述R2均为H原子，所述R3和所述R4均为乙基，所述Y为碘。
本发明中所述信号增强型近红外荧光探针，基于荧光聚集淬灭原理，通过含二硫键或二硒键的连接体-NH-R'-X1-X1-R'-NH-(X1为-S-或-Se-)将两个近红外花菁类荧光染料分子连接形成，由于两个荧光分子的距离被拉近，表现出荧光猝灭；该探针中的二硫键或二硒键作为反应位点，当在硫醇分子存在下，硫醇会与之发生反应导致二硫键或二硒键锻炼，两个荧光基团分离，距离被拉远，从而使该探针的荧光大大增强。
在硫醇分子存在下，该探针的最大发射波长在755nm，能有效避开组织自吸收和自荧光，最大激发为620nm，stocks位移高达135nm，背景干扰小、信噪比较高；同时，该探针的毒性低，在检测情况下，该探针的激发波长较长，位于近红外区域，对细胞和活体伤害较小，且穿透力强，由于该探针是基于荧光聚集淬灭原理，在硫醇分子存在下，荧光信号实现从无到有，信号变化非常明显，易于对硫醇进行定性、定量检测。
本发明第一方面提供的所述信号增强型近红外荧光探针的stocks位移较大、背景干扰少，对硫醇有较高的灵敏度、高选择性，同时探针的毒性低，对细胞和活体伤害较小，很适合用来进行生物体内硫醇的检测。
本发明第二方面提供了一种信号增强型近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)分别提供化学结构式如式(Ⅱ)的化合物以及如式(Ⅲ)所示化合物的盐酸盐或其硫酸盐：
式中，X1为-S-或-Se-，R'为C1-12的亚烷基，X2为-C(CH3)2-、-O-、-S-或-Se-，R1和R2分别独立地选自H原子、C1-18烷基或如SO3R5所示的基团，其中，R5为C1-18烷基或苄基，R3和R4分别独立地选自C1-18烷基或苄基，Y为氟、氯、溴或碘；
(2)将式(Ⅱ)所示的化合物与如式(Ⅲ)所示化合物的盐酸盐或其硫酸盐按照摩尔比为(1.5-4)：1的比例溶解在溶剂中，再加入缚酸剂，保护气体氛围下，在30-75℃下反应3-10h，提纯后得到信号增强型近红外荧光探针，所述信号增强型近红外荧光探针的化学结构式如式(Ⅰ)所示：
式(Ⅰ)中，X1为-S-或-Se-，R'为C1-12的亚烷基，X2为-C(CH3)2-、-O-、-S-或-Se-，R1和R2分别独立地选自H原子、C1-18烷基或如SO3R5所示的基团，其中，R5为C1-18烷基或苄基，R3和R4分别独立地选自C1-18烷基或苄基，Y为氟、氯、溴或碘。
优选地，所述X1为-S-。
优选地，所述R'为-CH2CH2-。
优选地，所述X2为-C(CH3)2-。
优选地，所述R1和所述R2均为H原子。
优选地，所述R3和所述R4均为乙基。
优选地，所述Y为碘。
进一步优选地，所述X1为-S-，所述R'为-CH2CH2-，所述X2为-C(CH3)2-，所述R1和所述R2均为H原子，所述R3和所述R4均为乙基，所述Y为碘。
本发明中，所述如式(Ⅲ)所示化合物的盐酸盐或其硫酸盐，为如式(Ⅲ)所示化合物的盐酸盐形式，或如式(Ⅲ)所示化合物的硫酸盐形式。举例来说，当式(Ⅲ)中，所述X1为-S-，所述R'为-CH2CH2-时，式(Ⅲ)所示化合物的盐酸盐形式为(CAS号为：56-17-17，又称为胱铵二盐酸盐)；式(Ⅲ)所示化合物的硫酸盐形式为
优选地，所述将式(Ⅱ)所示的化合物与如式(Ⅲ)所示化合物的盐酸盐或其硫酸盐按照摩尔比为(1.5-4)：1的比例溶解在溶剂中，再加入缚酸剂，具体为：
将所述式(Ⅲ)所示化合物的盐酸盐或其硫酸盐和缚酸剂溶解在溶剂中，得到第一混合溶液，将所述式(Ⅱ)所示的化合物溶解在溶剂中，得到第二混合溶液，然后将所述第二混合溶液逐滴加入到第一混合溶液中。
优选地，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈和甲醇的一种或多种。
优选地，所述缚酸剂为三乙胺、N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)或吡啶。
优选地，所述缚酸剂与所述化学结构式如式(Ⅲ)的化合物的摩尔比为(1.2-2)：1。
优选地，所述保护气体为氮气、氩气或氦气。
优选地，所述提纯的方法为：反应结束后，旋蒸除去溶剂，并再加入二氯甲烷，采用湿法过硅胶柱，用二氯甲烷和甲醇的混合溶液进行梯度洗脱，除去溶剂，即得所述信号增强型近红外荧光探针。
本发明第二方面提供的一种信号增强型近红外荧光探针的制备方法，该制备方法简单易操作。
本发明第三方面提供了第一方面所述的信号增强型近红外荧光探针在检测硫醇中的应用。即，所述探针可以应用于制备硫醇检测、诊断或治疗的药物中。
本发明中，所述硫醇包括含巯基的化合物，如谷胱甘肽，半胱氨酸，二硫苏糖醇和苯硫酚中的一种或多种，但不限于此。
在硫醇分子存在下，该探针的最大发射波长在755nm，最大激发为620nm，stocks位移高达135nm，能有效避开组织自吸收和自荧光、背景干扰小、信噪比较高；同时，该探针的毒性低，在检测情况下，该探针的激发波长较长，位于近红外区域，对细胞和活体伤害较小，且穿透力强，由于该探针是基于荧光聚集淬灭原理，在硫醇分子存在下，荧光信号实现从无到有，信号变化非常明显，易于对硫醇进行定性、定量检测。
综上，本发明提供的一种信号增强型近红外荧光探针及其制备方法和应用的有益效果包括以下几个方面：
(1)所述信号增强型近红外荧光探针的激发、发射波长均在近红外区，对细胞或组织的穿透力强，样本损伤小，该探针的stocks位移大，背景干扰小，信噪比较高；
(2)所述信号增强型近红外荧光探针的制备方法简单易操作；
(3)所述信号增强型近红外荧光探针基于荧光聚集淬灭原理而形成，在对硫醇检测时，荧光信号从无到有，变化明显，且该探针对硫醇线性相关性较好，易于对硫醇进行定性、定量检测；
(4)所述信号增强型近红外荧光探针的毒性低，带正电，在细胞膜负电的作用下能很快进入细胞内检测细胞或组织内的硫醇。
附图说明
图1为实施例1制得的信号增强型近红外荧光探针的高分辨质谱图；
图2为实施例1制得的信号增强型近红外荧光探针(CYSSCY)的荧光强度随谷胱甘肽(GSH)浓度的变化曲线图；
图3为实施例1制得的探针CYSSCY在不同浓度的GSH下的荧光强度图；
图4为实施例1制得的探针CYSSCY的荧光强度与不同浓度的GSH的线性关系图；
图5为实施例1制得的探针CYSSCY的细胞毒性测试结果图；
图6为实施例1制得的探针CYSSCY对Hela细胞内硫醇的荧光成像图；
图7为实施例1制得的探针CYSSCY对荷瘤老鼠的荧光成像图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例1：
一种信号增强型近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
室温下，在25mL圆底烧瓶中加入胱胺二盐酸盐(81mg,0.36mmol)、1.5mL甲醇、60μL三乙胺，再加入2mL乙腈，快速搅拌约0.5小时后，溶液变透明，胱胺二盐酸盐全部溶解，得到第一混合溶液；
然后把(简写为Cy.7.Cl，345.6mg,0.54mmol)溶解在4mL乙腈中，得到第二混合溶液，然后将其用滴液漏斗滴加到上述第一混合溶液中，滴加速度大概为1滴/20s，在氮气保护下30℃反应3小时。旋去溶剂，用硅胶柱纯化，将样品用二氯甲烷溶解，湿法上样，洗脱剂用二氯甲烷：甲醇从200:1到20:1进行梯度洗脱，旋去溶剂，浓缩后得到靛蓝色粉末状固体CYSSCY(180.7mg，0.13mmol)，产率：36％，该粉末状固体即信号增强型近红外荧光探针
反应方程式为：
对实施例1得到的信号增强型近红外荧光探针进行UPLC-TOF-MS质谱测试，测试结果如图1所示，图1为实施例1制得的探针的高分辨质谱图。从图1中可以看出，通过质谱测出的分子离子峰M+为551.3339，符合C72H90N6S2 2+的理论分子量551.3326。
实施例2：
一种信号增强型近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
室温下，在25mL圆底烧瓶中加入胱胺二盐酸盐(81mg,0.36mmol)、1.5mL甲醇、99.84μL三乙胺(0.72mmol)，再加入2mL的DMF，快速搅拌约0.5小时后，溶液变透明，胱胺二盐酸盐全部溶解，得到第一混合溶液；
然后把(简写为Cy.7.Cl，919.44mg,1.44mmol)溶解在4mL的DMF中，得到第二混合溶液，然后将其用滴液漏斗滴加到上述第一混合溶液中，滴加速度大概为1滴/20s，加热，在氮气保护下75℃反应10小时。旋去溶剂，用硅胶柱纯化，将样品用二氯甲烷溶解，湿法上样，洗脱剂用二氯甲烷：甲醇从200:1到20:1进行梯度洗脱，旋去溶剂，浓缩后得到靛蓝色粉末状固体CYSSCY(111.2mg，0.08mmol)，产率：21％，该粉末状固体即信号增强型近红外荧光探针
实施例3：
一种信号增强型近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
室温下，在25mL圆底烧瓶中加入胱胺二盐酸盐(81mg,0.36mmol)、1.5mL甲醇、74.88μL三乙胺(0.54mmol)，再加入2mL的DMF，快速搅拌约0.5小时后，溶液变透明，胱胺二盐酸盐全部溶解，得到第一混合溶液；
然后把(简写为Cy.7.Cl，919.44mg,1.44mmol)溶解在4mL的DMF中，得到第二混合溶液，然后将其用滴液漏斗滴加到上述第一混合溶液中，滴加速度大概为1滴/20s，加热，在氮气保护下40℃反应5小时。旋去溶剂，用硅胶柱纯化，将样品用二氯甲烷溶解，湿法上样，洗脱剂用二氯甲烷：甲醇从200:1到20:1进行梯度洗脱，旋去溶剂，浓缩后得到靛蓝色粉末状固体CYSSCY(143.0mg，0.103mmol)，产率：27％，该粉末状固体即信号增强型近红外荧光探针
实施例4：
一种信号增强型近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
室温下，在25mL圆底烧瓶中加入胱胺二盐酸盐(81mg,0.36mmol)、1.5mL甲醇、74.88μL三乙胺，再加入2mL的DMF，快速搅拌约0.5小时后，溶液变透明，胱胺二盐酸盐全部溶解，得到第一混合溶液；
然后把(简写为Cy.7.Cl，459.72mg,0.72mmol)溶解在4mL的DMF中，得到第二混合溶液，然后将其用滴液漏斗滴加到上述第一混合溶液中，滴加速度大概为1滴/20s，加热，在氮气保护下50℃反应6小时。旋去溶剂，用硅胶柱纯化，将样品用二氯甲烷溶解，湿法上样，洗脱剂用二氯甲烷：甲醇从200:1到20:1进行梯度洗脱，旋去溶剂，浓缩后得到靛蓝色粉末状固体CYSSCY(153.6mg，0.111mmol)，产率：29％，该粉末状固体即信号增强型近红外荧光探针
效果实施例
对谷胱甘肽(GSH)溶液的荧光测试
将实施例1制得的信号增强型近红外荧光探针(CYSSCY)配置成探针浓度为20μM的DMSO/PBS(pH＝7.4,V/V＝9:l)的测试溶液100mL，每次取0.5mL加入已配好的不同浓度的谷胱甘肽(GSH)溶液，使探针RBSSCY分子的终浓度为10μM，谷胱甘肽终浓度分别为0μM，1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM，10μM，11μM，12μM，13μM，14μM，15μM，16μM，17μM，18μM，19μM，20μM，40μM，60μM，80μM，100μM，测试探针的荧光强度与谷胱甘肽浓度的变化关系，结果如图2-4所示。图2为该探针在620nm的激发波长下的荧光强度随GSH的浓度的变化曲线图；图3为在激发波长为620nm、发射波长为755nm处，该探针与不同浓度的GSH的荧光强度图；图4为该探针的荧光强度与不同浓度的GSH的线性关系图。
从图2-图3可以看出，随着GSH的加入，探针CYSSCY的荧光强度逐渐增强，并在GSH的浓度为0-20μM时，CYSSCY的荧光强度随GSH浓度有规律的变化，经过拟合，发现探针CYSSCY的浓度为10μM，GSH浓度在4μM-18μM时，CYSSCY的荧光强度与GSH的浓度有很好的线性关系(如图4)，相关系数R为0.99763，经计算得，GSH的检测下限是0.51μM。
细胞毒性实验
以Hela细胞为例，将实施例1制得的信号增强型近红外荧光探针(CYSSCY)配置在血清溶液中，分别配成浓度为0.1μM、1μM、5μM、10μM、30μM、60μM、90μM的各组，通过MTT法进行细胞毒性实验，其细胞毒性的结果如图5所示，从图5可以看出，探针CYSSCY在浓度0.1-10μM时，细胞存活率高达85％以上，这说明该探针的毒性很低，可以用于细胞内硫醇的检测。
体外肿瘤细胞内的硫醇检测
采用实施例1制得的信号增强型近红外荧光探针(CYSSCY)对Hela细胞内的硫醇进行检测，将该探针配制在牛血清中，控制探针浓度为5μM，采用德国Leica TCS SP5共聚焦显微镜进行荧光成像，收集576±25mn和756±25nm波长范围内的荧光，结果如图6所示。图6中A为空白试验，E为加入了探针CYSSCY的Hela细胞，C为加入了硫醇清除剂(N-乙基马来酰亚胺1mM)的Hela细胞，G为加入了硫醇清除剂(N-乙基马来酰亚胺1mM)培养3小时后又加入探针CYSSCY的Hela细胞，B、F、D、H分别为A、E、C、G相应的明场成像图。当将所述探针CYSSCY对原本含有硫醇的Hela细胞进行培养时(E)，可以很明显地看到该探针在激光光激发下发出强烈的红色荧光，且Hela细胞的背景荧光干扰很小，而当将该探针CYSSCY对经一定量的硫醇清除剂清理后的Hela细胞进行培养时(C)，由于处理后的Hela细胞内含的硫醇分子很少，该探针分子内的二硫键几乎不会被打断，该探针分子内的荧光聚集猝灭效应依然存在，故观察到的荧光较弱；而在经硫醇清除剂清理后3h，Hela细胞又恢复了产生硫醇分子的能力，又可以与该探针的二硫键反应，将原探针内的两个荧光染料基团分离，消除荧光聚集猝灭效应，从而表现出较强的荧光信号。以上对比说明，该探针CYSSCY对Hela细胞内的硫醇分子有很好的检测效果，为其应用于生物活体内硫醇的检测奠定了基础。
动物活体内硫醇的检测
将实施例1制得的信号增强型近红外荧光探针(CYSSCY)配制成浓度0.04mg/mL的PBS溶液，采用裸鼠作为研究对象，对荷瘤老鼠进行0.2mg/kg剂量的探针尾椎静脉注射，将探针CYSSCY分子注入荷瘤老鼠体内，注射0、4h、14h、24h内的肿瘤部位的成像效果如图7所示，采用600nm的红光激发，采集700-900nm的荧光信号。
从如图7可以看出，在注射探针14小时后，肿瘤部位发射出的荧光强度远远高于其他部位，而且非常清晰，而且一直持续到24小时，成功检测出小鼠肿瘤部位。结果表明，该近红外探针CYSSCY在肿瘤的检测中具有巨大的价值，另外，小动物活体成像具有较高的灵敏度，能够客观地评价荧光探针CYSSCY的靶向显象过程以及检测效果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种信号增强型近红外荧光探针，其特征在于，其化学结构式如式(Ⅰ)所示：
式(Ⅰ)中，X1为-S-，R'为-CH2CH2-，X2为-C(CH3)2-、-O-、-S-或-Se-，R1和R2分别独立地选自H原子、C1-18烷基或如SO3R5所示的基团，其中，R5为C1-18烷基或苄基，R3和R4分别独立地选自C1-18烷基或苄基，Y为氟、氯、溴或碘。
2.如权利要求1所述的近红外荧光探针，其特征在于，所述X2为-C(CH3)2-，所述R1和所述R2均为H原子，所述R3和所述R4均为乙基，所述Y为碘。
3.一种信号增强型近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分别提供化学结构式如式(Ⅱ)所示的化合物以及如式(Ⅲ)所示化合物的盐酸盐或其硫酸盐：
式中，X1为-S-，R'为-CH2CH2-，X2为-C(CH3)2-、-O-、-S-或-Se-，R1和R2分别独立地选自H原子、C1-18烷基或如SO3R5所示的基团，其中，R5为C1-18烷基或苄基，R3和R4分别独立地选自C1-18烷基或苄基，Y为氟、氯、溴或碘；
(2)将式(Ⅱ)所示的化合物与如式(Ⅲ)所示化合物的盐酸盐或其硫酸盐按照摩尔比为(1.5-4)：1的比例溶解在溶剂中，再加入缚酸剂，保护气体氛围下，在30-75℃下反应3-10h，提纯后得到信号增强型近红外荧光探针，所述信号增强型近红外荧光探针的化学结构式如式(Ⅰ)所示：
式(Ⅰ)中，X1为-S-，R'为-CH2CH2-，X2为-C(CH3)2-、-O-、-S-或-Se-，R1和R2分别独立地选自H原子、C1-18烷基或如SO3R5所示的基团，其中，R5为C1-18烷基或苄基，R3和R4分别独立地选自C1-18烷基或苄基，Y为氟、氯、溴或碘。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、乙腈和甲醇的一种或多种。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述缚酸剂为三乙胺、N，N-二异丙基乙胺或吡啶。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述缚酸剂与所述化学结构式如式(Ⅲ)化合物的盐酸盐或其硫酸盐的摩尔比为(1.2-2)：1。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述将式(Ⅱ)所示的化合物与式(Ⅲ)所示化合物的盐酸盐或其硫酸盐按照摩尔比为(1.5-4)：1的比例溶解在溶剂中，再加入缚酸剂，具体为：
将所述式(Ⅲ)所示的化合物和缚酸剂溶解在溶剂中，得到第一混合溶液，将所述式(Ⅱ)所示的化合物溶解在溶剂中，得到第二混合溶液，然后将所述第二混合溶液逐滴加入到所述第一混合溶液中。
8.如权利要求1或如权利要求3所述的制备方法制得的信号增强型近红外荧光探针在制备用于检测硫醇的探针中的应用。
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