CN105400780A - 一种荧光核酸银及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于核酸试剂制备和食品质量检测领域，特指一种荧光核酸银及其制备方法和应用。所述的荧光核酸银为荧光DNA纳米银簇，标记为DNA-AgNCs；纳米银簇的大小为3nm；在柠檬酸缓冲液中显示淡黄色，用600nm红光激发，666nm处有较强的荧光发射，以联吡啶钌为对照，荧光量子产率为0.2。将荧光核酸银和柠檬酸缓冲液混合得到核酸银溶液，核酸银溶液中以摩尔比DNA:BSA=1:1加入BSA溶液，可得BSA-DNA-Ag？NCs稳定荧光体系，可用于定性和定量分析奶粉中铁元素的含量的用途。
Description
技术领域
本发明属于核酸试剂制备和食品质量检测领域，特指一种荧光核酸银及其制备方法和应用。
背景技术
铁是人体必需的微量元素之一，是血红蛋白和肌红蛋白的形成因子，具有重要的生理生化功能。铁元素的缺乏将导致免疫系统功能降低、贫血等症状，影响健康，然而过量吸收铁会影响人体对铜、硒等元素的吸收，造成发育失衡，因此，合理的补铁对人体具有重要的意义；对于婴幼儿，奶粉是除母乳外最主要的食品，向婴幼儿奶粉中加入适量的人体必须微量元素非常重要，由于婴幼儿食品的特殊性和重要性，对微量元素的检测至关重要，科学系统地评价婴幼儿配方奶粉中铁元素的含量，对评价奶粉的质量和正确引导消费者具有重要的现实意义；在报道的文献中，往往采用干法灰化法处理婴幼儿配方奶粉，用火焰原子吸收光谱法测定奶粉中铁元素的含量[宋龙波,赵龙刚,赵延伟,陈海华.火焰原子吸收光谱法测定婴幼儿奶粉中铁锌元素含量[J].安徽农业科学,2012,40(33):16374-16376]，然而，这种检测方法存在着样品制备程序繁杂、耗时长等缺点；具有高灵敏度和高选择性的荧光探针近年来在检测中有着广泛的应用，荧光核酸银纳米团簇（DNA-AgNCs）因合成方法简单、毒性低、信号强等优点从众多探针中脱颖而出[ZhaoTT,ChenQY,WangPD,ChenZP.ADNA-AgclusterasasensorforBODIPYisomersandHepG-2cells[J].RSCAdv.,2014,4,10390-10394]；蛋白质和核酸的作用在生物过程中起着重要的作用，研究发现，蛋白质和核酸的结合可以有效提高核酸银的稳定性，拓宽核酸银在生物、化学等领域的应用[ZhouZX,DongSJ.Protein-DNAinteractions:anovelapproachtoimprovethefluorescencestabilityofDNA/Agnanoclusters[J].Nanoscale,2015,7,1296-1300]，稳定的核酸银体系用于食品检测鲜见报道，我们的研究将为奶粉中铁的定性定量检测提供新的方法。
发明内容
我们以一种CCCACCCACCCTGAGCTC小分子核酸（DNA)为模版，上述核酸购自上海生工生物工程有限公司，合成了一种新型荧光DNA纳米银簇（标记为DNA-AgNCs)；纳米银簇的大小为3nm；它在柠檬酸缓冲液中显示淡黄色，用600nm红光激发，666nm处有较强的荧光发射，荧光量子产率为0.2（以联吡啶钌为对照）。
核酸银与牛血清白蛋白(BSA)组装形成BSA-DNA-AgNCs体系中，DNA与BSA摩尔比1：1，由图2可见该BSA-DNA-AgNCs组合体系的荧光对于三价铁离子有明显的荧光感应，奶粉中富含丰富的蛋白质和微量元素铁，由图2可知，DNA-AgNCs加入到奶粉中可以有效检测奶粉中铁元素的含量。
新型荧光DNA纳米银簇（DNA-AgNCs)的合成反应过程如下：将CCCACCCACCCTGAGCTC小分子核酸溶解于柠檬酸缓冲液（pH7，10mM）中，DNA浓度为6.4μM；将DNA溶液水浴加热，慢慢升温至45~70℃（最佳为60℃），加入硝酸银溶液，Ag+的浓度为100~300μM（最佳为200μM）；将上述溶液混合均匀后继续升温至DNA序列的Tm值75℃，在该温度下稳定1~10分钟（最佳为3分钟），缓慢降至室温，降温时间为3小时，向上述溶液中加入NaBH4溶液，NaBH4的浓度为100~300μM（最佳为200μM），混合均匀后于室温避光保存24h即得核酸银产物（DNA-AgNCs）。
将核酸银产物和柠檬酸缓冲液混合得到核酸银溶液，核酸银溶液中以摩尔比DNA:BSA=1:1加入BSA溶液，可得BSA-DNA-AgNCs稳定荧光体系。
所述核酸银溶液的浓度为0.5-2μM，优选1μM。
本发明的优点：
本发明基于一种新型小分子核酸序列构建新型荧光核酸银纳米团簇，结果表明制备的核酸银能够与牛血清白蛋白（BSA）结合，形成稳定的荧光核酸（BSA-DNA-AgNCs），目前首个BSA稳定的荧光核酸；其次，该荧光核酸探针对三价铁离子有着明显的荧光响应，基于此，将BSA-DNA-AgNCs（核酸银）能直接运用于检测奶粉中的铁含量（图1，图2）。
附图说明
图1为BSA-DNA-AgNCs(1μM,摩尔比1：1)溶液加入Fe3+后的荧光变化图，λex=600nm，图中Fe3+浓度为从上至下分别为0、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0μM。
图2为BSA-DNA-AgNCs(1μM,摩尔比1：1)和DNA-AgNCs(1μM)在不同条件下的荧光淬灭常数；铁离子浓度分别为0,0.5,1.0,2.0,4.0μM。
具体实施方式
、试剂和原料
反应中所用的溶剂皆为分析纯，所用试剂未加特殊说明直接应用而未经任何特殊处理；一水合柠檬酸钠，九水合硝酸铁，氢氧化钠，硼氢化钠（粉末，96%），硝酸银（99%，A.C.S.）购于国药集团化学试剂有限公司，DNA序列（上海生工生物工程有限公司），奶粉（荷兰Nutrilon品牌，Fe3+含量为1.2mg/14.9g）。
紫外可见分光光度仪（日本岛津UV-2450型），190-800nm；CarryEclipse荧光分光光度计（美国瓦里安有限公司）；JEM-200CX型透射电镜（日本电子株式会社）；Jasco-810圆二色谱仪(日本分光公司)；DHG-9140A型电热恒温鼓风干箱（上海-恒科技有限公司）；DZF-6051型真空干燥箱（上海-恒科技有限公司）；TopPette手动单道可调式移液枪（20-200μl）；PHS-3C酸度计（上海第二分析仪器厂）；恒温水浴锅(巩义市予华仪器有限公司)。
化合物的合成方法：
实施例1（最佳合成条件）：
将CCCACCCACCCTGAGCTC小分子DNA溶解于柠檬酸缓冲液（pH7，10mM）中，DNA浓度为6.4μM；将DNA溶液水浴加热，慢慢升温至60℃，加入硝酸银溶液，Ag+的浓度为200μM；将上述溶液混合均匀后继续升温至DNA序列的Tm值75℃，在该温度下稳定3分钟，缓慢降至室温，降温时间为3小时，向上述溶液中加入NaBH4溶液，NaBH4的浓度为200μM，混合均匀后于室温避光保存24h即得核酸银产物（标记为DNA-AgNCs）；配制2μM、1μM、0.5μMDNA-AgNCs（溶剂为柠檬酸缓冲液）溶液，用600nm红光激发，测666nm处发射荧光强度分别为115，55，27；向1μM核酸银溶液中以摩尔比DNA：BSA=1:1加入BSA溶液，可得BSA-DNA-AgNCs稳定体系。
实施例2：
将CCCACCCACCCTGAGCTC小分子DNA溶解于柠檬酸缓冲液（pH7，10mM）中，DNA浓度为6.4μM；将DNA溶液水浴加热，慢慢升温至45℃，加入硝酸银溶液，Ag+的浓度为100μM；将上述溶液混合均匀后继续升温至DNA序列的Tm值75℃，在该温度下稳定3分钟，缓慢降至室温，降温时间为3小时，向上述溶液中加入NaBH4溶液，NaBH4的浓度为100μM，混合均匀后于室温避光保存24h即得核酸银产物（标记为DNA-AgNCs）；配制2μM、1μM、0.5μMDNA-AgNCs（溶剂为柠檬酸缓冲液）溶液，用600nm红光激发，未检测到荧光发射。
实施例3：
将CCCACCCACCCTGAGCTC小分子DNA溶解于柠檬酸缓冲液（pH7，10mM）中，DNA浓度为6.4μM；将DNA溶液水浴加热，慢慢升温至70℃，加入硝酸银溶液，Ag+的浓度为300μM；将上述溶液混合均匀后继续升温至DNA序列的Tm值75℃，在该温度下稳定3分钟，缓慢降至室温，降温时间为3小时，向上述溶液中加入NaBH4溶液，NaBH4的浓度为100μM，混合均匀后于室温避光保存24h即得核酸银产物（标记为DNA-AgNCs）；配制2μM、1μM、0.5μMDNA-AgNCs（溶剂为柠檬酸缓冲液）溶液，用600nm红光激发，未检测到荧光发射。
实施例4：
将CCCACCCACCCTGAGCTC小分子DNA溶解于柠檬酸缓冲液（pH7，10mM）中，DNA浓度为6.4μM；将DNA溶液水浴加热，慢慢升温至60℃，加入硝酸银溶液，Ag+的浓度为200μM；将上述溶液混合均匀后继续升温至DNA序列的Tm值75℃，在该温度下稳定1分钟，缓慢降至室温，降温时间为3小时，向上述溶液中加入NaBH4溶液，NaBH4的浓度为300μM，混合均匀后于室温避光保存24h即得核酸银产物（标记为DNA-AgNCs）；配制2μM、1μM、0.5μMDNA-AgNCs（溶剂为柠檬酸缓冲液）溶液，测666nm处发射荧光强度分别为50，23，7。
实施例5：
将CCCACCCACCCTGAGCTC小分子DNA溶解于柠檬酸缓冲液（pH7，10mM）中，DNA浓度为6.4μM；将DNA溶液水浴加热，慢慢升温至60℃，加入硝酸银溶液，Ag+的浓度为200μM；将上述溶液混合均匀后继续升温至DNA序列的Tm值75℃，在该温度下稳定10分钟，缓慢降至室温，降温时间为3小时，向上述溶液中加入NaBH4溶液，NaBH4的浓度为100μM，混合均匀后于室温避光保存24h即得核酸银产物（标记为DNA-AgNCs）；配制2μM、1μM、0.5μMDNA-AgNCs（溶剂为柠檬酸缓冲液）溶液，用600nm红光激发，未检测到荧光发射。
铁离子含量的检测：以实施例1得到的化合物为受试化合物
选择浓度为1μMBSA-DNA-AgNCs(λex=600nm，λem=666nm)，用Fe(NO3)3进行滴定，随着Fe(NO3)3浓度的增加，荧光强度降低（如图1）。
牛奶中铁离子含量的检测：以实施例1得到的化合物为受试化合物
选择浓度为1μMDNA-AgNCs(λex=600nm，λem=666nm)，用含有铁离子的某品牌奶粉进行滴定，记录随着铁含量的增加荧光强度的变化。（如图2）。
Claims (10)
1.一种荧光核酸银，其特征在于：所述的荧光核酸银为荧光DNA纳米银簇，标记为DNA-AgNCs；纳米银簇的大小为3nm；在柠檬酸缓冲液中显示淡黄色，用600nm红光激发，666nm处有较强的荧光发射，以联吡啶钌为对照，荧光量子产率为0.2。
2.如权利要求1所述的一种荧光核酸银的制备方法，其特征在于制备方法按照下述步骤进行：以一种CCCACCCACCCTGAGCTC小分子核酸为模版，将CCC
ACCCACCCTGAGCTC小分子DNA溶解于柠檬酸缓冲液中，将DNA溶液水浴加热，慢慢升温至45~70℃，加入硝酸银溶液，混合均匀后继续升温至DNA序列的Tm值75℃并在该温度下稳定1~10分钟，缓慢降至室温，向上述溶液中加入NaBH4溶液，混合均匀后于室温避光保存24h即得核酸银产物。
3.如权利要求2所述的一种荧光核酸银的制备方法，其特征在于：所述的柠檬酸缓冲液，pH值为7，浓度10mM。
4.如权利要求2所述的一种荧光核酸银的制备方法，其特征在于：所述小分子核酸与Ag+的浓度分别为6.4μM和100~300μM。
5.如权利要求4所述的一种荧光核酸银的制备方法，其特征在于：所述Ag+的浓度为200μM。
6.如权利要求2所述的一种荧光核酸银的制备方法，其特征在于：所述升温的温度为60℃；所述稳定时间为3min；所述降温时间为3小时。
7.如权利要求2所述的一种荧光核酸银的制备方法，其特征在于：所述NaBH4溶液的浓度为100~300μM；所述避光保存的时间为24小时。
8.如权利要求7所述的一种荧光核酸银的制备方法，其特征在于：所述NaBH4溶液的浓度为200μM。
9.以如权利要求1所述的荧光核酸银和牛血清白蛋白组装形成的BSA-DNA-
AgNCs体系，其特征在于：将荧光核酸银和柠檬酸缓冲液混合得到核酸银溶液，核酸银溶液中以摩尔比DNA:BSA=1:1加入BSA溶液，可得BSA-DNA-AgNCs稳定荧光体系。
10.如权利要求9所述的BSA-DNA-AgNCs体系用于定性和定量分析奶粉中铁元素的含量。
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