CN1062212A - 光学筛选显微细胞的方法和仪器 - Google Patents

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康思坦斯·马瑞·哈耶克
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Abstract

用于鉴定细胞和癌细胞表达的形态学和选择性 特征或性质的光学鉴别法和仪器，该方法及仪器的详 细内容见说明书。

Description

本发明涉及为研究或诊断目的而鉴别或筛选细胞的方法和仪器。更具体讲，本发明涉及光学鉴别有或没有特殊表面分子的细胞，其是用常规染色方法来观察细胞的形态特征，例如对癌症的辨别。
染色的细胞是常规细胞形态研究的基础。一般是将细胞放在载玻片上，然后染色，再通过显微镜对其进行光学和肉眼观察。由显微图像得到的光学或肉眼信息也可被用于自动扫描仪中，如图像分析仪。
19世纪后叶，Ehrlieh报道了血细胞的生态学，生理学和病理学，其通过建立检测和区别白血病和贫血的方法将血液学带进了新纪元。Ehrlih观察到酸性，碱性和中性染料与细胞成份如白血细胞（WBC）的颗粒和胞核有专一反应。
Romanowsky通过将多色染色用于细胞而进一步发展了血液学。目前，Wright染色（对Romanowsky染色的修饰）常被用于细胞的视觉检测。将外周血涂片染色并通常用于对异常形态变化的视觉检查。细胞类型的分类和细胞分化的阶段在鉴定疾病的方法中是关键因素。尽管可利用自动血液分析仪和流动血细胞计数器，但仍需要对细胞的直接视觉（显微的）评估。
当在外周血涂片上发现异常时，免疫研究也是重要的。因此测定白血病的特殊亚类以便更好地选择治疗疾病方法并尽可能地给患者提供专一的预后是必要的。例如，在急性白血病中，外周血中的胚细胞显著增加。由于缺乏分化，鉴别这些未成熟的细胞是淋巴细胞还是粒细胞是困难的。如果快速繁殖的胚细胞亚群被发现是带T11受体，则白血病可分类为急性成淋巴细胞白血病（ALL），T-细胞类。一般讲，T谱系ALL要比B谱系ALL的预后差。另外，也常常根据它们的分化程度，将这些白血病进一步分成亚组。组Ⅰ和组Ⅱ显示出在早期胸腺前体细胞上可见的抗原;而在组Ⅲ中表达的那些与在成熟T细胞上发现的表面抗原相似。
免疫实验首先通过利用光学显微镜测定淋巴细胞的亚类而发展起来的。Coombs和其它人在1970年观察到了人淋巴细胞和羊血红细胞（RBC）间形成的玫瑰花结。后者研究发现，所有或至少大部分胸腺衍生的淋巴细胞（T-细胞）在适宜条件下都会显出玫瑰花结形成现象。这些研究利用了Ficoll分离的淋巴细胞并且采用光显微镜，用适宜的时间对分离的淋巴细胞进行了亚型分类。
现在淋巴细胞亚类通常是在带有荧光标记的单克隆抗体的样品中对细胞进行荧光标记来测定。该荧光标记的单克隆抗体结合到表达抗原的细胞表面上的抗原上。细胞样品然后通过用荧光显微镜或高尖端流动血细胞计数仪分析。当用流动血细胞计数仪时，必须由专门训练的技术人员进行细胞样品的制备，数据采集和数据分析。流动血细胞计数仪包括激光和复杂的光学系统，高能量计算机和电及流体系统。流体血细胞计数仪的部件系统必须定期和经常地进行维护和校准。虽然目前流动血细胞计数仪是作为淋巴细胞亚类的测定或癌症免疫表现型的标准方法，但该方法仍有几个缺陷，这包括仪器价格昂贵，需要正确操作该仪器的专门技能。流动血细胞计数法对一般病理学家来讲的另一个缺点是：只有大的机构能负担流动血细胞计数仪的费用。另外，送样品到另一机构进行流动血细胞计数分析往往需3天或更多天才能得到结果。因此，对一般病理学家来讲最好是有一种快速，廉价，简单和容易的筛选方法。
淋巴细胞亚类也可利用由本发明的受让人，Coulter  Electronics，Inc，开发的自动仪和方法来测定。一种改善的简单自动仪和用其的方法披露于US申请号587，646，1990，9，20提出，标题为“AUTOMATED  ANALYZER  AND  METHOD  FOR  SCREENING  CELLS  OR  FORMED  BODIES  FOR  ENUMERATION  OF  POPULATIONS  EXPRESSING  SELECTED  CHARACTERISTICS”，其是1987，3，13提出的同一标题的US申请号025，345的继续申请。该申请将电子视觉孔径原理，用于鉴定和/或计算所定义的胞群或形成的群体的选择生物分子的专一性和显微镜材料技术结合起来。自动分析仪可和特殊的溶解试剂和/或偶联到显微中心球或变化组分的支持物上的抗体合起来使用。
第二个申请，US系列号285，856，1988，12，16提出，标题为“METHOD  AND  APPARATUSFOR  SCREENING  CELLS  OR  FORMED  BODIES  WITH  POPULATIONS  EXPRESSING  SELECTED  CHARACTERISTICS”，披露了从全血样品或部分全血样品直接筛分亚类。
第三个申请，US号339，156，1989，4，14提出，标题为“METHOD  AND  APPARATUS  FOR  SCREENING  CELLS  OR  FORMED  BODIES  WITH  POPULATIONS  EXPRESSING  SELECTED  CHARACTERISTICS  UTILIZING  AT  LEAST  ONE  SENSING  PARAMETER”，披露了多份或五份白血细胞差别，淋巴细胞亚类和由全血样品或带血红细胞和/或通过消除群体排除了白血细胞的群体和/或带有一或多种光或电参数的白血细胞亚类的样品进行的重叠测定。
第四个申请，US  No.07/525，231，1990，5，17提出，标题为“METHOD  AND  APPARATUS  FOR  SCREENING  OBSCURED  OR  PARTIALLY  OBSCURED  CELLS”，披露了暗细胞分析，其是利用具有能结合到暗细胞上的专一抗体中心球产生由一个细胞群体到另一细胞群体的暗色细胞的辨别特征。上述四篇对比申请在此收入为参考文献。
实现本发明的方法和仪器可用各种免疫反应，如包括反应物和形成的胞体或细胞的免疫反应。本发明也用于形成的胞体悬浮液分析，如其中的一些细菌和病毒。这里所用的细胞定义为动物或植物细胞，其包括细胞类细菌，真菌，它们是分开辨别的或在聚集中辨别的。细胞是能以独立单位起作用的生命物质的最小结构聚集。例如，细胞可是人体血红细胞（RBC）和WBC群体，来自组织或血样的癌细胞或其它异常细胞。形成的胞体定义为一些细菌和病毒，细胞和形成的胞体适宜标记。这样它们就能按与鉴别人体血细胞的同样方式，通过本发明的方法和仪器进行光学鉴别。
虽然已在上面申请中使用的术语“反应物”定义为溶解剂和单克隆抗体，但反应物包括各种试剂，它们可检测和与细胞或形成的胞体上的一或多个专一分子反应。一些实例如下：
反应物  专一性分子
抗体  抗原
药  药物受体
激素  激素受体
生长因子  生长因子受体
这些反应物可偶联或结合到细胞上的专一分子上。这些反应物是起化学反应的部分;但这些反应物不必进行化学变化。
先有技术中披露了用光学显微镜和抗体标记的中心球测定淋巴细胞亚型的方法。该方法来自加利福尼亚，Richmond的Bio-Rad实验室。该方法可鉴别T和B淋巴细胞。抗体标记的中心球被用来结合到显有所需表面抗原的细胞上。两种不同颜色的抗体标记的中心球被用来区别T和B淋巴细胞。显微学家通过抗体标记中心球结合到细胞上来鉴别对具体抗原呈阳性的细胞。没有抗体标记的中心球结合到其上的细胞代表了阴性细胞群体，其表达不令人感兴趣的抗原。但该方法受到这样的限制，即淋巴细胞必须利用分离介质，如Ficoll-Hypaque，首先从全血样品中分离出来。粒细胞污染可导致假的非阳性细胞值增加和吞噬细胞数目的增加。另外，由于首先从全血细胞中去除了其它细胞，因此仅能进行淋巴细胞亚型测定。另外由于这些细胞不是用常规Romanowsky或Wright类染色，而染色仅用于测定细胞的存活性，因此，限制了细胞形态学评估。又由于细胞是在悬浮液中而不是在常规的载玻片上评估的，从而进一步限制了形态学评估。
本发明提供一种光学筛选细胞的方法和仪器以鉴定细胞的形态和细胞所表达的特性。将细胞与一或多个不同组的中心球混合，每组中心球上都结合有可与某种特异性分子结合的反应物，该特异分子可存在于一种或多种类型的细胞上。将细胞和中心球在载玻片上制成涂片并用赖特氏型染色剂染色。然后由操作人员和/或自动地观测细胞，如果有的话，则可鉴定与不同的中心球结合的细胞的类型。
样品可以是任何细胞悬液，例如得自全血样品或其一部分，在样品中可除去红血细胞或保持红血细胞完整。中心球组可单独或同时混入相同或不同的样品部分，最好与之混合。不同的中心球组具有为光学差异的不同光学特性。中心球组之间的不同光学特性可为颜色、大小、形状或其组合特性。
当血样中包括大量对特异性抗原呈阳性的细胞时，则出现成群的细胞。可目测或光学观测细胞群作为快速筛选程序。据观察细胞群在混合容器中形成聚集的边缘或在载片上呈显微凝集。
也可利用可与一种或多种类型的细胞上的某种特异性分子结合的第一反应物光学筛选细胞。作为一个例子，第一反应物可以是以不足以先与一组中心球结合的浓度获得的。在这种情况下，可将第一反应物与细胞混合而使细胞结合其上，然后将具有与之结合的第二反应物的一组中心球加到第一反应物与细胞的混合物中。在这种情况下第二反应物是可与第一反应物结合以使中心球与细胞结合的类型。与中心球结合的第一反应物和第二反应物也可与细胞同时混合。同样，与中心球结合的第二反应物可与第一反应物混合以使第一反应物与第二反应物结合，然后具有与之结合的第一和第二反应物的中心球可与细胞混合。
特异性分子可以是存在于样品中的癌细胞的特异性分子。可将癌细胞制成一种或多种样品涂片，用一或多个不同组的中心球加以鉴定。这就提供了一种获得癌症筛选信息的简单而快速的方法，病理学家可以此来进行治疗和预后或免除制作一种或多种进一步的涂片或其它流动细胞检测程序。
图1是本发明的一种光学筛选分析仪实施方案的方框图;
图2是本发明的第二种光学筛选分析仪实施方案的方框图;
图3是本发明的特定光学筛选分析仪实施方案的方框图;
图4是染色后的载玻片的光学图像，它显示了中心球与某一特异性细胞抗原的结合;
图5是染色后的载玻片的光学图像，它显示了中心球与不同的特异性细胞抗原的结合;
图6是染色后的载玻片的光学图像，它显示了中心球与表明CLL类型的进一步不同的特异性细胞抗原结合;
图7是染色后的载玻片的光学图像，它显示了中心球不与进一步分化的CLL类型的另一种特异性细胞抗原的结合;
图8是染色后的载玻片的光学图像，它显示了中心球与嗜中性白细胞上某一特异性细胞抗原结合;
图9是着色不同的中心球的光学图像，它显示了中心球与嗜中性白细胞上另一种特异性细胞抗原结合;
图10是图8和图9的着色不同和大小不同的中心球的光学图像，它显示了不同的中心球与嗜中性白细胞上不同的细胞抗原结合;
图11是中心球与一种类型的细胞上特异性细胞抗原结合而不与其它类型细胞上的抗原结合的光学图像;
图12是染色后的载玻片的光学图像，它显示了中心球与一种类型的细胞上不同的特异性细胞抗原结合而不与其它类型细胞上的抗原结合;
图13是染色后的载玻片的光学图像，它显示了其上结合有第二反应物的中心球与可与细胞上特异性细胞抗原结合的第一反应物结合;
图14是染色后的载玻片的光学图像，它显示了中心球与骨髓中的嗜中性白细胞上特异性细胞抗原结合;
图15是染色后的载玻片的光学图像，它显示了中心球不与被怀疑的HTLV-1样品中的第一种特异性细胞抗原结合;
图16是染色后的载玻片的光学图像，它显示了中心球与图15所示的被怀疑的HTLV-1样品中的第二种特异性细胞抗原结合。
参见图1，本发明的第一种光学细胞筛选实施方案一般以参照符号10表示。光学细胞筛选仪10包括生物样品12，该样品至少包含第一组生物细胞（未示出），如全血样品中或来自全血样品的细胞。
样品12通过线路14与至少一种通过线路18的反应物16合并。反应物16可包括一种螯合剂，如标准EDTA，它作为抗凝血剂，加到样品12中以便阻止嗜中性白细胞吞食中心球。
反应物16也包括多组或第一组中心球，其具有对可存在于与之结合的至少一种类型的细胞上的特定抗原有专一性的抗体。对于血液，细胞可表达可与一种或多种特异性抗体结合的抗原。一般来说，抗原是抗体可与之结合的分子，因此，对于血液或其它活细胞，反应可被规定为第一种类型的分子与第二种类型的分子特异地进行化学反应。然后合并的样品12和反应物16最好用按功能命名的混合台20进行混合。然后将一部分混合物置于载玻片上，用按功能命名的涂片制备台22制做涂片。然后在按功能命名的染色台24内给涂片染色。
染色应为一种可用于区分各种细胞特性的组织学染色。对于血液细胞，染色最好是如前所述的所谓“赖特氏”型染色，染色后便可在常规情况下用显微镜区分细胞的形态。一些可用于本发明方法的其它类型的组织学染色剂的实例有苏木精、结晶紫和吉姆萨氏血液染剂。苏木精可用作一般的组织染色显示动物组织中的细胞核。结晶紫可用作细菌染色显示被膜。吉姆萨氏血液染色可用于显示白细胞、立克次氏体、细菌和内含体的区别。然后用光学分析仪26光学观测染色后的载玻片。光学筛选载玻片上的细胞以确定哪些类型的细胞上结合有中心球。这可鉴定细胞上是否存在特定的受体或抗原并由此鉴定样品的状态，这一点将在下文中进一步描述。
在光学筛选仪器10中，样品12或者是全血样品，其中保留有红血细胞或者只是有或无血小板或RBC'S和所有WBC群体的部分全血样品。本发明的第二种光学细胞筛选仪实施方案一般以参考符号28表示，可参见图2。光学细胞筛选仪28包括生物样品30，该样品可以是全血样品，也可以是至少包括白血细胞的血液样品。生物样品30也可得自其它生物流体或组织，即骨髓、尿、脊髓液或胸膜液或淋巴腺。
需要时，红血细胞可用按功能命名的去除台32从混合物中除去。红血细胞也可以多种方式用去除台32从混合物中除去。红血细胞可被细胞溶解剂溶解。下文中描述了一种这样的优选细胞溶解剂和可与之一起使用的猝灭剂。红血细胞也可用多个磁性中心球除去，中心球上具有与之结合的红血细胞特异的抗体（未示出）。被结合的红血细胞保留在磁场中，除去剩余的样品以除去红血细胞。例如，可以使用的一种特定的红血细胞特异性抗体公开于美国专利4，752，563，题为MONOCLONAL  ANTIBODY  FOR  RECOVERY  OF  LEUKOCYTES  IN  HUMAN  PERIPHERAL  BLOOD  AND  METHOD  OF  RECOVERY  EMPLOYING  SAID  MONOCLONAL  ANTIBODY，本文授引该文献作为参考。除了样品缓冲液之外或代替样品缓冲液，可包括一种缓冲液。也可使用优选的RBC细胞溶解剂和红血细胞特异性中心球的组合物。有关红血细胞去除的详细情况可参见本文前面提到的本发明受让人的4个申请。
然后样品30通过线路34与通过线路38的反应物合并。合并的样品30和反应物32最好混合起来。可在此使用的合适的混合仪器可详见1990年5月1日提交的题为METHOD  AND  APPARATUS  FOR  RAPID  MIXING  OF  SMALL  VOLUMES  FOR  ENHANCING  BIOLOGICAL  REACTIONS的美国专利申请517，309，该申请是1987年5月13日提交的同一题目的美国专利申请025，337的继续申请，在此援引作为参考。需要的话，通过使用混合器可加快反应速度，而不会明显破坏细胞重要特性。混合器20可利用相同类型的混合仪器，但也可以是其它类型的温和混合仪器，例如简单的辊筒式摇摆器，因为反应速度并不是至关重要的。
然后用载玻片制备台40将一部分去除了红血细胞的混合物在载玻片上浓缩，制成涂片。一旦经浓缩令人感兴趣的细胞和除去过量的水份（如通过载玻片离心分离）制得载玻片后，立即按前述方法在染色台42内给载玻片染色。然后再用分析仪44对染色后的载玻片作光学分析，分析仪44可以与分析仪26相同。关于在与反应物36混合之前红血细胞的去除，见光学细胞筛选仪28。一般来说，当用磁性中心球去除红血细胞时这是优先选用的。这也可使用较少的令人感兴趣的中心球，因为去除红血细胞后就不会干扰中心球的结合了。当使用细胞溶解剂时，最好是在反应物36和样品30合并之后去除红血细胞，这样细胞暴露于细胞溶解剂的时间较短。
自动或半自动光学细胞筛选仪实施方案示于图3，一般以参照符号46表示。光学细胞筛选仪46包括样品制备仪48，它可在需要时除去红血细胞或血小板和加入一个或多个有不同抗体结合其上的不同的中心球组，其中的抗体对可存在于样品中的一种或多种类型的细胞上的不同抗原是特异的。样品制备仪48也最好使样品与中心球混合以便细胞与中心球迅速结合。
然后用载玻片制备仪50将等分试样或一部分制得的样品在载玻片上制成涂片。载玻片制备仪50可以是含有红血细胞的载玻片的常规载玻片制备仪，也可以是用于去除了红细胞的样品的载玻片旋转仪。
然后在染色仪52内给载玻片染色。一旦将载玻片染色后。可立即用光学显微镜54光学观测或分析样品。光学显微镜54可有多个输出端，即供使用者双眼观看的目测输出端56，拍摄细胞和中心球照片用的照相机输出端58，除目测输出端56之外的可供使用者观测用的录像输出端60，从显像输出端60可制得扫描带，和图像分仪机输出端62，它可自动扫描和鉴定细胞的形态及中心球的颜色和/或大小。可使用多种类型的常规图像分析仪，例如Inovision  Corp  Research  Triangle  Park，North  Carolina销售的图像分析仪和Perceptics  Corpora-tion，Knoxville，Tennessee销售的Bio  Vision工作台。
对于血液样品，每种生物样品含有至少第一组生物细胞（未示出），包括至少一种白血细胞群体，其具有至少一种可定义的亚型，例如全血样品中或来自全血样品的白血细胞群体。如本文所使用的，白血细胞亚型是特异性单克隆抗体可与之结合的白血细胞群体的亚型。世界卫生组织和国际免疫学学会已为单克隆抗体下了定义。单克隆抗体已用定义细胞或细胞群的特异性的群集标示（CD）命名法定义，这些单克隆抗体对该CD群是特异的。在下列实例例中使用了某些CD群。表Ⅰ中示出了单克隆抗体的命名、特异性和一些商业来源。
表Ⅰ
区分的群  抗体  特异性
（商业来源）
CD2（gp50）  T11（Coulter）  E玫瑰花结受体
OKT11（ortho）;
Leu5a（BD）
CD4（gp56）  T4（Coulter）  助细胞/诱导剂T
OK4a（ortho）;
Leu3a（BD）
CD5（gp67）  T1（Coulter）  所有成熟的T-细胞，
成熟的淋巴细胞，
B-细胞亚型
CD7（gp40）  3A1（Coulter）  T-细胞，多数T-ALL
CD8（gp32-33）  T8（Coulter）  细胞毒性/抑制剂T
OKT8（Ortho）;
Leu2a（BD）
CD10（gp100）  J5（Coulter）  普通急性淋巴母细胞
抗CALLA（BD）  白血病抗原，
前B细胞，
粒细胞
CD13（150）  MY7（Coulter）  单核细胞，
粒细胞，CF11-6
CD14（gp55）  MO2，MY4（Coulter）  单核细胞，
少数粒细胞
CD19（gp95）  B4（Coulter）  黑猩猩B细胞，
前BALL
CD20（gp35）  B1（Coulter）  除血浆细胞外的所有
Leu16（BD）  B细胞，B肿瘤细胞
骨髓瘤除外，一些非
T-ALL细胞
CDW29（gp135）  4B4（Coulter）  助细胞/诱导剂T
CD33（gp67）  MY9（Coulter）  早期髓样前期细胞，
髓样细胞，AML
CD34（gp115）  HPCA-1（BD）  髓样前期细胞
CD41（p130，115）  PLT-1（Coulter）  血小板和巨核细胞
agp-分子量为4道尔顿的糖蛋白
Coulter-Coulter  Immunology  Division  of  Coulter  Corpora-tion（Hialeah，Florida）
BD-Becton-Dickimson免疫细胞测定系统ortho-ortho诊断系统（Raritan，New  Jersey）
另外，可举例说明的有三种其它抗体，它们尚无CD命名。一种抗体是N特异性抗体，公开于美国专利4，931，395，题为MONOCLONAL  ANTIBOOY  SPECIFIC  TO  NEUTROPHILS。第二种抗体是N和E特异性抗体，公开于美国专利4，865，971，题为MONOCLONAL  ANTIBODY  SPECIFIC  TO  A  COMMON  DETERMINANT  SITE  OF  NEUTROPHILS  AND  EOSINOPHILS，在此授引这两篇专利文献作为参考。第三种抗体是所谓HLA-DR（p29/34），如Coulter提供的I3，其对MHCⅡ类HLADR、单核细胞、巨噬细胞、B细胞和活化T-细胞具有特异性。
虽然并非所有CD的实例都有一个以上的所列商业来源，但实际上所有CD的实例都可从上面所列的一个以上来源或其它易于辨认的商业来源获得。
所用的磁性中心球可以是任何适宜类型的，在实施例中使用的是直径为0.7和1.3微米，具有10%（重量/体积）固体的聚苯乙烯磁性中心球（Bangs  Laboratories  of  Carmel，Indiana销售的产品）。非磁性中心球也可以是任何适宜类型的，在实施例中使用的是直径1.05，2.17和3.06微米，具有8%（重量/体积）固体的无表面活性剂硫酸化聚苯乙烯胶乳中心球（Inter-facial  Dynamics  of  Protland，Oregon销售的IDC中心球）。
虽然这些特异性中心球用于举例说明，但也可使用其它常规来源的其它类型和大小的中心球。一般说来，最好使用直径为5微米或更小的中心球，因为有多个中心球结合到每个细胞上较好。同样，用较小尺寸的中心球可更好地保持载玻片和细胞的形态。然而，也可使用较大直径的中心球，10微米直径的非磁性中心球已被采用。但在这种情况下，多个细胞将与每个中心球结合，而不是多个中心球与每个细胞结合。
可以看出本发明的方法是足够特异的，单个的中心球即可表明抗原/受体存在于细胞上。然而，为了消除由于重合造成的潜在的假读数，认为只有结合两个或多个中心球的细胞才表明受体存在。一般来说，根据中心球的数目/浓度不同，一个以上的中心球将与每个显示特定抗原/受体的细胞结合。
一般来说，操作步骤如下：
1.将完全混合的全血加到EDTA管中（即试管中已含有EDTA），如果未在EDTA中采血。血液最好在EDTA中采集。
2.从EDTA管中取100μl血液加到试管中。
3.将适量的中心球加到血液中并涡旋混合物大约2-3秒钟。
4.盖上试管并温和混合一段时间以使细胞与中心球结合。已发现大约10分钟就足够了。
5.混合后，取出等分试样，制做血液涂片。涂片应类似于常用于计数差异的外周血涂片。
6.当载玻片完全干燥后，用赖特氏或赖特氏/吉姆萨氏染剂染色，染色方法与常规不同载玻片的染色方法相同。
7.用表明具有与之连接的中心球的细胞的40×或100X物镜在油浸没透镜上观看载玻片。
8.当某种细胞类型与两个或多个中心球牢固结合时可看到定量的阳性结果。细胞群体中特殊抗原的阳性程度可反映在被中心球结合的群体的细胞数目上。
按照总的白细细计数所建议的中心球与全血之比如下：
白血细胞计数（细胞/μl）（1.17微米中心球的1%溶液）
0-20，000  10μl
20，001-75，000  20ml
大于75，000  30ml
如果需要排空血小板，则在将血液加到试管（上述步骤2）之前使用下列程序。
1.将200μl  EDTA抗凝全血加到试管中。
2.加入20μl磁性PLT-1中心球。
3.混合一段足够的时间以使细胞与中心球结合。已发现15秒至2分钟的时间就足够了。
4.置于磁场中5分钟。
5.除去上清液（从全血中除去具有结合的血小板的中心球）。
6.用于上述步骤2。
图4说明了利用本发明的方法所确定的CD2对淋巴细胞的专一性。许多结合有T11专一性抗体的非磁性中心球64已显示被结合至RBC′S68还未被除去的载玻片上的淋巴细胞上。有一些游离（未结合）的T11中心球64′。嗜中性白细胞70证实了T11中心球64的专一性，因为它们不与嗜中性白细胞70结合。
尽管附图是按照标准的绘图习惯绘制成黑白的，但是实际的染色载玻片是有色的。关于这一点，如同常规，各种细胞的颜色如下：
嗜中性白细胞：细胞质为线粉色且较小，各种颗粒为线粉色至蓝黑色。细胞核为深蓝紫色。
胚细胞：细胞质为蓝色且染色不均匀，细胞核为紫色。
淋巴细胞：细胞质为蓝色，细胞核为深蓝紫色。
嗜曙红细胞：细胞质被染色成红橙色的大型球状颗粒所遮蔽。细胞核为深蓝紫色。
单核细胞：细胞质为蓝灰色，细胞核为深蓝紫色。
嗜碱性细胞：颗粒体为深紫色，细胞核为轻浅的线色。颗粒体遮蔽了细胞质。
红血细胞：细胞为红色，但中部颜色较浅。
血小板：细胞为线蓝色，具有较少的蓝色颗粒。
另外，磁性类型的中心球为红棕色，非磁性中心球为白色。这使得细胞和中心球彼此易于区别。根据需要，中心球也可以是产生差异的其它颜色、大小和形状。
图5显示了结合了4B4专一性抗体的许多非磁性中心球72与许多的血小板74结合，而这些血小板似乎是由中心球72团聚在一起。由于4B4专一性抗体如所示的那样与血小板结合并且也将与某些L′S结合，因此在对样品进行4B4型L′S分析前，首先应排空血小板。
图6说明了结合有B1专一性抗体的许多中心球76与存在B细胞CLL的淋巴细胞78结合。中心球76是3μm的中心球，而中心球64和72则是2μm的中心球。该图显示了许多淋巴细胞78上结合了中心球76，暗示了B细胞CLL的存在，因为正常血液中很少有L′S为B1型淋巴细胞。
图7中，淋巴细胞78在另一样品部分中再次与许多中心球80混合，该中心球80上结合了J5专一性抗体。中心球80将与某些类型的CLL结合。因此，中心球80的未结合（已显示两个游离的中心球80连接一个RBC68）则说明淋巴细胞78缺乏J5结合的CALLA。
图8说明的是三种中性白细胞82，每种细胞具有许多的中心球84，其上结合了N和E专一性抗体，如前面所提到的。该图说明了N和E中心球对嗜中性白细胞82的专一性。在每一实例中均对整个载玻片或其大部分进行了测定以证实中心球不与其专一性之外的任何其它WBC′S结合。
图9说明的是两种嗜中性白细胞86，每种细胞上均结合了许多中心球88。中心球88上再次结合有N和E专一性抗体。在此，中心球为磁性，直径相当于1μm，非磁性中心球在载玻片上为白色，磁性中心球的颜色为淡棕色，它能够从颜色上以及大小区别于非磁性中心球。
这一差别在图10中得到最好说明，其中已证实单个嗜中性白细胞90上结合了许多2μm的非磁性白色中心球92，而中心球92上则结合了N专一性抗体（如前所述）。嗜中性白细胞90上也结合了许多1μm磁性淡棕色中心球94，而中心球94上则结合了N和E专一性抗体。从而使得同时鉴定为具有两个或多个感兴趣抗原的特定细胞能够被鉴定。
如图4-10所示，RBC′S通常不被除去。图4-10所示的涂片是通过观察具有所有细胞的血细胞的常规方式制备的。而且，细胞离心能够破坏细胞，尤其是异常细胞的形态，因此是不可取的。但是，当仅存在相当于或低于约1000-2000WBC′S/μ1的极低WBC计数时，能够非常容易地除去RBC′S。WBC′S的浓度大大地有助于其观察。应该以最少限度地影响剩余细胞形态的方式除去RBC′S。
一个可取的除去RBC′S的方式是向样品中加入溶解液，然后再加入终止液。优选的溶解液可以是浓度约为0.21%（w/v）的柠檬酸-水合物与浓度约为0.02%（w/v）的皂素的混合物。优选的终止液可以是浓度约为2.9%（w/v）的氯化钠与浓度约为0.59%（w/v）的碳酸氢钠的水溶液。推荐使用制菌剂，如浓度约为0.01%（w/v）的叠氮化钠，但它并不需要在溶解液和终止液中同时使用。
一般来说，利用上述溶解液和终止液时，其方法如下：
1.向试管中加入100μl  EDTA全血。
2.向血液中加入适当量的中心球，如40μl浓度为2×107/ml的中心球。
3.温和地混合足够时间，如约10-30分钟，使细胞与中心球结合。
4.取出35ml混合物，加至12×75mm的试管中。
5.加入500μl溶解液并轻微涡动。
6.迅速加入250μl终止液。
7.保温约1分钟。
8.根据需要，加入100ml  5%BSA于PBS中的缓冲液。
9.将400ml混合物加至细胞离心装置中，并以500rpm的转速旋转5分钟以将细胞转至载玻片上。
10.步骤10与第页上所述方法的步骤6-8相同。
也可利用前面所述的磁性中心球除去RBC′S。
图11显示的是排除了除WBC′S之外的所有细胞的细胞离心载玻片。除去可能存在的RBC′S并根据需要除去其它细胞，然后将剩余的细胞旋转离心至载玻片上以浓缩细胞，并除去过量的水分。这有助于观察所需细胞，由于这类细胞在全血样品中的数量相对较少，因此难以定位。图11证实许多中心球96上结合了T11专一性抗体，该中心球96与三种淋巴细胞98结合，但它不与嗜中性白细胞100或单核细胞102结合，这后两种细胞也暴露于中心球96。
图12是通过细胞离心制得的另一个载玻片，它说明许多中心球104上结合了N和E专一性抗体，该中心体104与数个嗜中性白细胞106结合但不与单核细胞108结合。
尽管通过特定的实例说明了通过大小和颜色区别的中心球的使用，但也可通过它们所具有的不同形状区别中心球。
在本发明的实施过程中还观察到两个另外的现象，即装边和载玻片凝集。这两种现象均称作细胞团集。装边现象发生在具有大量的对特定抗原阳性的细胞的全血样品中。该现象是全血与中心球在反应容器（如试管）中混合或保温的过程中被观察到的。阳性细胞和中心球趋向于沿全血外表面凝集，在试管上形成一个细微的边。该边仅可在阳性样品中见到。在显微镜载玻片上也可观察到类似的凝集现象。将一滴全血加到载玻片上并通过轻轻振动载玻片将其与一滴包衣了抗体的乳汁珠混合，就可在含有大量的对相应的特定抗原阳性的细胞的样品中观察到肉眼可见的凝集现象。该凝集现象在载玻片上表现为在红血背景下的白色团块，肉眼可见。
这些凝集反应能够在适宜的条件下提供一个快速筛选高WBC数的方法。利用每微升约为或高于40-50，000个细胞的总WBC细胞数（正常WBC细胞的范围为4-11，000个/μl）已观察到这些现象。尽管无需借助其它装置就可用肉装观察到细胞团聚，但仍可利用手动或自动操作的显微镜装置或其它光学仪器。另外，也可通过用光束对混合容器进行手动或自动光学扫描而用肉眼观察到装边现象，当发生装边现象时光束会产生衍射图案。
图13说明许多中心球110上结合了第二反应物，该第二反应物与第一反应物结合，而第一反应物反过来又与细胞112上的特定分子结合。在这种情况下，该细胞表达与第一反应物相结合的CD34抗原。第一反应物，如HPCA-1不易以直接与中心球110结合的适宜浓度得到。因此，将第二反应物（这里是山羊抗鼠抗体）与中心球结合。该第二反应物将与任何鼠抗体结合，因此中心球110将与结合到细胞112上的中心球上的第一反应物结合。与第二反应物结合的第一反应物和中心球110也将同时与样品结合在一起。或者，可将第一反应物与中心球110上的第二反应物结合，然后，与第二反应物结合并且也与第一反应物结合的中心体110将通过第一反应物而与样品结合。单独与细胞112结合而无中心球110的第一反应物则不能通过肉眼或显微镜加以区别。
一般来说，第一种方法的步骤如下：
1.步骤1与第18页上所述方法的步骤1和2相同。
2.加入10μl的第一反应物，并且涡动混合物约2-3秒钟。
3.将混合物保温约10分钟。
4.加入10μl其上结合了第二反应物的中心球。
5.步骤5与第18页上所述方法的步骤4-8相同。
图5-12所述的其它类型方法也可用在图13所述的反应物结合类型上。可向第二样品部分中加入具有不同反应物的其它组中心球，这些中心球具有区别于彼此的不同大小和/或颜色。也可在第一样品部分中将具有不同反应物的一套或多套中心球与第一和第二反应物结合。但是，在这一方法中其它反应物必须是不同于第二反应物的其它类型，否则中心球也将与第二反应物结合。例如，当第二反应物是抗鼠抗体时，其它反应物可以是猪、兔或其它不同类型的抗体。
利用图13所述的不同方法的目的是为了确定各种方法的效果。第一个例子是，通过温和涡动将5μlT4抗体加到100μl全血中。将该混合物静置或保温10分钟。保温之后，加入10μl中心球，轻轻涡动并在滚筒式振荡器上混合10分钟，然后按照前述方法制除片。其结果是中心球与L′S的正常结合，两个实例分别为37%和44%。
在第二个例子中，是将中心球和T4抗体同时加入，并在滚筒上振荡10分钟，然后制成载玻片。其结果是两个实例的百分数分别下降为28和31。
在第三个例子中，是在无任何抗体的情况下加入中心球并混合，然后制成载玻片。在此例中，正如所料，未发现中心球与细胞结合。
在另一例子中，是将T4抗体与样品在滚筒中振荡10分钟，然后加入中心球并混合10分钟，最后制成载玻片。它产生正常的百分数36。
在最后一个例子中，是将中心球与T4抗体一起混合并静置10分钟。然后将该混合物加至样品部分并混合10分钟，最后制成载玻片。得到较低的百分数23和27。一种解释是混合物中剩余的部分游离抗体封闭了中心球所要结合的某些位点。
图14显示的是骨髓样品中的几个嗜中性白细胞114，每个细胞上均结合了许多中心球116。中心球116上结合了N专一性抗体。该例子说明了该方法对除血液之外的其它类型液体（这里是骨髓）的效力。
图15和图16进一步说明了本发明的实例。
母申请的方法同样可用于筛选癌细胞，如同在母申请中所提到和在下面将要更具体叙述的那样。不同类型的癌细胞表达出不同的特定分子，从而可以利用特定的单克隆抗体来协助区分各种类型的癌症。这种区分极其重要，因为时间是关键，并且不同类型的癌症需要采用不同的治疗方法。
而且，仅通过细胞染色并观察细胞的形态可能不足以确定具体的癌症类型。或者，病理学家可能需要进一步的信息以证实形态评估的结果。当需要这类信息时，通常是利用带有荧光单克隆抗体的流动血细胞计数仪器来提供该信息。
表Ⅱ显示了一个这类流动血细胞计数单克隆抗体板。
表Ⅱ
白血病/淋巴瘤免疫表现型鉴定板
相关/限制
MAb  B-细胞  T-细胞  髓单核细胞
HLA-DR + -a+b
CD19  +  -  -
CD10 +c- -
CD20 +d- -
CD2  -  +  -
CD5 -c+ -
CD7 - + -f
CD13  -  -  +
CD33  -  -  +
CD14 - - +g
a后胸腺T细胞恶性肿瘤通常为HLA-DR，而T-细胞急性白血病和淋巴瘤几乎总是HLA-DR。
bHLA-DR普通存在于成髓细胞上，但不存在于前髓细胞上。因此，成单核细胞及其子代始终为HCA-DR;急性前髓细胞白血病（M3）几乎总是HLA-DR。
c非常频繁，CD10在滤泡淋巴瘤中为阳性。
d由于CD20在个体发育时出现较晚，因此它不象CD19在急性白血病中那样普遍地表达。但是，它几乎总是存在于B细胞淋巴瘤中。
eCD5在正常循环的B细胞小亚群上共同表达。它是鉴别慢性淋巴细胞白血病的有用标记物，在此处CD5于亚性肿瘤B细胞上同时表达。
fCD7以小百分比存在于别的普通急性骨髓白血病中。它通常为后胸腺T细胞恶性肿瘤阴性，因此它的缺乏可用于T细胞恶性肿瘤的早期检测。
gCD14实际上限制于成熟的单核细胞。因此，它被用于从胚细胞或单核细胞前体中分离单核细胞，胚细胞和单核细胞前体通常为HLA-DR阳性，CD14阴性。
表Ⅱ选自Landay、A.L.and  Dugue，R.E.In  press，1991  Hematopoietic  Neoplasmas.Manual  of  Clinical  Laboratory  Immunology，American  Societyfor  Microbiology，Washington，D.C.该表是利用流动血细胞计数单克隆抗体荧光染料加以说明的，但是正如前面所述，这类流动血细胞计数仪器不是总能够得到，从而大大地耽搁了时间。
本申请人发现，在没有流动血细胞计数仪器的情况下使用本发明的中心球时同样可以应用信号测定。可利用其上结合了各种单克隆抗体的不同组中心球的板子来对样品中存在的癌症类型这一信息进行快速筛选。例如，利用在一个或多个涂片上几套可光学区分的中心球或利用每一涂片上的不同组中心球或者将二者结合在一起，可提供快速筛选的信息。存在于不同组中心球上的大多数或全部中心球可包括如下单克隆抗体：
HLA-DR  -如但不限于I3
B淋巴细胞  -如但不限于CD19
T-细胞  -如但不限于CD2
单核细胞  -如但不限于CD14
骨髓细胞  -如但不限于CD33
申请人也已发现，KC-48似乎也能提供有关骨髓白血病的信息。
利用本发明，对从病理学家那获得的并被鉴定为急性骨髓白血病（AML）的样品进行信息筛选，以证实它确为AML癌症。AML是一种早期癌症，其成熟细胞很少。因此，与中心球结合了的单克隆抗体应与未成熟细胞结合以区分该类癌细胞。利用其中13和KC48单克隆抗体为轻微阳性至中等阳性（即在每一细胞上按中等数量与中等数量的细胞结合）的各个涂片，通过快速筛选板证实了上述推断。T11单克隆抗体中心球与样品中的少量成熟L′S结合。骨髓（这里是CD34）单克隆抗体中心球仅为很弱的阳性，而MY4和B4单克隆抗体中心球为阴性，即不与任何细胞结合。
如果快速筛选板的结果是确定性的，那么病理学就可在不需其它信息的情况下决定治疗方案。如果快速筛选板的结果不是确定的，那么病理学家可通过例如流动血细胞计数仪器获得进一步的信息。
也可利用本发明获得进一步的信息，例如，如果原始快速筛选板上显示的是T-细胞阳性癌症，则可利用另外的载玻片来提供进一步的信息。例如，然后利用CD4、CD8和CD10来进一步确定癌症的类型。一些不同类型的癌症包括上面所提到的ALL和AML、慢性淋巴细胞白血病（CLL）以及人T-细胞亲淋巴性病毒-1（HTLV-1）白血病。HTLV-1染色的细胞与B-细胞癌在形态上可能难以区分，但是其差别是很大的。通过在两个分开的染色样品中使用中心球或者在一个染色过的载玻片上使用两组可区分的中心球，可以将这两类癌症区分开来。举例来说，两组中心球之一上可以结合有T4单克隆抗体，而另一组中心球上可以结合有T8单克隆抗体。如果仅T4组中心球与细胞结合，那么癌症很可能是HTLV-1。如果T8组中心球也与大部分细胞结合，那么癌症可能不是HTLV-1，还必须对样品更多的信息作进一步的分析。当病理学家为了证实HTLV-1型白血病时，他可以对血清样品作进一步的分析以证实HTLV-1病毒的存在。
在图15中，是用一对癌细胞120来说明被怀疑为HTLV-1癌的样品，其中加入了结合有CD8专一性抗体的中心球。利用了一个游离的中心球122，细胞120很明显地不与中心球122结合。
图16说明的是在图15中所说明的怀疑为HTLV-1癌样品的不同样品部分中的一对癌细胞120。在该样品部分中，结合了CD4专一抗性的许多中心球124很明显地与细胞120结合。无CD8专一性抗体结合于细胞120而有CD4专一性抗体结合于细胞120这一情况强有力地说明细胞120为HTLV-1白血病细胞。
如果病理学家已测定出该癌症为淋巴瘤类型的癌症，则仅需快速筛选板提供有关是B-细胞还是T-细胞淋巴瘤方面的信息。
另一个提供快速癌症筛选信息的方法是利用磁性中心球并在结合后通过磁力排除结合细胞。在这一例子中，首先制备一个无中心球的标准涂片以作为对照。然后将通过磁力排除过的第二块涂片与对照涂片进行比较。如果感兴趣的形态细胞或其大部分被除去，那么癌症或其部分细胞则对与中心球一起使用的那类单克隆抗体阳性。在这种情况下单独排除过的涂片将为需要筛选的每一种单克隆抗体所利用。

Claims (44)

1、一种光学筛选显微癌细胞的方法，其包括：
提供包含大量细胞，其中至少一部分显示是癌细胞的样品；
将至少第一部分所述细胞和至少第一组中心球结合起来，该中心球具有至少能结合到所述细胞上的第一反应物，该反应物对至少第一特异分子有专一性，该专一分子存在于至少一种类型的癌细胞上；
在含所述中心球的载玻片上制备所述细胞的涂片；
用组织学染色法将所述涂片染色；和
用显微镜光学观察至少一些细胞以便至少鉴定可与所述第一组中心球结合的细胞是否存在，从而提供辨别癌症信息。
2、权利要求1定义的方法，其包括提供全血样品或部分全血样品并用Wright类染料将所述涂片染色。
3、权利要求2定义的方法，其中所述第一反应物是对至少所述第一特异分子有专一性的抗体，该专一分子是第一细胞抗原。
4、权利要求2定义的方法，其包括加螯合剂到所述样品中以防止嗜中性白细胞群体吞食所述中心球。
5、权利要求2定义的方法，其包括将所述涂片进行图像分析。
6、权利要求2定义的方法，其包括鉴定至少一些所述细胞的形态特征并鉴定所述特征细胞上结合的中心球的存在或不存在。
7、权利要求1定义的方法，其包括对所述涂片进行图像分析。
8、权利要求1定义的方法，其包括将所述第一批所述细胞与具有至少能结合到其上的第二反应物的至少第二组中心球结合，该第二组反应物对至少第二特异分子是专一性的，第二特异分子存在于至少一种类型细胞上，所述第二组中心球具有与所述第一组中心球不同的光学特征，用显微镜光学观察至少一些所述细胞以至少鉴定与第二组中心球结合的细胞是否存在。
9、权利要求8定义的方法，其包括同时将所述第一批的所述细胞与至少所述第一和第二组中心球结合。
10、权利要求8定义的方法，其中所述第一和第二组的所述中心球在大小上存在着物理差异。
11、权利要求8定义的方法，其中所述第一和第二组所述中心球在颜色上存在着光学差异。
12、权利要求1定义的方法，其包括将至少第二批所述细胞与具有至少可结合到该细胞上的第二反应物的至少第二组中心球相结合，该第二反应物对至少第二特异分子有专一性，该第二特异分子存在于至少第二类癌细胞上;
在含所述中心球的载玻片上制备所述细胞的涂片;
用组织学型染料将所述涂片染色;和
用显微镜光学观察至少一些所述细胞以至少鉴定可与所述第二组中心球结合的细胞是否存在。
13、权利要求12定义的方法，其中所述第一和第二组所述中心球在大小上存在着物理差异。
14、权利要求12定义的方法，其中第一和第二组所述中心球在颜色上存在着光学差异。
15、权利要求12定义的方法，其中所述第一反应物是CD4单克隆抗体，所述第二反应物是CD8单克隆抗体，可与所述CD4和CD8单克隆抗体中心球结合的细胞是否存在是HTLV-1白血病的标志。
16、权利要求1定义的方法，其包括将许多不同批的所述细胞分别与不同组的中心球结合，每组中心球具有可结合到所述细胞上的不同反应物，不同反应物对不同的特异分子有专一性，不同的特异分子存在不同类型的癌细胞上;
在含所述中心球的不同载玻片上制备所述不同细胞的不同涂片;
用组织学染剂将每一涂片染色;和
用显微镜光学观察每一所述涂片上的至少一部分所述细胞，以便至少鉴定可与所述种类中心球结合的细胞是否存在，从而提供了一种快速鉴定癌症的方法。
17、权利要求1定义的方法，其包括将第一批所述细胞与许多种类中心球混合，每种中心球具有可与所述细胞结合的不同反应物，不同的反应物对不同的特异性分子是专一的，不同特异性分子存在于至少一种癌细胞上，各种所述中心球相互具有不同的光学特征，用显微镜从光学上观察至少一部分细胞并至少鉴定可与所述不同组中心球结合的细胞是否存在。
18、权利要求17定义的方法，其包括同时将所述第一批所述细胞与所述的多组中心球混合。
19、权利要求17定义的方法，其中每组所述中心球在大小或颜色上存在着物理学差异。
20、权利要求1定义的方法，其包括提供全血样品或部分全血样品和至少一些所述细胞的形态学特征，鉴定在许多所述细胞上存在着许多与之结合的中心球。
21、权利要求1定义的方法，其包括将所述第一批所述细胞与所述第一组中心球结合。
22、光学筛选显微癌细胞方法，其包括：提供样品，该样品包括大量细胞，其中至少一些细胞显示是癌细胞;
在载玻片上制备第一批所述细胞的第一涂片;
用组织学染色将所述第一涂片染色;
用显微镜从光学上观察至少一部分所述细胞，
以至少鉴定潜在癌细胞的存在;
将至少第二批所述细胞与至少结合了第一反应物的至少一组中心球结合，该第一反应物对至少一种特异分子是专一性的，该特异分子存在于至少一种癌细胞上;
用可与所述中心球结合的任何细胞从上述第二批中除去所述种类中心球;
在含所述中心球的载玻片上制备所述细胞的第二涂片;用组织学染色将所述第二涂片染色;和在所述第二涂片上光学观察至少一些所述第二批细胞并将所述第二涂片与所述第一涂片进行比较以鉴定所述潜在癌细胞是否存在。
23、用于光学鉴定样品中的癌症微观细胞的仪器，样品包括许多细胞，其中至少一些细胞显示是癌细胞，该仪器包括：
用于将至少第一批所述细胞与至少第一组中心球结合的装置，该中心球含至少可与所述细胞结合的第一反应物，该反应物对至少第一特异分子有专一性，该特异分子存在于至少一种癌细胞上;
用于在含所述中心球的载玻片上制备所述细胞涂片的装置。
用组织学染色将所述涂片染色的装置;和用显微镜从光学上观察至少一些细胞以至少鉴定与所述第一种微球体结合的细胞是否存在，从而提供癌症鉴定信息的装置。
24、权利要求23定义的仪器，其包括所述样品是全血样品或部分全血样品，和用Writht型染色将所述涂片染色的装置。
25、权利要求24定义的仪器，其中所述第一反应物是抗体，其对至少所述第一特异分子是专一性的，该特异分子是第一细胞抗原。
26、权利要求24定义的仪器，其包括用于加螯合剂到所述样品中以防止嗜中性白细胞群体吞食所述中心球的装置。
27、权利要求24中定义的仪器，其包括用于图像分析所述涂片的装置。
28、权利要求24定义的仪器，其包括用于定至少一些所述细胞的形态特征的装置和用于鉴定结合在所述特征细胞上是否存在结合的中心球的装置。
29、权利要求23定义的仪器，其包括用于图像分析所述涂片的装置。
30、权利要求23定义的仪器，其包括用于将所述第一批所述细胞与至少第二组中心球结合的装置，该中心球具有可结合到所述细胞上的第二反应物，该反应物对至少第二特异分子有专一性，该特异分子存在于至少一种细胞上，所述第二组中心球与所述第一组中心球存在着不同光学特征，和用显微镜从光学上观察至少一些所述细胞以至少鉴定可与第二组中心球结合的细胞是否存在的装置。
31、权利要求30定义的仪器，其包括用于同时将所述第一批所述细胞与至少第一和第二组中心球结合的装置。
32、权利要求30定义的仪器，其中所述第一和第二组所述中心球在大小上存在着物理学差异。
33、权利要求30定义的仪器，其中第一和第二组所述中心球在颜色上存在着光学差异。
34、权利要求23中定义的仪器，其包括：
用于将至少第二批所述细胞与至少第二组中心球结合的装置。该中心球具有可结合到所述细胞上的第二反应物，该反应物对至少第二特异分子有专一性，该特异分子存在于至少第二种癌细胞上;
用于在含中心球的涂片上制备所述细胞涂片的装置;
用组织学染色将所述涂片染色的装置;和
用显微镜从光学上观察至少一些所述细胞以至少鉴定可与所述第二组中心球结合的细胞是否存在的装置。
35、权利要求34定义的仪器，其中所述第一和第二组所述中心球的大小上存在着物理学差异。
36、权利要求34定义的仪器，其中第一和第二组所述中心球在颜色上存在着光学差异。
37、权利要求34定义的仪器，其中所述第一反应物是CD4单克隆抗体，所述第二反应物是CD8单克隆抗体，可与所述CD4和CD8抗体中心球结合的细胞存在与否是HTLV-1白血病的标志。
38、权利要求23定义的仪器，其包括：用于将许多不同批的所述细胞分别与不同组的中心球结合的装置，每组中心球含可结合到所述细胞上的不同反应物，该不同反应物对不同的特异分子有专一性、而不同特异分子存在于不同类型的癌细胞上;
用于在含所述中心球的不同载玻片上制备所述不同细胞的不同涂片的装置;
用组织学染色将每种所述载玻片染色的装置;和
用显微镜从光学上观察在每种所述载玻片上的至少一些所述细胞以至少鉴定可与所述组中心球结合的细胞是否存在，从而提供快速鉴定癌症方法的装置。
39、权利要求23定义的仪器;其包括：将所述第一批所述细胞与许多组的中心球相结合的装置，每组中心球含可结合到所述细胞上的不同反应物，该反应物对不同特异分子有专一性，该特异分子存在于至少一种癌细胞上，各种所述中心球相互存在着不同光学特征，和用显微镜光学观察至少一些所述细胞以鉴定可与所述不同组中心球结合的细胞是否存在的装置。
40、权利要求39定义的仪器，其包括同时将所述第一批所述细胞与所述许多组中心球结合的装置。
41、权利要求39定义的仪器，其中每个所述组中心球都在大小或颜色上存在着差异。
42、权利要求23定义的仪器，其包括：所述样品是全血样品或部分全血样品，和用于定至少一些所述细胞的形态特征的装置，其还包括鉴定在所述特征细胞上的许多结合的中心球的存在。
43、权利要求23定义的仪器，其包括将所述第一批所述细胞与所述第一组中心球混合的装置。
44、用于在样品中光学鉴定癌症的微观细胞的仪器，样品包括许多细胞，其中至少一些细胞显示是癌细胞，该仪器包括：
在载玻片上制备第一批所述细胞的第一涂片的装置;
用组织学染色将所述第一涂片染色的装置;
用显微镜光学观察至少一些细胞以至少鉴定存在的潜在癌细胞的装置;
将至少第二批所述细胞与至少一组中心球结合的装置，该中心球具有至少一种可与所述细胞结合的第一反应物，该反应物对存在于至少一种癌细胞上的至少一种特异分子有专一性;
用可与所述中心球结合的任何细胞从所述第二批细胞中除去所述组中心球的装置;在含所述中心球的载玻片上制备所述第二批细胞的第二涂片的装置;
用组织学染色将所述第二涂片染色的装置;在所述第二涂片上光学观察至少一些所述第二批细胞的装置和将所述第二涂片与所述第一涂片比较以鉴定所述潜在类型癌细胞是否存在的装置。
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