CN111751528A - 核固红染色在抗双链dna检测方法中新用途 - Google Patents

核固红染色在抗双链dna检测方法中新用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种核固红染色在抗双链DNA检测方法中新用途，属于免疫分析技术领域，本发明的技术方案是以绿蝇短膜虫为抗原基质，应用甘油核固红染色液进行封片染色，间接免疫荧光检测抗dsDNA抗体，绿蝇短膜虫体内的细胞核细胞核呈现橘红色或者黄色；与鞭毛相连接的部位即为鞭毛基体，被染成浅橘红色或者浅黄色；体积略小于细胞核大于鞭毛基体，位置介于两种细胞器中间的即为动基体，动基体出现绿色荧光即为抗dsDNA抗体阳性，本发明的技术特点是能够在荧光显微镜下清晰辨别细胞核，动基体，鞭毛基体三种细胞器。

Description

核固红染色在抗双链DNA检测方法中新用途
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域；或是利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法，特别是应用核固红染色和免疫荧光检测抗双链DNA测定方法。
背景技术
实验室检测抗双链DNA(dsDNA)抗体的常规方法有ELISA、绿蝇短膜虫间接免疫荧光检测(CLIFF)和免疫印迹法(IBT)，但美国风湿病学会(ACR)1997年修定的SLE分类诊断标准中并未对抗dsDNA抗体的检测方法进行限定。临床实验室常采用间接免疫荧光检测dsDNA，本方法以绿蝇短膜虫为抗原基质，检测血清中抗双链DNA抗体，绿蝇短膜虫(crithidia luciliae)属原生动物门动鞭毛虫纲动质目短膜虫属，主要寄生在节肢动物体内，对人畜无害，它的身体大多呈椭圆形，中间有一个大的核，尾部有一根长长的鞭毛帮助身体运动，在鞭毛基部和核之间有一个略小于核的线粒体(也称动基体)，该动基体内含有大量的纯的dsDNA，通常不含有其它抗原，抗dsDNA抗体阳性表现为动基体均质的或边缘亮度增强的荧光，仅细胞核或鞭毛基体出现的荧光判断为抗dsDNA抗体阴性。
核固红，又称钙红，细胞核坚牢红，核快红，分子式：C14H8NNaO7S，分子量：357.28，性状：遇氢氧化钠成浅紫色，在硫酸中为棕色溶液，溶于乙醇和水，最大吸收波长518nm，有刺激性，文献上也有指本品为中性红(Neutral red)的，颜色指数(Colour Index Number)60760，水中溶解度:1g/L(25℃)，密封阴凉干燥避光保存，临床上主要用于病理学染色，在本发明用于区分绿蝇短膜虫体内的细胞核，动基体，鞭毛基体，而不干扰荧光测定。
目前检测方法中存在的问题是：荧光显微镜下绿蝇短膜虫体内的细胞核，动基体，鞭毛基体很难分辨，结构模糊，荧光特征可以出现三种细胞器可以同时阴性，同时阳性，或者其中的一个或两个阳性等情况，细胞核和动基体大小基本相似，很难分辨动基体的荧光模型。
发明内容
本发明目的是提供一种准确区分细胞核，动基体，鞭毛基体三种细胞器的核固红染色抗dsDNA抗体荧光测定方法，该方法使绿蝇短膜虫体内的细胞核呈现橘红色或者黄色；与鞭毛相连接的部位即为鞭毛基体，染色为浅橘红色或者浅黄色；体积略小于细胞核大于鞭毛基体，介于两种细胞器中间的即为动基体，动基体出现绿色荧光即为抗dsDNA抗体阳性。
采用的技术方案是：本方法以绿蝇短膜虫为抗原基质，检测血清中抗双链DNA抗体，应用甘油核固红染色液进行封片染色，间接免疫荧光检测抗dsDNA抗体，绿蝇短膜虫体内的细胞核细胞核呈现橘红色或者浅黄色；与鞭毛相连接的部位即为鞭毛基体，染色为浅橘红色或者浅黄色；体积略小于细胞核大于鞭毛基体，介于两种细胞器中间的即为动基体，动基体出现绿色荧光即为抗dsDNA抗体阳性。
附图说明
图1本发明绿蝇短膜虫体内细胞核、动基体、鞭毛基体结构示意图。
图中：1.虫体 2.细胞核
3.动基体 4.鞭毛基体
5.鞭毛
具体实施方式
实施例1
1.试剂抗双链DNA抗体IgG检测试剂盒(内含PBS吐温缓冲液，生物薄片，异硫氰酸荧光黄[FITC]标记的荧光二抗，封片剂)由欧蒙医学诊断(中国)有限公司提供。
2.含有核固红的封片剂，在试剂盒封片剂(甘油)中加入核固红0.2g/L溶解24小时后备用。
3.仪器：EURO Star 3Plus荧光显微镜试剂
实施例2
检测步骤：
实验准备：PBS吐温缓冲液：将1包磷酸盐溶于1升蒸馏水，加入2mL吐温20并混匀；
样本准备：待检血清样本用PBS吐温缓冲液1:10稀释。例如：将11.1μl血清样本加入到100μl PBS吐温缓冲液中并充分混匀；
加样：将加样板放在泡沫板上，将11μL稀释后的血清样本加至加样板的每一反应区上，应避免产生气泡。加完所有待测样本后再开始温育(每次最多加200份样本)；
温育：将生物载片有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里，反应立即开始。应确保每一样本均与生物薄片接触且样本间互不接触。室温温育30分钟；
冲洗：用盛于烧杯内的PBS吐温缓冲液冲洗载片1秒钟，然后立即将生物载片浸入装有PBS吐温缓冲液的洗杯中，浸泡至少5分钟。有条件可使用旋转摇床进行振荡；
加样：将20μLFITC标记的荧光二抗加至洁净加样板的反应区上，待加完所有的荧光二抗后开始温育。建议使用连续加样器。FITC标记的抗人IgG使用前需混匀。为节约时间，可在第一次温育的同时滴加荧光二抗至另一个加样板的反应区；
温育：从洗杯中取出一张生物载片，在5秒钟内用吸水纸擦去背面和边缘的水分后，立即盖在加样板的凹槽里。注意：为避免破坏基质，不要擦拭反应区的间隙部分。应确保生物薄片与液滴接触良好，然后继续下一张。室温温育30分钟，从此时开始，应避免阳光直射载片；
冲洗：用盛于烧杯内的PBS吐温缓冲液冲洗载片1秒钟，然后立即将生物载片浸入装有PBS吐温缓冲液的洗杯中，浸泡至少5分钟；
封片：将盖玻片直接放在泡沫板的凹槽里，滴加含有核固红的封片剂至盖玻片：每一反应区约10μL，从洗杯中取出一张生物载片，用吸水纸擦干背面和边缘的水分，注意不要擦拭反应区间隙，将生物载片有生物薄片的一面朝下放在已准备好的盖玻片上，立即检查盖玻片是否已嵌入到载片的凹槽里。
在荧光显微镜下观察检测结果。观察组织器官时用20×物镜，观察细胞基质用40×物镜。激发滤片：488nm，分光滤镜：510nm，阻挡滤镜：520nm。
荧光模式：间接免疫荧光法检测dsDNA的抗原基质是绿蝇短膜虫，绿蝇短膜虫内呈现橘红色或者黄色即为细胞核，与鞭毛相连接的即为鞭毛基体，染色为浅橘红色或者浅黄色，绿蝇短膜虫拥有一个只含双链DNA(nDNA，dsDNA)而不含其它细胞核抗原的动基体，与动基体反应的抗体必然是抗双链DNA抗体如出现绿色荧光即为抗双链DNA抗体阳性。
如果样本阳性，则可观察到鞭毛虫动基体均质和部分环形荧光，同时，阳性对照血清必须显示相同的荧光模式；如果样本阴性，则动基体不显示荧光。仅细胞核、鞭毛基体或细胞浆的荧光应判断为阴性。由于细胞核和鞭毛基体核固红染色呈浅橘红色，当细胞核和鞭毛基体核固红也出现荧光时，由于色谱叠加，会出现黄色或者浅黄色。
通过本发明，可以明显区别绿蝇短膜虫体内细胞核，动基体，鞭毛基体结构，能够准确分辨动基体，根据动基体荧光形态很容易判断抗双链DNA抗体的结果。

Claims (2)

1.一种核固红染色在抗双链DNA检测方法中新用途，属于免疫分析技术领域，本发明技术方案是以绿蝇短膜虫为抗原基质，检测血清中抗双链DNA抗体，应用甘油核固红染色液进行封片染色，间接免疫荧光检测抗dsDNA抗体，绿蝇短膜虫体内的细胞核细胞核呈现橘红色或者黄色；与鞭毛相连接的部位即为鞭毛基体，被染色呈浅橘红色或者浅黄色；体积略小于细胞核大于鞭毛基体，介于两种细胞器中间的即为动基体，动基体出现绿色荧光即为抗dsDNA抗体阳性。
2.根据权利要求1所述的一种核固红染色在抗双链DNA检测方法中新用途，其特征在于封片剂为甘油核固红染色液，0.05～1.0g核固红溶解到1L甘油中24小时后备用，核固红染色作用是使绿蝇短膜虫体内的细胞核呈现橘红色或者黄色，鞭毛基体被染色呈浅橘红色或者浅黄色，动基体体积略小于细胞核大于鞭毛基体，核固红染色不着色，阳性为绿色荧光，阴性无绿色荧光，甘油核固红染色液利于区分三种细胞器，利于荧光结果判读。
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