CN111458503A - 一种用于血细胞分离计数的抗体芯片及其制备方法 - Google Patents

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吕正和
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杨乐天琪
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Abstract

本发明提出了一种用于血细胞分离计数的抗体芯片的制备方法，包括以下步骤：S1.载玻片的羟基化；S2.载玻片的氨基化；S3.载玻片的醛基化；S4.区域包被链霉亲和素；S5.孵育抗体；S6.包被区域的封闭；S7.载玻片的干燥；S8.真空包装。本检测通过过氧化物酶染色法对固定在玻片上的CD3、CD4、CD8细胞与单核细胞进行区别，进行自动计数或者人工计数。

Description

一种用于血细胞分离计数的抗体芯片及其制备方法
技术领域
本发明涉及细胞芯片技术领域，具体涉及一种用于血细胞分离计数的抗体芯片及其制备方法。
背景技术
血细胞的数量在临床疾病诊断具有重要意义；由于各种原因造成的血细胞生成与破坏的失常，都会引起血细胞在数量上或质量上的改变，从而导致疾病的发生。现存血细胞计数方法主要为血球计数板计数法和流式细胞仪计数法。血球计数板计数法须人眼计数，操作繁琐，耗时长，且可能由于血细胞分布不均造成读数误差；流式细胞仪计数法速度快，结果准确，但仪器昂贵。因此，急需开发出一种便捷的、准确度高的血细胞计数方法。
抗体芯片是蛋白芯片的一种，具有微型化、集成化、高通量化的特点，可以用于检测某一特定的生理或病理过程相关蛋白的表达丰度，目前主要用于信号转异、蛋白质组学、肿瘤及其他疾病的相关研究。蛋白芯片技术的基本原理是将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，然后，用标记了特定荧光抗菌素体的蛋白质或其他成分与芯片作用，经漂将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，由此达到测定各种蛋白质功能或数目的目的。
发明内容
本发明提供一种成本低廉、操作简便的用于血细胞分离计数的抗体芯片，可用于血细胞、CD3和/或CD4和/或CD8的阳性T淋巴细胞的分离计数。
本发明提供一种用于血细胞分离计数的抗体芯片的制备方法，包括以下步骤：
S1.将载玻片浸泡于氢氧化钠溶液中，使之羟基化；
S2.将步骤S1得到的载玻片浸泡在3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇水溶液中，使之氨基化；
S3.将步骤S2得到的载玻片浸泡戊二醛水溶液中，使之醛基化；
S4.将步骤S3得到的载玻片区域包被链霉亲和素；
S5.在步骤S4得到的载玻片不同区域画框，分别孵育不同的抗体；
S6.对步骤S5得到的载玻片的包被区域进行封闭；
S7.对步骤S6得到的载玻片进行干燥；
S8.将步骤S7得到的载玻片真空包装。
作为本发明进一步的改进，步骤S1的具体方法为：配制1-10wt％的氢氧化钠溶液；将载玻片放置于氢氧化钠溶液中浸泡后；转移至超声清洗机中超声，用纯化水清洗，然后烘干。
优选地，氢氧化钠为分析纯。
优选地，步骤S1的具体方法为：配制1-10wt％的氢氧化钠溶液；将载玻片放置于氢氧化钠溶液中浸泡1小时；转移至超声清洗机中超声15分钟，用纯化水清洗3次，然后置于100℃烘箱干燥1小时。
作为本发明进一步的改进，步骤S2的具体方法为：配制5wt％硅烷偶联剂KH550的乙醇水溶液；将载玻片浸泡在5wt％硅烷偶联剂KH550乙醇水溶液中，取出，用纯化水洗涤，再用95％(v/v)乙醇洗涤，然后烘干。
优选地，5wt％硅烷偶联剂KH550的乙醇水溶液中乙醇的质量分数为50％。
优选地，步骤S2的具体方法为：配制5wt％硅烷偶联剂KH550的乙醇水溶液；将载玻片浸泡在5wt％硅烷偶联剂KH550乙醇水溶液2小时；用纯化水洗涤2次，再用95％(v/v)乙醇洗涤2次，然后置于110℃干烘15min。
作为本发明进一步的改进，步骤S3的具体方法为：配制1-10wt％戊二醛水溶液；将所有载玻片浸泡在1-10wt％戊二醛水溶液中，取出载玻片，置于纯化水中超声波清洗机处理，然后用纯化水清洗，将醛基载玻片烘干。
优选地，步骤S3的具体方法为：配制1-10wt％戊二醛水溶液；将所有载玻片浸泡在2wt％戊二醛水溶液中1小时，取出载玻片，置于纯化水中超声波清洗机处理10min，然后用纯化水清洗5次，将醛基载玻片置于25℃培养箱中烘干。
作为本发明进一步的改进，步骤S4的具体方法为：
(1)将湿盒置于水平工作台，加纯化水至湿盒底部被完全覆盖，将载玻片正面朝上，置于湿盒支架上；
(2)用稀释液将链霉亲和素稀释，混合均匀，配置1-100μg/ml链霉亲和素工作液；
(3)在载玻片上每个包被区域加入链霉亲和素工作液；
(4)将湿盒置于冰箱内孵育；
(5)将载玻片插入载玻片架上，在PBST溶液中旋转提拉，洗涤后将载玻片置于鼓风干燥箱中吹干至载玻片表面无液体。
优选地，稀释液为western blot的一抗稀释液，购于上海碧云天生物技术有限公司。
优选地，每个包被区域加入链霉亲和素工作液5μL。
优选地，PBST溶液的配置方法为将0.2mol/L的NaH2PO4溶液和0.2mol/L的Na2HPO4溶液混合，所述NaH2PO4溶液和Na2HPO4溶液的体积比为1:4。
优选地，步骤S4的具体方法为：
(1)将湿盒置于水平工作台，加纯化水至湿盒底部被完全覆盖，将载玻片正面朝上，置于湿盒支架上；
(2)用稀释液将链霉亲和素稀释至25ug/mL，混合均匀，配置链霉亲和素工作液；
(3)在载玻片上每个包被区域加入链霉亲和素工作液；
(4)将湿盒置于2-8℃冰箱内孵育15-20小时；
(5)将载玻片插入载玻片架上，在PBST溶液中旋转提拉3次，洗涤3次后将载玻片置于鼓风干燥箱中吹干至载玻片表面无液体。
作为本发明进一步的改进，步骤S5的具体方法为：
(5)将吹干的载玻片正面朝上，置于湿盒支架上；
(6)用稀释液分别将0.1-100μg/ml的抗体稀释，混合均匀，得到抗体工作液；
(7)在包被了亲和素的载玻片上对应的框分别加入稀释好的抗体工作液置于培养箱中孵育；
(1)将载玻片插入载玻片架上，在PBST溶液中旋转提拉，洗涤后将载玻片置于鼓风干燥箱中吹干至载玻片表面无液体。
作为本发明进一步的改进，所述抗体包括Biotin anti-human CD3、Biotin anti-human CD19、Biotin anti-human CD16+56、Biotin anti-human CD38、Biotin anti-humanHLA-DR、Biotin anti-human CD14、Biotin anti-human CD4+、Biotin anti-human CD25+、Biotin anti-human Fox p3+、Biotin anti-human CD8+、Biotin anti-human CD28+、Biotin anti-human CD29+、Biotin anti-human CD34+、Biotin anti-human CD45RA+、Biotin anti-human Th1、Biotin anti-human Th2中的一种或几种。
优选地，PBST溶液的配置方法为将0.2mol/L的NaH2PO4溶液和0.2mol/L的Na2HPO4溶液混合，所述NaH2PO4溶液和Na2HPO4溶液的体积比为1:4。
优选地，稀释液为western blot的一抗稀释液，购于上海碧云天生物技术有限公司。
优选地，步骤S5的具体方法为：
(1)将吹干的载玻片正面朝上，置于湿盒支架上；
(2)用稀释液分别将抗体稀释至25μg/mL，混合均匀，得到抗体工作液；
(3)在包被了亲和素的载玻片上对应区域分别加入5μL稀释好的抗体工作液，置于35±2℃培养箱中孵育1.5±0.5小时；
(4)将载玻片插入载玻片架上，在PBST溶液中旋转提拉3次，洗涤3次后将载玻片置于鼓风干燥箱中吹干至载玻片表面无液体。
作为本发明进一步的改进，步骤S6的具体方法为：将配置好的封闭保护剂加至载玻片的包被区域，置于培养箱中孵育。
优选地，每个包被区域加入10μL封闭保护剂。
作为本发明进一步的改进，所述封闭保护剂包括蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂和缓冲溶液；所述蛋白为酪蛋白、酪蛋白处理液、甲基化牛血清白蛋白或者人血清白蛋白中的一种，所述表面活性剂为聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯辛基苯基醚或聚氧乙烯月桂酸，所述缓冲溶液为磷酸缓冲液，所述蛋白保护剂为糖类，蛋白溶液、蛋白保护剂、表面活性剂在所述缓冲溶液中的质量浓度比为：(0.01-5)：(0.1-20)：(0.05-5)。
作为本发明进一步的改进，所述封闭保护剂中还添加了灵芝提取物和甘草提取物，添加量为总质量的1％和2％。
优选地，步骤S6的具体方法为：将配置好的封闭保护剂加至载玻片的包被区域，置于35±2℃培养箱中孵育2±0.5小时。
作为本发明进一步的改进，步骤S7的具体方法为：甩干载玻片上的封闭保护剂，后置于培养箱中烘干。
优选地，步骤S7的具体方法为：甩干载玻片上的封闭保护剂，后置于23±2℃培养箱中烘干15-20小时。
本发明进一步保护一种上述制备方法制得的用于血细胞分离计数的抗体芯片。
用于血细胞分离计数的抗体芯片(免疫化学法)采用抗原抗体特异性反应原理，将CD3、CD4、CD8阳性细胞固定于载玻片上。当人体外周血样品中细胞膜表面表达有CD4抗原的细胞与载玻片的CD4抗体包被区接触反应后，通过抗原抗体特异性结合反应，这些CD4抗原表达细胞便会被固定在载玻片上；同理可固定CD3、CD8细胞。除了CD4细胞表面有相应抗原的高表达外，单核细胞也会有CD4抗原的低表达。
本发明具有如下有益效果：本检测通过过氧化物酶染色法对固定在载玻片上的CD4细胞与单核细胞进行区别。由于单核细胞包浆内含有过氧化物酶，所以经过过氧化物酶染色后，细胞内会出现黑灰色颗粒。与之相反，由于CD3、CD4、CD8细胞为淋巴细胞，而淋巴细胞包浆内不含有过氧化物酶，所以细胞内不出现黑灰色颗粒。通过显微镜对细胞内没有灰黑色显示的CD3、CD4、CD8细胞进行自动计数或者人工计数。
(1)成本低廉，检测费用远远低于流式细胞法，特别适用于无流式细胞仪检测条件而又急需开展CD4细胞检测项目的艾滋病流行严重地区。
(2)操作简便，无需特殊专业培训，检测人员通过简单培训即可掌握全套流程，实现医务专业人员缺乏地区的可操作性。
(3)产品室温贮存，无需冷藏，器具简便易携，操作环境无特殊要求，为资源匮乏地区进行正常检测提供有力保障。
(4)用血量少，静脉血或手指末梢血均可，手指血的使用极大降低了采血难度，减少了受检者的受压程度，为幼儿、常住院病人等采血困难者提供了便利。
(5)玻片样本可长期保存，随时随地复查，因为通过检测已将CD4细胞永久固定于玻片，可随时随地进行计数或复查；可为受检者建立免疫力数据库，制作个性化健康管理档案，实现病程监测。
(6)检测样本处理时间短，无需溶血。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明作用原理图；
图2为204例临床验证数据和流式细胞术的相关性、一致性评价结果图；
图3为204例临床验证数据和流式细胞检测Bland-Altman一致性评价结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1用于血细胞分离计数的抗体芯片的制备
S1.羟基化；
(1)配制1wt％分析氢氧化钠；
(2)将载玻片放置于氢氧化钠溶液中浸泡1小时；
(3)转移至超声清洗机中超声15分钟，用纯化水清洗3次，然后置于100℃烘箱干燥1小时。
S2.氨基化；
(1)配制5％硅烷偶联剂KH550乙醇水溶液；
(2)将玻片浸泡在5％硅烷偶联剂KH550乙醇水溶液2小时；
(3)用纯化水洗涤2次，再用95％(v/v)乙醇洗涤两次，然后置于110℃干烘15min。
S3.醛基化；
(1)配制2wt％戊二醛水溶液；
(2)将所有玻片浸泡在wt2％戊二醛水溶液中1小时。
(3)取出玻片，置于纯化水中超声波清洗机处理10min,然后用纯化水清洗5次。
(4)将醛基玻片置于25℃培养箱中烘干。
S4.包被链霉亲和素；
(1)将湿盒置于水平工作台，加纯化水至湿盒底部被完全覆盖，将定制玻片正面朝上，置于湿盒支架上。
(2)链霉亲和素工作液的配制：用稀释液将链霉亲和素稀释至25ug/ml，混合均匀；
(3)加样：在定制玻片上每个包被区域加入链霉亲和素工作液5μl；
(4)将湿盒置于2-8℃冰箱内孵育15-20小时；
(5)洗涤干燥：将玻片插入玻片架上，在PBST溶液中旋转提拉3次，洗涤3次后将玻片置于鼓风干燥箱中吹干至玻片表面无液体。
S5.孵育Biotin anti-human CD4、Biotin anti-human CD8a、Biotin anti-humanCD3抗体；
(1)将吹干的玻片正面朝上，置于湿盒支架上。
(2)抗体工作液配制：用稀释液分别将Biotin anti-human CD4、Biotin anti-human CD8a、Biotin anti-human CD3抗体稀释至25ug/ml，混合均匀；
(3)加样：在包被了亲和素的玻片上对应3、4、8的框分别加入5ul稀释好的Biotinanti-human CD3抗体工作液、Biotin anti-human CD4抗体工作液、Biotin anti-humanCD8a抗体工作液，置于35±2℃培养箱中孵育1.5±0.5小时；
(4)将玻片插入玻片架上，在PBST溶液中旋转提拉3次，洗涤3次后将玻片置于鼓风干燥箱中吹干至玻片表面无液体。
S6.封闭；
将配置好的封闭保护剂每10ul加至玻片的每个包被区域，置于35±2℃培养箱中孵育2±0.5小时；
S7.干燥；
甩干玻片上的封闭保护剂，后置于23±2℃培养箱中烘干15-20小时。
S8.真空包装。
实施例2免疫细胞化学染色分析与计数试剂盒的制备
免疫细胞化学染色分析与计数试剂盒包含用于血细胞分离计数的抗体芯片、稀释液、过氧化氢溶液、染色液和复染液。
用于血细胞分离计数的抗体芯片通过实施例1制备。
稀释液可以由稀释液片剂溶于水溶液而制成。稀释液片剂为市售商品，购自上海保康生物高科技有限公司，主要成分为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、柠檬酸、吐温20等，以一片溶解于40ml水溶液即可配制成pH7.0-7.4的磷酸盐缓冲液。其规格为10片/包，密封铝箔袋装，遮光密闭保存。试剂盒组装时仅在袋外加贴标签即可。稀释液也可以通过将上述各种盐按一定的浓度配制而成。
过氧化氢溶液体积百分比浓度为2.5-3.5％，遮光密闭阴凉处保存。实际生产时只需分装成30ml/瓶，并在瓶外加帖标签即可。
染色液的配制：将碱性品红、亚硝基铁氰化钠、联苯胺按1-5％、3-5％、1-5％(W/V)的浓度比例溶解于95％乙醇后，置于棕色聚酯乙烯塑料试剂瓶中，于2-26℃密封保存。
复染液的配制：将碱性品红按2-5％(W/V)的浓度比例溶解于95％乙醇后，置于棕色聚酯乙烯塑料试剂瓶中，于2-26℃密封保存。
实施例3免疫细胞化学染色分析与计数试剂盒的检测
适用仪器：
带有10倍物镜的光学显微镜或自动计数显微系统。
样本要求：
静脉血标本的采集：标本须以EDTA作为抗凝剂(1.0-1.5mg EDTA:1ml全血)。所有标本须在采血后6小时内完成接种。
严禁冰箱保存。
当发现血液标本有溶血，凝结，血浆比例失调，极端温度下保存，无有效编号等情况时请拒绝接受样本。
检测方法：
1.溶液配制
1)配制磷酸盐缓冲液：一包磷酸盐缓冲液剂加入400ml纯水的比例，搅拌均匀。
注意：磷酸盐缓冲液检测时新鲜配制，当日可重复清洗。
2)配制过氧化酶染色液：一包过氧化酶染色剂加入500ml 95％乙醇，充分搅拌至少5分钟。
3)配制复染液：0.8g碱性品红加入500ml75％乙醇，搅拌均匀；
注意：1)过氧化物酶染色液、复染液可于6个月内重复使用约1000片；2)复染液不得少于450ml，若少于450ml，请及时添加。
2.将湿盒至于水平工作台，加室温水至湿盒底部被完全覆盖。注意湿盒支架处应保持干燥。
3.在2ml圆底管上标记病人样品编号，加380ul缓冲液于2ml圆底管中。
4.加20ul摇匀血样缓冲液中，即刻混匀稀释血样。
5.拆除内包装，取出玻片，将包被面朝上，置于湿盒支架上(勿使玻片接触到水)。
注意：请勿接触到抗体包被区域；
6.吸取5ul稀释血样，滴入各抗体包被区中央。确认没有血样流出，且抗体包被区内无气泡，盖紧盒盖，室温(20℃-30℃)孵育40分钟。
7.孵育40分钟后，将玻片按序插入染色架(注意与湿盒中玻片序列对应)，将染色架即刻放入磷酸盐缓冲液中，旋转提拉直至玻片呈无色透明。
8.将染色架即刻放入过氧化酶染色液中，静置1分钟。
9.在步骤8计时1分钟内，将1ml 2.5％-3.5％过氧化氢溶液加入预先盛有400ml水的过氧化氢染液缸中，搅拌均匀后制成新鲜工作液。
注意：过氧化氢工作液必须在使用前一步骤新鲜配制，当日内可重复使用，每次使用前需重新添加1ml 2.5％-3.5％过氧化氢溶液。
10.将稍加沥干的染色架放入新鲜过氧化氢工作溶液中，静置4分钟。
11.将染色架放入400ml75％乙醇染液缸中，旋转提拉直至玻片呈无色透明。
注意：75％乙醇当日可重复利用。
12.将染色架锁扣打开，置于干燥仪下干燥6分钟将染色架放入复染液，静置1分钟。
13.将染色架转入500ml纯水染色缸中，静置30秒，其后根据玻片数量不等提拉相应次数，提出即可。
注意：玻片数少于15片提拉3下，玻片数大于或等于15片提拉5下。
14.将染色架锁扣打开，用干燥仪干燥后，可用显微镜人工计数或自动计数。
注意：若细胞染色淡而影响计数，请重复13、14。
参考区间：
中国大陆地区将康成年人CD3+T淋巴细胞数参考范围大约在750-2860个/ul；CD4+T淋巴细胞数参考范围大约在400-1440个/ul；CD8+T淋巴细胞数参考范围大约在300-1250个/ul；CD4/CD8比值正常值参考范围大约在0.90-2.87。
建议各实验室建立自己的参考值范围。
检测结果解释：
用显微镜人工计数或自动计数包被区中的CD3、CD4、CD8细胞。CD3、CD4、CD8细胞均为圆型、绛红色、体积较小、透亮、有折光感，细胞内没有灰黑色显示的细胞。将细胞数乘以4即为每立方毫米中CD3、CD4、CD8细胞数。细胞内有灰黑色显示的、细胞结构破裂或不完整的，都不予计数。
注：避免对位于边框上的细胞重复计数。
实施例4-15
通过控制步骤S5中不同的抗体组合，可以得到不同的抗体芯片，从而制备不同试剂盒。
Figure BDA0002409097670000141
Figure BDA0002409097670000151
对比例1
采用专利CN 101957378A“CD4细胞芯片及其制备方法和应用”方法得到含有CD4细胞芯片的试剂盒。
测试例1应用血细胞分离计数的抗体芯片进行检测
1、特异结合反应：加水于湿盒内，使湿盒底部完全被水覆盖，搁置玻片处应保持干燥。取出玻片，将玻片置于湿盒支架上，盖紧盒盖。将稀释后血样滴加在血细胞分离计数的抗体芯片的已包被抗体处，进行抗原抗体反应。室温下(20～30℃)湿盒内反应40分钟。
2、淋洗、染色：反应后的玻片用稀释液提拉5～10次不等，主要是用稀释液洗去非特异性结合细胞和多余血样，然后放入染色液缸中(有CD3和/或CD4和/或CD8抗原表达的细胞将被染上色)，静置1分钟后，将稍加沥干的玻片架转入新鲜过氧化氢工作溶液中，静置4分钟。接着将玻片架转入75％酒精专用缸中浸泡2分钟后，根据玻片数量不同提拉5～10次不等，直至玻片呈无色透明或淡粉红色后将玻片架转入复染液缸中，静置1分钟。最后将玻片架转入水中，根据玻片数量不同提拉5～10次不等，直至玻片呈淡紫红色(如镜检发现细胞染色过淡，请重复复染)。
上述染色步骤中，染色液染色后的玻片转入过氧化氢溶液中浸置，是因为除了CD3、CD4、CD8淋巴细胞表面有CD3、CD4、CD8抗原的高表达外，单核细胞也存在CD3、CD4、CD8抗原的低表达，经染色液染色，CD3、CD4、CD8细胞与单核细胞都被染上色。但是单核细胞胞浆内含有过氧化物酶，而CD3、CD4、CD8细胞为淋巴细胞，淋巴细胞胞浆内不含有过氧化物酶，采用过氧化物酶染色法对固定在玻片上的CD3、CD4、CD8细胞与单核细胞进行区别，即将染色后的玻片转入过氧化氢溶液中，让氧化物酶与过氧化氢反应。由于单核细胞胞浆内含有过氧化物酶，经过过氧化物酶染色后，细胞内会出现黑灰色颗粒。与此相反，由于所需检测的CD3、CD4、CD8细胞胞浆内不含过氧化物酶，在过氧化氢溶液中浸置后，细胞内不出现黑灰色颗粒，通过光学显微镜即可对CD3、CD4、CD8细胞与单核细胞进行区分，该方法简单，而且无需增加CD4抗体来剔除单核细胞，成本非常低廉。
3、计数：玻片自然晾干后可直接用普通光学显微镜的10倍物镜计算CD3、CD4、CD8细胞数量；或用江西业力医疗器械有限公司研发的固相芯片扫描分析系统进行自动计数，计数准确率达到98％。
测试例2
将本发明得到的试剂盒进行204例随机临床检测，与流式细胞术计数结果对比如表1、图2和图3。
表1 204例随机临床检测的数据和流式细胞结果对比表
Figure BDA0002409097670000171
Figure BDA0002409097670000181
Figure BDA0002409097670000191
Figure BDA0002409097670000201
Figure BDA0002409097670000211
图2为204例临床验证数据和流式的相关性、一致性评价结果：T淋巴细胞检测试剂与流式细胞法检测结果相关性大于0.96。
图3为204例临床验证数据和流式细胞检测Bland-Altman一致性评价结果。
与现有技术相比，本检测通过过氧化物酶染色法对固定在载玻片上的CD4细胞与单核细胞进行区别。由于单核细胞包浆内含有过氧化物酶，所以经过过氧化物酶染色后，细胞内会出现黑灰色颗粒。与之相反，由于CD3、CD4、CD8细胞为淋巴细胞，而淋巴细胞包浆内不含有过氧化物酶，所以细胞内不出现黑灰色颗粒。通过显微镜对细胞内没有灰黑色显示的CD3、CD4、CD8细胞进行自动计数或者人工计数。
成本低廉，检测费用远远低于流式细胞法，特别适用于无流式细胞仪检测条件而又急需开展CD3、CD4、CD8细胞细胞检测项目的艾滋病流行严重地区。
操作简便，无需特殊专业培训，检测人员通过简单培训即可掌握全套流程，实现医务专业人员缺乏地区的可操作性。
产品室温贮存，无需冷藏，器具简便易携，操作环境无特殊要求，为资源匮乏地区进行正常检测提供有力保障。
用血量少，静脉血或手指末梢血均可，手指血的使用极大降低了采血难度，减少了受检者的受压程度，为幼儿、常住院病人等采血困难者提供了便利。
玻片样本可长期保存，随时随地复查，因为通过检测已将CD3、CD4、CD8细胞永久固定于玻片，可随时随地进行计数或复查；可为受检者建立免疫力数据库，制作个性化健康管理档案，实现病程监测。
检测样本处理时间短，无需溶血。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于血细胞分离计数的抗体芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将载玻片浸泡于氢氧化钠溶液中，使之羟基化；
S2.将步骤S1得到的载玻片浸泡在3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇水溶液中，使之氨基化；
S3.将步骤S2得到的载玻片浸泡戊二醛水溶液中，使之醛基化；
S4.将步骤S3得到的载玻片区域包被链霉亲和素；
S5.在步骤S4得到的载玻片不同区域画框，分别孵育不同的抗体；
S6.对步骤S5得到的载玻片的包被区域进行封闭；
S7.对步骤S6得到的载玻片进行干燥；
S8.将步骤S7得到的载玻片真空包装。
2.根据权利要求1所述一种用于血细胞分离计数的抗体芯片的制备方法，其特征在于，步骤S1的具体方法为：配制1-10wt％的氢氧化钠溶液；将载玻片放置于氢氧化钠溶液中浸泡后；转移至超声清洗机中超声，用纯化水清洗，然后烘干。
3.根据权利要求1所述一种用于血细胞分离计数的抗体芯片的制备方法，其特征在于，步骤S2的具体方法为：配制1-10wt％硅烷偶联剂KH550的乙醇水溶液；将载玻片浸泡在硅烷偶联剂KH550乙醇水溶液中，取出，用纯化水洗涤，再用95％(v/v)乙醇洗涤，然后烘干。
4.根据权利要求1所述一种用于血细胞分离计数的抗体芯片的制备方法，其特征在于，步骤S3的具体方法为：配制1-10wt％戊二醛水溶液；将所有载玻片浸泡在戊二醛水溶液中，取出载玻片，置于纯化水中超声波清洗机处理，然后用纯化水清洗，将醛基载玻片烘干。
5.根据权利要求1所述一种用于血细胞分离计数的抗体芯片的制备方法，其特征在于，步骤S4的具体方法为：
(1)将湿盒置于水平工作台，加纯化水至湿盒底部被完全覆盖，将载玻片正面朝上，置于湿盒支架上；
(2)用稀释液将链霉亲和素稀释，混合均匀，配置1-100μg/ml链霉亲和素工作液；
(3)在载玻片上每个包被区域加入链霉亲和素工作液；
(4)将湿盒置于冰箱内孵育；
(5)将载玻片插入载玻片架上，在PBST溶液中旋转提拉，洗涤后将载玻片置于鼓风干燥箱中吹干至载玻片表面无液体。
6.根据权利要求1所述一种用于血细胞分离计数的抗体芯片的制备方法，其特征在于，步骤S5的具体方法为：
(1)将吹干的载玻片正面朝上，置于湿盒支架上；
(2)用稀释液分别将0.1-100μg/ml的抗体稀释，混合均匀，得到抗体工作液；
(3)在包被了亲和素的载玻片上对应的框分别加入稀释好的抗体工作液置于培养箱中孵育；
(4)将载玻片插入载玻片架上，在PBST溶液中旋转提拉，洗涤后将载玻片置于鼓风干燥箱中吹干至载玻片表面无液体。
7.根据权利要求6所述一种用于血细胞分离计数的抗体芯片的制备方法，其特征在于，所述抗体包括Biotin anti-human CD3-、Biotin anti-human CD19、Biotin anti-humanCD16+56、Biotin anti-human CD38、Biotin anti-human CD3、Biotin anti-human HLA-DR、Biotin anti-human CD14、Biotin anti-human CD4+、Biotin anti-human CD25+、Biotin anti-human Fox p3+、Biotin anti-human CD8+、Biotin anti-human CD28+、Biotin anti-human CD28-、Biotin anti-human CD29+、Biotin anti-human CD34+、Biotin anti-human CD45RA+、Biotin anti-human Th1、Biotin anti-human Th2中的一种或几种。
8.根据权利要求1所述一种用于血细胞分离计数的抗体芯片的制备方法，其特征在于，步骤S6的具体方法为：将配置好的封闭保护剂加至载玻片的包被区域，置于培养箱中孵育；
其中，所述封闭保护剂包括蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂和缓冲溶液，所述蛋白为酪蛋白、酪蛋白处理液、甲基化牛血清白蛋白或者人血清白蛋白中的一种，所述表面活性剂为聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯辛基苯基醚或聚氧乙烯月桂酸，所述缓冲溶液为磷酸缓冲液，所述蛋白保护剂为糖类，蛋白溶液、蛋白保护剂、表面活性剂在所述缓冲溶液中的质量浓度比为：(0.01-5)：(0.1-20)：(0.05-5)。
9.根据权利要求8所述一种用于血细胞分离计数的抗体芯片的制备方法，其特征在于，所述封闭保护剂中还添加了灵芝提取物和甘草提取物，添加量为总质量的1％和2％。
10.如权利要求1-9任一项权利要求所述制备方法制得的用于血细胞分离计数的抗体芯片。
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