JP4659146B2 - 血液分析装置及び血液分析方法 - Google Patents
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Description
本発明は、血液検体を光学的に測定し、血液検体に含まれる血球を複数に分類する血液分析装置及び血液分析方法に関する。
健常人の末梢血液の白血球には、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球の種類がある。リンパ球はさらにサブセットと呼ばれる３種類（Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫリンパ球）に大別される。
Ｂリンパ球は、骨髄由来のリンパ球で、表面に免疫グロブリンを持つ。Ｂリンパ球は、形質細胞に分化し抗体を産生するなど、人体の免疫機能において非常に重要な役割を果たしている。また、Ｔリンパ球は、胸腺由来のリンパ球で、表面に免疫グロブリンを持たない。Ｔリンパ球は、免疫系の調節に重要な役割を果たしており、Ｔリンパ球の障害は、免疫不全、自己免疫、アレルギー及び増殖性免疫疾患が多発することが知られている。
上述のように、Ｂリンパ球及びＴリンパ球は、免疫機構に強く関わっている。そのため、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の増減を確認することで、免疫機能の変化を把握することができる。また、Ｂリンパ球及びＴリンパ球は一定の比率で存在するが、疾患の存在により変動することがある。そのため、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の比率を測定することで、疾患の存在について、有用な情報を得ることができる。
Ｂリンパ球の増加を示す疾患としては、多発性骨髄腫、Ｂリンパ球性慢性リンパ性白血病、伝染性単核球症、及びバーキットリンパ腫などがあげられる。Ｂリンパ球が減少する疾患としては、ＡＩＤＳ、進行癌、ホジキンリンパ腫、無リンパ球性低免疫グロブリン血症、無免疫グロブリン血症、細網異形性症、麻疹、水痘、及びヘルペスなどがあげられる。
Ｔリンパ球の増加を示す疾患としては、ＡＴＬ、セザリー症候群、伝染性単核症及び無免疫グロブリン血症などがあげられる。Ｔリンパ球が減少する疾患としては、ＡＩＤＳ、進行癌及び無リンパ球性低免疫グロブリン血症などがあげられる。
フローサイトメトリーを用いた白血球の分類方法として、カチオン性界面活性剤及びノニオン性界面活性剤を含む溶血剤と、核酸を染色する蛍光色素で血液試料を処理することで、白血球を５つに分類計数する方法が開示されている（特許文献１）。しかしながら、特許文献１には、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の測定について、全く記載されていない。
なお、リンパ球の分類・計数を行う技術として、蛍光標識抗体を用いて標識したリンパ球を、フローサイトメトリーを用いてリンパ球の分類・計数することが既に知られている（特許文献２）。
しかしながら、上記特許文献２に開示されている技術では、高価な蛍光標識抗体を測定に使用する必要があり、測定コストが嵩み、また操作が煩雑であり測定に時間がかかるという問題がある。
本発明は、高価な蛍光標識抗体を用いることなく、Ｂリンパ球及びＴリンパ球に関する情報を取得することが可能な血液分析装置及び血液分析方法を提供することを目的とする。
即ち、本発明の一の態様の血液分析装置は、血液検体を供給する血液検体供給部と、前記血液検体供給部から供給された血液検体と、溶血剤と、核酸を染色する蛍光色素とを混合して、蛍光標識抗体を用いることなく測定試料を調製する試料調製部と、前記試料調製部により調製された測定試料に光を照射する光源と、前記光源により光が照射された測定試料から発せられる蛍光を検出する第１検出器と、前記光源により光が照射された測定試料から発せられる散乱光を検出する第２検出器と、前記第１検出器により検出された蛍光の強度及び前記第２検出器により検出された散乱光の強度に基づいて、リンパ球の蛍光強度の粒度分布に関する指標を取得し、取得されたリンパ球の蛍光強度の粒度分布に関する指標に基づいて、Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率に関する情報を取得する情報処理部と、前記情報処理部によって取得されたＢリンパ球数とＴリンパ球数との比率に関する情報を出力する出力部と、を備える。
この態様において、前記情報処理部は、前記Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率に関する情報として、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の総数に対するＢリンパ球数の比率を示す値、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の総数に対するＴリンパ球数の比率を示す値、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の総数に対するＢリンパ球数の比率が所定の範囲に属することを示す情報、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の総数に対するＴリンパ球数の比率が所定の範囲に属することを示す情報、又はＴリンパ球数とＢリンパ球数との比率の異常の有無を示す情報を取得するように構成されていてもよい。
上記態様において、前記情報処理部は、前記リンパ球の蛍光強度の粒度分布に関する指標として、リンパ球の蛍光強度の代表値を取得し、取得された前記代表値に基づいて、Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率に関する情報を取得するように構成されていてもよい。
上記態様において、前記情報処理部は、前記リンパ球の蛍光強度の粒度分布に関する指標として、リンパ球の蛍光強度の散布度を取得し、取得された前記散布度に基づいて、Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率に関する情報を取得するように構成されていてもよい。
上記態様において、前記情報処理部は、前記リンパ球の蛍光強度の粒度分布に関する指標として、リンパ球の蛍光強度の分布の偏りを示す値を取得し、取得された前記分布の偏りを示す値に基づいて、Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率に関する情報を取得するように構成されていてもよい。
上記態様において、前記情報処理部は、前記分布の偏りを示す値として、リンパ球の蛍光強度の分布の尖度又は歪度を取得し、取得された前記尖度又は歪度に基づいて、Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率に関する情報を取得するように構成されていてもよい。
上記態様において、前記情報処理部は、前記リンパ球の蛍光強度の粒度分布に関する指標を所定の閾値と比較することにより、Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率が異常であるか否かを判定するように構成されており、前記出力部は、前記情報処理部によりＢリンパ球数とＴリンパ球数との比率が異常であると判定された場合に、前記Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率に関する情報として、Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率が異常であることを示す情報を出力するように構成されていてもよい。
上記態様において、前記情報処理部は、前記リンパ球の蛍光強度の粒度分布に関する指標に基づいて、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の総数に対するＢリンパ球数の比率を示す値を取得し、取得された前記値を所定の閾値と比較することにより、Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率が異常であるか否かを判定するように構成されており、前記出力部は、前記情報処理部によりＢリンパ球数とＴリンパ球数との比率が異常であると判定された場合に、前記Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率に関する情報として、Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率が異常であることを示す情報を出力するように構成されていてもよい。
上記態様において、前記情報処理部は、前記リンパ球の蛍光強度の粒度分布に関する指標に基づいて、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の総数に対するＴリンパ球数の比率を示す値を取得し、取得された前記値を所定の閾値と比較することにより、Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率が異常であるか否かを判定するように構成されており、前記出力部は、前記情報処理部によりＢリンパ球数とＴリンパ球数との比率が異常であると判定された場合に、前記Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率に関する情報として、Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率が異常であることを示す情報を出力するように構成されていてもよい。
上記態様において、前記情報処理部は、前記第１検出器により検出された蛍光の強度及び前記第２検出器により検出された散乱光の強度に基づいて、前記測定試料に含まれるリンパ球を他の白血球から区別し、リンパ球の蛍光強度の粒度分布に関する指標を取得するように構成されていてもよい。
上記態様において、前記情報処理部は、前記測定試料に含まれるリンパ球を他の白血球から区別することにより白血球を分類するように構成されており、前記出力部は、前記情報処理部による白血球の分類結果を出力するように構成されていてもよい。
上記態様において、前記情報処理部は、前記測定試料に含まれる白血球を、リンパ球を含む少なくとも４つの集団に分類するように構成されていてもよい。
上記態様において、前記試料調製部は、前記血液検体供給部から供給された血液検体と、カチオン性界面活性剤及びノニオン性界面活性剤を含む溶血剤と、核酸を染色する蛍光色素とを混合することにより、測定試料を調製するように構成されていてもよい。
また、本発明の一の態様の血液分析方法は、血液検体と、溶血剤と、核酸を染色する蛍光色素とを混合して、蛍光標識抗体を用いることなく測定試料を調製するステップと、調製された測定試料に光を照射するステップと、光が照射された測定試料から発せられる蛍光及び散乱光のそれぞれを検出するステップと、検出された蛍光の強度及び散乱光の強度に基づいて、リンパ球の蛍光強度の粒度分布に関する指標を取得するステップと、取得されたリンパ球の蛍光強度の粒度分布に関する指標に基づいて、Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率に関する情報を取得するステップと、取得されたＢリンパ球数とＴリンパ球数との比率に関する情報を出力するステップと、を有する。
本発明に係る血液分析装置及び血液分析方法によれば、蛍光標識抗体を用いることなく、Ｂリンパ球及びＴリンパ球に関する情報を取得することが可能となる。
以下、本発明の好ましい実施の形態を、図面を参照しながら説明する。
（実施の形態１）
本実施の形態は、血液検体と、溶血剤と、核酸を染色する蛍光色素とを混合して測定試料を調製し、前記測定試料を光学式フローサイトメータにより測定することにより、前記血液検体中におけるＢリンパ球及びＴリンパ球に関する情報を取得する血液分析装置である。
本実施の形態は、血液検体と、溶血剤と、核酸を染色する蛍光色素とを混合して測定試料を調製し、前記測定試料を光学式フローサイトメータにより測定することにより、前記血液検体中におけるＢリンパ球及びＴリンパ球に関する情報を取得する血液分析装置である。
［血液分析装置の構成］
図１は、本実施の形態に係る血液分析装置の外観を示す斜視図である。本実施の形態に係る血液分析装置１は、血液検体に含まれる血球を白血球、赤血球、血小板等を検出し、各血球を計数する多項目血球分析装置である。図１に示すように、血液分析装置１は、測定ユニット２と、測定ユニット２の前面側に配置された検体搬送ユニット４と、測定ユニット２及び検体搬送ユニット４を制御可能な情報処理ユニット５とを備えている。
図１は、本実施の形態に係る血液分析装置の外観を示す斜視図である。本実施の形態に係る血液分析装置１は、血液検体に含まれる血球を白血球、赤血球、血小板等を検出し、各血球を計数する多項目血球分析装置である。図１に示すように、血液分析装置１は、測定ユニット２と、測定ユニット２の前面側に配置された検体搬送ユニット４と、測定ユニット２及び検体搬送ユニット４を制御可能な情報処理ユニット５とを備えている。
図２は、検体を収容する検体容器の外観を示す斜視図であり、図３は、複数の検体容器を保持するサンプルラックの外観を示す斜視図である。図２に示すように、検体容器Ｔは、管状をなしており、上端が開口している。内部には患者から採取された血液検体が収容され、上端の開口は蓋部ＣＰにより密封されている。検体容器Ｔは、透光性を有するガラス又は合成樹脂により構成されており、内部の血液検体が視認可能となっている。また、検体容器Ｔの側面には、バーコードラベルＢＬ１が貼付されている。このバーコードラベルＢＬ１には、検体ＩＤを示すバーコードが印刷されている。サンプルラックＬは、１０本の検体容器Ｔを並べて保持することが可能である。サンプルラックＬでは、各検体容器Ｔが垂直状態（立位状態）で保持される。また、サンプルラックＬの側面には、バーコードラベルＢＬ２が貼付されている。このバーコードラベルＢＬ２には、ラックＩＤを示すバーコードが印刷されている。
＜測定ユニットの構成＞
次に、測定ユニットの構成について説明する。図４は、測定ユニットの構成を示すブロック図である。図４に示すように、測定ユニット２は、検体である血液を検体容器（採血管）Ｔから吸引する検体吸引部２１と、検体吸引部２１により吸引した血液から測定に用いられる測定試料を調製する試料調製部２２と、試料調製部２２により調製された測定試料から血球を検出する検出部２３とを有している。また、測定ユニット２は、検体搬送ユニット４のラック搬送部４３によって搬送されたサンプルラックＬに収容された検体容器Ｔを測定ユニット２の内部に取り込むための取込口（図１参照）と、サンプルラックＬから検体容器Ｔを測定ユニット２の内部に取り込み、検体吸引部２１による吸引位置まで検体容器Ｔを搬送する検体容器搬送部２５とをさらに有している。
次に、測定ユニットの構成について説明する。図４は、測定ユニットの構成を示すブロック図である。図４に示すように、測定ユニット２は、検体である血液を検体容器（採血管）Ｔから吸引する検体吸引部２１と、検体吸引部２１により吸引した血液から測定に用いられる測定試料を調製する試料調製部２２と、試料調製部２２により調製された測定試料から血球を検出する検出部２３とを有している。また、測定ユニット２は、検体搬送ユニット４のラック搬送部４３によって搬送されたサンプルラックＬに収容された検体容器Ｔを測定ユニット２の内部に取り込むための取込口（図１参照）と、サンプルラックＬから検体容器Ｔを測定ユニット２の内部に取り込み、検体吸引部２１による吸引位置まで検体容器Ｔを搬送する検体容器搬送部２５とをさらに有している。
図４に示すように、検体吸引部２１は、吸引管２１１を有している。また、検体吸引部２１はシリンジポンプ（図示せず）を備えている。また、吸引管２１１は、鉛直方向に移動可能であり、下方に移動されることにより、吸引位置まで搬送された検体容器Ｔの蓋部ＣＰを前記吸引管が貫通し、内部の血液を吸引するように構成されている。
試料調製部２２は、混合チャンバＭＣを備えている。吸引管２１１は、シリンジポンプ（図示せず）によって検体容器Ｔから所定量の全血検体を吸引し、吸引された検体は、混合チャンバＭＣの位置へ移送され、前記シリンジポンプによって、それぞれのチャンバＭＣへ所定量の全血検体を分配供給する。また、試料調製部２２は、混合チャンバＭＣを加温するためのヒータＨを備えている。
試料調製部２２は、第１試薬を収容する試薬容器２２１、第２試薬を収容する試薬容器２２２及びシース液（希釈液）である第３試薬を収容する試薬容器２２３にチューブを介して接続されている。また、試料調製部２２は、図示しないコンプレッサに接続されており、当該コンプレッサにより発生される圧力により試薬容器２２１、２２２、及び２２３からそれぞれの試薬を分取することが可能となっている。
第１試薬は、赤血球を溶血するため溶血剤を含む試薬である。第１試薬に含まれる溶血剤としては、白血球の測定に使用される公知の溶血剤が使用できる。より具体的な溶血剤としては、カチオン性界面活性剤及びノニオン性界面活性剤を含むものが好ましい。
ここで、カチオン性界面活性剤としては、４級アンモニウム塩型界面活性剤又はピリジニウム塩型界面活性剤が好ましい。より具体的には、
（Ｒ１は炭素数６〜１８のアルキル基又はアルケニル基、Ｒ２およびＲ３は炭素数１〜４のアルキル基又はアルケニル基、Ｒ４は炭素数１〜４のアルキルおよびアルケニル基又はベンジル基、Ｘはハロゲン原子である。）
で表される全炭素数９〜３０の界面活性剤が挙げられる。
で表される全炭素数９〜３０の界面活性剤が挙げられる。
Ｒ１としては、炭素数が６、８、１０、１２及び１４のアルキル基又はアルケニル基が好ましく、特に直鎖のアルキル基が好ましい。より具体的なＲ１としてはオクチル基、デシル基、及びドデシル基が挙げられる。また、Ｒ２およびＲ３としては、特にメチル基、エチル基、及びプロピル基が好ましい。また、Ｒ４としては、メチル基、エチル基、及びプロピル基が好ましい。
また、ノニオン性界面活性剤としては、以下の構造式（ＩＩ）で示されるポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤が好ましい。
で表されるポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤を用いるのが、好ましい。
なお、溶血剤は、上述のカチオン性界面活性剤及びノニオン性界面活性剤以外の成分を含むことができる。溶血剤に含むことができるその他の成分としては、例えば、有機酸や緩衝剤等が挙げられる。
ここで、有機酸としては、分子内に少なくとも１つの芳香環を有する有機酸又はその塩が好ましい。より具体的には、安息香酸、フタル酸、馬尿酸、サリチル酸、p-アミノベンゼンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、及びそれらのその塩等が挙げられる。
また、緩衝剤としては、例えば、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳ及びリン酸塩等が挙げられる。なお、緩衝剤としては、溶血剤のｐＨを、４．５〜１１．０、好ましくは５．０〜１０．０に保つ緩衝剤が好ましい。
このような好ましい第１試薬としては、市販の白血球測定用の溶血試薬であるシスメックス（株）製のストマトライザー４ＤＬが挙げられる。
第２試薬は、血液試料中の有核細胞を蛍光染色するための試薬である。かかる第２試薬には、核酸を蛍光色素が含有されている。このような色素を用いることにより、核酸を持たない赤血球はほとんど染色されず、核酸を有する白血球や有核赤血球等の有核の血球が染色される。なお、核酸を染色できる蛍光色素は、光源から照射される光によって適宜選択することができる。
具体的な核酸を染色できる蛍光色素としては、例えば、プロピジウムアイオダイド、エチジウムブロマイド、エチジウム−アクリジンヘテロダイマー、エチジウムジアジド、エチジウムホモダイマー−１、エチジウムホモダイマー−２、エチジウムモノアジド、トリメチレンビス［［３‐［［４‐［［（３‐メチルベンゾチアゾール‐３‐イウム）‐２‐イル］メチレン］‐１，４‐ジヒドロキノリン］‐１‐イル］プロピル］ジメチルアミニウム］・テトラヨージド（ＴＯＴＯ−１）、４‐［（３‐メチルベンゾチアゾール‐２（３Ｈ）‐イリデン）メチル］‐１‐［３‐（トリメチルアミニオ）プロピル］キノリニウム・ジヨージド（ＴＯ−ＰＲＯ−１）、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'‐テトラメチル‐Ｎ，Ｎ'‐ビス［３‐［４‐［３‐［（３‐メチルベンゾチアゾール‐３‐イウム）‐２‐イル］‐２‐プロペニリデン］‐１，４‐ジヒドロキノリン‐１‐イル］プロピル］‐１，３‐プロパンジアミニウム・テトラヨージド（ＴＯＴＯ−３）、又は２‐［３‐［［１‐［３‐（トリメチルアミニオ）プロピル］‐１，４‐ジヒドロキノリン］‐４‐イリデン］‐１‐プロペニル］‐３‐メチルベンゾチアゾール‐３‐イウム・ジヨージド（ＴＯ−ＰＲＯ−３）、及び以下の構造式（Ｉ）で示される蛍光色素が挙げられる。この中でも、以下の構造式（Ｉ）で示される蛍光色素が好ましい。
ここで、構造式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ４のいずれか一方が炭素数６〜１８のアルキル基の場合、他方は水素原子又は炭素数６未満のアルキル基であることが好ましい。炭素数６〜１８のアルキル基としては、炭素数６、８又は１０のアルキル基が好ましい。Ｒ１及びＲ４のベンジル基の置換基としては、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数２〜２０のアルケニル基、又は炭素数２〜２０のアルキニル基が挙げられる。Ｒ２及びＲ３のアルキル基としては、炭素数１〜２０のアルキル基が挙げられ、特にメチル基又はエチル基が好ましい。Ｒ２及びＲ３のアルケニル基としては、炭素数２〜２０のアルケニル基が挙げられる。Ｒ２及びＲ３のアルキニル基としては、炭素数２〜２０のアルキニル基が挙げられる。Ｒ２及びＲ３のアルコキシ基としては、炭素数１〜２０のアルコキシ基が挙げられ、特にメトキシ基又はエトキシ基が好ましい。Ｘ−におけるアニオンとしては、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、ＣＦ３ＳＯ３ −、及びＢＦ４ −などが挙げられる。
上記の核酸を染色できる蛍光色素の第２試薬中の濃度は、蛍光色素の種類により適宜設定することができる。例えば、構造式（Ｉ）で示される蛍光色素の濃度としては、０．２〜０．６ｐｇ／μＬが好ましく、特に０．３〜０．５ｐｇ／μＬが好ましい。なお、第２試薬は、核酸を染色できる蛍光色素を１種類又は２種類以上含むこともできる。
このような好ましい第２試薬としては、市販の白血球測定用の染色試薬であるシスメックス（株）製のストマトライザー４ＤＳが挙げられる。
第３試薬は、後述するシースフローセルへと供給されるシース液である。かかるシース液は、希釈液としても使用される。このシース液としては、例えばシスメックス（株）製セルパック（II）が挙げられる。
検出部２３は、ＷＢＣ測定（白血球計数）及びＤＩＦＦ測定（白血球分類）を行うことができる光学検出部Ｄを有している。この光学検出部Ｄは、ＷＢＣ（成熟白血球）、ＮＲＢＣ（有核赤血球）、及びリンパ芽球（Ｌ−Ｂｌａｓｔ）の検出を、半導体レーザを使用したフローサイトメトリー法により行うことが可能であるように構成されている。また、この検出部２３を使用することにより、白血球を、ＬＹＭＰＨ（リンパ球）、ＥＯ（好酸球）、ＮＥＵＴ＋ＢＡＳＯ（好中球＋好塩基球）、及びＭＯＮＯ（単球）の４種類、又はＮＥＵＴ（好中球）、ＬＹＭＰＨ（リンパ球）、ＥＯ（好酸球）、ＢＡＳＯ（好塩基球）、及びＭＯＮＯ（単球）の５種類に分類することが可能となっている。Ｂリンパ球及びＴリンパ球の測定を行うときには、血液検体と第１試薬及び第２試薬とが混合された測定試料（Ｂ・Ｔリンパ球測定試料）が光学検出部Ｄに供給される。なお、第１試薬としてストマトライザー４ＤＬを用い、第２試薬としてストマトライザー４ＤＳを用いた場合は、ＤＩＦＦ測定とＢリンパ球及びＴリンパ球の測定を、同一試料で行うことができる。
図５は、光学検出部Ｄの概要構成を示している。この光学検出部Ｄは、フローセル２３１に測定試料及びシース液を送り込み、フローセル２３１中に液流を発生させ、フローセル２３１内を通過する液流に含まれる血球に半導体レーザ光を照射して測定するものであり、シースフロー系２３２、ビームスポット形成系２３３、前方散乱光受光系２３４、側方散乱光受光系２３５、蛍光受光系２３６を有している。
シースフロー系２３２は、フローセル２３１内を測定試料がフローセル２３１内をシース液に包まれた状態で流すように構成されている。ビームスポット形成系２３３は、半導体レーザ２３７から照射された光が、コリメータレンズ２３８とコンデンサレンズ２３９とを通って、フローセル２３１に照射されるよう構成されている。また、ビームスポット形成系２３３は、ビームストッパ２４０も備えている。
前方散乱光受光系２３４は、前方への散乱光を前方集光レンズ２４１によって集光し、ピンホール２４２を通った光をフォトダイオード（前方散乱光受光部）２４３で受光するように構成されている。
側方散乱光受光系２３５は、側方への散乱光を側方集光レンズ２４４にて集光するとともに、一部の光をダイクロイックミラー２４５で反射させ、フォトダイオード（側方散乱光受光部）２４６で受光するよう構成されている。
光散乱は、光の進行方向に血球のような粒子が光の進行方向に障害物として存在すると、粒子により光がその進行方向を変えることによって生じる現象である。この散乱光を検出することによって、粒子の大きさや材質に関する情報を得ることができる。特に、前方散乱光からは、粒子（血球）の大きさに関する情報を得ることができる。また、側方散乱光からは、粒子内部の情報を得ることができる。血球粒子にレーザ光が照射された場合、側方散乱光強度は細胞内部の複雑さ（核の形状、大きさ、密度や顆粒の量）に依存する。したがって、これら散乱光強度は、白血球の分類等に利用することができる。
蛍光受光系２３６は、ダイクロイックミラー２４５を透過した光をさらに分光フィルタ２４７に通し、アバランシェフォトダイオード（蛍光受光部）２４８で受光するよう構成されている。
蛍光物質により染色された血球に光を照射すると、照射した光の波長より長い波長の光を発する。蛍光の強度はよく染色されていれば強くなり、この蛍光強度を測定することによって血球の染色度合いに関する情報を得ることができる。したがって、（側方）蛍光強度の差は、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の測定及び白血球の分類等に利用することができる。
次に、図４に戻って、検体容器搬送部２５の構成について説明する。検体容器搬送部２５は、検体容器Ｔを把持可能なハンド部２５ａを備えている。ハンド部２５ａは、互いに対向して配置された一対の把持部材を備えており、この把持部材を互いに近接及び離反させることが可能である。かかる把持部材を、検体容器Ｔを挟んだ状態で近接させることにより、検体容器Ｔを把持することができる。また、検体容器搬送部２５は、ハンド部２５ａを上下方向及び前後方向（Ｙ方向）に移動させることができ、さらに、ハンド部２５ａを揺動させることができる。これにより、サンプルラックＬに収容され、検体供給位置４３ａに位置した検体容器Ｔをハンド部２５ａにより把持し、その状態でハンド部２５ａを上方に移動させることによりサンプルラックＬから検体容器Ｔを抜き出し、ハンド部２５ａを揺動させることにより、検体容器Ｔ内の検体を撹拌することができる。
また、検体容器搬送部２５は、検体容器Ｔを挿入可能な穴部を有する検体容器セット部２５ｂを備えている。上述したハンド部２５ａによって把持された検体容器Ｔは、撹拌完了後移動され、把持した検体容器Ｔを検体容器セット部２５ｂの穴部に挿入する。その後、把持部材を離反させることにより、ハンド部２５ａから検体容器Ｔが開放され、検体容器セット部２５ｂに検体容器Ｔがセットされる。かかる検体容器セット部２５ｂは、図示しないステッピングモータの動力によって、図中Ｙ１及びＹ２方向へ水平移動可能である。
測定ユニット２の内部には、バーコード読取部２６が設けられている。検体容器セット部２５ｂは、バーコード読取部２６の近傍のバーコード読取位置２６ａ及び検体吸引部２１による吸引位置２１ａへ移動可能である。検体容器セット部２５ｂがバーコード読取位置２６ａへ移動したときには、セットされた検体容器Ｔが図示しない回転機構により水平回転され、バーコード読取部２６により検体バーコードが読み取られる。これにより、検体容器ＴのバーコードラベルＢＬ１がバーコード読取部２６に対して反対側に位置する場合でも、検体容器Ｔを回転させることにより、バーコードラベルＢＬ１をバーコード読取部２６へ向けることができ、バーコード読取部２６に検体バーコードを読み取らせることが可能である。また、検体容器セット部２５ｂが吸引位置へ移動したときには、検体吸引部２１により、セットされた検体容器Ｔから検体が吸引される。
＜情報処理ユニットの構成＞
次に、情報処理ユニット５の構成について説明する。情報処理ユニット５は、コンピュータにより構成されている。図６は、情報処理ユニット５の構成を示すブロック図である。情報処理ユニット５は、コンピュータ５ａによって実現される。図６に示すように、コンピュータ５ａは、本体５１と、画像表示部５２と、入力部５３とを備えている。本体５１は、ＣＰＵ５１ａ、ＲＯＭ５１ｂ、ＲＡＭ５１ｃ、ハードディスク５１ｄ、読出装置５１ｅ、入出力インタフェース５１ｆ、通信インタフェース５１ｇ、及び画像出力インタフェース５１ｈを備えており、ＣＰＵ５１ａ、ＲＯＭ５１ｂ、ＲＡＭ５１ｃ、ハードディスク５１ｄ、読出装置５１ｅ、入出力インタフェース５１ｆ、通信インタフェース５１ｇ、及び画像出力インタフェース５１ｈは、バス５１ｊによって接続されている。
次に、情報処理ユニット５の構成について説明する。情報処理ユニット５は、コンピュータにより構成されている。図６は、情報処理ユニット５の構成を示すブロック図である。情報処理ユニット５は、コンピュータ５ａによって実現される。図６に示すように、コンピュータ５ａは、本体５１と、画像表示部５２と、入力部５３とを備えている。本体５１は、ＣＰＵ５１ａ、ＲＯＭ５１ｂ、ＲＡＭ５１ｃ、ハードディスク５１ｄ、読出装置５１ｅ、入出力インタフェース５１ｆ、通信インタフェース５１ｇ、及び画像出力インタフェース５１ｈを備えており、ＣＰＵ５１ａ、ＲＯＭ５１ｂ、ＲＡＭ５１ｃ、ハードディスク５１ｄ、読出装置５１ｅ、入出力インタフェース５１ｆ、通信インタフェース５１ｇ、及び画像出力インタフェース５１ｈは、バス５１ｊによって接続されている。
ＣＰＵ５１ａは、ＲＡＭ５１ｃにロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。そして、後述するような血液分析用並びに測定ユニット２及び検体搬送ユニット４の制御用のコンピュータプログラム５４ａを当該ＣＰＵ５１ａが実行することにより、コンピュータ５ａが情報処理ユニット５として機能する。
ＲＯＭ５１ｂは、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、又はＥＥＰＲＯＭ等によって構成されており、ＣＰＵ５１ａに実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータ等が記録されている。
ＲＡＭ５１ｃは、ＳＲＡＭまたはＤＲＡＭ等によって構成されている。ＲＡＭ５１ｃは、ハードディスク５１ｄに記録されているコンピュータプログラム５４ａの読み出しに用いられる。また、ＣＰＵ５１ａがコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ５１ａの作業領域として利用される。
ハードディスク５１ｄは、オペレーティングシステム及びアプリケーションプログラム等、ＣＰＵ５１ａに実行させるための種々のコンピュータプログラム及び当該コンピュータプログラムの実行に用いられるデータがインストールされている。後述するコンピュータプログラム５４ａも、このハードディスク５１ｄにインストールされている。また、このコンピュータプログラム５４ａは、イベントドリブン型のコンピュータプログラムである。
読出装置５１ｅは、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、またはＤＶＤ−ＲＯＭドライブ等によって構成されており、可搬型記録媒体５４に記録されたコンピュータプログラムまたはデータを読み出すことができる。また、可搬型記録媒体５４には、コンピュータを情報処理ユニット５として機能させるためのコンピュータプログラム５４ａが格納されており、コンピュータ５ａが当該可搬型記録媒体５４からコンピュータプログラム５４ａを読み出し、当該コンピュータプログラム５４ａをハードディスク５１ｄにインストールすることが可能である。
なお、前記コンピュータプログラム５４ａは、可搬型記録媒体５４によって提供されるのみならず、電気通信回線（有線、無線を問わない）によってコンピュータ５ａと通信可能に接続された外部の機器から前記電気通信回線を通じて提供することも可能である。例えば、前記コンピュータプログラム５４ａがインターネット上のサーバコンピュータのハードディスク内に格納されており、このサーバコンピュータにコンピュータ５ａがアクセスして、当該コンピュータプログラムをダウンロードし、これをハードディスク５１ｄにインストールすることも可能である。
また、ハードディスク５１ｄには、例えば米マイクロソフト社が製造販売するWindows（登録商標）等のマルチタスクオペレーティングシステムがインストールされている。以下の説明においては、本実施の形態に係るコンピュータプログラム５４ａは当該オペレーティングシステム上で動作するものとしている。
入出力インタフェース５１ｆは、例えばUSB，IEEE1394，又はRS-232C等のシリアルインタフェース、SCSI，IDE，又は IEEE1284等のパラレルインタフェース、及びＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器等からなるアナログインタフェース等から構成されている。入出力インタフェース５１ｆには、キーボード及びマウスからなる入力部５３が接続されており、ユーザが当該入力部５３を使用することにより、コンピュータ５ａにデータを入力することが可能である。また、入出力インタフェース５１ｆは、測定ユニット２及び検体搬送ユニット４に接続されている。これにより、情報処理ユニット５は、測定ユニット２及び検体搬送ユニット４のそれぞれを制御可能となっている。
通信インタフェース５１ｇは、Ethernet（登録商標）インタフェースである。通信インタフェース５１ｇはＬＡＮを介してホストコンピュータ６に接続されている（図４参照）。コンピュータ５ａは、通信インタフェース５１ｇにより、所定の通信プロトコルを使用して当該ＬＡＮに接続されたホストコンピュータ６との間でデータの送受信が可能である。
画像出力インタフェース５１ｈは、ＬＣＤまたはＣＲＴ等で構成された画像表示部５２に接続されており、ＣＰＵ５１ａから与えられた画像データに応じた映像信号を画像表示部５２に出力するようになっている。画像表示部５２は、入力された映像信号にしたがって、画像（画面）を表示する。
［血液分析装置１の測定動作］
以下、本実施の形態に係る血液分析装置１の動作について説明する。
以下、本実施の形態に係る血液分析装置１の動作について説明する。
＜検体測定動作＞
まず、本実施の形態に係る血液分析装置１の検体測定動作について説明する。血液分析装置１は、光学検出部Ｄを用いたＢリンパ球及びＴリンパ球の測定を実行可能である。かかる測定の工程は、Ｂ・Ｔリンパ球測定試料を測定する測定工程と、測定工程によって得られた測定データを解析処理するデータ処理工程によって構成される。
まず、本実施の形態に係る血液分析装置１の検体測定動作について説明する。血液分析装置１は、光学検出部Ｄを用いたＢリンパ球及びＴリンパ球の測定を実行可能である。かかる測定の工程は、Ｂ・Ｔリンパ球測定試料を測定する測定工程と、測定工程によって得られた測定データを解析処理するデータ処理工程によって構成される。
まず、検体容器Ｔを保持したサンプルラックＬがオペレータによって分析前ラック保持部４１に載置される。ラック送込部４１ｂが分析前ラック保持部４１に載置されたサンプルラックＬに係合し、後方へと搬送され、ラック搬送部４３へと送られる。その後、ラック搬送部４３によって当該サンプルラックＬが搬送され、測定対象の検体が収容されている検体容器Ｔが検体供給位置４３ａに位置する。次に、測定ユニット２のハンド部２５ａにより、当該検体容器Ｔが把持され、サンプルラックＬからこの検体容器Ｔが取り出される。ハンド部２５ａはその後揺動運動を行い、検体容器Ｔの内部の検体が撹拌される。次に、検体容器セット部２５ｂにこの検体容器Ｔが挿入され、Ｙ方向へと検体容器セット部２５ｂが移動し、バーコード読取部２６による検体バーコード読み取りを行った後、吸引位置に到達する。その後、以下の測定工程が実行される。
測定工程
まず、測定工程について説明する。血液分析装置１は、測定工程では、全血検体と第１試薬と、第２試薬を混合してＢ・Ｔリンパ球測定試料を作成し、このＢ・Ｔリンパ球測定試料を光学検出部Ｄにてフローサイトメトリー法によって測定する。
まず、測定工程について説明する。血液分析装置１は、測定工程では、全血検体と第１試薬と、第２試薬を混合してＢ・Ｔリンパ球測定試料を作成し、このＢ・Ｔリンパ球測定試料を光学検出部Ｄにてフローサイトメトリー法によって測定する。
ここで、第１試薬としては、上述のストマトライザー４ＤＬを用いた。また、第２試薬としては、上述のストマトライザー４ＤＳを用いた。
図７は、測定工程での血液分析装置１の動作手順を示すフローチャートである。まず、ＣＰＵ５１ａは、検体吸引部２１を制御して、吸引管２１１により検体容器Ｔの全血検体を定量吸引する（ステップＳ１０１）。ステップＳ１０１の処理は、具体的には、吸引管２１１が検体容器Ｔの中に挿入され、シリンジポンプの駆動によって、全血検体が定量（３９．０μＬ）吸引される。
次に、ＣＰＵ５１ａが測定ユニット２を制御することにより、試薬容器２２１から第１試薬（１ｍＬ）が、試薬容器２２２から第１試薬（３０μＬ）が、吸引管２１１から全血検体（１１μＬ）が混合チャンバＭＣにそれぞれ供給される。より具体的には、まず全血検体がチャンバＭＣに供給された後に、第１試薬及び第２試薬がチャンバＭＣに供給される（ステップＳ１０２）。
ＣＰＵ５１ａは、混合チャンバＭＣへの第１試薬及び第２試薬の供給から２２秒間経過したか否かを判定し（ステップＳ１０３）、２２秒間待機する。ここで、ヒータにより混合チャンバＭＣは３５℃に加温されており、これにより、第１試薬と第２試薬と血液検体との混合液が３５℃で２２秒加温され、Ｂ・Ｔリンパ球測定試料が調製される。
ＣＰＵ５１ａは、混合チャンバＭＣへの第１試薬及び第２試薬の供給から２２秒間経過したか否かを判定し（ステップＳ１０３）、２２秒間待機する。ここで、ヒータにより混合チャンバＭＣは３５℃に加温されており、これにより、第１試薬と第２試薬と血液検体との混合液が３５℃で２２秒加温され、Ｂ・Ｔリンパ球測定試料が調製される。
そして、Ｂ・Ｔリンパ球測定試料を対象に光学検出部Ｄにて光学測定が行われる（ステップＳ１０４）。ステップＳ１０４の処理においては、具体的には、Ｂ・Ｔリンパ球測定試料とシース液とが同時に光学検出部Ｄのフローセル２３１に供給され、そのときの前方散乱光がフォトダイオード２４３で受光され、側方散乱光がフォトダイオード２４６で受光され、アバランシェフォトダイオード２４８で受光される。このような光学検出部Ｄの各受光素子により出力される出力信号（アナログ信号）は図示しないＡ／Ｄ変換器によりデジタル信号に変換され、図示しない信号処理回路により所定の信号処理が施されてデジタルデータである測定データに変換され、情報処理ユニット５にこの測定データが送信される。この信号処理においては、測定データに含まれる特徴パラメータとして、前方散乱光信号（前方散乱光強度）、側方散乱光信号（側方散乱光強度）、及び蛍光信号（蛍光強度）が得られる。これにより、測定工程が終了する。また、後述するように、情報処理ユニット５のＣＰＵ５１ａは、測定データに対して所定の解析処理を実行することにより、ＮＥＵＴ、ＬＹＭＰＨ、ＥＯ、ＢＡＳＯ、ＭＯＮＯ、及びＷＢＣ等の数値データを含む分析結果データを生成し、ハードディスク５１ｄに分析結果データを記憶する。
データ処理工程
次に、データ処理工程について説明する。図８は、データ処理工程での血液分析装置１の処理手順を示すフローチャートである。血液分析装置１の情報処理ユニット５は、測定ユニット２から測定データを受信する（ステップＳ３０１）。ＣＰＵ５１ａによって実行されるコンピュータプログラム５４ａはイベントドリブン型のプログラムであり、測定データを受信するイベントが発生すると、ステップＳ３０２の処理が呼び出される。
次に、データ処理工程について説明する。図８は、データ処理工程での血液分析装置１の処理手順を示すフローチャートである。血液分析装置１の情報処理ユニット５は、測定ユニット２から測定データを受信する（ステップＳ３０１）。ＣＰＵ５１ａによって実行されるコンピュータプログラム５４ａはイベントドリブン型のプログラムであり、測定データを受信するイベントが発生すると、ステップＳ３０２の処理が呼び出される。
ステップＳ３０２において、ＣＰＵ５１ａは、測定データを用いてリンパ球と他の血球群とを弁別する（ステップＳ３０２）。次に、分類されたリンパ球の蛍光強度と細胞数に基づいて、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の割合を測定する（ステップＳ３０３）。かかる処理について詳しく説明する。図９は、測定データにおける側方散乱光強度及び蛍光強度のスキャッタグラムである。図１０及び図１１は、分類されたリンパ球の、蛍光強度と細胞数のヒストグラムである。
図９に示す測定データにおける側方散乱光強度及び蛍光強度のスキャッタグラムでは、単球のクラスター、リンパ球のクラスター、好中球のクラスター、及び好酸球のクラスターが現れる。なお、図９は、白血球をＮＥＵＴ（好中球）、ＬＹＭＰＨ（リンパ球）、ＥＯ（好酸球）、ＢＡＳＯ（好塩基球）、及びＭＯＮＯ（単球）の５種類に分類したスキャッタグラムである。ステップＳ３０２の処理においては、ＣＰＵ５１ａは、測定データの側方散乱光強度及び蛍光強度を用いて、リンパ球のクラスターを他のクラスターと弁別する。図１０は、Ｂリンパ球が多い血液検体における、蛍光強度と細胞数のヒストグラムを示す。図１１は、Ｔリンパ球が多い血液検体における、蛍光強度と細胞数のヒストグラムを示す。蛍光強度と細胞数のヒストグラムでは、Ｂリンパ球は、Ｔリンパ球より蛍光強度が低いところにピークが現れる。逆に、Ｔリンパ球は、Ｂリンパ球より蛍光強度が高いところにピークが現れる。ステップＳ３０３の処理においては、ＣＰＵ５１ａは、ステップＳ３０２で弁別されたリンパ球のクラスターにおける、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の割合を、蛍光強度と細胞数の粒度分布の情報に基づいて取得する。
次にステップＳ３０４において、ＣＰＵ５１ａは、ステップＳ３０３において取得したＢリンパ球及びＴリンパ球の割合が、所定の範囲（正常範囲）であるか否かを判定する（ステップＳ３０４）。ここで、正常範囲は、複数の正常な血液検体におけるＢリンパ球及びＴリンパ球の割合から、予め設定することができる。したがって、この処理においてＢリンパ球及びＴリンパ球の割合が、正常範囲である場合は（ステップＳ３０４においてＹＥＳ）、血液検体中のリンパ球に異常が無いと判断することができる。よってこの場合には、ＣＰＵ５１ａは、ＲＡＭ５１ｃに設けられたリンパ球フラグに「０」をセットする（ステップＳ３０５）。ここで、リンパ球フラグは血液検体におけるリンパ球の異常の有無を示すフラグであり、「１」がセットされている場合にはリンパ球が異常であることを示し、「０」がセットされている場合にはリンパ球が正常であることを示す。その後、ＣＰＵ５１ａは、ステップＳ３０７へ処理を移す。
一方、ステップＳ３０４においてＢリンパ球及びＴリンパ球の割合が、正常範囲外である場合は（ステップＳ３０４においてＮＯ）、血液検体中のリンパ球に異常が有ると判断することができる。よってこの場合には、ＣＰＵ５１ａは、リンパ球フラグに「１」をセットする（ステップＳ３０６）。その後、ＣＰＵ５１ａは、ステップＳ３０７へ処理を移す。
ステップＳ３０７において、ＣＰＵ５１ａは、上述のようにして得た分析結果をハードディスク５１ｄに格納する（ステップＳ３０７）。次にＣＰＵ５１ａは、ハードディスク５１ｄに記憶した分析結果を示す分析結果画面を画像表示部５２に表示させ（ステップＳ３０８）、処理を終了する。
図１２及び図１３は、血液分析装置１の分析結果画面を示す図である。図１２は、血液検体Ａの分析結果画面を示している。図１３は、血液検体Ｂの分析結果画面を示している。図１２及び図１３に示すように、分析結果画面Ｒ１及びＲ２においては、測定された測定項目（ＷＢＣ、ＲＢＣ、ＰＬＴ、ＮＲＢＣ等）の数値データが表示される。血液検体Ａは、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の割合が異常な検体であり、この血液検体Ａに係る分析結果データでは、リンパ球フラグが「１」にセットされている。したがって、血液検体Ａの分析結果画面Ｒ１では、図１２に示すように、リンパ球の異常が存在している可能性を示す情報である「T・B-lymphocyte?」の表示が、Ｆｌａｇの欄Ｆに付される。一方、血液検体ＢはＢリンパ球及びＴリンパ球の割合が正常な検体であり、血液検体Ｂに係る分析結果データでは、リンパ球フラグが「０」にセットされている。したがって、血液検体Ｂの分析結果画面Ｒ２では、図１３のＦｌａｇの欄Ｆに示すように、上記の「Ｔ・Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ？」の表示は付されない。また、この分析結果画面Ｒ１及びＲ２には、測定データの側方散乱光強度及び蛍光強度のスキャッタグラムであるＳＬ１及びＳＬ２が表示される。さらに、この分析結果画面Ｒ１及びＲ２には、リンパ球の蛍光強度と細胞数のヒストグラムであるＳＮ１及びＳＮ２が表示される。オペレータはこのスキャッタグラムを参照することによって、血液分析装置１によるリンパ球の異常の有無の検出結果の根拠を把握することができる。また血液分析装置１によるリンパ球の異常の有無の検出結果の妥当性を判断することができる。
以上のような構成とすることにより、血液分析装置１は、溶血剤が含有された第２試薬と、血液検体と核酸を染色する蛍光色素が含有された第２試薬とを混合して調製したＢ・Ｔリンパ球測定試料を光学検出部Ｄにより測定することにより、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の割合を測定することができる。すなわち、蛍光標識抗体を用いることなく、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の割合を測定することができるため、コストを抑制することができる。さらに、血液分析装置１を用いることで、蛍光標識抗体を用いることなく、リンパ球の異常を判定することが可能となる。
（実施の形態２）
本実施の形態に係る血液分析装置は、測定ユニット２及び情報処理ユニット５を備えており、測定ユニット２には、ＷＢＣ測定（白血球計数）及びＤＩＦＦ測定（白血球分類）を行うことができる光学検出部Ｄを有する検出部２３が設けられている。本実施の形態に係る光学検出部Ｄは、ＷＢＣ（成熟白血球）、ＮＲＢＣ（有核赤血球）、及びリンパ芽球（Ｌ−Ｂｌａｓｔ）の検出を、半導体レーザを使用したフローサイトメトリー法により行うことが可能であるように構成されている。また、この検出部２３を使用することにより、白血球を、ＬＹＭＰＨ（リンパ球）、ＥＯ（好酸球）、ＮＥＵＴ＋ＢＡＳＯ（好中球＋好塩基球）、及びＭＯＮＯ（単球）の４種類、又はＮＥＵＴ（好中球）、ＬＹＭＰＨ（リンパ球）、ＥＯ（好酸球）、ＢＡＳＯ（好塩基球）、及びＭＯＮＯ（単球）の５種類に分類することが可能となっている。Ｂリンパ球及びＴリンパ球の測定を行うときには、血液検体と第１試薬及び第２試薬とが混合された測定試料（Ｂ・Ｔリンパ球測定試料）が光学検出部Ｄに供給される。
本実施の形態に係る血液分析装置は、測定ユニット２及び情報処理ユニット５を備えており、測定ユニット２には、ＷＢＣ測定（白血球計数）及びＤＩＦＦ測定（白血球分類）を行うことができる光学検出部Ｄを有する検出部２３が設けられている。本実施の形態に係る光学検出部Ｄは、ＷＢＣ（成熟白血球）、ＮＲＢＣ（有核赤血球）、及びリンパ芽球（Ｌ−Ｂｌａｓｔ）の検出を、半導体レーザを使用したフローサイトメトリー法により行うことが可能であるように構成されている。また、この検出部２３を使用することにより、白血球を、ＬＹＭＰＨ（リンパ球）、ＥＯ（好酸球）、ＮＥＵＴ＋ＢＡＳＯ（好中球＋好塩基球）、及びＭＯＮＯ（単球）の４種類、又はＮＥＵＴ（好中球）、ＬＹＭＰＨ（リンパ球）、ＥＯ（好酸球）、ＢＡＳＯ（好塩基球）、及びＭＯＮＯ（単球）の５種類に分類することが可能となっている。Ｂリンパ球及びＴリンパ球の測定を行うときには、血液検体と第１試薬及び第２試薬とが混合された測定試料（Ｂ・Ｔリンパ球測定試料）が光学検出部Ｄに供給される。
また本実施の形態に係る血液分析装置は、ＣＰＵ５１ａに後述する処理を行わせるコンピュータプログラムがハードディスク５１ｄにインストールされている。本実施の形態に係る血液分析装置のその他の構成については、実施の形態１に係る血液分析装置１の構成と同様であるので、同一構成要素については同一符号を付し、その説明を省略する。
次に、本実施の形態に係る血液分析装置の動作について説明する。本実施の形態に係る血液分析装置は、測定工程及びデータ処理工程を含む検体測定動作を実行可能である。なお、本実施の形態に係る検体分析装置の測定工程については、実施の形態１に係る検体分析装置１の測定工程と同様であるので、その説明を省略する。
図１４は、本実施の形態に係る血液分析装置のデータ処理工程における処理手順を示すフローチャートである。血液分析装置の情報処理ユニット５は、測定ユニット２から測定データを受信する（ステップＳ３２１）。ＣＰＵ５１ａによって実行される本実施の形態に係るコンピュータプログラムはイベントドリブン型のプログラムであり、測定データを受信するイベントが発生すると、ステップＳ３２２の処理が呼び出される。
ステップＳ３２２において、ＣＰＵ５１ａは、測定データを用いて白血球を４つのグループ（ＬＹＭＰＨ、ＥＯ、ＮＥＵＴ＋ＢＡＳＯ、及びＭＯＮＯ）に分類する（ステップＳ３２２）。次に、ＣＰＵ５１ａは、分類されたリンパ球についての蛍光強度の平均値を算出する（ステップＳ３２３）。
詳しくは後述するように、リンパ球についての蛍光強度の代表値（資料の特徴又は傾向を示す客観的な尺度となる数値）である平均値、中央値、平均値と中央値との差、二乗平均平方根（ＲＭＳ）は、Ｂリンパ球とＴリンパ球との比率に対して単調に変化する。つまり、リンパ球についての蛍光強度の平均値、中央値、平均値と中央値との差、及びＲＭＳは、Ｂリンパ球とＴリンパ球との比率と１対１に対応する。さらに詳しくは、リンパ球についての蛍光強度の平均値、中央値、平均値と中央値との差、及びＲＭＳのそれぞれは、Ｂリンパ球の比率（Ｔリンパ球及びＢリンパ球の総数に対するＢリンパ球数の比率）が増加するにしたがって線形に変化する（図２５Ａ、図２５Ｂ、図２５Ｃ、及び図２５Ｉ参照）。本実施の形態に係る血液分析装置においては、ハードディスク５１ｄに、リンパ球についての蛍光強度の平均値と、Ｂリンパ球の比率との関係を示すルックアップテーブルである平均値参照データが格納されている。ＣＰＵ５１ａは、平均値参照データを参照することにより、算出されたリンパ球についての蛍光強度の平均値に対応するＢリンパ球の比率ＲＢを取得する（ステップＳ３２４）。なお、ここでは平均値参照データをルックアップテーブルとしたが、リンパ球についての蛍光強度の平均値と、Ｂリンパ球の比率との関係を示す数式を平均値参照データとして記憶しておき、この数式によってリンパ球についての蛍光強度の平均値に対応するＢリンパ球の比率ＲＢを取得する構成としてもよい。
次にＣＰＵ５１ａは、Ｂリンパ球の比率ＲＢが所定の正常範囲にあるか否かを判定する（ステップＳ３２５）。ここで、正常範囲は、複数の健常人の正常な血液検体と、Ｂリンパ球の比率の異常を呈する患者の患者血液検体におけるＢリンパ球の比率から予め設定されたものであり、ハードディスク５１ｄに記憶されている。なお、本実施の形態においては、Ｂリンパ球の比率の正常範囲を「５％〜２０％」としている。Ｂリンパ球の比率ＲＢが正常範囲にある場合には（ステップＳ３２５においてＹＥＳ）、ＣＰＵ５１ａは、ＲＡＭ５１ｃに設けられたリンパ球フラグに「０」をセットする（ステップＳ３２６）。その後、ＣＰＵ５１ａは、ステップＳ３２８へ処理を移す。リンパ球フラグについては、実施の形態１と同様であるので、その説明を省略する。
一方、ステップＳ３２５においてＢリンパ球の比率ＲＢが正常範囲外である場合には（ステップＳ３２５においてＮＯ）、ＣＰＵ５１ａは、リンパ球フラグに「１」をセットする（ステップＳ３２７）。その後、ＣＰＵ５１ａは、ステップＳ３２８へ処理を移す。
ステップＳ３２８において、ＣＰＵ５１ａは、上述のようにして得た分析結果をハードディスク５１ｄに格納する（ステップＳ３２８）。次にＣＰＵ５１ａは、ハードディスク５１ｄに記憶した分析結果を示す分析結果画面を画像表示部５２に表示させ（ステップＳ３２９）、処理を終了する。
図１５は、本実施の形態に係る血液分析装置の分析結果画面の一例を示す図である。図１５に示すように、分析結果画面Ｒ３においては、診断の参考に利用されるリサーチ項目として、Ｂリンパ球の比率ＲＢが示される。具体的には、リサーチ項目の表示領域ＲＥに設けられた項目の欄にＢリンパ球の比率を示す「B-cell」が、データの欄にＢリンパ球の比率ＲＢの数値データである「２０％超」が表示される。なお、本実施の形態に係る血液分析装置においては、Ｂリンパ球の比率ＲＢが２０％を超える場合には「２０％超」、５〜２０％の場合には「５〜２０％」、５％未満の場合には「５％未満」というように、Ｂリンパ球の比率ＲＢが属する範囲が表示される。オペレータはこのＢリンパ球の比率ＲＢを参照することによって、血液分析装置１によるリンパ球においてＢリンパ球がどのような比率で存在しているかを把握することができる。本実施の形態に係る血液分析装置の分析結果画面Ｒ３のその他の構成は、実施の形態１に係る血液分析装置の分析結果画面Ｒ１と同様であるので、その説明を省略する。
（実施の形態３）
本実施の形態に係る血液分析装置は、ＣＰＵ５１ａに後述する処理を行わせるコンピュータプログラムがハードディスク５１ｄにインストールされている。本実施の形態に係る血液分析装置のその他の構成については、実施の形態２に係る血液分析装置の構成と同様であるので、同一構成要素については同一符号を付し、その説明を省略する。
本実施の形態に係る血液分析装置は、ＣＰＵ５１ａに後述する処理を行わせるコンピュータプログラムがハードディスク５１ｄにインストールされている。本実施の形態に係る血液分析装置のその他の構成については、実施の形態２に係る血液分析装置の構成と同様であるので、同一構成要素については同一符号を付し、その説明を省略する。
次に、本実施の形態に係る血液分析装置の動作について説明する。本実施の形態に係る血液分析装置は、測定工程及びデータ処理工程を含む検体測定動作を実行可能である。なお、本実施の形態に係る検体分析装置の測定工程については、実施の形態１に係る検体分析装置１の測定工程と同様であるので、その説明を省略する。
図１６は、本実施の形態に係る血液分析装置のデータ処理工程における処理手順を示すフローチャートである。ステップＳ３３１及びＳ３３２の処理は、実施の形態２において説明したステップＳ３２１及びＳ３２２の処理と同様であるので、その説明を省略する。ステップＳ３３３において、ＣＰＵ５１ａは、分類されたリンパ球についての蛍光強度の平均値及び中央値のそれぞれを算出し、得られた平均値及び中央値の差を演算する（ステップＳ３３３）。
本実施の形態に係る血液分析装置においては、ハードディスク５１ｄに、リンパ球についての蛍光強度の平均値及び中央値の差と、Ｂリンパ球の比率との関係を示すルックアップテーブルである参照データが格納されている。ＣＰＵ５１ａは、参照データを参照することにより、算出されたリンパ球についての蛍光強度の平均値及び中央値の差に対応するＢリンパ球の比率ＲＢを取得する（ステップＳ３３４）。なお、ここでは参照データをルックアップテーブルとしたが、リンパ球についての蛍光強度の平均値及び中央値の差と、Ｂリンパ球の比率との関係を示す数式を参照データとして記憶しておき、この数式によってリンパ球についての蛍光強度の平均値及び中央値の差に対応するＢリンパ球の比率ＲＢを取得する構成としてもよい。
ステップＳ３３５〜Ｓ３３９の処理は、実施の形態２において説明したステップＳ３２５〜Ｓ３２９の処理と同様であるので、その説明を省略する。
（実施の形態４）
本実施の形態に係る血液分析装置は、ＣＰＵ５１ａに後述する処理を行わせるコンピュータプログラムがハードディスク５１ｄにインストールされている。本実施の形態に係る血液分析装置のその他の構成については、実施の形態２に係る血液分析装置の構成と同様であるので、同一構成要素については同一符号を付し、その説明を省略する。
本実施の形態に係る血液分析装置は、ＣＰＵ５１ａに後述する処理を行わせるコンピュータプログラムがハードディスク５１ｄにインストールされている。本実施の形態に係る血液分析装置のその他の構成については、実施の形態２に係る血液分析装置の構成と同様であるので、同一構成要素については同一符号を付し、その説明を省略する。
次に、本実施の形態に係る血液分析装置の動作について説明する。本実施の形態に係る血液分析装置は、測定工程及びデータ処理工程を含む検体測定動作を実行可能である。なお、本実施の形態に係る検体分析装置の測定工程については、実施の形態１に係る検体分析装置１の測定工程と同様であるので、その説明を省略する。
図１７は、本実施の形態に係る血液分析装置のデータ処理工程における処理手順を示すフローチャートである。ステップＳ３４１及びＳ３４２の処理は、実施の形態２において説明したステップＳ３２１及びＳ３２２の処理と同様であるので、その説明を省略する。ステップＳ３４３において、ＣＰＵ５１ａは、分類されたリンパ球についての蛍光強度の歪度を算出する（ステップＳ３４３）。
後述するように、リンパ球についての蛍光強度の歪度は、Ｂリンパ球とＴリンパ球との比率に対して単調に変化する。つまり、リンパ球についての蛍光強度の歪度は、Ｂリンパ球とＴリンパ球との比率と１対１に対応する。さらに詳しくは、リンパ球についての蛍光強度の歪度は、Ｂリンパ球の比率が増加するにしたがって線形に増加する（図２５Ｄ参照）。蛍光強度におけるＢリンパ球の出現位置と、Ｔリンパ球の出現位置とは相違する。これにより、Ｂリンパ球の比率が高くなるに従い、蛍光強度の集中する位置（ピーク）がＢリンパ球の出現位置に近づき、Ｔリンパ球の比率が高くなるに従い、蛍光強度の集中する位置（ピーク）がＴリンパ球の出現位置に近づく（図２４Ａ〜図２４Ｉ参照）。よってＢリンパ球とＴリンパ球との比率が変化すると、リンパ球についての蛍光強度の分布の形状が変化し、この変化に応じて歪度が変化する。つまり歪度は、リンパ球についての蛍光強度の分布の形状の特徴を表しており、リンパ球についての蛍光強度の分布の偏りを示しているといえる。本実施の形態に係る血液分析装置においては、ハードディスク５１ｄに、リンパ球についての蛍光強度の歪度と、Ｂリンパ球の比率との関係を示すルックアップテーブルである歪度参照データが格納されている。ＣＰＵ５１ａは、歪度参照データを参照することにより、算出されたリンパ球についての蛍光強度の歪度に対応するＢリンパ球の比率を取得する（ステップＳ３４４）。なお、ここでは歪度参照データをルックアップテーブルとしたが、リンパ球についての蛍光強度の歪度と、Ｂリンパ球の比率との関係を示す数式を参照データとして記憶しておき、この数式によってリンパ球についての蛍光強度の歪度に対応するＢリンパ球の比率を取得する構成としてもよい。
（実施の形態５）
本実施の形態に係る血液分析装置は、ＣＰＵ５１ａに後述する処理を行わせるコンピュータプログラムがハードディスク５１ｄにインストールされている。本実施の形態に係る血液分析装置のその他の構成については、実施の形態２に係る血液分析装置の構成と同様であるので、同一構成要素については同一符号を付し、その説明を省略する。
本実施の形態に係る血液分析装置は、ＣＰＵ５１ａに後述する処理を行わせるコンピュータプログラムがハードディスク５１ｄにインストールされている。本実施の形態に係る血液分析装置のその他の構成については、実施の形態２に係る血液分析装置の構成と同様であるので、同一構成要素については同一符号を付し、その説明を省略する。
次に、本実施の形態に係る血液分析装置の動作について説明する。本実施の形態に係る血液分析装置は、測定工程及びデータ処理工程を含む検体測定動作を実行可能である。なお、本実施の形態に係る検体分析装置の測定工程については、実施の形態１に係る検体分析装置１の測定工程と同様であるので、その説明を省略する。
図１８は、本実施の形態に係る血液分析装置のデータ処理工程における処理手順を示すフローチャートである。ステップＳ３５１及びＳ３５２の処理は、実施の形態２において説明したステップＳ３２１及びＳ３２２の処理と同様であるので、その説明を省略する。ステップＳ３５３において、ＣＰＵ５１ａは、分類されたリンパ球についての蛍光強度の尖度及び分散を算出する（ステップＳ３５３）。
後述するように、リンパ球についての蛍光強度の尖度は、Ｂリンパ球とＴリンパ球との比率に対して変化する。Ｂリンパ球の比率が高くなるに従い、蛍光強度におけるＢリンパ球の出現位置付近に蛍光強度の分布が集中する。また、Ｔリンパ球の比率が高くなるに従い、蛍光強度におけるＴリンパ球の出現位置付近に蛍光強度の分布が集中する（図２４Ａ〜図２４Ｉ参照）。Ｂリンパ球の比率が高まれば、蛍光強度の分布の偏りが強まり、またＴリンパ球の比率が高まれば、蛍光強度の分布の偏りが強まる。よってＢリンパ球とＴリンパ球との比率が変化すると、リンパ球についての蛍光強度の分布の形状が変化し、この変化に応じて尖度が変化する。つまり尖度は、リンパ球についての蛍光強度の分布の形状の特徴を表しており、リンパ球についての蛍光強度の分布の偏りを示しているといえる。例えば、図２５Ｅに示される尖度は、Ｂリンパ球の比率が３０％以上の領域において概ね線形に変化する。つまり、リンパ球についての蛍光強度の尖度は、上記領域においてＢリンパ球の比率と１対１に対応する。
また、リンパ球についての蛍光強度の散布度（統計データの散らばりの程度を表す数値）である分散、標準偏差、標準誤差は、Ｂリンパ球とＴリンパ球との比率に対して変化する。ここで、分散、標準偏差、又は標準誤差は、上記の尖度と組み合わせることにより、Ｂリンパ球の比率を特定することが可能である。例えば、図２５Ｆ、図２５Ｇ、及び図２５Ｈに示される、分散、標準偏差、標準誤差は、Ｂリンパ球の比率が４０％以下の領域において単調増加し、Ｂリンパ球の比率が４０％以上の領域においてほぼ一定値を示す。つまり、リンパ球についての蛍光強度の分散、標準偏差、標準誤差は、Ｂリンパ球の比率が４０％以下の領域においてＢリンパ球の比率と１対１に対応する。したがって、Ｂリンパ球の比率が４０％以上の場合には、尖度を用いてＢリンパ球の比率を特定することができ、Ｂリンパ球の比率が４０％未満の場合には、分散、標準偏差、標準誤差を用いてＢリンパ球の比率を特定することができる。
本実施の形態に係る血液分析装置においては、ハードディスク５１ｄに、リンパ球についての蛍光強度の尖度と、Ｂリンパ球の比率との関係を示すルックアップテーブルである尖度参照データが格納されている。また、ハードディスク５１ｄには、リンパ球についての蛍光強度の分散と、Ｂリンパ球の比率との関係を示すルックアップテーブルである分散参照データが格納されている。本実施の形態においては、図２５Ｅに示す蛍光強度の尖度とＢリンパ球の比率との関係が尖度参照データとして記憶され、図２５Ｆに示す蛍光強度の分散とＢリンパ球の比率との関係が分散参照データとして記憶されている。ＣＰＵ５１ａは、尖度参照データ及び分散参照データを参照することにより、算出されたリンパ球についての蛍光強度の尖度及び分散に対応するＢリンパ球の比率を取得する（ステップＳ３５４）。この処理においては、ＣＰＵ５１ａがまず分散参照データを参照して、取得された分散に対応するＢリンパ球の比率を特定する。リンパ球についての蛍光強度の分散では、上述したようにＢリンパ球の比率が４０％以上の領域においてほぼ一定値を示すため、取得された分散が当該一定値付近である場合には、Ｂリンパ球の比率を正確に特定することは困難である。このため、分散参照データにより特定されたＢリンパ球の比率が４０％未満の値の場合には、ＣＰＵ５１ａはそのＢリンパ球の比率を採用する。一方、分散参照データにより特定されたＢリンパ球の比率が４０％以上の値の場合には、ＣＰＵ５１ａは尖度参照データを参照して、取得された尖度に対応するＢリンパ球の比率を特定し、当該Ｂリンパ球の比率を採用する。なお、ここでは分散参照データをルックアップテーブルとしたが、リンパ球についての蛍光強度の分散と、Ｂリンパ球の比率との関係を示す数式を分散参照データとして記憶しておき、この数式によってリンパ球についての蛍光強度の分散に対応するＢリンパ球の比率を取得する構成としてもよい。また、リンパ球についての蛍光強度の尖度と、Ｂリンパ球の比率との関係を示す数式を尖度参照データとして記憶しておき、この数式によってリンパ球についての蛍光強度の尖度に対応するＢリンパ球の比率を取得する構成としてもよい。
ステップＳ３５５〜Ｓ３５９の処理は、実施の形態２において説明したステップＳ３２５〜Ｓ３２９の処理と同様であるので、その説明を省略する。
（その他の実施の形態）
なお、試料調製部２２における、血液検体と第１試薬と第２試薬との混合の際の反応温度及び反応時間は、血液検体中の血球の損傷や染色の状態により適宜設定すればよく、特に制限されない。具体的には、反応温度が高いときは反応時間を短くし、反応温度が低いときは反応時間を長くするように調整することができる。より具体的には、血液検体と第１試薬及び第２試薬の混合は、２０℃〜４０℃の温度において、３〜１８０秒間行うことが好ましい。
なお、試料調製部２２における、血液検体と第１試薬と第２試薬との混合の際の反応温度及び反応時間は、血液検体中の血球の損傷や染色の状態により適宜設定すればよく、特に制限されない。具体的には、反応温度が高いときは反応時間を短くし、反応温度が低いときは反応時間を長くするように調整することができる。より具体的には、血液検体と第１試薬及び第２試薬の混合は、２０℃〜４０℃の温度において、３〜１８０秒間行うことが好ましい。
また、上述した実施の形態１〜５においては、溶血剤を含む第１試薬、及び核酸を染色できる蛍光色素を含む第２試薬を用いて、測定工程を行う構成について述べたが、これに限定されるものではない。溶血剤及び核酸染色色素の両方を含む試薬を、血液検体と混合してＢ・Ｔリンパ球測定試料を調製することもできる。
また、上述した実施の形態１〜５においては、血液検体として、全血検体を用いたが、これに制限されるものではない。血液検体は、リンパ球を含むものであれば良い。例えば、比重遠心を用いて、リンパ球を含む画分を採取して得られた試料を血液検体とすることもできる。リンパ球を含む画分を採取して得られた試料を血液検体とした場合、蛍光強度のみを用いてＢリンパ球及びＴリンパ球の割合を測定することもできる。
また、上述した実施の形態１〜５においては、ＣＰＵ５１ａが上記のコンピュータプログラム５４ａを実行することにより、測定ユニット２の制御及び測定データの処理を行う構成について述べたがこれに限定されるものではない。上記コンピュータプログラム５４ａと同様の処理を実行することが可能なＦＰＧＡ又はＡＳＩＣ等の専用ハードウェアにより、測定ユニット２の制御及び測定データの処理を実行する構成としてもよい。
また、上述した実施の形態１〜５においては、単一のコンピュータ５ａによりコンピュータプログラム５４ａの全ての処理を実行する構成について述べたが、これに限定されるものではなく、上述したコンピュータプログラム５４ａと同様の処理を、複数の装置（コンピュータ）により分散して実行する分散システムとすることも可能である。
また、上記の実施の形態２〜５においては、リンパ球についての蛍光強度の平均値、リンパ球についての蛍光強度の平均値と中央値との差、リンパ球についての蛍光強度の歪度、並びにリンパ球についての蛍光強度の尖度及び分散の組み合わせと対応するＢリンパ球の比率を取得する構成について述べたが、これに限定されるものではない。リンパ球についての蛍光強度の平均値、リンパ球についての蛍光強度の平均値と中央値との差、リンパ球についての蛍光強度の歪度、又はリンパ球についての蛍光強度の尖度及び分散の組み合わせと、Ｔリンパ球の比率（Ｂリンパ球及びＴリンパ球の総数に対するＴリンパ球の比率）との関係を示すデータを記憶しておき、リンパ球についての蛍光強度の平均値、平均値と中央値との差、歪度、又は尖度及び分散の組み合わせを取得し、上記データを参照して、Ｔリンパ球の比率を取得する構成としてもよい。この場合、Ｔリンパ球の比率が正常範囲にあるか否かを判定することにより、Ｂリンパ球とＴリンパ球との比率の異常を検出することができる。また、Ｔリンパ球の比率を分析結果として表示することもできる。
また上記の実施の形態２〜５においては、リンパ球についての蛍光強度の平均値、リンパ球についての蛍光強度の平均値と中央値との差、リンパ球についての蛍光強度の歪度、並びにリンパ球についての蛍光強度の尖度及び分散の組み合わせと対応するＢリンパ球の比率を取得する構成について述べたが、これに限定されるものではない。上記の統計データ以外のリンパ球についての蛍光強度の統計データを使用して、Ｂリンパ球とＴリンパ球との比率を取得する構成としてもよい。統計データのうち代表値は、Ｂリンパ球とＴリンパ球との比率と１対１に対応するため、中央値、又は二乗平均平方根（ＲＭＳ）を単独で使用して、Ｂリンパ球とＴリンパ球との比率を取得する構成とすることができる。さらに詳しくは、リンパ球についての蛍光強度の中央値又はＲＭＳを取得し、中央値又はＲＭＳとＢリンパ球の比率との対応関係を示すデータから、取得された中央値又はＲＭＳに対応するＢリンパ球の比率を取得する構成とすることができる。
また、統計データのうち散布度は、特定の範囲においてＢリンパ球とＴリンパ球との比率に対して単調に変化し、それ以外の範囲においてＢリンパ球とＴリンパ球との比率に対して概ね一定値を取る。より具体的に説明すると、分散及び標準偏差は、Ｂリンパ球の比率が０〜４０％の範囲において概ね線形に単調増加し、Ｂリンパ球の比率が４０〜１００％の範囲において概ね一定値を取る（図２５Ｆ及び図２５Ｇ参照）。また分散及び標準偏差は、Ｂリンパ球の比率が０〜４０％の範囲において変化率（傾き）が大きく、この範囲においては分散又は標準偏差に対応するＢリンパ球の比率を高精度に特定することができる。一般的に、Ｂリンパ球の比率の正常範囲は５〜２０％であると言われている。よって、Ｂリンパ球とＴリンパ球との比率の異常の有無を判別するだけであれば、分散又は標準偏差を単独で使用することが可能である。
一方、標準誤差は、Ｂリンパ球の比率が０〜４０％の範囲において概ね一定値を取り、Ｂリンパ球の比率が０〜４０％の範囲において概ね線形に単調増加する（図２５Ｈ参照）。また標準誤差は、Ｂリンパ球の比率が４０〜１００％の範囲において変化率（傾き）が大きく、この範囲においては標準誤差に対応するＢリンパ球の比率を高精度に特定することができる。よって、分散又は標準偏差と、標準誤差とを組み合わせて、Ｂリンパ球の比率を高精度に取得することが可能である。より具体的には、分散又は標準偏差により特定されるＢリンパ球の比率が０〜４０％の値の場合には、そのＢリンパ球の比率を採用し、分散又は標準偏差により特定されるＢリンパ球の比率が４０〜１００％の値の場合には、標準誤差により特定されるＢリンパ球の比率を採用する構成とすることが可能である。また、リンパ球についての蛍光強度の分散又は標準偏差とＴリンパ球の比率との関係、及びリンパ球についての蛍光強度の標準誤差とＴリンパ球の比率との関係を使用することも同様に可能である。
また、実施の形態５において説明したように、リンパ球についての蛍光強度の尖度は、Ｂリンパ球の比率が３０％以上の領域において概ね線形に変化する。したがって、リンパ球についての蛍光強度の尖度及び標準偏差を組み合わせることにより、Ｂリンパ球の比率を特定する構成とすることも可能である。
また上記の実施の形態２〜５においては、Ｂリンパ球の比率を含んだ分析結果画面を表示する構成について述べたが、これに限定されるものではない。Ｔリンパ球の比率、Ｂリンパ球数、又はＴリンパ球数の少なくとも１つを、Ｂリンパ球の比率に代えて、又はＢリンパ球の比率と共に表示することもできる。Ｂリンパ球及びＴリンパ球の総数がリンパ球数に近似することができることから、Ｂリンパ球数はリンパ球数にＢリンパ球の比率を乗じることで求められる。また、Ｔリンパ球数は、リンパ球数にＴリンパ球の比率を乗じることで求められる。
また上記の実施の形態２〜５においては、Ｂリンパ球の比率ＲＢを取得し、Ｂリンパ球の比率ＲＢが所定の正常範囲にあるか否かを判定することで、Ｂリンパ球とＴリンパ球との比率の異常の有無を判別する構成について述べたが、これに限定されるものではない。Ｂリンパ球の比率ＲＢの取得に用いた、リンパ球の蛍光強度の粒度分布に関する指標が、所定の範囲にあるか否かを判定することで、Ｂリンパ球とＴリンパ球との比率の異常の有無を判別することもできる。すなわち、リンパ球の蛍光強度の代表値、分散値、及び分布の偏りを示す値から選択される少なくとも一つの値と、閾値とを比較することで、Ｂリンパ球とＴリンパ球との比率の異常の有無を判別することもできる。例えば、実施の形態２の場合、リンパ球についての蛍光強度の平均値を、閾値と比較することで、Ｂリンパ球とＴリンパ球との比率の異常の有無を判別することができる。
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］
（測定用試料の調製）
健常人から、血液学検査用のEDTA−2K入り採血管を用いて、５０ｍＬの血液を採血した。採血した血液５０ｍＬを、６００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清（濃厚血小板層）を除去した。濃厚血小板除去後の血液を、リン酸緩衝生理食塩水で全量が１００ｍLになるように希釈した。ナカライテクス株式会社製のリンパ球分離溶液（ｄ＝１．１１９、ｄ＝１．０７７）を、取扱説明書に従って重層し、さらに希釈した血液を重層した。リンパ球分離溶液及び希釈した血液を重層した試料を、比重遠心（１９００ｒｐｍで１５分間）し、リンパ球及び単球を含む画分（６０ｍＬ）を採取した。
（測定用試料の調製）
健常人から、血液学検査用のEDTA−2K入り採血管を用いて、５０ｍＬの血液を採血した。採血した血液５０ｍＬを、６００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清（濃厚血小板層）を除去した。濃厚血小板除去後の血液を、リン酸緩衝生理食塩水で全量が１００ｍLになるように希釈した。ナカライテクス株式会社製のリンパ球分離溶液（ｄ＝１．１１９、ｄ＝１．０７７）を、取扱説明書に従って重層し、さらに希釈した血液を重層した。リンパ球分離溶液及び希釈した血液を重層した試料を、比重遠心（１９００ｒｐｍで１５分間）し、リンパ球及び単球を含む画分（６０ｍＬ）を採取した。
採取したリンパ球及び単球を含む画分（単核球層）６０ｍＬを１０ｍLずつに分け、リン酸緩衝生理食塩水をそれぞれに４０ｍＬ添加し、１９００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を除去することで、単核球層の洗浄を行った。この洗浄は二回行った。
洗浄後の単核球層を用い、StemCell Technologies社製のHuman Bell Enrichment Kit及びHuman Tell Enrichment Kitで、取扱説明書に従って磁気細胞分離を行った。この磁気細胞分離により０．５ｍＬのＢリンパ球を多く含む試料（Ｂリンパ球試料）と０．５ｍＬのＴリンパ球を多く含む試料（Ｔリンパ球試料）とを取得した。
５０μｌのＢリンパ球試料に、ＦＩＴＣで標識した抗ＣＤ１９抗体（Ｄａｋｏ社製）を５μｌ添加した。また、５０μｌのＴリンパ球試料に、ＦＩＴＣで標識した抗ＣＤ３抗体（Ｄａｋｏ社製）を５μｌ添加した。
標識抗体を添加したＢリンパ球試料（９μｌ）と、ストマトライザー４ＤＬ（４４２μｌ）と、ストマトライザー４ＤＳ（９μｌ）を混合し、室温で２分間インキュウベートすることで、Ｂリンパ球測定用試料を調製した。同様に、標識抗体を添加したＴリンパ球試料（９μｌ）と、ストマトライザー４ＤＬ（４４２μｌ）と、ストマトライザー４ＤＳ（９μｌ）を混合し、室温で２分間インキュウベートすることで、Ｔリンパ球測定用試料を調製した。
（フローサイトメトリーによる測定試料の分析）
上述の測定用試料の調製で得られた、Ｂリンパ球測定用試料及びＴリンパ球測定用試料を、それぞれFACS Calibur(BD社製)を使用し、細胞取り込み数２０００に設定し、フローサイトメトリーにより分析した。
上述の測定用試料の調製で得られた、Ｂリンパ球測定用試料及びＴリンパ球測定用試料を、それぞれFACS Calibur(BD社製)を使用し、細胞取り込み数２０００に設定し、フローサイトメトリーにより分析した。
図１９は、Ｂリンパ球測定用試料及びＴリンパ球測定用試料を用いた、フローサイトメトリーの分析から得られた、細胞数と蛍光強度の粒度分布図である。図２０は、Ｂリンパ球測定用試料を用いた、フローサイトメトリーの分析から得られた、側方散乱光強度と蛍光強度のスキャッタグラムである。図２１は、Ｔリンパ球測定用試料を用いた、フローサイトメトリーの分析から得られた、側方散乱光強度と蛍光強度のスキャッタグラムである。 図１９、図２０及び図２１から、Ｂリンパ球はＴリンパ球よりも低い蛍光強度に分布し、逆に、Ｔリンパ球はＢリンパ球よりも高い蛍光強度に分布することが明らかとなった。このことから、Ｂリンパ球及びＴリンパ球を蛍光強度の差に基づいて検出できることが示唆された。
（電子顕微鏡による解析）
溶血剤及び核酸を染色する蛍光色素で処理した、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の形態学的変化を、電子顕微鏡を用いて解析した。溶血剤及び核酸を染色する蛍光色素で処理した、Ｂリンパ球は、実施例１で取得したＢリンパ球試料（９μｌ）と、ストマトライザー４ＤＬ（４４２μｌ）と、ストマトライザー４ＤＳ（９μｌ）を混合し、３５℃で２２秒間インキュウベートすることで調製した。同様に、溶血剤及び核酸を染色する蛍光色素で処理した、Ｔリンパ球は、実施例１で取得したＴリンパ球試料（９μｌ）と、ストマトライザー４ＤＬ（４４２μｌ）と、ストマトライザー４ＤＳ（９μｌ）を混合し、３５℃で２２秒間インキュウベートすることで調製した。
溶血剤及び核酸を染色する蛍光色素で処理した、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の形態学的変化を、電子顕微鏡を用いて解析した。溶血剤及び核酸を染色する蛍光色素で処理した、Ｂリンパ球は、実施例１で取得したＢリンパ球試料（９μｌ）と、ストマトライザー４ＤＬ（４４２μｌ）と、ストマトライザー４ＤＳ（９μｌ）を混合し、３５℃で２２秒間インキュウベートすることで調製した。同様に、溶血剤及び核酸を染色する蛍光色素で処理した、Ｔリンパ球は、実施例１で取得したＴリンパ球試料（９μｌ）と、ストマトライザー４ＤＬ（４４２μｌ）と、ストマトライザー４ＤＳ（９μｌ）を混合し、３５℃で２２秒間インキュウベートすることで調製した。
溶血剤及び核酸を染色する蛍光色素で処理した、Ｂリンパ球試料に含まれるＢリンパ球を、１．５％グルタールアルデヒドで固定し、電子顕微鏡試料作製の方法（Mari Kono et al.（2009）"Morphological definition of CD71 positive reticulocytes by various staining techniques and electron microscopy compared to reticulocytes detected by an automated hematology analyzer",
Clinica Chimica Acta , Vol.404, p105-110.）に従い、走査型電子顕微鏡（日本電子 JSM-7500TFEA）及び透過型電子顕微鏡（日立 H-7500）を用いて解析した。溶血剤及び核酸を染色する蛍光色素で処理した、Ｔリンパ球試料に含まれるＴリンパ球も、同様に走査型電子顕微鏡及び透過型電子顕微鏡を用いて解析した。
Clinica Chimica Acta , Vol.404, p105-110.）に従い、走査型電子顕微鏡（日本電子 JSM-7500TFEA）及び透過型電子顕微鏡（日立 H-7500）を用いて解析した。溶血剤及び核酸を染色する蛍光色素で処理した、Ｔリンパ球試料に含まれるＴリンパ球も、同様に走査型電子顕微鏡及び透過型電子顕微鏡を用いて解析した。
また、対照として、溶血剤及び核酸を染色する蛍光色素による処理前の、Ｂリンパ球試料及びＴリンパ球試料に含まれる、Ｂリンパ球及びＴリンパ球も同様に電子顕微鏡を用いて解析した。
電子顕微鏡による解析結果を図２２に示す。図２２から、ストマトライザー４ＤＬとストマトライザー４ＤＳによる処理後の、Ｂリンパ球及びＴリンパ球を比較すると、Ｂリンパ球はＴリンパ球よりも、細胞質の量が減ることが明らかとなった。また、Ｂリンパ球は、Ｔリンパ球よりも、表面の凹凸が多数存在することが明らかとなった。このことから、溶血剤及び核酸を染色する蛍光色素による処理による、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の形態学的変化により、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の蛍光強度の差が生じることが示唆された。
［実施例２］
＜Ｂリンパ球試料及びＴリンパ球試料の調製＞
本願発明者らは、次のような手順によりＢリンパ球試料及びＴリンパ球試料の調製を行った。まず、健常人から、血液学検査用のＥＤＴＡ−２Ｋ入り採血管を用いて、５０ｍＬの血液を採取した。採取した血液４９ｍＬを、６００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清（濃厚血小板層）を除去した。濃厚血小板除去後の血液を、リン酸緩衝生理食塩水で全量が９８ｍLになるように希釈した。ナカライテクス株式会社製のリンパ球分離溶液（ｄ＝１．１１９、ｄ＝１．０７７）を、取扱説明書に従って重層し、さらに希釈した血液を重層した。リンパ球分離溶液及び希釈した血液を重層した試料を、比重遠心（１９００ｒｐｍで１５分間）し、リンパ球及び単球を含む画分を採取した。
＜Ｂリンパ球試料及びＴリンパ球試料の調製＞
本願発明者らは、次のような手順によりＢリンパ球試料及びＴリンパ球試料の調製を行った。まず、健常人から、血液学検査用のＥＤＴＡ−２Ｋ入り採血管を用いて、５０ｍＬの血液を採取した。採取した血液４９ｍＬを、６００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清（濃厚血小板層）を除去した。濃厚血小板除去後の血液を、リン酸緩衝生理食塩水で全量が９８ｍLになるように希釈した。ナカライテクス株式会社製のリンパ球分離溶液（ｄ＝１．１１９、ｄ＝１．０７７）を、取扱説明書に従って重層し、さらに希釈した血液を重層した。リンパ球分離溶液及び希釈した血液を重層した試料を、比重遠心（１９００ｒｐｍで１５分間）し、リンパ球及び単球を含む画分を採取した。
採取したリンパ球及び単球を含む画分（単核球層）にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加し、１９００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を除去することで、単核球層の洗浄を行った。この洗浄は二回行った。
洗浄後の単核球層試料を用い、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＨｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ及びＨｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔで、取扱説明書に従って磁気細胞分離を行った。この磁気細胞分離により０．５ｍＬのＢリンパ球を多く含む試料（Ｂリンパ球試料）と０．５ｍＬのＴリンパ球を多く含む試料（Ｔリンパ球試料）とを取得した。
＜Ｂリンパ球試料及びＴリンパ球試料の分離状況の確認＞
５０μＬのＢリンパ球試料を２つ準備し、一方にはＦＩＴＣで標識された抗ＣＤ１９抗体（Ｄａｋｏ製）を１μＬ添加し、もう一方にはコントロールとしてＦＩＴＣで標識されたマウスＩｇＧ（Ｄａｋｏ製）を１μＬ添加した。
５０μＬのＢリンパ球試料を２つ準備し、一方にはＦＩＴＣで標識された抗ＣＤ１９抗体（Ｄａｋｏ製）を１μＬ添加し、もう一方にはコントロールとしてＦＩＴＣで標識されたマウスＩｇＧ（Ｄａｋｏ製）を１μＬ添加した。
また、５０μＬのＴリンパ球試料を２つ準備し、一方にはＦＩＴＣで標識された抗ＣＤ３抗体（Ｄａｋｏ製）を１μＬ添加し、もう一方にはコントロールとしてＦＩＴＣで標識されたマウスＩｇＧ（Ｄａｋｏ製）を１μＬ添加した。
調製した試料を、それぞれフローサイトメータ（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ社製））を使用し、細胞取り込み数２０００の条件により分析することでＢリンパ球およびＴリンパ球を測定し、Ｂリンパ球およびＴリンパ球の分離状況を確認した。その結果、Ｂリンパ球試料はＢリンパ球86.7％の精製度であり、Ｔリンパ球試料はＴリンパ球97.3％の精製度であることが確認された。
＜測定用試料の解析＞
調製されたＢリンパ球試料およびＴリンパ球試料を、自動血球分析装置ＸＥ−２１００（シスメックス製）を用いて白血球４分類の測定を行った。測定試薬としては、ストマトライザー４ＤＬ、ストマトライザー４ＤＳ（いずれもシスメックス製）を使用した。
調製されたＢリンパ球試料およびＴリンパ球試料を、自動血球分析装置ＸＥ−２１００（シスメックス製）を用いて白血球４分類の測定を行った。測定試薬としては、ストマトライザー４ＤＬ、ストマトライザー４ＤＳ（いずれもシスメックス製）を使用した。
（Ｔ／Ｂリンパ球比率１０：０及び０：１０のデータ取得）
次に、測定により得られた蛍光強度と側方散乱光の情報を、カレイダグラフ（ヒューリンクス社製）を用いて解析した。まず、Ｔリンパ球試料の測定により得られた蛍光強度と側方散乱光の情報とから、Ｔリンパ球試料のスキャッタグラムを作成した。同様に、Ｂリンパ球試料の測定により得られた蛍光強度と側方散乱光の情報とから、Ｂリンパ球試料のスキャッタグラムを作成した。次に、Ｔリンパ球試料のスキャッタグラムを用い、リンパ球領域内に出現したドットをＴリンパ球として計数し、Ｔリンパ球試料に含まれるＴリンパ球数（１０５７個）を求めた。同様に、Ｂリンパ球試料のスキャッタグラムを用い、リンパ球領域内に出現したドットをＢリンパ球として計数し、Ｂリンパ球試料に含まれるＢリンパ球数（７４９個）を求めた。また、Ｔリンパ球として計数した各ドットと、それらの蛍光強度の情報から、Ｔリンパ球の蛍光強度の粒度分布図を作成した。同様に、Ｂリンパ球として計数した各ドットと、それらの蛍光強度の情報から、Ｂリンパ球の蛍光強度の粒度分布図を作成した。さらに、Ｔリンパ球及びＢリンパ球の、それぞれの蛍光強度の粒度分布図の平均値、中央値、歪度、尖度、分散、標準偏差、標準誤差、二乗平均平方根（ＲＭＳ）、平均−中央値（平均値から中央値を引いた値）を算出した。ここで、Ｔリンパ球試料の測定から得られた、スキャッタグラム、蛍光強度の粒度分布図及び算出値（平均値、中央値、歪度、尖度、分散、標準偏差、標準誤差、二乗平均平方根（ＲＭＳ）、平均−中央値）を、Ｔリンパ球とＢリンパ球との比率（以下、「Ｔ／Ｂリンパ球比率」という。）が１０：０のデータとした。また、Ｂリンパ球試料の測定から得られた、スキャッタグラム、蛍光強度の粒度分布図及び算出値を、Ｔ／Ｂリンパ球比率が０：１０のデータとした。
次に、測定により得られた蛍光強度と側方散乱光の情報を、カレイダグラフ（ヒューリンクス社製）を用いて解析した。まず、Ｔリンパ球試料の測定により得られた蛍光強度と側方散乱光の情報とから、Ｔリンパ球試料のスキャッタグラムを作成した。同様に、Ｂリンパ球試料の測定により得られた蛍光強度と側方散乱光の情報とから、Ｂリンパ球試料のスキャッタグラムを作成した。次に、Ｔリンパ球試料のスキャッタグラムを用い、リンパ球領域内に出現したドットをＴリンパ球として計数し、Ｔリンパ球試料に含まれるＴリンパ球数（１０５７個）を求めた。同様に、Ｂリンパ球試料のスキャッタグラムを用い、リンパ球領域内に出現したドットをＢリンパ球として計数し、Ｂリンパ球試料に含まれるＢリンパ球数（７４９個）を求めた。また、Ｔリンパ球として計数した各ドットと、それらの蛍光強度の情報から、Ｔリンパ球の蛍光強度の粒度分布図を作成した。同様に、Ｂリンパ球として計数した各ドットと、それらの蛍光強度の情報から、Ｂリンパ球の蛍光強度の粒度分布図を作成した。さらに、Ｔリンパ球及びＢリンパ球の、それぞれの蛍光強度の粒度分布図の平均値、中央値、歪度、尖度、分散、標準偏差、標準誤差、二乗平均平方根（ＲＭＳ）、平均−中央値（平均値から中央値を引いた値）を算出した。ここで、Ｔリンパ球試料の測定から得られた、スキャッタグラム、蛍光強度の粒度分布図及び算出値（平均値、中央値、歪度、尖度、分散、標準偏差、標準誤差、二乗平均平方根（ＲＭＳ）、平均−中央値）を、Ｔリンパ球とＢリンパ球との比率（以下、「Ｔ／Ｂリンパ球比率」という。）が１０：０のデータとした。また、Ｂリンパ球試料の測定から得られた、スキャッタグラム、蛍光強度の粒度分布図及び算出値を、Ｔ／Ｂリンパ球比率が０：１０のデータとした。
（Ｔ／Ｂリンパ球比率９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６および２：８のデータ取得）
次に、Ｔ／Ｂリンパ球比率が９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６および２：８の、データ（スキャッタグラム、蛍光強度の粒度分布図及び算出値）を、以下のようにして取得した。
次に、Ｔ／Ｂリンパ球比率が９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６および２：８の、データ（スキャッタグラム、蛍光強度の粒度分布図及び算出値）を、以下のようにして取得した。
Ｔ／Ｂリンパ球比率が９：１のデータの取得
上述のＴリンパ球として計数された１０５７個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報を、Ｔリンパ球の情報として抽出した。また、Ｂリンパ球として計数された７４９個から任意に選択された１１８個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報を、Ｂリンパ球の情報として抽出した。そして、Ｔリンパ球（１０５７個）及びＢリンパ球（１１８個）の合計１１７５の情報に基づき、Ｔ／Ｂリンパ球比率が９：１のデータを取得した。
上述のＴリンパ球として計数された１０５７個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報を、Ｔリンパ球の情報として抽出した。また、Ｂリンパ球として計数された７４９個から任意に選択された１１８個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報を、Ｂリンパ球の情報として抽出した。そして、Ｔリンパ球（１０５７個）及びＢリンパ球（１１８個）の合計１１７５の情報に基づき、Ｔ／Ｂリンパ球比率が９：１のデータを取得した。
Ｔ／Ｂリンパ球比率が８：２のデータの取得
上述のＴリンパ球として計数された１０５７個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報とを、Ｔリンパ球の情報として抽出した。また、Ｂリンパ球として計数された７４９個から任意に選択された２６５個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報とを、Ｂリンパ球の情報として抽出した。そして、Ｔリンパ球（１０５７個）及びＢリンパ球（２６５個）の合計１３２２の情報に基づき、Ｔ／Ｂリンパ球比率が８：２のデータを取得した。
上述のＴリンパ球として計数された１０５７個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報とを、Ｔリンパ球の情報として抽出した。また、Ｂリンパ球として計数された７４９個から任意に選択された２６５個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報とを、Ｂリンパ球の情報として抽出した。そして、Ｔリンパ球（１０５７個）及びＢリンパ球（２６５個）の合計１３２２の情報に基づき、Ｔ／Ｂリンパ球比率が８：２のデータを取得した。
Ｔ／Ｂリンパ球比率が７：３のデータの取得
上述のＴリンパ球として計数された１０５７個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報とを、Ｔリンパ球の情報として抽出した。また、Ｂリンパ球として計数された７４９個から任意に選択された４５４個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報とを、Ｂリンパ球の情報として抽出した。そして、Ｔリンパ球（１０５７個）及びＢリンパ球（４５４個）の合計１５１１の情報に基づき、Ｔ／Ｂリンパ球比率が７：３のデータを取得した。
上述のＴリンパ球として計数された１０５７個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報とを、Ｔリンパ球の情報として抽出した。また、Ｂリンパ球として計数された７４９個から任意に選択された４５４個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報とを、Ｂリンパ球の情報として抽出した。そして、Ｔリンパ球（１０５７個）及びＢリンパ球（４５４個）の合計１５１１の情報に基づき、Ｔ／Ｂリンパ球比率が７：３のデータを取得した。
Ｔ／Ｂリンパ球比率が６：４のデータの取得
上述のＴリンパ球として計数された１０５７個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報とを、Ｔリンパ球の情報として抽出した。また、Ｂリンパ球として計数された７４９個から任意に選択された７０３個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報とを、Ｂリンパ球の情報として抽出した。そして、Ｔリンパ球（１０５７個）及びＢリンパ球（７０３個）の合計１７６０の情報に基づき、Ｔ／Ｂリンパ球比率が６：４のデータを取得した。
上述のＴリンパ球として計数された１０５７個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報とを、Ｔリンパ球の情報として抽出した。また、Ｂリンパ球として計数された７４９個から任意に選択された７０３個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報とを、Ｂリンパ球の情報として抽出した。そして、Ｔリンパ球（１０５７個）及びＢリンパ球（７０３個）の合計１７６０の情報に基づき、Ｔ／Ｂリンパ球比率が６：４のデータを取得した。
Ｔ／Ｂリンパ球比率が５：５のデータの取得
上述のＴリンパ球として計数された１０５７個から任意に選択された７５０個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報とを、Ｔリンパ球の情報として抽出した。また、Ｂリンパ球として計数された７４９個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報とを、Ｂリンパ球の情報として抽出した。そして、Ｔリンパ球（７５０個）及びＢリンパ球（７４９個）の合計１４９９の情報に基づき、Ｔ／Ｂリンパ球比率が５：５のデータを取得した。
上述のＴリンパ球として計数された１０５７個から任意に選択された７５０個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報とを、Ｔリンパ球の情報として抽出した。また、Ｂリンパ球として計数された７４９個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報とを、Ｂリンパ球の情報として抽出した。そして、Ｔリンパ球（７５０個）及びＢリンパ球（７４９個）の合計１４９９の情報に基づき、Ｔ／Ｂリンパ球比率が５：５のデータを取得した。
Ｔ／Ｂリンパ球比率が４：６のデータの取得
上述のＴリンパ球として計数された１０５７個から任意に選択された５００個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報とを、Ｔリンパ球の情報として抽出した。また、Ｂリンパ球として計数された７４９個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報とを、Ｂリンパ球の情報として抽出した。そして、Ｔリンパ球（５００個）及びＢリンパ球（７４９個）の合計１２４９の情報に基づき、Ｔ／Ｂリンパ球比率が４：６のデータを取得した。
上述のＴリンパ球として計数された１０５７個から任意に選択された５００個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報とを、Ｔリンパ球の情報として抽出した。また、Ｂリンパ球として計数された７４９個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報とを、Ｂリンパ球の情報として抽出した。そして、Ｔリンパ球（５００個）及びＢリンパ球（７４９個）の合計１２４９の情報に基づき、Ｔ／Ｂリンパ球比率が４：６のデータを取得した。
Ｔ／Ｂリンパ球比率が２：８のデータの取得
上述のＴリンパ球として計数された１０５７個から任意に選択された１８８個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報とを、Ｔリンパ球の情報として抽出した。また、Ｂリンパ球として計数された７４９個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報とを、Ｂリンパ球の情報として抽出した。そして、Ｔリンパ球（１８８個）及びＢリンパ球（７４９個）の合計９３７の情報に基づき、Ｔ／Ｂリンパ球比率が２：８のデータを取得した。
上述のＴリンパ球として計数された１０５７個から任意に選択された１８８個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報とを、Ｔリンパ球の情報として抽出した。また、Ｂリンパ球として計数された７４９個の各ドットから、それぞれの蛍光強度と側方散乱光の情報とを、Ｂリンパ球の情報として抽出した。そして、Ｔリンパ球（１８８個）及びＢリンパ球（７４９個）の合計９３７の情報に基づき、Ｔ／Ｂリンパ球比率が２：８のデータを取得した。
図２３Ａ〜図２３Ｉは、各Ｔ／Ｂリンパ球比率におけるリンパ球の粒度分布のそれぞれを示す蛍光強度及び側方散乱光情報のスキャッタグラムである。図２４Ａ〜図２４Ｉは、各Ｔ／Ｂリンパ球比率におけるリンパ球の分布のそれぞれを示す蛍光強度の粒度分布図（ヒストグラム）である。各Ｔ／Ｂリンパ球比率における、平均値、中央値、歪度、尖度、分散、標準偏差、標準誤差、二乗平均平方根（ＲＭＳ）、及び平均−中央値のそれぞれを表１に示す。また、図２５Ａ〜図２５Ｉは、各Ｔ／Ｂリンパ球比率におけるリンパ球の蛍光強度の平均値、中央値、歪度、尖度、分散、標準偏差、標準誤差、二乗平均平方根（ＲＭＳ）、及び平均−中央値のそれぞれの変化を示すグラフである。
図２４Ａ〜図２４Ｉから、Ｔリンパ球の比率が高いほど、蛍光強度の粒度分布のピークは右側（高い蛍光強度を示す方向）にシフトすることが分かる。逆に、Ｂリンパ球の比率が高いほど、蛍光強度の粒度分布のピークは左側（低い蛍光強度を示す方向）にシフトすることが分かる。さらに、表１及び図２５Ａ〜図２５Ｉから、リンパ球についての蛍光強度の平均値、中央値、歪度、尖度、分散、標準偏差、標準誤差、二乗平均平方根（ＲＭＳ）及び／又は平均−中央値を用いることで、試料中のＴ／Ｂリンパ球比率の測定が可能であることが示唆された。
図２５Ａ、図２５Ｂ及び図２５Ｉから、蛍光強度の平均値、中央値及び二乗平均平方根（ＲＭＳ）は、試料中のＢリンパ球の比率の増加に伴い、値が低下することが分かる。また、図２５Ｃ及び図２５Ｄから、蛍光強度の平均−中央値及び歪度は、試料中のＢリンパ球の比率の増加に伴い、その値が増加することが分かる。従って、核酸を染色する蛍光色素で処理した血液検体における、リンパ球の蛍光強度の平均値、中央値及び二乗平均平方根（ＲＭＳ）又は平均−中央値から、血液検体中のＢリンパ球の比率を求めることが可能であることが示唆される。また、求めたリンパ球の比率が、正常範囲（５〜２０％）から逸脱している場合、血液検体のＢリンパ球の比率が異常であると判定することが可能であることが示唆される。
図２５Ｅから、蛍光強度の尖度は、試料中のＢリンパ球の比率が約３０〜１００％では、試料中のＢリンパ球の比率の増加に伴い、その値が増加することが分かる。従って、核酸を染色する蛍光色素で処理した血液検体におけるリンパ球の蛍光強度の尖度から、Ｂリンパ球の比率が約３０〜１００％の範囲内において、血液検体中のＢリンパ球の比率を求めることが可能であることが示唆される。また、図２５Ｈから、蛍光強度の標準誤差は、試料中のＢリンパ球の比率が約４０〜１００％では、試料中のＢリンパ球の比率の増加に伴い、その値が増加することが分かる。従って、核酸を染色する蛍光色素で処理した血液検体におけるリンパ球の蛍光強度の標準誤差から、Ｂリンパ球の比率が約４０〜１００％の範囲内において、血液検体中のＢリンパ球の比率を求めることが可能であることが示唆される。
図２５Ｆ及び図２５Ｇから、蛍光強度の分散及び標準偏差は、試料中のＢリンパ球の比率が０〜約４０％の範囲では、試料中のＢリンパ球の比率の増加に伴い、その値が増加することが分かる。従って、核酸を染色する蛍光色素で処理した血液検体における、リンパ球の蛍光強度の分散又は標準偏差から、Ｂリンパ球の比率が０〜約４０％の範囲において、血液検体中のＢリンパ球の比率を求めることが可能であることが示唆される。また、求めたリンパ球の比率が、正常範囲（５〜２０％）から逸脱している場合、血液検体のＢリンパ球の比率が異常であると判定することが可能であることが示唆される。また、リンパ球の蛍光強度の分散又は標準偏差と、リンパ球の蛍光強度の歪度、尖度又は標準誤差とを組み合わせることで、血液検体中のＢリンパ球の０〜１００％範囲の比率を求めることが可能であることが示唆される。
［実施例３］
＜健常人の血液の解析＞
（Ｔ／Ｂリンパ球比率の確認）
５０μＬの単核球層試料を３つ準備し、１つ目にはＦＩＴＣで標識された抗ＣＤ１９抗体（Ｄａｋｏ製）を１μＬ添加し、２つ目にはＦＩＴＣで標識された抗ＣＤ３抗体（Ｄａｋｏ製）を１μＬ添加し、３つ目にはコントロールとしてＦＩＴＣで標識されたマウスＩｇＧ（Ｄａｋｏ製）を１μＬ添加した。
＜健常人の血液の解析＞
（Ｔ／Ｂリンパ球比率の確認）
５０μＬの単核球層試料を３つ準備し、１つ目にはＦＩＴＣで標識された抗ＣＤ１９抗体（Ｄａｋｏ製）を１μＬ添加し、２つ目にはＦＩＴＣで標識された抗ＣＤ３抗体（Ｄａｋｏ製）を１μＬ添加し、３つ目にはコントロールとしてＦＩＴＣで標識されたマウスＩｇＧ（Ｄａｋｏ製）を１μＬ添加した。
調製した試料を、それぞれフローサイトメータ（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ社製））を使用し、細胞取り込み数２０００の条件で分析することでＢリンパ球およびＴリンパ球を測定した。その結果、単核球層試料の、CD3陽性細胞、すなわちＴリンパ球の割合は２０．７％であり、CD19陽性細胞、すなわちＢリンパ球の割合は２．５９％であった。この結果から、実施例２における、健常人の血液のＴ／Ｂリンパ球比率は、８：１（すなわちＢリンパ球比率が約１１％）であることを確認した。
（リンパ球数の確認）
実施例２で採血した健常人の血液を、ＸＥ−２１００を用い、白血球４分類の測定を行った。測定試薬としては、ストマトライザー４ＤＬ、ストマトライザー４ＤＳ（いずれもシスメックス製）を使用した。測定の結果、健常人の血液に含まれる、リンパ球数は１５５０／μLであった。
実施例２で採血した健常人の血液を、ＸＥ−２１００を用い、白血球４分類の測定を行った。測定試薬としては、ストマトライザー４ＤＬ、ストマトライザー４ＤＳ（いずれもシスメックス製）を使用した。測定の結果、健常人の血液に含まれる、リンパ球数は１５５０／μLであった。
（平均−中央値の算出）
測定により得られた蛍光強度と側方散乱光の情報を、カレイダグラフ（ヒューリンクス社製）を用いて解析した。まず、測定により得られた蛍光強度と側方散乱光の情報から、全血試料のスキャッタグラムを作成した。次に、全血試料のスキャッタグラムを用い、リンパ球領域内に出現したドットをリンパ球として計数したところ、１００４個であった。この１００４個のドットについて、それらの蛍光強度の情報から、全血試料中のリンパ球について、蛍光強度の粒度分布の平均−中央値を算出した。蛍光強度の粒度分布の平均−中央値は、０．５０２４８８であった。ここで、健常人の血液のＢリンパ球の比率は１１％である。従って、Ｂリンパ球の比率１１％における、蛍光強度の粒度分布の平均−中央値の実測値は、０．５０２４８８となる。
測定により得られた蛍光強度と側方散乱光の情報を、カレイダグラフ（ヒューリンクス社製）を用いて解析した。まず、測定により得られた蛍光強度と側方散乱光の情報から、全血試料のスキャッタグラムを作成した。次に、全血試料のスキャッタグラムを用い、リンパ球領域内に出現したドットをリンパ球として計数したところ、１００４個であった。この１００４個のドットについて、それらの蛍光強度の情報から、全血試料中のリンパ球について、蛍光強度の粒度分布の平均−中央値を算出した。蛍光強度の粒度分布の平均−中央値は、０．５０２４８８であった。ここで、健常人の血液のＢリンパ球の比率は１１％である。従って、Ｂリンパ球の比率１１％における、蛍光強度の粒度分布の平均−中央値の実測値は、０．５０２４８８となる。
＜モデル血液の解析＞
（モデル血液の調製）
実施例２で採血した健常人の血液を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０倍希釈し、１０倍希釈全血試料を調製した。また、実施例２で調製したＢリンパ球試料４００μＬを１０００ｒｐｍ、３分遠心した。遠心後、上清を除き、Ｂリンパ球のペレットを取得した。取得したＢリンパ球のペレットを、１０倍希釈全血試料２００μＬに分散し、モデル血液を調整した。
（モデル血液の調製）
実施例２で採血した健常人の血液を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０倍希釈し、１０倍希釈全血試料を調製した。また、実施例２で調製したＢリンパ球試料４００μＬを１０００ｒｐｍ、３分遠心した。遠心後、上清を除き、Ｂリンパ球のペレットを取得した。取得したＢリンパ球のペレットを、１０倍希釈全血試料２００μＬに分散し、モデル血液を調整した。
（リンパ球数の確認）
上述の健常人の血液の解析における、リンパ球数の確認と同様の手法で、調製したモデル血液のリンパ球数を測定した。測定の結果、モデル血液に含まれる、リンパ球数は５２３０／μLであった。
上述の健常人の血液の解析における、リンパ球数の確認と同様の手法で、調製したモデル血液のリンパ球数を測定した。測定の結果、モデル血液に含まれる、リンパ球数は５２３０／μLであった。
（平均−中央値の算出）
上述の健常人の血液の解析における、平均−中央値の算出と同様の手法で、調製したモデル血液の蛍光強度の粒度分布の平均−中央値を算出した。蛍光強度の粒度分布の平均−中央値は、３．１６６５２９であった。なお、リンパ球領域内に出現したドットは、４０３８個であった。
上述の健常人の血液の解析における、平均−中央値の算出と同様の手法で、調製したモデル血液の蛍光強度の粒度分布の平均−中央値を算出した。蛍光強度の粒度分布の平均−中央値は、３．１６６５２９であった。なお、リンパ球領域内に出現したドットは、４０３８個であった。
ここで、健常人の血液に含まれる、リンパ球数は１５５０／μLである。従って、１０倍希釈全血試料のリンパ球数は、１５５／μLとなる。また、モデル血液のリンパ球数は、５２３０／μLである。１０倍希釈全血試料に由来するリンパ球数は、１５５／μLである。従って、Ｂリンパ球試料に由来するモデル血液中のＢリンパ球数は、５０７５／μLとなる。さらに、健常人の血液のＢリンパ球の比率は１１％である。理論上、このＢリンパ球の比率は、１０倍希釈全血試料でも同じである。従って、１０倍希釈全血試料におけるＢリンパ球数は、１５５／μLの１１％なので、１７／μLとなる。モデル血液において、Ｂリンパ球試料に由来するＢリンパ球数は５０７５／μLであり、１０倍希釈全血試料に由来するＢリンパ球数は１７／μLであるから、モデル血液の全Ｂリンパ球数は、５０９２／μLとなる。モデル血液のリンパ球数は５２３０／μLであるから、Ｂリンパ球の比率は９７％となる。Ｂリンパ球の比率９７％における、蛍光強度の粒度分布の平均−中央値の実測値は、３．１６６５２９となる。
＜平均−中央値の変化を示すグラフと実測値の相関の確認＞
実施例２で得られた、図２５Ｃに示される蛍光強度の平均−中央値とＢリンパ球の比率との関係を示すグラフに、健常人の血液及びモデル血液の蛍光強度の粒度分布の実測値をプロットしたグラフを、図２６に示す。図２６中、「■」は、実測値のプロットを示す。図２６から、蛍光強度の平均−中央値とＢリンパ球の比率との関係を示すグラフと、蛍光強度の粒度分布の実測値との間に相関があることが分かる。
実施例２で得られた、図２５Ｃに示される蛍光強度の平均−中央値とＢリンパ球の比率との関係を示すグラフに、健常人の血液及びモデル血液の蛍光強度の粒度分布の実測値をプロットしたグラフを、図２６に示す。図２６中、「■」は、実測値のプロットを示す。図２６から、蛍光強度の平均−中央値とＢリンパ球の比率との関係を示すグラフと、蛍光強度の粒度分布の実測値との間に相関があることが分かる。
本発明の血液分析装置及び血液分析方法は、血液検体を光学的に測定し、血液検体に含まれる細胞群を複数に分類する血液分析装置及び血液分析方法として有用である。
１ 血液分析装置
２ 測定ユニット
２２ 試料調製部
２２１，２２２，２２３ 試薬容器
２３ 検出部
２３１ フローセル
２３７ 半導体レーザ
２４３ フォトダイオード
２４６ フォトダイオード
２４８ アバランシェフォトダイオード
５ 情報処理ユニット
５ａ コンピュータ
５１ 本体
５１ａ ＣＰＵ
５１ｂ ＲＯＭ
５１ｃ ＲＡＭ
５１ｄ ハードディスク
５１ｈ 画像出力インタフェース
５２ 画像表示部
５４ａ コンピュータプログラム
ＭＣ 混合チャンバ
Ｈ ヒータ
Ｄ 光学検出器
Ｒ１，Ｒ２,Ｒ３ 分析結果画面
ＳＬ１，ＳＬ２ 側方散乱光強度及び蛍光強度のスキャッタグラム
ＳＮ１，ＳＮ２ リンパ球の蛍光強度と細胞数のヒストグラム
２ 測定ユニット
２２ 試料調製部
２２１，２２２，２２３ 試薬容器
２３ 検出部
２３１ フローセル
２３７ 半導体レーザ
２４３ フォトダイオード
２４６ フォトダイオード
２４８ アバランシェフォトダイオード
５ 情報処理ユニット
５ａ コンピュータ
５１ 本体
５１ａ ＣＰＵ
５１ｂ ＲＯＭ
５１ｃ ＲＡＭ
５１ｄ ハードディスク
５１ｈ 画像出力インタフェース
５２ 画像表示部
５４ａ コンピュータプログラム
ＭＣ 混合チャンバ
Ｈ ヒータ
Ｄ 光学検出器
Ｒ１，Ｒ２,Ｒ３ 分析結果画面
ＳＬ１，ＳＬ２ 側方散乱光強度及び蛍光強度のスキャッタグラム
ＳＮ１，ＳＮ２ リンパ球の蛍光強度と細胞数のヒストグラム
Claims (14)
- 血液検体を供給する血液検体供給部と、
前記血液検体供給部から供給された血液検体と、溶血剤と、核酸を染色する蛍光色素とを混合して、蛍光標識抗体を用いることなく測定試料を調製する試料調製部と、
前記試料調製部により調製された測定試料に光を照射する光源と、
前記光源により光が照射された測定試料から発せられる蛍光を検出する第１検出器と、
前記光源により光が照射された測定試料から発せられる散乱光を検出する第２検出器と、
前記第１検出器により検出された蛍光の強度及び前記第２検出器により検出された散乱光の強度に基づいて、リンパ球の蛍光強度の粒度分布に関する指標を取得し、取得されたリンパ球の蛍光強度の粒度分布に関する指標に基づいて、Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率に関する情報を取得する情報処理部と、
前記情報処理部によって取得されたＢリンパ球数とＴリンパ球数との比率に関する情報を出力する出力部と、
を備える、血液分析装置。 - 前記情報処理部は、前記Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率に関する情報として、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の総数に対するＢリンパ球数の比率を示す値、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の総数に対するＴリンパ球数の比率を示す値、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の総数に対するＢリンパ球数の比率が所定の範囲に属することを示す情報、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の総数に対するＴリンパ球数の比率が所定の範囲に属することを示す情報、又はＴリンパ球数とＢリンパ球数との比率の異常の有無を示す情報を取得するように構成されている、
請求項１に記載の血液分析装置。 - 前記情報処理部は、前記リンパ球の蛍光強度の粒度分布に関する指標として、リンパ球の蛍光強度の代表値を取得し、取得された前記代表値に基づいて、Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率に関する情報を取得するように構成されている、
請求項１又は２に記載の血液分析装置。 - 前記情報処理部は、前記リンパ球の蛍光強度の粒度分布に関する指標として、リンパ球の蛍光強度の散布度を取得し、取得された前記散布度に基づいて、Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率に関する情報を取得するように構成されている、
請求項１乃至３の何れかに記載の血液分析装置。 - 前記情報処理部は、前記リンパ球の蛍光強度の粒度分布に関する指標として、リンパ球の蛍光強度の分布の偏りを示す値を取得し、取得された前記分布の偏りを示す値に基づいて、Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率に関する情報を取得するように構成されている、
請求項１乃至４の何れかに記載の血液分析装置。 - 前記情報処理部は、前記分布の偏りを示す値として、リンパ球の蛍光強度の分布の尖度又は歪度を取得し、取得された前記尖度又は歪度に基づいて、Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率に関する情報を取得するように構成されている、
請求項５に記載の血液分析装置。 - 前記情報処理部は、前記リンパ球の蛍光強度の粒度分布に関する指標を所定の閾値と比較することにより、Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率が異常であるか否かを判定するように構成されており、
前記出力部は、前記情報処理部によりＢリンパ球数とＴリンパ球数との比率が異常であると判定された場合に、前記Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率に関する情報として、Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率が異常であることを示す情報を出力するように構成されている、
請求項１乃至６の何れかに記載の血液分析装置。 - 前記情報処理部は、前記リンパ球の蛍光強度の粒度分布に関する指標に基づいて、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の総数に対するＢリンパ球数の比率を示す値を取得し、取得された前記値を所定の閾値と比較することにより、Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率が異常であるか否かを判定するように構成されており、
前記出力部は、前記情報処理部によりＢリンパ球数とＴリンパ球数との比率が異常であると判定された場合に、前記Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率に関する情報として、Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率が異常であることを示す情報を出力するように構成されている、
請求項１乃至６の何れかに記載の血液分析装置。 - 前記情報処理部は、前記リンパ球の蛍光強度の粒度分布に関する指標に基づいて、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の総数に対するＴリンパ球数の比率を示す値を取得し、取得された前記値を所定の閾値と比較することにより、Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率が異常であるか否かを判定するように構成されており、
前記出力部は、前記情報処理部によりＢリンパ球数とＴリンパ球数との比率が異常であると判定された場合に、前記Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率に関する情報として、Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率が異常であることを示す情報を出力するように構成されている、
請求項１乃至６の何れかに記載の血液分析装置。 - 前記情報処理部は、前記第１検出器により検出された蛍光の強度及び前記第２検出器により検出された散乱光の強度に基づいて、前記測定試料に含まれるリンパ球を他の白血球から区別し、リンパ球の蛍光強度の粒度分布に関する指標を取得するように構成されている、
請求項１乃至９の何れかに記載の血液分析装置。 - 前記情報処理部は、前記測定試料に含まれるリンパ球を他の白血球から区別することにより、白血球を分類するように構成されており、
前記出力部は、前記情報処理部による白血球の分類結果を出力するように構成されている、
請求項１０に記載の血液分析装置。 - 前記情報処理部は、前記測定試料に含まれる白血球をリンパ球を含む少なくとも４つの集団に分類するように構成されている、
請求項１１に記載の血液分析装置。 - 前記試料調製部は、前記血液検体供給部から供給された血液検体と、カチオン性界面活性剤及びノニオン性界面活性剤を含む溶血剤と、核酸を染色する蛍光色素とを混合することにより、測定試料を調製するように構成されている、
請求項１乃至１２の何れかに記載の血液分析装置。 - 血液検体と、溶血剤と、核酸を染色する蛍光色素とを混合して、蛍光標識抗体を用いることなく測定試料を調製するステップと、
調製された測定試料に光を照射するステップと、
光が照射された測定試料から発せられる蛍光及び散乱光のそれぞれを検出するステップと、
検出された蛍光の強度及び散乱光の強度に基づいて、リンパ球の蛍光強度の粒度分布に関する指標を取得するステップと、
取得されたリンパ球の蛍光強度の粒度分布に関する指標に基づいて、Ｂリンパ球数とＴリンパ球数との比率に関する情報を取得するステップと、
取得されたＢリンパ球数とＴリンパ球数との比率に関する情報を出力するステップと、
を有する、血液分析方法。
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-
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