CN114031953B - 一种cd系列细胞检测的染色介质及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种CD系列细胞检测的染色介质，包括：碱性品红、亚硝基铁氰化钠、3,3',5,5'‑四甲基联苯胺；其中，各组分的重量以同一溶剂为参照，按以下质量体积比计，染料含量为0.0005‑0.0011g/ml，3,3',5,5'‑四甲基联苯胺含量为0.002‑0.009g/ml，亚硝基铁氰化钠含量为0.024‑0.036g/ml；还包括乙醇。一种CD系列细胞检测的染色液的制备方法，包括如下步骤：S1、按重量百分含量计，称取一定量的碱性品红、亚硝基铁氰化钠、3,3',5,5'‑四甲基联苯胺；S2、将上述试剂依次倒入内包装袋中，然后封口，配制成染色粉；S3、将上述配制好的染色粉倒入体积百分比浓度为85％‑88％的乙醇溶液中，充分搅拌均匀后，室温密闭避光放置。本发明的染色介质灵敏度高、稳定性好，不仅提升细胞染色效果，而且使用安全。
Description
技术领域
本发明涉及一种CD系列细胞检测的染色介质及其制备和应用。
背景技术
人体血细胞在分化成熟为不同谱系、分化为不同阶段及细胞活化过程中，出现或消失的细胞表面标记被称为白细胞分化抗原，1982年第一届人类白细胞分化抗原专题讨论会上决定将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的同一分化抗原(cluster ofdifferentiation)称为CD。不同的血细胞表面分布有不同CD分子，借助这些CD分子，可以进行细胞鉴定分离。目前，人类CD抗原编号现已达到CD363。
在该命名系统中，特定细胞群表面的特异性抗原存在与否分别用“+”或“-"标注，并用hi(高)或low(低)标记细胞表达水平。例如临床通常以CD3+CD4+CD8-和CD3+CD4-CD8+分别用作辅助T细胞和细胞毒性T细胞的标记；再如CD4分子在辅助/调节性T细胞和单核细胞表面都有表达，但存在表达水平的高低之分。
当血细胞中辅助/调节性T细胞和单核细胞同时被CD系列细胞检测玻片捕获后，如何采用一种简单、安全的染色方法，快速将二者进行区分，是本领域技术人员急需解决的技术问题。
发明内容
针对上述现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种灵敏度高、稳定性好，不仅提升细胞染色效果，而且使用安全的染色介质及其制备和应用，该染色介质用于CD系列细胞检测。
本发明提供的技术方案如下：
一种CD系列细胞检测的染色介质，包括：碱性品红、亚硝基铁氰化钠、3,3',5,5'-四甲基联苯胺；其中，各组分的重量以同一溶剂为参照，按以下质量体积比计：
染料含量为0.0005-0.0011g/ml，
3,3',5,5'-四甲基联苯胺含量为0.002-0.009g/ml，
亚硝基铁氰化钠含量为0.024-0.036g/ml。
优选的，所述染色介质还包括溶剂乙醇。
进一步的，乙醇的体积百分比为85％-88％(v/v)。
优选的，所述染料为碱性品红或者中性红。
优选的，所述染色介质为：以0.25g-0.55g碱性品红、12g-18g亚硝基铁氰化钠、1g-4.5g TMB溶解于500ml 85％-88％(v/v)乙醇中。
本发明还提供了一种CD系列细胞检测的染色粉的制备方法，包括如下步骤：
S1、称取一定量的染料、亚硝基铁氰化钠、3,3',5,5'-四甲基联苯胺，其中，以同一溶剂为参照，染料含量为0.0005-0.0011g/ml，3,3',5,5'-四甲基联苯胺含量为0.002-0.009g/ml，亚硝基铁氰化钠含量为0.024-0.036g/ml；
S2、将上述试剂依次倒入内包装袋中，然后用封口机封口，配制成染色粉。
本发明还可以提供一种CD系列细胞检测的染色液的制备方法，包括如下步骤：
S1、称取一定量的染料、亚硝基铁氰化钠、3,3',5,5'-四甲基联苯胺，其中，以同一溶剂为参照，染料含量为0.0005-0.0011g/ml，3,3',5,5'-四甲基联苯胺含量为0.002-0.009g/ml，亚硝基铁氰化钠含量为0.024-0.036g/ml；
S2、将上述试剂依次倒入内包装袋中，然后用封口机封口，配制成染色粉；
S3、将上述配制好的染色粉倒入体积百分比浓度为85％-88％的乙醇溶液中，充分搅拌均匀后，室温密闭避光放置。
进一步的，步骤S3中，将染色粉缓慢倒入烧杯中，加入乙醇，充分搅拌后室温密闭避光放置12小时以上，即可使用。
本发明还可以提供一种CD系列细胞检测的试剂盒，包括上述的染色介质，还包括过氧化氢工作液，用于检测区分CD系列细胞和单核细胞。
本发明还可以提供一种CD系列细胞检测的染色介质的应用，通过如下步骤检测CD系列细胞：
S1、配制染色液；
S2、配制过氧化氢工作液：将过氧化氢溶液加入纯水中，搅拌均匀后制成过氧化氢工作液；
S3、将固定好血细胞的玻片放入过氧化物酶染色液中，静置；
S4、将稍加沥干的玻片放入过氧化氢工作液中，静置；
S5、在空气中干燥或用纸轻轻吸干的玻片置显微镜下进行观察区分。
优选的，所述过氧化氢工作液的制备方法包括如下步骤：
S1、取350-550ml纯化水；
S2、在上述纯化水中加入1mL体积百分比浓度为2％-4％的过氧化氢溶液，混匀。
优选的，单核细胞呈蓝黑色颗粒；CD系列细胞呈红色颗粒。
本发明的有益效果体现在：
(1)本发明提供的成品染色液稳定性好，安全性高，其中主要成分3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)也即TMB进入细胞与细胞质中的过氧化物酶反应，具体的，过氧化物酶将过氧化氢分解，释放出氧原子，氧原子将TMB氧化，使反应后形成多聚体四甲基联苯胺蓝，在过氧化物酶活性部位产生粗大的、深蓝色沉淀物四甲基联苯胺蓝，同时沉淀物使得过氧化物酶的活性部位更加暴露，利于酶氧化反应进行。
(2)由于四甲基联苯胺蓝会自我脱氢氧化成棕色的四甲基苯醌二胺，本发明的染色介质中，配比的设计尤为重要，以0.024-0.036g/ml的亚硝基铁氰化钠，跟0.002-0.009g/ml的3,3',5,5'-四甲基联苯胺与过氧化物酶形成的四甲基联苯胺蓝结合，发生定点稳定作用，亚硝基铁氰化钠促进蓝黑色或蓝灰色物质的形成，形成稳定的蓝色颗粒。而如果超过该范围，因亚硝基铁氰化钠在整体组分中的含量变少或变多导致与四甲基联苯胺蓝键合程度减少或受到负面影响，或者因3,3',5,5'-四甲基联苯胺含量偏少或偏多导致亚硝基铁氰化钠与四甲基联苯胺蓝的定点结合程度不够，容易造成单核细胞未被充分染色而蓝黑色较浅、甚至没有被染成蓝黑色，或者造成蓝黑色颗粒不稳定而分解，从而被碱性品红的红色覆盖，会干扰对单核细胞和CD系列细胞的扫描计数，影响检测结果准确性。同时，本发明中所采用的0.0005-0.0011g/ml的碱性品红，一方面将不含过氧化物酶的细胞染成均匀饱满的红色，从而与被染成蓝色的含过氧化物酶的细胞进行区分，便于对不含过氧化物酶的细胞进行观察和分析；另一方面，结合整体的配方设计，促使各组分之间达到协调的最佳性能，即使是在新鲜配制染液时，也能达到较好的结果，实际操作中很好的解决了细胞偏小、颜色偏深带来的问题，可使细胞保持良好的大小和形态，促进稳定蓝色颗粒的形成。
(3)本发明提供的染色介质成品化生产方法，操作简单，制备成本较低，主要成分取代了现有试剂的致突变风险高、有致癌作用的不安全问题，且经济效益和环境效益良好。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
根据本发明提供的一种实施例，为一种CD系列细胞检测的染色介质，包括：碱性品红、亚硝基铁氰化钠、3,3',5,5'-四甲基联苯胺；其中，各组分的重量以同一溶剂为参照，按以下质量体积比计：
染料含量为0.0005-0.0011g/ml，
3,3',5,5'-四甲基联苯胺含量为0.002-0.009g/ml，
亚硝基铁氰化钠含量为0.024-0.036g/ml。
根据本实施例，提供了一种全新配方设计的染色介质，染料(0.0005-0.0011g/ml)可使细胞保持良好的大小和形态，饱和的亚硝基铁氰化钠(0.024-0.036g/ml)可以稳定TMB(0.002-0.009g/ml)被氧化的产物四甲基联苯胺蓝，从而使颜色稳定。多组分以适当的配比进行恰到好处的协同作用，极大的降低了对单核细胞和CD系列细胞的扫描计数的干扰，提升了检测结果的准确性。其中，所述染料为碱性品红或者中性红等等其他试剂。
基于本实施例的染色介质，可以提供一种CD系列细胞检测的染色粉的制备方法，包括如下步骤：
S1、称取一定重量的碱性品红、亚硝基铁氰化钠、3,3',5,5'-四甲基联苯胺，其中，以同一溶剂为参照，染料含量为0.0005-0.0011g/ml，3,3',5,5'-四甲基联苯胺含量为0.002-0.009g/ml，亚硝基铁氰化钠含量为0.024-0.036g/ml；
S2、将上述试剂依次倒入内包装袋中，然后用封口机封口，配制成染色粉。
作为优选的实施例，为了便于检测CD系列细胞，染色介质中还包括溶剂乙醇。更优的，所述染色介质为：以0.25g-0.55g染料、12g-18g亚硝基铁氰化钠、1g-4.5g TMB溶解于500ml 85％-88％(v/v)乙醇中。
基于本实施例的染色介质，还可以提供另一种CD系列细胞检测的染色液的制备方法，包括：
S1、称取一定重量的碱性品红、亚硝基铁氰化钠、3,3',5,5'-四甲基联苯胺，其中，以同一溶剂为参照，染料含量为0.0005-0.0011g/ml，3,3',5,5'-四甲基联苯胺含量为0.002-0.009g/ml，亚硝基铁氰化钠含量为0.024-0.036g/ml；
S2、将上述试剂依次倒入内包装袋中，然后用封口机封口，配制成染色粉；
S3、将上述配制好的染色粉倒入体积百分比浓度为85％-88％的乙醇溶液中，充分搅拌均匀后，室温密闭避光放置。
作为优选的，步骤S3中，将染色粉缓慢倒入烧杯中，加入500mL 88％(v/v)乙醇，充分搅拌后转入带盖容器中，室温密闭避光放置12小时以上，即可使用。
根据本发明提供的另一种实施例，为一种CD系列细胞检测的试剂盒，包括前述的染色介质，还包括过氧化氢工作液。方便应用于检测区分CD系列细胞和单核细胞。
根据本发明提供的另一种实施例，为一种CD系列细胞检测的染色介质的应用，通过如下步骤检测CD系列细胞：
S1、配制染色液；
S2、配制过氧化氢工作液：现配现用：将过氧化氢溶液加入纯水中，搅拌均匀后制成过氧化氢工作液；
S3、将固定好血细胞的玻片放入过氧化物酶染色液中，静置；
S4、将稍加沥干的玻片放入过氧化氢工作液中，静置；
S5、在空气中干燥后或用纸轻轻吸干后的玻片置于显微镜下进行观察区分，单核细胞呈蓝黑色颗粒；CD系列细胞呈红色颗粒。
其中，所述过氧化氢工作液的制备方法包括如下步骤：
S1、取350-550ml纯化水；
S2、在上述纯化水中加入1mL体积百分比浓度为2％-4％的过氧化氢溶液，混匀。
以下提供若干具体的实施例做进一步的说明。
实施例1
本例提供一种CD系列细胞检测的染色液的制备及应用，其采用的原料如下：
过氧化物酶染色粉：碱性品红0.4g、亚硝基铁氰化钠15g、3,3',5,5'-四甲基联苯胺为3g；
过氧化物酶染色液：在500ml浓度为88％乙醇中加入上述过氧化物酶染色粉。
过氧化氢工作液：在400mL纯水中加入1ml体积百分比浓度为2.5％-3.5％的过氧化氢溶液。
该染色液的具体生产步骤如下：
1)过氧化物酶染色液配制：将上述过氧化物酶染色粉缓慢倒入烧杯中，加入500mL88％(v/v)乙醇，充分搅拌后转入带盖的容器中，室温密闭避光放置12小时以上，即可使用。
注意事项：配置好的过氧化物酶染色液应保存在密闭容器中，室温避光保存。
过氧化氢工作液，现配现用：将1mL市售的2.5％～3.5％过氧化氢溶液加入400mL纯水中，搅拌均匀后制成过氧化氢工作液。
2)固定好血细胞的玻片放入过氧化物酶染色液中，静置1分钟。
3)将稍加沥干的玻片放入过氧化氢工作液中，静置4分钟。
4)在空气中干燥或用纸轻轻吸干的玻片置显微镜下观察。
单核细胞呈蓝黑色颗粒；CD系列细胞呈红色颗粒。
实施例2
本例提供一种CD系列细胞检测的染色液的制备及应用，其采用的原料和制备过程如下：
1)配制染色液一：称取0.5g TMB、12g亚硝基铁氰化钠和0.4g碱性品红溶解于500ml的88％乙醇溶液，制成混合试剂。充分搅拌后转入带盖的容器中，室温密闭避光放置12小时以上，即可使用。
配制染色液二：称取1.0g TMB、12g亚硝基铁氰化钠和0.4g碱性品红溶解于500ml的88％乙醇溶液，制成混合试剂。充分搅拌后转入带盖的容器中，室温密闭避光放置12小时以上，即可使用。
配制染色液三：称取3.0g TMB、12g亚硝基铁氰化钠和0.4g碱性品红溶解于500ml的88％乙醇溶液，制成混合试剂。充分搅拌后转入带盖的容器中，室温密闭避光放置12小时以上，即可使用。
配制染色液四：称取4.5g TMB、12g亚硝基铁氰化钠和0.4g碱性品红溶解于500ml的88％乙醇溶液，制成混合试剂。充分搅拌后转入带盖的容器中，室温密闭避光放置12小时以上，即可使用。
配制染色液五：称取5.0g TMB、12g亚硝基铁氰化钠和0.4g碱性品红溶解于500ml的88％乙醇溶液，制成混合试剂。充分搅拌后转入带盖的容器中，室温密闭避光放置12小时以上，即可使用。
配制过氧化氢工作液：将1mL 2.5％～3.5％过氧化氢溶液加入400mL纯水中，搅拌均匀后制成过氧化氢工作液(现配现用)。
2)随机抽取5份外周血样本，每份样本制作2张固定了CD4 T淋巴血细胞的CD4玻片(CD4玻片可以捕获CD4 T淋巴细胞和部分表达了CD4的单核细胞)，在染色液中放入每份样本的2张玻片，静置1分钟。
3)将稍加沥干的玻片放入过氧化氢工作液中，静置4分钟。
4)在空气中干燥或用纸轻轻吸干的玻片置显微镜(10×)下观察。含有过氧化物酶的单核细胞会被染成蓝黑色，而不含过氧化物酶的CD4 T淋巴细胞会被染成红色。
5)用流式细胞仪检测每份血样中CD4 T淋巴细胞的数量。
表1为染色液一至染色液五染色后镜检细胞计数结果(按照蓝黑细胞为单核细胞；红色细胞为CD4 T淋巴细胞计数；流式细胞仪的为CD4 T淋巴细胞)
表1染色液一至染色液五染色后镜检细胞计数结果，单位：个/ul
表1结果显示,染色液二至染色液五染色后细胞大小正常，染色液一染色后细胞形态偏小。染色液二至染色液四染色后蓝黑细胞(单核细胞)数量显著高于染色液一和染色液五染色，红色细胞(CD4 T淋巴细胞)数量与流式结果一致，显著低于染色液一和染色液五。结果显示，由于染色液一中TMB含量过低，单核细胞未被充分染色而蓝黑色较浅甚至没有被染成蓝黑色，从而被碱性品红的红色覆盖，使单核细胞也呈现红色或蓝红色，会干扰对单核细胞和CD4 T淋巴细胞的扫描计数，影响检测结果准确性。染色液五中TMB含量过高对染色也会有负面作用。
综上，确定本发明染色液中TMB的含量为0.002-0.009g/ml以达到更加显著稳定的染色效果。
实施例3
本例与实施例2基本相同，不同之处仅在于：
1)配制染色液六：称取3g TMB、12g亚硝基铁氰化钠和0.5g中性红溶解于500ml的88％乙醇溶液，制成混合试剂。充分搅拌后转入带盖的容器中，室温密闭避光放置12小时以上，即可使用。
配制染色液七：称取3g TMB、12g亚硝基铁氰化钠和0.5g碱性品红溶解于500ml的88％乙醇溶液，制成混合试剂。充分搅拌后转入带盖的容器中，室温密闭避光放置12小时以上，即可使用。
表2为染色液六和染色液七染色后镜检细胞计数结果(按照蓝黑细胞为单核细胞；红色细胞为CD4 T淋巴细胞计数；流式细胞仪的为CD4 T淋巴细胞)
表2染色液六和染色液七染色后镜检细胞计数结果，单位：个/ul。
表2结果显示：
染色液六和染色液七染色后细胞大小均正常，蓝黑细胞数量一致，红色细胞(CD4T淋巴细胞)数量均与流式结果一致。以上结果说明，本发明染色液中对淋巴细胞着色的成分可以为碱性品红，也可以是中性红，二者染色效果一致。
综上，本发明染色液中对淋巴细胞着色的成分可以为碱性品红，也可以是中性红等其他试剂。
实施例4
本例与实施例2基本相同，不同之处仅在于：
1)配制常规染色液：称取0.5g TMB和12g亚硝基铁氰化钠溶解于500ml的88％乙醇溶液，制成混合试剂。充分搅拌后转入带盖的容器中，室温密闭避光放置12小时以上，即可使用。
配制染色液八：称取3g TMB、12g亚硝基铁氰化钠和0.4g碱性品红溶解于500ml的88％乙醇溶液，制成混合试剂。充分搅拌后转入带盖的容器中，室温密闭避光放置12小时以上，即可使用。
表3为常规染色液和染色液八染色后镜检细胞计数结果(以蓝黑细胞为单核细胞；红色细胞为CD4 T淋巴细胞；流式细胞仪的为CD4 T淋巴细胞)
表3常规染色液和染色液八染色后镜检细胞计数结果，单位：个/ul。
表3结果显示：
本发明染色液八染色后细胞大小正常，红色细胞和蓝黑色细胞颜色分明，易于区分，可直接对CD4 T淋巴细胞和表达了CD4的单核细胞进行计数。由于常规染色液没有添加碱性品红，因此CD4 T淋巴细胞无法被染成红色而难以计数。虽然常规染色液染色后可以通过增加吉姆萨染色或其他染色方式来使CD4T淋巴细胞着色，但增加了操作步骤而使染色变得复杂耗时。
另外，本发明染色液八染色后红色细胞(CD4 T淋巴细胞)数量与流式结果一致，蓝黑细胞数量显著高于常规染色液染色。而且，常规染色液染色后蓝黑细胞着色不充分，颜色较浅。该结果与实施例一结果一致，说明常规染色液用于CD系列玻片染色时，染色液中TMB含量低会使过氧化物酶染色效果差。
综上，本发明染色液能将含有过氧化物酶的细胞充分染色(染成蓝黑色)，与常规染色液比较，达到更加显著稳定的染色效果。
实施例5
本例的具体配制和使用步骤如下：
(1)配制染色液：称取3g TMB、12g亚硝基铁氰化钠和0.4g碱性品红溶解于500ml的88％乙醇溶液，制成混合试剂。充分搅拌后转入带盖的容器中，室温密闭避光放置12小时以上，即可使用。
(2)配制过氧化氢工作液：将1mL 2.5％～3.5％过氧化氢溶液加入400mL纯水中，搅拌均匀后制成过氧化氢工作液，现配现用；
(3)随机抽取5份外周血样本，每份样本制作1张固定了CD4 T淋巴血细胞的玻片，放入染色液中，静置1分钟。
(4)将稍加沥干的玻片放入过氧化氢工作液中，静置4分钟。
(5)在空气中干燥或用纸轻轻吸干的玻片置显微镜(10×)下观察。含有过氧化物酶的单核细胞会被染成蓝黑色，而不含过氧化物酶的CD4 T淋巴细胞会被染成红色。对红色细胞进行计数。
(6)用流式细胞仪检测每份血样中CD4 T淋巴细胞的数量。
(7)实验操作完成后将染色液放置在室温，密闭避光保存。每间隔约30天进行一次实验检测，检测步骤同(2)-(6)。
通过本发明染色液20210105(1个月)、20210205(2个月)、20210305(3个月)、20210405(4个月)、20210505(5个月)、20210604(6个月)检测细胞图像进行对照，发现本发明染色液重复使用6个月后仍然具有稳定的染色效果，表现为在染色液重复使用6个月后细胞形态和显色基本没有变化，染色后细胞形态正常，蓝黑细胞与待检红色细胞显色充分，红色细胞数量与流式检测结果一致。
表4为本发明实施例5所制备染色液重复使用的CD4 T淋巴细胞检测结果(红色为待检细胞，CD4 T淋巴细胞)
表4本发明染色液重复使用的CD4 T淋巴细胞检测结果，单位：个/ul。
表4结果显示：
本发明染色液重复使用6个月后仍然具有稳定的染色效果，表现为染色后细胞形态正常，蓝黑细胞与待检红色细胞显色充分，红色细胞数量与流式检测结果一致。
常规染色液一般为采用滴染的方法进行染色，即滴加少量染色液在染色区域，染色结束后即洗弃染色液，不会再对染色液回收重复使用。而本发明染色液可重复使用至少6个月(一般8-10个月)仍具有稳定良好的染色效果，染色后的细胞形态仍能保持较好状态能够维持较为统一的细胞形态，即使是在新鲜配制染液时，也能达到较好的结果，实际操作中很好的解决了细胞偏小、颜色偏深带来的问题。这样可节省成本，减少操作人员配制染色液的次数，提高工作效率。
以上也充分印证了本发明协同体系的稳定作用。
实施例6
本例与实施例2基本相同，不同之处仅在于：
1)配制染色液九：称取3g TMB、10g亚硝基铁氰化钠和0.4g碱性品红，溶解于500ml的88％乙醇溶液，制成混合试剂。充分搅拌后转入带盖的容器中，室温密闭避光放置12小时以上，即可使用。
配制染色液十：称取3g TMB、18g亚硝基铁氰化钠和0.4g碱性品红，溶解于500ml的88％乙醇溶液，制成混合试剂。充分搅拌后转入带盖的容器中，室温密闭避光放置12小时以上，即可使用。
配制染色液十一：称取3g TMB、20g亚硝基铁氰化钠和0.4g碱性品红，溶解于500ml的88％乙醇溶液，制成混合试剂。充分搅拌后转入带盖的容器中，室温密闭避光放置12小时以上，即可使用。
表5为染色液九、染色液十、染色液十一染色后镜检细胞计数结果(按照蓝黑细胞为单核细胞；红色细胞为CD4 T淋巴细胞计数；流式细胞仪的为CD4 T淋巴细胞)
表5染色液九、十、十一染色后镜检细胞计数结果，单位：个/ul。
结果显示：
染色液十染色后蓝黑细胞(单核细胞)数量显著高于染色液九和染色液十一染色，红色细胞(CD4 T淋巴细胞)数量与流式结果一致，显著低于染色液九和染色液十一。结果显示，由于染色液九中亚硝基铁氰化钠含量过低，影响对单核细胞的染色，使单核细胞也呈现红色或蓝红色，会干扰对单核细胞和CD4 T淋巴细胞的扫描计数，影响检测结果准确性。而染色液十一中亚硝基铁氰化钠含量过高，也会对染色造成负面影响。
综上，确定本发明染色液中亚硝基铁氰化钠的含量为0.024-0.036g/ml以达到更加显著稳定的染色效果。
实施例7
本例与实施例2基本相同，不同之处仅在于：
配制染色液十二：称取3g TMB、12g亚硝基铁氰化钠和0.1g碱性品红溶解于500ml的88％乙醇溶液，制成混合试剂。充分搅拌后转入带盖的容器中，室温密闭避光放置12小时以上，即可使用。
配置染色液十三：称取3g TMB、12g亚硝基铁氰化钠和0.25g碱性品红溶解于500ml的88％乙醇溶液，制成混合试剂。充分搅拌后转入带盖的容器中，室温密闭避光放置12小时以上，即可使用。
配置染色液十四：称取3g TMB、12g亚硝基铁氰化钠和0.55g碱性品红溶解于500ml的88％乙醇溶液，制成混合试剂。充分搅拌后转入带盖的容器中，室温密闭避光放置12小时以上，即可使用。
配置染色液十五：称取3g TMB、12g亚硝基铁氰化钠和0.65g碱性品红溶解于500ml的88％乙醇溶液，制成混合试剂。充分搅拌后转入带盖的容器中，室温密闭避光放置12小时以上，即可使用。
表6为染色液十二至染色液十五染色后镜检细胞计数结果(按照蓝黑细胞为单核细胞；红色细胞为CD4 T淋巴细胞计数；流式细胞仪的为CD4 T淋巴细胞)
表6染色液十二至染色液十五染色后镜检细胞计数结果，单位：个/ul
通过对染色后的细胞图像进行检测，结果显示,染色液十二至染色液十四染色后细胞大小正常。而染色液十五染色后细胞形态偏小。表6数据显示，染色液十三和染色液十四染色后红色细胞数量与流式结果一致。染色液十二染色后蓝黑细胞(单核细胞)数量与染色液十三和染色液十四一致，但红色细胞(CD4 T淋巴细胞)数量低于染色液十三和染色液十四。染色液十五染色后红色细胞数量和蓝黑色细胞数量均低于染色液十三和染色液十四。
结果表明，由于染色液十二中碱性品红含量过低导致CD4 T淋巴细胞染色不充分而偏浅偏淡，甚至部分细胞没有着色，会干扰对CD4 T淋巴细胞的扫描计数，使计数结果偏低。由于染色液十五中碱性品红含量过高导致细胞形态偏小，部分细胞形态过小而显色不明显，难以区分其颜色，无法将其归为单核细胞或CD4 T淋巴细胞，造成计数结果偏低，影响检测结果准确性。
因此，确定本发明染色液中碱性品红的含量为0.0005-0.0011g/ml以达到更加显著稳定的染色效果。
综上，结合整体的配方设计，促使各组分之间达协调的最佳性能，即使是在新鲜配制染液时，也能达到较好的结果，实际操作中很好的解决了细胞偏小、颜色偏深带来的问题。
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种CD系列细胞检测的染色介质，其特征在于，包括：染料、亚硝基铁氰化钠、3,3',5,5'-四甲基联苯胺，所述染料为碱性品红或者中性红；其中，各组分的重量以溶剂乙醇为参照，按以下质量体积比计：
染料含量为0.0005-0.0011 g/ml，
3,3',5,5'-四甲基联苯胺含量为0.002-0.009 g/ml，
亚硝基铁氰化钠含量为0.024-0.036 g/ml；
所述溶剂乙醇的体积百分比为85%-88 %(v/v)。
2.根据权利要求1所述的CD系列细胞检测的染色介质，其特征在于：
所述染色介质为：以0.25g-0.55g 染料、12g-18g 亚硝基铁氰化钠、1g-4.5g 3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶解于500ml 85%-88 %(v/v)乙醇。
3.一种CD系列细胞检测的染色液的制备方法，其特征在于，包括：
S1、称取一定量的染料、亚硝基铁氰化钠、3,3',5,5'-四甲基联苯胺，其中，以同一溶剂为参照，染料含量为0.0005-0.0011 g/ml，3,3',5,5'-四甲基联苯胺含量为0.002-0.009g/ml，亚硝基铁氰化钠含量为0.024-0.036 g/ml，所述染料为碱性品红或者中性红；
S2、将上述试剂依次倒入内包装袋中，然后封口，配制成染色粉；
S3、将上述配制好的染色粉倒入体积百分比浓度为85%-88%的乙醇溶液中，充分搅拌均匀后，室温密闭避光放置。
4.根据权利要求3所述的CD系列细胞检测的染色液的制备方法，其特征在于：
步骤S3中，将染色粉缓慢倒入烧杯中，加入乙醇，充分搅拌后室温密闭避光放置12小时以上，即可使用。
5.一种CD系列细胞检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的染色介质，还包括过氧化氢工作液，用于检测区分CD系列细胞和单核细胞。
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