CN108051411B - 一种基于错配的银的功能核酸的比色传感器及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了金属离子检测技术领域的一种基于错配的银的功能核酸的比色传感器及其应用。该比色传感器包括分子识别元件和信号转换元件，所述分子识别元件包括等温扩增体系，等温扩增体系包括A体系和B体系，A体系包括扩增模板、dNTPs和促发链，B体系包括Bst0DNA聚合酶和Nt.BstNBI切刻内切酶；分子识别元件识别银离子，并将产生扩增产物，扩增产物在硫代黄色素作用下，形成G‑四链体结构，通过检测荧光强度，计算得出银离子浓度。本发明比色传感器基于银离子的胞嘧啶错配、等温指数放大反应和G‑四链体液相传感技术构建，用于银离子的检测，简便快速、灵敏度高、特异性高、耐高盐以及成本低。

Description

一种基于错配的银的功能核酸的比色传感器及其应用

技术领域

本发明属于金属离子检测技术领域，具体涉及一种基于错配的银的功能核酸的比色传感器及其应用。

背景技术

银广泛存在于自然界中，它有着特殊的杀菌、催化和光学特性，可作为金属催化剂、抗菌剂和感光剂等。其应用形式包括银盐(AgNO₃)，化合物银如(SD-Ag)和纳米银，在电子、电镀、感光等行业有着广泛的应用。在临床医学上，如烧伤敷料等，被广泛用作消炎抗菌剂。

这些涉及银的行业的生产和应用中会产生含银的工业废水，该废水对环境的污染非常严重，相比其他形式的银，离子形式的银是毒性最大的，银离子在水中易被生物富集，进而抑制蛋白的活性，间接地影响生物的繁衍。体内研究显示机体可通过吸入、皮肤接触和摄食等多种途径接触到纳米银，进而通过循环系统遍布全身，在包括皮肤、肝脏、肺、心血管系统和生殖系统在内的众多组织产生毒副反应，通过氧化应激和凋亡，对人体产生极大的危害。

随着纳米技术的发展，发现纳米银颗粒在催化剂、等离子共振材料、纳米电化学和生物传感器等领域有着巨大的应用前景。溶液中银离子浓度是影响纳米银生成的一个重要因素，对痕迹量银离子浓度的准确控制是开展这些科学研究工作的前提。所以对于银离子浓度变化的在线监测，需要一种有效科学的银检测方法，为相关领域的机理研究提供有力依据。

目前，银离子的检测方法很多，如电热原子吸收法(ETAAS)、电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-AES)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、原子吸收光谱法、原子发射光谱法、催化动力学分光光度法和催化动力学-氯离子选择性电极法等。这些方法前处理繁杂，均需要取样后分析，不适用于银离子浓度的快速原位检测；都需要昂贵的仪器，成本较高。因此迫切需要发展无污染的、简便快速、高灵敏度和高特异性的方法来满足微量金属银的检测需要。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提出一种基于错配的银的功能核酸的比色传感器及其应用，具体技术方案如下：

一种基于错配的银的功能核酸的比色传感器，包括分子识别元件和信号转换元件，

所述分子识别元件包括等温扩增体系；所述等温扩增体系包括A体系和B体系；

所述A体系包括：扩增模板、dNTPs和促发链；

所述B体系包括：Bst DNA聚合酶和Nt.BstNBI切刻内切酶；

所述分子识别元件识别银离子，并将产生扩增产物；

所述促发链的序列(5’-3’)为：CCCCCCCCCCCCCCCCTTACCTTGGGGGGTT；

所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCTACCCGCCCTACCCAACTGACTCAACCCCCCAAGGTAAGCCCCCCCCCCCCCCC；

其中扩增模板中GACTC为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列；

所述信号转换元件包括硫代黄色素。

所述B体系还包括Bst DNA聚合酶反应缓冲溶液和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液。

所述Bst DNA聚合酶反应缓冲液：20mM Tris-HCl,10mM(NH₄)₂SO₄,50mM KCl,2mMMgSO₄,0.1％吐温20，0.1％牛血清白蛋白，pH 8.8；

所述Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲液：100mM NaCl,50mM Tris-HCl,10mMMgCl₂,300μg/ml海藻糖，pH 7.9。

所述传感器在银离子检测中的应用。

一种检测银离子的方法，包括如下步骤：

制备银离子浓度和G-四链体功能核酸荧光强度关系的标准曲线；

按上述制备标准曲线的过程检测待测样品的G-四链体功能核酸荧光强度，通过上述标准曲线计算银离子的浓度；

其中，银离子浓度和G-四链体功能核酸显荧光强度关系的标准曲线的步骤包括：

(1)将扩增模板，dNTPs，促发链和超纯水混合均匀，制备A体系；将Bst DNA聚合酶，聚合酶反应缓冲溶液，Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶的反应缓冲溶液混合均匀，制备B体系；

所述促发链的序列(5’-3’)为：CCCCCCCCCCCCCCCCTTACCTTGGGGGGTT；

所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCTACCCGCCCTACCCAACTGACTCAACCCCCCAAGGTAAGCCCCCCCCCCCCCCC；

其中扩增模板中GACTC为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列；

(2)将不同浓度的银离子溶液分别与A体系混合，然后分别与B体系混合，孵育扩增，终止反应后得到一系列的扩增产物；

(3)将上述一系列扩增产物分别与硫代黄色素原液、显色缓冲液与超纯水混匀并反应，形成G-四链体结构；

(4)测定步骤(3)的反应混合液的荧光强度，得到荧光强度随银离子浓度变化的标准曲线。

步骤(2)的操作为：银离子溶液与A体系混合后于55℃孵育5min，然后与B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min，95℃保持10min以终止反应。

步骤(3)中扩增产物加入量为10μL，显色缓冲液加入量为50μL，硫代黄色素原液加入量为2μL，超纯水加入量为38μL。

步骤(3)中显色缓冲液的配方为：50mM Tris-HCl，50mMKCl，pH7.2。

步骤(3)中反应温度为25℃，反应时间为20min。

本发明同时也提供了一种检测银离子的试剂盒，包括等温扩增体系和显色体系；

所述等温扩增体系包括A体系、B体系和银离子标准溶液；所述A体系包括扩增模板、dNTPs、促发链和超纯水；

所述B体系包括Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；

所述显色体系包括：硫代黄色素原液和显色缓冲液；

所述促发链的序列(5’-3’)为：CCCCCCCCCCCCCCCCTTACCTTGGGGGGTT；

所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCTACCCGCCCTACCCAACTGACTCAACCCCCCAAGGTAAGCCCCCCCCCCCCCCC。

所述显色缓冲液的配方为：50mM Tris-HCl，50mM KCl，pH7.2；所述硫代黄色素原液由0.1mol硫代黄色素干粉与1mL显色缓冲液混合得到。

利用所述的试剂盒检测银离子的方法，包括如下步骤：

(1)制备银离子浓度和G-四链体功能核酸荧光强度关系的标准曲线

将6μL 1μM的扩增模板，3μL 2.5mM的dNTPs、6μL 1μM的促发链和7.2μL的超纯水混合均匀，制备A体系；将0.1μL 8U/μL的Bst DNA聚合酶，3μL 10×的聚合酶反应缓冲溶液，1.2μL 10U/μL的Nt.BstNBI切刻内切酶和1.5μL 10×的Nt.BstNBI切刻内切酶的反应缓冲溶液混合均匀，制备B体系；

将2μL的不同浓度银离子溶液分别与A体系混合，于55℃孵育5min，然后与B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min，95℃保持10min以终止反应，得到一系列扩增产物；

将10μL扩增产物、2μL硫代黄色素原液、50μL显色缓冲液与38μL超纯水混匀并反应，形成G-四链体结构；

用酶标仪设定激发波长425nm，激发上述反应混合液，测定485nm下荧光强度，得到荧光强度随银离子浓度变化的标准曲线。

(2)按上述制备标准曲线的过程进行待测样品的检测，通过上述标准曲线计算银离子的浓度。

本发明的有益效果为：

1、本发明提供了一种基于错配的银的功能核酸的比色传感器和银离子检测方法，基于银离子可以和胞嘧啶形成(胞嘧啶-银离子-胞嘧啶)的错配；有且只有银离子存在时，才能形成等温指数放大反应(EXPAR)的模板链，产生信号的放大和转化，并生成大量富含鸟嘌呤的寡核苷酸序列，该富含鸟嘌呤的寡核苷酸序列在硫代黄色素诱导下形成G-四链体结构，在425nm的激发光激发下发出荧光，最大发射波长在485nm，转化成可视化的信号，可以进行定性的判断。

2、本发明基于银离子的胞嘧啶错配、等温指数放大反应和G-四链体液相传感技术，设计了1条引物链和1条模板链，经过信号的放大和转化，通过手持式光谱检测仪就可以进行定量检测银离子，简便快速、灵敏度高、特异性高、成本低，可用于环境中银离子的现场检测。

3、本发明的传感器能够抵抗高盐浓度的干扰，实现高盐环境中的银离子的检测，并保持较高的特异性和灵敏度。

附图说明

图1为不同浓度的银离子作用下等温指数放大反应中扩增产物的变化图。

图2为荧光强度随银离子浓度变化的标准曲线。

具体实施方式

以下实施例便于更好地理解本发明。实施例中实验材料如无特殊说明均可通过商业途径获得，实验方法如无特殊说明均为常规方法。

本发明基于银离子的胞嘧啶错配、等温指数放大反应(EXPAR)和G-四链体液相传感技术，构建一种比色传感器。银离子可以和胞嘧啶形成(胞嘧啶-银离子-胞嘧啶)的错配；有且只有银离子存在时，才能形成EXPAR的模板链，促发EXPAR放大信号，并生成大量富含鸟嘌呤的寡核苷酸序列；该富含鸟嘌呤的寡核苷酸序列在硫代黄色素诱导下形成G-四链体结构，在425nm的激发光激发下发出荧光，最大发射波长在485nm，通过手持式光谱检测仪进行检测与定量。

实施例1：基于错配的银的功能核酸的比色传感器的构建

1、实验材料

一水吗啉乙磺酸(MES)，氯化钾，氯化钠，氯化镁，磷酸氢钾，乙二胺四乙酸二钠，硫代黄色素，三羟甲基氨基甲烷，硝酸银，尿素，Nt.BstNBI切刻内切酶，Bst DNA聚合酶等。

2、序列设计

设计并合成促发链和扩增模板，扩增模板中GACTC为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列，序列前四个碱基对处(C和A之间)即是合成链切割位点。

所述促发链的序列(5’-3’)为：CCCCCCCCCCCCCCCCTTACCTTGGGGGGTT；

所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCTACCCGCCCTACCCAACTGACTCAACCCCCCAAGGTAAGCCCCCCCCCCCCCCC。

3、构建方法

基于错配的银的功能核酸的比色传感器的构建方法，包括如下步骤：

(1)配制扩增反应体系

反应体系由A体系和B体系组成。

A体系组成(22.2μL)

B体系组成(5.8μL)

本发明的“×”如无特殊限定，则为体积倍量。

本发明的“终浓度”无特殊限定，则为物质混合后的在总的反应体系的浓度。如1μM扩增模板母液6μL，终浓度为0.2μM，指的扩增模板在等温扩增体系中的浓度。

(2)将2μL待测银离子溶液与A体系混合均匀，在55℃孵育5min，然后与B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min；95℃保持10min，以终止反应，得到扩增产物。放入-20℃备用。

所述扩增产物的序列(5’-3’)为：GGGTAGGGCGGGTAGGG

(3)将10μL扩增产物、50μL显色缓冲液和2μL硫代黄色素原液与38μL超纯水混匀，25℃反应20min，使扩增产物结合硫代黄色素形成G-四链体结构。

显色缓冲液的配方为：50mM Tris-HCl，50mMKCl，pH7.2。

硫代黄色素原液由0.1mol硫代黄色素干粉与1mL显色缓冲液混合。

(4)用酶标仪设定激发波长425nm，激发步骤(4)的反应混合液，测定波长485nm下的荧光强度。

4、等温指数放大反应孵育扩增时间的确定

采用实施例1中3的构建方法，待测银离子溶液选为不同浓度硝酸银溶液(1MNaNO₃为溶解环境)，硝酸银浓度取1nM、50nM和100nM，以超纯水为阴性对照。使用real-timePCR仪进行信号检测，如图1，确定等温指数放大反应孵育扩增时间最佳为20min。

实施例2：银离子的检测

银离子浓度的检测，具体步骤如下：

(1)制备荧光强度随银离子浓度变化的标准曲线

采用实施例1中3的构建方法，待测银离子溶液为不同浓度硝酸银溶液(1M NaNO₃为溶解环境)，硝酸银浓度取10pM、20pM、40pM、60pM、80pM和100pM，设定激发波长425nm，制备波长485nm下荧光强度(FL)随银离子浓度变化的标准曲线(图2)，标准曲线为y＝70.334x+139.4，R²＝0.9998。

所述不同浓度硝酸银溶液用1mM硝酸银母液配置。

(2)本实施例中待测银离子溶液为硝酸银溶液(NaNO₃为溶解环境)，

采用实施例1中3的构建方法，酶标仪测定待测银离子溶液的荧光强度，代入标准曲线y＝70.334x+139.4，得到银离子浓度。结果如表1。

表1

实施例3：一种检测银离子的试剂盒

一种检测银离子的试剂盒，包括等温扩增体系和显色体系；

等温扩增体系包括A体系、B体系和银离子标准溶液；A体系包括扩增模板、促发链、dNTPs和超纯水；B体系包括Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；

显色体系包括：硫代黄色素原液和显色缓冲液。

促发链的序列(5’-3’)为：CCCCCCCCCCCCCCCCTTACCTTGGGGGGTT；

扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCTACCCGCCCTACCCAACTGACTCAACCCCCCAAGGTAAGCCCCCCCCCCCCCCC；

Bst DNA聚合酶反应缓冲液：20mM Tris-HCl,10mM(NH₄)₂SO₄,50mM KCl,2mMMgSO₄,0.1％吐温20，0.1％牛血清白蛋白，pH 8.8；

Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲液：100mM NaCl,50mM Tris-HCl,10mM MgCl₂,300μg/ml海藻糖，pH 7.9。

显色缓冲液的配方为：50mM Tris-HCl，50mM KCl，pH7.2。

硫代黄色素原液由0.1mol硫代黄色素干粉与1mL显色缓冲液混合得到。

Claims (10)

1.一种基于错配的银的功能核酸的比色传感器，包括分子识别元件和信号转换元件，其特征在于，

所述分子识别元件包括等温扩增体系；所述等温扩增体系包括A体系和B体系；

所述A体系包括：扩增模板、dNTPs和促发链；

所述B体系包括：Bst DNA聚合酶和Nt.BstNBI切刻内切酶；

所述分子识别元件识别银离子，并将产生扩增产物；

所述促发链的序列(5’-3’)为：CCCCCCCCCCCCCCCCTTACCTTGGGGGGTT；

所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCTACCCGCCCTACCCAACTGACTCAACCCCCCAAGGTAAGCCCCCCCCCCCCCCC；

其中扩增模板中GACTC为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列；

所述信号转换元件包括硫代黄色素。

2.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述B体系还包括Bst DNA聚合酶反应缓冲溶液和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液。

3.权利要求1或2所述传感器在银离子检测中的应用。

4.一种检测银离子的方法，其特征在于，包括如下步骤：

制备银离子浓度和G-四链体功能核酸荧光强度关系的标准曲线；

按上述制备标准曲线的过程检测待测样品的G-四链体功能核酸荧光强度，通过上述标准曲线计算银离子的浓度；

其中，制备银离子浓度和G-四链体功能核酸荧光强度关系的标准曲线的步骤包括：

(1)将扩增模板，dNTPs，促发链和超纯水混合均匀，制备A体系；将Bst DNA聚合酶，BstDNA聚合酶反应缓冲溶液，Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶的反应缓冲溶液混合均匀，制备B体系；

所述促发链的序列(5’-3’)为：CCCCCCCCCCCCCCCCTTACCTTGGGGGGTT；

所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCTACCCGCCCTACCCAACTGACTCAACCCCCCAAGGTAAGCCCCCCCCCCCCCCC；

其中扩增模板中GACTC为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列；

(2)将不同浓度的银离子溶液分别与A体系混合，然后分别与B体系混合，孵育扩增，终止反应后得到一系列的扩增产物；

(3)将上述一系列扩增产物分别与硫代黄色素原液、显色缓冲液、超纯水混匀并反应，形成G-四链体结构；

(4)测定步骤(3)的反应混合液的荧光强度，得到荧光强度随银离子浓度变化的标准曲线。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)的操作为：银离子溶液与A体系混合后于55℃孵育5min，然后与B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min，95℃保持10min以终止反应。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中扩增产物加入量为10μL，显色缓冲液加入量为50μL，硫代黄色素原液加入量为2μL，超纯水加入量为38μL。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述显色缓冲液的配方为：50mMTris-HCl，50mMKCl，pH7.2。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中反应温度为25℃，反应时间为20min。

9.一种检测银离子的试剂盒，其特征在于，包括等温扩增体系和显色体系；

所述等温扩增体系包括A体系、B体系和银离子标准溶液；所述A体系包括扩增模板、促发链、dNTPs和超纯水；

所述B体系包括Bst DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；

所述促发链的序列(5’-3’)为：CCCCCCCCCCCCCCCCTTACCTTGGGGGGTT；

所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCTACCCGCCCTACCCAACTGACTCAACCCCCCAAGGTAAGCCCCCCCCCCCCCCC；

其中扩增模板中GACTC为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列；

所述显色体系包括：硫代黄色素原液和显色缓冲液。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述显色缓冲液的配方为：50mM Tris-HCl，50mMKCl，pH7.2；所述硫代黄色素原液由0.1mol硫代黄色素干粉与1mL显色缓冲液混合得到。

Images