CN103278649B - 精子酪氨酸磷酸化的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种精子酪氨酸磷酸化的检测试剂盒，包括如下组分：获能缓冲液；荧光结合物；荧光封固液。本发明还提供了用所述的试剂盒进行精子酪氨酸磷酸化检测的方法。本发明相对于现有技术，在方法学的各环节进行了最优化设计，包括获能和上游法的最佳缓冲液配比、专业组织载片提供了稳定的反应场所、特异性结合的精子双标记技术配方，并消除了精液中脱落细胞等非精子物质对检测结果的影响，从而保证了方法学的可靠性，检测结果特异，重复性好；由于采用了优化检测方案，减少了操作步骤和操作时间，大大提高了检测效率；由于采用了优化检测方案，减化了试剂结构，较大程度地降低了检测成本；由于操作简单、采用即用型试剂且性能稳定。

Description

精子酪氨酸磷酸化的检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于体外检测试剂类，特别涉及精子酪氨酸磷酸化的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

精子和卵母细胞结合启动了顶体反应，释放游离的溶解性顶体成分并暴露出结合的可溶解性顶体成分，在经过超激活而增强的鞭毛运动的驱动下使精子穿透卵透明带基质。为了检测这一过程，需要使用来源于尸检、外科卵巢切除术或体外授精得到的人卵母细胞。这些试验可使用盐水中储存的卵母细胞，但试验受到人卵母细胞来源稀少的限制。

现有技术使用仓鼠卵来代替人卵母细胞作为筛查的方法，这种方法存在以下缺点：①仓鼠饲养繁琐；②仓鼠取卵及后续操作复杂；③检测方案试剂不够完善；④检测成本昂贵。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种性能稳定、重复性好且便于应用推广的精子酪氨酸磷酸化的检测试剂盒，利用此试剂盒，不需受卵母细胞来源稀少的限制，即可整体判断精子-卵透明带结合能力，本发明还提供了利用此试剂盒进行精子酪氨酸磷酸化的检测方法，其方法特异、结果易于判定、操作简单、易于推广应用。

本发明提供了一种精子酪氨酸磷酸化的检测试剂盒，包括如下组分：

1）获能缓冲液，其pH值为7.0～9.0，是以蒸馏水溶解以下物质配制而成，每1000ml获能缓冲液含有：

生化缓冲液：0.4～24.0g，

牛血清蛋白：0.35～20.0g，

乳酸钠：0.3～20.0g，

葡萄糖:0.1～10.0g，

余量为蒸馏水；

2）荧光结合物，其pH值为7.0～9.0，是含荧光素标记的酪氨酸磷酸化抗体的量为1～10mg/L的磷酸盐缓冲液；

3）荧光封固液,其pH值为7.0～9.0，是以蒸馏水溶解以下物质配制而成，每100ml含有：

Na₂HPO₄·12H₂O：0.06～6.00g，

KH₂PO₄：0.005～0.500g，

NaN₃：0.002～0.200g，

对苯二氨0.025～2.500g，

甘油：2～45ml，

余量为蒸馏水。

所述生化缓冲液为磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、三羟甲基氨基甲烷或N-(2-羟乙基)哌嗪-N-2-乙烷磺酸中的任意一种。

所述荧光素为异硫氰酸荧光黄、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、藻红蛋白或7-氨基-4-甲基香豆素中的任意一种。

所述精子酪氨酸磷酸化的检测试剂盒还包括固定液、组织载片、可盛装组织载片的载玻片桶以及盖玻片。

所述固定液为体积含量为10～100%的有机溶液，所述有机溶液为乙醇溶液、乙醚酒精液、甲醇溶液、乙酸溶液、丙酮溶液、carnoy固定液或中性缓冲甲醛液中的任意一种。

本发明还提供了所述的试剂盒进行精子酪氨酸磷酸化检测的方法，包括如下步骤：

步骤一：在试管底部加入完全液化的新鲜的精液标本，在精液上层加入体积为精液体积1～1.5倍的获能缓冲液；

步骤二：保持液面分层且试管呈45°角倾斜，放置于37℃、CO₂占总体积含量5%、空气占总体积含量95%的CO₂培养箱中孵育2小时，以诱导精子获能，在其最上层形成含有活动精子的获能培养液；

步骤三：吸取最上层的获能培养液，并在其中加入体积为前述吸取的获能培养液体积8～20倍的生理盐水悬浮精子，离心得到精子沉淀团；

步骤四：在精子沉淀团中加入生理盐水重新悬浮精子并计数精子密度；

步骤五：以生理盐水将精子沉淀团调配至密度为1×10⁶～30×10⁶活动精子/ml的精子悬液；

步骤六：取上述调配后的精子悬液5μl，均匀涂片于组织载片上的涂片窗内，空气中自然干燥；

步骤七：将涂布有精子悬液的组织载片完全浸泡于盛有固定液的载玻片桶内，盖紧盖后置室温固定20～40min，蒸馏水洗涤；

步骤八：去除组织载片表面及涂片窗内的水分，在涂片窗内加入荧光结合物30～50μl进行染色，水平放置于湿盒内，2～8℃冰箱过夜反应或者30～45℃反应0.5～1.5小时；

步骤九：取出组织载片，蒸馏水洗涤，去除组织载片表面及涂片窗内的水分；

步骤十：在每个涂片窗内加1滴荧光封固液，盖上盖玻片，使用有蓝色荧光滤色片的荧光显微镜在激发光450-490nm、100倍物镜下观察结果，其中，每个涂片窗至少观察400个精子，记录精子酪氨酸磷酸化的数量，精子酪氨酸磷酸化判定标准：精子头部呈橙红色，精子中尾部明显增粗且呈明亮的黄绿色荧光，表示发生了酪氨酸磷酸化；然后记录头部呈橙红色的精子，即被观察精子的总数，来计算精子酪氨酸磷酸化发生率：

精子酪氨酸磷酸化发生率（%）=精子酪氨酸磷酸化的数量/被观察精子的总数×100%。

步骤五中的以精子悬液的密度被调配至10×10⁶活动精子/ml的精子悬液。

所述步骤十中是在荧光显微镜的100W荧光汞灯下观察结果。

所述步骤七和步骤九所述的蒸馏水洗涤，其洗涤次数为3次，每次浸泡2min。

本发明相对于现有技术，具有如下有益效果：本发明在方法学的各环节进行了最优化设计，包括获能和上游法的最佳缓冲液配比、专业组织载片提供了稳定的反应场所、特异性结合的精子双标记技术配方，并消除了精液中脱落细胞等非精子物质对检测结果的影响，从而保证了方法学的可靠性，检测结果特异，重复性好；由于采用了优化检测方案，减少了操作步骤和操作时间，大大提高了检测效率；由于采用了优化检测方案，减化了试剂结构，较大程度地降低了检测成本；由于操作简单、采用即用型试剂且性能稳定。

附图说明

图1为510±40nm蓝色滤色块荧光激发下发生酪氨酸磷酸化和未发生酪氨酸磷酸化的精子的显微照片。

图2为与图1同一视野中500-550nm绿色荧光滤色块荧光激发下滤去中尾部黄绿色荧光只显示精子头部的橙红色荧光的精子的显微照片。

图3为与图1同一视野中450-490nm蓝色荧光滤色块荧光激发下中尾部呈明亮黄绿色且明显增粗的精子数量的显微照片。

具体实施方式

本发明的检验原理是荧光染色法，精子体外获能后经历浆膜流体性增强、超活化运动和cAMP激活等一系列复杂的分子和生化反应，精子中尾段发生酪氨酸磷酸化，发生酪氨酸磷酸化的精子可与异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗酪氨酸磷酸化抗体结合，450～490nm蓝光激发后精子中尾部发出绿色荧光。

本发明所用的仪器、设备和材料：

1.适用仪器：荧光显微镜

2.操作过程中用到的其他设备：

1）2－8℃冰箱                       5）光学显微镜

2）－20℃冷柜                       6）二氧化碳培养箱

3）37℃水浴箱                       7）超净工作台

4）低速离心机                       8）精子计数装置

3.其他需要的材料

1）精液采样装备                     5）5ml玻璃试管

2）液化剂                           6）15ml锥形离心管

3）1-10μl数字可调移液枪和一次吸头  7）Eppendorf管

4）一次性塑料吸管                   8）湿盒

实施例1

一、试剂盒制备

1.配制获能缓冲液

1）称取N-(2-羟乙基)哌嗪-N-2-乙烷磺酸（HEPES）4.766g、牛血清蛋白3.5g、乳酸钠3.7g、葡萄糖1.0g溶于800毫升蒸馏水中，搅拌溶解；

2）用0.5mol/L的NaOH溶液调pH至7.5，用蒸馏水定容至1000毫升，即为获能缓冲液，置于4℃保存，每套试剂盒只需60ml。

2.配制固定液

称取100ml甲醇作为本试剂盒的固定液。

3.荧光结合物配制

使用1.0ml的浓度为0.5mg/ml的酪氨酸磷酸化抗体-FITC与99ml的浓度为0.01mol/L、pH8.0的磷酸盐缓冲液配制成含酪氨酸磷酸化抗体-FITC浓度为5mg/L的100ml磷酸盐缓冲液，即为荧光结合物，每套试剂盒只需2ml。其中酪氨酸磷酸化抗体-FITC是购买于SouthernBiotechnology Associates,Inc.的Mouse Anti-PhosphotyrosineFITC,(Clone PY20)(规格：0.5mg/ml,1.0ml)。

4.配制荧光封固液

1）称取Na₂HPO₄·12H₂O0.6g、KH₂PO₄0.05g、NaN₃0.02g、对苯二氨0.25g置于烧杯，加蒸馏水至70ml；

2）再加入20ml甘油，搅拌混匀；

3）最后用0.5mol/L的NaOH溶液调pH至8.0，加蒸馏水至100ml，搅拌均匀即为荧光封固液，4℃保存，每套试剂盒只需3ml。

5.组织载片和长形盖玻片

1）组织载片规格25.4×76.2mm，厚度1～1.2mm，进行烤漆处理，每张载玻片上形成8个直径8mm的透明视窗，用于精子涂布。

2）长形盖玻片规格：24×60mm。

综上，将上述各种试剂、组织载片和长形盖玻片制备出试剂盒组成如下：

二、用上述试剂盒进行精子酪氨酸磷酸化检测

（一）精子样本准备

受试者禁欲3天，通过手淫法（或用特制的精液采集套以性交方式）留取全部精液标本，取此新鲜精液标本，将新鲜的精液标本置37℃或室温30-60min，待其完全液化后1小时内进行检测，若精液液化迟缓或粘稠度过高，可加入适量的液化剂如精子洗涤液，以吸管反复吹打精液促进其完全液化并降低粘稠度。

（二）试剂准备

临用前将获能缓冲液置于37℃、5%CO₂培养箱中至少平衡1小时。

固定液、组织载片、荧光结合物和荧光封固液置室温至少平衡0.5小时。

（三）检测步骤

步骤一：在洁净的5ml玻璃小试管（或无毒圆底塑料小试管）底部，加入上述完全液化的新鲜精液1ml，在精液上层加入1.2ml获能缓冲液。（获能缓冲液开封后一次性分装放-20℃保存，用前取出解冻，由于获能缓冲液容易被细菌污染，从已开盖后的试剂瓶中吸取获能缓冲液时，应严格执行无菌操作，不得使用已产生絮状沉淀物的获能缓冲液，未用完的获能缓冲液置2～8℃保存，尽量避免多次反复使用）

步骤二：勿打乱液面分层，保持试管45°角倾斜，置于37℃、5%CO₂（CO₂占总体积含量5%，空气占总体积含量95%，本申请其它处同此）培养箱中孵育2小时，以诱导精子获能，在其最上层形成获能培养液。

步骤三：小心吸取最上层含有活动精子的获能培养液0.5ml至锥底离心管中，加入8ml生理盐水，悬浮精子，300g离心10分钟在其管底形成精子沉淀团。

步骤四：弃去精子沉淀团上方的液体，在底下精子沉淀团中加入生理盐水至总体积0.2ml，重新混匀悬浮精子并计数精子密度。

步骤五：以生理盐水调配至密度为1×10⁶活动精子/ml的精子悬液。

步骤六：取上述调配后的精子悬液5μl，均匀涂片于组织载片上的涂片窗内，空气中自然干燥。

步骤七：将干燥后的组织载片完全浸泡于盛有固定液的载玻片桶内，盖紧盖后置于室温固定30min；蒸馏水洗涤3次，每次浸泡2min。（注意：载玻片桶内的固定液可至少反复使用3～5次，使用过程中应尽量避免固定液长时间暴露于空气中，以免试剂挥发而失效。）

步骤八：去除组织载片表面及涂片窗内的水分（可用洗耳球轻轻吹干），在涂片窗内加入上述荧光结合物40μl进行染色，水平放置于湿盒内，2～8℃冰箱过夜反应8～20小时。

步骤九：从冰箱取出组织载片，蒸馏水洗涤3次，每次浸泡2min。去除组织载片表面及涂片窗内的水分（可用洗耳球轻轻吹干或空气中自然干燥）。

步骤十：在每个涂片窗内加1滴荧光封固液，盖上盖玻片，在荧光显微镜激发光450-490nm（蓝色荧光滤色块）、100×物镜条件且在100W荧光汞灯下观察结果。每个涂片窗至少观察计数400个精子，记录发生酪氨酸磷酸化的精子数量。

(四)结果判定与计算

精子酪氨酸磷酸化判定标准：精子头部呈橙红色（见图中圆形状），精子中尾部明显增粗且呈明亮的黄绿色荧光（见图中长条状），表示发生了酪氨酸磷酸化。

具体来说，经510±40nm（蓝色滤色块）荧光激发后，精子头部呈橙红色；精子中尾部明显增粗且呈明亮的黄绿色荧光，表示发生了酪氨酸磷酸化（图1中“→”所示）；精子中尾部无荧光或呈淡绿色荧光，则表示精子未发生酪氨酸磷酸化（图1中无“→”标识的精子）。且每标本至少观察计数400个头部呈橙红色的精子，记录发生酪氨酸磷酸化的精子数量。

精子头部染色荧光染料的激发光510±40（470-550）nm，发射光620±50nm。某些发射光范围较窄（450-490nm）的蓝色荧光滤色块，可能只能观察到发生酪氨酸磷酸化精子的中尾部黄绿色荧光，而看不到精子头部的橙红色荧光（图3），这时需要用到绿色荧光滤色块（500-550nm），即先在绿色荧光滤色块下计数被观察精子（头部呈橙红色发荧光）的总数（图2），不移动视野，切换到蓝色荧光滤色块后，再计数在同一视野内中尾部呈明亮黄绿色且明显增粗的精子数量，即发生酪氨酸磷酸化的精子数量（图3中“→”所示）。

本实施例中观察了400个精子，其中中尾部呈明亮黄绿色且明显增粗的精子数量为38,被观察精子（头部呈橙红色发荧光）的总数为400个，精子酪氨酸磷酸化发生率=38/400*100%=9.5%。

(五)重复性验证

取上述已液化的新鲜精液分为20等份（分别标记为样品1，样品2…，样品20），按照上述试剂盒检测方法对每份进行检测，精子酪氨酸磷酸化发生率依次为：9.8%，9.6%，9.9%，10.1%，9.8%，9.6%，9.9%，9.7%，9.8%，9.7%，9.8%，9.5%，9.9%，9.7%，9.6%，10.0%，9.9%，9.9%，10.0%，9.5%。经计算以上精子酪氨酸磷酸化发生率的平均值9.79%，变异数（CV）1.7%，变异数较小，变异程度也较小（波动较小），因为此检测方法重复性和稳定性好。

实施例2

一、试剂盒制备

1.配制获能缓冲液

1）称取N-(2-羟乙基)哌嗪-N-2-乙烷磺酸（HEPES）0.4766g、牛血清蛋白0.35g、乳酸钠0.37g、葡萄糖0.1g溶于800毫升蒸馏水中，搅拌溶解；

2）用0.01mol/L NaOH调pH至7.0，用蒸馏水定容至1000毫升，即为获能缓冲液，置于4℃保存，每套试剂盒只需60ml。

2.配制固定液

称取90ml乙醇，用蒸馏水定容至100ml，作为每套试剂盒的固定液。

3.荧光结合物配制

使用1.0ml的浓度为0.5mg/ml的酪氨酸磷酸化抗体-FITC与499ml的浓度为0.01mol/L、pH8.0的磷酸盐缓冲液配制成含酪氨酸磷酸化抗体-FITC浓度为1mg/L的500ml磷酸盐缓冲液，即为荧光结合物，每套试剂盒只需2ml。其中酪氨酸磷酸化抗体-FITC是购买于Southern Biotechnology Associates,Inc.的MouseAnti-Phosphotyrosine FITC,(Clone PY20)(规格：0.5mg/ml，1.0ml)。

4.配制荧光封固液

1）称取Na₂HPO₄·12H₂O0.06g、KH₂PO₄0.005g、NaN₃0.002g、对苯二氨0.025g置于烧杯，加蒸馏水至70ml；

2）加入2ml甘油，搅拌混匀；

3）最后用0.01mol/L的NaOH溶液调pH至7.5，加蒸馏水至100ml，搅拌均匀即为荧光封固液，4℃保存，每套试剂盒只需3ml。

5.组织载片和长形盖玻片

1）组织载片规格25.4×76.2mm，厚度1～1.2mm，进行烤漆处理，每张载玻片上形成8个直径5mm的透明视窗，用于精子涂布。

2）长形盖玻片规格：24×60mm。

综上，将上述各种试剂、组织载片和长形盖玻片制备出试剂盒组成如下：

二、用上述试剂盒进行精子酪氨酸磷酸化检测

（一）精子样本准备

受试者禁欲7天，通过手淫法（或用特制的精液采集套以性交方式）留取全部精液标本，取此新鲜精液标本，待其完全液化后1小时内进行检测，若精液液化迟缓或粘稠度过高，可加入适量的液化剂，其中液化剂是深圳市博锐德生物科技有限公司的精液液化剂，按10μl液化剂/ml精液的比例加入，促进精液完全液化并降低粘稠度。

（二）试剂准备

临用前将获能缓冲液置于37℃、5%CO₂培养箱中至少平衡1小时。

固定液、组织载片、荧光结合物和荧光封固液置室温至少平衡0.5小时。

（三）检测步骤

步骤一：在洁净的5ml玻璃小试管（或无毒圆底塑料小试管）底部，加入上述完全液化的新鲜精液1ml，在精液上层加入1.2ml获能缓冲液。（获能缓冲液开封后一次性分装放-20℃保存，用前取出解冻，由于获能缓冲液容易被细菌污染，从已开盖后的试剂瓶中吸取获能缓冲液时，应严格执行无菌操作，不得使用已产生絮状沉淀物的获能缓冲液，未用完的获能缓冲液置2～8℃保存，尽量避免多次反复使用）

步骤二：勿打乱液面分层，保持试管45°角倾斜，置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育1小时，以诱导精子获能，在其最上层形成获能培养液。

步骤三：小心吸取最上层含有活动精子的获能培养液0.8ml至锥底离心管中，加入10ml生理盐水，悬浮精子，200g离心20分钟在其管底形成精子沉淀团。

步骤四：弃去精子沉淀团上方的液体，在底下精子沉淀团中加入生理盐水至总体积0.3ml，重新混匀悬浮精子并计数精子密度。

步骤五：以生理盐水调配至密度为10×10⁶活动精子/ml的精子悬液。

步骤六：取上述调配后的精子悬液5μl，均匀涂片于组织载片上的涂片窗内，空气中自然干燥。

步骤七：将干燥后的组织载片完全浸泡于盛有固定液的载玻片桶内，盖紧盖后置于室温固定3小时；蒸馏水洗涤3次，每次浸泡2min。（注意：载玻片桶内的固定液可至少反复使用3～5次，使用过程中应尽量避免固定液长时间暴露于空气中，以免试剂挥发而失效。）

步骤八：去除组织载片表面及涂片窗内的水分（可用洗耳球轻轻吹干），在涂片窗内加入上述荧光结合物40μl进行染色，水平放置于湿盒内，2～8℃冰箱过夜反应8～20小时。

步骤九：从冰箱取出组织载片，蒸馏水洗涤3次，每次浸泡2min。去除组织载片表面及涂片窗内的水分（可用洗耳球轻轻吹干或空气中自然干燥）。

步骤十：在每个涂片窗内加1滴荧光封固液，盖上盖玻片，在荧光显微镜激发光450-490nm（蓝色荧光滤色块）、100×物镜条件且在100W荧光汞灯下观察结果。每个涂片窗至少观察计数400个精子，记录发生酪氨酸磷酸化的精子数量。

(四)结果判定与计算

结果判定与计算见实施例1。

本实施例中观察了400个精子，其中中尾部呈明亮黄绿色且明显增粗的精子数量为71,被观察精子（头部呈橙红色发荧光）的总数为400，精子酪氨酸磷酸化发生率=71/400*100%=17.8%.

(五)重复性验证

取上述已液化的新鲜精液分为20等份（分别标记为样品1，样品2…，样品20），按照上述试剂盒检测方法对每份进行检测，精子酪氨酸磷酸化发生率依次为：17.5%，16.9%，17.9%，17.9%，18.5%，17.3%，17.7%，17.8%，18.7%，18.0%，18.1%，18.7%，17.6%，17.5%，18.2%，17.8%，17.7%，17.3%，18.3%，18.0%。经计算以上精子酪氨酸磷酸化发生率的平均值17.9%，变异数（CV）2.6%，变异数较小，变异程度也较小（波动较小），因为此检测方法重复性和稳定性好。

实施例3

一、试剂盒制备

1.配制获能缓冲液

1）称取N-(2-羟乙基)哌嗪-N-2-乙烷磺酸（HEPES）23.83g、牛血清蛋白20.0g、乳酸钠20.0g、葡萄糖10.0g溶于800毫升蒸馏水中，搅拌溶解；

2）用0.5mol/L NaOH调pH至9.0，用蒸馏水定容至1000毫升，即为获能缓冲液，置于4℃保存，每套试剂盒只需60ml。

2.配制固定液

称取100ml乙酸，作为每套试剂盒的固定液。

3.荧光结合物配制

使用1.0ml的浓度为0.5mg/ml酪氨酸磷酸化抗体-FITC与49ml的浓度为0.01mol/L、pH8.0的磷酸盐缓冲液配制成含酪氨酸磷酸化抗体-FITC的浓度10mg/L的50ml磷酸盐缓冲液，即为荧光结合物，每套试剂盒只需2ml。其中酪氨酸磷酸化抗体-FITC是购买于SouthernBiotechnology Associates,Inc.的Mouse Anti-PhosphotyrosineFITC,(Clone PY20)(0.5mg/ml,1.0ml)。

4.配制荧光封固液

1）称取Na₂HPO₄·12H₂O6g、KH₂PO₄0.5g、NaN₃0.2g、对苯二氨2.5g置于烧杯，加蒸馏水至50ml；

2）加入45ml甘油，搅拌混匀；

3）最后用0.5mol/L的NaOH溶液调pH至9.0，加蒸馏水至100ml，搅拌均匀即为荧光封固液，4℃保存，每套试剂盒只需3ml。

5.组织载片和长形盖玻片

1）组织载片规格25.4×76.2mm，厚度1～1.2mm，进行烤漆处理，每张载玻片上形成8个直径10mm的透明视窗，用于精子涂布。

2）长形盖玻片规格：24×60mm。

综上，将上述各种试剂、组织载片和长形盖玻片制备出试剂盒组成如下：

二、用上述试剂盒进行精子酪氨酸磷酸化检测

（一）精子样本准备

受试者禁欲7天，通过手淫法（或用特制的精液采集套以性交方式）留取全部精液标本，取此新鲜精液标本，待其完全液化后1小时内进行检测，若精液液化迟缓或粘稠度过高，可加入适量的液化剂，其中液化剂是深圳市博锐德生物科技有限公司的精液液化剂，按10μl液化剂/ml精液的比例加入，促进精液完全液化并降低粘稠度。

（二）试剂准备

临用前将获能缓冲液置于37℃、5%CO₂培养箱中至少平衡1小时。

固定液、组织载片、荧光结合物和荧光封固液置室温至少平衡0.5h。

（三）检测步骤

步骤一：在洁净的5ml玻璃小试管（或无毒圆底塑料小试管）底部，加入上述完全液化的新鲜精液1ml，在精液上层加入1.2ml获能缓冲液。（获能缓冲液开封后一次性分装放-20℃保存，用前取出解冻，由于获能缓冲液容易被细菌污染，从已开盖后的试剂瓶中吸取获能缓冲液时，应严格执行无菌操作，不得使用已产生絮状沉淀物的获能缓冲液，未用完的获能缓冲液置2～8℃保存，尽量避免多次反复使用）

步骤二：勿打乱液面分层，保持试管45°角倾斜，置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育3小时，以诱导精子获能，在其最上层形成获能培养液。

步骤三：小心吸取最上层含有活动精子的获能培养液1.0ml至锥底离心管中，加入10ml生理盐水，悬浮精子，400g离心5分钟在其管底形成精子沉淀团。

步骤四：弃去精子沉淀团上方的液体，在底下精子沉淀团中加入生理盐水至总体积0.2ml，重新混匀悬浮精子并计数精子密度。

步骤五：以生理盐水调配至密度为30×10⁶活动精子/ml的精子悬液。

步骤六：取上述调配后的精子悬液5μl，均匀涂片于组织载片上的涂片窗内，空气中自然干燥。

步骤七：将干燥后的组织载片完全浸泡于盛有固定液的载玻片桶内，盖紧盖后置于室温固定20min；蒸馏水洗涤3次，每次浸泡2min。（注意：载玻片桶内的固定液可至少反复使用3～5次，使用过程中应尽量避免固定液长时间暴露于空气中，以免试剂挥发而失效。）

步骤八：去除组织载片表面及涂片窗内的水分（可用洗耳球轻轻吹干），在涂片窗内加入上述荧光结合物40μl进行染色，水平放置于湿盒内，37℃反应1小时。

步骤九：取出组织载片，蒸馏水洗涤3次，每次浸泡2min。去除组织载片表面及涂片窗内的水分（可用洗耳球轻轻吹干或空气中自然干燥）。

步骤十：在每个涂片窗内加1滴荧光封固液，盖上盖玻片，在荧光显微镜激发光450-490nm（蓝色荧光滤色块）、100×物镜条件且在100W荧光汞灯下观察结果。每个涂片窗至少观察计数400个精子，记录发生酪氨酸磷酸化的精子数量。

(四)结果判定与计算

结果判定与计算见实施例1。

本实施例中观察了400个精子,其中中尾部呈明亮黄绿色且明显增粗的精子数量为137个,被观察精子（头部呈橙红色发荧光）的总数为400个，精子酪氨酸磷酸化发生率=137/400*100%=34.3%。

(五)重复性验证

取上述已液化的新鲜精液分为20等份（分别标记为样品1，样品2…，样品20），按照上述试剂盒检测方法对每份进行检测，精子酪氨酸磷酸化发生率依次为：34.4%，33.9%，34.6%，33.9%，34.5%，34.3%，33.7%，33.8%，34.7%，33.3%，34.1%，34.7%，33.6%，34.5%，34.5%，33.8%，33.6%，33.3%，34.2%，34.1%。经计算以上精子酪氨酸磷酸化发生率的平均值34.1%，变异数（CV）1.3%，变异数较小，变异程度也较小（波动较小），因为此检测方法重复性和稳定性好。

Claims (8)

1.一种精子酪氨酸磷酸化的检测试剂盒，其特征在于，包括如下组分：

1)获能缓冲液，其pH值为7.0～9.0，是以蒸馏水溶解以下物质配制而成，每1000ml获能缓冲液含有：

生化缓冲液为N-(2-羟乙基)哌嗪-N-2-乙烷磺酸：0.4～24.0g，

牛血清蛋白：0.4～20.0g，

乳酸钠：0.3～20.0g，

葡萄糖:0.1～10.0g，

余量为蒸馏水；

2)荧光结合物，其pH值为7.0～9.0，是含荧光素标记的酪氨酸磷酸化抗体的量为1～10mg/L的磷酸盐缓冲液；

3)荧光封固液,其pH值为7.0～9.0，是以蒸馏水溶解以下物质配制而成，每100ml含有：

Na₂HPO₄·12H₂O：0.06～6.00g，

KH₂PO₄：0.005～0.500g，

NaN₃：0.002～0.200g，

对苯二氨0.025～2.500g，

甘油：2～45ml，

余量为蒸馏水。

2.根据权利要求1所述的精子酪氨酸磷酸化的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光素为异硫氰酸荧光黄、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、藻红蛋白或7-氨基-4-甲基香豆素中的任意一种。

3.根据权利要求2所述的精子酪氨酸磷酸化的检测试剂盒，其特征在于，所述精子酪氨酸磷酸化的检测试剂盒还包括固定液、组织载片、可盛装组织载片的载玻片桶以及盖玻片。

4.根据权利要求3所述的精子酪氨酸磷酸化的检测试剂盒，其特征在于，所述固定液为体积含量为10～100％的有机溶液，所述有机溶液为乙醇溶液、乙醚酒精液、甲醇溶液、乙酸溶液、丙酮溶液、carnoy固定液或中性缓冲甲醛液中的任意一种。

5.一种利用权利要求1至4中任一项所述的试剂盒进行精子酪氨酸磷酸化检测的方法，包括如下步骤：

步骤一：在试管底部加入完全液化的新鲜的精液标本，在精液上层加入体积为精液体积1～1.5倍的获能缓冲液；

步骤二：保持液面分层且试管呈45°角倾斜，放置于37℃、CO₂占总体积含量5％、空气占总体积含量95％的CO₂培养箱中孵育2小时，以诱导精子获能，在其最上层形成含有活动精子的获能培养液；

步骤三：吸取最上层的获能培养液，并在其中加入体积为前述吸取的获能培养液体积8～20倍的生理盐水悬浮精子，离心得到精子沉淀团；

步骤四：在精子沉淀团中加入生理盐水重新悬浮精子并计数精子密度；

步骤五：以生理盐水将精子沉淀团调配至密度为1×10⁶～30×10⁶活动精子/ml的精子悬液；

步骤六：取上述调配后的精子悬液5μl，均匀涂片于组织载片上的涂片窗内，空气中自然干燥；

步骤七：将涂布有精子悬液的组织载片完全浸泡于盛有固定液的载玻片桶内，盖紧盖后置室温固定20～40min，蒸馏水洗涤；

步骤八：去除组织载片表面及涂片窗内的水分，在涂片窗内加入荧光结合物30～50μl进行染色，水平放置于湿盒内，2～8℃冰箱过夜反应或者30～45℃反应0.5～1.5小时；

步骤九：从冰箱取出组织载片，蒸馏水洗涤，去除组织载片表面及涂片窗内的水分；

步骤十：在每个涂片窗内加1滴荧光封固液，盖上盖玻片，使用有蓝色荧光滤色片的荧光显微镜在激发光450-490nm、100倍物镜下观察结果，其中，每个涂片窗至少观察400个精子，记录精子酪氨酸磷酸化的数量，精子酪氨酸磷酸化判定标准：精子头部呈橙红色，精子中尾部明显增粗且呈明亮的黄绿色荧光，表示发生了酪氨酸磷酸化；然后记录头部呈橙红色的精子，即被观察精子的总数，来计算精子酪氨酸磷酸化发生率：

精子酪氨酸磷酸化发生率(％)＝精子酪氨酸磷酸化的数量/被观察精子的总数×100％。

6.根据权利要求5所述的试剂盒进行精子酪氨酸磷酸化检测的方法，其特征在于，步骤五中的以精子悬液的密度被调配至10×10⁶活动精子/ml。

7.根据权利要求6所述的试剂盒进行精子酪氨酸磷酸化检测的方法，其特征在于，所述步骤十中是在荧光显微镜的100W荧光汞灯下观察结果。

8.根据权利要求7所述的试剂盒进行精子酪氨酸磷酸化检测的方法，其特征在于，所述步骤七和步骤九所述的蒸馏水洗涤，其洗涤次数为3次，每次浸泡2min。