CN104004514A

CN104004514A - 一种检测三价铋离子的对称双罗丹明荧光探针及制备方法和用途

Info

Publication number: CN104004514A
Application number: CN201410247133.9A
Authority: CN
Inventors: 高勇; 申川川; 陈庆华; 余喜娣; 张晓伟; 付妹
Original assignee: Fujian Normal University
Current assignee: Fujian Normal University
Priority date: 2014-06-06
Filing date: 2014-06-06
Publication date: 2014-08-27
Anticipated expiration: 2034-06-06
Also published as: CN104004514B

Abstract

本发明公开一种检测三价铋离子的对称双罗丹明荧光探针及制备方法和用途，该种荧光探针具有下列结构通式：其中：R₁、R₂、R₃、R₄同时采用氢，或者R₁、R₂、R₃或R₄选自氢、2-6个碳原子烷基或4-8个碳原子环烷基中的一种；n是介于2-9之间的自然数。所述的对称双罗丹明荧光探针用于溶液体系中三价铋离子的检测、生物活细胞和活组织内的三价铋离子的分析检测和荧光成像检测或医学上对于三价铋离子的检测。

Description

一种检测三价铋离子的对称双罗丹明荧光探针及制备方法和用途

技术领域

本发明属于荧光探针及其制备领域，特别涉及一种检测三价铋离子的对称双罗丹明荧光探针及制备方法和用途。

背景技术

铋位于元素周期表第六周期第ⅤA族，处于金属和非金属的交界处，是一种原子数很大而无毒性的元素，被认为是最安全的绿色金属。自然界中的铋主要以三价和五价形式存在。许多三价铋离子化合物都具有生物活性，被用做抗菌和抗癌类药物。例如，枸橼酸铋雷尼替丁是被众多国家批准的治疗消化性溃疡和根除幽门螺杆菌的新化合物（Metal Ions In Biological Systems, 41, 333-378）。²¹²Bi和²¹³Bi化合物可用来作为针对放射疗法的药物治疗癌症，且副作用比顺铂小（化学进展, 2008, 20(9), 1315-1323）。

虽然含铋化合物作为治疗胃溃疡的药物已经在临床上使用多年，但它的作用机理并不十分明确。研究三价铋与生物分子如多肽、蛋白质和酶等目标靶的相互作用方式，将使我们更好地理解含铋化合物的作用机理，进一步推动铋在医药上的应用。此外，虽然一般认为铋是一种无毒的元素，但是铋是人和生物体非必需的微量元素，近年来科学家们发现长期过量的服用一些三价铋制剂也会可引起肾损伤，造成肾小管退化坏死，也能造成肝的脂肪性变和坏死，少数中毒可导致神经系统机能性障碍和失调，甚至出现神经错乱。因此对于生物体系中三价铋离子的检测及其生理特性和药物特性的研究引起了广泛的关注，相关研究将有助于更好的研发出新型有效的抗菌和抗癌药物。

目前对于铋离子的检测主要采用火焰原子吸收光谱、电热原子吸收光谱、原子发射光谱、原子荧光光谱、X-射线荧光光谱等方法，这些方法对于样品都有破坏性，不适用于生物样品和生物体系的原位检测。

荧光分子探针法具有灵敏度高、专一性强、无损伤、快速、准确等特点在检测生命体内金属离子方面显示出了独特的优势，并广泛的应用于金属离子参与的生物学研究（Inorg. Chim. Acta, 2012, 381, 2-14）。罗丹明B又称玫瑰红B,罗丹明基荧光探针具有良好的荧光性能和较小的细胞毒性，广泛的应用于生物体内离子及小分子的检测、生物大分子的分析和检测以及复杂生物体系的研究等领域。该类探针在识别前后荧光呈现从无到有的增强型响应，具有很高的灵敏度，通过对识别基团的精心选择和设计该类探针表现出良好的选择性和抗干扰性（Chem. Rev. 2012, 112, 1910-1956）。令人遗憾的是目前尚未见识别三价铋离子的罗丹明基荧光探针的报道。综上所述，开发一种可检测三价铋离子的罗丹明基荧光探针对于研究三价铋离子的生物活性和药理作用具有重要的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测三价铋离子的对称双罗丹明荧光探针及制备方法和用途，该方法制备的荧光探针通过三价铋离子的络合诱导使罗丹明发生螺环的开环，使得探针分子发生颜色变化（无色到粉红色）和荧光信号的增强，其识别前后的颜色变化可以通过裸眼观察。该探针对三价铋离子具有高度选择性，其他常见离子均无明显干扰，可在pH=7.4的生理环境下工作，具有在生物体系中检测三价铋离子的用途。

本发明的目的之一是提供一种检测三价铋离子的对称双罗丹明荧光探针，其结构式如下：

其中：R₁、R₂、R₃、R₄可以同时氢，或者R₁、R₂、R₃或R₄选自氢、2-6个碳原子烷基或4-8个碳原子环烷基中的一种； n是介于2-9之间的自然数。

本发明的目的之二是提供一种检测三价铋离子的对称双罗丹明荧光探针的制备方法。该方法包括以下步骤：

（1）按罗丹明与二胺类物质摩尔比为1：5-10称取罗丹明溶于无水乙醇中，搅拌至罗丹明完全溶解后，将配比量的二胺类物质缓慢滴加到罗丹明的乙醇溶液中，滴加完毕后在40-60℃下保温反应，冷却到室温，抽滤，蒸馏水洗涤，得到罗丹明二胺中间体，干燥后用于下一步合成；

（2）按罗丹明二胺中间体、双(三氯甲基)碳酸酯与缚酸剂摩尔比为1：1：4-8，称取上述罗丹明二胺中间体和缚酸剂，用干燥的有机溶剂溶解，将配比量的双(三氯甲基)碳酸酯溶解在干燥的有机溶剂中缓慢滴加到溶有罗丹明二胺和缚酸剂的溶液中，滴加完毕后，室温下反应后减压蒸除溶剂，用柱层析分离得到目标产物。

所述步骤（1）中二胺类物质通式为H₂N-(CH₂)n-NH₂，n可以是本领域的常规数值，n优选介于2-9之间的自然数。

所述步骤（2）中缚酸剂采用本领域常规的，缚酸剂优选吡啶或三乙胺。

所述步骤（2）中柱层析所用填料可以是本领域常规的，优选氧化铝。

所述步骤（2）中的有机溶剂可以是本领域常规的，优选至少有一种选自乙腈、二氯甲烷、二甲基亚砜、氯仿、N,N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃。

更具体地说，本发明所述的一种检测三价铋离子的对称双罗丹明荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

1. 将1摩尔罗丹明溶于无水乙醇中，搅拌至罗丹明完全溶解后，将5-10摩尔二胺类物质缓慢滴加到罗丹明的乙醇溶液中，滴加完毕后在50℃保温反应3h-12h，冷却到室温，抽滤，蒸馏水洗涤，得到罗丹明二胺中间体。干燥后可以直接用于下一步合成。

2. 将1摩尔的上述罗丹明二胺中间体和4-8摩尔的缚酸剂，用干燥的有机溶剂溶解，将1摩尔的双(三氯甲基)碳酸酯溶解在干燥的有机溶剂中缓慢滴加到溶有罗丹明二胺和缚酸剂的溶液中，滴加完毕后，室温下保温反应20h-48h。减压蒸除溶剂，用柱层析分离得到目标产物。

所述步骤1中二胺类物质通式为H₂N-(CH₂)n-NH₂，n是介于2-9之间的自然数。

所述步骤2中缚酸剂为吡啶或三乙胺。

所述步骤2中柱层析所用填料为氧化铝。

所述步骤2中有机溶剂为乙腈、二氯甲烷、二甲基亚砜、氯仿、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃，或者它们的混合物。

本发明上述所涉及的一种检测三价铋离子的对称双罗丹明荧光探针的合成反应式为：

本发明的目的之三是提供该荧光探针的用途。

本发明的一种检测三价铋离子的对称双罗丹明荧光探针用于溶液体系中三价铋离子的检测，生物活细胞和活组织内的三价铋离子的分析检测和荧光成像检测，以及医学上对于三价铋离子的检测。

本发明的有益效果是：该系列探针能选择性识别三价铋离子，并且不受其它常见阳离子的干扰，目前文献尚未见罗丹明基三价铋离子荧光探针的报道；该系列探针适用的pH值范围为4-11，这个适用范围可以满足绝大多数生物样品的要求；该系列探针的灵敏度高，检测限可达6.77×10^-8M；细胞实验显示该系列探针对细胞中三价铋离子具有选择性响应，可用于生物体系。

附图说明

图1为本发明实施例3中荧光探针对三价铋离子的选择性荧光发射图。荧光探针的浓度为10μM，各种常见阳离子的浓度是30μM。横坐标为波长（nm），纵坐标为荧光强度，激发波长为520nm。

图2为本发明实施例3中荧光探针在干扰离子共存条件下的荧光强度柱状图。荧光探针的浓度为10μM，Bi³⁺的浓度为30μM，其它干扰离子的浓度为150μM。横坐标为波长（nm），纵坐标为荧光强度，激发波长为520nm。

图3为本发明实施例3中荧光探针对三价铋离子荧光响应的线性关系图。荧光探针的浓度为10μM，横坐标为波长（nm），纵坐标为荧光强度，激发波长为520nm。

图4为本发明实施例3中荧光探针在不同pH值下的紫外吸收光谱图。荧光探针的浓度为10μM，横坐标为波长（nm），纵坐标为紫外吸收强度。

图5为本发明实施例3中荧光探针在Hela细胞中对三价铋离子的显微荧光成像图。图中的左边图是含有三价铋离子的Hela细胞用荧光探针孵育后的荧光成像照片，右边图是亮场照片。

具体实施方式

下述的罗丹明B当采用罗丹明110替换后，其制备对称双罗丹明荧光探针的方法与所得探针的性能同采用罗丹明B一样。

实施例1

（1）在100mL的三颈圆底烧瓶中加入罗丹明B 2.0g（4.18mmoL），无水乙醇15mL，搅拌至罗丹明B完全溶解后，将1.4mL（20.9mmoL）乙二胺缓慢滴加到上述的罗丹明B的乙醇溶液中，滴加完毕后在50℃保温反应6h。反应液静置，冷却到室温，抽滤，得到浅粉色沉淀。用蒸馏水洗涤至洗涤液呈无色且接近中性，得到罗丹明乙二胺中间体1.55g，产率76.5%。m.p. 216℃-217℃（文献值216℃-218℃）。

（2）在100mL三颈圆底烧瓶中加入罗丹明乙二胺中间体 0.60g（1.2mmoL）和0.83mL（6 mmoL）三乙胺，用10mL干燥的二氯甲烷溶解，将溶有0.36g（1.2mmoL）双(三氯甲基)碳酸酯的10mL干燥的二氯甲烷溶液缓慢滴加到烧瓶中，滴加完毕后，室温下反应24h。蒸除溶剂，用中性氧化铝柱层析（乙醇：二氯甲烷=1:100），得到0.48g荧光探针，产率79.3%。m.p.：233℃-234℃。¹HNMR(400 MHz,CDCl₃): δ(ppm)=7.93-7.81(m, 2H, ArH), 7.48-7.40 (m, 4H, ArH), 7.11-7.03 (m, 2H, ArH), 6.47-6.42 (d, J = 8.8 Hz, 4H, ArH), 6.40-6.35 (d, J = 2.5 Hz, 4H, ArH), 6.30-6.24 (dd, J = 8.9, 2.5 Hz, 4H, ArH), 5.07 (s, 2H, NH), 3.38-3.27 (m, 16H, CH₂CH₃), 3.27-3.20 (d, J = 7.5 Hz, 4H, CH₂), 2.99-2.90 (dd, J = 11.0, 5.5 Hz, 4H,CH₂), 1.21-1.12 (m, 24H, CH₂CH₃)；¹³CNMR (100MHz, CDCl₃): δ(ppm) = 169.25 (s), 157.69 (s), 153.84 (s), 153.25 (s), 148.83 (s), 132.49 (s), 130.75 (s), 128.62 (s), 128.00 (s), 123.79 (s), 122.84 (s), 108.19 (s), 105.19 (s), 97.81 (s), 65.36 (s), 44.33 (s), 40.79 (s), 40.29 (s), 12.62 (s)；IR(KBr, cm^-1)：3413.89, 2970.40, 2928.31, 1687.29, 1613.72, 1545.76, 1514.53, 1467.78, 1425.53, 1379.66, 1355.87, 1265.92, 1222.58,1156.50, 1117.76, 1074.08, 1012.26, 820.11, 788.34, 758.91, 703.19； HRMS: Anal. calcd for C₆₁H₇₀O₅N_8:994.5469; found: 995.5507( [M + H⁺] )。

实施例2

（1）在100mL的三颈圆底烧瓶中加入罗丹明B 2.0g（4.18mmoL），无水乙醇15mL，搅拌待罗丹明B完全溶解后，将3.5mL（41.8mmL） 1,3-丙二胺缓慢滴加到烧瓶中，滴加完毕后在50℃保温反应7h。反应液静置，冷却到室温，抽滤，得到浅粉色沉淀。用蒸馏水洗涤至洗涤液呈无色且接近中性，得到罗丹明丙二胺中间体 1.50g，产率72.0%。m.p. 189℃-191℃（文献值188℃-191℃）。

（2）在100mL的三颈圆底烧瓶中加入罗丹明丙二胺中间体 0.5g（1.0mmoL）和0.48mL（6 mmoL）吡啶，用10mL干燥的乙腈溶解，将溶有0.3g（1.0mmoL）双(三氯甲基)碳酸酯的干燥的乙腈缓慢滴加到烧瓶中，滴加完毕后，室温下反应30h。蒸除溶剂，用中性氧化铝柱层析（乙醇：二氯甲烷=1:100），得到0.38g荧光探针，产率74.2%。m.p：231℃-232℃。¹HNMR (400 MHz, CDCl₃): δ(ppm) = 8.97-7.87 (m, 2H, ArH), 7.52-7.40 (m, 4H, ArH), 7.16-7.06 (m, 2H, ArH), 6.48-6.34 (d, J = 8.8 Hz, 8H, ArH), 6.31-6.21 (m, 4H, ArH), 5.61 (s,2H, NH), 3.43-3.27 (m, 16H, CH₂CH₃), 3.27-3.16 (m, 4H, CH₂), 3.03-2.89 (dd, J = 11.3, 5.9 Hz, 4H, CH₂), 2.41-2.22 (m, 4H, CH₂), 1.22-0.91 (m, 24H, CH₂CH₃)；¹³CNMR (100 MHz, CDCl₃): δ(ppm) = 168.54 (s), 153.43 (d, J = 14.9 Hz), 148.85 (s), 132.39 (s), 131.26 (s), 130.92 (s), 128.80 (d, J = 9.1 Hz), 128.06 (s), 123.79 (s), 122.79 (s), 108.10 (s), 105.50 (s), 97.73 (s), 65.57 (s), 44.37 (s), 36.86 (s), 30.58 (s), 28.25 (s), 19.19 (s), 13.73 (s), 12.59 (s)；IR(KBr, cm^-1): 3413.47, 2968.17, 2929.44, 1685.17, 1613.68, 1545.85, 1514.64, 1467.23, 1426.39, 1391.96, 1354.92, 1303.26, 1267.49, 1222.50, 1118.50, 1075.76, 1017.28, 820.37, 787.76, 758.17, 702.63；HRMS: Anal. calcd for C₆₃H₇₄O₅N_8:1022.5782; found: 1023.5793( [M + H⁺] )。

实施例3

（1）：在100mL的三颈圆底烧瓶中加入罗丹明B 4.0g（8.36mmoL），无水乙醇20mL，搅拌至罗丹明B完全溶解后，将6.7mL（66.88mmoL）1,4-丁二胺缓慢滴加到烧瓶中，滴加完毕后保温50℃反应8h。反应液静置，冷却到室温，抽滤，得到浅粉色沉淀。用蒸馏水洗涤至洗涤液呈无色且接近中性，得到罗丹明丁二胺中间体2.36g，产率56.0%。

（2）在100mL的三颈圆底烧瓶中加入罗丹明丁二胺中间体 0.6g（1.2mmoL）和0.83mL（6 mmoL）三乙胺，用10mL已干燥的二氯甲烷溶解，将溶有0.36g（1.2mmoL）双(三氯甲基)碳酸酯的10mL干燥的二氯甲烷溶液缓慢滴加到烧瓶中，室温下反应48h。蒸除溶剂，用中性氧化铝柱层析（乙醇：二氯甲烷=1:100），得到0.42g荧光探针，产率68.3%。m.p：225℃-226℃。¹HNMR (400 MHz, CDCl₃): δ(ppm)= 7.91-7.85 (m, 2H, ArH), 7.45-7.39 (m, 4H, ArH), 7.11-7.03 (m, 4H, ArH), 6.46-6.33 (m, 8H, ArH), 6.31-6.22 (dd, J = 8.9, 2.6 Hz, 4H, ArH), 4.85 -4.76 (s, 2H, NH), 3.39-3.27 (m, 16H,CH₂CH₃), 3.17-3.07 (dt, J = 14.7, 7.3 Hz, 4H, CH₂), 3.05-2.92 (dd, J = 12.7, 6.7 Hz, 4H, CH₂), 1.95-1.71 (m, 8H, CH₂), 1.20-1.11 (m, 24H, CH₂CH₃)；¹³CNMR (100 MHz, CDCl₃): δ(ppm) = 168.27 (s), 158.35 (s), 153.62 (s), 153.30 (s), 148.78 (s), 132.29 (s), 131.29 (s), 128.90 (s), 128.00 (s), 123.75 (s), 122.69 (s), 108.10 (s), 105.75 (s), 97.82 (s), 65.00 (s), 44.39 (s), 39.80 (s), 39.59 (s), 26.99 (s), 25.64 (s), 12.60 (s)；IR(KBr, cm^-1): 3414.48, 2969.35, 2928.39, 1689.44, 1613.73, 1547.17, 1513.79, 1467.03, 1421.42, 1356.33, 1326.25, 1304.33, 1265.30, 1221.52, 1117.61, 820.54, 787.85, 758.27, 702.07；HRMS: Anal. calcd for C₆₅H₇₈O₅N_8:1050.6095; found: 1051.6109( [M + H⁺] )。

实施例4

使用实施例3制得的荧光探针评价对三价铋离子的选择性。图1是在浓度为10μM的实施例3制得的荧光探针的乙醇/水(v/v, 1:1, pH=7.0)溶液中加入30μM的各种金属离子时溶液荧光强度的变化。荧光激发波长为520nm。从图中可以看到，向实施例3制得的荧光探针溶液中加入30μM的K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Ba²⁺、Hg²⁺、Fe³⁺、Al³⁺、Cr³⁺、Sn²⁺、Co²⁺等金属离子时，荧光光谱在500-700nm之间无发射峰。但加入30μM的Bi³⁺后，荧光光谱在583nm处荧光强度明显增强，出现一个新的发射峰。这说明该探针对三价铋离子具有良好的选择性。

实施例5

使用实施例3制得的荧光探针评价探针在其他离子存在下检测三价铋离子的抗干扰性。图2是在浓度为10μM的实施例3制得的荧光探针的乙醇/水(v/v, 1:1, pH=7.0)溶液中，先分别加入150μM的干扰离子（K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Ba²⁺、Hg²⁺、Fe³⁺、Al³⁺、Cr³⁺、Sn²⁺、Co²⁺），再加入30μM的Bi³⁺，以520nm为激发波长，分别测试Bi³⁺加入前后的溶液荧光光谱（图中纵坐标柱短、颜色深的是未加Bi³⁺，纵坐标柱长、颜色浅的是已加Bi³⁺），以最大发射峰位置（583nm）的荧光强度为纵坐标，金属离子为横坐标，作二维柱状图。从图中可以看出，在其它干扰离子共存的条件下，该探针对Bi³⁺仍有很好的识别能力，表现出良好的抗干扰能力。

实施例6

使用实施例3制得的荧光探针评价探针的荧光强度与三价铋离子浓度的线性关系。图3是浓度为10μM的实施例3制得的荧光探针的乙醇/水(v/v, 1:1, pH=7.0)溶液在583nm处的荧光强度随Bi³⁺浓度的变化曲线图。由图可知当Bi³⁺浓度在3.75×10^-6mol/L- 4×10^-5mol/L范围内逐渐增大时，体系的荧光强度逐渐增强，该探针浓度与Bi³⁺的浓度呈线性关系，线性相关系数为0.9933，对Bi³⁺的检测限为6.77×10^-8M。

实施例7

使用实施例3制得的荧光探针评价pH值对探针稳定性的干扰。图4是浓度为10μM的实施例3制得的荧光探针的乙醇/水(v/v, 1:1)溶液在pH= 2-11范围内的紫外吸收光谱图。从图中可以看出，该探针在pH≤4的酸性环境下，在560nm处出现新的紫外吸收峰，这说明罗丹明螺环打开。当pH= 4-11时，在500~650nm之间无紫外吸收峰，说明该探针可稳定存在。由上述可知该探针适用的pH值范围为4-11。

实施例8

使用实施例3制得的荧光探针用于活细胞成像，具体步骤如下。Hela细胞用含10%胎牛血清RPMI 1640培养基，在37℃、5%CO₂培养箱中培养。细胞在0.17mm的盖玻片上贴壁14小时，然后用20μM三价铋离子溶液在培养箱中孵育30分钟，取出后用PBS洗板3次；再加以实施例3制得的10μM荧光探针溶液，同样条件孵育30分钟，然后再用PBS洗板3次，移至荧光显微镜下观察，其在Hela细胞中对三价铋离子的显微荧光成像图见图5，图中的左边图是含有三价铋离子的Hela细胞用荧光探针孵育后的荧光成像照片，从此荧光成像照片中可以观察到细胞质内有很强的荧光，右边图是亮场照片，此亮场照片表明细胞在实验过程中仍保持正常的细胞活力。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims

1.一种检测三价铋离子的对称双罗丹明荧光探针，其特征在于该种荧光探针具有下列结构通式：

其中：R₁、R₂、R₃、R₄同时采用氢，或者R₁、R₂、R₃或R₄选自氢、2-6个碳原子烷基或4-8个碳原子环烷基中的一种；n是介于2-9之间的自然数。

2.一种权利要求1所述的检测三价铋离子的对称双罗丹明荧光探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的一种检测三价铋离子的对称双罗丹明荧光探针的制备方法，其特征在于所述步骤（1）中二胺类物质通式为H₂N-(CH₂)n-NH₂，n是介于2-9之间的自然数。

4.根据权利要求2或3所述的一种检测三价铋离子的对称双罗丹明荧光探针的制备方法，其特征在于所述步骤（2）中缚酸剂为吡啶或三乙胺。

5.根据权利要求2所述的一种检测三价铋离子的对称双罗丹明荧光探针的制备方法，其特征在于所述步骤（2）中柱层析所用填料为氧化铝。

6.根据权利要求4所述的一种检测三价铋离子的对称双罗丹明荧光探针的制备方法，其特征在于所述步骤（2）中的有机溶剂至少有一种选自乙腈、二氯甲烷、二甲基亚砜、氯仿、N,N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃。

7.权利要求1所述的一种检测三价铋离子的对称双罗丹明荧光探针的用途，其特征在于所述的对称双罗丹明荧光探针用于溶液体系中三价铋离子的检测、生物活细胞和活组织内的三价铋离子的分析检测和荧光成像检测或医学上对于三价铋离子的检测。