CN111875611A - 一种抗癌铂前药还原活化的荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

一种抗癌铂前药还原活化的荧光探针及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明合成了一种用于研究基于顺铂支架的抗癌铂（IV）前药还原活化的荧光探针的制备方法与应用，能够专一性检测识别铂（II）（顺铂），该探针的结构式如（1）所示。利用铂IV前药与其铂（II）同源物之间反应活性的差异，设计专门用于检测铂（II）药物的探针。探针以罗丹明6G异羟肟酸为荧光基团，二硫代氨基甲酸酯为识别基团。二硫代氨基甲酸酯可特异性识别铂（II）不受其他生物分子、离子、细菌等干扰。此探针对研究基于顺铂支架的抗癌铂（IV）前药的还原活化具有重要的科研及应用价值。

Description

一种抗癌铂前药还原活化的荧光探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种新型检测抗癌铂（IV）前药还原活化的荧光分子探针及其制备方法和应用。
背景技术
癌症对人类的威胁越来越严重，因此抗癌药物的研究越来越受到学者的关注。在1965年发现其强效抗肿瘤活性后，无机药物顺铂已成为临床上最重要的抗癌药物之一，可用于治疗膀胱癌、卵巢癌、肺癌等。它的成功推动了第二代药物，即卡铂和奥沙利铂的开发，这两种药物也都基于顺铂（II）药效团，这些FDA批准的Pt（II）药物共同构成了一些最广泛使用的化疗药物。然而，尽管这些Pt（II）药物对抗癌有一定的成效，但Pt（II）药物的使用受到高毒性、严重副作用和耐药性的限制。为了解决这些局限性，研究人员开发了稳定的Pt（IV）羧酸盐复合物作为抗癌前药，可通过细胞内还原活化，释放其潜在的细胞毒活性。随着人们越来越重视四价铂配合物，大量的具有抗癌活性的四价铂配合物被合成出来，典型的代表是iproplatin、ormaplatin、LA12、JM216。稳定的Pt（IV）抗癌前药具有替代惯性，难以被血液中的其他亲核试剂所替代，还可以通过调节不同的配基结构来改变Pt（IV）类抗癌药物的抗癌活性，为克服传统铂类药物耐药性提供了有效策略，并且四价铂抗癌药可口服，打破了二价铂药物只能注射给药的现状。
虽然人们对理解和利用这种前药策略作为下一代Pt药物的跳板感兴趣，但缺乏能够直接观察这些临床重要化合物的摄取和积累的工具。据报道，虽然Pt（IV）复合物也已通过使用后标记策略与荧光团进行标记来研究这种前药策略。然而，用这种庞大的有机基团修饰Pt（IV）复合物会改变药效团和它们的摄取特性，从而使它们与顺铂不同。因此，理想的成像探针应该与Pt支架脱离，并且具有足够的选择性以区分复杂细胞环境中的Pt（IV）/ Pt（II）。目前，研究顺铂及其Pt（IV）衍生物之间的关系均依靠活化剂，但细胞中的还原活化剂种类很多，在众多活性剂中筛选出还原效果最好的是现在亟待解决的问题，开发能筛选还原活化剂的工具对于理解Pt（IV）络合物的还原和发挥抗癌作用是具有重要意义的。
发明内容
本发明旨在提供一种具有选择性好、灵敏度高、响应速度快的抗癌铂（IV）前药还原活化的荧光探针及其制备方法与应用。我们提供了一种用于检测顺铂（II）药物的荧光探针，通过探针直接检测Pt（II），我们可以间接确定Pt（IV）前药是否被活化；通过荧光强度的检测，筛查了还原效果最好的活化剂，并考察了pH与氧气对于铂（IV）前药还原活化的影响，为临床上研究Pt（IV）类抗癌药物提供基础。
一种抗癌铂前药还原活化的荧光探针，该探针的结构式如（1）所示：
Figure 418538DEST_PATH_IMAGE001
（1）
化学名称：2-（（3',6'-双（乙基氨基）-2',7'-二甲基-3-氧代螺并[异吲哚啉-1,9'-黄嘌呤] -2-基）氧基）（2-((3',6'-bis(ethylamino)-2',7'-dimethyl-3-oxospiro[isoindoline-1,9'-xanthen]-2-yl)oxy)ethyl diethylcarbamodithioate）。
所述抗癌铂前药还原活化的荧光探针的制备方法，合成路线如下：
Figure 876065DEST_PATH_IMAGE002
。
优选方案，具体制备方法包括：
（1）将罗丹明6G异羟肟酸溶解在DMF或DMSO或DMA中，并加入三乙胺或吡啶，同时加入1,2-二溴乙烷，将反应混合物在50~80 oC下回流3~6 h，除去溶剂，将残余物溶于二氯甲烷中；将有机混合物用水和NaHCO3洗涤，干燥，然后用柱层析分离得中间体：2-(2-溴乙氧基)-3’,6’-二乙胺基-2’,7’-二甲基螺[异吲哚啉-1,9’-氧杂蒽]-3-酮；
（2）将中间体：2-(2-溴乙氧基)-3’,6’-二乙胺基-2’,7’-二甲基螺[异吲哚啉-1,9’-氧杂蒽]-3-酮溶于DMF或DMSO或DMA溶液中，加入二乙基二硫代氨基甲酸钠，简称NaDDTC，反应回流10~14 h，除去溶剂，将残余物溶于二氯甲烷中；将有机液用水和盐水洗涤，干燥，然后用柱层析分离得到荧光分子探针（1）。
优选方案：步骤（1）中所述罗丹明6G异羟肟酸与1,2-二溴乙烷的摩尔比例为：1：10~30，进一步优化的摩尔比例为1：15~25；罗丹明6G异羟肟酸与三乙胺或吡啶的摩尔比例为1：5~20，进一步优化的摩尔比例为1：5~15。
优选方案：步骤（2）中中间体与二乙基二硫代氨基甲酸钠的摩尔比例为：1：1~4，进一步优化的摩尔比例为1：1~2。
优选方案：步骤（1）中所述罗丹明6G异羟肟酸的制备方法为：以DMF为溶剂，加入罗丹明6G、盐酸羟胺、碳酸钾和DMF，其中罗丹明6G、盐酸羟胺、碳酸钾和DMF的摩尔比例为1：（2~3）：（2~3）：（3~5）；在氮气下室温反应10~12 h，将反应混合物倒入饱和食盐水中，过滤干燥得罗丹明6G异羟肟酸粗品，然后用柱层析分离或重结晶技术纯化得罗丹明6G异羟肟酸。
说明书中所述简称的中文全称为：二甲基亚砜（DMSO）、二甲基甲酰胺（DMF）、
二甲基乙酰胺（DMA）。
本发明还公开了所述抗癌铂前药还原活化的荧光探针在检测顺铂试剂中的应用。
本发明还公开了所述抗癌铂前药还原活化的荧光探针在检测四价铂还原活化试剂中的应用。
进一步优选的，在检测四价铂还原活化试剂中，控制检测时间为200-240min，控制检测pH值为7.2-7.5，控制在有氧的条件下进行。
本发明公开了上述检测铂（II）（顺铂）荧光分子探针在检测顺铂及研究基于顺铂支架的抗癌铂（IV）前药的还原活化中的应用。
附图说明
图1为本发明实施例1中的荧光分子探针的合成示意图。
图2为本发明的荧光分子探针加入顺铂后的荧光光谱变化图，其中A是探针溶液随顺铂浓度变化的荧光光谱图，B是探针的线性相关图。
图3为本发明的荧光分子探针对常见小分子、离子的选择性图，其中A是选择性荧光光谱图，B是选择性荧光比值柱状图。
图4为本发明的荧光分子探针对不同还原剂与铂（IV）前药共同存在下的荧光谱变化图。
图5为本发明的荧光分子探针在不同还原剂与铂（IV）前药共同存在下，随时间改变的荧光谱变化图。
图6为本发明的荧光分子探针在不同还原剂与铂（IV）前药共同存在下，随pH改变的荧光谱变化图，其中A是荧光强度变化图，B是荧光比值变化图。
图7为本发明的荧光分子探针在不同还原剂与铂（IV）前药共同存在下，随氧气改变的荧光谱变化图。
图8为本发明的荧光分子探针的氢谱图。
图9为本发明的荧光分子探针的碳谱图。
图10为本发明的荧光分子探针的高分辨质谱图。
具体实施方式
以下将结合附图和具体实施例来进一步阐述本发明。这些实施例仅用于解释和说明本发明，而并非限制本发明的范围。
实施例1
一种能够检测铂（II）（顺铂）的荧光探针的制备方法，合成路线如图1所示，具体包括以下步骤：
（1）在装有磁子的两口圆底烧瓶中，加入罗丹明6G 0.480 g，1.0 mmol、盐酸羟胺0.140g，2.0 mmol、碳酸钾0.276 g，2.0 mmol和DMF 3.0 mL，在氮气气氛下室温25 oC反应12 h。将反应混合物倒入饱和食盐水中，过滤收集固体，干燥得罗丹明6G异羟肟酸粗品，然后用柱层析分离，甲醇/乙酸乙酯=1:4，v/v，Rf=0.6，得罗丹明6G异羟肟酸，产率为95.0 %。
（2）将罗丹明6G异羟肟酸220 mg，0.48 mmol溶解在DMF 2 mL中，并加入三乙胺671μL，4.81 mmol和1,2-二溴乙烷829 μL，9.62 mmol。将反应混合物在60 oC下回流4 h。除去溶剂，将残余物溶于二氯甲烷15 mL中。将有机混合物用水10 mL和NaHCO3洗涤，经Na2SO4干燥，然后用柱层析分离，石油醚/乙酸乙酯=3:1，v/v，Rf=0.45，得2-(2-溴乙氧基)-3’,6’-二乙胺基-2’,7’-二甲基螺[异吲哚啉-1,9’-氧杂蒽]-3-酮，产率为73.1 %。
（3）将2-(2-溴乙氧基)-3’,6’-二乙胺基-2’,7’-二甲基螺[异吲哚啉-1,9’-氧杂蒽]-3-酮199 mg，0.35 mmol溶于DMF 2 mL溶液中，加入NaDDTC（二乙基二硫代氨基甲酸钠）159 mg，0.70 mmol，反应回流12 h。除去溶剂，将残余物溶于二氯甲烷15 mL中。将有机液用水10 mL和盐水10 mL洗涤，经Na2SO4干燥，然后用柱层析分离，石油醚/乙酸乙酯=3:1，v/v，Rf=0.45，得到荧光分子探针（1），产率为54.8 %，分子结构式如图1所示。
实施例2
一种能够检测铂（II）（顺铂）的荧光探针的制备方法，以DMSO作溶剂合成荧光分子探针（1），包括以下步骤：
（1）在装有磁子的两口圆底烧瓶中，加入罗丹明6G 0.480 g，1.0 mmol、盐酸羟胺0.140g，2.0 mmol、碳酸钾0.276 g，2.0 mmol和DMSO 3.0 mL，在氮气气氛下室温25 oC反应11 h。将反应混合物倒入饱和食盐水中，过滤收集固体，干燥得罗丹明6G异羟肟酸粗品，然后用柱层析分离，甲醇/乙酸乙酯=1:4，v/v，Rf=0.6，得罗丹明6G异羟肟酸，产率为94. 5%。
（2）将罗丹明6G异羟肟酸220 mg，0.48 mmol溶解在DMSO 2 mL中，并加入三乙胺1004 μL，7.20 mmol和1,2-二溴乙烷1034 μL，12 mmol。将反应混合物在80 oC下回流3 h。除去溶剂，将残余物溶于二氯甲烷15 mL中。将有机混合物用水10 mL和NaHCO3洗涤，经Na2SO4干燥，然后用柱层析分离，石油醚/乙酸乙酯=3:1，v/v，Rf=0.45，得2-(2-溴乙氧基)-3’,6’-二乙胺基-2’,7’-二甲基螺[异吲哚啉-1,9’-氧杂蒽]-3-酮，产率为68.3%。
（3）将2-(2-溴乙氧基)-3’,6’-二乙胺基-2’,7’-二甲基螺[异吲哚啉-1,9’-氧杂蒽]-3-酮199 mg，0.35 mmol溶于DMSO 2 mL溶液中，加入NaDDTC（二乙基二硫代氨基甲酸钠）318 mg，1.40 mmol，反应回流10 h。除去溶剂，将残余物溶于二氯甲烷15 mL中。将有机液用水10 mL和盐水10 mL洗涤，经Na2SO4干燥，然后用柱层析分离，石油醚/乙酸乙酯=3:1，v/v，Rf=0.45，得到荧光分子探针（1），产率为52.4%，分子结构式如图1所示。
实施例3
一种能够检测铂（II）（顺铂）的荧光探针的制备方法，以DMA作溶剂合成荧光分子探针（1），包括以下步骤：
（1）在装有磁子的两口圆底烧瓶中，加入罗丹明6G 0.480 g，1.0 mmol、盐酸羟胺0.140g，2.0 mmol、碳酸钾0.276 g，2.0 mmol和DMA 3.0 mL，在氮气气氛下室温25 oC反应10 h。将反应混合物倒入饱和食盐水中，过滤收集固体，干燥得罗丹明6G异羟肟酸粗品，然后用柱层析分离，甲醇/乙酸乙酯=1:4，v/v，Rf=0.6，得罗丹明6G异羟肟酸，产率为93.7%。
（2）将罗丹明6G异羟肟酸220 mg，0.48 mmol溶解在DMA 2 mL中，并加入三乙胺468μL，3.36 mmol和1,2-二溴乙烷620 μL，7.20 mmol。将反应混合物在70 oC下回流5 h。除去溶剂，将残余物溶于二氯甲烷15 mL中。将有机混合物用水10 mL和NaHCO3洗涤，经Na2SO4干燥，然后用柱层析分离，石油醚/乙酸乙酯=3:1，v/v，Rf=0.45，得2-(2-溴乙氧基)-3’,6’-二乙胺基-2’,7’-二甲基螺[异吲哚啉-1,9’-氧杂蒽]-3-酮，产率为70.4%。
（3）将2-(2-溴乙氧基)-3’,6’-二乙胺基-2’,7’-二甲基螺[异吲哚啉-1,9’-氧杂蒽]-3-酮199 mg，0.35 mmol溶于DMA 2 mL溶液中，加入NaDDTC（二乙基二硫代氨基甲酸钠）120 mg，0.53 mmol，反应回流13 h。除去溶剂，将残余物溶于二氯甲烷15 mL中。将有机液用水10 mL和盐水10 mL洗涤，经Na2SO4干燥，然后用柱层析分离，石油醚/乙酸乙酯=3:1，v/v，Rf=0.45，得到荧光分子探针（1），产率为52.0%，分子结构式如图1所示。
实施例4
一种能够检测铂（II）（顺铂）的荧光探针的制备方法，以吡啶代替三乙胺合成荧光分子探针（1），包括以下步骤：
（1）在装有磁子的两口圆底烧瓶中，加入罗丹明6G 0.480 g，1.0 mmol、盐酸羟胺0.140g，2.0 mmol、碳酸钾0.276 g，2.0 mmol和DMF 3.0 mL，在氮气气氛下室温25 oC反应11 h。将反应混合物倒入饱和食盐水中，过滤收集固体，干燥得罗丹明6G异羟肟酸粗品，然后用柱层析分离，甲醇/乙酸乙酯=1:4，v/v，Rf=0.6，产率为94.5%，得罗丹明6G异羟肟酸。
（2）将罗丹明6G异羟肟酸220 mg，0.48 mmol溶解在DMF 2 mL中，并加入吡啶579 μL，7.20 mmol和1,2-二溴乙烷910 μL，10.56 mmol。将反应混合物在60 oC下回流6 h。除去溶剂，将残余物溶于二氯甲烷15 mL中。将有机混合物用水10 mL和NaHCO3洗涤，经Na2SO4干燥，然后用柱层析分离，石油醚/乙酸乙酯=3:1，v/v，Rf=0.45，得2-(2-溴乙氧基)-3’,6’-二乙胺基-2’,7’-二甲基螺[异吲哚啉-1,9’-氧杂蒽]-3-酮，产率为71.6%。
（3）将2-(2-溴乙氧基)-3’,6’-二乙胺基-2’,7’-二甲基螺[异吲哚啉-1,9’-氧杂蒽]-3-酮199 mg，0.35 mmol溶于DMF 2 mL溶液中，加入NaDDTC（二乙基二硫代氨基甲酸钠）79.5 mg，0.35mmol，反应回流14 h。除去溶剂，将残余物溶于二氯甲烷15 mL中。将有机液用水10 mL和盐水10 mL洗涤，经Na2SO4干燥，然后用柱层析分离，石油醚/乙酸乙酯=3:1，v/v，Rf=0.45，得到荧光分子探针（1），产率为40.5%，分子结构式如图1所示。
对比实施例5
一种能够检测铂（II）（顺铂）的荧光探针的制备方法，合成步骤如下：
（1）罗丹明6G异羟肟酸的制备方法同实施例1。
（2）将罗丹明6G异羟肟酸346 mg，0.75 mmol溶于DMF 1 mL中，并向其中加入三乙醇胺TEA 379 mg，3.75 mmol和1,2-二溴乙烷351 mg，1.87 mmol。在黑暗中室温持续反应18小时。将反应混合物溶于二氯甲烷60 mL中，用NaHCO3洗涤，并留出有机层。将水相用二氯甲烷100 mL再萃取，然后合并有机层并用NaCl洗涤。将有机萃取物经Na2SO4干燥，并通过快速柱色谱法纯化，使用乙酸乙酯：石油醚=1：4作为洗脱剂，得到2-(2-溴乙氧基)-3’,6’-二乙胺基-2’,7’-二甲基螺[异吲哚啉-1,9’-氧杂蒽]-3-酮，产率为63.0%。
（3）荧光分子探针（1）的制备方法同实施例1。
对比实施例6
一种能够检测铂（II）（顺铂）的荧光探针的制备方法，合成步骤如下：
（1）罗丹明6G异羟肟酸的制备方法同实施例1。
（2）2-(2-溴乙氧基)-3’,6’-二乙胺基-2’,7’-二甲基螺[异吲哚啉-1,9’-氧杂蒽]-3-酮的制备方法同实施例1。
（3）将2-(2-溴乙氧基)-3’,6’-二乙胺基-2’,7’-二甲基螺[异吲哚啉-1,9’-氧杂蒽]-3-酮118 mg，0.21 mmol 溶于DMF 3 mL中。加入NaDDTC 52.3 mg，0.23 mmol并将反应混合物在黑暗中搅拌20分钟。将溶液真空干燥，将残余物溶于二氯甲烷10 mL中。过滤混合物除去白色固体，除去溶剂，得到荧光分子探针（1），产率为45.9%。
实施例7
荧光探针（一）检测顺铂的浓度变化：
（A）在PU管中加入10 μM顺铂荧光探针，780 μL MeOH，1.2 mL pH＝7 .45的缓冲溶液，以及0-100 μM顺铂标准溶液。将其在37 ℃条件下反应150分钟，以530 nm激发波长记录检测液的荧光光谱。（B）根据检测液在559 nm处的荧光强度与波长的标准曲线。图2表明探针在559 nm处的荧光强度随着顺铂浓度的增加而增强。
实施例8
荧光探针（一）对顺铂或其他分析物的荧光响应：
在PU管中加入10 μM顺铂荧光探针，在10 mM MeOH / HEPES（v / v = 4：6，10 mM，pH =7.45）中加入50 μM顺铂标准溶液或100 μM其他分析物。将其在37 ℃条件下反应150分钟，以530 nm激发波长进行荧光检测，观察顺铂荧光探针对顺铂或其他分析物的荧光响应。（从左到右分析物依次是：空白，顺铂，Na +，Zn2 +，Mg2 +，Ca2 +，Fe3 +，Cu2 +，Ba2 +，Co2 +，Ni2 +，Fe2 +，Bi3 +，Mn2 +，Cr3 +， Cd2 +，Ag +，Sn2 +，Zr4 +，Ti2 +，Pb2 +，Li +，K +，F-，Cl-，NO2 -，C2O4 2-，H2PO4 -，CO3 2-，S2O5 2-，HSO3 -，N3 -，Br-，SO3 2-，SO4 2 -，ClO4 -，I-，NH4 +，SCN-，NO3 -，CH3COO-，HPO4 2-，H2O2，ClO-，1O2，·OH，O2·-，ONOO-，TBHP，GSH，Cys，Hcy，L-谷氨酸，L-组氨酸）。图3说明探针可特异性识别顺铂，具有研究基于顺铂支架的抗癌铂（IV）前药还原活化作用的潜力。
实施例9
荧光探针（一）检测不同还原剂对铂（IV）前药还原活化情况：
在PU管中加入10 μM顺铂荧光探针，480 μL MeOH，1.0 mL pH＝7 .45的缓冲溶液， 100μM四价铂溶液，再分别添加100 μM Cys、Hcy、GSH、AA溶液。将其在37 ℃条件下反应150分钟，以530 nm激发波长进行荧光检测，观察顺铂荧光探针检测不同还原剂对铂（IV）前药还原活化情况。图4说明， Cys、Hcy、GSH、AA对铂（IV）前药具有较好的还原活化作用。
实施例10
荧光探针（一）检测时间对于还原剂活化铂（IV）前药还原效果的影响情况：
在PU管中加入10 μM顺铂荧光探针，480 μL MeOH，1.0 mL pH＝7 .45的缓冲溶液，50 μM四价铂溶液，再分别添加50 μM Cys、Hcy、GSH、AA溶液。将其在37 ℃条件下反应60、120、180、240、300、360、480分钟，以530 nm激发波长进行荧光检测，在不同时间下观察顺铂荧光探针检测不同还原剂对铂（IV）前药还原活化情况。图5说明，在时间为240分钟时，还原剂活化铂（IV）前药还原效果最好。
实施例11
荧光探针（一）检测pH对于还原剂活化铂（IV）前药还原效果的影响情况：
在PU管中加入10 μM顺铂荧光探针，480 μL MeOH，1.0 mL pH＝7 .45的缓冲溶液，50 μM四价铂溶液，再分别添加50 μM Cys、Hcy、GSH、AA溶液。将其在37 ℃条件下反应240分钟，以530 nm激发波长进行荧光检测，在不同pH下观察顺铂荧光探针检测不同还原剂对铂（IV）前药还原活化情况。图6说明，虽然随着pH的增大，探针检测到的四种还原剂活化铂（IV）前药的荧光强度越来越低，但是pH为7.45时，四种还原剂活化铂（IV）前药的活化率是最高的，并且四种还原剂的还原效率排序为AA>Cys>GSH>Hcy。
实施例12
荧光探针（一）检测氧气对于还原剂活化铂（IV）前药还原效果的影响情况：
在PU管中加入10 μM顺铂荧光探针，480 μL MeOH，1.0 mL pH＝7 .45的缓冲溶液， 50μM四价铂溶液，再分别添加50 μM Cys、Hcy、GSH、AA溶液。将其在正常条件下、除空气氧、除空气氧和溶解氧三种不同条件下， 37 ℃反应240分钟，以530 nm激发波长进行荧光检测，在不同含氧量下观察顺铂荧光探针检测不同还原剂对铂（IV）前药还原活化情况。图7说明，无氧环境对于还原剂活化铂（IV）前药还原效果有一定的影响，需要在有氧的条件下比较合适，并且四种还原剂的还原效率依然排序为AA>Cys>GSH>Hcy。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细的介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围因由所附的权利要求来限定。

Claims (9)

1.一种抗癌铂前药还原活化的荧光探针，其特征是，该探针的结构式如式（1）所示：
Figure 609020DEST_PATH_IMAGE001
式（1）。
2.权利要求1所述抗癌铂前药还原活化的荧光探针的制备方法，其特征是，合成路线如下：
Figure 588478DEST_PATH_IMAGE002
。
3.根据权利要求2所述抗癌铂前药还原活化的荧光探针的制备方法，其特征是，具体制备方法包括：
（1）将罗丹明6G异羟肟酸溶解在DMF或DMSO或DMA中，并加入三乙胺或吡啶，同时加入1,2-二溴乙烷，将反应混合物在50~80℃下回流3~6 h，除去溶剂，将残余物溶于二氯甲烷中；将有机混合物用水和NaHCO3洗涤，干燥，然后用柱层析分离得中间体：2-(2-溴乙氧基)-3’,6’-二乙胺基-2’,7’-二甲基螺[异吲哚啉-1,9’-氧杂蒽]-3-酮；
（2）将中间体：2-(2-溴乙氧基)-3’,6’-二乙胺基-2’,7’-二甲基螺[异吲哚啉-1,9’-氧杂蒽]-3-酮溶于DMF或DMSO或DMA溶液中，加入二乙基二硫代氨基甲酸钠，简称NaDDTC，反应回流10~14 h，除去溶剂，将残余物溶于二氯甲烷中；将有机液用水和盐水洗涤，干燥，然后用柱层析分离得到荧光分子探针（1）。
4.根据权利要求2所述抗癌铂前药还原活化的荧光探针的制备方法，其特征是，步骤（1）中所述罗丹明6G异羟肟酸与1,2-二溴乙烷的摩尔比例为：1：10~30，进一步优化的摩尔比例为1：15~25；罗丹明6G异羟肟酸与三乙胺或吡啶的摩尔比例为1：5~20，进一步优化的摩尔比例为1：5~15。
5.根据权利要求2所述抗癌铂前药还原活化的荧光探针的制备方法，其特征是，步骤（2）中中间体与二乙基二硫代氨基甲酸钠的摩尔比例为：1：1~4，进一步优化的摩尔比例为1：1~2。
6.根据权利要求2所述抗癌铂前药还原活化的荧光探针的制备方法，其特征是，步骤（1）中所述罗丹明6G异羟肟酸的制备方法为：以DMF为溶剂，加入罗丹明6G、盐酸羟胺、碳酸钾和DMF，其中罗丹明6G、盐酸羟胺、碳酸钾和DMF的摩尔比例为1：（2~3）：（2~3）：（3~5）；在氮气下室温反应10~12 h，将反应混合物倒入饱和食盐水中，过滤干燥得罗丹明6G异羟肟酸粗品，然后用柱层析分离或重结晶技术纯化得罗丹明6G异羟肟酸。
7.权利要求1所述抗癌铂前药还原活化的荧光探针在检测顺铂试剂中的应用。
8.权利要求1所述抗癌铂前药还原活化的荧光探针在检测四价铂还原活化试剂中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征是，在检测四价铂还原活化试剂中，控制检测时间为200-240min，控制检测pH值为7.2-7.5，控制在有氧的条件下进行。
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