CN101957378A - Cd4细胞芯片及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种CD4细胞芯片，包括固相载体和固定于该载体上的抗体，所述抗体为CD4单克隆抗体，所述固相载体为玻片。本发明还公开了CD4细胞芯片的制备方法、含CD4细胞芯片的CD4细胞检测试剂盒、以及应用CD4细胞芯片进行检测的方法。本发明还公开了CD4细胞芯片和CD4细胞检测试剂盒的应用。本发明CD4细胞芯片，成本低廉、操作简便，特别适用于艾滋病毒感染严重的贫困地区。

Description

CD4细胞芯片及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及细胞芯片，尤其涉及一种CD4细胞芯片及其制备方法和应用。

背景技术

CD4细胞是指带有CD4抗原的T淋巴细胞，又被称为辅助T细胞，在维持机体的细胞免疫和体液免疫中具有枢纽作用。CD4细胞是免疫系统中的主要战斗细胞，也是人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的主要靶细胞。人体感染HIV后的主要病理过程是免疫系统的损害，主要表现为：CD4细胞的丢失和绝对数量的减少。目前，CD4细胞计数已经广泛应用于指导临床抗HIV治疗，并已成为世界卫生组织对艾滋病发病定义的金标准。世界卫生组织定义当人体外周血中CD4细胞数量≤200个/微升则判定为艾滋病患者。准确可靠的CD4细胞计数已成为评价HIV感染者免疫状况、预测病程进展、评价抗病毒药物治疗效果和估测预后的重要指标。此外，有研究表明，CD4细胞在恶性肿瘤、乙型肝炎、慢性阻塞性肺疾病、肺结核、脑梗死等其他疾病的病程监测、疗效评估、预后评价等方面也发挥重要作用。CD4细胞的数量已是衡量个体免疫状态及功能的重要指标。当人体外周血中CD4细胞数量≤350个/微升，为免疫力低下，需详细诊断是否为艾滋病患者；当人体外周血中CD4细胞数量在350～450个/微升，为免疫力弱化，是亚健康状态；当人体外周血中CD4细胞数量在450～1440个/微升，为正常范围。

目前CD4细胞计数的标准检测方法是传统流式细胞法。该方法的基本原理是将样品中CD4细胞与荧光标记抗体反应后，进入流式细胞仪，然后使样品中所有细胞依次排列成单行，测定每个细胞的荧光量从而得到CD4细胞在淋巴细胞中的百分率。流式细胞法在得到CD4细胞在淋巴细胞中的百分率以及淋巴细胞绝对值后，两者相乘即获得CD4细胞数。现在国内外临床使用的流式细胞仪被美国BD公司和贝克曼库尔特公司所垄断，其售价根据型号及等级不同大致在60至100万元人民币，而每次测试所需费用在150至400元人民币。因此虽然流式细胞法具有结果精确，操作过程自动化，样本处理量大等诸多优点，但价格昂贵，加上其检测所用的进口试剂，使每次测试成本很高，而且流式细胞仪培训要求高、维护也十分繁琐。

现国内在一些大、中城市的省级医疗卫生单位，流式细胞仪的使用已获得普及，而在地区级医疗卫生单位，尤其是艾滋病流行严重的贫困边远地区，还鲜见流式细胞仪的使用。国外流式细胞仪的使用现状也与国内相似，在发达国家的大、中型医疗卫生机构流式细胞仪的使用已获得普及，而在艾滋病流行最严重的一些发展中国家，尤其是一些非洲国家，几乎还很少有流式细胞仪。流式细胞仪的昂贵限制了其临床上的普及。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种成本低廉、操作简便的CD4细胞芯片。此外，还需要提供一种CD4细胞芯片的制备方法和应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种CD4细胞芯片，包括固相载体和固定于该载体上的抗体，所述抗体为CD4单克隆抗体，所述固相载体为玻片。

优选的，在所述玻片表面设有反应区，所述CD4单克隆抗体固定在该反应区；更优选的，所述反应区为单凹，或是在玻片表面圈出的具有一定形状的封闭区域。进一步优选的，单凹的孔径为9～12mm，孔深为0.2～0.3mm，采用表面设有单凹或封闭区域的玻片，使被测样品局限于反应区范围内进行抗原抗体特异性结合反应，有效降低了血液用量，使手指术梢血采样成为可能，同时在满足细胞检测要求的情况下，大大降低了抗体使用成本。

在本发明的另一方面，提供了一种CD4细胞芯片的制备方法，包括以下步骤：

用酸清洗玻片，使玻片表面带阴离子电荷；

将清洗过的玻片放入多聚赖氨酸溶液中浸泡适当时间，通过多聚赖氨酸携带的阳离子电荷与所述玻片表面阴离子电荷之间的吸引，使多聚赖氨酸吸附于玻片表面；

将CD4单克隆抗体滴加在玻片表面，室温孵育合适时间，再用磷酸盐缓冲液清洗后烘干，于2～26℃保存待用。

优选的，用酸清洗玻片的步骤包括：先用铬酸清洗玻片，再用5％～10％硝酸水溶液清洗玻片，然后用水将玻片冲洗干净。由于玻片的主要成分是二氧化硅，用铬酸、硝酸水溶液先后处理后玻片表面呈阴离子，有利于吸附携带的阳离子的多聚赖氨酸。

优选的，所述玻片表面设有反应区，将CD4单克隆抗体滴加在玻片表面的反应区内，经过酸清洗后玻片表面带阴离子电荷，与多聚赖氨酸所带正电荷异性相吸，多聚赖氨酸与抗体蛋白以肽键结合。玻片表面设有反应区，不仅降低抗体使用成本，而且有效降低被测血液用量。

在本发明的另一方面，提供了一种CD4细胞检测试剂盒，至少包括上述CD4细胞芯片。

优选的，该CD4细胞检测试剂盒还包括稀释液、过氧化氢溶液、染色液和复染液。

所述稀释液为磷酸盐缓冲液，pH值为7.0～7.4；所述过氧化氢溶液的体积百分比浓度为2.5～3.5％；所述染色液由碱性品红、亚硝基铁氰化钠、联苯胺按1～5％、3～5％、1～5％的质量体积百分比浓度溶解于95％乙醇配制而成；所述复染液由碱性品红按2～5％的质量体积百分比浓度溶解于95％乙醇配制而成。

在本发明的另一方面，还提供了一种应用CD4细胞芯片进行检查的方法，包括以下步骤：

将待测血样滴加在CD4细胞芯片表面的抗体处，使其进行抗原抗体特异性结合反应；

用稀释液洗去非特异性结合细胞和多余血样；

将玻片放入染色液中染色，并把染色后的玻片在过氧化氢溶液中浸置后，再转入复染液中染色，以区分CD4细胞和单核细胞；

在光学显微镜下对CD4细胞计数，或采用自动计数仪完成CD4细胞计数。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述CD4细胞芯片在制备诊断、监测或辅助治疗包括艾滋病、肿瘤性疾病、自体免疫性疾病、器官移植、乙型肝炎、脑梗死、慢性阻塞性肺疾病的免疫力低下疾病产品中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述CD4细胞检测试剂盒用于诊断、监测或辅助治疗包括艾滋病、肿瘤性疾病、自体免疫性疾病、器官移植、乙型肝炎、脑梗死、慢性阻塞性肺疾病的免疫力低下疾病的用途。

CD4细胞检测可独立或与病毒载量协同作为艾滋病诊断、病程监测及辅助治疗的重要指标。监测和调控艾滋病感染者及患者的CD4细胞数量，使其维持在一定范围，让患者保持正常稳定的免疫功能，与病毒共存，维持正常的学习、工作和生活。

CD4细胞检测作为人体细胞免疫功能评估的重要指标之一，广泛应用于免疫力低下疾病、慢性疾病等临床疾病的病理分析、辅助诊断、指导治疗、预后判断等方面。主要应用于：病毒感染性疾病；肿瘤性疾病；自体免疫性疾病；器官移植患者；乙型肝炎；脑梗死；慢性阻塞性肺疾病；其他免疫缺损或异常的患者。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述CD4细胞检测试剂盒用于健康体检的用途。

CD4细胞检测提供了人体免疫力的量化指标。检测免疫力的主要指标是血清免疫球蛋白(Ig)定量分析和T淋巴细胞亚群分析。主要应用于：亚健康检测；健康人群免疫功能评估；功能性免疫制剂(中药、保健品、免疫球蛋白等)功效的评价；疾病预防、筛查的辅助诊断。

由于采用上述技术方案，本发明CD4细胞芯片具有如下优点：

(1)成本低廉，检测费用远远低于流式细胞法，特别适用于无流式细胞仪检测条件而又急需开展CD4细胞检测项目的艾滋病流行严重地区。

(2)操作简便，无需特殊专业培训，检测人员通过简单培训即可掌握全套流程，实现医务专业人员缺乏地区的可操作性。

(3)产品室温贮存，无需冷藏，器具简便易携，操作环境无特殊要求，为资源匮乏地区进行正常检测提供有力保障。

(4)用血量少，静脉血或手指末梢血均可，手指血的使用极大降低了采血难度，减少了受检者的受压程度，为幼儿、常住院病人等采血困难者提供了便利。

(5)玻片样本可长期保存，随时随地复查，因为通过检测已将CD4细胞永久固定于玻片，可随时随地进行计数或复查；可为受检者建立免疫力数据库，制作个性化健康管理档案，实现病程监测。

(6)检测样本处理时间短，无需溶血。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明制备CD4细胞芯片所依据的多聚离子电荷结合法原理示意图；

图2是本发明实施例3应用CD4细胞芯片进行检测的步骤示意图；

图3是本发明CD4细胞检测盒与流式细胞法检测结果的相关性示意图。

具体实施方式

本发明突破常规细胞检测法的传统原理，将细胞投入到固相包被抗体上加以固定并进行分析。当血样中表达有CD4抗原的细胞与预先包被有CD4单克隆抗体的玻片接触后反应，CD4细胞便会被固定在玻片上。经淋洗、染色后，即可用显微镜或自动计数仪对CD4细胞进行计数。

常用的抗体固相包被技术中，利用范德华力的物理吸附法不适用于玻璃载体；而利用共价键结合的多聚赖氨酸反应法及氨基硅烷偶联法虽能包被抗体，但非特异性细胞固定过多，不适用于特异性细胞检测。本发明开发出以多聚离子电荷结合法(见图1)为原理的抗体包被新技术，即玻片载体通过处理后表面带阴离子电荷，带阳离子电荷的多聚赖氨酸通过阴阳离子相互作用吸附于玻片载体上，多聚赖氨酸与抗体蛋白以肽键结合，从而有效地将抗体包被于玻片上，基于多聚离子电荷结合法原理制成的本发明CD4细胞芯片，包括固相载体玻片和固定于该玻片上的CD4单克隆抗体，既能使抗体均匀包被，又适用于特异性细胞检测。

优选的，本发明在玻片表面设有反应区，CD4单克隆抗体固定在该反应区；更优选的，反应区为单凹，或是在玻片表面圈出的具有一定形状的封闭区域。在本发明实施例中，采用一种特殊加工的表面带有微小单凹的载玻片作为固相载体，CD4单克隆抗体固定于该单凹中。单凹的孔径为9～12mm，孔深为0.2～0.3mm，单凹的孔形圆整、无塌眼、无擦痕、无砂眼、无气泡、无睫毛状孔边，孔内外不得有霉斑、麻斑。玻片上的单凹结构使被测样品局限于一定范围内进行抗原抗体特异性结合反应，血液用量仅0.25微升左右，为流式细胞法所用量的1/400，既大大降低了抗体使用成本，又满足了细胞检测的要求，同时使手指术梢血采样成为可能。

实施例1  CD4细胞芯片的制备

1.玻片清洗

在室温下，将玻片于铬酸清洗液中浸泡2～4小时，工艺用水冲洗干净。将玻片浸泡于5％～10％硝酸水溶液中，85℃烘箱加热1.5～3.5小时。工艺用水冲洗干净后，将玻片浸泡于工艺用水中室温保存。由于玻片的主要成分是二氧化硅，用铬酸、硝酸水溶液先后处理后玻片表面带阴离子电荷。

2.抗体包被前处理

取出浸泡于工艺用水中的玻片，敲击掉适量工艺用水，使玻片仍以湿润状态浸泡于0.1～0.5％(W/V)的多聚赖氨酸溶液中30～60分钟，用工艺用水淋洗干净后，以600～800r/min速度离心4分钟甩干，室温保存。多聚赖氨酸携带阳离子电荷，通过与玻片表面阴离子电荷的相互作用，使多聚赖氨酸吸附于玻片表面。

3.抗体包被

将浓度为5～10μg/ml的鼠抗人CD4单克隆抗体10-20μl滴加在单凹上，室温孵育30～40分钟。用PBS液淋洗后，80℃烘箱干燥5～10分钟，放入玻片盒中2～26℃密闭保存。

实施例2  CD4细胞检测试剂盒的制备

CD4细胞检测试剂盒包含CD4细胞芯片、稀释液、过氧化氢溶液、染色液和复染液。

CD4细胞芯片通过实施例1制备。

稀释液可以由稀释液片剂溶于水溶液而制成。稀释液片剂为市售商品，购自上海保康生物高科技有限公司，主要成分为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、柠檬酸、吐温20等，以一片溶解于40ml水溶液即可配制成pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液。其规格为10片/包，密封铝箔袋装，遮光密闭保存。试剂盒组装时仅在袋外加贴标签即可。稀释液也可以通过将上述各种盐按一定的浓度配制而成。

过氧化氢溶液体积百分比浓度为2.5～3.5％，遮光密闭阴凉处保存。实际生产时只需分装成30ml/瓶，并在瓶外加帖标签即可。

染色液的配制：将碱性品红、亚硝基铁氰化钠、联苯胺按1～5％、3～5％、1～5％(W/V)的浓度比例溶解于95％乙醇后，置于棕色聚酯乙烯塑料试剂瓶中，于2～26℃密封保存。

复染液的配制：将碱性品红按2～5％(W/V)的浓度比例溶解于95％乙醇后，置于棕色聚酯乙烯塑料试剂瓶中，于2～26℃密封保存。

实施例3  应用CD4细胞芯片进行检测(整体流程见图2)

1、特异结合反应：加水于湿盒内，使湿盒底部完全被水覆盖，搁置玻片处应保持干燥。取出玻片，将玻片置于湿盒支架上，盖紧盒盖。将稀释后血样滴加在CD4细胞芯片的已包被抗体处，进行抗原抗体反应。室温下(20～30℃)湿盒内反应40分钟。

2、淋洗、染色：反应后的玻片用稀释液提拉5～10次不等，主要是用稀释液洗去非特异性结合细胞和多余血样，然后放入染色液缸中(有CD4抗原表达的细胞将被染上色)，静置1分钟后，将稍加沥干的玻片架转入新鲜过氧化氢工作溶液中，静置4分钟。接着将玻片架转入75％酒精专用缸中浸泡2分钟后，根据玻片数量不同提拉5～10次不等，直至玻片呈无色透明或淡粉红色后将玻片架转入复染液缸中，静置1分钟。最后将玻片架转入水中，根据玻片数量不同提拉5～10次不等，直至玻片呈淡紫红色(如镜检发现细胞染色过淡，请重复复染)。

上述染色步骤中，染色液染色后的玻片转入过氧化氢溶液中浸置，是因为除了CD4淋巴细胞表面有CD4抗原的高表达外，单核细胞也存在CD4抗原的低表达，经染色液染色，CD4细胞与单核细胞都被染上色。但是单核细胞胞浆内含有过氧化物酶，而CD4细胞为淋巴细胞，淋巴细胞胞浆内不含有过氧化物酶，采用过氧化物酶染色法对固定在玻片上的CD4细胞与单核细胞进行区别，即将染色后的玻片转入过氧化氢溶液中，让氧化物酶与过氧化氢反应。由于单核细胞胞浆内含有过氧化物酶，经过过氧化物酶染色后，细胞内会出现黑灰色颗粒。与此相反，由于所需检测的CD4细胞胞浆内不含过氧化物酶，在过氧化氢溶液中浸置后，细胞内不出现黑灰色颗粒，通过光学显微镜即可对CD4细胞与单核细胞进行区分，该方法简单，而且无需增加CD4抗体来剔除单核细胞，成本非常低廉。

3、计数：玻片自然晾干后可直接用普通光学显微镜的10倍物镜计算CD4细胞数量；或用上海汇中细胞生物科技有限公司研发的自动计数仪进行自动计数。

4、准确性分析：

本发明CD4细胞检测盒经上海传染病医院、北京协和医院、北京佑安医院、上海中山医院、美国疾病预防控制中心(CDC)和日本大分大学艾滋病诊疗中心共1301例临床考核所得数据与流式细胞法进行Pearson相关性分析和Bland-Altman散点图分析(见图3)。Pearson相关性分析和Bland-Altman散点图分析是研证两方法能否互相替代的经典分析工具，其中Pearson相关性分析可得两方法之间具有良好的相关性；Bland-Altman散点图分析是临床检验研究中用来比较两检验方法之间差异的最佳分析方法。结果表明：CD4细胞检测盒与流式细胞法检测结果的相关性达0.95，平均绝对误差仅3个/μl。

5、特异性定量分析：

本发明CD4细胞检测盒通过用流式细胞法检测分别包被CD4、CD8抗体的细胞芯片反应前后CD4、CD8的百分含量的变化进行芯片特异性定量分析，数据表明：当细胞芯片包被有CD4抗体时，仅特异的与CD4细胞结合，反应后芯片上血样几乎无CD4细胞残留，而CD8细胞则完全没有被结合，反之亦然(见下表1)。

表1  CD4细胞检测盒特异性定量分析

同一血样反应前后CD4、CD8细胞百分率(n＝6)

6、批次间重复性检测：

本发明CD4细胞检测盒中细胞芯片进行不同生产批次间重复性检测结果比较数据表明，CV控制在5％之内，重复性良好(见下表2)。其中CV为数据波动百分数，用来评价重复性，一般重复性考核CV控制在20％以内为合格。

表2  CD4细胞检测盒批次间重复性检测

7、操作者间重复性检测：

本发明CD4细胞检测盒中细胞芯片进行操作者间重复性检测结果比较数据表明，CV控制在5％之内，重复性良好(见下表3)。

表3  CD4细胞检测盒操作者间重复性检测

8、灵敏度测定：

本发明CD4细胞检测盒对血样不同稀释浓度的CD4细胞进行灵敏度测定，数据表明：无论血样中CD4细胞过多或过少均能准确检测(见下表4)，表4中的“r”指与流式检测的相关性。

表4  CD4细胞检测盒灵敏度测定

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种CD4细胞芯片，包括固相载体和固定于该载体上的抗体，其特征在于，所述抗体为CD4单克隆抗体，所述固相载体为玻片。

2.根据权利要求1所述的CD4细胞芯片，其特征在于，在所述玻片表面设有反应区，所述CD4单克隆抗体固定在该反应区。

3.一种CD4细胞芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

用酸清洗玻片，使玻片表面带阴离子电荷；

将清洗过的玻片放入多聚赖氨酸溶液中浸泡适当时间，通过多聚赖氨酸携带的阳离子电荷与所述玻片表面阴离子电荷之间的吸引，使多聚赖氨酸吸附于玻片表面；

将CD4单克隆抗体滴加在玻片表面，室温孵育合适时间，再用磷酸盐缓冲液清洗后烘干，于2～26℃保存待用。

4.一种CD4细胞检测试剂盒，其特征在于，至少包括权利要求1所述的CD4细胞芯片。

5.根据权利要求4所述的CD4细胞检测试剂盒，其特征在于，还包括稀释液、过氧化氢溶液、染色液和复染液。

6.根据权利要求5所述的CD4细胞检测试剂盒，其特征在于，所述染色液由碱性品红、亚硝基铁氰化钠、联苯胺按1～5％、3～5％、1～5％的质量体积百分比浓度溶解于95％乙醇配制而成。

7.一种应用CD4细胞芯片进行检查的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将待测血样滴加在CD4细胞芯片表面的抗体处，使其进行抗原抗体特异性结合反应；

用稀释液洗去非特异性结合细胞和多余血样；

将玻片放入染色液中染色，并把染色后的玻片在过氧化氢溶液中浸置后，再转入复染液中染色，以区分CD4细胞和单核细胞；

在光学显微镜下对CD4细胞计数，或采用自动计数仪完成CD4细胞计数。

8.权利要求1所述的CD4细胞芯片在制备诊断、监测或辅助治疗包括艾滋病、肿瘤性疾病、自体免疫性疾病、器官移植、乙型肝炎、脑梗死、慢性阻塞性肺疾病的免疫力低下疾病产品中的应用。

9.权利要求4所述的CD4细胞检测试剂盒用于诊断、监测或辅助治疗包括艾滋病、肿瘤性疾病、自体免疫性疾病、器官移植、乙型肝炎、脑梗死、慢性阻塞性肺疾病的免疫力低下疾病的用途。

10.权利要求4所述的CD4细胞检测试剂盒用于健康体检的用途。

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