ES2309154T3 - Analisis de hemoglobina. - Google Patents
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- G01N33/721—Haemoglobin
- G01N33/723—Glycosylated haemoglobin
Abstract
Un equipo (kit) de ensayo de hemoglobina glicatada, comprendiendo el citado kit: una membrana porosa capaz de retener hemoglobina precipitada; un primer reactivo que comprende iones zinc en solución acuosa básica o que comprende un compuesto de zinc soluble en agua; y un segundo reactivo que comprende un conjugado cromóforo-ácido borónico donde al menos uno de los reactivos primero y segundo además comprende un compuesto tensioactivo capaz de lisar eritrocitos, siendo ácido el citado segundo reactivo, si es líquido, y el conjugado de ácido borónico y el zinc están presentes en reactivos separados en el kit de ensayo.
Description
Análisis de hemoglobina.
Esta invención se refiere a mejoras en métodos
de ensayo para hemoglobina glicatada y en relación con ellos.
Las proteínas en solución en los fluidos
corporales están sometidas continuamente a procesos de
glicosilación. La glucosa reacciona con las proteínas por
reacciones no enzimáticas para formar glicoproteínas, y en muchos
casos el nivel de formación de glicoproteína es proporcional a la
concentración de glucosa en el fluido corporal en cuestión. Para
proteínas no inicialmente sintetizadas como glicoproteínas, la
fracción de una proteína presente en forma glicatada es, por tanto,
una función del tiempo de vida de la proteína en el organismo y las
concentraciones de glucosa a las que ha sido expuesta la
proteína.
A diferencia de las medidas de concentraciones
de glucosa en sangre, plasma u orina, que solamente dan información
acerca de la concentración de glucosa en el momento de la toma de
muestra, la cantidad de una proteína presente en forma
glicosilatada da indicación del control de concentración de glucosa
del organismo a lo largo de periodos de tiempo más prolongados.
Los eritrocitos (células rojas de la sangre)
tienen un tiempo de vida medio de aproximadamente 120 días y
contienen grandes cantidades de hemoglobina. La fracción de
hemoglobina de eritrocitos en forma glicosilada es, por tanto, una
buena medida de control de la enfermedad en pacientes con
diabetes mellitus, y es una función de las concentraciones
de glucosa en la sangre del paciente en las semanas anteriores a la
toma de muestras.
En la Patente estadounidense
US-A-5242842 (Axis) se ha propuesto
un ensayo de hemoglobina glicosilatada que emplea como reactivo
marcado con un informador un conjugado de ácido borónico, por
ejemplo, un conjugado de éster de
N-(resorufina-4-carbonil)piperidina-4-ácido
carboxílico-N-hidroxi-succinimida
(RESOS) o isotiocianato de fluoresceína (FITC) con ácido
aminofenilborónico. El componente aniónico
B(OH)_{3}^{-} del reactivo se une a los grupos
cis-diol de la hemoglobina glicosilatada para marcar
la hemoglobina glicosilatada con el marcador informador (por
ejemplo RESOS o FITC).
En la Patente estadounidense
US-A-5631364 (Axis) se describe un
grupo de conjugados de ácido borónico marcados por un informador
particularmente eficaz, que incluye el conjugado
xileno-cianol-ácido fenilborónico citado allí como
XC-DAPOL-CPBA. El marcador cromóforo
da a este conjugado una absorción máxima de 616 nm (es decir, es de
color azul) y la proporción de hemoglobina en una muestra que está
glicosilatada puede determinarse midiendo la absorbancia de la
muestra a 616 nm y a 415 nm, donde la hemoglobina tiene un máximo de
absorción.
Un ensayo diagnóstico para hemoglobina glicatada
(es decir, glicosilatada) utilizando este sistema está disponible
comercialmente de Axis Shield Plc como el ensayo NycoCard® HbAlc.
Para llevar a cabo este ensayo, se mezcla una solución acuosa
ligeramente alcalina de reactivo con una muestra de sangre y la
mezcla se aplica a una membrana porosa que se enjuaga antes de
determinar la reflectancia luminosa por la membrana (es decir por
la hemoglobina atrapada en la membrana). La solución de reactivo
comprende un agente tensioactivo (para la lisis de los eritrocitos
y liberar la hemoglobina),
XC-DAPOL-CPBA para unirse a
hemoglobina glicatada e iones zinc para precipitar la hemoglobina.
La hemoglobina precipitada, tanto la glicatada como la no glicatada,
es captada por la membrana mientras que otras proteínas glicatadas
y el exceso de conjugado de ácido borónico se eliminan por lavado
desde la membrana en la etapa de enjuagado.
Los resultados de este ensayo, sin embargo,
pueden variar con el tiempo de almacenado del reactivo, llegando a
ser no fiables si se almacenan durante aproximadamente 6 meses o
más. Dado que un laboratorio clínico puede tener equipos (kits) de
ensayo de distintas edades, existe la necesidad de aumentar la
precisión reproducible de un ensayo de hemoglobina glicatada basado
en conjugado de ácido borónico.
Los autores de la presente invención han
encontrado ahora que la fiabilidad de tales ensayos se puede mejorar
si están presentes el conjugado de ácido borónico y el zinc en
reactivos separados en el kit de ensayo. Según esto, un aspecto de
la invención proporciona un kit para ensayo de hemoglobina
glicatada, comprendiendo el citado kit:
una membrana porosa capaz de retener la
hemoglobina precipitada;
un primer reactivo que comprende iones de zinc
en solución acuosa básica o que comprende un compuesto hidrosoluble
de zinc;
un segundo reactivo que comprende un conjugado
de cromóforo-ácido borónico; y
opcionalmente, un reactivo acuoso de lavado;
donde al menos uno de los reactivos primero y
segundo comprende además un compuesto tensioactivo capaz de lisar
eritrocitos, y donde el citado segundo reactivo, si es líquido, es
ácido.
\newpage
El segundo reactivo del kit de la invención
puede ser una solución, o puede ser un material seco o sin
disolvente. Este reactivo comprende preferiblemente al menos parte
del compuesto tensioactivo. El disolvente, cuando el reactivo es
líquido, puede ser agua o disolvente orgánico miscible con agua, por
ejemplo un alcohol, éter, cetona, amida, sulfóxido,etc., o una
mezcla de dos o más de ellos. Los ejemplos de disolventes preferidos
son agua, metanol, DMSO y formamida. El reactivo incluye
preferiblemente un ácido (por ejemplo ácido cítrico) y,
preferiblemente tiene un pH por debajo de 6, más preferiblemente por
debajo de 5, si es líquido. Si el reactivo es seco o libre de
disolvente, es especialmente preferido que se prepare por desecado
de una solución para la que el disolvente es agua, metanol, o
metanol y agua (preferiblemente hasta 70% en volumen de metanol,
por ejemplo al menos 20%, por ejemplo 30 a 70%). La utilización de
agua como disolvente es la especialmente preferida. Se ha
encontrado, sorprendentemente, que secando una solución tal que
contenga el conjugado de ácido borónico y compuesto tensioactivo,
por ejemplo por evaporación, queda una residuo oleoso que se
disuelve en agua más rápidamente que el conjugado o el compuesto
tensioactivo solos. Además, cuando se utiliza un sistema
metanol/agua, se encuentra que el residuo es capaz de dar un
recubrimiento más uniforme a una superficie que en el caso de
metanol solo. Los resultados son, incluso, mejores que cuando se
utiliza agua sola como disolvente. Hay que hacer notar que se
conoce desde hace tiempo lo problemático que es secar soluciones de
compuesto tensioactivo con el resultado de quedar por lo general un
residuo grumoso, tipo papilla, por lo que esta capacidad para
producir un residuo uniforme, dispersable rápidamente en agua es de
lo más sorprendente.
La adición de una macromolécula hidrosoluble que
no interfiera con el ensayo de hemoglobina, por ejemplo, una
proteína tal como albúmina (por ejemplo albúmina de suero bovino) en
la producción del segundo reactivo, en forma seca o libre de
disolvente se ha encontrado como especialmente beneficiosa ya que el
residuo seco es más uniforme, especialmente después de un largo
período de tiempo de almacenamiento. La inclusión de tal
macromolécula es también beneficiosa cuando el segundo reactivo está
en forma líquida ya que reduce la incidencia de precipitación del
conjugado. Además de su inclusión en el primer o en el segundo
reactivo, o en ambos, ha mostrado que acorta el tiempo requerido
para el mezclado uniforme de los reactivos primero y segundo. Como
resultado, se prefiere que uno u otro o ambos de los reactivos
primero y segundo, o ambos, contengan tal compuesto macromolecular,
en particular BSA, a una concentración de hasta 1% peso/volumen,
especialmente 0,025 a 0,3% peso/volumen, más especialmente 0,05 a
0,1% peso/volumen.
El conjugado de ácido borónico puede, por
ejemplo, ser cualquiera de los conjugados cromóforo - ácido
borónico descritos en las Patentes estadounidenses
US-A-5242842,
US-A-5631364 y
US-A-5739318; se prefiere, sin
embargo, XC-DAPOL-CPBA.
El agente tensioactivo utilizado en los
reactivos puede ser cualquier agente tensioactivo capaz de lisar
eritrocitos, por ejemplo, desoxicolatos, Tritones y Tweens; son
preferidos, sin embargo, compuestos tensioactivos
no-iónicos tales como Tritons, en particular Triton
X-100.
El primer reactivo puede consistir en una
solución acuosa básica o puede ser soluble en agua o en una base
acuosa para producir una solución acuosa básica. En el segundo caso,
puede ser una solución acuosa desecada que requiere simplemente la
reconstitución con agua.
El primer reactivo comprende también,
preferiblemente, compuesto tensioactivo y puede contener otros
componentes opcionales, por ejemplo, sales inorgánicas (por ejemplo
cloruro de sodio o magnesio y azida de sodio), glicina y compuestos
tampón. El zinc se introduce preferiblemente como sal inorgánica,
por ejemplo, cloruro. El disolvente primario es preferiblemente
agua, pero pueden estar presentes otros disolventes miscibles con
agua. El pH del reactivo es básico, preferiblemente básico débil,
por ejemplo. de 7,1 a 8,5, preferiblemente 8,0 a 8,2, especialmente
aproximadamente 8,1. El pH sin embargo, debe ser tal como para hacer
que la mezcla del primero y segundo reactivo sea básica cuando se
combinan los dos.
El primer reactivo contiene, preferiblemente,
zinc 5 a 30 mM, especialmente 7 a 20 mM, y 0,05 a 0,22 peso/volumen
de compuesto tensioactivo y está tamponado preferiblemente a pH 7,4
a 8,2.
El segundo reactivo, si es un líquido acuoso,
contiene preferiblemente 0,15 a 0,75 mg/g, especialmente 0,20 a
0,50 mg/g de conjugado y 0,05 a 0,25% peso/volumen, especialmente
0,1 a 0,2% peso/volumen de compuesto tensioactivo, y 5 a 20%
volumen/volumen, especialmente 10 15% volumen/volumen de disolvente
orgánico miscible con agua, (por ejemplo formamida o DMSO), y si es
seco está formado preferiblemente por una solución acuosa que
contiene 0,1 a 0,5% mg/ml, especialmente 0,1 a 0,4 mg/ml, más
especialmente 0,15 a 0,3% mg/ml de conjugado, 0,1 a 0,5%
peso/volumen, especialmente 0,25 a 0,4% peso/volumen de compuesto
tensioactivo, 0,2 a 0,6 mM, especialmente 0,4 a 0,55 mM de ácido
(por ejemplo, ácido cítrico), hasta 70% volumen/volumen,
preferiblemente 0 (por ejemplo 1% volumen/volumen y más) hasta 50%
volumen/volumen de metanol, y preferiblemente 0,025 a 0,3%
peso/volumen, especialmente 0,05 a 0,1%, BSA.
El reactivo de lavado es, convenientemente, un
tampón acuoso, por ejemplo Hepes. Un reactivo de lavado
particularmente adecuado comprende morfolina 50 mM, NaCl 200 mM,
Triton X-100 al 0,5% peso/volumen, glicerina al 1%
peso/volumen, NaN_{3} al 0,05% peso/volumen, pH 9,1.
La membrana utilizada en el kit de la invención
puede ser cualquier membrana de tamaño de poro adecuado, siendo
conveniente, sin embargo, un filtro de fibra de vidrio o filtro de
borosilicato o una membrana celulósica, por ejemplo, con un
"tamaño de poro" de 0,5 a 1,5 \mum, especialmente 0,8 \mum
a 1,0 \mum. Deseablemente, dispuesta frente a la membrana, hay
una capa absorbente, por ejemplo, una capa celulósica o una capa de
poliéter sulfona, sobre la superficie más alejada de la superficie
de aplicación de la muestra, la que servirá para arrastrar la
muestra y reactivos a través de la membrana por acción capilar.
En el kit de la invención, los reactivos primero
y segundo (donde el segundo reactivo es líquido) se disponen
preferiblemente en un recipiente de dos cámaras con una membrana
frangible de separación de las cámaras. Esta puede tomar, por
ejemplo, la forma de un recipiente rompible (por ejemplo de vidrio)
dispuesto en el interior de un recipiente flexible. La rotura del
separador de membrana frangible (por ejemplo la pared de un vial de
vidrio) permite que se mezclen los dos reactivos antes de ser
puestos en contacto con la muestra de sangre. Cuando el segundo
reactivo es un material seco, está presente preferiblemente en el
kit recubriendo la base y/o paredes de un recipiente de un
recipiente o un tapón. De esta forma, el primer reactivo se puede
introducir en el recipiente del segundo reactivo para que se
disuelva el conjugado para el ensayo, o se puede colocar un tapón
recubierto con el segundo reactivo seco en el cuello de un vial (por
ejemplo un vial llenado previamente) del primer reactivo líquido.
El segundo reactivo, si es líquido se puede utilizar,
correspondientemente, para disolver un primer reactivo seco para
utilizarlo en el ensayo.
Los recipientes de reactivo del kit tal como se
suministran deberán estar, deseablemente, tapados para evitar
pérdida de líquidos o introducción de humedad.
En otro aspecto, la invención proporciona
también un método de ensayo de una mezcla de sangre en cuanto a
hemoglobina glicatada, comprendiendo el citado método el contacto de
una muestra de sangre con un agente tensioactivo capaz de lisar
eritrocitos, un conjugado cromóforo-ácido borónico, e iones de zinc
en solución acuosa, dejando incubar la muestra, haciendo pasar la
muestra incubada a través de una membrana porosa capaz de retener
hemoglobina precipitada, inundando la membrana para separar el
conjugado que no se ha copulado a hemoglobina, midiendo el reflejo
de la luz de la membrana a longitudes de onda a las que la
hemoglobina y el conjugado, respectivamente, absorben luz, y
comparando las intensidades de luz reflejada medidas con lo que se
tiene una indicación (por ejemplo cuantitativa,
semi-cuantitativa o cualitativa) de la proporción de
hemoglobina en la muestra de sangre que está glicatada,
caracterizado porque el citado conjugado e iones de zinc se reúnen
por combinación de un primer reactivo que comprende iones zinc en
solución acosa básica y un segundo reactivo que comprende un
conjugado cromóforo-ácido borónico donde al menos uno de dichos
reactivos primero y segundo comprende además un compuesto
tensioactivo capaz de lisar eritrocitos, y donde el citado segundo
reactivo, si es líquido, es ácido.
Queda claro que el kit de la invención se puede
utilizar en el método de ensayo de la invención.
Tal como se ha mencionado antes, la combinación
de compuesto tensioactivo y conjugado es soluble en agua más
fácilmente que el compuesto tensioactivo o el conjugado solos. Según
esto, otro aspecto de la invención proporciona un material soluble
en agua producido por secado de una solución (por ejemplo una
solución acuosa, alcanólica o alcanólica-acuosa) de
un ácido orgánico cíclico insaturado (por ejemplo, uno que tiene un
peso molecular de 500 a 1500 D, por ejemplo un conjugado de ácido
borónico) y un compuesto tensioactivo (por ejemplo, un compuesto
tensioactivo no iónico, especialmente un Tritón). Esta solución
puede contener, naturalmente, otros solutos que asimismo se
liberarán cuando el material se pone en contacto con agua.
La invención se describirá a continuación además
con referencia a los siguientes Ejemplos no limitativos.
Las condiciones de secado para el segundo
reactivo en los Ejemplos 2, 5 y 6 y para el precursor en solución
del Ejemplo 3 son las siguientes:
Se puede utilizar una estufa de secado al vacío
o una liofilizadora con controlador de vacío programable. El
aparato deberá fijarse para conseguir una presión de 7 a 10 mbar al
cabo de 40-65 minutos. Las condiciones de fijación
variarán dependiendo del número de tubos (cantidad de líquido) que
se va a secar y el tipo de liofilizadora, Las condiciones de
fijación pueden variar, según esto, para producir una película
uniforme de material seco sobre las paredes de plástico.
Para una estufa de secado al vacío Heraeus (VT
6025) se han utilizado las siguientes condiciones
(400-500 tubos):
- Temperatura: 30ºC
- Tiempo para obtener P2: 5 minutos
- P2: 100 mbar
- Tiempo de estancia en P2: 5 minutos
\vskip1.000000\baselineskip
- Tiempo para obtener P3: 5 minutos
- P3: 50 mbar
- Tiempo de estancia en P3: 5 minutos
\vskip1.000000\baselineskip
- Tiempo para obtener P4: 5 minutos
- P4: 20 mbar
- Tiempo de estancia en P4: 5 minutos
\vskip1.000000\baselineskip
- Tiempo para obtener P5: 10 minutos
- P5: 7 mbar
- Tiempo de estancia en P5: 804 minutos
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El primer reactivo comprende:
El reactivo se prepara mezclando 1 ml de Hepes
1M, 0,25 ml de glicina 1 M, 2 ml de H_{2}O, 0,09 ml de ZnCl_{2}
1M, 0,15 ml de MgCl_{2} 1M, 0,4 ml de NaCl 5M, 0,075 ml de
Triton-X-100 al 10% y 0,025 ml de
NaN_{3} al 10%. Se ajusta el pH a 8,1 y se añade agua hasta 5
ml.
\vskip1.000000\baselineskip
El primer reactivo se puede obtener
alternativamente como sigue:
se disuelven 24,6, mg de cloruro de zinc en 2,5
ml de agua. Se disuelven 233,8 mg de cloruro de sodio, 61 mg de
cloruro de magnesio hexahidratado, 0,05 ml de azida sódica al 10% y
0,1 ml de Triton X-100 al 10% en 2,5 ml de agua. Se
combinan entonces las dos soluciones. Se disuelven 476,6 mg de Hepes
y 37,6 mg de glicina en 1,5 ml de agua y 0,4 ml de hidróxido de
sodio 5 M. Esta solución de Hepes se añade entonces a la solución
de zinc y Triton X-100 y se ajusta el pH a 8,1 y el
volumen a 10 ml.
\vskip1.000000\baselineskip
El segundo reactivo comprende:
El reactivo se prepara por mezclado de 0,11 ml
de formamida, 0,52 ml de
XC-DAPOL-CPBA (3,15 g/litro en
formamida) y agua hasta 5 ml. Se puede utilizar DMSO en lugar de
formamida.
\newpage
Se mezclan 100 \mul del primer reactivo con
100 \mul del segundo reactivo. La mezcla se añade a 5 \mul de
sangre y se deja incubar durante 2 minutos. Se coloca entonces una
parte alícuota de 25 \mul en un filtro de fibra de vidrio. Se
añaden 25 \mul de una solución de lavado de pH 9,1 (Ejemplo 4) y
el resultado se lee sobre un lector NycoCard® a 632 y 476 nm.
Ejemplo
2
El primer reactivo comprende:
\vskip1.000000\baselineskip
El reactivo se prepara mezclando 1 ml de Hepes
1M, 0,25 ml de glicina 1M, 2 ml de H_{2}O, 0,09 ml de ZnCl_{2}
1M, 0,15 ml de MgCl_{2} 1M, 0,4 ml de NaCl 5M, 0,1 ml de
Triton-X-100 al 10% y 0,05 ml de
NaN_{3} al 10%. Se ajusta el pH a 8,12 y se añade agua hasta 10
ml.
El primer reactivo se puede obtener
alternativamente como sigue: se disuelven 12,3 mg de cloruro de zinc
en 2,5 ml de agua. Se disuelven 116,9 mg de cloruro de sodio, 30,5
mg de cloruro de magnesio hexahidratado, 0,05 ml de azida de sodio
al 10% y 0,1 ml de Tritón X-100 al 10% en 2,5 ml de
agua. Se combinan entonces las dos soluciones. Se disuelven 238,3
mg de HEPES y 18,8 mg de glicina en 1,5 ml de agua y 0,2 ml de
hidróxido de sodio 5M. Esta solución de HEPES se añade entonces a
la solución de zinc y Triton X-100 y el pH se ajusta
a 8,1 y el volumen
a 10 ml.
a 10 ml.
\vskip1.000000\baselineskip
El precursor en solución comprende:
\vskip1.000000\baselineskip
El precursor en solución se prepara disolviendo
XC-DAPOL-CPBA a 0,36 mg/ml en
metanol. Se mezclan 2 ml de lo anterior con 105 \mul de Triton
X-100 al 10%, 1 ml de agua y 15 \mul de ácido
cítrico 0,1 M.
\newpage
Se evaporan 150 \mul del precursor en
solución.
El precursor en solución puede comprender
alternativamente
El precursor en solución se prepara por
disolución de XC-DAPOL-CPBA en
metanol a 2,5 mg/ml. Se mezclan 2 ml de la solución con 4,8 ml de
Triton X-100 y se añaden 2 ml de BSA al 5%
peso/volumen y el pH se ajusta a 4,1 con ácido cítrico 0,1 M (unos
50-60 \mul). Se añade agua hasta un volumen de 10
ml. Se ajusta la cantidad de
XC-DAPOL-CPBA utilizada para
proporcionar una densidad óptica (OD) de 32,5 a 620 nm.
Se secan entonces al vacío 125 \mul de este
precursor en solución para producir el segundo reactivo.
Se mezclan 200 \mul del primer reactivo con el
segundo reactivo y a continuación con 5 \mul de sangre. El
procedimiento de ensayo se sigue entonces como en el Ejemplo 1.
Ejemplo
3
El primer reactivo comprende:
Se disuelven en 2,5 ml de agua 13,6 mg de
ZnCl_{2}.. Se disuelven 116,9 mg de NaCl, 40,6 mg de Mg Cl_{2}
x 6H_{2}O, 0,05 ml de NaN_{3} al 10% peso/volumen y 0,1 ml de
Triton-X-100 al 10% peso/volumen en
2,5 ml de agua. Se mezclan entonces las dos soluciones. Se
disuelven entonces 55,2 mg de glicinamida en 1,5 ml de agua y 0,4
ml de NaOH 5M y esta solución se añade a la solución de zinc. Se
ajusta el pH a 8,1 y el volumen a 10 ml.
Se secan al vacío 200 \mul del precursor en
solución.
La solución que contiene BSA citada en el
Ejemplo 2 como precursor en solución se utiliza en forma
líquida.
Se mezclan 200 \mul del primer reactivo con el
segundo reactivo y luego con 5 \mul de sangre. El procedimiento
de ensayo prosigue después como en el Ejemplo 1.
Ejemplo
4
La solución de lavado comprende:
La solución se prepara por mezclado de los
componentes, ajuste a pH 9,1 y adición de agua hasta conseguir la
concentración deseada.
Ejemplo
5
Se preparan los materiales para el ensayo como
en el Ejemplo 2, excepto en que el precursor en solución se prepara
disolviendo el conjugado de ácido borónico en NaOH 0,5 mM a 0,25
mg/ml. Esto requiere 10 a 30 minutos de agitación. Se mezclan
entonces 2 ml de la solución con 0,05 ml de Triton
X-100 al 10% y se agita durante otros 10 minutos.
El pH se reduce entonces a aproximadamente 4,5 por adición de 0,01
ml de ácido cítrico 0,1 M. El ensayo se lleva a cabo como en el
Ejemplo 2.
Ejemplo
6
Los materiales para el ensayo se preparan como
en el Ejemplo 2 excepto en que el precursor en solución se prepara
por disolución del ácido borónico en NaOH 10 mM a 2,5 mg/ml. Se
mezclan 2 ml de lo anterior con 4,8 ml de Triton
X-100 al 0,7% peso/volumen. Se añaden 2 ml de BSA al
0,5% peso/volumen y el pH se ajusta a 4,1 con ácido cítrico 0,1 M
(50-60 \mul). Se añade agua a un volumen de 10 ml.
La cantidad de conjugado utilizada se ajusta para proporcionar una
densidad óptica de 32,5 a 620 nm. El ensayo se lleva a cabo como en
el Ejemplo 2.
Claims (10)
1. Un equipo (kit) de ensayo de hemoglobina
glicatada, comprendiendo el citado kit:
- una membrana porosa capaz de retener hemoglobina precipitada;
- un primer reactivo que comprende iones zinc en solución acuosa básica o que comprende un compuesto de zinc soluble en agua; y
- un segundo reactivo que comprende un conjugado cromóforo-ácido borónico donde al menos uno de los reactivos primero y segundo además comprende un compuesto tensioactivo capaz de lisar eritrocitos, siendo ácido el citado segundo reactivo, si es líquido, y el conjugado de ácido borónico y el zinc están presentes en reactivos separados en el kit de ensayo.
2. Un kit según la reivindicación 1 que
comprende además un reactivo acuoso de lavado.
3. Un kit como se reivindica en cualquiera de
las reivindicaciones 1 y 2 donde el citado primer reactivo comprende
iones de zinc en solución acuosa básica.
4. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 donde el citado segundo reactivo contiene un
compuesto tensioactivo,
5. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 donde el citado segundo reactivo es un
material seco.
6. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 donde el citado segundo reactivo es líquido y
los citados reactivos primero y segundo se disponen en un
recipiente de dos cámaras con una membrana frangible que separa las
cámaras.
7. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 donde el citado primer reactivo contiene un
compuesto tensioactivo.
8. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 donde al menos uno de los citados primero y
segundo reactivos contiene albúmina.
9. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 donde uno de los citados primero y segundo
reactivo está en forma líquida en un recipiente y el otro de los
citados primero y segundo reactivo está en forma seca recubriendo
un tapón aplicable al citado recipiente.
10. Un método para ensayo de una muestra de
sangre en cuanto a la hemoglobina glicatada, comprendiendo el citado
método poner en contacto una muestra de sangre con un compuesto
tensioactivo capaz de lisar eritrocitos, un conjugado de
cromóforo-ácido borónico, e iones zinc en solución acuosa, dejando
incubar la muestra, haciendo pasar la muestra incubada a través de
una membrana porosa capaz de retener hemoglobina precipitada,
inundando la membrana para separar el conjugado no copulado a la
hemoglobina, midiendo la luz reflejada desde la membrana a
longitudes de onda a las que, respectivamente, la hemoglobina y el
conjugado absorben luz, y comparando las intensidades luminosas
reflejadas medidas, lo que proporciona indicación de la proporción
de hemoglobina en la muestra de sangre que está glicatada, que se
caracteriza porque el citado conjugado e iones zinc se
reúnen por combinación de un primer reactivo que comprende iones
zinc en solución acuosa básica y un segundo reactivo que comprende
un conjugado cromóforo-ácido borónico donde al menos uno de los
citados reactivos primero y segundo comprende además un agente
tensioactivo capaz de lisar eritrocitos y donde el citado segundo
reactivo es ácido, si es líquido.
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