BR112012012342B1 - Dispositivo de fluxo lateral para detectar um analito em uma amostra, e método de aplicação de uma amostra a uma tira de teste cromatográfico de fluxo lateral de um dispositivo de fluxo lateral - Google Patents
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Abstract
dispositivo de fluxo lateral para detectar um analito em uma amostra, tira de teste universal, compressor de amostra, método de aplicação de uma amostra a uma tira de 5 teste, método de acentuação de um sinal sobre um dispositivo de fluxo lateral e método de detecção de pelo menos um analito em uma amostra um compressor de amostra aplica pressão a um coletor de amostra e uma zona de aplicação de amostra de uma tira de teste para transferir uma amostra a partir do coletor de amostra e um parceiro de ligação de um analito à zona de aplicação de amostra em um dispositivo de fluxo lateral. pelo menos um dos parceiros de ligação do analito não está localizado sobre a tira de teste antes do uso do dispositivo de fluxo lateral. a tira de teste pode ser uma tira de teste universal sem nenhuma molécula que liga especificamente o analito que está localizado sobre a tira de teste. o compressor de amostra pode ser um compressor de amostra universal também sem nenhuma molécula que liga especificamente o analito sobre o compressor de amostra. o dispositivo de fluxo lateral também pode incluir um ou mais elementos acentuadores, em que os elementos de acentuação se ligam ao sanduíche de analito para intensificar um sinal de detecção na zona de teste.
Description
[001] Este pedido reivindica uma ou mais invenções, as quais foram reveladas em Pedido Provisório sob No 61/266.641, depositado em 4 de dezembro de 2009, intitulado "LATERAL FLUXO NUCLEIC ACID DETECTOR", Pedido Provisório sob No 61/331.966, depositado em 6 de maio de 2010, intitulado "MULTIPLANAR LATERAL FLUXO ASSAY WITH SAMPLE COMPRESSOR", Pedido Provisório sob No 61/352.093, depositado em 7 de junho de 2010, intitulado "LATERAL FLOW ASSAYS", e Pedido Provisório sob No 61/392.981, depositado em 14 de outubro de 2010, intitulado "MULTIPLANAR LATERAL FLUXO ASSAY WITH SAMPLE COMPRESSOR". Reivindica-se, pelo presente e conforme faculta o Título 35 USC §119(e), o benefício dos pedidos provisórios dos Estados Unidos da América, sendo os pedidos supracitados incorporados, pelo presente, neste documento, a título de referência.
[002] ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] A invenção pertence ao campo de testes laboratoriais remotos. Mais particularmente, a invenção pertence a ensaios de fluxo lateral.
[004] Ensaios de fluxo lateral é um subconjunto de ensaios que combinam diversos reagentes e etapas de processo em uma tira de ensaio, sendo que fornece, portanto, um meio sensível e rápido para a detecção de moléculas alvo. Imunoensaios de fluxo lateral baseados em anticorpo são disponível para uma faixa ampla de analitos alvo e podem ser projetados para princípios de teste competitivo ou sanduíche. Geralmente, analitos com peso molecular alto com vários epítopos são analisados em um formato sanduíche enquanto que moléculas pequenas que representam somente um epítopo são detectadas por meio de um ensaio competitivo. Os primeiros testes foram feitos para gonadotrofina coriônica humana (hCG). Atualmente existem testes comercialmente disponíveis para monitorar ovulação, detectar organismos de doenças contagiosas, analisar fármacos de abuso, e medir outros analitos importantes à fisiologia humana. Os produtos também foram introduzidos para teste veterinário, teste ambiental, e monitoramento de produto.
[005] Na técnica anterior, o receptor etiquetado móvel (também conhecido como o traçador ou o teste conjugado no presente documento) nesses ensaios é seco na tira de teste, contida em uma solução de eluição externa (de modo que isto possa ser pré-misturada com a amostra anterior à aplicação na tira de teste), ou parte do meio de eluição.
[006] A Publicação de Patente EU EP0582231, publicada em 9 de fevereiro de 1994, intitulada “SOLID PHASE ASSAY”, revela um ensaio com um suporte de sólido poroso com uma primeira porção que entra em contato com uma amostra que pode inclui um analito de interesse. A amostra flui através do suporte sólido, e o analito, se presente, se combina com um traçador, o qual é ligado, de forma reversível, no suporte sólido. A amostra e o traçador percorre, inicialmente, em uma direção perpendicular à primeira porção (por exemplo, de forma vertical) por meio de fluxo capilar. O traçador e analito então continuam a percorrer por fluxo capilar através do material para uma segunda porção que inclui um aglutinante imobilizado, o qual se liga ao em um formato de imunoensaio sanduíche. O percurso parar a segunda porção ocorrem em uma direção perpendicular à direção na qual o traçador e amostra percorrem inicialmente (por exemplo, de forma lateral). Todos os percursos da amostra e traçador ocorrem devido ao fluxo capilar através do dispositivo. Embora o percurso ocorra, de forma vertical e lateral, existe uma única trajetória do fluxo. A amostra, o traçador, e o aglutinante imobilizado estão todos na mesma trajetória do fluxo.
[007] A Publicação de Patente sob No U.S. 2007/0224701, publicada em 27 de setembro de 2007, intitulada “COMBINATION VERTICAL AND LATERAL FLUXO IMMUNOASSAY DEVICE”, revela dispositivos, kits e métodos de imunoensaio para determinar a presença ou ausência de um analito em uma amostra líquida com o uso de uma combinação de fluxo vertical e fluxo lateral. O dispositivo inclui uma almofada de traçador com um receptor etiquetado que está verticalmente justaposto com um meio de suporte de aglutinante. O dispositivo revelado nesta publicação é multi-secionado, mas, semelhante a EP0582231, somente tem uma única trajetória do fluxo. A amostra, o receptor etiquetado, e o meio de suporte de aglutinante estão todos na mesma trajetória do fluxo.
[008] O compressor de amostra aplica pressão a um coletor de amostra em uma zona de aplicação de amostra de uma tira de teste para transferir uma amostra em um coletor de amostra e um parceiro de ligação de um analito para uma zona de aplicação de amostra em um dispositivo de fluxo lateral. Pelo menos um dos parceiros de ligação do analito não está localizado na tira de teste ou na solução de eluição anterior ao uso do dispositivo de fluxo lateral. A tira de teste pode ser uma tira de teste universal com nenhuma molécula que ligue especificamente o analito na tira de teste. Um compressor de amostra pode ser um compressor de amostra universal com nenhuma molécula que ligue especificamente o analito em um compressor de amostra. O dispositivo de fluxo lateral também pode incluir um elemento de acentuação, em que o elemento de acentuação se liga ao analito em sanduíche para intensificar um sinal de detecção na zona de teste.
[009] Em uma modalidade da presente invenção, o dispositivo de fluxo lateral para detectar um analito inclui um compressor de amostra, um coletor de amostra com uma porção de coleta de amostra, uma tira de teste com uma zona de aplicação de amostra e uma zona de teste, um conjugado que inclui um primeiro parceiro de ligação para o analito e uma etiqueta, e um segundo parceiro de ligação para o analito. O conjugado ou o segundo parceiro de ligação ou ambos o conjugado e o segundo parceiro de ligação não estão localizados na tira de teste anterior ao uso do dispositivo de fluxo lateral. O compressor de amostra, o coletor de amostra, e a tira de teste formam uma pilha vertical para aplicar uma amostra à tira de teste por compressão. O compressor de amostra tem, preferencialmente, uma almofada/velo, sendo que o conjugado e/ou o segundo parceiro de ligação estão localizados na almofada anterior ao uso do dispositivo de fluxo lateral. Em algumas modalidades, o dispositivo de fluxo lateral inclui um primeiro parceiro de ligação de controle localizado em um compressor de amostra almofada e um segundo parceiro de ligação de controle imobilizado em uma zona de controle da tira de teste, em que o primeiro parceiro de ligação de controle é um parceiro de ligação para o segundo parceiro de ligação de controle. O dispositivo de fluxo lateral é formado, preferencialmente, de modo que um resultado positivo semente seja alcançado por isolamento do analito na zona de teste pela ligação do analito ao primeiro parceiro de ligação e ao segundo parceiro de ligação. A zona de teste inclui, preferencialmente, nenhuma molécula a qual liga, de forma específica, o analito. Preferencialmente, o segundo parceiro de ligação inclui um identificador e a zona de teste inclui um parceiro de ligação imobilizado para o identificador.
[010] Em outra modalidade da presente invenção, a tira de teste universal inclui uma zona de teste, mas nenhuma molécula que liga, de forma específica, um analito. A tira de teste também inclui, preferencialmente, uma zona de controle com um parceiro de ligação de controle imobilizado na zona de controle. A tira de teste também inclui, preferencialmente, um identificador imobilizado na zona de teste, em que o identificador é uma porção química de biotina, avidina, neutravidina, estreptavidina, lectina ou glicosil.
[011] Em ainda outra modalidade da presente invenção, o compressor de amostra para uso em um dispositivo de fluxo lateral inclui uma almofada e pelo menos um parceiro de ligação de um analito. O compressor de amostra também inclui, preferencialmente, um parceiro de ligação de controle móvel na almofada.
[012] Em algumas modalidades, o compressor de amostra é o compressor de amostra universal com nenhuma molécula que liga, de forma específica, um analito. O compressor de amostra universal inclui, preferencialmente, uma almofada e um parceiro de ligação de controle móvel na almofada.
[013] Em outra modalidade da presente invenção, o dispositivo de fluxo lateral para detectar um analito inclui uma tira de teste com uma zona de aplicação de amostra e uma zona de teste, um conjugado com um primeiro parceiro de ligação para o analito e uma etiqueta, e um segundo parceiro de ligação para o analito e um elemento de acentuação. O analito, o conjugado, e o segundo parceiro de ligação forma um sanduíche, o qual é imobilizado na zona de teste quando o analito estiver presente, e o elemento de acentuação se ligado ao sanduíche para intensificar um sinal de detecção na zona de teste. Em algumas modalidades, o conjugado inclui ouro coloidal e o elemento de acentuação inclui pelo menos um sal de prata. Em outras modalidades, o elemento de acentuação inclui um antígeno e o conjugado inclui um parceiro de ligação específico para o antígeno. O elemento de acentuação inclui, preferencialmente, uma etiqueta. Em uma modalidade preferencial, a zona de teste não inclui uma molécula que liga, de forma específica, o analito. Preferencialmente, o segundo parceiro de ligação inclui um identificador e a zona de teste inclui um parceiro de ligação imobilizado do identificador.
[014] Em ainda outra modalidade da presente invenção, o método de aplicação de uma amostra a uma tira de teste de um dispositivo de fluxo lateral inclui: colocar um coletor de amostra com uma porção de coleta de amostra com uma amostra em uma pilha vertical entre o compressor de amostra e uma zona de aplicação de amostra da tira de teste e aplicar uma pressão a uma porção de coleta de amostra com o uso de um compressor de amostra para transferir pelo menos uma porção de uma amostra para uma zona de aplicação de amostra. The método inclui, preferencialmente, colocar uma almofada com um parceiro de ligação para uma analito na pilha vertical, e aplicar a pressão para transferir pelo menos uma porção do parceiro de ligação para uma zona de aplicação de amostra. A transferência de uma amostra para uma zona de aplicação de amostra não ocorre, preferencialmente, por fluxo.
[015] Em ainda outra modalidade da presente invenção, o método de aplicação de uma amostra a uma tira de teste de um dispositivo de fluxo lateral inclui: primeiro colocar pelo menos um parceiro de ligação externa em uma zona de aplicação de amostra da tira de teste. O parceiro de ligação externa pode estar localizado em uma almofada externa. Em modalidades em que existem dois parceiros de ligação de analito que ligam o analito antes de alcançar a zona de teste, um ou ambos os parceiros de ligação de analito podem ser adicionados. O coletor de amostra que inclui a amostra é colocado em uma pilha vertical entre o parceiro de ligação externa e o compressor de amostra. O compressor de amostra aplica pressão ao coletor de amostra para transferir o parceiro de ligação externa e pelo menos uma porção de uma amostra para uma zona de aplicação de amostra. Alternativamente, o parceiro de ligação externa poderia ser adicionado e comprimido pelo compressor de amostra, então removido, antes que o coletor de amostra seja empilhado acima de uma zona de aplicação de amostra, em que a amostra é comprimida sobre a tira de teste. Em outra modalidade alternativa, pelo menos um parceiro de ligação externa é colocado na pilha vertical entre o compressor de amostra e o coletor de amostra. Alternativamente, o coletor de amostra é adicionado e comprimido, então removido, e então o parceiro de ligação externa é adicionado e comprimido sobre a tira de teste. Em outras modalidades, o coletor de amostra está em uma pilha vertical entre um primeiro parceiro de ligação externa e um segundo parceiro de ligação externa, e o compressor de amostra aplica pressão à pilha vertical. Nessas modalidades, nem a tira e nem o compressor de amostra têm um parceiro de ligação de analito específico.
[016] A Figura 1 mostra uma tira de teste e o coletor de amostra em um dispositivo de fluxo lateral.
[017] A Figura 2A mostra o compressor de amostra em uma modalidade da presente invenção.
[018] A Figura 2B mostra outro compressor de amostra em uma modalidade da presente invenção.
[019] A Figura 2C mostra o coletor de amostra em uma modalidade da presente invenção.
[020] A Figura 3A mostra uma tira de teste de fluxo lateral em uma modalidade da presente invenção.
[021] A Figura 3B mostra um sanduíche completo, sendo que inclui o analito, o conjugado, e um parceiro de ligação imobilizado em uma modalidade da presente invenção.
[022] A Figura 3C mostra um dispositivo de fluxo lateral, sendo que inclui a tira de teste da Figura 3A, o coletor de amostra, e o compressor de amostra em uma modalidade da presente invenção.
[023] A Figura 4A mostra outra tira de teste de fluxo lateral em uma modalidade da presente invenção.
[024] A Figura 4B mostra um sanduíche completo, sendo que inclui o analito, o conjugado, e um segundo parceiro de ligação identificado em uma modalidade da presente invenção.
[025] A Figura 4C mostra um dispositivo de fluxo lateral, sendo que inclui a tira de teste da Figura 4A, o coletor de amostra, e o compressor de amostra em uma modalidade da presente invenção.
[026] A Figura 5A mostra ainda outra tira de teste de fluxo lateral em uma modalidade da presente invenção.
[027] A Figura 5B mostra um dispositivo de fluxo lateral, sendo que inclui a tira de teste da Figura 5A, o coletor de amostra, e o compressor de amostra em uma modalidade da presente invenção.
[028] A Figura 6A mostra outra tira de teste de fluxo lateral em uma modalidade da presente invenção.
[029] A Figura 6B mostra um dispositivo de fluxo lateral, sendo que inclui a tira de teste da Figura 6A, o coletor de amostra, e o compressor de amostra em uma modalidade da presente invenção.
[030] A Figura 7A mostra um dispositivo semelhante ao dispositivo da Figura 3C, exceto que a zona de teste está em uma zona de aplicação de amostra em uma modalidade da presente invenção.
[031] A Figura 7B mostra um dispositivo semelhante ao dispositivo da Figura 4C, exceto que a zona de teste está em uma zona de aplicação de amostra em uma modalidade da presente invenção.
[032] A Figura 7C mostra um dispositivo semelhante ao dispositivo da Figura 5B, exceto que a zona de teste está em uma zona de aplicação de amostra em uma modalidade da presente invenção.
[033] A Figura 7D mostra um dispositivo semelhante ao dispositivo da Figura 6B, exceto que a zona de teste está em uma zona de aplicação de amostra em uma modalidade da presente invenção.
[034] A Figura 8A mostra um dispositivo de fluxo lateral em uma modalidade da presente invenção.
[035] A Figura 8B mostra outro dispositivo de fluxo lateral em uma modalidade da presente invenção.
[036] A Figura 9 mostra uma pilha vertical em uma modalidade da presente invenção.
[037] A Figura 10 mostra um sanduíche de conjugado de ouro da técnica anterior na zona de teste.
[038] A Figura 11 mostra um sanduíche com acentuação de sinal na zona de teste em uma modalidade da presente invenção.
[039] A Figura 12 mostra um sanduíche com empilhamento na zona de teste em uma modalidade da presente invenção.
[040] A Figura 13 mostra uma vista explodida esquemática de um dispositivo de fluxo lateral com elementos de acentuação de sinal em modalidades da presente invenção.
[041] A Figura 14 mostra um dispositivo de fluxo lateral em outra modalidade da presente invenção.
[042] A Figura 15A mostra uma pilha que se forma em uma modalidade da presente invenção.
[043] A Figura 15B mostra a pilha da Figura 15A imobilizada na zona de teste.
[044] A Figura 15C mostra um complexo que se forma na zona de controle.
[045] A Figura 16 mostra um dispositivo de fluxo lateral em outra modalidade da presente invenção.
[046] A Figura 17A mostra uma pilha que se forma em uma modalidade da presente invenção.
[047] A Figura 17B mostra a pilha da Figura 17A imobilizada na zona de teste.
[048] A Figura 18 mostra um dispositivo de fluxo lateral em outra modalidade da presente invenção.
[049] A Figura 19A mostra uma pilha que se forma em uma modalidade da presente invenção.
[050] A Figura 19B mostra a pilha da Figura 19A imobilizada na zona de teste.
[051] A Figura 20A mostra uma tira de teste de fluxo lateral em uma modalidade da presente invenção.
[052] A Figura 20B mostra um sanduíche “completo”, o qual se forma, preferencialmente, antes de atingir a linha de teste, entre o analito, o conjugado etiquetado, e um segundo parceiro de ligação móvel etiquetado.
[053] A Figura 21A mostra outra modalidade de uma tira de teste de fluxo lateral com elementos de acentuação.
[054] A Figura 21B mostra o complexo empilhado na linha de teste na presença de analito.
[055] A Figura 21C mostra um complexo empilhado na linha de teste com elementos de acentuação adicionais.
[056] A presente invenção refere-se a métodos e dispositivos para detectar um analito (também conhecido como o alvo) em uma amostra, em que a amostra a ser analisada é aplicada a um excipiente cromatográfico. Em configurações de múltiplos planos para testes laboratoriais remotos, o conjugado que contém um dos parceiros de ligação do analito, em questão, é entregue, preferencialmente, a partir de um plano diferente. A amostra que contém analito é coletada diretamente da fonte e, preferencialmente, não é submetido a tratamento, eluição, diluição, ou concentração anterior. O conjugado é feito para entrar em contato com a amostra por meio do compressor de amostra, também referido no presente documento como um dispositivo de compressor. A compressão auxilia na combinação de conjugado e amostra mobilizados. O compressor de amostra, o qual inclui o conjugado em modalidades preferenciais, é, de preferência, completamente separado de um dispositivo de análise de amostra. O compressor de amostra não é parte da trajetória do fluxo na tira de teste. Como um resultado, a transferência do conjugado e da amostra para um dispositivo de análise de amostra, o qual é, de preferência, uma tira de teste, é iniciada com o uso de pressão, e não fluxo ou ação capilar. Após o compressor de amostra ser aplicado, se necessário, pode haver um lapso de tempo antes de aplicar o tampão contínuo. Esse lapso de tempo entre aplicação de amostra e o início do teste pelo fluxo pode ser de até 24 horas ou muitos dias, dependendo da estabilidade do analito. Os componentes de tira de não teste, que incluem, dependendo da modalidade, qualquer combinação do compressor de amostra, do coletor de amostra, e um ou mais parceiros de ligação externa, permanecem, preferencialmente, associados com a tira de teste até que o fluxo seja iniciado.
[057] Um dispositivo de fluxo lateral da presente invenção pode ser um imunoensaio que utiliza anticorpos ou um não imunoensaio não utiliza anticorpos, mas, ao invés disso, utiliza outros parceiros de ligação, que incluem, mas não limitados a, ácidos nucleicos, nanopartículas, ligantes, e receptores.
[058] Antes de descrição adicional da presente invenção, e para que a invenção pode ser mais prontamente compreendida, certos termos foram definidos no presente contexto já que dizem respeito à presente invenção:
[059] O termo “compressão”, conforme usado no presente documento se refere à aplicação da amostra e quaisquer componentes em uma almofada do compressor de amostra para a tira de teste. A almofada, a porção de coleta do coletor de amostra, e uma zona de aplicação de amostra são todos, preferencialmente, compressíveis de modo que a compressão dos três ocorra durante a aplicação de uma amostra para a tira de teste.
[060] O termo “pressão”, conforme usado no presente documento se refere a pressão física, e mais especificamente, pressão física aplicada pelo compressor de amostra para uma amostra no coletor de amostra e, por sua vez, para uma zona de aplicação de amostra de uma tira de teste. Conforme usado no presente documento, pressão, a qual pode ser proporcionada por uma inclinação mecânica ou por um usuário do dispositivo de fluxo lateral, faz com que a almofada do compressor de amostra, a porção de coleta do coletor de amostra, e a zona de aplicação de amostra da tira de teste entrem em contato físico para transferir a amostra e quaisquer componentes na almofada do compressor de amostra para a tira de teste. Essa transferência não ocorre, preferencialmente, por fluxo vertical.
[061] Os termos “vertical” e “verticalmente”, conforme usados no presente documento se referem à direção paralela à espessura ou profundidade, em oposição às dimensões de largura e comprimento dos elementos utilizados no dispositivo, tal como as almofadas ou meios.
[062] Os termos “lateral” e “lateralmente”, conforme usados no presente documento, se referem à direção paralela ao comprimento, em oposição às dimensões de largura e profundidade dos elementos utilizados no dispositivo, tal como as almofadas ou meios.
[063] Em algumas modalidades, muitos dos elementos da tira de teste são substancialmente planos e têm uma dimensão lateral que é maior que a dimensão vertical. As magnitudes dessas dimensões relativas entre si, entretanto, podem ser alteradas dentro do espírito da invenção. Geralmente, os termos “vertical”, “verticalmente”, “lateral”, e “lateralmente” também se referem à justaposição ou orientação dos elementos do dispositivo. Para elementos justapostos verticalmente, uma linha normal em relação a e que cruza uma superfície plana de um tal elemento também é substancialmente normal em relação a e cruza a superfície plana dos outros elementos justapostos verticalmente.
[064] O termo “trajetória do fluxo”, conforme usado no presente documento, se refere à trajetória do fluxo capilar em um dispositivo de fluxo durante o uso do dispositivo. A trajetória do fluxo em um dispositivo de fluxo lateral convencional é lateralmente ao longo do comprimento do dispositivo. Em modalidades preferenciais da presente invenção, a trajetória do fluxo somente é lateral, porque a amostra é transferida verticalmente por compressão com o uso de pressão ao invés de por fluxo. Em contraste, o fluxo vertical é usado para transferir a amostra para a tira de teste na técnica anterior discutida acima.
[065] O termo “etiqueta”, conforme usado no presente documento, se refere a qualquer átomo, átomos, molécula, ou moléculas, tal como um identificador fluorescente, usado para fornecer um sinal detectável e preferencialmente quantificável. Métodos de detecção da etiqueta incluem, mas não são limitados a, detecção visível, fluorescência, quimioluminescência, radioatividade, colorimetria, gravimetria, difração de raio X, absorção de raio X, magnetismo, e atividade enzimática. Zonas de teste de espectro visível podem ser interpretadas por um espectrômetro para render resultados de testes quantificados.
[066] O termo “lise no local”, conforme usado no presente documento, se refere a tecnologias para incorporar agentes de lise em um dispositivo de teste laboratorial remoto, tal como uma tira de teste de cromatografia ou outro dispositivo de imunoensaio de fluxo lateral, de modo que a operação de lise não seja conduzida como uma etapa separada.
[067] O termo “zona”, conforme usado no presente documento, se refere a qualquer porção da tira de teste. Os limites de uma zona são, de preferência, planos perpendiculares à direção lateral. O termo “zona” também engloba o termo “linha”, o qual se refere a uma zona que tem um comprimento na direção lateral significativamente menos que sua largura.
[068] As modalidades da presente invenção incluem ensaios em que o analito (alvo) a ser detectado não se liga diretamente a um parceiro de ligação imobilizado na zona de teste de uma tira de teste. Em vez disso, o analito interage, preferencialmente, com um ou mais parceiros de ligação de analito em outras zonas (ou no tampão, em algumas modalidades) sobre a tira. Pelo menos um dos parceiros de ligação de analito inclui um primeiro identificador que forma um complexo com um segundo identificador imobilizado na zona de teste.
[069] Em modalidades preferenciais, uma zona de controle parceiro de ligação é incluída no compressor de amostra. Com este projeto, se a zona de conjugado no compressor de amostra não for comprimida adequadamente e levado a entrar em contato com a tira de teste, nenhuma zona de controle será desenvolvida mesmo com um fluxo adequado do tampão contínuo. Portanto, a aparência da zona de controle com ambas as amostras de teste positivo e negativo indica um verdadeiro controle de procedimento no test.
[070] Em algumas modalidades da presente invenção, quando o lateral fluxo começa, a tira de teste não está mais em contato compressivo com o compressor de amostra e coletor de amostra. Em outras modalidades da presente invenção, entretanto, a pilha vertical é mantida durante lateral fluxo para maximizar a transferência do compressor de amostra e coletor de amostra para a tira de teste. Em ainda outras modalidades, o coletor de amostra é removido da pilha vertical após a aplicação de uma amostra na tira de teste, mas o compressor de amostra é então mantido em contato com a tira de teste durante lateral fluxo para maximizar a transferência do compressor de amostra para a tira de teste.
[071] A invenção fornece um método sensível e rápido para a detecção de analitos, por exemplo, patógenos, enzimas, mediadores imunológicos, ácidos nucleicos, proteínas, glicoproteínas, lipopolisacarídeos, adutos de proteína, marcadores de tumor e cardíacos, e/ou compostos de baixo peso molecular, que incluem, mas não limitados a, haptenos. Os métodos e dispositivos são adequados para diagnose em seres humanos e animais, por exemplo, animais de gado ou de estimação. A detecção pode incluir detecção direta do analito e/ou a detecção de anticorpos contra o analito, os quais estão presentes na amostra de fluido a ser testada. Preferencialmente, o método inclui uma determinação paralela de uma pluralidade de analitos. Os patógenos são selecionados, preferencialmente, de vírus ou microorganismos, tal como bactérias, fungos (por exemplo, levedura ou bolores) ou parasitas (por exemplo, amebas ou nematódeos). Os mediadores imunes são parte da cascata inflamatória e incluem, mas não são limitados a, anticorpos, fatores de crescimento, complemento, citocinas, linfocinas, quimiocinas, interferonas e derivados de interferona, proteínas reativa a C, calcitonina, amiloide, moléculas de adesão, anticorpos, e componentes quimio atrativos. Os compostos de baixo peso molecular podem incluir moléculas de produto químico ou de fármaco ou complexos e metabólitos formados por moléculas de produto químico ou de fármaco.
[072] A detecção pode incluir uma detecção direta do alvo, por exemplo, o patógeno, e/ou a detecção de anticorpos contra o alvo, por exemplo, o patógeno o qual está presente na amostra de fluido a ser testada. Preferencialmente, o método inclui uma determinação paralela de uma pluralidade de alvos.
[073] Alternativamente, o analito de interesse pode se um composto de baixo peso molecular. Em uma modalidade preferencial, a analito a ser detectado é uma molécula de fármaco, tal como heroína ou metanfetamina. Em outras modalidades preferenciais, o composto de baixo peso molecular é uma molécula pequena, tal como um hapteno.
[074] A invenção também inclui a detecção de uma pluralidade de patógenos, alérgeno, mediadores imunes, ácidos nucleicos, ou compostos de baixo peso molecular em um único excipiente cromatográfico. Um dispositivo de análise de amostra pode permitir a detecção simultânea de uma pluralidade de compostos de baixo peso molecular, mediadores imunes, ácidos nucleicos, proteínas, ou patógenos. Embora a amostra seja preferencialmente um fluido, uma massa ou matéria seca substancial ou parcialmente sólida pode ser testada como uma amostra em dispositivos e métodos da presente invenção. Por exemplo, o fluido pode congelar ou endurecer, tal como em na cicatrização de um ferimento, ser coletado com o coletor de amostra, e então transferido para uma zona de aplicação de amostra. A amostra pode, alternativamente, se uma parte endurecida de uma bolha raspada da bolha a qual pode ser umedecida por um fluido corporal próximo ao sítio da bolha, tal como quando coleta uma amostra a ser testada para uma doença sexualmente transmitida, ou umedecida pelo tampão transiente na tira de teste. A amostra pode se uma ou mais secreções de ferimentos ou bolhas.
[075] A amostra corporal é, preferencialmente, totalmente de sangue, soro, plasma, um fluido de membrana mucosa (das cavidades orais, nasais, vaginais, anais, de ouvido interno, e oculares), fluido cerebrospinal (CSF), fluido de lágrima, fluido peniano, uma secreção ou esxudato de uma glândula, ou uma secreção ou esxudato de uma lesão ou bolha, por exemplo, lesões ou bolhas na pele. Mais preferencialmente, a amostra é selecionada a partir de fluidos orais, nasais, oculares, genitais, e retais e secreções ou esxudatos de lesões ou bolhas de pele.
[076] Em algumas modalidades, a quantidade de líquido associado com a amostra é insuficiente para transferir a amostra e/ou qualquer conjugado ou segundo parceiro de ligação na almofada do compressor de amostra para uma zona de aplicação de amostra sob compressão; em vez disso, o tampão contínuo fornece o fluido adicional requerido para a transferência da amostra e/ou conjugado e/ou segundo parceiro de ligação para uma zona de aplicação de amostra da tira de teste. Em outras modalidades, a amostra e/ou qualquer conjugado ou segundo parceiro de ligação na almofada do compressor de amostra é transferido para uma zona de aplicação de amostra mediante compressão. Em modalidades alternativas, o tampão contínuo pode ser aplicado através do compressor.
[077] Em modalidades preferenciais, a amostra é um fluido que não goteja ou flui após ser coletado. Em vez disso, o fluido é uma massa congelada, de modo que, depois que a amostra é coletada no coletor de amostra, a amostra pode ser contida verticalmente ou até mesmo invertida, e a amostra permanece no coletor de amostra. Por exemplo, quando uma amostra ocular é coletada e não sujeita a pré-tratamento, a amostra permanece no coletor de amostra mesmo se contida verticalmente ou invertida, primeiramente devido à tensão de superfície. Isso é porque a amostra é retida e contida, de forma eficaz, no coletor de amostra material, por exemplo, no velo de coletor de amostra. Em modalidades preferenciais, fibras de tereftalato de polietileno (PET), tal como fibras Dacron®, ou fibras de náilon são usadas porque a ligação é específica ou permanente, então, essas fibras “liberam” o analito quando molhadas. O fenômeno é semelhante a limpar gentilmente um entorno por uma toalha de papel de modo que a umectação seja contida nos poros pela tensão de superfície. Outros materiais que poderiam ser usados para o velo de coletor de amostra incluem, mas não são limitadas a, poliésteres, celulose, raiom, alginato de cálcio, estruturas mecânicas microprojetadas que contêm microcapilares e/ou microcanais, ou outros panos ou malhas. Em modalidades em que um material de coletor estéril é necessário para coletar um fluido corporal humano, materiais que podem se esterilizados e são aprovados por biocompatibilidade são, preferencialmente, usados.
[078] Uma vantagem significativa do método é que resultados de teste são fornecidos dentro do período de consulta médica, por exemplo, em poucos minutos. Preferencialmente, os resultados são fornecidos em um período de tempo de até 20 minutos, mais preferencialmente até 15 minutos. O teste também pode ser realizado até 24 a 48 horas depois que a amostra foi tirada do paciente. Também, como o teste não é invasivo, este representa muito pouco risco ao paciente. Portanto, o melhor tratamento disponível pode ser aplicado em um tempo hábil para um patógeno específico. Uma vantagem adicional sobre métodos da técnica anterior é que somente poucos microlitros de amostra são requeridos para executar uma análise. A amostra é, preferencialmente, cerca de 0,1 microlitro a cerca de 100 microlitro, mais preferencialmente cerca de 0,2 microlitro a cerca de 20 microlitros e com máxima preferência cerca de 0,5 microlitro a cerca de 15 microlitros.
[079] A invenção pode ser executada por meio de um simples kit de teste. O manuseio do kit de teste não necessita de equipamento de laboratório adicional, manuseio adicional de reagentes, ou instrumentação. Outra vantagem importante da invenção descrita no presente documento é que o limite de detecção é, tipicamente, 10 a 100 vezes menos que os testes diagnósticos disponíveis atualmente, porque amostras não necessitam de diluição antes que elas sejam transferidas para o dispositivo de análise. Portanto, os métodos da presente invenção são mais sensíveis e precisos que métodos da técnica anterior.
[080] Se ambos o conjugado, o qual inclui um primeiro parceiro de ligação para o analito e uma etiqueta detectável, e um segundo parceiro de ligação para o analito estão localizados no compressor de amostra, um dispositivo de análise de amostra pode ser fabricado e usado para teste de qualquer analito. O usuário somente precisaria escolher o compressor específico que conteve os parceiros de ligação que alvejaram o analito de interesse.
[081] Em algumas das modalidades da invenção, a amostra de fluido corporal é coletada, de forma não invasiva, com um dispositivo de coleta ou membro de chumaço. A etapa de coleta inclui, preferencialmente, enxugar ou untar o membro de chumaço sobre uma superfície do corpo que contém fluido corporal a ser testado. Preferencialmente, o membro de chumaço é estéril. O membro de chumaço pode ser seco ou pré- tratado com um fluido antes da etapa de coleta.
[082] Em modalidades preferenciais, não existe pré- tratamento do membro de chumaço, e a amostra é coletada e transferida para um dispositivo de análise de amostra sem qualquer tratamento da amostra coletada. Ao coletar a amostra com um dispositivo de coleta e não sujeitar a amostra a etapas de pré-tratamento, tal como extrair e/ou diluir a amostra, a degradação da amostra é evitada. O analito a ser testado permanece, preferencialmente, intacta ou em sua forma nativa rodeada ou misturada com as outras substâncias de ocorrência natural na amostra.
[083] Na técnica anterior, quando a amostra és extraída e diluída em tampão, a amostra, frequentemente, não está intacta. Isto pode alterar a “conformação” do analito devido a sua estabilidade ou labilidade. Ao coletar a amostra diretamente com o uso de um dispositivo de coleta e não pré- tratar a amostra, a natureza nativa da amostra é preservada na forma concentrada. Visto que esses resultados em uma concentração superior de amostra em menos volume, isto intensifica a sensibilidade do teste. Adicionalmente, sem diluição da amostra, o tempo de aparência e a intensidade da zona de teste estão diretamente proporcionais à concentração de analito. Com o uso de um espectrômetro, é possível obter quantificação numérica absoluta. Adicionalmente, não ter que pré-tratar a amostra torna o teste mais fácil, mais rápido, e menos caro. Isto também permite que o teste seja executado em um cenário clínico por médicos, enfermeiras, ou técnicos de laboratório. Em tiras de teste usadas para detectar conjuntivite, a sensibilidade dos testes é comparável à sensibilidade de testes de reação em cadeia de polimerase ultra sensível.
[084] Os métodos e dispositivos da técnica anterior requeriam pré-tratamento. Algumas das razões que se acreditava que pré-tratamento era necessário, incluía a crença equivocada de que pré-tratamento resultaria em uma amostra mais homogênea. Outra razão foi que se acreditava que amostras concentradas precisavam ser tamponadas antes de conduzir um ensaio de ligação. Outros descreveram a necessidade de lavar a amostra, remover substâncias e partículas contaminantes que poderia, de forma potencial, causar uma reação de ligação não específica e, portanto, um resultado de teste falso-positivo. Houve também uma crença generalizada na técnica anterior que uma amostra homogênea maior produziu os resultados de teste de ensaio mais sensíveis e específicos.
[085] Ao contrário, ao não pré-tratar a amostra, o usuário mantém amostras altamente concentradas e não homogêneas. Conforme descrito pelo princípio de polarização interfacial de material, em materiais dielétricos não homogêneos existem distribuições de carga que ocorrem nas interfaces das fases, sendo que constitui o dielétrico não homogêneo. Em uma amostra de fluido corporal infeccioso in vivo “intacta” (não diluída ou não incomodada), as cargas ou excipientes de carga são impedidos por retenção em centros de impureza ou nas interfaces de fase. A característica dessa amostra "intacta" resulta em um efeito de capacitor de duas camadas, resultando na polarização espaço-carga. A característica de uma natureza não homogênea “intacta” resulta em eficácia de ligação superior e, portanto, um ensaio mais sensível.
[086] Era previamente desconhecido quais efeitos fluidos corporais, incluindo sangue, lágrimas, e esxudatos purulentos, teriam em materiais de velo de coletor diferentes. Especificamente, era desconhecido se os analitos seriam liberados, de forma eficaz, do outro material celular e transferido do coletor de amostra para um dispositivo de análise de amostra.
[087] Em algumas modalidades, o tamanho de amostra é preferencialmente poucos microlitros. Após transferência da amostra para uma zona de aplicação de amostra (preferencialmente sem tratar a amostra), meio de eluição (também conhecido como tampão contínuo) é adicionado. Métodos da técnica anterior métodos de imunoensaios de fluxo lateral contínuo foram incapazes de executar essas etapa de lavagem. Por exemplo, quando se coleta uma amostra ocular para teste por infecções de olho, tal como conjuntivite, o tamanho de amostra é preferencialmente 3 a 15 microlitros. Neste exemplo, 150 a 200 microlitros de meio de eluição são então adicionados ao tira de teste. Como uma comparação com sistemas de ensaio diferentes, esta lavagem de 40 a 50 vezes excede a lavagem executada em testes ELISA dependente de máquina.
[088] Em um exemplo de coleta da amostra, com o uso de um movimento de redemoinho gentil, um membro de chumaço estéril pode ser aplicado à superfície do corpo ou membrana mucosa de interesse e permitido capturar quaisquer patógenos, compostos de baixo peso molecular, e/ou mediadores imunes, peptídeos, glicoproteínas, ácidos nucleicos, e componentes relacionados a alergia contidos no fluido corporal.
[089] O membro de chumaço pode se um parte que é separada de um dispositivo de análise de amostra. A amostra é então transferida ao entrar em contato com o membro de chumaço com um dispositivo de análise de amostra e o compressor de amostra sob condições, em que pelo menos parte da amostra está no membro de chumaço. Pelo menos parte do conjugado em modalidades em que o conjugado está localizado no compressor de amostra e/ou pelo menos parte do segundo parceiro de ligação em modalidades em que o segundo parceiro de ligação está localizado no compressor de amostra também são transferidos para um dispositivo de análise de amostra devido à pressão. Isto é fenômeno semelhante à compressão do fluido para fora de uma espoja. Nesta modalidade, o membro de chumaço preferencialmente entra em contato com ambos uma zona de aplicação de amostra no dispositivo de análise e uma almofada porção do compressor de amostra (a qual inclui, preferencialmente, o conjugado e/ou um segundo parceiro de ligação para o analito). A amostra e conjugado são então transferidos para uma zona de aplicação de amostra e então percorre para a zona de detecção. Em algumas modalidades, o membro de chumaço pode ser fixado em uma posição de contato com um dispositivo de análise de amostra no qual uma zona de coleta de amostra do membro de chumaço está em contato direto com uma zona de aplicação de amostra do dispositivo de análise. Portanto, o membro de chumaço e/ou o dispositivo de análise incluem, preferencialmente, meios de fixação para fornecer um conato fixo entre ambas as partes em um posição predeterminada. Alternativamente, o membro de chumaço pode ser uma parte integrada de um dispositivo de análise de amostra e a transferência inclui passar pelo menos uma parte da a amostra no membro de chumaço, bem como no conjugado, para uma zona de aplicação de amostra ao exercer pressão com o uso do compressor de amostra. Em algumas modalidades, o compressor de amostra também é uma parte integrada de um dispositivo de análise de amostra integrado e é preferencialmente conectado ao dispositivo por uma articulação. Em outras modalidades, o compressor de amostra é separado do remanescente do dispositivo.
[090] A transferência da amostra do membro de chumaço para uma zona de aplicação de amostra em um dispositivo de análise de amostra é preferencialmente um transferência direta, isto é, a transferência acontece sem pré-tratamento da amostra no membro de chumaço. Em modalidades sem pré-tratamento da amostra ou do membro de chumaço, microfiltragem ocorre na região em que o velo de membro de chumaço entra em contato diretamente com o velo na tira. As fibras do velo se entrelaçam para formar uma interferência física ou áspera. Portanto, elementos maiores contidos na amostra são retidos e não eluídos em um dispositivo de análise de amostra. Conforme o conjugado e a amostra se movem através de uma zona de aplicação de amostra, os analitos menores são eluídos. Também, quando se usa amostras de fluidos de membrana mucosa, interrupção mecânica da mucosa em fluidos corporais de membrana mucosa purifica a amostra e o analito de interesse.
[091] Em outras modalidades, a transferência inclui uma eluição da amostra do membro de chumaço com um meio de eluição, por exemplo, um tampão ou água. O meio de eluição pode ser adicionado a partir de uma fonte externa ou pode ser fornecido, por exemplo, como um reservatório, dentro do dispositivo de análise. Adicionalmente, a transferência é, preferencialmente, uma transferência capilar e/ou cromatográfica de fluido para a zona de detecção em um dispositivo de análise de amostra.
[092] Em algumas modalidades preferenciais, o membro de chumaço é posicionado entre uma tira de teste de fluxo lateral e uma porção do compressor de amostra de almofada (que pode incluir o conjugado que inclui um primeiro parceiro de ligação para o analito e uma etiqueta detectável, um segundo parceiro de ligação para o analito que inclui um identificador, um parceiro de ligação de zona de controle, ou qualquer combinação de qualquer um desses). Com essa etapa, o espécime coletado é transferido diretamente sobre uma tira de teste. A tira de teste inclui, preferencialmente, uma ou diversas membranas ou velos ativos capilares.
[093] Em algumas modalidades preferenciais, a amostra é adicionada a uma tira de teste cromatográfica, e o conjugado é adicionado como uma etapa separada após uma amostra ser adicionada. Nessas modalidades, o conjugado e a amostra não são adicionados simultaneamente. Por exemplo, o coletor de amostra que inclui a amostra é posicionado em uma zona de aplicação de amostra de uma tira de teste. Pelo menos um pouco da amostra é transferida para a tira de teste nesse momento. Então, o compressor de amostra que contém o conjugado é adicionado e o compressor de amostra comprime o coletor de amostra. Isso facilita transferir adicionalmente uma amostra, bem como transferir o conjugado sobre a tira de teste. Se o analito está presente, um complexo entre o analito em uma amostra e o conjugado pode ser formado tão logo o conjugado comece a comprimir a amostra. Com amostras de fluido, o complexo começa a se formar devido à natureza do fluido de uma amostra por si só. Em modalidades preferenciais, o segundo parceiro de ligação para o analito também está no compressor de amostra ou em uma zona de aplicação de amostra da tira de teste. Nessas modalidades, o sanduíche completo entre o primeiro parceiro de ligação, o analito e o segundo parceiro de ligação pode ser formado antes que o tampão seja adicionado. A adição de tampão aperfeiçoa adicionalmente a formação de complexo e, então, o transporte dos componentes para a zona de detecção. Já que o complexo pode se formar durante a compressão, pode haver um atraso de tempo entre amostragem e testagem. A reação entre o analito e o conjugado começa preferencialmente antes que o tampão seja adicionado à tira de teste. O atraso de tempo entre quando a amostra e o conjugado são adicionados e quando o tampão é adicionado pode ser de até 24 horas ou mesmo mais longo.
[094] O processo de detecção será iniciado diretamente com a transferência de amostra ou pode exigir um meio de eluição para ser aplicado para análise de amostra. Em algumas modalidades, o meio de eluição é água de torneira simples. Em outras modalidades, o meio de eluição é uma solução tampão alcalina. No caso de uma tira de teste imunoquímica em que a zona de detecção está lateralmente à jusante de uma zona de aplicação de amostra, o meio de eluição escolhido se move em direção a uma zona de detecção e passa, desse modo, pelo sítio de contato no interior do dispositivo de coleta. O analito e o conjugado são eluídos pelo meio de eluição e transportados com o mesmo para a zona de detecção. Na zona de detecção, o analito é determinado por métodos qualitativos e/ou quantitativos, por exemplo, em uma reação de ligação imunológica.
[095] A tira de teste pode ser feita como um único material cromatográfico ou, preferencialmente, com diversos materiais ativos capilares produzidos a partir do mesmo material ou de diferentes materiais e fixados em um reforço de carreador. Esses materiais estão em contato próximo entre si a fim de formar uma trajetória de transporte ao longo da qual um líquido direcionado por fluxos de forças capilares a partir da zona de início, passando pelo sítio de contato do chumaço e pela zona de detecção, em direção a uma zona de descarte na outra extremidade da tira.
[096] Alguns materiais e membranas preferenciais para a tira de teste incluem, mas sem limitação, fibras de tereftalato de polietileno (PET), como fibras Dacron®, nitrocelulose, poliéster, náilon, acetato de celulose, hidrogel, polipropileno, fibras de vidro e combinações desses materiais e seus reforços. As características dos velos e membranas dependem dos tipos de materiais usados para uma região ou zona da tira de teste particular ou dispositivo de coleta. Conforme descrito no presente documento, os materiais que permitem que reagentes (incluindo aqueles na zona de reagente, a zona de captura, ou qualquer uma das outras zonas descritas no presente documento) sejam móveis e viajem com o meio de eluição incluem materiais de velo ou fibras, em que a ligação não é específica ou permanente, para que o analito e os reagentes possam ser liberados quando encontram o meio de eluição ou com um grande volume de amostra. Alguns desses materiais incluem, mas sem limitação, fibras de tereftalato de polietileno (PET), como fibras Dacron®, fibras de náilon, fibras de poliéster, fibras de acetato de celulose, fibras de polipropileno, fibras de vidro, espuma, esponjas e outros tecidos e malhas. Em contraste, os materiais que imobilizam reagentes em uma zona particular (incluindo, por exemplo, os reagentes imobilizados na zona de teste e na zona de controle da zona de detecção e os reagentes de captura nas modalidades que incluem reagentes de captura imobilizados em uma zona de captura à jusante de uma zona de aplicação de amostra) incluem, mas sem limitação, nitrocelulose e fibras de náilon quimicamente tratadas de tal modo que fibras individuais na malha de náilon se liguem permanentemente a reagentes, como as proteínas. Alguns métodos para fabricar diferentes porções da tira incluem, mas sem limitação, materiais de remoção, aspersão, remolhagem e secagem sobre a tira.
[097] Embora a nitrocelulose seja usada para a zona de detecção em muitas das modalidades da presente invenção, em outras modalidades, membranas neutras, como náilon ou poliéster, podem ser usadas. Nessas modalidades, proteínas, como neutravidina, anticorpos e antígenos, nanopartículas, ou ácidos nucleicos não são imobilizados diretamente. São, ao invés disso, conjugados a microesferas que são “depositadas” na membrana e são retidas nas fendas.
[098] Alguns materiais preferenciais para a porção do compressor de amostra de almofada incluem, mas sem limitação, fibras de tereftalato de polietileno (PET), como fibras de Dacron®, fibras de náilon, fibras de poliéster, fibras de acetato de celulose, fibras de polipropileno, fibras de vidro, velo, espuma, esponjas e outros panos e malhas.
[099] Os materiais de tira de teste preferencialmente filtro e/ou matéria de particulado de retenção, assim como detritos celulares, os precipitados, etc., nas membranas. Adicionalmente, já que o volume da amostra é preferencialmente tão pequeno, a amostra permanece dentro dos materiais e o tampão de eluição fluindo diretamente embaixo da amostra faz contato e transporta a amostra de tal modo que a amostra pode ser extraída, dissolvida e/ou filtrada antes de alcançar a zona de teste da zona de detecção.
[0100] Ademais, os dispositivos e kits de testes da presente invenção preferencialmente realizam os métodos descritos no presente documento.
[0101] Em modalidades preferenciais, o conjugado é localizado em um compressor de amostra, separado do dispositivo de análise de amostra. O conjugado inclui preferencialmente um primeiro parceiro de ligação para o analito, assim como sendo marcado com uma etiqueta identificável. A etiqueta é preferencialmente detectável visivelmente e/ou por fluorescência, mas qualquer forma de detecção conhecida na técnica pode ser usada, dependendo da etiqueta escolhida.
[0102] Em algumas modalidades, a etiqueta identificável para o conjugado pode ser ouro coloidal, esferas de látex coloridas, nanopartículas fluorescentes, nanopartículas de quimioluminescentes, nanopartículas paramagnéticas ou nanopartículas fosforescentes.
[0103] A interpretação qualitativa é realizada visualmente observando-se a tonalidade e intensidade de zona de teste. Em um exemplo em que um corante vermelho visual é usado como a etiqueta, quando a concentração do analito é igual ou levemente acima do limite mais baixo de detecção, a zona de teste pode ser vista de modo fraco e a tonalidade é rosa. Conforme a concentração do analito é aumentada, a intensidade de zona de teste consequentemente aumenta e a tonalidade comuta do rosa para vermelho brilhante. Uma interpretação quantitativa é desenvolvida com o uso de um espectrômetro que opera no espectro visível. Ou uma medida de absorção ou uma medida de refletância pode ser usada no espectro visível para desenvolver a quantificação da zona de teste. Primeiro, um conjunto de concentrações caracterizadas do analito é desenvolvido. Cada uma das concentrações é aplicada à zona de aplicação de amostra e o teste é executado. O espectrômetro é usado para medir ou a absorção ou a refletância da zona de teste. Uma curva padrão é calculada a partir dos valores medidos do espectrômetro. A curva padrão é normalmente linear. Em outras modalidades, se identificadores fluorescentes forem usados, um conjunto similar de concentrações conhecidas do analito pode ser desenvolvido. Uma concentração desconhecida do analito testado e quantificado pelo espectrômetro rende um valor que, quando plotado na curva padrão, pode ser correlacionado a uma concentração do analito.
[0104] A etiqueta visual pode ser qualquer etiqueta visível a olho nu, incluindo, mas não limitada a partículas coloridas tal como ouro coloidal, esferas de látex tingidas, selênio ou carbono. Em algumas modalidades, os identificadores visuais são também revestidos com elementos fluorescentes. Em algumas modalidades, o elemento fluorescente é um corante fluorescente. Alternativamente, uma mistura de preferencialmente conjugados de esfera de látex fluorescente sem cor é misturada com conjugados de ouro coloidal (um espectro visível), ou conjugados que produzem uma zona de teste de leitura visível, em imunoensaios de fluxo lateral acentuar a sensibilidade do ensaio e para auxiliar na leitura visual de positivos verdadeiros e negativos verdadeiros. Em modalidades em que nanopartículas são usadas, as nanopartículas que podem ser usadas incluem, mas não são limitadas a, selênio, carbono e ouro coloidal.
[0105] Em algumas modalidades, um segundo parceiro de ligação para o analito é também localizado no compressor de amostra. O segundo parceiro de ligação inclui um identificador, mas não uma etiqueta identificável. O segundo parceiro de ligação pode estar localizado alternativamente na zona de aplicação de amostra da tira de teste, a montante da zona de aplicação de amostra ou em qualquer localização da tira de teste entre a zona de aplicação de amostra e a zona de detecção. Nas modalidades em que há um segundo parceiro de ligação para o analito ou a montante da zona de detecção ou no compressor de amostra, a zona de detecção inclui um identificador imóvel que se liga à porção de identificador do segundo parceiro de ligação.
[0106] Em uma modalidade preferencial, o segundo parceiro de ligação é etiquetado com biotina. Nas modalidades em que o identificador no segundo parceiro de ligação é biotina, o identificador imobilizado na zona de detecção é preferencialmente avidina, neutravidina ou estreptavidina. Em outras modalidades, o segundo parceiro de ligação é etiquetado com avidina, neutravidina, ou estreptavidina. Nessas modalidades, o identificador imobilizado na zona de detecção é preferencialmente biotina. Alternativamente, o identificador no segundo parceiro de ligação pode ser uma lectina e o identificador imobilizado pode ser uma porção química de glicosil. Por exemplo, em algumas modalidades, a lectina é a Lectina de Ervilha Forrageira e a porção química de glicosil é uma unidade de glicosil eritrócito. O identificador no segundo parceiro de ligação e o identificador imobilizado podem ser revertidos dentro do espírito da presente invenção. Por exemplo, a porção química de glicosil pode ser o identificador no segundo parceiro de ligação, com um identificador de lectina imobilizado na zona de detecção. Em outras modalidades, outros receptores e ligantes podem ser usados.
[0107] Em uma modalidade preferencial, os parceiros de ligação específicos para os analitos na zona de conjugado no compressor de amostra e/ou na zona de aplicação de amostra são monoclonais, policlonais ou anticorpos recombinantes ou fragmentos de anticorpos capazes de se ligarem a um patógeno. Em outras modalidades, os parceiros de ligação específicos podem também ser antígenos capazes de se ligarem a anticorpos contra um patógeno, um mediador imune, peptídeos, glicoproteínas ou um alérgeno. Outros tipos de parceiros de ligação são macromoléculas bio-orgânicas como aptâmeros ou receptores, nanopartículas ou ácidos nucleicos. Os métodos e dispositivos da presente invenção podem ser usados para quaisquer ensaios de ligação e podem evitar o uso de anticorpo/antígenos ou ácidos nucleicos, por exemplo, em ensaios de ligação de ligante-receptor e ensaios de ligação de enzima-substrato.
[0108] Em todas essas modalidades, um “sanduíche” completo é preferencialmente criado entre o primeiro parceiro de ligação do conjugado, o analito e o segundo parceiro de ligação, na zona de aplicação de amostra quando analito está presente. Alternativamente, o “sanduíche” completo pode se formar entre a zona de aplicação de amostra e a zona de detecção, se ou do primeiro parceiro de ligação ou do segundo parceiro de ligação for localizado a jusante da zona de aplicação de amostra. O sanduíche completo quando percorre para a zona de detecção, em que o identificador no segundo parceiro de ligação liga-se ao identificador imobilizado na zona de detecção. Note que o complexo entre o identificador no segundo parceiro de ligação e o identificador imobilizado na zona de detecção o corre independente de se o analito é presente ou não. Entretanto, o complexo é somente detectável quando o analito é presente e o conjugado (que inclui uma etiqueta identificável) ligou-se ao analito.
[0109] Em outras modalidades, ao invés de ter um segundo parceiro de ligação para o analito ou no compressor de amostra ou na tira de teste a montante da zona de detecção, um segundo parceiro de ligação imobilizado para o analito é localizado na zona de detecção. Nessas modalidades, metade do “sanduíche” forma-se entre o primeiro parceiro de ligação do conjugado e o analito, que percorre então para a zona de teste, em que o meio sanduíche liga-se ao imobilizado segundo parceiro de ligação, completando o “sanduíche” completo.
[0110] O dispositivo também inclui preferencialmente uma zona de controle, que indica se o teste foi executado corretamente. Em modalidades preferenciais, um parceiro de ligação de zona de controle, por exemplo, um parceiro de ligação de zona de controle móvel com uma etiqueta visual, é também localizado no compressor de amostra. Colocando o parceiro de ligação de zona de controle móvel, que se liga a um parceiro de ligação imobilizado na zona de controle, no compressor de amostra indicará se a transferência ou não do conjugado ocorreu a partir do compressor de amostra para a zona de aplicação de amostra do dispositivo de análise de amostra. Isso é um controle muito útil, já que é essencial que o conjugado seja transferido a fim de detectar a presença do analito.
[0111] A amostra pode ser tomada por um membro de chumaço padrão conforme usado atualmente no escritório do médico ou salas de emergência. Esse membro de chumaço é pressionado subsequentemente na zona de aplicação de amostra da tira de teste cromatográfica com o uso do compressor de amostra.
[0112] Em algumas modalidades preferenciais, ao invés de células de lise "do lado de fora" de um dispositivo de teste laboratorial remoto, a presente invenção utiliza "lise in situ". Nessas modalidades, os métodos e dispositivos da presente invenção incorporam uma zona de lise incluindo pelo menos um agente de lise como parte de uma tira de teste de ensaio de fluxo lateral, tal como aquelas discutidas no presente documento ou outros dispositivos de ensaio de fluxo lateral conhecidos na técnica, a fim de lisar o material de amostra in situ. Adicionalmente, uma zona de captura captura substâncias de interferência para aumentar a precisão do ensaio.
[0113] Seguindo o carregamento de amostra, a amostra que percorre com o líquido de transporte encontra o agente de lise. O agente de lise terá sido pré-carregado na tira de teste e é eluído pelo líquido de transporte. Em algumas modalidades preferenciais, o agente de lise foi secado na tira de teste. Alternativamente, o agente de lise pode ser pré-seco por secagem por congelamento ou liofilização e então pré-carregado na tira de teste. Em outras modalidades, o agente de lise pode ser absorvido, adsorbido, incorporado ou preso na tira de teste. Em uma modalidade preferencial, o agente de lise é localizado na zona de aplicação de amostra ou a montante da zona de aplicação de amostra, de modo que a amostra é lisada quando é transferida para o dispositivo de análise de amostra. O agente de lise é preferencialmente solúvel ou miscível no líquido de transporte de amostra e o agente de lise é solubilizado e ativado após o contato com o líquido de transporte de amostra. O líquido de transporte de amostra então contém tanto o agente de lise na solução ou suspensão quanto componentes de amostra na suspensão. Quaisquer componentes suscetíveis a lise na amostra, após serem expostos em suspensão ao agente de lise, são os próprios lisados in situ. O analito é preferencialmente então exposto para ambos o conjugado etiquetado e o segundo parceiro de ligação, para formar o sanduíche antes de alcançar a zona de detecção. Alternativamente, o agente de lise pode ser incluído no tampão contínuo.
[0114] Alternativamente, o agente de lise pode ser introduzido à tira de teste durante uma etapa de compressão de amostra. Em uma modalidade, o agente de lise é localizado na almofada do compressor de amostra. Alternativamente, o agente de lise pode ser seco no membro de chumaço do coletor de amostra se o membro de chumaço não necessitar ser estéril. De outra forma, o membro de chumaço pode ser esterilizado após a adição do agente de lise com o uso de tecnologias de esterilização que não danificam a capacidade de lise do agente de lise.
[0115] A concentração do agente de lise pré- carregado em uma tira de teste é preferencialmente entre 0,001% e 5% de peso/volume. O volume para ser pré-carregado depende de onde o agente de lise é pré-carregado. As faixas apropriadas são 1 a 10 microlitros quando pré-carregados na lã de coletor de amostra (a zona de aplicação de amostra) ou 5 a 50 microlitros quando pré-carregados na almofada absorvente ou em outras localizações dentro da tira de teste. Idealmente, a quantidade pré-carregada pode ser aproximadamente 3 microlitros pré-carregados na lã de coletor de amostra ou aproximadamente 10 microlitros pré-carregados na almofada absorvente ou em outras localizações dentro da tira de teste.
[0116] A seleção de um agente e ambiente de lise específico dependerá do analito e do ensaio. O pH e a resistência iônica são a chave para o ambiente de lise. Quanto ao pH estabelecido pelo agente de lise, um pH abaixo de 4,0 tende a precipitar materiais, especialmente proteínas. O pH mais alto, acima de aproximadamente 10,0, tende a lisar os materiais tal como proteínas e paredes de células. Portanto, um pH de aproximadamente 10,0 ou acima é preferencial para muitas aplicações. Alternativamente, o pH mais baixo pode ser preferencial para alvos de acido nucleico.
[0117] Quanto à resistência iônica estabelecida pelo agente de lise, tanto a resistência iônica alta quando a baixa podem ser usadas para lisar. Por exemplo, uma resistência iônica mais baixa (hipotônica) tende a separar eritrócitos. A água por si só pode lisar eritrócitos. Os ambientes de resistência iônica mais alta podem ser usados para romper certas membranas e paredes celulares.
[0118] Quanto a agentes de lise específicos, os mesmos podem ser agrupados e selecionados com base em suas propriedades: sais, agentes catiônicos e anfotéricos e detergentes iônicos e não iônicos. Cloreto de amônio (NH4Cl) lisa eritrócitos. Outros sais, incluindo, mas não limitados a concentrações altas de cloreto de sódio (NaCl) e cloreto de potássio (KCl), podem romper certas membranas e paredes celulares. Outros agentes de lise são agentes anfotéricos incluindo, mas não limitados a Lyso PC, CHAPS e Zwittergent. Alternativamente, os agentes catiônicos incluindo, mas não limitados a, C16 TAB e cloreto de benzalcónio podem ser usados como um agente de lise. Ambos os detergentes iônico e não iônico são frequentemente usados para separar ou lisar os componentes de membrana celular ou parede célula tal como lipoproteínas e glicoproteínas. Os detergentes iônicos comuns incluem, mas não são limitados a, SDS, EDTA, Colato e Deoxicolato. Os detergentes iônicos são bons agentes solubilizantes. Os anticorpos retêm sua atividade em 0,1% de SDS ou menos. Os detergentes iônicos comuns incluem, mas não são limitados a, Octilglucoside, Digitonina, C12E8, Lubrol, Triton X-100, Noniodet P-40, Tween 20, e Tween 80. Os detergentes não iônicos e iônicos leves são desnaturantes mais fracos e são frequentemente usados para solubilizar proteínas de membrana tal como proteínas de superfície virais. Os agentes de lise adicionais incluem, mas não são limitados a, ureia e enzimas. As combinações de diferentes agentes de lise podem ser usadas para otimizar o ambiente de lise.
[0119] Os tensoativos agem geralmente como agentes umectantes a abaixam a tensão de superfície de um líquido. Isso permite então a propagação mais se abaixando a tensão interfacial entre líquidos. Então, os tensoativos podem interferir com a ligação natural do antígeno e anticorpo ou ligante e receptores. As concentrações são, portanto, experimentalmente escolhidas para cada classe de agente de lise. Uma vez que a lise ocorre, é importante que as reações de ligação desejadas não sejam impedidas. Geralmente, 0,001% de concentração de agente de lise é considerado o limite mais inferior e o limite superior é aproximadamente 1%. Há um efeito sinérgico ou aditivo quando as combinações de agentes de lise são usadas. Isso expande a faixa de trabalho da concentração para executar de aproximadamente 0,001% a 1%. Finalmente, algumas ligações não específicas indesejáveis podem ser previnidas a uma concentração de Tween 20 de 5%. Em todos os casos, a quantidade total do agente de lise pré-carregado em todas as localizações de uma tira de teste individual deve ser suficiente para lisar barreiras para imunodetecção, permitindo a operação prática da tira de teste.
[0120] O agente de lise por is só não deve interferir com quaisquer outros agentes indicadores ou detectores de ensaio e, dessa forma, não interfere com quaisquer outras reações e interações de ensaio para tal extensão como para prevenir a operação prática do ensaio. Um agente de lise deve ter vida de prateleira suficiente para permitir a fabricação, distribuição e armazenamento antes do uso de uma tira de teste no teste laboratorial remoto.
[0121] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o dispositivo de fluxo lateral da presente invenção inclui um líquido de transporte de amostra, que pode ser um tampão, um compressor de amostra e uma tira de teste de cromatografia que contém um ou diversos materiais de lã ou membranas com propriedades capilares através das quais a amostra flui. Em um dispositivo e método da invenção, não é necessário lisar as células na amostra antes de aplicar a amostra à tira de teste.
[0122] A Figura 1 mostra um dispositivo de análise de amostra (tira de teste) 1 e um coletor de amostra 2. O coletor de amostra 2 pode ser qualquer tipo de coletor de amostra 2 conhecido na técnica, por exemplo, o coletor de amostra 2 pode ser um membro de chumaço. A amostra 20 pode incluir o analito 3, assim como partículas de interferência 5 (que podem incluir proteínas de interferência ou genes de interferência) e outras partículas de interferência ou detritos celulares 4. O dispositivo de análise de amostra 1 inclui uma zona de conjugado 8 a montante da zona de aplicação de amostra 18 nessa figura. Embora a zona de conjugado 8 seja mostrada a montante da zona de aplicação de amostra 18 nessa figura, a zona de conjugado 8 pode sobrepor alternativamente a zona de aplicação de amostra 18 ou estar a jusante da zona de aplicação de amostra 18 dentro do espírito da presente invenção. A zona de aplicação de amostra 18 é também uma zona de microfiltração, que filtra preferencialmente detritos celulares e partículas de interferência 4 que estão na amostra 20.
[0123] A zona de conjugado 8 preferencialmente inclui tanto um conjugado móvel 15, que inclui uma porção que se liga ao analito 3 e uma etiqueta identificável e um parceiro de ligação de zona de controle 16 com uma etiqueta identificável, que pode ser, por exemplo, um anticorpo de zona de controle com uma etiqueta visual. Em algumas modalidades, o conjugado móvel é um conjugado de anticorpo de teste com uma etiqueta visual. O parceiro de ligação de zona de controle 16 se liga com um parceiro de ligação imobilizado para este na zona de controle 11 e indica se o teste foi executado corretamente. Se o analito 3 estiver presente na amostra 20, o analito liga-se ao conjugado 15, e o complexo de conjugado 15-analito 3 percorre para a zona de teste 10 na zona de detecção 12. O analito 3 então se liga a um parceiro de ligação imobilizado 17 para o analito 3, para formar o “sanduíche” completo em um ensaio tipo sanduíche.
[0124] A transferência da amostra do coletor de amostra 2 para a zona de aplicação de amostra 18 no dispositivo de análise de amostra é preferencialmente uma transferência direta, isto é, a transferência ocorre sem o pré-tratamento da amostra no coletor de amostra 2. Nas modalidades sem o pré-tratamento da amostra ou o coletor de amostra 2, uma pressão 14 é aplicada e a microfiltração ocorre na região em que a lã de coletor de amostra contata diretamente a lã no dispositivo de análise de amostra 1. As fibras da lã se interligam para formar uma grade ou interferência física. Dessa forma, elementos maiores contidos na amostra, por exemplo, detritos celulares e partículas de interferência 4 são retidos e não eluídos.
[0125] O dispositivo de aplicação de amostra 1 também inclui preferencialmente uma zona de bloqueio 9 que inclui um ou mais reagentes de captura. Essa zona de bloqueio captura proteínas e/ou genes de interferência 5 que podem estar na amostra 20. A captura de uma substância de interferência 4, 5 por um ou mais reagentes de captura ocorre quando o reagente de captura interage de alguma maneira com a substância de interferência para impedir a substância de interferência de interferir com a detecção do analito. Enquanto uma zona de bloqueio 9 é mostrada na Figura 1, os reagentes de captura podem ser localizados em uma zona de captura 9 feita de materiais que permitem que os reagentes de captura sejam móveis, no meio de eluição e secos com os reagentes, incorporados na zona de aplicação de amostra, incorporada no material de lã de coletor de amostra e/ou imobilizado em um material de imobilização (por exemplo, nitrocelulose) ou como uma linha ou uma zona. Qualquer um desses ou qualquer combinação desses pode ser usado nas modalidades da presente invenção, dependendo da matriz de amostra e teste.
[0126] O dispositivo de análise de amostra 1 também inclui opcionalmente uma almofada absorvente 7 a montante da zona de conjugado 8 e da zona de aplicação de amostra 18. O tampão é adicionado e percorre na direção da seta 6 para eluir os componentes de teste, incluindo a amostra 20, o conjugado 15 e o parceiro de ligação de zona de controle 16, para a zona de detecção 12. O dispositivo de análise de amostra 1 também inclui preferencialmente uma almofada de refugo 13 na extremidade a jusante do dispositivo 1. O dispositivo de análise de amostra 1 pode também incluir opcionalmente um apoio 23.
[0127] Os dispositivos e métodos da presente invenção incluem um compressor de amostra 30. Alguns exemplos esquemáticos do compressor de amostras 30 que podem ser usados são mostrados nas Figuras 2A e 2B. Os compressores de amostra 30 incluem preferencialmente um manípulo 31, uma porção estendida 32 e uma porção de almofada 33. Em alguns projetos, o compressor de amostra inclui seções adicionais, tal como uma porção de saliência 34 em que a porção de almofada 33 é colocada sobre. Enquanto os exemplos específicos são mostrados nas Figuras 2A e 2B, qualquer compressor de amostra 30 que é capaz de exercer uma pressão para transferir um ou mais componentes do ensaio e a amostra para o dispositivo de análise de amostra pode ser usado nas modalidades da presente invenção. Em modalidades preferenciais, o conjugado 36 é pré-carregado e seco em uma almofada 33 que forma a zona de conjugado. Em algumas modalidades preferenciais, um controle etiquetado 61 que é capaz de formar um complexo com um parceiro de ligação na zona de controle é também pré-carregado e seco na almofada 33 do compressor de amostra 30. Em outras modalidades preferenciais, o segundo parceiro de ligação 38 para o analito é localizado na almofada 33. Qualquer combinação do conjugado 36, segundo parceiro de ligação 38 ou parceiro de ligação de zona de controle 61 pode estar na porção de almofada 33 do compressor de amostra 30.
[0128] A Figura 2C mostra um exemplo de um coletor de amostra 35. Nesse exemplo, o coletor de amostra 35 é um membro de chumaço. O coletor de amostra 35 preferencialmente inclui uma porção de coleta de amostra 60, que é preferencialmente feita de materiais do tipo lã. Em algumas modalidades, o coletor de amostra 35 é estéril.
[0129] As Figuras 3A até 3C mostram uma modalidade de um sistema com um compressor de amostra 30, um coletor de amostra 35 e um dispositivo de análise de amostra (uma tira de teste na figura). A tira de teste preferencialmente inclui uma almofada absorvente 42, uma zona de aplicação de amostra 44, uma zona de detecção 52 e uma almofada de refugo opcional 47. A tira de teste também inclui preferencialmente um apoio de excipiente 48. A zona de detecção 52 inclui preferencialmente uma zona de teste 45, que inclui um parceiro de ligação imobilizado 38 para o analito 40, assim como uma zona de controle 46. Nessa modalidade, o conjugado 36 está no compressor de amostra 30. O primeiro parceiro de ligação 37, que é parte do conjugado 36, do compressor de amostra 30 liga o analito 40 na amostra de teste parta formar um meio sanduíche, que é, então, transportado para o segundo parceiro de ligação 38 que é imobilizado em uma zona de teste 45. O sanduíche completo 420 que se forma entre a porção 37 do conjugado 36 que se liga ao analito 40, o analito 40 e o segundo parceiro de ligação 38 são mostrados na Figura 3B. Em modalidades preferenciais, a almofada 33 no compressor de amostra 30 também inclui um parceiro de ligação de zona de controle 61 com uma etiqueta identificável. O parceiro de ligação de zona de controle 61 forma um complexo com seu parceiro de ligação na zona de controle 46. Incluindo o parceiro de ligação de zona de controle 61 no compressor de amostra 30, ao invés de na tira de teste ou no tampão conforme conhecido na técnica anterior, permite que o usuário esteja certo de que os componentes no compressor de amostra 30, que, nessa modalidade incluem ambos o conjugado 36 e o parceiro de ligação de zona de controle 61, tenham transferido eficazmente ao dispositivo de análise de amostra e dessa forma garante a operação apropriada do sistema.
[0130] Em um exemplo, ambos o primeiro parceiro de ligação 37 e o segundo parceiro de ligação 38 são diferentes anticorpos ao analito. O parceiro de ligação de zona de controle 61 é também preferencialmente um anticorpo e seu parceiro de ligação na zona de controle é um antígeno (ou vice versa). Em outras modalidades, os parceiros de ligação específicos podem ser também antígenos capazes de se ligarem a anticorpos contra o analito. Outros tipos de parceiros de ligação são macromoléculas bio-orgânicas como aptâmeros ou receptores, nanopartículas ou ácidos nucleicos. O dispositivo mostrado nas Figuras 3A-3C da presente invenção pode ser usado para quaisquer ensaios de ligação e pode evitar o uso de anticorpo/antígenos ou ácidos nucleicos, por exemplo, em ensaios de ligação de ligante-receptor e ensaios de ligação de enzima-substrato.
[0131] Em operação, o coletor de amostra 35 é colocado de tal modo que a amostra está diretamente acima da zona de aplicação de amostra 44. Em algumas modalidades, a colocação do coletor de amostra 35 acima da zona de aplicação de amostra 44 não é simultânea com a colocação do compressor de amostra 30. Em outras palavras, nessas modalidades, algumas das amostras são transferidas para a zona de aplicação de amostra 44 antes do compressor de amostra 30 se adicionado à pilha vertical.
[0132] O compressor de amostra 30 exerce a pressão 51 no coletor de amostra 35, com o uso da pressão para transferir a amostra, incluindo o analito 40 (se presente) e o conjugado 36 na zona de aplicação de amostra 44. Se houver também um parceiro de ligação de zona de controle 61 no compressor de amostra 30, o parceiro de ligação de zona de controle 61 é também transferido. Note que a transferência é devido à pressão, não devido ao fluxo ou ação capilar. Então, o tampão 43 é adicionado para permitir que o fluxo do complexo de conjugado 36 - analito 40 (se presente) para zona de detecção 52. Um parceiro de ligação imobilizado 38 na zona de teste 45 que liga o analito, formando o sanduíche completo. Já que o conjugado 36 inclui uma etiqueta 41, o complexo que se forma é detectável e indica um resultado positivo. A operação apropriada do teste também resulta em um resultado positivo detectável na zona de controle 46 devido à interação entre o parceiro de ligação de zona de controle 61 e seu parceiro imobilizado na zona de controle 46.
[0133] Embora não seja mostrada, pode também opcionalmente haver uma zona de lise, que sobrepõe preferencialmente ou está a montante da zona de aplicação de amostra 44. Em outras modalidades, pode haver uma zona de bloqueio que inclui reagentes de captura, similares à zona discutida com respeito à Figura 1.
[0134] Em outras modalidades, a zona de conjugado pode conter ambos os parceiros de ligação para o analito na amostra para formar um “sanduíche completo”. Um dos parceiros de ligação preferencialmente tem um marcador adequado tal como biotina, avidina, lectina, uma porção química de glicosil, um ligante específico ou um receptor específico. O outro pode ser conjugado para as nanopartículas apropriadas conforme mencionado abaixo. O sanduíche completo é então capturado na zona de teste em que o parceiro de ligação do marcador adequado, incluindo, mas não limitados a, avidina para biotina, biotina para avidina, porção química de glicosil para lectina, lectina para a porção química de glicosil, um receptor para o ligante ou um ligante para o receptor, é imobilizado.
[0135] A Figura 20A mostra um exemplo de uma tira de teste em uma modalidade da presente invenção. A tira de teste preferencialmente inclui uma almofada absorvente 42, uma zona de aplicação de amostra 44, uma zona de detecção 52 e uma almofada de refugo ótima 47. A tira de teste também preferencialmente inclui um apoio de excipiente 48. Nessa modalidade, o sanduíche completo (primeiro parceiro de ligação 513-analito-40-segundo parceiro de ligação-518) se forma na zona de aplicação de amostra 44. O “sanduíche completo” 514 é mostrado na Figura 20B. A zona de teste 45 nessa modalidade inclui um identificador imobilizado 510 que se liga ao identificador 519 do segundo parceiro de ligação 518. O identificador imobilizado 510 não se liga diretamente ao analito 40; ao invés disso, o mesmo se liga através de um intermediário, o identificador 519 no segundo parceiro de ligação 518 ao analito 40.
[0136] Nessa modalidade, um primeiro parceiro de ligação 513, que é parte do conjugado etiquetado 505, liga o analito 40 na amostra de teste para formar metade de um sanduíche. O segundo parceiro de ligação 518 também inclui um identificador 519. O segundo parceiro de ligação 518 nessa modalidade é preferencialmente pré-carregado e seco na zona de aplicação de amostra 44 da tira de teste, enquanto o conjugado etiquetado 505 é preferencialmente pré-carregado e seco em uma zona de conjugado etiquetado 515 a montante da zona de aplicação de amostra 44. Alternativamente, o segundo parceiro de ligação 518 e/ou a zona de conjugado etiquetado 515 pode ser localizado em qualquer lugar na tira de teste a montante da zona de detecção 52 incluindo, mas não limitado a, sobrepondo a zona de aplicação de amostra 44, a montante da zona de aplicação de amostra 44 ou entre a zona de aplicação de amostra 44 e a zona de detecção 52. Em uma modalidade preferencial, aproximadamente 75 a 80% do conjugado 505 etiquetado 509 está a montante da zona de aplicação de amostra (com aproximadamente 20 a 25% do conjugado etiquetado 505 sobrepondo a zona de aplicação de amostra 44) e aproximadamente 75 a 80% do segundo parceiro de ligação 518 é localizado a jusante da zona de aplicação de amostra 44 (com aproximadamente 20 a 25% do segundo parceiro de ligação sobrepondo a zona de aplicação de amostra 44). Embora não preferencial, em outras modalidades, ou o conjugado etiquetado 505, o segundo parceiro de ligação 518 ou ambos podem ser localizados no tampão ou pré-misturados com a amostra antes da amostra ser adicionada à tira de teste. Em ainda outras modalidades, qualquer um ou todos os componentes pode sobrepor a zona de detecção 52.
[0137] Em algumas modalidades, ambos o primeiro parceiro de ligação 513 e o segundo parceiro de ligação 518 são anticorpos diferentes ao analito 40. Em outras modalidades, os parceiros de ligação específicos podem ser também antígenos capazes de se ligarem a anticorpos contra o analito. Outros tipos de parceiros de ligação são macromoléculas bio-orgânicas como aptâmeros ou receptores, nanopartículas ou ácidos nucleicos. O dispositivo mostrado na Figura 20A pode ser usado para quaisquer ensaios de ligação e pode evitar o uso de anticorpo/antígenos ou ácidos nucleicos, por exemplo, em ensaios de ligação de ligante-receptor e ensaios de ligação de enzima-substrato.
[0138] Em uma modalidade preferencial, o segundo parceiro de ligação 518 é etiquetado 519 com biotina. Nas modalidades em que o identificador 519 no segundo parceiro de ligação 518 é biotina, o identificador imobilizado 510 na zona de detecção 52 é preferencialmente avidina, neutravidina ou estreptavidina. Em outras modalidades, o segundo parceiro de ligação 518 é etiquetado 519 com avidina, neutravidina, ou estreptavidina. Nessas modalidades, o identificador imobilizado 510 na zona de detecção 52 é preferencialmente biotina. Alternativamente, o identificador 519 no segundo parceiro de ligação 518 pode ser uma lectina e o identificador imobilizado 510 pode ser uma porção química de glicosil. Por exemplo, em algumas modalidades, a lectina é a Lectina de Ervilha Forrageira e a porção química de glicosil é uma unidade de glicosil eritrócito. O identificador no segundo parceiro de ligação e o identificador imobilizado podem ser revertidos dentro do espírito da presente invenção. Por exemplo, a porção química de glicosil pode ser o identificador no segundo parceiro de ligação, com um identificador de lectina imobilizado na zona de detecção. Em outras modalidades, outros receptores e ligantes podem ser usados para os identificadores.
[0139] Em operação, um coletor de amostra que contém a amostra é colocado de tal modo que a amostra está diretamente acima da zona de aplicação de amostra 44. Em modalidades preferenciais, a amostra não foi submetida ao pré-tratamento antes da aplicação à tira de teste. Ao invés disso, a amostra ainda está em sua forma nativa.
[0140] A amostra é transferida para a zona de aplicação de amostra 44 da tira de teste. Um sanduíche se forma com o conjugado etiquetado 505 como um pedaço de esfera e o segundo parceiro de ligação 518 como um segundo pedaço de esfera, com o analito 40 entre os mesmos, quando os três componentes entram em contato um com o outro durante o fluxo 43. O complexo conjugado etiquetado 505 - analito 40 (se presente) - segundo parceiro de ligação 518 (um sanduíche completo) flui para a zona de detecção 52. Um identificador imobilizado 510 na zona de teste 45 então se liga ao identificador 519. Já que o conjugado etiquetado 505 inclui uma etiqueta 509, o complexo que se forma é detectável e indica um resultado positivo. A operação apropriada do teste também resulta em um resultado positivo detectável na zona de controle 46 preferencialmente devido à interação entre um parceiro de ligação de linha de controle e seu parceiro imobilizado na zona de controle 46.
[0141] Embora não seja mostrado, pode também haver opcionalmente uma zona de lise, que preferencialmente se sobrepõe à zona de aplicação de amostra 44 ou está alternativamente localizada em outras porções da tira de teste dentro do espírito da presente invenção.
[0142] Em algumas modalidades preferenciais que usam identificadores, a zona de detecção inclui um anticorpo contra o identificador. O anticorpo pode ser um anticorpo de domínio monoclonal, policlonal ou único. Por exemplo, quando o identificador é biotina, um anticorpo antibiotina é imobilizado na zona de teste ao invés de avidina, neutravidina, ou estreptavidina.
[0143] As Figuras 4A a 4C mostram um exemplo de uma modalidade do sistema com um compressor de amostra 30, um coletor de amostra 35, e um dispositivo de análise de amostra (uma tira de teste na figura). Similarmente à Figura 3A a 3C, a tira de teste preferencialmente inclui uma almofada absorvente 42, uma zona de aplicação de amostra 44, uma zona de detecção 52, e uma almofada de desperdício opcional 47. A tira de teste também preferencialmente inclui um apoio de excipiente 48. Nessa modalidade, todo o sanduíche (primeiro parceiro de ligação 37-analito-40-segundo parceiro de ligação-38) se forma na zona de aplicação de amostra 44 (preferencialmente antes da adição de tampão). Em algumas modalidades, a colocação do coletor de amostra 35 acima na zona de aplicação de amostra 44 não é simultânea a colocação do compressor de amostra 30. Em outras palavras, nessas modalidades, parte da amostra é transferida para a zona de aplicação de amostra 44 antes de o compressor de amostra 30 ser adicionado à pilha vertical.
[0144] A zona de teste 45 nessa modalidade inclui um identificador imobilizado 50 que se liga ao identificador 39 do segundo parceiro de ligação 38. Nessa modalidade, um primeiro parceiro de ligação 37, que é parte do conjugado 36 e é preferencialmente pré-carregado e seco na almofada 33 do compressor de amostra 30, se liga ao analito 40 na amostra de teste para formar um meio sanduíche. O segundo parceiro de ligação 38 nessa modalidade é também preferencialmente pré-carregado e seco na almofada 33 do compressor de amostra. O segundo parceiro de ligação 38 também inclui um identificador 39.
[0145] O sanduíche completo 420 que se forma entre o parceiro de ligação 37 do conjugado 36, o analito 40, e o segundo parceiro de ligação 38 nessa modalidade (assim como as modalidades nas Figuras 5A a 5B, 6A a 6B, 7B, 7C e 7D) é mostrado na Figura 4B. Em modalidades preferenciais, a almofada 33 no compressor de amostra 30 também inclui um parceiro de ligação de zona de controle 61 (mostrado na Figura 3C) com uma etiqueta detectável. O parceiro de ligação de zona de controle 61 forma um complexo com seu parceiro de ligação na zona de controle 46. Incluir o parceiro de ligação de zona de controle 61 no compressor de amostra 30, ao invés de na tira de teste ou no tampão conforme conhecido na técnica anterior, permite que o usuário tenha certeza de que os componentes no compressor de amostra 30, que incluem tanto o conjugado 61 quanto o parceiro de ligação de zona de controle 61, tenham sido efetivamente transferidos para o dispositivo de análise de amostra e assim garante a operação apropriada do sistema.
[0146] Em um exemplo, tanto o primeiro parceiro de ligação 37 quanto o segundo parceiro de ligação 38 são anticorpos diferentes ao analito. O parceiro de ligação de zona de controle 61 é também preferencialmente um anticorpo, e seu parceiro de ligação na zona de controle é um antígeno (ou vice versa). Em outras modalidades, parceiros de ligação específicos podem também ser antígenos capazes de se ligar a anticorpos contra o analito. Outros tipos de parceiros de ligação são macromoléculas bio-orgânicas como aptâmeros ou receptor3s, nanopartículas ou ácidos nucleicos. O dispositivo mostrado nas Figuras 4A a 4C da presente invenção pode ser usado para quaisquer ensaios de ligação, e pode evitar o uso de anticorpo/antígenos ou ácidos nucleicos, por exemplo, em ensaios de ligação entre ligante e receptor e ensaios de ligação entre enzima e substrato.
[0147] Em uma modalidade preferencial, o segundo parceiro de ligação 38 é identificado com biotina 39. Nas modalidades em que o identificador 39 no segundo parceiro de ligação 38 é biotina, o identificador imobilizado 50 na zona de detecção é preferencialmente avidina, neutravidina, ou estreptavidina. Em outras modalidades, o segundo parceiro de ligação 38 é identificado 39 com avidina, neutravidina, ou estreptavidina. Nessas modalidades, o identificador imobilizado 50 na zona de detecção 52 é preferencialmente biotina. Alternativamente, o identificador 39 no segundo parceiro de ligação 38 pode ser uma lecitina e o identificador imobilizado 50 pode ser uma porção química de glicosil. Por exemplo, em algumas modalidades, a lecitina é a Lecitina de Ervilha de Jardim e a porção química de glicosil é uma unidade de glicosil de eritrócito. O identificador no segundo parceiro de ligação e o identificador imobilizado podem ser invertidos dentro do espírito da presente invenção. Por exemplo, a porção química de glicosil pode ser o identificador no segundo parceiro de ligação, com um identificador de lecitina imobilizado na zona de detecção. Em outras modalidades, outros receptores e ligantes podem ser usados para os identificadores.
[0148] Em operação, o coletor de amostra 35 é colocado de tal maneira que a amostra esteja diretamente acima da zona de aplicação de amostra 44. O compressor de amostra 30 exerce pressão 51 no coletor de amostra 35. A pressão é transferida para a amostra (incluindo o analito 40, se presente), o conjugado 36, e o segundo parceiro de ligação identificado 38 na zona de aplicação de amostra 44. Se houver também um parceiro de ligação de zona de controle 61 no compressor de amostra 30, o parceiro de ligação de zona de controle 61 é também transferido. Note-se que a transferência se deve à pressão, não se deve ao fluxo ou à ação capilar. Então, o tampão 43 é adicionado para permitir o fluxo do complexo de conjugado 36-analito 40 (se presente)-segundo parceiro de ligação 38 (um sanduíche completo) para a zona de detecção 52. Um identificador imobilizado 50 na zona de teste 45 então se liga ao identificador 39. Como o conjugado 36 inclui uma etiqueta 41, o complexo que se forma é detectável e indica um resultado positivo. A operação apropriada do teste também resulta em um resultado positivo detectável na zona de controle 46 devido à interação entre o parceiro de ligação de zona de controle 61 e seu parceiro imobilizado na zona de controle 46.
[0149] Embora não seja mostrado, pode também haver opcionalmente uma zona de lise, que preferencialmente se sobrepõe à zona de aplicação de amostra 44. Em outras modalidades, pode haver uma zona de bloqueio que inclui reagentes de captura, similar à zona discutida com relação à Figura 1.
[0150] Em outra modalidade, os dois parceiros de ligação para o analito estão localizados de tal maneira a atingir um “sanduíche vertical” em que a amostra se liga ao conjugado que é comprimido a partir da segunda placa e pode se ligar simultaneamente ou concorrentemente ao outro parceiro de ligação localizado na tira no plano da tira. Assim um ensanduichamneto do analito na amostra é alcançado por ligação ao parceiro a partir do conjugado entregue de cima do plano da tira e ligação ao segundo parceiro de ligação localizado no plano da tira abaixo do material de entrega de amostra.
[0151] As Figuras 5A e 5B mostram outro exemplo de uma modalidade do sistema com um compressor de amostra 30, um coletor de amostra 35, e um dispositivo de análise de amostra (uma tira de teste na figura). Similarmente à Figura 3A a 3C, a tira de teste preferencialmente inclui uma almofada absorvente 42, uma zona de aplicação de amostra 44, uma zona de detecção 52, e uma almofada de desperdício opcional 47. A tira de teste também preferencialmente inclui um apoio de carreador 48. Similar à modalidade mostrada nas Figuras 4A e 4C, nessa modalidade, todo o sanduíche (primeiro parceiro de ligação 37-analito 40-segundo parceiro de ligação 38) se forma na zona de aplicação de amostra 44. A zona de teste 45 nessa modalidade inclui um identificador imobilizado 50 que se liga ao identificador 39 do segundo parceiro de ligação 38. Nessa modalidade, um primeiro parceiro de ligação 37, que é parte do conjugado 36 e é preferencialmente pré- carregado e seco na almofada 33 do compressor de amostra 30, se liga ao analito 40 na amostra de teste para formar um meio sanduíche. O segundo parceiro de ligação 38 nessa modalidade é preferencialmente pré-carregado e seco na zona de aplicação de amostra 44 da tira de teste. O segundo parceiro de ligação 38 também inclui um identificador 39. Alternativamente, o segundo parceiro de ligação 38 nessa modalidade pode estar localizado em qualquer lugar na tira de teste a montante da zona de detecção incluindo, mas não limitado a, sobrepondo-se à zona de aplicação de amostra, a montante da zona de aplicação de amostra, e entre a zona de aplicação de amostra e a zona de detecção.
[0152] Em modalidades preferenciais, a almofada 33 no compressor de amostra 30 também inclui um parceiro de ligação de zona de controle 61 (mostrado na Figura 3C) com uma etiqueta detectável. O parceiro de ligação de zona de controle 61 forma um complexo com seu parceiro de ligação na zona de controle 46. Incluir o parceiro de ligação de zona de controle 61 no compressor de amostra 30, ao invés de na tira de teste ou no tampão conforme conhecido na técnica anterior, permite que o usuário tenha certeza de que os componentes no compressor de amostra 30, que incluem tanto o conjugado 61 quanto o parceiro de ligação de zona de controle 61, tenham sido efetivamente transferidos para o dispositivo de análise de amostra e assim garante a operação apropriada do sistema.
[0153] Em um exemplo, tanto o primeiro parceiro de ligação 37 quanto o segundo parceiro de ligação 38 são anticorpos diferentes ao analito. O parceiro de ligação de zona de controle 61 é também preferencialmente um anticorpo, e seu parceiro de ligação na zona de controle é um antígeno (ou vice versa). Em outras modalidades, parceiros de ligação específicos podem também ser antígenos capazes de se ligar a anticorpos contra o analito. Outros tipos de parceiros de ligação são macromoléculas bio-orgânicas como aptâmeros ou receptores, nanopartículas ou ácidos nucleicos. O dispositivo mostrado nas Figuras 5A a 5B da presente invenção pode ser usado para quaisquer ensaios de ligação, e pode evitar o uso de anticorpo/antígenos ou ácidos nucleicos, por exemplo, em ensaios de ligação entre ligante e receptor e ensaios de ligação entre enzima e substrato.
[0154] Em uma modalidade preferencial, o segundo parceiro de ligação 38 é identificado com biotina 39. Nas modalidades em que o identificador 39 no segundo parceiro de ligação 38 é biotina, o identificador imobilizado 50 na zona de detecção é preferencialmente avidina, neutravidina, ou estreptavidina. Em outras modalidades, o segundo parceiro de ligação 38 é identificado 39 com avidina, neutravidina, ou estreptavidina. Nessas modalidades, o identificador imobilizado 50 na zona de detecção 52 é preferencialmente biotina. Alternativamente, o identificador 39 no segundo parceiro de ligação 38 pode ser uma lecitina e o identificador imobilizado 50 pode ser uma porção química de glicosil. Por exemplo, em algumas modalidades, a lecitina é a Lecitina de Ervilha de Jardim e a porção química de glicosil é uma unidade de glicosil de eritrócito. O identificador no segundo parceiro de ligação e o identificador imobilizado podem ser invertidos dentro do espírito da presente invenção. Por exemplo, a porção química de glicosil pode ser o identificador no segundo parceiro de ligação, com um identificador de lecitina imobilizado na zona de detecção. Em outras modalidades, outros receptores e ligantes podem ser usados para os identificadores.
[0155] Em operação, o coletor de amostra 35 é colocado de tal forma que a amostra esteja diretamente acima da zona de aplicação de amostra 44. O compressor de amostra 30 exerce pressão 51 no coletor de amostra 35, com uso de pressão para transferir à amostra (incluindo o analito 40, se presente) e o conjugado 36 na zona de aplicação de amostra 44. Um sanduíche “vertical” se forma com o conjugado 36 como uma peça superior e o segundo parceiro de ligação 38 como a peça inferior, com o analito 40 entre os mesmos. Se houver também um parceiro de ligação de zona de controle 61 no compressor de amostra 30, o parceiro de ligação de zona de controle 61 é também transferido. Note-se que a transferência se deve à pressão, não se deve ao fluxo ou à ação capilar. Então, o tampão 43 é adicionado para permitir o fluxo do complexo de conjugado 36-analito 40 (se presente)-segundo parceiro de ligação 38 (um sanduíche completo) para a zona de detecção 52. Um identificador imobilizado 50 na zona de teste 45 então se liga ao identificador 39. Como o conjugado 36 inclui uma etiqueta 41, o complexo que se forma é detectável e indica um resultado positivo. A operação apropriada do teste também resulta em um resultado positivo detectável na zona de controle 46 devido à interação entre o parceiro de ligação de zona de controle 61 e seu parceiro imobilizado na zona de controle 46.
[0156] Embora não seja mostrado, pode também haver opcionalmente uma zona de lise, que preferencialmente se sobrepõe à ou está localizada a montante da zona de aplicação de amostra 44. Em outras modalidades, pode haver uma zona de bloqueio que inclui reagentes de captura, similar à zona discutida com relação à Figura 1.
[0157] As Figuras 6A e 6B mostram outra modalidade da presente invenção, em que o compressor de amostra 30 inclui o segundo parceiro de ligação 38 para o analito 40, acoplado a um identificador 39, e a tira de teste inclui o conjugado 36, que inclui tanto um primeiro parceiro de ligação 37 para o analito 40 como uma etiqueta detectável 41, e o identificador imobilizado 50 que se liga ao identificador no segundo parceiro de ligação na zona de teste 45. Essa modalidade opera similarmente à modalidade descrita com relação às Figuras 5A e 5B, exceto pelo fato de que o sanduíche “vertical” se forma com o segundo parceiro de ligação 38 como a peça superior e o conjugado 36 como a peça de fundo, com o analito 40 entre os mesmos. Alternativamente, o conjugado 36 nessa modalidade pode estar localizado em qualquer lugar na tira de teste a montante da zona de detecção incluindo, mas não limitado a, sobrepondo-se à zona de aplicação de amostra, a montante da zona de aplicação de amostra, ou entre a zona de aplicação de amostra e a zona de detecção.
[0158] As Figuras 7A a 7D são similares às Figuras 3C, 4C, 5B, e 6B, respectivamente, exceto pelo fato de que a zona de detecção 52 se sobrepõe à zona de aplicação de amostra 44 nessas figuras. A zona de detecção nessas modalidades é preferencialmente feita de nitrocelulose. Embora nenhum fluxo lateral seja estritamente requerido para executar o ensaio nessas modalidades, ao menos uma quantidade nominal de fluxo é preferencial se forma que o sanduíche seja capaz de se ligar na zona de teste e qualquer conjugado não ligado seja eliminado da zona de teste. Em uma modalidade, ao invés de um tampão contínuo ser aplicado a uma extremidade da tira de teste, um fluido de lavagem pode ser diretamente aplicado à zona de teste, ou de cima ou do lado, por exemplo, com uso de uma garrafa de água. Em uma modalidade, o compressor de amostra e o coletor de amostra são substancialmente transparentes de forma que a zona de teste pode ser lida sem remoção da pilha vertical da tira de teste. Note-se que, apesar de tanto a zona de teste 45 e como de controle 46 serem mostradas dentro da zona de aplicação de amostra nessas figuras, em outras modalidades, a zona de teste 45 poderia se sobrepor à zona de aplicação de amostra 44 enquanto a zona de controle 46 está a jusante da zona de aplicação de amostra 44. Se a zona de controle estiver lateralmente a jusante da zona de aplicação de amostra 44, poderia ser necessário adicionar o tampão para permitir o fluxo. Adicionalmente, pode ser preferencial adicionar um tampão, por exemplo, um tampão que inclua prata, para intensificar o sinal de um resultado positivo.
[0159] Uma tira de teste universal 80, conforme mostrada na Figura 8A, pode ser usada quando o compressor de amostra 30 inclui ambos os parceiros de ligação 37, 38 para o analito 40. O compressor de amostra 30 e o coletor de amostra 35 poderiam ser transferidos à tira de teste universal 80 na janela de amostra 81. Já que os elementos específicos para o e analito 40 que são testados estão no compressor de amostra 30, a zona de teste 83 na janela de visualização 82 da tira de teste universal 80 somente precisa ter um identificador 50 que forma um complexo com o identificador 39 no segundo parceiro de ligação 38 para o analito 40. Por exemplo, quando o segundo parceiro de ligação 38 para o analito 40 estiver identificado 39 com biotina, a zona de teste 83 da tira de teste universal 80 poderia incluir avidina 39, um parceiro de ligação para biotina. A universal tira de teste 80 também preferencialmente inclui uma zona de controle 84 e um alojamento 85. Para as modalidades das Figuras 7A a 7D, a zona de teste está localizada na janela de amostra 81. Em outras modalidades, o marcador adequado pode ser uma sequência de nucleotídeo que pode se hibridizar com a sequência de ácido nucleico adequada imobilizada na zona de teste.
[0160] Embora o compressor de amostra e o coletor de amostra sejam mostrados como entidades separadas nas Figuras 1 a 8A, a almofada 33 do compressor de amostra e a porção de coletor de amostra 60 do coletor de amostra podem ser componentes de um único elemento dentro do espírito da presente invenção. Por exemplo, o coletor de amostra pode ser conectado de forma giratória ou flexível como parte de um cartucho ao compressor de amostra, de forma que uma amostra possa ser coletada de um paciente com a porção de coleta de amostra sem expor o paciente à almofada do compressor de amostra e então a porção de coleta de amostra e a almofada do compressor de amostra podem ser colocadas em contato para aplicação na zona de aplicação de amostra da tira de teste por compressão. O coletor de amostra também pode ser conectado de forma giratória ou flexível ao cassete de teste ou pode ser inserido como um cartucho. Em outra modalidade, a amostra pode ser injetada por força diretamente na tira de teste antes da colocação do compressor e/ou conjugados em posição. Já em outra modalidade, o coletor de amostra pode contatar os conjugados em um cartucho externo que então se encaixa ou se insere em um cassete de teste para colocar o material em contato com a tira de teste.
[0161] Em algumas modalidades, o compressor de amostra 30 é conectado de forma giratória ao alojamento 85 conforme mostrado na Figura 8B. Apesar de a articulação do compressor de amostra 30 ser mostrada de forma que o compressor de amostra 30 seja girado em direção à extremidade a jusante da tira quando aberto, o alojamento poderia ser projetado de forma que o compressor de amostra 30 seja articulado para qualquer lado ou em outras direções dentro do espírito da presente invenção. A porção de coleta de amostra 60 do coletor de amostra 35 está preferencialmente inserida a partir do lado de forma que de alinhe com um furo de inserção 88 no lado do alojamento 85. No entanto, o coletor de amostra 35 poderia ser inserido em qualquer direção dependendo do projeto do alojamento. O compressor de amostra 30 preferencialmente inclui uma almofada (não visível na Figura 8B), com um ou mais componentes de ensaio, localizados na superfície do compressor de amostra voltado para a zona de aplicação de amostra da tira de teste 80. O compressor de amostra 30 é então fechado de forma que uma pressão de compressão seja aplicada à pilha vertical da almofada do compressor de amostra, a porção de coleta de amostra, e a zona de aplicação de amostra para transferir a amostra e um ou mais componentes de ensaio para a zona de aplicação de amostra da tira de teste. Apesar de haver um empilhamento de almofada absorvente fora do alojamento na extremidade a montante mais afastada do dispositivo na Figura 8B, o comprimento da almofada absorvente pode variar. De fato, contanto que o tampão possa ser adicionado a uma extremidade a montante (por exemplo, através de uma janela de aplicação no alojamento), não é necessário ter a almofada absorvente se estendendo significantemente para fora do alojamento. Nessa modalidade, não há possibilidade de perder o compressor de amostra, e não há necessidade de alinhar o compressor de amostra com a zona de aplicação de amostra quando se forma a pilha vertical. Outra vantagem dessas modalidades é que permitem um espaço de tempo entre a aplicação da amostra e a iniciação real do fluxo para a zona de teste. Em outras palavras, o sanduíche pode ser pré-produzido, e o fluxo iniciado muito depois.
[0162] Alternativamente, a almofada 33 pode ser separada do compressor de amostra dentro do espírito da presente invenção. A almofada pode estar em um aplicador de parceiro de ligação similar ao coletor de amostra. Nessas modalidades, o aplicador de parceiro de ligação pode estar localizado entre a porção de coleta de amostra e a zona de aplicação de amostra quando a pressão é aplicada pelo compressor de amostra para transferir a amostra à zona de aplicação de amostra.
[0163] A Figura 9 mostra uma pilha vertical que inclui um compressor de amostra 30, um coletor de amostra 35 com uma porção de coleta de amostra 60, um aplicador de parceiro de ligação 62 com uma almofada aplicadora 64, e uma zona de aplicação de amostra 44 de uma tira de teste. Apesar de o aplicador de parceiro de ligação 62 inclui um manípulo na Figura 9, o aplicador de parceiro de ligação 62 poderia, de forma alternativa, simplesmente ser uma almofada. A porção de saliência 34 do compressor de amostra 30 aplica pressão à porção de coleta de amostra 60 carregada com uma amostra e a almofada aplicadora 64 carregada com ao menos um parceiro de ligação para um analito a ser testado na amostra. A pressão preferencialmente força ao menos uma porção da amostra da porção de coleta de amostra 60 para molhar a almofada aplicadora 64, assim mobilizando parte do parceiro de ligação de forma que ao menos parte da amostra e parte do parceiro de ligação sejam transferidos para a zona de aplicação de amostra 44. Em algumas modalidades, essa transferência ocorre sem diluição. Nas modalidades com volumes pequenos de amostra ou amostras viscosas ou sólidas, no entanto, um líquido adicional pode ser usado para facilitar a transferência da amostra e do parceiro de ligação para a tira de teste. Em algumas modalidades, conforme mostrado na Figura 9, o compressor de amostra não tem almofada, embora uma almofada possa ser usada para auxiliar na transferência, tal como por fornecimento de líquido ou tampão adicional, dentro do espírito da presente invenção. Em algumas modalidades, conforme mostrado na Figura 9, a porção de coleta de amostra 60 está localizada entre o compressor de amostra 30 e a almofada aplicadora 64 na pilha vertical para auxiliar na transferência do parceiro de ligação para a tira de teste durante a compressão. Alternativamente, a almofada aplicadora 64 pode ser colocada entre o compressor de amostra 30 e a porção de coleta de amostra 60 dentro do espírito da presente invenção. Nas modalidades em que o sanduíche completo se forma antes de alcançar a zona de teste, dois aplicadores de parceiro de ligação (um aplicador separado para cada parceiro de ligação do analito) podem ser usados, com a porção de coleta de amostra, a primeira almofada aplicadora, e a segunda almofada aplicadora sendo colocadas em qualquer ordem na pilha vertical dentro do espírito da presente invenção. Alternativamente, um único aplicador de parceiro de ligação poderia incluir ambos os parceiros de ligação para o analito. Em outras modalidades, a amostra, o primeiro parceiro de ligação, e o segundo parceiro de ligação podem ser fornecidos sequencialmente à tira de teste em qualquer ordem com uso do compressor de amostra dentro do espírito da presente invenção.
[0164] Em um método de aplicação de uma amostra a uma tira de teste de um dispositivo de fluxo lateral, ao menos um parceiro de ligação externo é primeiramente colocado na zona de aplicação de amostra da tira de teste. O parceiro de ligação externo pode estar localizado em uma almofada externa. Nas modalidades em que há dois parceiros de ligação de analito que ligam o analito antes de alcançar a zona de teste, qualquer um ou ambos os parceiros de ligação de analito podem ser adicionados. Um coletor de amostra que inclui a amostra é colocado em uma pilha vertical entre o parceiro de ligação externo e um compressor de amostra. O compressor de amostra aplica pressão ao coletor de amostra para transferir o parceiro de ligação externo e ao menos uma porção da amostra para a zona de aplicação de amostra. Alternativamente, o parceiro de ligação externo poderia ser adicionado e comprimido pelo compressor de amostra, então removido, antes de o coletor de amostra ser empilhado sobre a zona de aplicação de amostra, onde a amostra é comprimida na tira de teste. Em outra modalidade alternativa, ao menos um parceiro de ligação externo é colocado na pilha vertical entre o compressor de amostra e o coletor de amostra. Alternativamente, o coletor de amostra é adicionado e comprimido, então removido, e então o parceiro de ligação externo é adicionado e comprimido na tira de teste. Em outras modalidades, o coletor de amostra está em uma pilha vertical entre um primeiro parceiro de ligação externo e um segundo parceiro de ligação externo, e o compressor de amostra aplica pressão à pilha vertical. Nessas modalidades, nem a tira nem o compressor de amostra tem um parceiro de ligação de analito específico. A amostra, o parceiro de ligação de analito, e o parceiro de ligação de controle móvel podem ser também aplicados à zona de aplicação de amostra em múltiplas etapas em qualquer combinação dentro do espírito da presente invenção.
[0165] Alternativamente, em um dispositivo de fluxo lateral da presente invenção, o compressor de amostra pode ser um compressor de amostra universal sem nenhum componente específico ao analito de interesse. Em uma modalidade, o compressor de amostra não contém componente do ensaio. Nas modalidades com um controle, a almofada do compressor de amostra contém somente o parceiro de ligação de zona de controle móvel. Nessas modalidades, um ou mais aplicadores de parceiro de ligação incluem ao menos um parceiro de ligação para o analito e se tornam parte da pilha vertical com o compressor de amostra e o coletor de amostra quando a amostra é transferida para a zona de aplicação de amostra. A amostra, o parceiro de ligação de analito, e o parceiro de ligação de controle móvel podem ser também aplicados à zona de aplicação de amostra em múltiplas etapas em qualquer combinação dentro do espírito da presente invenção.
[0166] Em outra modalidade da presente invenção, o compressor de amostra 30 também serve como o coletor de amostra, e a almofada 33 do compressor de amostra também serve como a porção de coleta de amostra. Nessa modalidade, o conjugado, o segundo parceiro de ligação, o parceiro de ligação de linha de controle, e/ou qualquer combinação dos três, estão preferencialmente localizados em uma superfície posterior da almofada 33, onde a almofada é presa ao compressor de amostra arm. Nas modalidades em que a coleta de amostra precisa ser realizada de forma esterilizada, o compressor de amostra 30 é então preferencialmente esterilizado por radiação antes do uso como um coletor de amostra. A amostra é então coletada com uso da parte frontal da almofada de forma que o paciente não seja exposto ao conjugado ou ao segundo parceiro de ligação durante a aquisição de amostra. Quando a amostra é aplicada à zona de aplicação de amostra da tira de teste, a almofada é preferencialmente comprimida de forma que a amostra se mistura com o conjugado ou o segundo parceiro de ligação e ao menos uma porção de ambos é espremida para fora na tira de teste.
[0167] Em algumas modalidades, um dispositivo de fluxo lateral da presente invenção pode também incluir um sistema de amplificação de sinal integrado, em linha, ou in situ. O sistema de amplificação de amostra pode ser usado em combinação com um compressor de amostra ou em um método ou dispositivo sem um compressor de amostra dentro do espírito da presente invenção. Nas modalidades em que ouro coloidal é usado como a etiqueta detectável para o conjugado, o sinal do ouro coloidal no conjugado ligado à zona de teste pode ser ainda amplificado por acentuação de prata. As formulações adequadas de sais de prata e os desenvolvedores de prata podem ser secos no sítio de aplicação de amostra ou a montante do mesmo ou a jusante do mesmo. Os sais e os desenvolvedores de prata podem ser secos juntos, a montante ou a jusante um do outro, ou podem ser separados pela área de aplicação de amostra. Em outras modalidades, o empilhamento, em que o sistema inclui um conjugado com um antígeno adicional e um segundo conjugado, que é preferencialmente uma nanopartícula, com o parceiro de ligação específico do antígeno, é usado para amplificar o sinal. O segundo conjugado também preferencialmente inclui uma etiqueta. No segundo conjugado, o parceiro de ligação pode ser conjugado a uma partícula que é do mesmo tamanho, menor, ou maior que a partícula no primeiro conjugado. Já em outras modalidades, tanto a acentuação de prata quanto a acentuação de empilhamento podem ser usadas na mesma tira de teste. Os elementos de conjugado de empilhamento e acentuação de prata podem estar juntos ou a montante ou a jusante entre si. Um recurso preferencial dessas modalidades é que tanto as nanopartículas de “empilhamento” e/ou os acentuadores de prata não entrem em contato com o conjugado inicialmente, mas entrem em contato somente enquanto o conjugado estiver imobilizado na zona de teste. Assim, uma especificidade melhor é atingida.
[0168] Em algumas modalidades em que um “sanduíche completo” é formado entre o analito 40, o primeiro parceiro de ligação de analito 37, e o segundo parceiro de ligação de analito 38 antes de o complexo alcançar a zona de detecção 52 (consulte, por exemplo, as figuras 4A a 4C, 5A a 5B, e 6A a 6B), acentuação de prata ou outros sinais de amplificação podem ser colocados a montante da zona de aplicação de amostra 44 de forma que o sal de prata e/ou desenvolvedor de prata interaja com o sanduíche completo antes de o complexo alcançar a zona de detecção 52. Em outras modalidades com um sanduíche completo, o sal de prata e/ou desenvolvedor de prata estão localizados a jusante da zona de aplicação de amostra 44 de forma que o sanduíche completo se forma e percorre até o sal/desenvolvedor de prata antes de alcançar a zona de detecção 52.
[0169] Na técnica anterior conforme mostrado na Figura 10, há uma correspondência de um para um entre analito 40 e etiqueta 41 na zona de teste 45, devido ao fato de que cada analito se liga a um parceiro de ligação imobilizado 38 e um parceiro de ligação móvel 37 com uma etiqueta 41 no conjugado 36.
[0170] Em um sistema de amplificação de sinal da presente invenção, a fonte de amplificação pode estar localizada em qualquer lugar na tira de teste, incluindo na zona de aplicação de amostra, ou a montante ou a jusante da mesma. Alternativamente, a fonte de amplificação pode estar localizada no tampão ou no compressor de amostra.
[0171] Em algumas modalidades, conforme mostrado na Figura 11, a fonte de amplificação 70 deposita a si própria de forma não específica no conjugado de forma que múltiplos conjugados estão associados a um analito ligado na zona de teste. Nessa modalidade, a fonte de amplificação é preferencialmente um ou mais sais de prata, e um desenvolvedor de prata pode ser usados para acentuar o sinal em ensaios com uso de ouro coloidal como a porção de etiqueta 41 do conjugado. Os sais de prata e desenvolvedor de prata podem estar localizados ou introduzidos de qualquer maneira que acentue a detecção do analito. Nas modalidades em que ouro coloidal é usado como a etiqueta detectável para o conjugado, o sinal do ouro coloidal no conjugado ligado na zona de teste pode ser amplificado por acentuação de prata. As formulações adequadas de sais de prata e os desenvolvedores de prata podem ser secos no sítio de aplicação de amostra ou a montante do mesmo ou a jusante do mesmo. Os sais e os desenvolvedores de prata podem ser secos juntos, a montante ou a jusante um do outro, ou podem ser separados pela área de aplicação de amostra. Alternativamente, sais e/ou desenvolvedores de prata podem ser incluídos como parte do tampão.
[0172] Em uma modalidade preferencial, a mistura dos sais e desenvolvedores de prata é seca em uma área entre a zona de aplicação de amostra e a zona de teste. Nessa modalidade, um sanduíche completo do analito entre dois parceiros de ligação (um sendo um conjugado em ouro e o outro adequadamente identificado com marcadores tais como biotina) se move para a área de acentuação de prata e juntos percorrem até a zona de teste onde são capturados. Embora a acentuação de prata possa ser aplicada ao meio sanduíche antes da captura, a acentuação de prata é preferencialmente aplicada após a captura, devido ao fato de que esta poderia de outra forma interferir na ligação na zona de teste. Os sais e desenvolvedores de prata podem ser usados em qualquer uma das modalidades descritas na presente invenção, incluindo, mas não limitado àquelas mostradas nas Figuras 3A a 3C, 4A a 4C, 5A a 5B, 6A a 6B e 7A a 7D.
[0173] Já em outra modalidade, a área de acentuação de prata está localizada embaixo do material de aplicação de amostra. O compressor com ambos os parceiros de ligação conforme descrito acima poderia formar o sanduíche completo e se tornar acentuado por sais e desenvolvedores de prata todos em um local. Esse mega complexo então pode se mover para a zona de teste onde pode ser capturado.
[0174] Já em outra modalidade, a acentuação de prata é atingida por incorporação dos sais e desenvolvedores de prata no tampão contínuo. Em outras modalidades, os sais de prata e/ou desenvolvedores de prata podem estar localizados no compressor de amostra ou no coletor de amostra em situações em que o coletor de amostra não precise ser esterilizado. De outra forma, o coletor de amostra pode ser esterilizado após a adição dos sais de prata e/ou desenvolvedor de prata com uso de técnicas de esterilização, tais como, por exemplo, radiação, que não danifica os sais de prata e/ou desenvolvedor de prata.
[0175] Já em outra modalidade, os sais de prata são secos no sítio, a montante, ou a jusante da área de aplicação de amostra e o desenvolvedor de prata pode ser adicionado à janela de visualização como uma etapa separada.
[0176] Em uma modalidade preferencial que envolve a acentuação de prata, como a prata é sensível à luz, o teste é executado invertido (com o cassete girado nas modalidades em que um cassete é usado) ou de outra forma protegido da luz ambiente antes da conclusão do teste.
[0177] Em outra modalidade, a acentuação de prata é atingida como uma etapa separada em que o sal de prata e o desenvolvedor são adicionados juntamente ou separadamente à área de janela de visualização 82 onde a zona de teste 83 está localizada. Se não há área de janela de visualização 82, o sal e o desenvolvedor de prata são preferencialmente adicionados à zona de teste 83 da tira. Em algumas dessas modalidades, a acentuação de prata é adicionada à tira de teste enquanto esta está ainda úmida ou seca após o uso. Em algumas dessas modalidades, a tira é removida de qualquer alojamento e uma porção da tira que contém a zona de teste 83 é cortada e tratada com acentuação de prata juntamente ou separadamente.
[0178] Em uma modalidade preferencial, após o teste ser executado, permite-se que a tira seque no ar. A secagem moderada da tira é realizada em aproximadamente 20 a 30 minutos, mas depende das condições ambientais. Após a tira ter secado, uma gota ou duas do sal ou desenvolvedores de prata são adicionadas à área de janela de visualização 82 onde a zona de teste 83 está localizada. Se não há área de janela de visualização 82, o sal e o desenvolvedor de prata são preferencialmente adicionados à zona de teste 83 da tira. Isso acentua a sensibilidade em ao menos 5 vezes. O sal e desenvolvedores de prata podem ser adicionados juntamente ou separadamente. A acentuação de prata ocorre quase instantaneamente e os resultados são preferencialmente lidos dentro de dois a três minutos após a adição da acentuação de prata. Se os resultados não forem lidos rapidamente, a tira pode se tornar preta e o fundo inferirá na leitura da linha de teste verde/preta. Esse fundo pode ser em grande medida minimizado se uma solução de lavagem for adicionada à janela de visualização 82/zona de teste 83. A sensibilidade pode ser ainda acentuada com uso de um leitor óptico portátil, por exemplo, um espectrômetro em miniatura feito pela Ocean Optics, Inc. (Dunedin, Flórida). Um leitor portátil é um espectrômetro em miniatura de mão, que quantifica a intensidade de cor da linha de teste medindo a absorbância ou a refletância do complexo etiquetado que se liga à linha de teste. A quantificação da linha de teste pode ser determinada pelo uso de uma curva padrão. No desenvolvimento de uma curva padrão, criam-se diversas titulações da concentração de analito e registra-se a saída do leitor em cada titulação. O leitor intensifica a sensibilidade de um teste em 5 a 10 vezes. Em operação, a janela de detecção para visualizar a linha de teste visível é colocada em ou em proximidade à abertura do espectrômetro de forma que uma medição de absorbância ou refletância direta possa ser feita.
[0179] Em outra modalidade preferencial, a solução de sal e/ou desenvolvedor de prata inclui um líquido volátil. O sal e o desenvolvedor de prata poderiam ser compostos juntamente em uma única solução ou como soluções separadas. Qualquer líquido que evapore à temperatura ambiente ou se vaporize facilmente e não interfira no teste poderia ser usado. O solvente volátil é escolhido de forma que não dissolva o material de membrana (por exemplo, nitrocelulose) que compõe a zona de teste 83 onde o segundo parceiro de ligação 17 (consulte a Figura 1), 38 (consulte as Figuras 3A a 3C e 7A) ou o identificador imobilizado 50 (consulte as Figuras 4A a 4C, 5A a 5B, 6A a 6B e 7B a 7D) estão localizados. Alguns exemplos de um líquido volátil que poderia ser usado incluem, mas não se limitam a, metanol, álcool isopropílico, concentrações baixas de benzeno, e concentrações baixas de acetona. A acentuação de prata tem o sal de prata e um desenvolvedor que é preferencialmente relativamente orgânico em natureza. A solução de sal e desenvolvedor de prata é adicionada à área de janela de visualização 82 onde a zona de teste 83 está localizada no final do teste (por exemplo, aproximadamente 10 minutos após a amostra ser adicionada à tira), quando a tira ainda está bem úmida. Se não há área de janela de visualização 82, o sal e o desenvolvedor de prata são preferencialmente adicionados à zona de teste 83 da tira. O líquido volátil “seca” a área onde o líquido é adicionado (a zona de teste 83). Nessa modalidade, não é necessário esperar que toda a tira esteja moderadamente seca. Essa modalidade a cria secagem “in-situ” somente da área de interesse (a zona de teste 83).
[0180] Em algumas modalidades, conforme mostrado na Figura 12, a amplificação se deve a um fenômeno de “empilhamento” em que um segundo conjugado 74 “se empilha” em ao menos uma porção do complexo formado durante o ensaio. Nessas modalidades, o primeiro conjugado 72 inclui uma porção adicional 73 a qual um parceiro de ligação 76 da porção 73 especificamente se liga, e o segundo conjugado 74 preferencialmente também inclui uma etiqueta 78. Por exemplo, quando o segundo parceiro de ligação 38 inclui um identificador de avidina 39, o sanduíche completo é capturado na zona de teste pela biotina imobilizada 50, e subsequentemente ou concorrentemente, o conjugado de “empilhamento” se acumula ou é empilhado no sanduíche completo imobilizado na zona de teste, gerando mais acumulação em pilhada e melhor percepção de sinal. Em uma modalidade, o primeiro conjugado é ouro conjugado a um anticorpo do analito e IgY de galinha, e o segundo conjugado é uma esfera de látex vermelha conjugada a um antígeno antigalinha de coelho.
[0181] Preferencialmente, o “empilhamento” é somente usado em modalidades em que o “sanduíche completo” é formado antes de alcançar a zona de teste. Por exemplo, nas Figuras 4C, 5B, 6B, 7B, 7C e 7D, um sanduíche completo é formado na zona de aplicação de amostra. Em uma modalidade preferencial, um anticorpo de camundongo em conjugado etiquetado de liga ao antígeno para formar um primeiro complexo. O primeiro complexo imediatamente se liga ao anticorpo policlonal etiquetado por biotina mobilizada para formar um sanduíche completo como um segundo complexo. O segundo complexo é então capturado na zona de teste por avidina por meio da etiqueta de biotina. O conjugado de etiqueta anticamundongo liberado de forma mais lenta então se liga e se empilha ao anticorpo de camundongo no segundo complexo na zona de teste. O conjugado de etiqueta anticamundongo está preferencialmente localizado de forma que alcance a zona de teste após os complexos de analito terem sido formados. Algumas localizações preferenciais para o conjugado de etiqueta anticamundongo incluem na zona de aplicação de amostra, a montante da zona de aplicação de amostra, adicionado ao tampão após uma quantidade predeterminada de tempo, aplicado à zona de teste após o sanduíche ter sido formado, ou no trajeto de fluxo, mas encapsulado para atrasar sua liberação, por exemplo, em 20 a 30 segundos. Nessa modalidade, o empilhamento intensifica a sensibilidade do ensaio em 3 a 5 vezes.
[0182] Nas modalidades da presente invenção com conjugados de ouro, que podem ser usados em todos os ensaios de fluxo lateral, IgY de galinha etiquetado e seco, ou outra porção química imunogênica não específica, é incorporado na tira de teste a montante da zona de aplicação de amostra ou alternativamente no tampão. Quando a amostra é de mamífero (por exemplo, humano), a porção química imunogênica não específica é preferencialmente de um organismo não mamífero tal como, por exemplo, um pássaro, um peixe, ou uma planta, de forma que não interfira na ligação de analito. O segundo conjugado, por exemplo, IgY antigalinha, é então mobilizado pelo tampão. O atraso da mobilização do segundo conjugado permite que o sanduíche completo flua e comece a ligação por meio de identificador-identificador imobilizado, por exemplo, biotina-avidina, captura na zona de teste no caso de um segundo parceiro de ligação móvel. O sanduíche completo se acumula na zona de teste seguido por ligação e empilhamento do segundo conjugado, por exemplo, esferas de látex vermelho, no topo do primeiro conjugado, por exemplo, ouro. Essa modalidade também intensifica a sensibilidade do ensaio em 3 a 5 vezes. Nas modalidades em que o segundo parceiro de ligação para o analito é imobilizado na zona de teste, o meio sanduíche preferencialmente percorre até a zona de teste seguido por ligação e empilhamento.
[0183] A Figura 11 mostra amplificação não específica e a Figura 12 mostra amplificação específica. Em outras modalidades, combinações de ambas amplificação específica e amplificação não específica podem ser usadas, para amplificar ainda mais o sinal. Como um exemplo, a primeira amplificação deve-se a um fenômeno de “empilhamento”, conforme mostrado e discutido acima com respeito à Figura 12 em que um segundo conjugado 74 “empilha” em pelo menos uma porção do complexo formado durante o ensaio. Amplificação adicional é fornecida quando uma fonte de amplificação 70 deposita a si mesma de modo não específico no conjugado de modo que múltiplos conjugados sejam associados a uma ligação de analito na zona de teste, conforme mostrado e discutido acima com respeito à Figura 11. Outras combinações de amplificação específica e não específica podem ser usadas de maneira alternativa.
[0184] Em outra modalidade de intensificação de sinal e empilhamento, a intensificação é desempenhada com o uso de uma enzima conjugada para a porção química de empilhamento. Em um exemplo, a enzima é peroxidase de rábano, e a mesma é conjugada para um anticorpo anticamundongo de coelho. Embora a peroxidase de rábano seja muitas vezes usada para amplificar um sinal fraco, outras enzimas que intensificam sinais fracos podem ser alternativamente usadas incluindo, mas sem se limitar a, urease, catalase, fosfatase alcalina, e glicose oxidase. Similarmente, outros anticorpos que se ligam ao conjugado ou a um intermediário podem ser alternativamente usados. Não há nanopartículas ou microesferas nessa modalidade. Ao invés disso, essa modalidade inclui uma forma “solúvel” do conjugado. O local em que essa enzima conjugada é seca pode variar; o mesmo pode ser a montante, a jusante, ou sobrepondo à zona de aplicação da amostra. Em modalidades com um compressor de amostra, a enzima conjugada pode estar alternativamente no compressor de amostra. A enzima conjugada é preferencialmente seca na tira de teste, mas não imobilizada. A mesma pode ser localizada sozinha ou em combinação com outros componentes que formam o “sanduíche” com o anticorpo (que é preferencialmente biotinilado) e/ou o anticorpo conjugado a ouro.
[0185] A Figura 14 mostra uma modalidade de um detector com uma enzima conjugada para a porção química de empilhamento. A zona de controle 46 inclui um primeiro parceiro de ligação de controle imobilizado 110. A zona de teste 45 inclui um primeiro parceiro de ligação de zona de teste imobilizado 109 na membrana. Um primeiro parceiro de ligação de analito 102 conjugado a um segundo parceiro de ligação de zona de teste 101 é seco ou incorporado de outro modo (por exemplo, liofilizado) dentro da zona de aplicação da amostra 44. Embora não mostrado nessa Figura, o primeiro parceiro de ligação de analito 102 pode ser alternativamente localizado a montante ou a jusante da zona de aplicação da amostra 44. Um parceiro de ligação 107 para um segundo parceiro de ligação de analito 103 é conjugado a uma enzima 108, e é localizado a montante da zona de aplicação da amostra 44. Alternativamente, o parceiro de ligação 107 para o segundo parceiro de ligação de analito 103 poderia sobrepor a zona de aplicação da amostra 44 ou estar localizado a jusante da zona de aplicação da amostra 44. A almofada 33 no compressor de amostra 30 é preferencialmente incorporada com o segundo parceiro de ligação de analito 103 conjugado a uma primeira etiqueta detectável 104 e é preferencialmente misturado com um segundo parceiro de ligação de controle 105 conjugado a uma segunda etiqueta detectável 106, que serve como um controle.
[0186] Embora a Figura 14 mostre os diferentes reagentes em certos locais na tira de teste ou no compressor de amostra 30, outros locais para cada um do primeiro parceiro de ligação de analito 102 conjugado a um segundo parceiro de ligação de zona de teste 101, o parceiro de ligação 107 para o segundo parceiro de ligação de analito 103, o segundo parceiro de ligação de analito conjugado à primeira etiqueta detectável 104, e ao segundo parceiro de ligação de controle 105 conjugado à segunda etiqueta detectável 106 na tira de teste e/ou na almofada 33 do compressor de amostra 30 são também possíveis. Outras modalidades não exigem um compressor de amostra 30. Nessas modalidades, os reagentes 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107 e 108 serão localizados em diversos locais, preferencialmente a montante da zona de teste 45, na tira de teste.
[0187] A amostra é tirada de um chumaço de amostra 35, que é então colocada na zona de aplicação da amostra 44 através da janela de amostra 81 (em modalidades com um alojamento e uma janela de amostra) ou apenas na zona de aplicação da amostra 44. O compressor de amostra 30 é então comprimido na zona de aplicação da amostra 44. Uma ponta absorvente do compressor de amostra 30 é preferencialmente imerso em tampão contínuo por aproximadamente 15 a 30 segundos antes de remover o compressor de amostra 30. As Figuras 15A e 15B mostram os diferentes complexos que formam entre os reagentes de teste e o analito. Se o analito 40 está presente na amostra, o mesmo complexa com o primeiro parceiro de ligação de analito 102 e o segundo parceiro de ligação de analito 103, que complexa com o parceiro de ligação 107 conjugado com a enzima 108.
[0188] Se o analito 40 não está presente na amostra, o segundo parceiro de ligação de analito 103 ainda complexa com o parceiro de ligação 107 conjugado com a enzima 108, mas os mesmos não complexam com a amostra ou o primeiro parceiro de ligação de analito 102. O segundo parceiro de ligação de zona de teste 101 se ligará ao primeiro parceiro de ligação de zona de teste 109 na zona de teste 45, independentemente de o analito 40 estar presente ou não na amostra. Entretanto, se não houver analito presente, nada estará visível na linha de teste. O resultado é visualmente lido em aproximadamente dez minutos. Se uma linha de teste visível se forma juntamente com uma linha de controle visível, o resultado indica altos níveis de analito na amostra. Se, ao fim de 10 minutos, não houver linha visível na linha de teste, então uma gota de um substrato para a enzima é adicionada na linha de teste. Se a adição do substrato de enzima resultar em um sinal visível, o resultado indica uma amostra positiva fraca. Uma linha visível na linha de controle indica que o segundo parceiro de ligação de controle 105 conjugado à segunda etiqueta detectável 106 foi ligado ao primeiro parceiro de ligação de controle 110 na zona de controle 46 e que o teste foi executado corretamente. A Figura 15C mostra o complexo que se forma na zona de controle.
[0189] Como um exemplo, um detector de Vírus de Herpes Simples (HSV) inclui as seguintes seções, conforme mostrado na Figura 14. A zona de controle 46 inclui anticorpo IgY antigalinha de coelho imobilizado 110. A zona de teste 45 inclui NeutrAvidina imobilizada 109 na membrana de nitrocelulose. Anti-HSV-1 101 e/ou HSV-2 102 policlonal biotinilado é seco sobre a zona de aplicação da amostra 44. Embora não mostrado nessa Figura, o anti-HSV-1/HSV-2 102 pode ser alternativamente seco a montante ou a jusante da zona de aplicação da amostra 44. IgG anticamundongo de coelho (H&L) 107 conjugado a peroxidase de rábano (HRP) 108 é seco a montante da zona de aplicação da amostra 44. Alternativamente, o IgG anticamundongo de coelho 107 conjugado a peroxidase de rábano 108 poderia sobrepor a zona de aplicação da amostra 44 ou estar localizado a jusante da zona de aplicação da amostra 44. A almofada 33 no compressor de amostra 30 é preferencialmente incorporada com anti-gD 1&2 monoclonal de camundongo 103 (anticorpos monoclonais direcionado na direção contrária à glicoproteína D de vírus de herpes simples) conjugada a ouro coloidal 104 e misturado com IgY de galinha 105 conjugado a esferas de látex tingidas de azul 106, que servem como um controle.
[0190] A amostra é tomada em um chumaço de amostra 35, que é então colocado na zona de aplicação da amostra 44 através da janela de amostra 81 (em modalidades com um alojamento e uma janela de amostra) ou apenas na zona de aplicação da amostra 44. O compressor de amostra 30 é então comprimido sobre a zona de aplicação da amostra 44. A ponta absorvente do compressor de amostra 30 é preferencialmente imerso em tampão contínuo por aproximadamente 15 a 30 segundos antes de remover o compressor de amostra 30. As Figuras 15A e 15B mostram os diferentes complexos que se formam entre os reagentes de teste e o analito. Se HSV (o analito 40) está presente na amostra, o mesmo complexa com o anti-HSV 1/2 101, 102 policlonal biotinilado e o anti-gD1&2 monoclonal de camundongo 103 conjugado a ouro coloidal 104, que complexa com o IgG anticamundongo de coelho 107 conjugado com HRP 108.
[0191] Se HSV não está presente na amostra, o anti-gD1&2 monoclonal de camundongo 103 conjugado a ouro coloidal 104 ainda complexa com o IgG anticamundongo de coelho 107 conjugado com HRP 108, mas os mesmos não complexam com a amostra ou o anti-HSV 1/2 101, 102 policlonal biotinilado. O anti-HSV 1/2 101, 102 policlonal biotinilado se ligará a neutravidina 109 na zona de teste 45, independentemente de o HSV estar presente ou não na amostra. Entretanto, se não houver HSV presente, o anti-HSV 1/2 101, 102 policlonal biotinilado não será visível na linha de teste. O resultado é visualmente lido em aproximadamente dez minutos. Se uma linha de teste vermelha visível se forma juntamente com a linha de controle azul, o resultado indica altos níveis de HSV na amostra. Se, ao fim de 10 minutos, não houver linha vermelha visível na linha de teste, então uma gota de um substrato de enzima TMBM (ou outro substrato para peroxidase de rábano) é adicionada na linha de teste. Se a adição de TMBM resulta em uma linha de teste azul/roxa, o resultado indica uma amostra positiva fraca. Uma linha azul na linha de controle indica que o IgY de galinha 105 conjugado às esferas de látex tingidas de azul 106 foi ligado ao IgY antigalinha de coelho 110 na zona de controle 46 e que o teste foi executado corretamente. A Figura 15C mostra o complexo que se forma na zona de controle.
[0192] Nessa modalidade, o teste laboratorial remoto se torna ligado por enzima e a amplificação depende da quantidade de enzima e substrato, e aumenta com o tempo. Isso não ocorre em conjugados visualmente identificado para nanopartículas como ouro coloidal ou microesferas como esferas de látex. Ademais, o resultado da linha de teste não é devido a qualquer imunoensaio de antígeno-anticorpo, mas a um ensaio de ligação entre um ligante e um receptor como neutravidina e biotina. A ligação na linha de teste não é devida à ligação imunológica, mas à ligação química. Assim, a mesma não é um imunoensaio ligado por enzima (ELISA ou EIA). Ao invés disso, a mesma é uma cromofiltografia ligada por enzima, ou cromofiltografia de enzima multiplanar direta quando usada com um compressor de amostra. Mesmo com uma etapa adicional de adicionar o substrato de enzima à linha de teste, o teste é ainda simples de ser realizado.
[0193] Em uma modalidade de empilhamento alternativa, mostrada nas Figuras 16, 17A e 17B, uma enzima é fisicamente ligada à etiqueta detectável tanto no conjugado quanto na porção química de empilhamento. Em um exemplo, a enzima reveste esferas visivelmente detectáveis (por exemplo, esferas de látex vermelhas) e é conjugada a um anticorpo anticamundongo de coelho. Embora peroxidase de rábano seja muitas vezes usada para amplificar um sinal fraco, outras enzimas que intensificam sinais fracos podem ser alternativamente usadas incluindo, mas sem se limitar a, urease, catalase, fosfatase alcalina, e glicose oxidase. Similarmente, outros anticorpos que se ligam ao conjugado ou a um intermediário podem ser alternativamente usados. Não há nanopartículas ou microesferas nessa modalidade. Ao invés disso, essa modalidade inclui uma forma “solúvel” do conjugado. O local em que essa enzima conjugada é seca pode variar; o mesmo pode ser a montante, a jusante, ou sobrepondo à zona de aplicação da amostra. Em modalidades com um compressor de amostra, a enzima conjugada pode estar alternativamente no compressor de amostra. A enzima conjugada é preferencialmente seca na tira de teste, mas não imobilizada. A mesma pode ser localizada sozinha ou em combinação com outros componentes que formam o “sanduíche” com o anticorpo, que é preferencialmente biotinilado.
[0194] A Figura 16 mostra uma modalidade de um detector com uma enzima fisicamente ligada à etiqueta detectável tanto no conjugado quanto na porção química de empilhamento. A zona de controle 46 inclui um primeiro parceiro de ligação de controle imobilizado 110, similar ao detector mostrado na Figura 14. A zona de teste 45 inclui um primeiro parceiro de ligação de zona de teste imobilizado 209 em uma membrana. Um primeiro parceiro de ligação de analito 202 conjugado a um segundo parceiro de ligação de zona de teste 201 é seco ou incorporado de outro modo (por exemplo, liofilizado) dentro da zona de aplicação da amostra 44. Embora não mostrado nessa Figura, o primeiro parceiro de ligação de analito 202 pode ser alternativamente localizado a montante ou a jusante da zona de aplicação da amostra 44.
[0195] Um parceiro de ligação 207 para um segundo parceiro de ligação de analito 203, que é conjugado a uma enzima 208 e conjugado a uma etiqueta detectável 215 (que é também conjugado à enzima 208), é preferencialmente incorporado dentro da almofada 33 do compressor de amostra 30. Em outras modalidades, há apenas um parceiro de ligação 207 para o segundo parceiro de ligação de analito 203 conjugado a uma etiqueta detectável 215, e a etiqueta detectável é também conjugada à enzima 208. Em algumas modalidades, a enzima 208 é conjugada à etiqueta detectável 215 ao revestir a etiqueta detectável 215. Em algumas modalidades, o parceiro de ligação 207 conjugado à enzima 208 mais o parceiro de ligação 207 conjugado à etiqueta detectável 215 (que é também conjugado à enzima 208) poderia ser localizado na tira de teste, sobrepondo à zona de aplicação da amostra 44 ou ser localizado a jusante ou a montante da zona de aplicação da amostra 44. A almofada 33 no compressor de amostra 30 é preferencialmente também incorporada com o segundo parceiro de ligação de analito 203 conjugado a uma etiqueta detectável 204 revestida com a enzima 208, que é preferencialmente misturada com um segundo parceiro de ligação de controle 105 conjugado a uma etiqueta detectável 106 (mostrado na Figura 14), que serve como um controle.
[0196] Embora a Figura 16 mostre os diferentes reagentes em certos locais na tira de teste ou no compressor de amostra 30, outros locais para cada um do primeiro parceiro de ligação de analito 202 conjugado ao segundo parceiro de ligação de zona de teste 201, o parceiro de ligação 207 conjugado à enzima 208 mais o parceiro de ligação 207 conjugado à etiqueta detectável 215 revestida com a enzima, e o segundo parceiro de ligação de controle 105 conjugado à etiqueta detectável 106, na tira de teste e/ou na almofada 33 do compressor de amostra 30 são também possíveis. Outras modalidades não exigem um compressor de amostra 30. Nessas modalidades, os reagentes 201, 202, 203, 204, 105, 106, 207, 208 e 215 serão localizados em diversos locais, preferencialmente a montante da zona de teste 45, na tira de teste.
[0197] A amostra é tomada em um chumaço de amostra 35, que é então colocado na zona de aplicação da amostra 44 através da janela de amostra 81 (em modalidades com um alojamento e uma janela de amostra) ou apenas na zona de aplicação da amostra 44. O compressor de amostra 30 é então comprimido sobre a zona de aplicação da amostra 44. A ponta absorvente do compressor de amostra 30 é preferencialmente imerso em tampão contínuo por aproximadamente 15 a 30 segundos antes de remover o compressor de amostra 30. As Figuras 17A e 17B mostram os diferentes complexos que se formam entre os reagentes de teste e o analito. Se o analito 40 está presente na amostra, o mesmo complexa com o primeiro parceiro de ligação de analito 202 e o segundo parceiro de ligação de analito 203. O segundo parceiro de ligação de analito também complexa com o parceiro de ligação 207.
[0198] Se o analito 40 não está presente na amostra, o segundo parceiro de ligação de analito 203 ainda complexa com o parceiro de ligação 207, mas os mesmos não complexam com a amostra ou o primeiro parceiro de ligação de analito 202. O segundo parceiro de ligação de zona de teste 201 se ligará ao primeiro parceiro de ligação de zona de teste 209 na zona de teste 45, independentemente de se o analito 40 está presente ou não na amostra. Entretanto, se não há analito 40 presente, o segundo parceiro de ligação de zona de teste 201 conjugado ao primeiro parceiro de ligação de analito 202 e complexado com o primeiro parceiro de ligação de zona de teste 209 não será visível na linha de teste. O resultado é visualmente lido em aproximadamente dez minutos. Se uma linha de teste vermelha visível se forma juntamente com uma linha de controle visível, o resultado indica altos níveis de analito na amostra. Se, ao fim de 10 minutos, não houver linha visível na linha de teste, então uma gota do substrato de enzima é adicionada na linha de teste. Se a adição do substrato de enzima resulta em uma linha de teste visível, o resultado indica uma amostra positiva fraca. A linha visível na linha de controle indica que o segundo parceiro de ligação de controle 105 foi ligado ao primeiro parceiro de ligação de controle 110 na zona de controle 46 e que o teste foi executado corretamente. O complexo da linha de controle é mostrado na Figura 15C.
[0199] Nessa modalidade, a enzima é fisicamente ligada à etiqueta detectável (por exemplo, esferas de látex) e se move com a etiqueta detectável. Assim, questões de especificidade e de antecedentes são aprimoradas. Em altos níveis de antígeno, um resultado positivo é visivelmente detectável de modo fácil através de uma linha visível. Em níveis muito baixos, o substrato de enzima é adicionado à janela de resultados para se obter uma reação de cor amplificada de enzima. Ao depositar muitos dos reagentes, incluindo o parceiro de ligação 207, que inclui a enzima 208 e a etiqueta detectável 215, no compressor de amostra, esses reagentes não estão na tira. Em algumas modalidades preferenciais, o segundo parceiro de ligação de analito 203 pode ser pré-misturado com o parceiro de ligação 207 (com ou sem o parceiro de ligação etiquetado de enzima) e ser incorporado no compressor de amostra almofada. Nessas modalidades, a tira de teste inclui o segundo parceiro de ligação de zona de teste 202, que se liga ao primeiro parceiro de ligação de zona de teste 209. Isso faz da tira de teste um ensaio de ligação e não um imunoensaio.
[0200] Como um exemplo, um detector de Vírus de Herpes Simples (HSV) inclui as seguintes seções, conforme mostrado na Figura 16. A zona de controle 46 inclui anticorpo IgY antigalinha de coelho imobilizado 110, similar ao detector mostrado na Figura 14. A zona de teste 45 inclui NeutrAvidina imobilizada 209 na membrana de nitrocelulose. Anti-HSV-1 201 e/ou HSV-2 202 policlonal biotinilado é seca sobre a zona de aplicação da amostra 44. Embora não mostrado nessa Figura, o anti-HSV-1/HSV-2 202 pode ser alternativamente seco a montante ou a jusante da zona de aplicação da amostra 44. IgG anticamundongo de coelho (H&L) 207 conjugado a peroxidase de rábano (HRP) 208 mais IgG anticamundongo de coelho 207 conjugado a esferas de látex vermelhas 215 revestidas com peroxidase de rábano e preferencialmente incorporadas na almofada 33 do compressor de amostra 30. Em outras modalidades, há apenas IgG anticamundongo de coelho 207 conjugado a esferas de látex vermelhas 215 revestidas com peroxidase de rábano. Alternativamente, o IgG anticamundongo de coelho 207 conjugado a peroxidase de rábano 208 mais IgG anticamundongo de coelho 207 conjugado a esferas de látex vermelhas 215 revestidas com peroxidase de rábano poderiam ser localizados na tira de teste, sobrepondo à zona de aplicação da amostra 44 ou sendo localizados a jusante ou a montante da zona de aplicação da amostra 44. A almofada 33 no compressor de amostra 30 é preferencialmente também incorporada com anti-gD 1&2 monoclonal de camundongo 203 (anticorpos monoclonais direcionados na direção contrária a glicoproteína D de vírus de herpes simples) conjugado a esferas de látex vermelhas 204 revestidas com peroxidase de rábano e misturadas com IgY de galinha 105 conjugado a esferas de látex tingidas de azul 106 (mostrado na Figura 14), que serve como um controle.
[0201] A amostra é tomada em um chumaço de amostra 35, que é então colocado na zona de aplicação da amostra 44 através da janela de amostra 81 (em modalidades com um alojamento e uma janela de amostra) ou apenas na zona de aplicação da amostra 44. O compressor de amostra 30 é então comprimido sobre a zona de aplicação da amostra 44. A ponta absorvente do compressor de amostra 30 é preferencialmente imerso em tampão contínuo por aproximadamente 15 a 30 segundos antes de remover o compressor de amostra 30. As Figuras 17A e 17B mostram os diferentes complexos que se formam entre os reagentes de teste e o analito. Se HSV (o analito 40) está presente na amostra, o mesmo complexa com o anti-HSV-1/2 201/202 policlonal biotinilado e o anti-gD1&2 monoclonal de camundongo 203 conjugado a esferas de látex vermelhas 204, que complexa com o IgG anticamundongo de coelho 207 conjugada com HRP 208 e o IgG anticamundongo de coelho 207 conjugado a esferas de látex vermelhas 215 revestidas com peroxidase de rábano.
[0202] Se HSV não está presente na amostra, o anti-gD1&2 monoclonal de camundongo 203 conjugado a esferas de látex vermelhas 204 ainda complexa com o IgG anticamundongo de coelho 207, mas os mesmos não complexam com a amostra ou o anti-HSV 1/2 201/202 policlonal biotinilado. O anti-HSV 1/2 201/202 policlonal biotinilado se ligará a Neutravidina 209 na zona de teste 45, independentemente de o HSV estar presente ou não na amostra. Entretanto, se não houver HSV presente, o anti-HSV-1/2 201/202 policlonal biotinilado não estará visível na linha de teste. O resultado é visualmente lido em aproximadamente dez minutos. Se uma linha de teste vermelha visível se forma juntamente com a linha de controle azul, o resultado indica altos níveis de HSV na amostra. Se, ao fim de 10 minutos, não houver linha vermelha visível na linha de teste, então uma gota do substrato de enzima TMBM (ou outro substrato para peroxidase de rábano) é adicionada na linha de teste. Se a adição de TMBM resulta em uma linha de teste azul/roxa, o resultado indica uma amostra positiva fraca. Uma linha azul na linha de controle indica que o IgY de galinha 105 conjugado a esferas de látex tingidas de azul 106 foi ligado ao IgY antigalinha de coelho 110 na zona de controle 46 e que o teste foi executado corretamente. O complexo da linha de controle é mostrado na Figura 15C.
[0203] Nesse exemplo, um anticorpo anticamundongo de coelho é conjugado a enzima, que é também conjugado a esferas de látex vermelhas, e anticorpo anticamundongo de coelho adicional é conjugado diretamente às mesmas esferas. A enzima é fisicamente ligada a esferas e se move com as esferas. Assim, questões de especificidade e de antecedentes são aprimoradas. Em altos níveis de antígeno, um resultado positivo é visivelmente detectável de modo fácil por uma linha vermelha. Em níveis muito baixos, o substrato de enzima é adicionado à janela de resultados para se obter uma reação de cor amplificada de enzima.
[0204] Ao depositar o anticorpo anticamundongo de coelho conjugado às esferas vermelhas (juntamente com a enzima conjugada na mesma esfera) no compressor de amostra, esses reagentes não estão na tira. Em algumas modalidades preferenciais, o anti-gD 1&2 monoclonal de camundongo livre pode ser pré-misturado com o anticamundongo de coelho (com ou sem o anticamundongo de coelho etiquetado de enzima) e ser incorporado no compressor de amostra almofada. Nessas modalidades, a tira de teste inclui biotina que se liga a neutravidina. Isso faz da tira de teste um ensaio de ligação e não um imunoensaio.
[0205] As Figuras 18, 19A e 19B mostram outra modalidade de empilhamento da presente invenção. Nessa modalidade, uma enzima é conjugada/fisicamente ligada a uma etiqueta detectável na porção química de empilhamento e o conjugado que se liga ao analito não inclui uma etiqueta detectável. Essa modalidade intensifica adicionalmente a especificidade. Em um exemplo, a enzima reveste esferas visivelmente detectáveis (por exemplo, esferas de látex vermelhas) e é conjugada a um anticorpo anticamundongo de coelho. Embora peroxidase de rábano seja muitas vezes usada para amplificar um sinal fraco, outras enzimas que intensificam sinais fracos podem ser alternativamente usadas incluindo, mas sem se limitar a, urease, catalase, fosfatase alcalina, e glicose oxidase. Similarmente, outros anticorpos que se ligam ao conjugado ou a um intermediário podem ser alternativamente usados. Não há nanopartículas ou microesferas nessa modalidade. Ao invés disso, essa modalidade inclui uma forma “solúvel” do conjugado. O local em que essa enzima conjugada é seca pode variar; o mesmo pode ser a montante, a jusante, ou sobrepondo à zona de aplicação da amostra. Em modalidades com um compressor de amostra, a enzima conjugada pode estar alternativamente no compressor de amostra. A enzima conjugada é preferencialmente seca na tira de teste, mas não imobilizada. A mesma pode ser localizada sozinha ou em combinação com outros componentes que formam o “sanduíche” com o anticorpo (que é preferencialmente biotinilado).
[0206] Uma modalidade de um detector com enzima conjugada/fisicamente ligada a uma etiqueta detectável na porção química de empilhamento e um conjugado que se liga ao analito que não inclui uma etiqueta detectável é mostrada na Figura 18. A zona de controle 46 inclui um primeiro parceiro de ligação de controle imobilizado 110, similar ao detector mostrado na Figura 14. A zona de teste 45 inclui um primeiro parceiro de ligação de zona de teste imobilizado 309 em uma membrana. Um primeiro parceiro de ligação de analito 302 conjugado a um segundo parceiro de ligação de zona de teste 301 é seco ou incorporado de outro modo (por exemplo, liofilizado) dentro da zona de aplicação da amostra 44. Embora não mostrado nessa Figura, o primeiro parceiro de ligação de analito 302 pode ser alternativamente localizado a montante ou a jusante da zona de aplicação da amostra 44. Uma mistura de um parceiro de ligação 307 para o segundo parceiro de ligação de analito 303 conjugado a uma enzima 308 e o parceiro de ligação 307 conjugado a uma etiqueta detectável 315 (por exemplo, esferas de látex) revestida ou de outro modo conjugada à enzima 308 é preferencialmente incorporada na almofada 33 do compressor de amostra 30. Em outras modalidades, há apenas o parceiro de ligação 307 conjugado à etiqueta detectável 315, que é também conjugado à enzima 308 (por exemplo, através do revestimento de enzima de esferas de látex). Embora o parceiro de ligação 307 conjugado à enzima e o parceiro de ligação 307 conjugado à etiqueta detectável 315 revestida com a enzima sejam mostrados no compressor de amostra 30 nessa Figura, esses componentes podem ser alternativamente localizados na tira de teste, sobrepondo à zona de aplicação da amostra 44 ou sendo localizados a jusante ou a montante da zona de aplicação da amostra 44. A almofada 33 no compressor de amostra 30 é preferencialmente também incorporada com um segundo parceiro de ligação de analito 303. Diferentemente das modalidades anteriores, o segundo parceiro de ligação de analito 303 não é conjugado a uma etiqueta detectável ou uma enzima. Em algumas modalidades, o segundo parceiro de ligação de analito 303 é preferencialmente misturado com o segundo parceiro de ligação de controle 105 conjugado à etiqueta detectável 106 (mostrado na Figura 14), que serve como um controle.
[0207] Embora a Figura 18 mostre os diferentes reagentes em certos locais na tira de teste ou no compressor de amostra 30, outros locais para cada um do primeiro parceiro de ligação de analito 302 conjugado ao segundo parceiro de ligação de zona de teste 301, a mistura do parceiro de ligação 307 para o segundo parceiro de ligação 303 conjugado a uma etiqueta detectável 315 revestida ou de outro modo conjugada à enzima 308, o segundo parceiro de ligação de analito 303 o segundo parceiro de ligação de controle 105 conjugado a uma etiqueta detectável 106, na tira de teste e/ou na almofada 33 do compressor de amostra 30 são também possíveis. Outras modalidades não exigem um compressor de amostra 30. Nessas modalidades, os reagentes 301, 302, 303, 304, 105, 106, 307, 308 e 315 serão localizados em diversos locais, preferencialmente a montante da zona de teste 45, na tira de teste.
[0208] A amostra é tomada em um chumaço de amostra 35, que é então colocado na zona de aplicação da amostra 44 através da janela de amostra 81 (em modalidades com um alojamento e uma janela de amostra) ou apenas na zona de aplicação da amostra 44. O compressor de amostra 30 é então comprimido sobre a zona de aplicação da amostra 44. A ponta absorvente do compressor de amostra 30 é preferencialmente imersa em tampão contínuo por aproximadamente 15 a 30 segundos antes de remover o compressor de amostra 30. As Figuras 19A e 19B mostram os diferentes complexos que se formam entre os reagentes de teste e o analito. Se o analito 40 está presente na amostra, o mesmo complexa com o primeiro parceiro de ligação de analito 302 e o segundo parceiro de ligação de analito 303. O segundo parceiro de ligação de analito 303 também complexa com o parceiro de ligação 307.
[0209] Se o analito 40 não está presente na amostra, o segundo parceiro de ligação de analito 303 ainda complexa com o parceiro de ligação 307, mas os mesmos não complexam com a amostra ou o primeiro parceiro de ligação de analito 302. O segundo parceiro de ligação de zona de teste 301 se liga ao primeiro parceiro de ligação de zona de teste 309 na zona de teste 45, independentemente de o analito estar presente ou não na amostra. Entretanto, se não houver analito 40 presente, o complexo resultante não estará visível na linha de teste. O resultado é visualmente lido em aproximadamente dez minutos. Se uma linha de teste visível se forma juntamente com a linha de controle visível, o resultado indica altos níveis de analito 40 na amostra. Se, ao fim de 10 minutos, não houver linha visível na linha de teste, então uma gota do substrato de enzima é adicionada na linha de teste. Se a adição do substrato de enzima resulta em uma linha de teste visível, o resultado indica uma amostra positiva fraca. A linha visível na linha de controle indica que o segundo parceiro de ligação de controle 105 conjugado à etiqueta detectável 106 foi ligado ao primeiro parceiro de ligação de controle 110 na zona de controle 46 e que o teste foi executado corretamente. O complexo da linha de controle é mostrado na Figura 15C.
[0210] Nessa modalidade, o parceiro de ligação 307 é conjugado à enzima 308, que é também conjugado à etiqueta detectável 315 (por exemplo, esferas de látex), e o parceiro de ligação adicional 307 é conjugado diretamente à mesma etiqueta detectável 315. A enzima é fisicamente ligada à etiqueta detectável e se move com a etiqueta detectável. Assim, questões de especificidade e de antecedentes são aprimoradas. Em altos níveis de antígeno, um resultado positivo é visivelmente detectável de modo fácil por uma linha vermelha. Em níveis muito baixos, o substrato de enzima é adicionado à janela de resultados para se obter uma reação de cor amplificada de enzima.
[0211] Ao depositar o parceiro de ligação 307 e seus outros componentes (308 e 315) no compressor de amostra, esses reagentes não estão na tira. Em algumas modalidades preferenciais, o segundo parceiro de ligação de analito 303 pode ser pré-misturado com o parceiro de ligação 307 (com ou sem o parceiro de ligação etiquetado de enzima 307) e ser incorporado no compressor de amostra almofada. Nessas modalidades, o dispositivo inclui parceiros de ligação como biotina e avidina. Isso faz da tira de teste um ensaio de ligação e não um imunoensaio.
[0212] Como um exemplo, um detector de Vírus de Herpes Simples (HSV) inclui as seguintes seções, conforme mostrado na Figura 18. A zona de controle 46 inclui anticorpo IgY antigalinha de coelho imobilizado 110, similar ao detector mostrado na Figura 14. A zona de teste 45 inclui NeutrAvidina imobilizada 309 em uma membrana de nitrocelulose. Anti-HSV-1 301 e/ou HSV-2 302 policlonal biotinilado é seco sobre a zona de aplicação da amostra 44. Embora não mostrado nessa Figura, o anti-HSV-1/HSV-2 302 pode ser alternativamente localizado a montante ou a jusante da zona de aplicação da amostra. IgG anticamundongo de coelho (H&L) 307 conjugado a peroxidase de rábano (HRP) 308 mais IgG anticamundongo de coelho 307 conjugado a esferas de látex vermelhas 315 revestidas com peroxidase de rábano é preferencialmente incorporado na almofada 33 do compressor de amostra. Em outras modalidades, há apenas IgG anticamundongo de coelho 307 conjugado a esferas de látex vermelhas 315 revestidas com peroxidase de rábano. Alternativamente, o IgG anticamundongo de coelho 307 conjugado a peroxidase de rábano 308 mais IgG anticamundongo de coelho 307 conjugado a esferas de látex vermelhas revestidas com peroxidase de rábano 308 poderiam ser localizados na tira de teste, sobrepondo à zona de aplicação da amostra 44 ou sendo localizados a jusante ou a montante da zona de aplicação da amostra 44. A almofada no compressor de amostra 30 é preferencialmente também incorporada com anti-gD 1&2 monoclonal de camundongo livre 303. Diferentemente das modalidades anteriores, os anticorpos monoclonais de camundongo livres 303 não são conjugados a uma etiqueta detectável ou a uma enzima. Os anticorpos monoclonais de camundongo livres 303 são preferencialmente misturados com IgY de galinha 105 conjugado a esferas de látex tingidas de azul (mostrado na Figura 14), que servem como um controle.
[0213] A amostra é tomada em um chumaço de amostra 35, que é então colocado na zona de aplicação da amostra 44 através da janela de amostra 81 (em modalidades com um alojamento e uma janela de amostra) ou apenas na zona de aplicação da amostra 44. O compressor de amostra 30 é então comprimido sobre a zona de aplicação da amostra 44. A ponta absorvente do compressor de amostra 30 é preferencialmente imersa em tampão contínuo por aproximadamente 15 a 30 segundos antes de remover o compressor de amostra 30. As Figuras 19A e 19B mostram os diferentes complexos que se formam entre os reagentes de teste e o analito. Se HSV (o analito 40) está presente na amostra, o mesmo complexa com o anti -HSV-1/2 301/302 policlonal biotinilado e o anti -gD1&2 monoclonal de camundongo 303, que complexa com o IgG anticamundongo de coelho 307 conjugado com HRP 308 e IgG anti-camundongo de coelho 307 conjugado a esferas de látex vermelhas 315 revestidas com peroxidase de rábano.
[0214] Se HSV não está presente na amostra, o anti-gD1&2 monoclonal de camundongo 303 ainda complexa com o IgG anticamundongo de coelho 307, mas os mesmos não complexam com a amostra ou o anti-HSV1/2 301/302 policlonal biotinilado. O anti-HSV1/2 301/202 policlonal biotinilado se ligará a neutravidina 309 na zona de teste 45, independentemente de HSV estar presente ou não na amostra. Entretanto, se não há HSV presente, o anti-HSV 1/2 301/302 policlonal biotinilado não será visível na linha de teste. O resultado é visualmente lido em aproximadamente dez minutos. Se uma linha de teste vermelha visível se forma juntamente com a linha de controle azul, o resultado indica altos níveis de HSV na amostra. Se, ao fim de 10 minutos, não houver linha vermelha visível na linha de teste, então uma gota do substrato de enzima TMBM (ou outro substrato para peroxidase de rábano) é adicionada na linha de teste. Se a adição de TMBM resultar em uma linha de teste azul/roxa, o resultado indica uma amostra positiva fraca. Uma linha azul na linha de controle indica que o IgY de galinha 105 conjugado a esferas de látex tingidas de azul 106 foi ligado ao IgY antigalinha de coelho 110 na zona de controle 46 e que o teste foi executado corretamente. O complexo da linha de controle é mostrado na Figura 15C.
[0215] Nesse exemplo, anticorpo anticamundongo de coelho é conjugado à enzima, que é também conjugado a esferas de látex vermelhas, e o anticorpo anticamundongo de coelho adicional é conjugado diretamente às mesmas esferas. A enzima é fisicamente ligada a esferas e se move com as esferas. Assim, questões de especificidade e de antecedentes são aprimoradas. Em altos níveis de antígeno, um resultado positivo é visivelmente detectável de modo fácil por uma linha vermelha. Em níveis muito baixos, o substrato de enzima é adicionado à janela de resultados para se obter uma reação de cor amplificada de enzima.
[0216] Ao depositar o anticorpo anticamundongo de coelho conjugado às esferas vermelhas (juntamente com a enzima conjugada na mesma esfera) no compressor de amostra, esses reagentes não estão na tira. Em algumas modalidades preferenciais, o anti-gD 1&2 monoclonal de camundongo livre pode ser pré-misturado com o anticamundongo de coelho (com ou sem o anticamundongo de coelho etiquetado de enzima) e ser incorporado no compressor de amostra almofada. Nessas modalidades, o dispositivo inclui parceiros de ligação como biotina e avidina. Isso faz da tira de teste um ensaio de ligação e não um imunoensaio.
[0217] Em algumas modalidades preferenciais, a nitrocelulose é “bloqueada” com bloqueadores, o que aumenta a especificidade da reação. Alguns exemplos de bloqueadores incluem, mas não se limitam a, caseína, e Albumina de Soro Bovino (BSA). Sempre que um bloqueia a membrana de nitrocelulose, a carga inerente da nitrocelulose é neutralizada e, assim, nenhuma proteína adicional pode ligar à membrana bloqueada. Em adição, a estrutura cromatográfica é mudada e o fluxo é mais próximo a um fluxo deslizante ou corrediço ao invés de cromatografia tradicional. O resultado é um processo de cromofiltografia exclusivo.
[0218] A Figura 21A mostra outra modalidade de uma tira de teste de fluxo lateral com elementos de acentuação. Essa modalidade preferencialmente inclui um parceiro de ligação etiquetado 407 que é específico para uma espécie ao invés de um analito 40. Como um exemplo, quando o parceiro de ligação 402 para o analito for um anticorpo de camundongo, o parceiro de ligação específico de espécie etiquetado 407 é um anticorpo anticamundongo. Como outro exemplo, quando o parceiro de ligação 402 para o analito for um anticorpo de coelho, o parceiro de ligação específico de espécie etiquetado 407 é um anticorpo anticoelho. Aqueles versados na técnica entenderão que qualquer parceiro de ligação específica de espécie 407, ou outro parceiro de ligação não específico para o analito 40, mas específico para um parceiro de ligação 402 para o analito, pode ser usado nessa modalidade. Aqueles versados na técnica também saberão como escolher espécies para minimizar reações cruzadas.
[0219] A zona de aplicação da amostra 44 inclui um primeiro parceiro de ligação 402 para o analito 40. Note- se que o primeiro parceiro de ligação 402 não inclui uma etiqueta detectável. Nessa modalidade, alguns dos primeiros parceiros de ligação 402 são preferencialmente identificados 401 e um parceiro de ligação 409 para o identificador 401 é preferencialmente etiquetado com uma etiqueta detectável. Em modalidades preferenciais, a quantidade do primeiro parceiro de ligação 402 que é identificada 401 é de 1 a 10% da quantidade total do primeiro parceiro de ligação 402 no teste.
[0220] A zona de aplicação da amostra 44 também inclui um parceiro de ligação específica de espécie etiquetado 407 (conjugado a uma etiqueta detectável 417) que se liga ao primeiro parceiro de ligação 402 devido às espécies do primeiro parceiro de ligação 402. A zona de aplicação da amostra 44 também preferencialmente inclui um parceiro de ligação de controle 415 etiquetado 405. Embora o primeiro parceiro de ligação 402 para o analito 40, o conjugado incluindo uma etiqueta visível 417 e um parceiro de ligação específico de espécie 407, e o conjugado de controle 405 conjugado a uma etiqueta visível 415 sejam mostrados na zona de aplicação da amostra 44 nessa Figura, qualquer combinação desses elementos pode ser localizada em outros locais na tira de teste (a montante, a jusante, ou sobrepondo à zona de aplicação da amostra) ou em um compressor de amostra 30, conforme descrito em modalidades anteriores.
[0221] A zona de teste 45 inclui um segundo parceiro de ligação imobilizado 427 no analito 40. A zona de controle 46 inclui um parceiro de ligação imobilizado 420 para o parceiro de ligação de controle 405. A zona de teste 45 e a zona de controle 46 são preferencialmente localizadas em uma membrana de nitrocelulose.
[0222] Quando uma amostra que inclui analito 40 é adicionada à tira de teste, o primeiro parceiro de ligação 402 se liga ao analito 40 e forma um “meio sanduíche”. Isso preferencialmente ocorre sem fluxo na tira de teste. Quando o tampão contínuo é aplicado, o mesmo mobiliza o “meio sanduíche”. O tampão contínuo também mobiliza o parceiro de ligação específica de espécie 407. Durante o fluxo, o parceiro de ligação específica de espécie 407 interage com e se liga ao primeiro parceiro de ligação 402 no meio sanduíche. Devido a múltiplos sítios de ligação no primeiro parceiro de ligação 402, há um efeito de agregação ou de empilhamento que intensifica a detecção do analito 40. Na zona de teste 45, o analito 40, que é agora parte de um complexo agregado ou empilhado, se liga ao segundo parceiro de ligação imobilizado 427 para formar o sanduíche completo. O resultado é um sinal visível intensificado formado na zona de teste 45. A ligação entre o parceiro de ligação de controle 405 e o parceiro de ligação de controle imobilizado 420 resulta em um sinal detectável 415.
[0223] Na presença do analito 40, o sinal detectável 417 conjugado ao parceiro de ligação específica de espécie 407 é parte do complexo e deveria ser visível. Se uma linha de teste visível é “lida” pelo usuário, o teste é registrado como um resultado positivo para a presença do analito 40. Se a linha de teste não é visível ou equívoca, então um ou mais gotas de um fluido incluindo um parceiro de ligação identificador 409 para o identificador 401 conjugado a uma etiqueta detectável (por exemplo, ouro coloidal ou esferas de látex) são adicionadas na zona de teste 45. O identificador parceiro de ligação 409 instantaneamente se liga ao identificador 401 no primeiro parceiro de ligação 402. Isso acentua em muito a visibilidade da linha de teste na presença do analito 40. Na ausência do analito, o identificador parceiro de ligação 409 dissipa e nenhuma linha de teste é visível.
[0224] A Figura 21B mostra um complexo empilhado na linha de teste quando o analito 40 está presente na amostra. A Figura 21C mostra o complexo empilhado com a adição dos identificadores 401 e 409.
[0225] Em um exemplo da modalidade mostrada nas Figuras 21A a 21C para detectar Vírus De Herpes Simples (HSV), a zona de aplicação da amostra 44 inclui gD 1&2 de HSV de camundongo livre 402 (que se liga ao HSV), assim como alguns gD 1&2 de HSV de camundongo 401 biotinilado 402. Em uma modalidade preferencial, aproximadamente 1 a 10% do gD1&2 de HSV livre 402 é biotinilado 401.
[0226] A zona de aplicação da amostra 44 também inclui anticorpo anticamundongo de coelho 407 conjugado a esferas de látex vermelhas 417 e um anticorpo IgY de galinha de controle 405 conjugado a esferas de látex azuis 415. Note- se que o anticorpo anticamundongo de coelho 407 não é específico a um analito 40. Ao invés disso, o mesmo se liga especificamente ao anticorpo gD1&2 de HSV de camundongo 402. Conforme discutido acima, qualquer um de gD1&2 de HSV 402, de gD1&2 401/402 de HSV biotinilado, o anticorpo anticamundongo de coelho conjugado a esferas de látex vermelhas, o anticorpo IgY de galinha conjugado a esferas de látex azuis, ou qualquer combinação desses elementos, alternativamente pode ser a montante, a jusante, ou sobrepondo à zona de aplicação da amostra 44, ou incluído em um compressor de amostra 30 em modalidades em que um compressor de amostra 30 é usado. A zona de teste 45 inclui anti-HSV de coelho imobilizado 427, que se liga ao analito de HSV 40 quando presente na amostra. A zona de controle 46 inclui IgG antigalinha/coelho de coelho imobilizado 420. A zona de teste 45 e a zona de controle 46 são preferencialmente localizadas em uma membrana de nitrocelulose.
[0227] Quando uma amostra incluindo analito 40 é adicionada à tira de teste, o gD1&2 de HSV 402 se liga ao analito de HSV 40 e forma um “meio sanduíche”. Isso ocorre sem fluxo na tira de teste. Quando o tampão contínuo é aplicado, o mesmo mobiliza o “meio sanduíche”. O tampão contínuo também mobiliza o anticorpo anticamundongo de coelho 407. Durante o fluxo, o anticorpo anticamundongo de coelho 407 interage com e se liga ao anticorpo gD1&2 de HSV 402 no meio sanduíche. Devido a múltiplos sítios de ligação no anticorpo de camundongo 402, há um efeito de agregação ou de empilhamento que intensifica a detecção do analito 40. Na zona de teste 45, o analito de complexo agregado ou empilhado 40, que é agora parte de um complexo agregado ou empilhado, se liga ao anti-HSV de coelho imobilizado 427 para formar o sanduíche completo. O resultado é um sinal visível intensificado que se forma na zona de teste 45. A ligação ocorre entre o conjugado de controle IgY de galinha 405 e o IgG antigalinha/coelho de coelho imobilizado 420, que resulta em uma etiqueta detectável azul 415.
[0228] Na presença do analito 40, as esferas de látex vermelhas 417 conjugadas ao anticorpo anticamundongo de coelho 407 são parte do complexo e deveriam ser visíveis. Se uma linha de teste visível é “lida” pelo usuário, o teste é registrado como um resultado positivo para a presença do analito 40. Se a linha de teste não é visível ou equívoca, então a gota de avidina, Neutravidina, ou estreptavidina conjugada 409 a ouro coloidal ou esferas de látex é adicionada na zona de teste 45. A avidina, neutravidina, ou estreptavidina conjugada 409 instantaneamente se liga à biotina 401 no anticorpo gD1&2 de HSV 402. Isso acentua em muito a visibilidade da linha de teste na presença do analito 40. Na ausência do analito, a avidina, estreptavidina, ou neutravidina conjugada 409 dissipa e nenhuma linha de teste é visível.
[0229] Em algumas modalidades, ao invés de uma membrana de nitrocelulose, um indivíduo pode usar membranas como náilon ou poliéster que são neutros. Nessas modalidades, as proteínas como neutravidina, anticorpos e antígenos não são diretamente imobilizados. Os mesmos são, ao invés disso, conjugados a microesferas que são “depositadas” na membrana e são mantidas nas fendas. Embora o uso de uma membrana neutra seja mostrado com respeito a essa modalidade em particular, membranas neutras e microesferas depositadas nessas membranas podem ser alternativamente usadas em outras modalidades da presente invenção.
[0230] A Figura 13 mostra alguns locais preferenciais de materiais de intensificação de sinal tanto para intensificação de prata quanto empilhamento em modalidades de dispositivos de fluxo lateral da presente invenção. A Figura 13 mostra esquematicamente duas opções para o local da zona de detecção, e apenas os elementos específicos para o sinal intensificação são mostrados na Figura.
[0231] Em modalidades com intensificação de prata, o sal de prata 70 é preferencialmente localizado em uma zona 90 entre a zona de aplicação da amostra 44 e a zona de teste 45 para permitir que pelo menos parte do sanduíche se forme antes da ligação de sal de prata. Alternativamente, o sal de prata 70 pode ser colocado na almofada 33 do compressor de amostra 30, na zona de aplicação da amostra 44, em uma zona 92 a montante da zona de aplicação da amostra 44, no tampão contínuo 43, ou diretamente na zona de teste 45 após o ensaio ter sido executado. Em algumas modalidades, o desenvolvedor de prata 71 é também localizado na zona 90 entre a zona de aplicação da amostra e a zona de teste. Em outras modalidades, o desenvolvedor de prata 71 é localizado na zona 92 a montante da zona de aplicação da amostra 44, no tampão contínuo 43, na almofada 33 do compressor de amostra 30, ou diretamente na zona de teste 45 após o ensaio ter sido executado.
[0232] Em modalidades com empilhamento, o primeiro conjugado 72 pode ser localizado na almofada 33 do compressor de amostra 30, na zona de aplicação da amostra 44, em uma zona 92 a montante da zona de aplicação da amostra 44, ou em uma zona 90 a jusante da zona de aplicação da amostra. Alternativamente, o primeiro conjugado 72 pode ser pré- misturado com a amostra antes da aplicação na zona de aplicação da amostra; nessa modalidade, o meio sanduíche é formado no lado de fora do dispositivo de ensaio. O segundo conjugado 74 é preferencialmente localizado em uma zona 92 a montante da zona de aplicação da amostra. Alternativamente, o segundo conjugado 74 pode ser localizado na almofada 33 do compressor de amostra 30. Alternativamente, o segundo conjugado 74 pode ser em um local em que o mesmo pode ser atrasado em relação ao alcance do primeiro conjugado 72, incluindo, mas sem se limitar a, a montante da zona de aplicação da amostra, a montante do conjugado, ou adicionado em um momento após o ensaio ter começado, como no tampão contínuo ou diretamente na zona de teste. Embora não preferencial, qualquer um ou ambos o primeiro conjugado 72 ou o segundo conjugado 74 podem ser alternativamente localizados no tampão contínuo 43 (não mostrado).
[0233] Embora os métodos e dispositivos sejam descritos no presente documento como ensaios de sanduíche, métodos e dispositivos da presente invenção podem ser igualmente usados em ensaios competitivos. Nesses ensaios competitivos, o conjugado preferencialmente inclui um analito ou um análogo de analito, ao invés de um parceiro de ligação do analito, ligado a uma etiqueta, ou, alternativamente, o segundo parceiro de ligação é substituído por analito ou análogo de analito. Um resultado de teste positivo é então indicado pela carência da presença da etiqueta na zona de teste da tira de teste.
[0234] Consequentemente, será entendido que as modalidades da invenção descritas no presente documento são meramente ilustrativas da aplicação dos princípios da invenção. Referências, no presente documento, a detalhes das modalidades ilustradas não se destinam a limitar o escopo das reivindicações, sendo que as próprias citam os recursos estimados como essenciais à invenção.
Claims (14)
1. DISPOSITIVO DE FLUXO LATERAL PARA DETECTAR UM ANALITO EM UMA AMOSTRA, caracterizado por compreender:um compressor de amostra compreendendo uma almofada compressível;um membro de chumaço para a coleta da amostra;uma tira de teste cromatográfico de fluxo lateral que compreende uma zona de aplicação de amostra e uma zona de teste lateralmente a jusante da zona de aplicação de amostra;um conjugado que compreende um primeiro parceiro de ligação para o analito e uma etiqueta;um segundo parceiro de ligação para o analito;um primeiro parceiro de ligação de controle localizado na almofada compressível do compressor de amostra; ea tira de teste de cromatografia de fluxo lateral compreendendo ainda uma zona de controle que compreende um segundo parceiro de ligação de controle imobilizado na zona de controle, em que o primeiro parceiro de ligação de controle é um parceiro de ligação para o segundo parceiro de ligação de controle;em que o compressor de amostra, o membro de chumaço, e a tira de teste cromatográfico de fluxo lateral formam uma pilha vertical para aplicar a amostra à tira de teste cromatográfico de fluxo lateral por compressão; eem que o coletor de amostra está localizado entre o compressor de amostra e a tira de teste na pilha vertical.
2. DISPOSITIVO DE FLUXO LATERAL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo conjugado, o segundo parceiro de ligação, ou ambos ambos o conjugado e o segundo parceiro de ligação estarem localizados sobre a almofada compressível do compressor de amostrar antes do uso do dispositivo de fluxo lateral.
3. DISPOSITIVO DE FLUXO LATERAL, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo conjugado estar localizado sobre a almofada compressível, e o segundo parceiro de ligação está localizado em um meio externo.
4. DISPOSITIVO DE FLUXO LATERAL, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo segundo parceiro de ligação estar localizado sobre a almofada compressível, e o conjugado estar localizado em um meio externo.
5. DISPOSITIVO DE FLUXO LATERAL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dispositivo de fluxo lateral ser formado de modo que um resultado positivo apenas é alcançado por meio da captura do analito na zona de teste através da formação de um complexo entre o analito, o primeiro parceiro de ligação e o segundo parceiro de ligação.
6. DISPOSITIVO DE FLUXO LATERAL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela zona de teste não compreender nenhuma molécula que liga especificamente o analito.
7. DISPOSITIVO DE FLUXO LATERAL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo segundo parceiro de ligação compreender um identificador, e a zona de teste compreende um parceiro de ligação imobilizado do identificador.
8. DISPOSITIVO DE FLUXO LATERAL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender, ainda, um alojamento que circunda pelo menos uma porção da tira de teste cromatográfico de fluxo lateral, em que uma porção giratória do alojamento forma o compressor de amostra.
9. DISPOSITIVO DE FLUXO LATERAL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender, ainda, um alojamento que circunda pelo menos uma porção da tira de teste cromatográfico de fluxo lateral, em que um cartucho inserível forma o compressor de amostra.
10. MÉTODO DE APLICAÇÃO DE UMA AMOSTRA A UMA TIRA DE TESTE CROMATOGRÁFICO DE FLUXO LATERAL DE UM DISPOSITIVO DE FLUXO LATERAL, sendo que o método é caracterizado por compreender as etapas de:a) colocar um membro de chumaço incluindo uma amostra coletada em uma pilha vertical entre um compressor de amostra compreendendo uma almofada compressível e uma zona de aplicação de amostra da tira de teste cromatográfico de fluxo lateral; eb) aplicar uma pressão ao membro de chumaço com o uso do compressor de amostra para transferir pelo menos uma porção da amostra para a zona de aplicação de amostra;em que um primeiro parceiro de ligação de controle está localizado na almofada compressível do compressor de amostra; eem que uma zona de controle na tira de teste cromatográfico de fluxo lateral compreende um segundo parceiro de ligação de controle imobilizado na zona de controle, em que o primeiro parceiro de ligação de controle é um parceiro de ligação para o segundo parceiro de ligação de controle.
11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela almofada compressível do compressor de amostra compreender ainda um componente selecionado a partir do grupo que consiste em um primeiro parceiro de ligação para um analito, um segundo parceiro de ligação para o analito e em ambos o primeiro parceiro de ligação para o analito e no segundo parceiro de ligação para o analito.
12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo membro de chumaço entregar a amostra passivamente por contato ou através de pressão sobre a tira de teste cromatográfico de fluxo lateral antes da aplicação do compressor de amostra à pilha vertical.
13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela etapa a) compreender, ainda, colocar uma almofada com um parceiro de ligação para um analito sobre a pilha vertical, e em que na etapa b) pelo menos uma porção do parceiro de ligação é transferida para a zona de aplicação de amostra.
14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela etapa b) ocorrer sem fluxo capilar.
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