CN104132919B - 一种基于g四聚体的荧光法检测纳米银颗粒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于G四聚体的荧光法检测纳米银颗粒的方法，首先利用双氧水在酸性环境中将银纳米颗粒转化成单价银离子，得到待检测的样品溶液；然后分别配置不同浓度的多种银离子溶液，作为标准品溶液以便绘制标准曲线；配置G‑DNA并分别与等体积的样品溶液及标准品溶液混合，使其充分相互作用；随后加入钾离子使G‑DNA折叠成G四聚体结构；最后加入N‑甲基卟啉二丙酸IX(NMM)，通过荧光法测定样品溶液中纳米银的含量。本发明采用荧光法对纳米银进行定量检测，具有灵敏度高、操作简单、用时短等优点；检测中采用的介质为G‑DNA，具有合成简单，成本低廉，化学稳定性好等特点。

Description

一种基于G四聚体的荧光法检测纳米银颗粒的方法
技术领域
本发明涉及环境检测技术领域，尤其涉及的是一种基于G四聚体的荧光法检测纳米银颗粒的方法。
背景技术
纳米银是将粒径制备到1-100nm的金属银单质，其粒径大多在20nm左右，具有广谱杀菌作用，而且不产生耐药性，因此在多个领域中(医疗卫生、纺织、涂料、日用品和化妆品、农业生产等)得到广泛应用。人工纳米银颗粒的大量生产和使用将不可避免的导致其进入环境并在环境中扩散。然而，大量研究表明，纳米银可能对生态环境和人类健康带来潜在的负面影响。例如，纳米银在洗涮过程中很容易渗漏到废水中，从而破坏处理厂处理废水所用的有益细菌；还可以对湖泊或河流中的水生生物造成威胁；纳米银在杀菌的同时，其性能也会影响土壤中环境友好型菌落的生长及繁殖，从而降低土壤的使用价值；纳米银可以与一些代谢酶相互作用，从而对体内代谢途径造成影响；纳米银也对人体健康具有潜在的危害，研究表明，纳米银的毒性与其内部特征及氧化状态有关，最终导致炎症、细胞毒性以及遗传毒性等的发生。日益增加的纳米银的使用逐渐引起大家对其造成的环境危害和潜在健康威胁的重视；然而，对于纳米银的检测很少有报到，而且大都基于传统的质谱、色谱等分析方法，耗时费力并且费用昂贵；因此，急需发展简便快速的方法来检测环境中纳米银的含量。
G-DNA是一段富含G碱基重复序列的单链DNA，在钾离子存在的情况下，通过G碱基间Hoogsteen氢键形成G四分体，进而通过非共价的π-π堆积作用形成具有更高结构顺序的G四聚体结构。已有研究表明银离子可以与G碱基相互作用从而破坏G四聚体的结构。利用此特性，已经报道了利用G四聚体生物传感器检测水样中重金属离子的方法。在我们的研究中发现纳米银颗粒也可以破坏G四聚体的结构，并且纳米银粒径越小，作用越明显。然而通过G四聚体无法直接区分或检测样品中总的纳米银颗粒总量。而在酸性条件下，双氧水可以将纳米银转化成银离子。这给我们一个重要的启示：利用双氧水将样品中纳米银转化成银离子后，再通过G四聚体检测银离子的量将能够方便的得到样品中纳米银的含量。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于G四聚体的荧光法检测纳米银颗粒的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种基于G四聚体的荧光法检测纳米银颗粒的方法，包括如下步骤：
(1)配置待检测的样品溶液：在纳米银水溶液中加入一定量的磷酸，调成酸性环境，然后加入双氧水混合均匀，将纳米银水溶液中的纳米银颗粒完全转化成银离子，得到待检测的样品溶液；
(2)配置多种标准品溶液：分别配置一定范围内不同浓度的多种银离子溶液，作为标准品溶液以便绘制标准曲线；
(3)取多份含G碱基重复序列的单链DNA(G-DNA)配置G-DNA溶液，所述G-DNA序列为TGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA，加热变性后，分别与等体积的样品溶液、多种标准品溶液混合并冷却至室温，得到多份混合溶液一；
(4)分别在多份混合溶液一中加入KAC、Triton X-100溶液得到多份混合溶液二，使G-DNA折叠形成G四聚体结构；
(5)在多份混合溶液二中，分别加入N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)得到多份混合溶液三，使NMM与G-DNA相互作用形成稳定的复合体；
(6)通过荧光光谱仪测定多份混合溶液三的荧光光谱，根据多种标准品溶液浓度与其相对应的最大荧光吸收值绘制标准曲线，通过标准曲线即可推算样品溶液中纳米银颗粒的含量。
作为上述的一种基于G四聚体的荧光法检测纳米银颗粒的方法的优选实施方式，
所述步骤(1)中，样品溶液的体积为0.25～1mL，样品溶液中磷酸终浓度为1μM、双氧水的终浓度为2mM；
所述步骤(2)中，分别配置0.5～10μM范围内不同浓度的多种银离子溶液，作为标准品溶液；
所述步骤(3)中，配置0.25～1mL 0.2-1μM G-DNA溶液，并加入EDTA螯合去除其中存在干扰的其他二价金属离子，加热变性后，分别与等体积的样品溶液、多种标准品溶液混合并冷却至室温，得到多份混合溶液一；
所述步骤(4)中，多份混合溶液二中KAC终浓度为1mM，Triton X-100终浓度为0.05％；
所述步骤(5)中，多份混合溶液三中NMM的终浓度为1μM。
本发明的工作原理为：
G-DNA在钾离子存在的条件下，能形成结构稳定的G四聚体，G四聚体与NMM相互作用后，能显著提升NMM的荧光值。而在银离子存在的情况下，银离子能够与G碱基相互作用，从而破坏G-DNA形成G四聚体的能力，使G四聚体与NMM的作用减弱，NMM的荧光值降低。本发明利用双氧水在酸性条件下将样品溶液中的纳米银颗粒完全氧化成为银离子，然后与G-DNA相互作用并加入钾离子，破坏G四聚体结构，并分别配置待检测的样品溶液和作为参考的标准品溶液，采用荧光定量的方法，通过G-DNA与NMM复合物的荧光值变化来推算样品溶液中纳米银的含量。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明提供的一种基于G四聚体的荧光法检测纳米银颗粒的方法，将G-DNA用于纳米银的检测中，该方法简单、快速，灵敏度高，不需要繁琐的前期处理及复杂的分析仪器，且可以大批量分析样品，能够大大提高样品分析的效率，具有较大的应用前景。检测中采用的介质为G-DNA，具有合成简单，成本低廉，化学稳定性好等特点。此外，本发明采用荧光分析法，相比于比色法来说，不受反应中双氧水对G-DNA活性的影响，体系更加稳定，检测得到的结果更加稳定和准确。
附图说明
图1是本发明的的工作原理示意图。
附图中符号及简写：●纳米银颗粒；银离子；NMM:N-甲基卟啉二丙酸IX。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例一
一种基于G四聚体的荧光法检测纳米银颗粒的方法，包括如下步骤：
(1)配置待检测的样品溶液：在纳米银水溶液中，加入2.5μL 100μM的磷酸和5.7μL88mM的双氧水，加入后溶液总体积为250μL，使H3PO4和H2O2的终浓度分别为1μM和2 mM，混匀后室温反应30 min，得到待检测的的样品溶液；
(2)配置多种标准品溶液：分别配置浓度为0.5、1、2、4、6、8、10μM的七种硝酸银溶液，作为七种标准品溶液以便绘制标准曲线；
(3)取八份2μL的100μM含G碱基重复序列的单链DNA(G-DNA)溶液，所述G-DNA序列为TGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA，分别加入到八份248μL的20mM Tris-Ac，2mMEDTA，pH 8.0的溶液中，在90℃加热5min变性后，分别与等体积的样品溶液、七种标准品溶液混合并在室温下静置30min，得到八份混合溶液一；
(4)分别在八份混合溶液一中加入5μL 100mM KAC，5％Triton X-100溶液，使KAc和Triton X-100的终浓度分别达到1mM和0.05％，得到八份混合溶液二，混匀后室温静置30min，使G-DNA折叠形成G四聚体结构；
(5)在八份混合溶液二中，分别加入5μL 100μM的N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)得到八份混合溶液三，混合溶液三中NMM的终浓度为1μM，使NMM与G-DNA相互作用形成稳定的复合体；
(6)通过荧光光谱仪测定八份混合溶液三的荧光光谱，激发波长：399nm；发射波长：500-750nm，根据七种种标准品溶液浓度与其相对应的608nm处最大荧光吸收值绘制标准曲线，通过标准曲线即可推算样品溶液中纳米银颗粒的含量。
实施例二
一种基于G四聚体的荧光法检测纳米银颗粒的方法，包括如下步骤：
(1)配置待检测的样品溶液：在纳米银水溶液中，加入10μL 100μM的磷酸和20μL100mM的双氧水，加入后溶液总体积为1mL，使H3PO4和H2O2的终浓度分别为1μM和2mM，混匀后室温反应30min，得到待检测的的样品溶液；
(2)配置多种标准品溶液：分别配置浓度为0.5、1、2、4、6、8、10μM的七种硝酸银溶液，作为七种标准品溶液以便绘制标准曲线；
(3)取八份8μL的100μM含G碱基重复序列的单链DNA(G-DNA)溶液，所述G-DNA序列为TGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA，分别加入到八份992μL的20mM Tris-Ac，2mMEDTA，pH 8.0的溶液中，在90℃加热5min变性后，分别与等体积的样品溶液、七种标准品溶液混合并在室温下静止30min，得到八份混合溶液一；
(4)分别在八份混合溶液一中加入20μL 100mM KAC，5％Triton X-100溶液，使KAc和Triton X-100的终浓度分别达到1mM和0.05％，得到八份混合溶液二，混匀后室温静置30min，使G-DNA折叠形成G四聚体结构；
(5)在八份混合溶液二中，分别加入20μL 100μM的N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)得到八份混合溶液三，混合溶液三中NMM的终浓度为1μM，使NMM与G-DNA相互作用形成稳定的复合体；
(6)通过荧光光谱仪测定八份混合溶液三的荧光光谱，激发波长：399nm；发射波长：500-750nm，根据七种种标准品溶液浓度与其相对应的608nm处最大荧光吸收值绘制标准曲线，通过标准曲线即可推算样品溶液中纳米银颗粒的含量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种基于G四聚体的荧光法检测纳米银颗粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配置待检测的样品溶液：在纳米银水溶液中加入一定量的磷酸，调成酸性环境，然后加入双氧水混合均匀，将纳米银水溶液中的纳米银颗粒完全转化成银离子，得到待检测的样品溶液；
(2)配置多种标准品溶液：分别配置一定范围内不同浓度的多种银离子溶液，作为标准品溶液以便绘制标准曲线；
(3)取多份含G碱基重复序列的单链DNA(G-DNA)配置G-DNA溶液，所述G-DNA序列为TGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA，加热变性后，分别与等体积的样品溶液、多种标准品溶液混合并冷却至室温，得到多份混合溶液一；
(4)分别在多份混合溶液一中加入KAC、Triton X-100溶液得到多份混合溶液二，使G-DNA折叠形成G四聚体结构；
(5)在多份混合溶液二中，分别加入N-甲基卟啉二丙酸IX得到多份混合溶液三，使N-甲基卟啉二丙酸IX与G-DNA相互作用形成稳定的复合体；
(6)通过荧光光谱仪测定多份混合溶液三的荧光光谱，根据多种标准品溶液浓度与其相对应的最大荧光吸收值绘制标准曲线，通过标准曲线即可推算样品溶液中纳米银颗粒的含量。
2.如权利要求1所述的一种基于G四聚体的荧光法检测纳米银颗粒的方法，其特征在于，
所述步骤(1)中，样品溶液的体积为0.25～1mL，样品溶液中磷酸终浓度为1μM、双氧水的终浓度为2mM；
所述步骤(2)中，分别配置0.5～10μM范围内不同浓度的多种银离子溶液，作为标准品溶液；
所述步骤(3)中，配置0.25～1mL 0.2-1μM G-DNA溶液，并加入EDTA螯合去除其中存在干扰的其他二价金属离子，加热变性后，分别与等体积的样品溶液、多种标准品溶液混合并冷却至室温，得到多份混合溶液一；
所述步骤(4)中，多份混合溶液二中KAC终浓度为1mM，Triton X-100终浓度为0.05％；
所述步骤(5)中，多份混合溶液三中N-甲基卟啉二丙酸IX的终浓度为1μM。
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