CN1067118A

CN1067118A - 绝对白血细胞亚类数和白血细胞多份差别的获得方法和仪器

Info

Publication number: CN1067118A
Application number: CN92103245.5A
Authority: CN
Inventors: R·F·布伦豪斯; C·M·哈杰科; T·拉塞尔; W·H·科特
Original assignee: Coulter Corp
Current assignee: Coulter Corp
Priority date: 1991-05-20
Filing date: 1992-05-20
Publication date: 1992-12-16
Also published as: TW215955B; WO1992021027A1; IL101826A; US5348859A; EP0585385A1; IL101826A0; BR9206033A; AU2008992A; JPH06507971A

Abstract

本发明提出鉴别和计数表达选定特性的细胞的光学筛选法和仪器(120,138)，其中细胞与一或多组且每组结合可与一或多类细胞(162，174)上的特异性分子结合的反应物，载玻片上已知体积中的细胞和中心球光学观测而鉴别并计数有无不同组中心球结合的细胞类型，细胞数与体积关联得绝对细胞数，并且用多份不同样品和反应物可得多份WBC差另/绝对数，不同组中心球因大小，形状，颜色或其组合不同而可光学区别。

Description

本发明一般涉及鉴别和筛选细胞以获得研究或诊断用细胞绝对数和/或多份差别/绝对数的方法和仪器。更具体地讲，本发明涉及在已知样品体积中光学鉴别和计数具有特异性表面分子的细胞以获得以前用简单光学技术而不可能得到的感兴趣群体的4份差别和/或绝对细胞数。

染色的细胞是常规细胞形态研究的基础。一般是将细胞放在载玻片上，然后染色，再通过显微镜对其进行光学和肉眼观察。由显微图像得到的光学或肉眼信息也可被用于自动扫描仪中，如图像分析仪。

19世纪后叶，Ehrlieh报道了血细胞的生态学，生理学和病理学，其通过建立检测和区别白血病和贫血的方法将血液学带进了新纪元。Ehrlih观察到酸性，碱性和中性染料与细胞成份如白血细胞（WBC）的颗粒和胞核有专一反应。

Romanowsky通过将多色染色用于细胞而进一步发展了血液学。目前，Wright染色（对Romanowsky染色的修饰）常被用于细胞的视觉检测。将外周血涂片染色并通常用于对异常形态变化的视觉检查。细胞类型的分类和细胞分化的阶段在鉴定疾病的方法中是关键因素。尽管可利用自动血液分析仪和流动血细胞计数器，但仍需要对细胞的直接视觉（显微的）评估。

当在外周血涂片上发现异常时，免疫研究也是重要的。因此测定白血病的特殊亚类以便更好地选择治疗疾病方法并尽可能地给患者提供专一的预后是必要的。例如，在急性白血病中，外周血中的胚细胞显著增加。由于缺乏分化，鉴别这些未成熟的细胞是淋巴细胞还是粒细胞是困难的。如果快速繁殖的胚细胞亚群被发现是带T11受体，则白血病可分类为急性成淋巴细胞白血病（ALL），T-细胞类。一般讲，T谱系ALL要比B谱系ALL的预后差。另外，也常常根据它们的分化程度，将这些白血病进一步分成亚组。组Ⅰ和组Ⅱ显示出在早期胸腺前体细胞上可见的抗原;而在组Ⅲ中表达的那些与在成熟T细胞上发现的表面抗原相似。

免疫实验首先通过利用光学显微镜测定淋巴细胞的亚类而发展起来的。Coombs和其它人在1970年观察到了人淋巴细胞和羊血红细胞（RBC）间形成的玫瑰花结。后者研究发现，所有或至少大部分胸腺衍生的淋巴细胞（T-细胞）在适宜条件下都会显出玫瑰花结形成现象。这些研究利用了Ficoll分离的淋巴细胞并且采用光显微镜，用适宜的时间对分离的淋巴细胞进行了亚型分类。

现在淋巴细胞亚类通常是在带有荧光标记的单克隆抗体的样品中对细胞进行荧光标记来测定。该荧光标记的单克隆抗体结合到表达抗原的细胞表面上的抗原上。细胞样品然后通过用荧光显微镜或高尖端流动血细胞计数仪分析。当用流动血细胞计数仪时，必须由专门训练的技术人员进行细胞样品的制备，数据采集和数据分析。流动血细胞计数仪包括激光和复杂的光学系统，高能量计算机和电及流体系统。流体血细胞计数仪的部件系统必须定期和经常地进行维护和校准。虽然目前流动血细胞计数仪是作为淋巴细胞亚类的测定的标准方法，但该方法仍有几个缺陷，这包括仪器价格昂贵，需要正确保持该义器的专门技能。

淋巴细胞亚类也可利用由本发明的受让人，Coulter Electronics，Inc，开发的自动仪和方法来测定。一种改善的简单自动仪和用其的方法披露于US申请号587，646，1990，9，20提出，标题为“AUTOMATED ANALYZER AND METHOD FOR SCREENING CELLS OR FORMED BODIES FOR ENUMERATION OF POPULATIONS EXPRESSING SELECTED CHARACTERISTICS”，其是1987，3，13提出的同一标题的US申请号025，345的继续申请。该申请将电子视觉孔径原理，用于鉴定和/或计算所定义的胞群或形成的群体的选择生物分子的专一性和显微镜材料技术结合起来。自动分析仪可和特殊的溶解试剂和/或偶联到显微中心球或变化组分的支持物上的抗体合起来使用。

第二个申请，US系列号285，856，1988，12，16提出，标题为“METHOD AND APPARATUSFOR SCREENING CELLS OR FORMED BODIES WITH POPULATIONS EXPRESSING SELECTED CHARACTERISTICS”，披露了从全血样品或部分全血样品直接筛分亚类。

第三个申请，US号339，156，1989，4，14提出，标题为“METHOD AND APPARATUS FOR SCREENING CELLS OR FORMED BODIES WITH POPULATIONS EXPRESSING SELECTED CHARACTERISTICS UTILIZING AT LEAST ONE SENSING PARAMETER”，披露了多份或五份白血细胞差别，淋巴细胞亚类和由全血样品或带血红细胞和/或通过消除群体排除了白血细胞的群体和/或带有一或多种光或电参数的白血细胞亚类的样品进行的重叠测定。

第四个申请，US No.07/525，231，1990，5，17提出，标题为“METHOD AND APPARATUS FOR SCREENING OBSCURED OR PARTIALLY OBSCURED CELLS”，披露了暗细胞分析，其是利用具有能结合到暗细胞上的专一抗体中心球产生由一个细胞群体到另一细胞群体的暗色细胞的辨别特征。上述四篇对比申请在此收入为参考文献。

实现该发明的方法和仪器可用各种免疫反应，如包括反应物和形成的胞体或细胞的免疫反应。该发明也用于形成的胞体悬浮液分析，如其中的一些细菌和病毒。这里所用的细胞定义为动物或植物细胞，其包括细胞类细菌，真菌，它们是分开辨别的或在聚集中辨别的。细胞是能以独立单位起作用的生命物质的最小结构聚集。例如，细胞可是人体血红细胞（RBC）和WBC群体，来自组织或血样的癌细胞或其它异常细胞。形成的胞体定义为一些细菌和病毒，细胞和形成的胞体适宜标记。这样它们就能按与鉴别人体血细胞的同样方式，通过本发明的方法和仪器进行光学鉴别。

虽然已在上面申请中使用的术语“反应物”定义为溶解剂和单克隆抗体，但反应物包括各种试剂，它们可检测和与细胞或形成的胞体上的一或多个专一分子反应。一些实例如下：

反应物专一性分子

抗体抗原

药药物受体

激素激素受体

生长因子生长因子受体

这些反应物可偶联或结合到细胞上的专一分子上。这些反应物是起化学反应的部分;但这些反应物不必进行化学变化。

先有技术中披露了用光学显微镜和抗体标记的中心球测定淋巴细胞亚型的方法。该方法来自加利福尼亚，Richmond的Bio - Rad实验室。该方法可鉴别T和B淋巴细胞。抗体标记的中心球被用来结合到显有所需表面抗原的细胞上。两种不同颜色的抗体标记的中心球被用来区别T和B淋巴细胞。显微学家通过抗体标记中心球结合到细胞上来鉴别对具体抗原呈阳性的细胞。没有抗体标记的中心球结合到其上的细胞代表了阴性细胞群体，其表达不令人感兴趣的抗原。但该方法受到这样的限制，即淋巴细胞必须利用分离介质，如Ficoll - Hypaque，首先从全血样品中分离出来。粒细胞污染可导致假的非阳性细胞值增加和吞噬细胞数目的增加。另外，由于首先从全细胞中去除了其它细胞，因此仅能进行淋巴细胞亚型测定。另外由于这些细胞不是用常规Romanowsky或Wright类染色，而染色仅用于测定细胞的存活性，因此，限制了细胞形态学评估。又由于细胞是在悬浮液中而不是在常规的载玻片上评估的，从而进一步限制了形态学评估。

光学筛选细胞以鉴定细胞的形态和细胞所表达的特性的改进方法和仪器见于母申请US Serial No:617,096,1990,11,23提出，题目为“METHOD ANDAPPARATUS FOR OPTICALLY SCREENING MICROSCOPIC CELLS”，在此收入为参考文献。将细胞与一或多个不同组的中心球混合，每组中心球上都结合有可与某种特异性分子结合的反应物，该特异分子可存在于一种或多种类型的细胞上。将细胞和中心球在载玻片上制成涂片并用赖特氏型染色剂染色。然后由操作人员和/或自动地观测细胞，如果有的话，则可鉴定与不同的中心球结合的细胞的类型。

本发明提供一种鉴别和计数已知样品体积中的有关细胞以获得绝对细胞计数和/或多份差别/绝对数的方法和仪器。细胞与一或多个不同组的中心球混合，每组中心球上都结合有可与某种特异性分子结合的反应物，该特异性分子可存在于一种或多种类型的细胞上。

部分样品与一或多组中心球混合和结合后，部分样品溶解以除去血红细胞。将特定体积的部分溶解样品涂到载玻片上，如血细胞计数器上，其中对溶解液急冷或不急冷。然后由操作人员和/或自动对细胞进行光学观测，以鉴定和计数细胞类型，细胞上必要时可能结合了不同的中心球。细胞计数与已知具体体积关联起来而得绝对细胞数。

如现有技术一样，还可得WBC总数，并且分开的样品部分可与一或多组中心球混合而使不同的WBC亚类区别开。每一不同的WBC亚类均可观测并计数。各样品部分计数可相互比较并与WBC总数比较而得至少4份WBC差别/绝对数，即M′S，L′S，N′S和E′S。

样品可以是全血样品或其一部分并且从样品中除去RBC′s。若不止一种类型的细胞上存在具体特异性分子，如抗原，则加入第二组不同的中心球以在细胞类型中进行区别。中心球组可单独依序或同时混入相同样品部分并优选与之混合。不同的中心球组具有可光学区别的不同光学特性。中心球组之间的不同光学特性可为颜色，大小，形状或其组合特性。

因此，本发明第一目的是提供一种光学筛选和计数显微细胞的方法，其特征是提供包括多个细胞的样品，将至少第一部分细胞与至少第一组其上结合有对至少第一类存在于至少一类细胞上的特异性分子具有专一性的至少第一反应物的中心球混合形成样品混合物，将特定体积的样品混合物涂到载玻片上，用显微镜观测至少某些细胞以至少鉴别并至少计数结合了第一组中心球的细胞存在数以及将该细胞数与该特定体积关联起来以得到绝对细胞数。

本发明第二目的是提供一种光学筛选并计数显微细胞的仪器，其特征是其中包括提供包括多个细胞的样品的装置，将至少第一部分细胞与至少第一组其上结合有对至少第一类存在于至少一类细胞上的特异性分子具有专一性的至少第一反应物的中心球混合形成样品混合物的装置，将特定体积样品混合物涂到载玻片上的装置，用显微镜观测至少某些细胞以至少鉴别并至少计数结合了第一组中心球的细胞存在数的装置以及将该细胞数与该特定体积关联起来以得到绝对细胞数的装置。

本发明又一目的是提供一种光学筛选并计数显微细胞的方法，其特征是提供包括多个细胞的样品，将至少一部分细胞与多组光学不同且每组上结合有对至少第一类存在于至少一类细胞上的特异性分子具有专一性的至少一类不同的反应物的中心球组混合形成样品的混合物，将特定体积样品混合物涂到载玻片上，用显微镜观测至少某些细胞以至少鉴别并至少计数其上每组中心球与不同反应物结合的细胞存在数以及将该细胞数与总数关联起来以得到多份细胞差别。

本发明再一目的是提供一种光学筛选并计数显微细胞的仪器，其特征是其中包括提供包括多个细胞的样品的装置，将至少一部分细胞与多组光学不同且每组上结合有对至少第一类存在于至少一类细胞上的特异性分子具有专一性的至少一类不同的反应物的中心球组混合形成样品混合物的装置，将特定体积样品混合物涂到载玻片上的装置，用显微镜观测至少某些细胞以至少鉴别并至少计数其上每组中心球与不同反应物结合的细胞存在数的装置以及将该细胞数与总数关联起来以得到多份细胞差别的装置。

以下参照说明书附图详述本发明。

图1是本发明的一种光学筛选分析仪实施方案的方框图；

图2是本发明的第二种光学筛选分析仪实施方案的方框图；

图3是本发明的特定光学筛选分析仪实施方案的方框图;

图4是染色后的载玻片的光学图像，它显示了中心球与某一特异性细胞抗原的结合;

图5是染色后的载玻片的光学图像，它显示了中心球与不同的特异性细胞抗原的结合;

图6是染色后的载玻片的光学图像，它显示了中心球与表明CLL类型的进一步不同的特异性细胞抗原结合;

图7是染色后的载玻片的光学图像，它显示了中心球不与进一步分化的CLL类型的另一种特异性细胞抗原的结合;

图8是染色后的载玻片的光学图像，它显示了中心球与嗜中性白细胞上某一特异性细胞抗原结合;

图9是着色不同的中心球的光学图像，它显示了中心球与嗜中性白细胞上另一种特异性细胞抗原结合;

图10是图8和图9的着色不同和大小不同的中心球的光学图像，它显示了不同的中心球与嗜中性白细胞上不同的细胞抗原结合;

图11是中心球与一种类型的细胞上特异性细胞抗原结合而不与其它类型细胞上的抗原结合的光学图像;

图12是染色后的载玻片的光学图像，它显示了中心球与一种类型的细胞上不同的特异性细胞抗原结合而不与其它类型细胞上的抗原结合;

图13是染色后的载玻片的光学图像，它显示了其上结合有第二反应物的中心球与可与细胞上特异性细胞抗原结合的第一反应物结合;

图14是染色后的载玻片的光学图像，它显示了中心球与骨髓中的嗜中性白细胞上特异性细胞抗原结合;

图15是本发明一种光学细胞计数实施方案的方框图;

图16A和B分别是典型血细胞计数器的顶视图和剖视图;

图17是血细胞计数器部分的光学图像，它显示了中心球与淋巴细胞上的特异性细胞抗原的结合;和

图18是血细胞计数器部分的光学图像，它显示了不同中心球与淋巴细胞和单核细胞中每一个上的特异性细胞抗原的结合。

参见图1，本发明的第一种光学细胞筛选实施方案一般以参照符号10表示。光学细胞筛选仪10包括生物样品12，该样品至少包含第一组生物细胞（未示出），如全血样品中或来自全血样品的细胞。

样品12通过线路14与至少一种通过线路18的反应物16合并。反应物16可包括一种螯合剂，如标准EDTA，它作为抗凝血剂，加到样品12中以便阻止嗜中性白细胞吞食中心球。

反应物16也包括多组或第一组中心球，其具有对可存在于与之结合的至少一种类型的细胞上的特定抗原有专一性的抗体。对于血液，细胞可表达可与一种或多种特异性抗体结合的抗原。一般来说，抗原是抗体可与之结合的分子，因此，对于血液或其它活细胞，反应可被规定为第一种类型的分子与第二种类型的分子特异地进行化学反应。然后合并的样品12和反应物16最好用按功能命名的混合台20进行混合。然后将一部分混合物置于载玻片上，用按功能命名的涂片制备台22制做涂片。然后在按功能命名的染色台24内给涂片染色。

染色应为一种可用于区分各种细胞特性的组织学染色。对于血液细胞，染色最好是如前所述的所谓“赖特氏”型染色，染色后便可在常规情况下用显微镜区分细胞的形态。一些可用于本发明方法的其它类型的组织学染色剂的实例有苏木精、结晶紫和吉姆萨氏血液染剂。苏木精可用作一般的组织染色显示动物组织中的细胞核。结晶紫可用作细菌染色显示被膜。吉姆萨氏血液染色可用于显示白细胞、立克次氏体、细菌和内含体的区别。然后用光学分析仪26光学观测染色后的载玻片。光学筛选载玻片上的细胞以确定哪些类型的细胞上结合有中心球。这可鉴定细胞上是否存在特定的受体或抗原并由此鉴定样品的状态，这一点将在下文中进一步描述。

在光学筛选仪器10中，样品12或者是全血样品，其中保留有红血细胞或者只是有或无血小板或RBC′S和所有WBC群体的部分全血样品。本发明的第二种光学细胞筛选仪实施方案一般以参考符号28表示，可参见图2。光学细胞筛选仪28包括生物样品30，该样品可以是全血样品，也可以是至少包括白血细胞的血液样品。生物样品30也可得自其它生物流体或组织，即骨髓、尿、脊髓液或胸膜液或淋巴腺。

需要时，红血细胞可用按功能命名的去除台32从混合物中除去。红血细胞也可以多种方式用去除台32从混合物中除去。红血细胞可被细胞溶解剂溶解。下文中描述了一种这样的优选细胞溶解剂和可与之一起使用的猝灭剂。红血细胞也可用多个磁性中心球除去，中心球上具有与之结合的红血细胞特异的抗体（未示出）。被结合的红血细胞保留在磁场中，除去剩余的样品以除去红血细胞。例如，可以使用的一种特定的红血细胞特异性抗体公开于美国专利4，752，563，题为MONOCLONAL ANTIBODY FOR RECOVERY OF LEUKOCYTES IN HUMAN PERIPHERAL BLOOD AND METHOD OF RECOVERY EMPLOYING SAID MONOCLONAL ANTIBODY，本文授引该文献作为参考。除了样品缓冲液之外或代替样品缓冲液，可包括一种缓冲液。也可使用优选的RBC细胞溶解剂和红血细胞特异性中心球的组合物。有关红血细胞去除的详细情况可参见本文前面提到的本发明受让人的4个申请。

然后样品30通过线路34与通过线路38的反应物合并。合并的样品30和反应物32最好混合起来。可在此使用的合适的混合仪器可详见1990年5月1日提交的题为METHOD AND APPARATUS FOR RAPID MIXING OF SMALL VOLUMES FOR ENHANCING BIOLOGICAL REACTIONS的美国专利申请517，309，该申请是1987年5月13日提交的同一题目的美国专利申请025，337的继续申请，在此援引作为参考。需要的话，通过使用混合器可加快反应速度，而不会明显破坏细胞重要特性。混合器20可利用相同类型的混合仪器，但也可以是其它类型的温和混合仪器，例如简单的辊筒式摇摆器，因为反应速度并不是至关重要的。

然后用载玻片制备台40将一部分去除了红血细胞的混合物在载玻片上浓缩，制成涂片。一旦经浓缩令人感兴趣的细胞和除去过量的水份（如通过载玻片离心分离）制得载玻片后，立即按前述方法在染色台42内给载玻片染色。然后再用分析仪44对染色后的载玻片作光学分析，分析仪44可以与分析仪26相同。关于在与反应物36混合之前红血细胞的去除，见光学细胞筛选仪28。一般来说，当用磁性中心球去除红血细胞时这是优先选用的。这也可使用较少的令人感兴趣的中心球，因为去除红血细胞后就不会干扰中心球的结合了。当使用细胞溶解剂时，最好是在反应物36和样品30合并之后去除红血细胞，这样细胞暴露于细胞暴露于细胞溶解剂的时间较短。

自动或半自动光学细胞筛选仪实施方案示于图3，一般以参照符号46表示。光学细胞筛选仪46包括样品制备仪48，它可在需要时除去红血细胞或血小板和加入一个或多个有不同抗体结合其上的不同的中心球组，其中的抗体对可存在于样品中的一种或多种类型的细胞上的不同抗原是特异的。样品制备仪48也最好使样品与中心球混合以便细胞与中心球迅速结合。

然后用载玻片制备仪50将等分试样或一部分制得的样品在载玻片上制成涂片。载玻片制备仪50可以是含有红血细胞的载玻片的常规载玻片制备仪，也可以是用于去除了红细胞的样品的载玻片旋转仪。

然后在染色仪52内给载玻片染色。一旦将载玻片染色后。可立即用光学显微镜54光学观测或分析样品。光学显微镜54可有多个输出端，即供使用者双眼观看的目测输出端56，拍摄细胞和中心球照片用的照相机输出端58，除目测输出端56之外的可供使用者观测用的录像输出端60，从显像输出端60可制得扫描带，和图像分仪机输出端62，它可自动扫描和鉴定细胞的形态及中心球的颜色和/或大小。可使用多种类型的常规图像分析仪，例如Inovision Corp Research Triangle Park，North Carolina销售的图像分析仪和Perceptics Corpora-tion，Knoxville，Tennessee销售的Bio Vision工作台。

对于血液样品，每种生物样品含有至少第一组生物细胞（未示出），包括至少一种白血细胞群体，其具有至少一种可定义的亚型，例如全血样品中或来自全血样品的白血细胞群体。如本文所使用的，白血细胞亚型是特异性单克隆抗体可与之结合的白血细胞群体的亚型。世界卫生组织和国际免疫学学会已为单克隆抗体下了定义。单克隆抗体已用定义细胞或细胞群的特异性的群集标示（CD）命名法定义，这些单克隆抗体对该CD群是特异的。仅作为举例，在下列实施例中使用了7种CD群，即CD2，CD4，CD8，CD10，CD20，CD29和CD34。表Ⅰ中示出了单克隆抗体的命名、特异性和一些商业来源。

表Ⅰ

区分的群抗体特异性

（商业来源）^b

CD2（gp50）^aT11（Coulter） E玫瑰花结受体

OKT11（ortho）;

Leu5a（BD）

CD4（gp56） T4（Coulter）助细胞/诱导剂T

OK4a（ortho）;

Leu3a（BD）

CD8（gp32-33） T8（Coulter）细胞毒性/抑制剂T

OKT8（Ortho）;

Leu2a（BD）

CD10（gp100） J5（Coulter）普通急性淋巴母细胞

抗CALLA（BD）白血病抗原，

前B细胞，

粒细胞

CD14（gp55） MO2，MY4（Coulter）单核细胞，

少数粒细胞

CD20（gp35） B1（Coulter）除血浆细胞外的所有

Leu16（BD） B细胞，B肿瘤细胞

骨髓瘤除外，一些非

T-ALL细胞

CDW29（gp135） 4B4（Coulter）助细胞/诱导剂T

CD34（gp115） HPCA-1（BD）髓样前期细胞

CD41（p130，115）^cPLT-1（Coulter）血小板和巨核细胞

^agp-分子量数千道尔顿的糖蛋白

^bCoulter-Coulter Immunology Division of Coulter Corpora-tion（Hialeah，Florida）

BD-Becton-Dickinson免疫细胞测定系统ortho-ortho诊断系统（Raritan，New Jersey）

^cp-分子量数千道尔顿的蛋白

另外，可举例说明的有二种其它抗体，它们尚无CD命名。一种抗体是N特异性抗体，公开于美国专利4，931，395，题为MONOCLONAL ANTIBOOY SPECIFICTO NEUTROPHILS。第二种抗体是N和E特异性抗体，公开于美国专利4，865，971，题为MONOCLONAL ANTIBODY SPECIFICTO A COMMON DETERMINANT SITE OF NEUTROPHILS AND EOSINOPHILS，在此授引这两篇专利文献作为参考。

所用的磁性中心球可以是任何适宜类型的，在实施例中使用的是直径为0.7和1.3微米，具有10%（重量/体积）固体的聚苯乙烯磁性中心球（Bangs Laboratories of Carmel，Indiana销售的产品）。非磁性中心球也可以是任何适宜类型的，在实施例中使用的是直径1.05，2.17和3.06微米，具有8%（重量/体积）固体的无表面活性剂硫酸化聚苯乙烯胶乳中心球（Inter-facial Dynamics of Protland，Oregon销售的IDC中心球）。

虽然这些特异性中心球用于举例说明，但也可使用其它常规来源的其它类型和大小的中心球。一般说来，最好使用直径为5微米或更小的中心球，因为有多个中心球结合到每个细胞上较好。同样，用较小尺寸的中心球可更好地保持载玻片和细胞的形态。然而，也可使用较大直径的中心球，10微米直径的非磁性中心球已被采用。但在这种情况下，多个细胞将与每个中心球结合，而不是多个中心球与每个细胞结合。

可以看出本发明的方法是足够特异的，单个的中心球即可表明抗原/受体存在于细胞上。然而，为了消除由于重合造成的潜在的假读数，认为只有结合两个或多个中心球的细胞才表明受体存在。一般来说，根据中心球的数目/浓度不同，一个以上的中心球将与每个显示特定抗原/受体的细胞结合。

一般来说，操作步骤如下：

1.将完全混合的全血加到EDTA管中（即试管中已含有EDTA），如果未在EDTA中采血。血液最好在EDTA中采集。

2.从EDTA管中取100μl血液加到试管中。

3.将适量的中心球加到血液中并涡旋混合物大约2-3秒钟。

4.盖上试管并温和混合一段时间以使细胞与中心球结合。已发现大约10分钟就足够了。

5.混合后，取出等分试样，制做血液涂片。涂片应类似于常用于计数差异的外周血涂片。

6.当载玻片完全干燥后，用赖特氏或赖特氏/吉姆萨氏染剂染色，染色方法与常规不同载玻片的染色方法相同。

7.用表明具有与之连接的中心球的细胞的40×或100X物镜在油浸没透镜上观看载玻片。

8.当某种细胞类型与两个或多个中心球牢固结合时可看到定量的阳性结果。细胞群体中特殊抗原的阳性程度可反映在被中心球结合的群体的细胞数目上。

按照总的白细胞计数所建议的中心球与全血之比如下：

Bead体积

白血细胞计数（细胞/μl）（1.17微米中心球的1%试剂溶液）

0-20，000 10μl

20，001-75，000 20ml

大于75，000 30ml

试剂由2um胶乳颗粒在10%牛血清白蛋白中的1%溶液，0.1%叠氮化钠和磷酸盐缓冲的盐水溶液组成。

如果需要排空血小板，则在将血液加到试管（上述步骤2）之前使用下列程序。

1.将200μl EDTA抗凝全血加到试管中。

2.加入20μl磁性PLT-1中心球。

3.混合一段足够的时间以使细胞与中心球结合。已发现15秒至2分钟的时间就足够了。

4.置于磁场中5分钟。

5.除去上清液（从全血中除去具有结合的血小板的中心球）。

6.用于上述步骤2。

图4说明了利用本发明的方法所确定的CD2对淋巴细胞的专一性。许多结合有T11专一性抗体的非磁性中心球64已显示被结合至RBC′S68还未被除去的载玻片上的淋巴细胞上。有一些游离（未结合）的T11中心球64′。嗜中性白细胞70证实了T11中心球64的专一性，因为它们不与嗜中性白细胞70结合。

尽管附图是按照标准的绘图习惯绘制成黑白的，但是实际的染色载玻片是有色的。关于这一点，如同常规，各种细胞的颜色如下：

嗜中性白细胞：细胞质为线粉色且较小，各种颗粒为线粉色至蓝黑色。细胞核为深蓝紫色。

胚细胞：细胞质为蓝色且染色不均匀，细胞核为紫色。

淋巴细胞：细胞质为蓝色，细胞核为深蓝紫色。

嗜曙红细胞：细胞质被染色成红橙色的大型球状颗粒所遮蔽。细胞核为深蓝紫色。

单核细胞：细胞质为蓝灰色，细胞核为深蓝紫色。

嗜碱性细胞：颗粒体为深紫色，细胞核为轻浅的线色。颗粒体遮蔽了细胞质。

红血细胞：细胞为红色，但中部颜色较线。

血小板：细胞为线蓝色，具有较少的蓝色颗粒。

另外，磁性类型的中心球为红棕色，非磁性中心球为白色。这使得细胞和中心球彼此易于区别。根据需要，中心球也可以是产生差异的其它颜色、大小和形状。

图5显示了结合了4B4专一性抗体的许多非磁性中心球72与许多的血小板74结合，而这些血小板似乎是由中心球72团聚在一起。由于4B4专一性抗体如所示的那样与血小板结合并且也将与某些L′S结合，因此在对样品进行4B4型L′S分析前，首先应排空血小板。

图6说明了结合有B1专一性抗体的许多中心球76与存在B细胞CLL的淋巴细胞78结合。中心球76是3μm的中心球，而中心球64和72则是2μm的中心球。该图显示了许多淋巴细胞78上结合了中心球76，暗示了B细胞CLL的存在，因为正常血液中很少有L′S为B1型淋巴细胞。

图7中，淋巴细胞78在另一样品部分中再次与许多中心球80混合，该中心球80上结合了J5专一性抗体。中心球80将与某些类型的CLL结合。因此，中心球80的未结合（已显示两个游离的中心球80连接一个RBC68）则说明淋巴细胞78缺乏J5结合的CALLA。

图8说明的是三种中性白细胞82，每种细胞具有许多的中心球84，其上结合了N和E专一性抗体，如前面所提到的。该图说明了N和E中心球对嗜中性白细胞82的专一性。在每一实例中均对整个载玻片或其大部分进行了测定以证实中心球不与其专一性之外的任何其它WBC′S结合。

图9说明的是两种嗜中性白细胞86，每种细胞上均结合了许多中心球88。中心球88上再次结合有N和E专一性抗体。在此，中心球为磁性，直径相当于1μm，非磁性中心球在载玻片上为白色，磁性中心球的颜色为淡棕色，它能够从颜色上以及大小区别于非磁性中心球。

这一差别在图10中得到最好说明，其中已证实单个嗜中性白细胞90上结合了许多2μm的非磁性白色中心球92，而中心球92上则结合了N专一性抗体（如前所述）。嗜中性白细胞90上也结合了许多1μm磁性淡棕色中心球94，而中心球94上则结合了N和E专一性抗体。从而使得同时鉴定为具有两个或多个感兴趣抗原的特定细胞能够被鉴定。

如图4-10所示，RBC′S通常不被除去。图4-10所示的涂片是通过观察具有所有细胞的血细胞的常规方式制备的。而且，细胞离心能够破坏细胞，尤其是异常细胞的形态，因此是不可取的。但是，当仅存在相当于或低于约1000-2000WBC′S/μl的极低WBC计数时，能够非常容易地除去RBC′S。WBC′S的浓度大大地有助于其观察。应该以最少限度地影响剩余细胞形态的方式除去RBC′S。

一个可取的除去RBC′S的方式是向样品中加入溶解液，然后再加入终止液。优选的溶解液可以是浓度约为0.21%（w/v）的柠檬酸-水合物与浓度约为0.02%（w/v）的皂素的混合物。优选的终止液可以是浓度约为2.9%（w/v）的氯化钠与浓度约为0.59%（w/v）的碳酸氢钠的水溶液。推荐使用制菌剂，如浓度约为0.01%（w/v）的叠氮化钠，但它并不需要在溶解液和终止液中同时使用。

一般来说，利用上述溶解液和终止液时，其方法如下：

1.向试管中加入100μl EDTA全血。

2.向血液中加入适当量的中心球，如40μl浓度为2×10⁷/ml的中心球。

3.温和地混合足够时间，如约10-30分钟，使细胞与中心球结合。

4.取出35ml混合物，加至12×75mm的试管中。

5.加入500μl溶解液并轻微涡动。

6.迅速加入250μl终止液。

7.保温约1分钟。

8.根据需要，加入100ml 5%BSA于PBS中的缓冲液。

9.将400ml混合物加至细胞离心装置中，并以500rpm的转速旋转5分钟以将细胞转至载玻片上。

10.步骤10与第19页上所述方法的步骤6-8相同。

也可利用前面所述的磁性中心球除去RBC′S。

图11显示的是排除了除WBC′S之外的所有细胞的细胞离心载玻片。除去可能存在的RBC′S并根据需要除去其它细胞，然后将剩余的细胞旋转离心至载玻片上以浓缩细胞，并除去过量的水分。这有助于观察所需细胞，由于这类细胞在全血样品中的数量相对较少，因此难以定位。图11证实许多中心球96上结合了T11专一性抗体，该中心球96与三种淋巴细胞98结合，但它不与嗜中性白细胞100或单核细胞102结合，这后两种细胞也暴露于中心球96。

图12是通过细胞离心制得的另一个载玻片，它说明许多中心球104上结合了N和E专一性抗体，该中心体104与数个嗜中性白细胞106结合但不与单核细胞108结合。

尽管通过特定的实例说明了通过大小和颜色区别的中心球的使用，但也可通过它们所具有的不同形状区别中心球。

在本发明的实施过程中还观察到两个另外的现象，即装边和载玻片凝集。这两种现象均称作细胞团集。装边现象发生在具有大量的对特定抗原阳性的细胞的全血样品中。该现象是全血与中心球在反应容器（如试管）中混合或保温的过程中被观察到的。阳性细胞和中心球趋向于沿全血外表面凝集，在试管上形成一个细微的边。该边仅可在阳性样品中见到。在显微镜载玻片上也可观察到类似的凝集现象。将一滴全血加到载玻片上并通过轻轻振动载玻片将其与一滴包衣了抗体的乳汁珠混合，就可在含有大量的对相应的特定抗原阳性的细胞的样品中观察到肉眼可见的凝集现象。该凝集现象在载玻片上表现为在红血背景下的白色团块，肉眼可见。

这些凝集反应能够在适宜的条件下提供一个快速筛选高WBC数的方法。利用每微升约为或高于40-50，000个细胞的总WBC细胞数（正常WBC细胞的范围为4-11，000个/μl）已观察到这些现象。尽管无需借助其它装置就可用肉装观察到细胞团聚，但仍可利用手动或自动操作的显微镜装置或其它光学仪器。另外，也可通过用光束对混合容器进行手动或自动光学扫描而用肉眼观察到装边现象，当发生装边现象时光束会产生衍射图案。

图13说明许多中心球110上结合了第二反应物，该第二反应物与第一反应物结合，而第一反应物反过来又与细胞112上的特定分子结合。在这种情况下，该细胞表达与第一反应物相结合的CD34抗原。第一反应物，如HPCA-1不易以直接与中心球110结合的适宜浓度得到。因此，将第二反应物（这里是山羊抗鼠抗体）与中心球结合。该第二反应物将与任何鼠抗体结合，因此中心球110将与结合到细胞112上的中心球上的第一反应物结合。与第二反应物结合的第一反应物和中心球110也将同时与样品结合在一起。或者，可将第一反应物与中心球110上的第二反应物结合，然后，与第二反应物结合并且也与第一反应物结合的中心体110将通过第一反应物而与样品结合。单独与细胞112结合而无中心球110的第一反应物则不能通过肉眼或显微镜加以区别。

一般来说，第一种方法的步骤如下：

1.步骤1与第19页上所述方法的步骤1和2相同。

2.加入10μl的第一反应物，并且涡动混合物约2-3秒钟。

3.将混合物保温约10分钟。

4.加入10μl其上结合了第二反应物的中心球。

5.步骤5与第19页上所述方法的步骤4-8相同。

图5-12所述的其它类型方法也可用在图13所述的反应物结合类型上。可向第二样品部分中加入具有不同反应物的其它组中心球，这些中心球具有区别于彼此的不同大小和/或颜色。也可在第一样品部分中将具有不同反应物的一套或多套中心球与第一和第二反应物结合。但是，在这一方法中其它反应物必须是不同于第二反应物的其它类型，否则中心球也将与第二反应物结合。例如，当第二反应物是抗鼠抗体时，其它反应物可以是猪、兔或其它不同类型的抗体。

利用图13所述的不同方法的目的是为了确定各种方法的效果。第一个例子是，通过温和涡动将5μlT4抗体加到100μl全血中。将该混合物静置或保温10分钟。保温之后，加入10μl中心球，轻轻涡动并在滚筒式振荡器上混合10分钟，然后按照前述方法制除片。其结果是中心球与L′S的正常结合，两个实例分别为37%和44%。

在第二个例子中，是将中心球和T4抗体同时加入，并在滚筒上振荡10分钟，然后制成载玻片。其结果是两个实例的百分数分别下降为28和31。

在第三个例子中，是在无任何抗体的情况下加入中心球并混合，然后制成载玻片。在此例中，正如所料，未发现中心球与细胞结合。

在另一例子中，是将T4抗体与样品在滚筒中振荡10分钟，然后加入中心球并混合10分钟，最后制成载玻片。它产生正常的百分数36。

在最后一个例子中，是将中心球与T4抗体一起混合并静置10分钟。然后将该混合物加至样品部分并混合10分钟，最后制成载玻片。得到较低的百分数23和27。一种解释是混合物中剩余的部分游离抗体封闭了中心球所要结合的某些位点。

图14显示的是骨髓样品中的几个嗜中性白细胞114，每个细胞上均结合了许多中心球116。中心球116上结合了N专一性抗体。该例子说明了该方法对除血液之外的其它类型液体（这里是骨髓）的效力。

现参照图15-18说明本发明实施方案。

图15示出了本发明第一光学细胞计数实施方案，示为参考号120。光学细胞计数器120包括生物样品122，含至少第一组生物细胞（未示出），如在或来自全血样品中。

样品122经管线124与至少一种经管线128送入的反应物126混合。反应物126可包括螯合剂，如标准EDTA作为抗凝血剂加入样品122中并阻止嗜中性血细胞（N′s）吞食中心球。

反应物126也包括多组或第一组中心球，其具有对可存在于与之结合的至少一种类型的细胞上的特定抗原有专一性的抗体。对于血液，细胞可表达可与一种或多种特异性抗体结合的抗原。一般来说，抗原是抗体可与之结合的分子，因此对于血液或其它活细胞，反应可被规定为第一种类型的分子与第二种类型的分子特异地进行化学反应。然后合并的样品122和反应物126最好用按功能命名的混合台130进行混合。

然后将特定体积的生物样品122和反应物的混合物与特定体积的溶解剂混合以用RBC清除台132去除RBC′s。特定体积的样品混合物和溶解剂可手工或自动混合，如可见于上述S.N.517，309。

溶解混合物置于载玻片134上，不进行猝灭。载玻片134可为血细胞计数器，其中将溶解混合物分配在已知体积的大量室中（见图16）。载玻片134再在光学分析仪136，如常见的光学显微镜中进行光学观测。对多个或所有室中已结合了中心球的目标细胞进行计数并将其与已知样品体积并联起来而得绝对细胞数。不结合中心球，对细胞的光学观测就不可能鉴定各细胞亚类。例如，CD4阳性L看起来正好与CD4阴性L相同。因此没有中心球与之结合的特异性单克隆抗体的选择性结合，就不可能实现光学亚类辩别。

对于任何要求细胞，绝对细胞数均可为群体或亚类群体，如一或多个WBC亚类群体，通过其中专一性地结合一或多个与中心球结合的抗体即可将其区别。例如，在AIDS病人中，CD4细胞群体中的绝对细胞数对于诊断和治疗均很重要。若怀凝血液带AIDS病毒，可将一种固定液加入样品混合物中以在例如台132上杀灭病毒，固定液例如可为多聚甲醛。

而且，可将物理及光学上不同于第一组中心球的第二组中心球加入样品混合物中。例如，在获得CD4绝对细胞数时，L′s和M′s均存在CD4抗原。若第一组中心球得以正确滴定，则M′s就不会结合有中心球。所用滴定方法中要求群体，这时为L′s具有比次要或非要求群体，如M′s更大或更高的亲和性。但是，实际上很难可靠地依赖于此。为保证M′s不被计数，第二组中心球中首先可加入只对M′s具有专一性的单克隆抗体，如CD14，以阻止将T4阳性M′s不正确计数为T4阳性L′s。两组中心球可在例如尺寸，形状或颜色方面不相同以易于相互光学区分开。

现参照附图16A和16B，其中清楚地示出了常见血细胞计数器室138，可以此构成载玻片134的计数室。在常见细胞计数器中，可有9个格栅或小段，但只有角段140-46可用于计数WBC′s，当然中心段148可用来计数RBC′s和/或血小板。载玻片134上一般可双份形成室138并且该室可包括溢流井和进料槽（未示出）。

室138可包括基板150（图16B），由光学透明材料制成，如为玻璃或塑料，其中可包括多个侧壁152，定义出中心区154，在该区上形成9个格栅，包括格栅或区段140-148。壁152顶上放玻璃盖156即完成载玻片134，之后投入待计数样品。

一般来说，为了按本发明得到绝对细胞数，可采用如下方法：

1.若不是用EDTA采集，则将充分混合的全血加入EDTA管，优选的是血液用EDTA采集。

2.将100ul血液从EDTA加入试管。

3.若具有仅对WBC亚类具有专一性的抗体的WBC亚类进行计数，则可加入抗体结合的中心球并与样品混合物混合约2分钟。优选的是，若WBC亚类受阻，例如M′s受阻，则先加入MY4结合的中心球并与混合物混合约2分钟，然后再加入T4或其它WBC亚类抗体结合的中心球并与混合物再混合约2分钟。

4.将特定体积的样品和中心球混合物与特定体积的溶解剂，如2%乙酸相加，稀释比为1比10。例如，应用10ul样品混合物结合90ul酸。

5.混合（手工或自动），时间不超过10秒。

6.向血细胞计数器中投入特定体积的溶解样品混合物，已精确稀释，如用UNOPETTE，制造商为Bector-Dickinson of Rutherford，New Jersey。加入血细胞计数器的样品混合物体积是以填充上述室，而又不出现溢流。

7.光学观测一或多个格栅中的细胞并对结合有中心球的细胞计数而得与特定体积关联的细胞数并校正而得绝对细胞数。原血样品稀释情况可确定获得要求细胞数的倍增数。

可用装有合适镜片，如40×物镜的适宜光学显微镜计数细胞。该方法中必要时可在步骤6之后或之间加适当固定液以保证杀灭HIV（AIDS）病毒。合适的固定液可为多聚甲醛。

本文中“绝对细胞数”指单位体积，本例中1ml全血样品中的数，稀释情况在最终计数得到时考虑进去。

若想得到绝对CD4细胞数，就必须采取额外的步骤。如上所述，M′s也包括CD4抗原。上述M′s可经适当滴定去除，以使中心球不会与M′s结合，其中考虑M′s上的中心球数或用第二组结合有M特异性抗体的中心球标记M′s，这些中心球可在大小，颜色或形状方面与CD4中心球区分开。

虽然在标准的血细胞计数器中仅用了血细胞计数室138的一些格栅或分段140-148，但CD4计数太低，因此不能应用该技术。在用AIDS样品时，尤其是如此。在正常的血液样品中有大约5000WBC′s/ml。若所有9个格栅均计数，则有十分之一（0.1）ml样品得以计数或有约500WBC′s（约55WBC′s/格栅或小段）。在5000WBC′s/ml中，仅有约1500是L′s，其中约800为T4阳性的。对于正常血液样品，这意味着在总的格栅中有约80T4阳性细胞或约8T4阳性细胞/区段。

在AIDS样品中T4阳性细胞可达到约400或更少/ml，因此仅有约40或更少/整个血细胞计算器138，并且仅有4或更少/区段。虽然图16A和16B仅示出一个室138，但典型的血细胞计数器包括一对室138。为确认这一小数目，两室对十分二（0.2）ml体积进行计数，即将细胞数加倍。而且血细胞计数器138井可做得更深以加大计数体积。肩部或壁152可做得尽可能高，其中仍可使细胞沉降并得以计数，例如达到2-4倍高，使计数体积再加大以加强总的低计数。

另一可进行，但只在必要时才进行的步骤是将载玻片上的细胞染色，这可提高细胞的可区分性并因而强化要求计数。染色可为例如Genetian或Grystal Violet，在乙酸中进行0.025%稀释，优选还加入溶解剂。必要时可单独进行染色。

还可进行现有技术中一般性或参考性方法以对上述方法进行检查，为此可进行手工操作。参考方法如下：

1.获得EDTA全血样品。

2.用例如Coulter STKS仪器确定总的WBC计数和差别。

3.确定为T4阳性的淋巴细胞百分数。

a.将100ul全血转入12×75mm试管。

b.加10ul Coulter Cyto-stat T4RD1/T8FITC（两色）试剂和涡进行混合。

c.将混合物培养5-10分钟。

d.用Coulter Q-prep将T4RDI/T8FITC溶解，急冷并固定。

e.用铝盖闸将淋巴细胞群体圈起来后在Coulter Profile上分析染色样品。

4.用上述数据计算绝对T4淋巴细胞数：

WBC数×%淋巴细胞×%T4+淋巴细胞。

如下表Ⅱ和Ⅲ中分别讨论了上面提出的方法和对照方法的比较结果，其中在CD4计数时如上述使M′s受阻，该例中用T4作为特异性抗体：

在表Ⅱ和Ⅲ中，CT为计数，AVG为平均值，SD为标准偏差，CV为SD/AVG。

表Ⅳ表明了CD4阳性计数的差异，其中对M′s进行或不进行阻止或闸闭。

表Ⅳ

样品鉴别 T4数（未阻止） T4数（阻止）

T4数对照T4数 T4数对对照T4数

28522 1010 1140 860 710

29968 1650 1999 1310 1450

49666 1200 1330 1000 960

另一获得绝对计数的方法是应用母申请的染色载玻片技术来校准未阻止CD4计数。按照本发明，不阻止M′s而将所有CD4阳性细胞计数而得CD4数。然后光学鉴别T4阳性L′s和T4阳性M′s数目，其中在单独的载玻片的涂片上进行（因为母申请所述染色为组织学染色，用以光学区别细胞种类，如L′s和M′s）。之后可用T4L′s/T4M′s之比校正用未阻止M样品技术按本发明所得T4阳性细胞数。

而且，若不应计数，但可用相同单克隆抗体标记的细胞可去除，而同时又不会去除任何非专一性细胞，或去除细胞恰好与应去除细胞百分数（数目）相同，就可直接得到绝对数，这就是直接计数。

图17示出了多个结合有CD8特异性抗体再与L′s162结合的非磁性中心球，这是仅与目标细胞，这里为L′s162结合的抗原例子。CD8阴性或未标记细胞164也一同示出了。在母申请所述载玻片上，细胞平化并因此可通过形态用组织学染色而区分开。在本发明中，图17和18所示载玻片示出了三个方向流动细胞。染色仅仅促使细胞背景和中心球间进行区分。载玻片，细胞和中心球为浅桃红色或紫色的各种色调。因此，在本发明载玻片上，甚至可在细胞类型，如L′s和M′s间将细胞区别开。而且，必须应用中心球将细胞和细胞亚类区别开（而用母申请技术就不能将这些亚类区分开）。

现参照图18，结合有CD4特异性抗体的多个非磁性中心球170与L′s162结合。但是，在这种情况下，由于CD4特异性抗体也与M′sCD4结合，这导致不正确的CD4L亚类计数，所以先将结合有CD14特异性抗体的第2组或多组非磁性中心球172与M′s174结合以阻止CD4特异性抗体中心球与之结合。同时示出了一对CD4和CD14阴性或未标记细胞176和178。在图17和18中，中心球160和170为2um中心球。在图17中，中心球170和172必须可光学区分开，因为细胞不能光学区分;所以说中心球172为半（0.5）um中心球。在L′s162和M′s174的情况下，一旦结合了中心球，细胞本身就部分或完全变暗。而且，虽然图17中未示出，但中心球172并不总是阻止所有CD14抗原，因此M′s174也可能结合中心球170和172。

上面表Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ提到的实施例以及其它实施例中（图17和18）均源于所谓正常的血液样品（即非-AIDS/未染病）。数个AIDS样品也按本发明进行了分析，其中可清楚地看出可得到基本上少于400的绝对T4计数。因此，本发明提出的方法看来对染病血液样品，如AIDS也同样有效。

尽管本发明主要目标在于获得一或多个绝对WBC亚类（或亚型）计数，但本发明也可得到多份WBC差异/绝对数。在这种情况下，血液样品的一或几部分如上处理，每一样品得到一或多个数。然后将各细胞数进行比较而得多份差别/绝对数。例如，4份WBC差别/绝对数可用全血样品如下获得：

1.将CD14专一性抗体（如MY4）结合的中心球加入第一份样品而得M数。

2.将N专一性抗体（如1D3）结合的中心球加入第二份样品而得N计数。

3.将E特异性抗体或N和E专一性抗体（如KC-48）结合的中心球加入第三份样品中而得E计数，可直接得到或用N和E计数减去N计数而得。

4.在样品份数或第4份样品中计数总的WBC′s并从总计数中减去上述M′s，N′s和E′s而得L计数（实际上为L′s和B′s）。

虽然实施例应用3或4份样品，便也可结合光学不同组中心球来实现2份样品的差异/绝对数。例如，可在一份样品中进行N和M计数，N和M各组中心球在大小，形状和/或颜色方面光学不同。原则上讲，在单份样品中可进行所有计数。而且，B′s一般是很不明显的，总起来少于WBC′s的1%。适宜的L或B专一性抗体可获得整个5份WBC差别/绝对数。

现有技术的载玻片/血液涂片技术可通过显微镜在涂片上将不同的M′s，N′s，L′s，E′s和B′s确定并计数而得5份差别。但是，这要求在细胞形态学方面受过训的技术人员，甚至有时还难于在某些细胞之间进行测定。而且，应用图像分析仪的自动仪器也许不能在有些细胞之间进行区分。此外，应用涂片技术不可能得到绝对计数。在本发明之中，可得到绝对亚类细胞计数并且可得到M′s，N′s和E′s的绝对差异计数，然后可用总的WBC′s计算L′s（包括B′s）。由于必然得到已结合中心球（或不同中心球）的那些细胞的计数，而不管细胞形态如何，所以图像分数仪或未受过训的技术人员更易于获得要求计数。

Claims

1、光学筛选和计数显微细胞的方法，其特征在于：

提供包括多个细胞的样品；

将至少第一部分细胞与至少第一组其上结合有对至少第一类存在于至少一类细胞上的特异性分子具有专一性的至少第一反应物的中心球混合形成样品混合物；

将特定体积的样品混合物涂到载玻片上；

用显微镜观测至少某些细胞以至少鉴定并至少计数结合了第一组中心球的细胞存在数；以及

将该细胞数与该特定体积关联起来而得绝对细胞数。

2、权利要求1的方法，其特征还在于提供包括至少一种WBC群体的全血样品或其一部分。

3、权利要求2的方法，其特征还在于第一反应物为对至少第一种为第一细胞抗原的特异性分子具有专一性的抗体。

4、权利要求2的方法，其特征还在于将螯合剂加入样品以防止嗜中性白细胞群体吞食中心球。

5、权利要求2的方法，其特征还在于在将样品混合物涂到载玻片上之前从样品中去除RBC群体。

6、权利要求6的方法，其特征还在于将第一部分细胞与至少第二组其上结合有对至少第二类存在于至少一类细胞上的特异性分子具有专一性的至少第二类反应物的中心球混合，第二组中心球具有不同于第一组中心球的光学特性，然后用显微镜光学观测至少一些细胞以至少鉴别是否存在结合有第二组中心球的细胞。

7、权利要求6的方法，其特征还在于同时将至少第一部分细胞与至少第一和第二组中心球混合。

8、权利要求6的方法，其特征还在于第一和第二组中心球在大小上存在着物理差异。

9、权利要求6的方法，其特征还在于第一和第二组中心球在颜色上存在着光学差异。

10、权利要求6的方法，其特征还在于第一和第二组中心球顺序加入。

11、权利要求10的方法，其特征还在于先加入第二组中心球。

12、权利要求1的方法，其特征还在于将第一部分细胞与第一组中心球混合。

13、权利要求2的方法，其特征还在于提供全血样品或其一部分，第一反应物为对至少第一类为第一细胞抗原的特异性分子具有专一性的抗体。

14、权利要求13的方法，其特征还在于在将样品混合物涂到载玻片上之前从样品中去除RBC群体。

15、权利要求14的方法，其特征还在于第一抗体为CD8专一性单克隆抗体，计数结合有CD8中心球的细胞，得CD8绝对数。

16、权利要求14的方法，其特征还在于第一抗体为CD4专一性单克隆抗体，计数结合有CD4中心球的细胞，得CD4绝对数。

17、权利要求16的方法，其特征还在于将第一部分细胞与其上结合有对至少第二类存在于至少一类细胞上的特异性抗原具有专一性的至少第二抗体的第二组中心球混合，第二组中心球具有不同于第一组中心球的光学性能，然后用显微镜光学观测至少某些细胞以至少鉴别是否存在结合有第二组中心球的细胞。

18、权利要求17的方法，其特征还在于第二抗体为CD14抗体。

19、权利要求17的方法，其特征还在于在光学观测细胞之前去除结合有第二抗体的细胞。

20、权利要求17的方法，其特征还在于第一和第二组中心球顺序加入。

21、权利要求20的方法，其特征还在于先加入第二组中心球。

22、权利要求1的方法，其特征还在于将载玻片上细胞混合物中的细胞进行染色以提高细胞的光学区别性。

23、光学筛选和计数显微细胞的仪器，其特征在于其中包括：

提供包括多个细胞的样品的装置;

将至少第一部分细胞与至少第一组其上结合有对至少第一类存在于至少一类细胞上的特异性分子具有专一性的至少第一反应物的中心球混合而形成样品混合物的装置;

将特定体积样品混合物涂到载玻片上的装置;

用显微镜观测至少某些细胞以至少鉴别并至少计数结合了第一组中心球的细胞存在数的装置;以及

将该细胞数与该特定体积关联起来以得到绝对细胞数的装置。

24、权利要求23的仪器，其特征还在于其中包括提供包括至少一类WBC群体的全血样品或其一部分的装置。

25、权利要求24的仪器，其特征还在于第一反应物为对至少第一种为第一细胞抗原的特异性分子具有专一性的抗体。

26、权利要求24的仪器，其特征还在于其中包括将螯合剂加入样品以防止嗜中性白细胞群体吞食中心球的装置。

27、权利要求24的仪器，其特征还在于其中包括在将样品混合物涂到载玻片上之前从样品中去除RBC群体的装置。

28、权利要求23的仪器，其特征还在于其中包括将第一部分细胞与至少第二组其上结合有对至少第二类存在于至少一类细胞上的特异性分子具有专一性的至少第二类反应物的中心球混合的装置，第二组中心球具有不同于第一组中心球的光学特性，以及用显微镜光学观测至少一些细胞以至少鉴别是否存在结合有第二组中心球的细胞的装置。

29、权利要求28的仪器，其特征还在于其中包括同时将至少第一部分细胞与至少第一和第二组中心球混合的装置。

30、权利要求28的仪器，其特征还在于第一和第二组中心球在大小上存在着物理差异。

31、权利要求28的仪器，其特征还在于第一和第二组中心球在颜色上存在着光学差异。

32、权利要求28的仪器，其特征还在于其中包括将第一和第二组中心球顺序加入的装置。

33、权利要求32的仪器，其特征还在于其中包括先加入第二组中心球的装置。

34、权利要求23的仪器，其特征还在于其中包括将第一部分细胞与第一组中心球混合的装置。

35、权利要求24的仪器，其特征还在于其中包括提供全血样品或其一部分的装置，第一反应物为对至少第一类为第一细胞抗原的特异性分子具有专一性的抗体。

36、权利要求35的仪器，其特征还在于其中包括在将样品混合物涂到载玻片上之前从样品中去除RBC群体的装置。

37、权利要求36的仪器，其特征还在于第一抗体为CD8专一性单克隆抗体，计数结合有CD8中心球的细胞，得CD8绝时数。

38、权利要求36的仪器，其特征还在于第一抗体为CD4专一性单克隆抗体，计数结合有CD4中心球的细胞，得CD4绝对数。

39、权利要求38的仪器，其特征还在于其中包括将第一部分细胞与其上结合有对至少第二类存在于至少一类细胞上的特异性抗原具有专一性的第二抗体的第二组中心球混合的装置，第二组中心球具有不同于第一组中心球的光学性能，以及用显微镜光学观测至少某些细胞以至少鉴别是否存在结合有第二组中心球的细胞的装置。

40、权利要求39的仪器，其特征还在于第二抗体为CD14抗体。

41、权利要求39的仪器，其特征还在于其中包括在光学观测细胞之前去除结合有第二抗体的细胞的装置。

42、权利要求39的仪器，其特征还在于其中包括第一和第二组中心球顺序加入的装置。

43、权利要求20的仪器，其特征还在于其中包括先加入第二组中心球的装置。

44、权利要求23的仪器，其特征还在于其中包括将载玻片细胞混合物中的细胞进行染色以提高细胞的光学区别性的装置。

45、光学筛选和计数显微细胞的方法，其特征在于：

提供包括多个细胞的样品;

将至少一部分细胞与多组光学不同且每组上结合有对至少第一类存在于至少一类细胞上的特异性分子具有专一性的至少一类不同的反应物的中心球组合形成样品混合物;

将特定体积样品混合物涂到载玻片上;

用显微镜观测至少某些细胞以至少鉴别并至少计数其上每组中心球与不同的反应物结合的细胞存在数;以及

将该细胞数与总数关联起来以得到多份细胞差别。

46、权利要求45的方法，其特征还在于提供至少包括多种WBC群体的全血样品或其一部分。

47、权利要求46的方法，其特征还在于每一不同的反应物为对至少第一种为第一细胞抗原的特异性分子具有专一性的抗体。

48、权利要求46的方法，其特征还在于将螯合剂加入样品以防止嗜中性白细胞群体吞食中心球。

49、权利要求46的方法，其特征还在于在将样品混合物涂到载玻片上之前从样品中去除RBC群体。

50、权利要求48的方法，其特征还在于将不同样品部分中的至少某些不同组中心球混合而形成单独的样品混合物并单独观测和计数每一份而形成多份细胞差别。

51、权利要求45的方法，其特征还在于各组中心球在大小上存在着物理差异。

52、权利要求45的方法，其特征还在于各组中心球在颜色上存在着光学差异。

53、权利要求45的方法，其特征还在于将部分细胞与各组中心球混合。

54、权利要求46的方法，其特征还在于提供全血样品或其一部分，每一反应物均为对至少第一类为不同的WBC′s上的第一细胞抗原的特异性分子具有专一性的抗体。

55、权利要求54的方法，其特征还在于在将样品混合物涂到载玻片上之前从样品中去除RBC群体。

56、权利要求55的方法，其特征还在于抗体至少为N，E和M专一性单克隆抗体，将结合了每一不同组中心球的细胞计数并得4份差别。

57、权利要求45的方法，其特征还在于将载玻片上细胞混合物中的细胞进行染色以提高细胞的光学区别性。

58、光学筛选并计数显微细胞的仪器，其特征在于其中包括：

提供包括多个细胞的样品的装置;

将至少一部分细胞与多组光学不同且每组上结合有对至少第一类存在于至少一类细胞上的特异性分子具有专一性的至少一类不同的反应物的中心球组混合形成样品混合物的装置;

将特定体积样品混合物涂到载玻片上的装置，

用显微镜观测至少某些细胞以至少鉴定并至少计数其上每组中心球与不同反应物结合的细胞存在数的装置;

以及将该细胞数与总数关联起来以得到多份细胞差别的装置。

59、权利要求58的仪器，其特征还在于其中包括提供至少包括多种WBC群体的全血样品或其一部分的装置。

60、权利要求59的仪器，其特征还在于每一不同的反应物为对至少第一种为第一细胞抗原的特异性分子具有专一性的抗体。

61、权利要求59的仪器，其特征还在于其中包括将螯合剂加入样品以防止嗜中性白细胞群体吞食中心球的装置。

62、权利要求59的仪器，其特征还在于其中包括在将样品混合物涂到载玻片上之前从样品中去除RBC群体的装置。

63、权利要求58的仪器，其特征还在于其中包括将不同样品部分中的至少某些不同组中心球混合而形成单独的样品混合物并单独观测和计数每一份而形成多份细胞差别的装置。

64、权利要求58的仪器，其特征还在于各组中心球在大小上存在着物理差异。

65、权利要求58的仪器，其特征还在于各组中心球在颜色上存在着光学差异。

66、权利要求58的仪器，其特征还在于其中包括将部分细胞与各组中心球混合的装置。

67、权利要求59的仪器，其特征还在于其中包括提供全血样品或其一部分的装置，每一反应物均为对至少第一类为不同的WBC′s上的第一细胞抗原的特异性分子具有专一性的抗体，

68、权利要求67的仪器，其特征还在于其中包括在将样品混合物涂到载玻片上之前从样品中去除RBC群体的装置。

69、权利要求68的方法，其特征还在于抗体至少为N，E和M专一性单克隆抗体，将结合了每一不同组中心球的细胞计数并得4份差别。

70、权利要求58的仪器，其特征还在于其中包括将载玻片上细胞混合物中的细胞进行染色以提高细胞的光学区别性的装置。