JPH06508526A - 配列−特異結合する、二重らせん核酸のためのポリマー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 配列−特異結合する、二重らせん核酸のためのポリマー本発明は米国特許出願第 ７１９．７３２号の一部継続出願であり、これは１９９１年６月２０日に掛出さ れ、現在認められ、前者は１９８９年１２月２０日に提出された出願第０７７４ ５４、０５５号の一部継続である（現在米国特許第５．０３４．５０６号として 発行されている）。

１　本発明の分野 本発明は、選択された塩基一対配列を有する二重鎖核酸に、配列特異性をもって 結合することがてきる非電荷ポリマーに関する。

２、客壓 アポゾリン、デルビニール及びフルトン、Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏ ｃ、　＋９６５．８７゜アオヤマ（１９８７）、　Ｂｕｌｌ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓ ａｃ、　Ｊｐｎ、　６０　２０７３゜アルノー　ボンド（＋９７３）、サイエン ス　胆１　６８　：　Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌ、　２４４９９゜アルノ ー　セルシング（１９７４）、　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　８８　５０ ９゜バルゴビン、マクブリッジ、キールツエク、ビューケージ及びカルサース　 ノ（シングダール（１９８６）、　Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　 １０８　２０４０゜バーウオルフ及びランゲン、“核酸の化学”、タウンセンド 及びチブソン、Ｅｄ、　Ｗｉｌｅｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７８第３５９ 頁。

ベリコバ、ザラドパ及びグリネバ（＋９６７）、　Ｔｅｔ、　Ｌｅｔｔｅｒｓ　 ３７　３５５７゜ビスチョフベルガー、テトラヘドロレター（１９８７）　２８ 　２８２＋。

チャンプリン及びパターン：／（＋９６５）、　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ 、　＋２　４１０゜ノーレイ、グリマン及びカネン（１９６８）、　Ｊ、　Ａｍ 、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　９０　５６１６、エルグエロ等、（１９７６）、ペ テロ環の互変異性化　Ａｄｖ、ペテロ環化学すブレメント１．　Ａｃａｄｅｍｉ ｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ。

フィッシャー−ファンツツィ及びヴエスコ（１９８８）、　Ｍｏ１ｅｃ、　＆　 Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ。

ブレオリアブイス及び二一デュジュン（１９７５）、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉ ｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

カミムラ、ツチャ、ウラカミ、コウラ、セキネ、シノザキ、ミウラ及びハタモー ガン及びウルス（＋９６８）、　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　３７　６３ ゜フィブス（１９２８）、　Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　２３９３゜ピッカリ ング、スリバスタバ、ヴイトコウスキー及びロビン、核酸化学、パート１、Ｅｄ 、　Ｔｏｗｎｓｅｎｄ及びＴｉｐｓｏｎ、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ及び５ｏｎｓ 、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐ　１４５゜リッチ及び’、ｉ−７：／（１９７５） 、　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ及びＭｏｌｅｃｕｌａ ｒＢｉｏｌｏｇｙ　、第３版、第２巻、第４６５−４６６頁。

セキネ、ベンヤコバ、ハタ、ヨコヤマ及びミャザヮ（１９８７）、　Ｊ、　Ｏｒ ｇ、　Ｃｈｅｍ。

スミス、ランラー、ゴールドバーク及びコラナ（＋９６１）、　Ｊ、　Ａｍｅｒ 、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ。

サマートン　バートレット（１９７８ｂ）、　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ ｏｌｏｇｙ叱２　１４５−１６２゜ヴオエト及びリッチ（１９７０）、　Ｐｒｏ ｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ａｅｉｄｓ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　＆　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂ ｉｏｌ。

標的病原体に特有の選択された一本鎖遺伝子配列を不活性化するために作られた オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレチド同族体は、１９６０年代の後半に、Ｂ ｅ１ｉｋｏｖａ、　１９６７によって及び次いでＰｉｔｈａ、　１９７０　：　 Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ、　１９７８ａ、ｂ、　＋９７９ａ。

ｂ：　Ｚａｍｅｃｎｉｋ、１９７８：　Ｊｏｎｅｓ、１９７９；　Ｋａｒｐｏｖ ａ、１９８０；　Ｍｉｌｌｅｒ、１９７９．　１９８０，１X８５； Ｔｏｕｌｍｅ、　１９８６；　５ｔｉｒｃｈａｋ、　１９８７．１９８９　によ って初めて報告された。このタイプのポリマー剤は、剤とその相補的−重鎖標的 遺伝子配列の間でワトソン／クリック塩基対合を利用することによってその配列 特異性を達成する。この様なポリマーだけが一本核漂的遺伝子配列を結合するの で、主に二本鎖状態で存在を不活性化することが望まれる遺伝子情報に於てこれ らは限られた価値がある。

多くの病原体及び病原性状態に関して、二重らせん遺伝子配列は遺伝子活性をブ ロックするための、より適する標的を提供する。配列−特異二重らせん一配向核 酸結合剤を発展させる最近の試みの１つは、Ｋｕｎｄｕ、　Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒ ｇｅｒ及び協力者によって１９７４から１９８０年の間報告されている（Ｋｕｎ ｄｕ　１９７４　；　Ｋｕｎｄｕ　１９７５　；　Ｋｕｎｄｕ１９８０）。この グループは２つのモノマー剤を報告し、夫々は二重らせん核酸中で特異塩基対へ の水素−結合に関与する。しかしこれらの剤は恐らく２つの理由で有効ではない 。第一に、これらは非剛性両存水素−結合基（アミド）を利用し、二の基は（水 素−結合するという意味で）プロトン供与体又は受容体のとちらがとして作用す ることができる。第二にこれらは水性溶液中で複雑な安定性のために十分な数の 水素結合（２）を提供する。種々の系からの実験結果がら、協同分子内水素結合 の実質上の数（たぶん少な（とも１２）がある場合、又は付加的な安定化相互作 用（静電性、疎水性等々）がある場合のみ、水素−結合錯体は、水性溶液中で安 定であることが示唆される。

先の他の試みは、Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ　及びＣｒｏｔｈｅｒｓ　、エール及び 協力者、ドイツによって報告されている（Ｋｏｓｔｕｒｋｏ　１９７９　：　Ｂ ｕｎｅｍａｎｎ　１８８１）　ｏこの研究者は、Ｇ：Ｃ塩基一対で二重らせんＤ ＮＡリッチに挿入するのに知られている染料及び恐らく小さな溝、部位を経てＡ 　Ｔ　塩基で二重らせんＤＮＡリッチに優先的に結合する他の染料から製造され たポリマーを使用している。ポリマーの製造は、アクリル部分の添加による２つ の染料の変化及び次いて限定された配列（鋳型）の二重らせんＤＮＡの存在下で 変化した染料混合物の重合を含んでいる。結果として生しるポリマーがテンプレ ートＤＮＡと同一配列を有する重複ＤＮＡに特異親和性を示すことは予期されて いたことである。しかしこの様な材料はごくわずかの配列特異性しか示さないこ とが証明された。二重らせんＤＮＡ中で特異配列に結合するのに作られた種々の ビス−挿入剤も報告されている（Ｐｅｌａｐａｒｔ、　１９８０）が、この様な 剤は最ｒＩＸ配列特異性しか生来生しない。

より最近になって、Ｄｅｒｖａｎが自然のＢ−Ｕ−特異的小さな溝−結合抗生物 質（ジスタマイシン）を取り上げ、その構造を体系的に拡張して配列特異性の重 要なレヘルを得ている（Ｓｃｈｕｌｔｚ　１９８２　；　５ｃｈｕｌｔｚ　１９ ８３　；　Ｙｏｕｎｇｑｕｉｓｔ　１９８５）、彼はまたこのすりゴマ−にＥＤ ＴＡ／Ｆｅ錯体を付加し、この錯体が一定の条件下で作用し、剤の結合部位近く て二重らせん標的配列を切断する。しかしこの特別な方法は治療適用に必要とさ れる特異性の高しルベルを導かない。というのは小さな溝てＨ−結合部位の固有 対称性があまりにも小さい配列情報を提供するからである。

更に最近になって、Ｄｅｒｖａｎ及び協力者が、標的遺伝子二重らせんの情報上 豊富な極性の大きい溝部位を配列−特異認識のために使う結合剤を報告した（Ｓ ｌｕｋａ　１９８７）。これはＤＮＡ−結合たん白質のＤＮＡ−配列−認識部分 を有する合成ポリペプチドを、ＤＮＡを二重らせんＤＮＡ上のたん白質の結合部 位で切断するのに適合させることを含む。切断活性は、合成ペプチドのアミノ末 端にＥＤＴＡ／Ｆｅ錯体を連結することによって達成され、この錯体が親たん白 質の自然標的配列で又はその付近で二重らせんＤＮＡを選択的に切断することを 例示した。

二重らせん標的化への他の方法は、１９５０年代の後半に初めて報告された研究 から発展しており、それは高い塩条件下ですべてチミンの又はすべてウラシルの ポリヌクレオチドが一方の鎖にすべてアデニン及びもう一方の鎖にすべてチミン 又はウラシルを有するワトソン／クリック遺伝子二重らせん上で特異的極性の大 きい溝部位に結合することができることをＸ−線回折を介して証明した（Ｈｏｏ ｇｓｔｅｅｎ１９５９）。次いて高い塩で及び７より低いｐＨ値で、プロトン化 されたシトシン部分を有するすべてシトシンのポリヌクレオチドが同様な方法で 一方の鎖にすべてグアニン及びもう一方の鎖にすべてシトシンを有するワトソン ／クリック二重らせん結合することができると報告された。

その後、高い塩下で及び７以下のｐＨで、シトシン及びチミン（又はウラシル） ともに含有するポリヌクレオチドは、一方の鎖にプリンの及びもう一方の鎖にピ リミジンの適切な配列を有するワトソン／クリック二重らせんに結合することが できることが証明された（Ｍｏｒｇｅｎ、　１９６８）。

１９７０年代に、このＨＯＯｇＳｔｅｅｎ結合メカニズムは、一方の鎖にプリン の及びもう一方の鎖にピリミジンの列を含有する二重らせん遺伝子フラグメント のアフィニティークロマトグラフィー精製に対して開発された（Ｆｌａｖｅｌｌ 、　１９７５　：　Ｚｕｉｄｅｍａ。

＋９７８）。１９８７年Ｄｅｒｖａｎ及び協力者は、すべてピリミジンのポリヌ クレオチドを位置づけるためにこのＨｏｏｇｓｔｅｅｎ結合メカニズムを開発し 、一方の鎖にプリンの及びもう一方の鎖にピリミジンの特異的配列を有する標的 遺伝子二重らせん上てＥＤＴＡ／Ｆｅ切断を行なった（Ｍｏｓｅｒ、　１９８７ ）。

Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎモードと異なる大きい溝結合モードは、１９６０年代半ばに 報告され、すべてプリンのポリヌクレオチド、ポリ（ｄｉ）、のポリ（ｄｌ）／ ポリ（ｒＣ）二重らせん（Ｉｎａｎｍ　１９６４）への及びポリ（ｄｉ）／ポリ （ｄＣ）二重らせん（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ　１９６５）　ヘの結合を含む。同 様にはとんとプリンのポリヌクレオチドは選択された生来の二重らせん遺伝子配 列の活性をブロックするのにＨｏｇａｎ及び協力者　（Ｃｏｏｎｅｙ、　＋９８ ８）によって最近使用された。これらの研究者は６ｍＭ　１４ｇ＋４の存在下で 、特異配列のほとんとプリンのポリヌクレオチド（２４プリン、３ピリミジン） が無細胞系でヒトＣ−ｍｙｃ遺伝子の転写を阻止すると報告した。

現在まで遺伝子二重らせんへの結合に使用される、報告されたポリヌクレオチド は、生きている生物内での有効な使用に重要な基準ｌ又は数種を満足させない。

第一にシトシン含有ＨＯＯｇＳｔｅｅｎ−結合ポリヌクレオチド（ポリピリミジ ン）は、有効な結合を得るために（シトシン部分をプロトン化するのに必要なた めに）生理学的ｐＨよりも低いｐｉ（を要求するが、最近Ｄｅｒｖａｎ及び協力 者はシトシンの代りに５−メチルシトシンの使用が生理学的ｐＨにいくらか近い ｐＨでＨｏｏｇＳｔｅｅｎ結合を許可しくＭａｈｌｅｒ、　＋９８９）、そして シトシンの代りに５−メチルシトシン及びチミン又はウラシルの代りに５−ブロ モウラシル双方の使用は、まだ更に結合を改良する（Ｐｏｕｓｉｃ、＋９８９） と証明した。

第二にポリプリンポリヌクレオチドの場合、イノシン（ハイポキサンチン）及び アデニン部分双方は細胞内適用て有効な大きな溝結合に対して、十分な配列特異 性及び十分な結合親和性を欠いている。イノシン（Ｉｎｍａｎ、　１９６４）及 びアデニン（Ｃｏｏｎｅｙ、　＋９８８）部分に対する不十分な配列特異性は、 次の事実から導かれ、それはイノシンが同様な親和性で０．１（又はＣ０Ｇ）塩 基対（すなわちＣのＮＨ，及びＧ又は１の０６）及びＡ：Ｔ又はＡ：Ｕ塩基対（ すなわちＡのＮＨ，及びＴＨ又はＵの０４）双方の中心極性大きな溝部分に結合 することができる、そしてなぜならば以下に述べる様に、アデニンが同様な親和 性で、Ｔ：Ａ又はＵ：Ａ塩基一対（すなわちＴ又はＵの０４及びＡのＮＨ６）及 びＧ、Ｃ塩基対（すなわちＧの０６及びＣのＮＨ４＞双方の中心極性大きな溝部 分に結合するからである。

その標的塩基一対に対するイノシン及びその標的塩基一対に対するアデニンの低 い結合親和性は、これらのプリンがその夫々の標的塩基一対の大きな溝部位にあ まり最適でない水素結合２個しか形成できないという事実に基づく。

第三に、ポリピリミジン及びポリプリンポリヌクレオチド双方が生理学的条件下 その標的遺伝子二重らせんへの有効な結合を達成せず、それは二本鎖錯体の３つ の密接に詰められたポリアニオン性主体の間に実質上静電的反発作用に基づく。

この反発作用を高い塩（Ｍｏｒｇａｎ、　１９６Ｂ）、二価カチオン（Ｃｏｏｎ ｅｙ、　１９８８）、又はポリアミン（Ｍａｓｅｒ、　＋９８７）によって、そ れにもかかわらず生細胞中での適用に対して、及び特に無傷の生物内の細胞によ って弱毒化することができるが、細胞内カチオン濃度のコントロールは一般に不 可能である。

更に、治療適用のために、ポリヌクレオチドはあまり最適ではない。というのは これらが毛管の網内細胞内層によって速やかに隔離され、容易に生物膜を横切れ ず、血中でかつ細胞内でヌクレアーゼによる分解に敏感であるからである。

結局、配列−特異二重らせん一配向核酸一結合剤の多くの生体内適用に、主要な 標的はＤＮＡであり、これは主にＢ又はＢ−１１コンホメーシヨンで細胞内に存 在して現われる。これに関連して遺伝子二重らせん結合する大きい溝に使用され るポリヌクレオチド（Ｍｏｓｅｒ、　１９８７　；　Ｃｏｏｎｅｙ、　１９８８ ）は、Ｂ−型コンホメーション中に存在する二重らせん遺伝子配列に結合するの に最適である長さよりも短い単位骨格の長さを有する。

４、本発明の要約 本発明は、標的配列中で選択された位置で少なくとも２個の異なって配向された ワトソンークリック塩基対を含有する二重らせんポリヌクレオチドの標的配列に 、配列−特異方法で結合するのに有効なポリマー組成物を含む。そのポリマーは 、次の形態から選ばれたサブユニットの特異配列から形成される：式中Ｙは２− 又は３一原子の長さの非電荷内部サブユツト連鎖基である：Ｒ゛はＨｌＯＨ又は ０−アルキルである：５−メチレンは５員成環中でβ立体化字配向及び６員成環 中で均一な立体化学配向を有する：Ｒ１はβ立体化字配向を育する：そしてポリ マー中のＲｉ基の少なくとも約７０％は次の塩基一対一特異性基２又は数種から 選択される： （ａ）　ＴＥＡ又はＵＳＡ配向された塩基一対に対して、Ｒｉは２．６−ジアミ ツーブリンである： （ｂ）　ＣＯＧ配向された塩基一対に対して、Ｒｉはグアニン又は６−チオグア ニンである； （ｃ）　Ｇ：Ｃ配向された塩基一対に対して、Ｒｉは次の骨格環構造及び水素結 合配列を有する平面塩基から成る群から選ばれ、この際Ｂはポリマー骨格を示す ：式中＊環位置は、水素−結合受容体基を育していてよい；たとえばカルボニル 酸素：そして（ｄ）　ＡＣＴ又はＡＬＵ配向された塩基一対に対して、Ｒｉは次 の骨格環構造及び水素結合配列を有する平面塩基から成る群から選ばれ、この際 Ｂはポリマー骨格を示す： 式中＊環位置は、水素結合供与基、たとえばＮＨｌを有していてよい。

１つの具体例で、Ａコンホメーションで二重らせん核酸への配列−特異結合に使 用するにあたり、Ｙは連鎖基は２個の原子の長さである。もう１つの具体例で、 Ｂ−梨ＤＮＡ−ＤＮＡ−二重らせん核酸配列への配列−特異結合に使用するにあ たり、Ｙ連鎖基３個の原子の長さである。

別の観点で、本発明は、次のサブユニット形の１つ：式中Ｒｉは２つの数個の水 素−結合部位を有する平面環構造である、を有する第−遊離又はポリマー−末端 サブユニットを次のサブユツト形の１つ：式中Ｚは２−原子又は３−原子長さの 部分である、を有する第二遊離又はポリマー−末端サブユニットとカップリング する方法を包含する。その方法はｉ）第一サブユニットを酸化して、ジアルデヒ ド中間体を発生する：ｉｉ）ジアルデヒド中間体と第二サブユニットとを第一ア ミンをジアルデヒドに連結するのに有効な条件下で接触させる：そして（ｉｉｉ ）次の形：から選択される連結された構造を生じるのに有効な還元剤を加えるこ とを含む。

もう１つの観点で、本発明は塩基一対の選択された配列を有する標的二重らせん 核酸フラグメントを液体サンプルから単離する方法を提供する。その方法は溶液 から試剤を単離することができる構造を含有するポリマー試剤とサンプルとを第 一に接触させる、つまりこの構造に付随して、上記タイプのポリマー組成物であ り、そのポリマー組成物は配列−特異方法で塩基一対の選択された配列との結合 に有効なサブユニット配列を育する。接触は、塩基一対の選択された配列へのポ リマー組成物の配列−特異結合に有効な条件下で実施する。

更に、本発明のポリマーを、標的核酸配列の存在を検出するために使用すること ができる。たとえば担体−結合ポリマー組成物を選択された二重らせん遺伝子配 列を有するテスト溶液と、その標的塩基対配列へのポリマー組成物の配列−特異 結合に有効な条件下に接触させることができる。次いで選択された二重らせん遺 伝子配列と結合した担体−結合ポリマーを、テスト溶液から分離する。次いでポ リマーの標的二重らせん配列の存在を検出する。たとえば選択された遺伝子配列 を検出することは、次のことの１つを使用する二二重らせん遺伝子配列への挿入 に有効な蛍光化合物、たとえば臭化エチジウム及びヨウ化プロピジウム：又は核 酸のポリアニオン骨格に結合するのに有効なオリゴカチオン部分に連結されるリ ポータ一部分。

更に、本発明の構成部分は、二重らせんポリヌクレオチドに於て標的配列に配列 特異方法で結合するのに有効なポリマー組成物を形成するのに使用するサブユニ ット組成物である。この組成物は、次のサブユニット構造のｉつを含む：式中Ｒ ゛はＨ、ＯＨ１又はＯ−アルキルである：５゛−メチレンは、サブユニット形（ ａ）、　（Ｃ）及び（ｄ）中にβ立体化字配向及びサブユニット形（ｂ）中に均 −立体化字配向を存する：Ｘは保護基又は線状ポリマー中に、ある選択された順 序でサブユニットを加えるのに適する連結基である；Ｙは線状ポリマーに、ある 選択されて順序でサブユニットを加えるのに適する核又は親電子連結基である； そしてＸ及びＹは一緒になって、サブユニットセットのサブユニット２個を連結 するあるいは、生じるサブユニット間連鎖は２又は３原子長さの部分である。そ して保護された状態で存在し、β立体化字配向を有するＲｉは次の骨格環構造及 び水素結合配列を有する平面塩基から成るグループから選ばれ、その際Ｂは脂肪 族骨格部分を示す：式中＊環位置は、水素−結合受容体基を有していてよい：又 はＲｉは次の骨格環構造及び水素結合配列を有する平面塩基から成る群から選ば れ、この際Ｂはポリマー骨格を示す： 式中＊環位置は、水素結合供与基を存していてよい。

本発明の他の実施態様は、選択された二重らせん遺伝子配列の生物学的活性を阻 害する方法を含む。この方法で、適する塩基一対の標的配列を、その活性が阻害 されねばならない選択された二重らせん遺伝子配列内で選ぶ。上述の様なポリマ ー組成物を提供し、それは標的配列に配列−特異方法で結合するのに有効である 。ポリマー組成物を、選択された二重らせん遺伝子配列と実質上生理学的条件下 で接触する。

この方法は更にポリマー組成物と選択された遺伝子配列との接触を包含し、その 際ポリマー組成物と選択された遺伝子配列との接触は、ポリマー組成物が不活性 化される選択された遺伝子配列を含有する組織又は部位を攻撃にすることを伴う 。投与のいくつかの方法は、ポリマー組成物を患者の呼吸器官にエアゾールの形 で投与する及び／又はポリマー組成物の水性溶液を患者に注射することを含む。

次の本発明の詳細な説明を、添付の図面を参照して読むことによって、本発明の これらの及び他の目的及び特徴はより十分に明らかになる。

図面の簡単な説明 図ＩＡ−ＩＤは、Ｔ：Ａ（ＩＡ）、　Ａ：Ｔ（ＩＢ）、　Ｃ０Ｇ（ＩＣ）及びＧ ：Ｃ（１０）配向ワトソンークリック塩基一対を示し、塩基一対の大きな溝水素 結合部位を示す（矢印）；図２Ａ及び２Ｂは、２−アミノピリミジン（２Ａ）、 及び２−ピリミジノン（２Ｂ）の互変異性形を示す： 図３Ａ及び３Ｂは、剛性（３Ａ）及び非−剛性水素−結合配列を示す：図４Ａ− ４Ｄは、Ａコンホメーション中のＵＳＡ塩基一対に対する標準位置づけ及び八− 型二重らせんに対するらせん軸の近似位置（４Ａ）、Ａコンホメーション中のＵ ＳＡ塩基一対の極性大きい溝部位に結合されたサブユニット塩基水素に対するＲ ａ。

θ、及びＡ値を算定するためにこの位置づけ図式の使用（４Ｂ）、Ｂコンホメー ション中のＴＡ塩基一対に対する標準位置づけ及びＢ−型二重らせんに対するら せん軸の近似位置（４Ｃ）、及びＢコンホメーション中のＴＥＡ塩基一対の極性 大きい溝部位に結合されたサブユニット塩基水素に対するＲ２Ｏ，及びＡ値を算 定するためにこの位置づけ図式の使用（４Ｄ）を示す；［１Ｊ５Ａ−５Ｃは、本 発明のポリマーの形成で使用するのに適する、代表的な２′−デオキシリポース （５Ａ）、リポース（５Ｂ）、及びリボース−由来の骨格構造（５Ｃ）を示す。

図６Ａ−６Ｆは、本発明のポリマーの形成で使用するのに適する、代表的なモル ホリノ骨格構造を示す。

図７Ａ−７Ｅは、本発明のポリマーの形成で適する、代表的な非環式骨格構造を 示す。

図８Ａは、４−原子単位骨格長さを存する、代表的な連結された非環式骨格構造 を示し、８Ｂ−８Ｃは５−原子単位主体長さを有する、連結された非環式骨格構 造を示し、そして８Ｄ−８Ｅは６−原子単位主体長さを有する、連結された非環 式骨格構造を示す。

図９Ａ−９Ｄは、６−原子単位主体長さを存する、代表的な連結された環状骨格 構造を示し、そして９Ｅ−９Ｆは、７−原子単位主体長さを有する、代表的な連 結された環状骨格構造を示す： 図１０Ａ及びＩＯＢは、グアニジン塩基及びＣＯＧ配向ワトソンークリック塩基 一対へのその結合（ＩＯＡ）及びジアミノプリン塩基及びＴ：Ａ配向ワトソンー クリック塩基一対へのその結合（ＩＯＢ）を示す。

図１１Ａ及びＩＩＢは、Ｇ：Ｃ（ＩＩＡ）及びＴ：Ａ（ＩＩＢ）配向塩基一対へ のシトシン塩基の水素結合を示す。

図１２Ａ及び１２Ｂは、Ａ：Ｔ（１２Ａ）及びＣ：Ｇ（１２Ｂ）配向塩基一対へ のウラシル塩基の水素結合を示す： 図１３Ａ−１３Ｄは、通常の骨格環構造、水素結合配置、及びＧ：Ｃ又はＡＣＴ ワトソンークリック塩基一対に結合するだめの互変異性塩基の骨格結合位置（１ ３Ａ）　、及び＋３Ａ構造の３つの特異的具体例（１３Ｂ−１３０）を示す：図 １４Ａ及び１４Ｂは、Ｇ：Ｃ（＋４Ａ）及びＡ：Ｔ（１４Ｂ）配向塩基一対への 図１３Ｂ構造の水素結合を示す； 図１５Ａ−１５Ｄは、通常の骨格環構造、水素結合配置、及びＧ：Ｃワトソンー クリック塩基一対に結合するための塩基の骨格結合位置（１５Ａ）　、及び図１ ５Ａ構造の３つの特異具体例（１５Ｂ−１５０）を示す：図１６は、ＧＣ配向塩 基対への図＋５Ｄ構造の水素結合を示す。

図１７Ａは、通常の骨格環構造、水素結合配置、及びＧ二〇ワトソンークリック 塩基一対に結合するための塩基の骨格結合位置を示し、及び１７８はＧ：Ｃ配向 塩基一対に水素結合された１７Ａ構造の特異具体例を示す：図１８Ａ　−１８Ｄ は、通常の骨格環構造、水素結合配置、及びＡ−Ｔ又はＡ：Ｕワトソンークリッ ク塩基一対に結合するための塩基の骨格結合位置（１８Ａ）　、及び１８Ａ構造 の３つの特異具体例（１８Ｂ−１８０）を示す；図１９はＡ：Ｔ配向塩基一対へ の図１８Ｄ構造の水素結合を示す：図２０は、この結合ポリマーの１つの具体例 の典型的固体−相合酸で使用されるカップリングサイクルを示す。

Ｕ；！Ｊ２１は、本発明により構成され、かつ塩基一対　ｃ：ｃ、　Ａ：Ｔ、　 ＴＥＡ、及びＧ二重の配列を有する八−型遺伝子二重らせんの領域に結合するた めに作られたセグメントを示す。

図２２は核酸−結合ポリマーを組立てる新規方法でカップリングサイクルを示す 。

本発明のポリマーを、二重らせん核酸の鎖中で選択された配列（標的配列）に塩 基一対特異性でもって結合する様に作成する。ここで使用される様に、二重らせ ん配列は、連続して配向されたワトソン／クリック塩基一対の配列に関係し、そ の際４つの配向塩基一対はＡ：Ｔ（又はＡＬＵ）、Ｔ：Ａ（又はＵＳＡ）、Ｇ： Ｃ及びＣ１Ｇてあり、この場合Ａ、　Ｔ、　Ｕ、　Ｇ、及びＣは夫々アデニン、 チミン、ウラシル、グアニン、及びシトシン核酸塩基と呼ぶ。

ポリマーはサブユニットから形成され、その各々は環状骨格構造及び集まって非 電荷骨格を形成する連結基、及び標的への塩基一対一特異水素一結合を提供する 、環状骨格構造に結合された塩基から成る。ポリマーサブユニットでの骨格構造 、連結基、及び結合された塩基の要求を以下に詳述する。

この二重らせん結合ポリマーに関連して、　°゛塩基なる言葉は、平面塩基一対 −特異水素結合部分にあたる。

Ａ、サブユニット塩基要求 ワトソン／クリック塩基一対で極性率さな溝部位の対称及び極性大きな溝部位の 非対称のゆえに、配列特異性の一定のレベルを得るために、小さな溝−結合剤は 対応する大きな溝−結合剤よりも２倍多くの塩基対を認めねばならない。したが ってサブユニット塩基の水素−結合は、標的二重らせんの大きな溝中て極性部位 となる。

図ＩＡ−ＩＤはＴＥＡ、　ＡＣＴ、　Ｃ：Ｇ及びＧ−Ｃ配向されたワトソン／ク リック塩基一対を、図中矢印によって示された大きな溝水素−結合によって示す 。ＴＥＡ及びＡ：Ｔ配向された塩基一対に関して、極性大きな溝部位は、Ｎ７及 びアデニンのＮ６水素を及びチミン（又はウラシル）の０４を含む。Ｃ：Ｇ及び Ｇ二重配向された塩基一対に関して、極性大きな溝部位は、グアニンの０６及び Ｎ７及びシトシンのＮ４上の水素を含む。

結合の遊離エネルギーに重要な分布をさせ、かつ十分な塩基一対特異性を提供す るために、サブユニット塩基は、その標的塩基一対への水素結合少なくとも２個 を形成しなければならない。すなわちポリマー中の各サブユニット塩基は、生理 学的ｐＨで、その夫々の配向された標的塩基一対土の極性大きな溝部位２又は３ 個に結合するのに適する水素−結合配置を含存しなければならない。表１は、４ つの配向されたワトソン／クリック塩基一対の夫々に対する極性大きな溝から成 る水素−結合及び上記大きな溝部位への水素−結合に適するサブユニット塩基の 対応する水素−結合配置を示す。

表１ 配向された　塩基一対の　サブユニット塩基の必要な塩基一対　水素結合配置　 水素結合配置Ａ　・　Ｔ　零零　Ｈ木本　ＮＸＮＸＮＮ　木本　Ｈ木本　Ｈ Ｔ：Ａ　ｎＨｕ　ＸＮ　ＮＸ　Ｎ 零零　〇〇＊＊ＦＩ Ｃ：Ｇ　Ｈ＊零　木本　ＮＮ　ＸＮ　ＮＨＨ木本　ＨＨ Ｇ　Ｃ旧＄１（ＮＮＮＮＸ ＨＨＨＨネオ 表中、Ｘは一般にＮ、０．又はＳ原子であるが、水素結合に適する非−結合電子 対を有するＦ、　Ｃ１，又はＢ「てあってもよい、そして＊＊Ｉよ水素−結合に 適する非結合電子対を示す。

上述した様に、ポリマーサブユニット塩基は、生理学的ｐＨで特異化された水素 −結合配置を有しなければならない（Ｈｏｏｇｓ　ｔｅｅｎ−タイプ大きい溝結 合に使用されるシトシン部分の場合とは対照的に）。これは生理学的ｐＨでサブ ユニット塩基の結合がポリマーとその標的二重らせんの間の結合の遊離エネルギ ーに実質上分配されることを保証する。

生理学的ｐＨて、サブユニット塩基は主に非イオン化されねばならない。更に特 異的に、塩基性部分は、少なくとも７．５又はその以上のｐＫｂ値を有しなけれ ばならず、そして酸性部分は少なくとも７．７又はそれ以上のｐＫａ値を有しな ければならない。この実質のイオン電荷の欠除は２つの利点を提供する。第一に 、生細胞中での適用に対して、結合ポリマー上でのイオン性基の欠除はポリマー の生物膜への通過を容易にする。第二に、負の電荷の欠除は、結合ポリマーと負 に電荷された、その標的二重らせんのホスファートとの間で電荷反発作用の問題 を回避する。

４つの配向されたワトソン／クリック塩基一対の大きい溝水素−結合配置を、表 ２中に示す。

表２ ＮＨ４０６８７Ｎ７０６　ＮＨ４ Ｎ７　ＮＨ６０４０４ＮＨ６Ｎ７ 表２中で、Ｈは窒素への水素結合、そして川よ水素結合に利用できる窒素又は酸 素の電子対である。

二重らせん遺伝子配列の大きな溝中にその関連する位置を見積っている表２中に 示された塩基一対Ｈ−結合配置の夫々の位置づけは、Ｃ：Ｃ塩基一対のＨ−結合 部位の２個（ＮＨ，及び０６）が、Ａ：Ｔ（Ｕ）塩基一対のＨ−結合部位の２個 （ＮＨ６及び０４）とほぼ同一に位置づけられるという事実を示す。同様に、Ｇ ：Ｃ塩基一対の水素−結合部位の２個（０６及びＮＨ４）は、Ｔ（Ｕ）−Ａ塩基 一対のＨ−結合部位の２個（０４及びＮＨ６）とほぼ同一に位置づけられる。配 向された塩基一対の中心水素−結合部位間の位置づけに於けるこれらの類似性の ために、大きな溝の中心近くの極性部位（上記表中で下線がある）のみに水素− 結合するサブユニット塩基は、一定の塩基一対に対して十分な特異性を欠く。し たがって単一配向された塩基一対に対する高い特異性をサブユニット塩基に得る ために、塩基はその夫々の標的塩基一対のＮ７に水素結合をしなければならない 。

サブユニット塩基が４つの配向されたワトソン／クリック塩基一対の１つのみと 結合しなければならない場合、そのサブユニット塩基の互変異性状態は、使用条 件下で十分に固定されていなければならない。すなわち塩基一対結合に対して位 置づけられた水素−結合基の少なくとも２個は、予定された塩基一対以外の塩基 一対に同じ様な親和性を有するＨ−結合できる構造を生じるために互変異性化し ない。説明するために、図２Ａは満足に固定された構造（はとんど専ら２−アミ ノ互変異性形で存在する２−アミノピリミジン）を示す。図２Ｂは、第二構造を 示し、これは生理学的条件下でその容易な互変異性化によって単−塩基一対に対 する特異性がない（２−ピリミジノン）。代表的なヘテロ環状構造の広い組合せ の優性互変異性形は、Ｅｌｇｕｅｒｏ、　Ｍａｒｚｉｎ、　Ｋａｔｒｉｔｚｋｙ 　＆　Ｌｉｎｄａ　（１９７６）による本に示されている。

サブユニット塩基は、塩基一対結合に対して位置づけられた塩基一対Ｈ−結合基 の少なくとも２個の比較的剛性配置を提供する構造を有する。この様な剛性は環 構造によって最良に提供され、その際標的塩基一対へのＨ−結合に関係する極性 へテロ原子の少な（とも２個が環の一部であるか又は環に直接結合している。説 明するために、図３Ａはこの剛性要求を満足する構造（２−アミノ−３−シアノ ピロール）を示す。図３Ｂは要求を満足させない構造（２−カルボキシアミドピ ロール）を示す。　゛ 最も簡単な配列−特異結合ポリマーは、ポリヌクレオチド二重らせん中で連続塩 基一対から成る標的に結合するものである。これは、同様に、結合ポリマーのサ ブユニット塩基がこれと結合しなければならない標的塩基一対よりも密でないこ とが要求される。したがって夫々のサブユニット構造は平面でなければならない 。これは芳香族特徴及び／又はほとんど又はすべての環原子に対して平面三方結 合を有するサブユニット塩基を使用して最良に得られる。

Ｂ、サブユニット−結合制限 ポリマーサブユニットの幾何学的要求を今、考慮すると、はとんどの二重らせん 核酸は、２つの一般のコンホメーションのどちらかを採用する。ＲＮＡ／ＲＮＡ 及びＲＮＡ／ＤＮＡ二重らせんＡ−タイプコンホメーションを採用する。ＤＮＡ ／ＤＮＡ二重らせんＢ−タイプコンホメーションを採用するが、特定の条件、た とえば高い塩又は低い極性溶剤下にＡコンホメーションに容易に変換することが できる。

二重らせん核酸中で、各々のワトソン／クリック塩基一対土の極性大きな溝部位 は、隣接する塩基一対土で大きな溝の対応する配置に介してかなり一様に位置づ けられ、相対位置は軸位置、軸上昇及び軸回転のらせんコンホメーションパラメ ーターによって決まる。

原則的に、塩基がその夫々の標的塩基一対に水素−結合する場合、異なるサブユ ニット塩基の骨格結合位置を、その標的塩基一対に対してすべての一定方法で位 置づける必要はない。しかしその標的塩基一対に対する異なるサブユニット塩基 の相対骨格結合位置中で著しい変化可能性がある場合、ポリマー中の成分サブユ ニットの主体構造夫々は、骨格の長さ及びサブユニット塩基結合の位置の点であ つらえねばならず、これは著しく高い開発及び製造コストを導く。

しかし一定のサブユニットセットのサブユニット塩基のすべてが、その夫々の標 的塩基一対に対する類似の骨格結合位置及び角度を有する場合、セットのサブユ ニットすべては同一骨格構造を存することができ、これはポリマー構成に要求さ れる合成努力を大いに簡略化する。この最後に、本発明で使用されるポリマーサ ブユニットを、下記の基準に従って、類似する骨格結合位置及び角度を有する様 に選ぶ。

類似の主体位置及び角度が何を意味するかを理解するために、図４八を参照する と、それは八−型遺伝子二重らせん、すなわち（Ａ、　１２．０．３２６）ＲＮ Ａのらせん軸（）Ｉａて示される）に対して位置づけられたワトソン／クリック 塩基一対（Ｗ／Ｃｂｐ）を示す。図中より低い水平線はワトソン／クリック塩基 一対の２＠のリボースＣＦ原子を結びつけ、そして垂直線（ＰＢで示される）は 最初に示した線の垂直二等分線である。

サブユニット塩基の骨格結合位置及び角度を、その時この標準化された位置でそ の対応する標的塩基一対土にサブユニット塩基を位置づけることによって決定し 、その際サブユニット塩基は、図４Ｂ中に２，６−ジアミツトリアジンサブユニ ツト塩基に関して示されている様にワトソンークリック塩基一対の適切な極性大 きな溝部位に水素結合される。

次いてそのＡ−型標的二重らせんに対する、サブユニット塩基の骨格結合位置を Ｒａ及びθａｔ１１によって記載することができ、その際、ＲａはＡ型標的二重 させんのらせん軸から、サブユニット塩基が結合される主体原子（Ｂで示される ）の中心への放射状距離、オングストロームであり、モしてθａは角度、度であ り、このらせん軸に対して垂直二等分線から前述の主体原子の中心へ右回りで測 定する。結合角度、Ａ、は角度として度で示され、これを垂直二等分線及びサブ ユニット塩基と骨格部分との間の結合に対する線平行の間で垂直二等分線から右 回りで測定する。

図４８はＡコンホメーションでＵＳＡ塩基一対に水素−結合された２、６−ジア ミツトリアジンサブユニツト塩基に関するＲａ、θａ、及びＡパラメーターを示 す。図４Ｃは、Ｂ−Ｗ二重らせんの対応して位置づけられた塩基一対を示し、そ して図４ＤはＢコンホメーションでＴ・Ａ塩基一対に水素−結合されたこの２． ６−ジアミツトリアジンサブユニツト塩基に関するＲｈ、θｂ、及びＡパラメー ターを示す。

標的塩基一対を一定の骨格結合部位を有する選択されたサブユニット塩基に関し て明瞭に限定するために、標的二重らせん中の各々ワトソン／クリック塩基一対 に対する２つの配向を考慮しなければならない。生じる４つの配向塩基一対をＡ ：Ｔ、　Ｔ：Ａ、　Ｃ：Ｇ及びＧ：Ｃ（及びＵがＴに代った対応する塩基一対） と呼ぶ。これらの塩基一対の配向を表３中に示す。

表３ 配向された塩基一対　標的塩基一対のプリンの名称　Ｎ７に対するθ値 Ａ：Ｔ（ＡＬＵ）　＞１８０゜ Ｔ：Ａ（ＵＳＡ）　＜　１８０’ Ｃ：Ｇ　＜１８０゜ Ｇ：Ｃ＞１８０’ 原則的に、その標的塩基一対土ての位置で、すべての一定のサブユニット塩基に 関する骨格結合位置は０６ないし１８０’の範囲内でθ値、Ｘ６、を有すること がてきる。標的塩基一対をひっくり返すことによって、その同−標的−結合され たサブユニット塩基のθ値は３６０’　−Ｘ”に変わる。次の議論中に使用され る協定は、結合ポリマーの各サブユニット塩基に関するθ値力＜　１８０’より 小さいことである。

かくて、ここで開示された結合ポリマーを組立てるのに適するサブユニットセッ トを選ぶことに関連して、所定の塩基一対のどの配向が特異化されたサブユニッ ト塩基に対する標的を構成するかを明確に定義するために、塩基一対一結合サブ ユニット塩基の骨格結合位置は１８０°よりも小さいθ値を有する様にその標的 塩基一対の配向を示すのが重要である。説明すると、トリアジンの０４によって 結合された骨格部分を有する２、６−ジアミツトリアジンサブユニツト塩基は、 ＡコンホメーションてＵ、Ａ塩基一対に結合して、２８’のθ値を生じる。この 同一サブユニット塩基が塩基一対の反対配向（すなわち八：υ）でその同−塩基 一対に水素−結合する場合、サブユニット塩基のθ値は３３２６（すなわち３６ ０°−２８°）である。

こ二で使用される慣例は、このサブユニット塩基に対する標的塩基一対がＵＳＡ （その際θは〈１８０°である）であり、ＡＵ（その際θは＞１８０’である） であることを示す。

予期される認識部分に対するＲ１　θ及びＡの満足な値は、ＣＰに分子モデル（ Ｔｈｅ　Ｅａｌｉｎｇ　Ｃｏｒｐ、、サウスナトク、Ｍａｓｓ、、アメリカ）を 用いて容易に得ることができる。僅かにより正確な値を、市場で入手できるコン ピューター分子メカニックスプログラムを介してサブユニット塩基／塩基一対二 重らせん中で水素−結合の最適化によって算定することができる。サブユニット 塩基は、所定のサブユニットセット（所定のポリマーの集合で使用されるサブユ ニットセット）がすへて互いに約２オングストローム以内にＲ値を、互いに約２ ０°以内にθ値を、そして互いに約３０６以内にＡ値を有する様に選ばねばなら ない。

サブユニット塩基が配向された塩基一対の１つのみに高い特異性を有するために 、サブユニット塩基が所定の塩基一対に２つの配向　（たとえばＧ−Ｃ及びＣ： Ｇ）で簡単に、その骨格構造へのその結合のまわりでサブユニット塩基の回転に よって結合してはならないことが重要である。したがって前述の骨格結合位置又 は角度は、標的塩基一対のＣ１゛　位置に対して非対称でなければならない。特 にサブユニット塩基に対するθａは約ｌθ°よりも大きい値を有しなければなら ない、又はサブユニット塩基に対する結合角度、Ａ、は約２５″よりも大きい値 を有しなければ二の項は、選ばれたサブユニットセットに関する骨格構造制限を 考慮に入れる。

主としてその構造は下記り項で議論される他のサブユニット構造にすべての選ば れた順序で結びつかねばならない。更にサブユニット骨格構造及び結合は、適切 な空間を提供し、そして標的二重らせん配列中でその各々の配向された塩基一対 へのサブユニット塩基の有効な結合に対するその各々のサブユニット塩基の正し い配向及び位置づけを考慮しなければならない。

サブユニット骨格構造及び結合に関する主な要求は、実曽上すべての特定の順序 てサブユニットを結びつける手段を提供することである。この要求は、異種又は 同種の結合基のどちらかを含存する構造によって満足させることができる。下記 に示す様に異種タイプ骨格部分は、一方の末端に核基（Ｎ）及びもう一方の末端 に電子基（Ｅ）を有する。

Ｎ　−−−−−−−−一−Ｅ Ｎ成分に関する好ましい官能基は、第−及び第二アミン、ヒドラジン、ヒドロキ シルスルフヒドリル及びヒドロキシルアミンを含む。Ｎ成分に関する好ましい官 能基は次の酸及びその誘導体を含む二カルボキシル化、チオカルボキシル化、リ ン酸化、チオリン酸化、エステル、チオエステル及びリン酸及びチオリン酸のア ミド、リン酸及びチオリン酸及びスルホン酸を含む。他の適するＥ基はアルデヒ ド、ジアルデヒド（又はジアルデヒドへの変換に適する近接ヒドロキシル）、ア ルキルハライド及びアルキルハライドを含む。

同種タイプ主体部分は２つのタイプを有することができ、１つのタイプは核末端 基を存し、もう１つのタイプは電子末端基を有する：あるいは、単一同種骨格部 分を適当なリンカ−で変えることができる。これらの変化物を以下に示す Ｅ−−−−−〜−−Ｅて変化されたＮ−−−−−−−−ＮＥ　リンカ−で変化さ れたＮ−−−−−−−−ＮＥ　−−−−−−−−Ｅて変化されたＮリンカ−Ｎ及 びＥに関する好ましい官能基は、異種骨格部分に於けると同一である。好ましい Ｅリンカ−はカルボニル、チオカルボニル；アルキル、エステル、チオエステル 及びホスホリル及びチオホスホリルのアミド：ホスホニル及びチオホスホニル、 スルホニル：及びシュウ酸を含む。好ましいＮリンカ−は、１．２−ジメチルヒ ドラジンである。

本発明は下記の図５−９に示されている様に、種々の環状及び非環状骨格構造と もに考慮する。非環状骨格構造の１つの制限は、ポリマー集合を準備する電子結 合基の活性化がサブユニット塩基の部位上で望まれない分子内結合の量の変化を 導くことができることにある。適切に構造化された環状骨格部分と対照的に、活 性化された電子性を、サブユニット塩基上で反応性部位から有効に単離すること ができ、それによって望まれない分子内反応を減少させる。

しかし脂肪族環状骨格部分は、各骨格構造中で多様キラル中心の存在を伴う。

環状骨格構造の適切な選択でこの様な多様キラル中心を伴う合成課題を、容易に 人手できる天然物を骨格部分又は好ましくは全サブユニットに、あるいはこれら に最も近い前駆体として使用することによって主に克服することができる。

天然起源から骨格構造、又は全サブユニットに関するこの採択は、多様キラル中 心を有する脂肪族環構造の新規合成の困難性、及び対応するより大きな費用をも たらす。

したがって環状骨格部分の好ましい概念は、デオキシリボース又はリポースから 成る、又はこれから容易に導かれるものである。更に単一対掌体が入手できる又 は容易に製造又は単離てきる、特定の他の天然環状構造も好ましい。

図５Ａ−５Ｃは、デオキシリボース又はリポースから成る又はこれから導かれる 典型的な環状骨格構造を示す。図中のＲ′は、Ｈ又はアルキルを示し、そしてＲ １はサブユニット塩基を示し、これは見た通り天然ヌクレオシドと同一β−配向 を有する。図６Ａ−６Ｆは、リポースから導かれる典型的環状モルホリノ骨格構 造を示し、これは５′−メチレン（親リボース中でのメンバーとして）に対する β−配向（図６八−Ｃ）又はα−配向（図６　Ｄ−６Ｆ）のとちらかを更にＲｉ 塩基のβ−配向によって有する。この様なサブユニットの合成を以下に及び例１ −５に示す。

図７Ａ−７Ｅは、非環式骨格構造の代表的タイプを示す。

Ｄ　サブユニット内連鎖 この項は、本発明のポリマーを形成するためにサブユニ・ノドの連結に使用され るサブユニット内連鎖のいくつかのタイプ及び性質を考慮する。第一に、骨格は 、中性の水性条件で安定でなければならない。結合ポリマー生理学的条件下での 使用に作られているので、サブユニット内連鎖がその条件下で安定であることが 必要である。連鎖はポリマーの集合、脱保護、及び精製に要求されるこれらの条 件下でも安定でなければならない。この安定要求を説明するために、アルキルス ルホナート（Ｒ−（ＳＯ□）−０−ＣＨ，−Ｒ’　）を除く。というのは生じる 構造がＣＨ，上で核攻撃が過度に敏感であるからである。更に、カーボナート（ Ｒ−０−（Ｃ＝０）−０−Ｒ”）及びエステル（Ｒ−（Ｃ＝０）−０−Ｒ’　） を連続的に製造する間、生理学的条件下でのその不安定性は、これらを小さい実 質上の値にさせる。

第二に、骨格は標的結合に適するコンホメーションに適合しなければならない。

サブユニット内連鎖が特異的回転コンホメーション（アミド、チオアミド、尿素 、チオ尿素、カルバマート、チオカルバマート、カルバザード、ヒドラジド、チ オヒドラジド、スルホンアミド、スルファミド、及びスルホニルヒドラジドに関 する場合のように）を存在させるならば、その時標的結合と一致する回転異性体 は最低のエネルギーコンホメーションであるか又はコンホメーションの間の回転 への障害は比較的低い（即ちコンホメーションは生理学的温度で迅速に交換でき なばならない）ということが重要である。かくて、第ニアミド（Ｎ−アルキルア ミド、これはよりトランスコンホメーションに適合する）は、トランスコンホメ ーションが標的二重らせんへの対合に適する場合、受は入れられる。第三アミド 及び関連するＮ、Ｎ−ジアルキル構造は一般に２個のほぼ等しい低いエネルギー コンホメーションを有し、かつ結合ポリマー中で有用であるということと対照的 に、連鎖は２つのコンホメーションの間での相互転換への比較的低いエネルギー 障害を有しなければならない。

２つのコンホメーションの間での回転への障害を、ＮＭＲによって以下のように 算定することができる：２つのコンホメーションがＮＭｌ’１時間尺度に対して 徐々に相互転換する温度で、２つの明瞭なシグナルがしばしば観察され、各々は シングルコンホマーを示す。ＮＭＲスペクトルを段階的に高くなる温度で行った ので、２つのコンホメーションルは合体し一迅速な相互転換を示す。合体温度（ Ｔｃ）は、かくして種々の連鎖タイプの回転自由の有用な尺度を提供する。例え ば、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドは、約１１４°ＣのＴｃを示しくＢａ５ｓｉ ｎｄａｌｅ、　１９８４）　、そして同族の第三アミドのコンホマーは生物学的 巨大分子で徐々に相互転換することがわかった。対照的に、Ｎ、Ｎ−ジアルキル カルバマート含有構造が丁度４４℃以下でＴｃを示しく本発明の支持で得られた 未発表の結果）、これは生理学的温度で適度のコンホメーション自由を示す。

Ｎ、Ｎ−ジアルキルスルフィンアミド（これはスルホンアミド及び関連物質の回 転エネルギー障害と類似するそれを存しなければならない。）はマイナス６０℃ よりも低いＴｃを有すると報告されている（Ｔｅｔ、　Ｃｅｔ、１０５０９（１ ９６４））。これらの考慮に基づき、Ｎ、Ｎ−ジアルキル−タイプ　カルバマー ト、チオカルバマート、カルバザード、及びリン及び硫黄の種々のアミダートを 含有する骨格連鎖が好ましく、一方Ｎ、Ｎ−ジアルキルータイプ　アミド、チオ アミド、尿素、チオ尿素、ヒドラジド、及びチオヒドラジド連鎖は一般に受け入 れられない。

第三に、骨格は変化してはならない。治療適用に関して、ｉ）毛管の細網芽内皮 内層のよって接収されてはならない；　ｉｉ）容易に細胞膜を通過する：　１ｉ ｉ）ヌクレアーゼによって分解されにくい；及び、ｉｖ）標的二重らせんの骨格 上で負電荷の高い密度によってはね返されないようなこれらの結合ポリマーを作 ることが望まれる。これらの計画された目障が、生理学的ＰＨで主に非電荷（非 −イオン）であるサブユニット内連鎖及び骨格部分双方を用いて最良に得られる 。

サブユニット塩基を水素−結合を介してその標的配列の連続塩基一対土に位置づ けする時、及びサブユニットセットのすべての認識部分がＲ２Ｏ，及びＡ値によ く合う場合、その時１つの骨格部分のサブユニット塩基結合位置から次の主体部 分結合位置への距離は次の平方根である：（Ｒサイン（ｒｏｔ））２＋（Ｒ）サ イン（ｒｏｔ）−Ｒ）’　＋（ｒｉｓｅ）”この際Ｒはらせん軸からサブユニッ ト塩基が結合する骨格部分の原子の中心への距離てあり、ｒｏｔは標的二重らせ んに対する軸回値（一般に八−型二重らせんに関して約３０°ないし３０°及び Ｂ−型二重らせんに関して３６°）であり、及びｒｉｓｅは標的二重らせんに関 して軸立ち上がり値（一般にＡ−型二重らせんに関して約２．８ないし３．３Ａ 及びＢ−型二重らせんに関して３．４Ａ）である。

それは、結合ポリマーの単位骨格長さ、すなわち１つの主体構造プラス主体構造 間のサブユニット間連鎖によって計らねばならない距離である。しかし八−型（ ＲＮＡ／ＲＮＡ及びＲＮＡ／ＤＮＡ二重らせん）及びＢ−型（ＤＮＡ／ＤＮＡ） 　ｆｆ的二重らせんともに、いくらか柔軟であり、そして算出される長さの要求 よりも１オングストローム短い又は長いフランクジョンである単位主体長さを有 する結合ポリマーを一般に収容することができることを強調しなければならない 。更にＢコンホメーション中のＤＮＡ／ＤＮＡを一定の条件下でＡコンホメーシ ョンに変えることができる評価しなければならない。

特別な骨格構造を選択するのに、次のファクターが要求される長さを与え、次の ことを考慮に入れらねばならない：第一に結合、たとえばアミド及びカルバマー トのまわりを妨げられた回転によって課せられたすべてのコンホメーション制限 ；第二に、サブユニット塩基はその標的塩基一対に位置し、これらの塩基と標的 二重らせんとの間、そして塩基とポリマー骨格との間のすべての立体相互作用： 第三に骨格構造の異なる成分の間の立体相互作用；そして第四に環状骨格部分に 関してサブユニット骨格構造の成分環構造の好ましいコンホメーション。

予想されるポリマー骨格が特別な標的コンホメーション（たとえば八−型又はＢ −型）に対しての使用に受け入れられがちであるかどうかを決定するための一般 的に満足方法は、所望のコンホメーション中にＣＰＫ分技モデル及び代表的な標 的遺伝子二重らせんを、これにＨ〜結合されたサブユニット塩基と共に集め、次 いで予想されるポリマー骨格を加える。予想されるポリマー骨格がエネルギー的 に好まれないコンホメーション採用することなく容易に結合され、そしてポリマ ー骨格の結合が標的構造の著しい不安を引き起さず、そして受け入れられない骨 格相互作用もない場合、骨格は使用可能でなければならない。予想される骨格構 造の適正に関する付加的な支持は、エネルギー最小化処理を経て最適化された結 合構造を得るために分枝メカニノクスブログロムを用いてコンピータ−上でポリ マー／標的三重らせんをモデル化することによって得ることができる。このよう なモデル化は、場合により、最初のＣＰＫモデル化で観察されるかもしれない顧 著な好まれない相互作用（たとえば極性−極性反発作用）を同定することができ る。

上述した様に、所定のサブユニットセットのサブユニット塩基に対するＲ２Ｏ及 びＡの様なファクター、そして特別のサブユニット構造及びサブユニット間連鎖 の立体及び回転抑制は、所定のコンホメーション中て標的二重らせんに結合する サブユニット塩基の正しい間隔を与えるために単位主体はどの位の長さでなけれ ばならないかについて提供する。しかし概して、セットのサブユニット塩基は約 ７オングストロームよりも小さいＲａ値を有し、そしてθ値は相互の約１２°内 に集まり、そしてＡ値は相互の約２０″内に集まるサブユニットセットは、図８ Ａ−８Ｃ中に示した様に一般に４−原子又は５−原子単位一長さの非環式−タイ プ骨格を、又は図９Ａ−９Ｄに示した様に八−タイプコンホメーションで標的二 重らせんに結合するための６−原子単位−長さ環状−タイプ骨格を要求する。

約１１．５オングストロームよりも小さいＲｂ値、相互の約９ａ内のθ、値、及 び相互の約２０°内に集められたＡ値を有するサブユニット塩基セットは、図８ Ｄ−８Ｅに示したように６−原子単位−長さの非環式−タイプの主体を、又は図 ９Ｅ−９Ｆに示したにようＢ−タイプコンホメーションで標的二重らせんに結合 するのに７０原子単位−長さの環状−タイプの主体を一般に要求する。

しかし、Ｂコンホメーションで一般に存在するＤＮＡ／ＤＮＡ二重らせんが、容 易にＡコンホメーションに変換できることを明記しなければならない。このＢか らＡの変換を生じる２つのこのような条件は、高い塩及び低い極性溶剤である。

標的二重らせんのＢからＡのコンホメーション変換を、Ｂ−型二重らせんに結合 するための最適の長さよりも短い主体単位−長さを有する二重らせん一配向結合 ポリマーによって誘発することができることも分かる。しかし、このようなコン ホメーション変換は、結合の遊離エネルギーの点て費用がかかり、そしてしたが って補償するために、その標的に対する結合ポリマーの親和性を増加しなければ ならない。この標的二重らせんのＢからＡのコンホメーション変換の実行可能性 の故に、幾つかの要求に関して八−型標的二重らせんに適するより短い単位−長 さの骨格を、Ｂコンホメーション中に通常存在する遺伝子配列を攻撃するのに使 用することもセットのサブユニット塩基は、Ｒ２Ｏ及びＡ値を満足に調和し、そ して長さ及びサブユニット塩基結合位置及び配向の点て同−又は極めて類似する サブユニット主体構造をセットのすへてのサブユニットに使用する場合、そのセ ットのサブユニットを選ばれた二重らせん配列を攻撃するためのすべての所望さ れる要求で集めることかできる。

このようにして調和されたセットのサブユニット各々は、標準−長さの骨格構造 に標準の位置で連結されたサブユニット塩基から成る。セットの各サブユニット のサブユニット塩基は、そのセットの他のサブユニットのサブユニット塩基のＲ ２Ｏ及びＡ値に密接に調和されたＲ２Ｏ及びＡ値を有する。

本発明の重要な特徴に従って、セットのポリマーサブユニットはそれぞれ異なる 配向塩基一対に対して特異的である、少なくとも２個の異なるサブユニットタイ プを含有しなければならない。特に、セットの少なくとも２個の異なるサブユニ ット各々の塩基は、そのそれぞれの標的塩基一対の大きな溝部位との水素結合少 な（とも２個を形成するのに有効であり、その際上述したように、これらの水素 結合の１つが、標的塩基一対のプリンＮ７窒素になる。

セットで他のサブユニット１個又は数個は、配向された塩基一対高い特異性でも って必ず結合しない、又はしなくてよい。かくして、セットの他のサブユニット は、以下に示すように、２個の異なるサブユニットに満足に結合する。このよう な低い一特異性又は非−特異性サブユニットは（ａ）ポリマー中高い一特異性サ ブユニット間に間隔を要求し及び（ｂ）ポリマー／二重らせん複合体中で平面塩 基間で相互作用を積み重ねるのに寄与することを提供するのに役立つ。

更に、及び本発明の重要な特徴にしたがって、ポリマー中のサブユニットは標的 配列で少なくとも約７０％の配向された塩基一対への高い一特異性塩基結合を提 供しなければならない。かくして、サブユニットセットは２個のこのような高い 一特異性塩基しか含まないので、標的二重らせん配列はこれらの２個の高い一特 異性塩基によって特異的に結合された少なくとも約７０％の配向された塩基一対 を含存しなければならない。

Ｅｌ、Ｃ：Ｇ及びＴＥＡ又はＵ：Ａ配向塩基一対に対する塩基サブユニット　セ ットはとんどの塩基サブユニットセットは、ＣＯＧ及びＴ：Ａ又はＵ：Ａ配向塩 基一対に特異的に水素結合するのに有効なグアニン又は６−チオゲアニンサブユ ニツト塩基を含有する高い一特異性グアニンである。図１０Ａに記載したように 、グアニン（又は６−チオグアニン）は、Ｃ：Ｇ配向塩基一対の極性大きい溝部 位に３つの水素結合を形成し、これはその標的塩基一対のグアニンＮ７を含む。

サブユニットを、例２に記載したように、β−立体化字配向で骨格構造に結合す る塩基を有する、種々のデオキシリボース、リボース又はモルホリノ骨格構造の いずれかと共に形成する。

塩基性セットの第二メンバーは、Ｔ：Ａ又はＵ：Ａ配向塩基一対に特異的に水素 結合するのに有効な２，６−ジアミツブリンを含有する高い一特異性ジアミノプ リンサブユニットである。図１０Ｂに記載したように、２．６−ジアミツプリン 塩基は、ＴＥＡ又はＵＡ配向塩基一対の極性大きい溝部位３つの水素結合を形成 し、これはその標的塩基一対のアデニンＮ７を含む。グアニンサブユニットを用 いたのと同様に、デオキシリボース、リボース又はモルホリノ骨格構造を有し、 かつ骨格構造への塩基の所望されたβ−立体化学結合を有する、種々のジアミノ プリンサブユニットを、例２に記載通りに、市場で入手できるヌクレオシドの変 化によって製造することができる。

ＣＰＫ分子模型は、グアニン及びアミノプリン部分が効果的に及び特異的にその 標的二重らせんを結合しなければならないことを示す。この大きい溝水素結合モ ードに関する付加的な助けは、これらの２つの３分子複合体、Ｃ：Ｇ：Ｇ及びＵ ：Ａ：Ｄ、に関して実施される最も良く適合する分析から得られる。Ｖｏｅｔ及 びＲｉｃｈ（＋９７０）による完全な再調査は、水素結合の長さ及び角度をプリ ン及びピリミジンの結晶性複合体のＸ−線回折から表で示している。これらの表 で、ＮＨ：Ｎ結合は２．７５Ａから３．１５Ａの長さに及び、そしてその角度は １１５’から１４５’に及ぶ。ＮＨ：Ｏ結合は２、６０Ａから３．２ＯＡの長さ に及び、そしてその角度は１１０＠から１４５’に及ぶ。

最も良く適合する算定で、ワトソンークリック塩基一対でプリン及びピリミジン に関して使用される構造パラメーターは、Ｒｉｃｈ及びＳｅｅｍａｎ（＋９７５ ）によって与えられたものである。これらのパラメーターが、原子分解で溶解す る、ＡｐＵ及びＧｐＣ結晶（右手非−平行ワトソンークリック）のＸ−線回折か ら得られる。上記グアニン構造パラメーターを、図１０Ａ中でサブユニット塩基 に対しても使用する。

ｅｌｏＢの２．６−ツアミノプリンサブユニツト塩基を集め、５ａｋｏｒｅ等（ １９６９）に報告されている様に、２個の１−メチルチミン（一方はワトソンー クリックモードて結合されたチミン及び他方は逆−８００ｇ５ｔｅｅｎモードて 結合されたチミン）に水素結合された９−エチル−２，６−ジアミツプリンの結 晶性３分子複合体Ｘ−線回折の研究から得られた９−エチル−２，６−ジアミツ プリンと実質上同一の構造パラメーターを有する。

分析を簡単にするために、近似はすべての原子が同一平面内にあるものとする。

表４はこの分析の結果である。この表中で、標準プリン及びピリミジンを番号付 はシステムを全体に使用し、サブユニット塩基−Ｇは、図１０Ａ　（グアニン） のサブユニット塩基を意味し及びサブユニット塩基−Ｄは、図１０Ｂ　（２，６ −ジアミツプリン）のサブユニット塩基を意味する。角度を上記Ｖｏｅｔ及びＲ ｉｃｈにおける様に測定する。

０２（Ｃ）　：Ｎ）１２（Ｇ）　１２５°　３．１７ＡＮ３（Ｃ）：ＮＨＩ（Ｇ ）　１１９”　２．９５ＡＮＨ４（Ｃ）：０６（Ｇ）　１２９’　２．６３Ａ大 きい溝水素−結合　角度　長さ ＮＨ２（サブユニット塩基−Ｇ）・Ｈ７（Ｇ）　１４０’　３．１２　ＡＮ）（ １（サブユニット塩基−Ｇ）：０６（Ｇ）　１１５”　２．７４　Ａ０６（サブ ユニット塩基−Ｇ）：ＮＨ４（Ｃ）　１４３’　２．６３ＡＮＨ３（Ｕ）：Ｎ１ （Ａ）　１１９’　２．９８Ａ０４（Ｕ）：ＮＨ６（Ａ）　＋２６’　２．７１ 　Ａ大きい溝水素−結合　角度　長さ ＮＨ２（サブユニット塩基−Ｄ）・Ｈ７（Ａ）　１３７”　２．８５　ＡＮｌ　 （サブユニット塩基−Ｄ）：ＮＨ６（Ａ）　１３９°　２．９５ＡＮＨ６（サブ ユニット塩基−Ｄ）・０４（Ｕ）　１３２°　３．０ＯＡこの表から明らかな様 に、サブユニット塩基／塩基一対複合体中のすべての水素−結合角度及び長さは 、水素−結合に関して決められた角度と長さ内にある。

塩基性グアニン　プラス　ジアミノプリンサブユニットセットを、容易に入手で きるグアノシン又はデオキシグアノシンから簡単に製造することができる。しか しこれらの２つのサブユニットのみから集められ及び少なくとも１６個の連続塩 ツムサイズを有するかなり大きいウィルス中に標的を有することがめられる。

しかし極めて広範囲のウィルスを攻撃することができる結合ポリマーを有するこ とが望まれ、このウィルスは更に３．２００塩基一対のゲノムサイズを有する極 めて小さいウィルス、たとえばヘバチチスＢでさえも含む。実質上その製造費用 を増加することなく、この結合ポリマーの標的範囲を広げるためのある有効な手 がかりは、グアニン及びジアミノプリン高い一特異性サブユニット塩基（すなわ ち配向塩基一対ＣＧ及びＴ：Ａ）に対する標的塩基対から主に（少なくとも約７ ０％）成る配列を攻撃することである。その時標的配列中に残る塩基対（すなわ ち、わずか約３０％Ｇ−Ｃ及び／又はＡ：Ｔ又はＡ：Ｕ）を、結合ポリマー中で 低い一特異性“スペサー”塩基によって収容することができる。このポリマーは 、第一にこれがその標的二重らせん上に位置する時、結合ポリマーの連続サブユ ニット塩基の間で積み重りだ相互作用の連続を提供することに役立つ。

かくて、１つの実施態様に於て、Ｒ１項に記載した塩基性サブユニットセットか ら集められたポリマーは更にｌ又は数種の低い一特異性スペーサーサブユニット 塩基を含む。

結合ポリマーがその標的二重らせん上に位置する場合、積み重ねられたサブユニ ット塩基をもって、スペーサーサブユニット塩基（これは必ずその夫々の塩基一 対に水素−結合されていない）は、高い一特異性サブユニット塩基のＲ１θ。

及びＡ値に密接に調和することがてきるＲ２Ｏ及びＡ値を有しなければならない 。

特に完全なサブユニットセットにとって、Ｒ値はすべて約２人以内になければな らず、θ値はすべて約２０°以内になければならず、そしてＡ値はすべて約３０ ″以内になければならない。好ましくは、スペーサーサブユニット塩基は、標的 結合特異性及び親和性にいくらか寄与するように、その夫々の標的塩基一対への 穏やかな水素−結合も提供しなければならない。

標的配列はＧ：Ｃ配向塩基一対を含有するので、サブユニットセット中の１つの 好ましいスペーサーユニットはシトシン塩基を含有し、これはＧ：ｃ及びＴＥＡ 配向塩基一対に弱く水素−結合することができる。図１１Ａは、Ｇ：Ｃ塩基一対 の大きな溝部位に水素結合されたシトシンを示し、そして図１１Ｂは、Ｔ：Ａ塩 基一対に水素結合されたシトシンを示す。どちらの場合も、標的塩基対のプリン のＮ７への水素結合を含まない。

標的配列は、Ａ−Ｔ又はＡＬＵ配向塩基一対を含有するので、サブユニット中の １つの好ましいスペーサーサブユニットはＡＣＴ及びｃ：Ｃ配向塩基一対に弱く 水素結合することができるウラシル（又はチミン）を含有する図１２ＡはＡＣＴ 塩基一対の大きな溝部位に水素結合されたウラシルを示し、そして図１２Ｂはｃ ：Ｃ塩基一対に水素結合されたウラシルを示す。ソトシンスペーサーを用いた様 に、これらの水素結合相互作用のどれも標的塩基一対のプリンのＮ７にかがわら ない。

これら２つのサブユニット塩基は、その標的塩基一対に結合する低い一特異性及 び低い親和性のみを提供するけれども、それにもかかわらず、ｉ）それらは標的 −結合された結合ポリマー中に積み重ねられるサブユニット塩基の連続を提供す る；１１）それらはサブユニットセットの高い一特異性グアニン及びジアミノプ リンサブユニット塩基のＲ２Ｏ及びＡ値と十分に調和するＲ２Ｏ及びＡを有する 。及び山）スペーサーサブユニット又はこれに近い前駆体は市場で入手できる及 び比較的に安価である。

４つのサブユニット塩基グアニン、ジアミノプリン、シトシン及びウラシル（又 はチミン）を含有する及び種々のデオキシリボース、リボース及びモルホリノ骨 格構造を有するサブユニットセットの合成を、例２中に記載する。例中に記載さ れたセットは、次の骨格構造を存する：（ａ）図５Ａ、例２Ａ中に見られる、２ −デオキシリボース；（ｂ）図５８（Ｒ＝メチル）、例２Ｂ中に見うレル、２’ 　−０−Ｊ　ｆ　ル＋）ボース；（Ｃ）図６Ａ、例２Ｃ中に見られる、モルホリ ノ；（ｄ）ｌｌＮ６ｃ、例２Ｄ中に見られる、Ｎ−カルボキシメチルモルホリノ −５−アミノ：（ｅ）図６Ｆ、例２Ｅ中に一般に見られる、Ｎ−カルボキシメチ ルモルホリノー（アルファ）５−アミノ： （ｆ）図５ｃ１例２Ｆ中に見られる、　５′カルバザードを有するリボース：（ ｇ）図５Ｃ中に見られ、しかしカルボニル基がスルホニル基代っている、例２Ｇ 中に見られる５′スルホニルヒドラジドを有するリボース；（ｈ）図５Ｃ１しか し０ＣＯＮＨＮＨ２基がＮＨＣＯＣＨ，ＮＨ２によって代ってイル、例２Ｈ中に 見られる、５−グリシンアミドを有するリボース：そして （１）図５Ｃ１しかし０ＣＯＮＨＮＨ２基が０ＰＯ２ＥｔＣＨ，ＮＨ，によって 代っている、例２Ｉ中に見られる、５゛（アミノメチル）（エチル）ホスファー トを有するリボース。

表５は塩基一対特異性を示し、このグアニン、ジアミノプリン、シトシン及びウ ラシル（又はチミン）サブユニットセットのサブユニット塩基に対するＲ２Ｏ及 びＡ値を概算する。

表５ サブユニット塩基　塩基一対　特異性　Ｒ１θ、ＡＧ　ＣＯｏ　５．８Ａ３３° 　６０’ Ｄ　Ｔ：Ａ　５．６Ａ　３２’　６０゜ＣＧ：Ｃ＆Ｔ：Ａ　４．８Ａ　３８”　 ５０゜Ｕ　Ａ：Ｔ＆Ｃ：Ｇ　４．８Ａ　３８’　５０’上記Ｇ、　Ｄ、　Ｃ及び Ｕ又はＴサブユニットセットで製造された結合ポリマーも一本鎖遺伝子配列に結 合する効力を有するが分るであろう。特に、ポリマーを適切な塩基配列の一本鎖 ボリヌクレオチドにワトソンークリック対合モードで結合することかできる。

ポリマー中のスペーサーサブユニット、Ｃ及びＵ又はＴは結合特異性の点て退化 するので、これらの低い一特異性スペーサーサブユニットの少なくとも２つは、 １つの高い一特異性すブユニットによって提供される標的特異性のレベルに同等 のレベルを提供することが要求される。かくて１６個の高い一特異性サブユニッ ト塩基を含有する結合ポリマーは、１２個の高い一特異性サブユニット塩基及び ８個の低い一特異性スペーサーサブユニット塩基を含有する結合ポリマーとほぼ 同一の標的特異性レベルを提供する。

ユニットセット もう一つの実施態様で、Ｒ１項に記載したグアニン　プラス　ジアミノプリンサ ブユニットセットは、Ｇ：Ｃ又はＡＣＴ配向塩基一対のどちらかに水素結合する ことができる互変異性サブユニット塩基を存する付加的なサブユニットを含む。

−膜化された骨格環構造及び１つの好ましい塩基タイプの水素結合配置を、図１ ３Ａ中に示し、その際Ｘ、はＨ又はＮＨ２：　Ｘ、はＨ，Ｆ又はＣＩ、及びＢは ポリマー骨格を示す。図１３Ｂ　−１３Ｄは以下に示す様に、この互変異性塩基 の３つの好ましい具体例を示す。

図１３Ｄから塩基の異なる互変異性形によって塩基一対を攻撃する水素結合をＧ 、Ｃ又はＡ：Ｔ配向塩基一対それぞれに関して図１４Ａ及び１４Ｂに示す。図１ ４Ａから明らかなように、Ｘ、は、互変異性体がＧ、Ｃ塩基一対に水素結合され る時水素結合受容体であり、塩基一対への３つの水素結合を提供することができ る。同様に、ｘｌは互変異性たいＡＣＴ塩基一対に水素結合を提供することがで きる。同様に、Ｘ。

は互変異性体がＡ、Ｔ塩基一対に水素結合される時水素結合供与体であり、塩基 一対への３つの水素結合を提供することができる。

表６は塩基一対特異性を示し、そしてグアニン、ジアミノプリンのサブユニット 塩基及び図１４のサブユニット塩基に関するＲ２Ｏ及びＡ値を概算する。

表６ サブユニット塩基　塩基一対　特異性　Ｒ１θ、　ＡＧ　ＣＯｏ　５．８Ａ　３ ３’　６０゜Ｄ　Ｔ：Ａ　５．６Ａ　３２＠６０’ 図１３Ｂの互変異性塩基　Ｇ：Ｃ＆Ａ：Ｔ　６．３Ａ　３６’　５５’互変異性 サブユニツトの多くの特別の具体例の合成を、例３に記載する。図１３Ｂ及び１ ３Ｃに見られる構造の合成を、２゛デオキシリボース骨格構造に関して例１３Ａ に：２゛０−メチルリボース骨格構造に関して例１３Ｂに：及びモルホリノ骨格 に関して例３Ｃに記載する。

また別の実施態様で、Ｒ１項に記載したグアニン　プラス　ジアミノブリンサブ ユニットセットは、付加的なサブユニット、その塩基がＧ：Ｃ配向塩基一対への 水素結合に特異的であるもの、又は付加的なサブユニット、その塩基がＡＣＴ（ 又はＡＬＵ）配向塩基一対への水素結合に特異的であるものを含み、あるいはセ ットは２つの付加的なサブユニット、その塩基一対がＧ：Ｃ配向塩基一対及びＡ ：Ｔ又はＡ：Ｕ配向塩基一対それぞれへの水素結合に特異的であるものを含む。

図１５Ａは、Ｇ：Ｃ配向塩基一対に有効に結合する塩基の一般的タイブの環構造 及び水素結合配置を示す。この構造タイプの３つの好ましい具体例を、１５Ｂ− １５Ｄに示す。図１６はそのＧ：Ｃ標的塩基一対に水素結合された、図１５Ｄの 構造を示す。

図１５Ａ及び図１６から明らかなように、図１５Ａ構造中のＸ位置は、塩基及び その標的Ｇ：Ｃ塩基一対の間に３つの水素結合を形成するための水素結合受容体 、例えば０であってよい。

図１５Ｂ−１５ｃのモルホリノ骨格構造及びＧ二重−特異性塩基を有するサブユ ニットの合成を例４Ｄに記載する。

図１７Ａは、Ｇ、Ｃ配向塩基一対に有効に結合する塩基の別の一般的タイブの環 構造及び水素結合配置を示す。そのＧ：Ｃｆｆ的塩基一対に水素結合された、こ の構造タイプの好ましい具体例を、図１７Ｂに示す。

図１７Ｂのモルホリノ主体構造及びＧ二重−特異性塩基を有するサブユニットの 合成を、例４Ｅに記載する。

図１８Ａは、ＡＣＴ又はＡＬＵ配向塩基一対に有効に結合する塩基の一般的タイ ブの環構造及び水素結合配置を示す。この構造タイプの３つの好ましい具体例を 、１８Ｂ−１８Ｄに示す。図１６はそのＧ：Ｃｅｅｌｉ的塩基一対に水素結合さ れた、図１５Ｄの構造を示す。図１９はそのＡ：Ｔ　ｔｌＦｆ的塩基一対に水素 結合された、図１８Ｄの構造を示す。

図１８Ｂ−１８Ｃのモルホリノ骨格構造及びＡ：Ｔ又はＡ：Ｕ−特異性塩基を有 するサブユニットの合成を例４Ｃに記載する。

Ｒ１項に記載したグアニン及びジアミノプリンサブユニットを有する、この項で 記載したサブユニット、その塩基がＧ：Ｃ、ＡＣＴ及びＡ、Ｕ配向塩基一対であ る、は完全なサブユニットセットを提供し、それは二重らせん核酸中の４つの可 能な配向塩基一対の各々に関して高い一特異性水素結合を提供する。本発明の１ つの観点に従って形成されたサブユニットセットは二重らせん標的配列中で３つ の異なる配向塩基一対に有効に結合するこられの高い一特異性サブユニットのい ずれか３つを包含する。例えばＴ：Ａ、　ＣＯＧ及びＧ：Ｃ塩基一対を含有する 標的配向で、選ばれたサブユニットセットは、通常の又は類似の骨格構造及びジ アミノプリン、グアニン（又はチオグアニン）、及び上記Ｇ：Ｃ特異性塩基の１ つを含有する。４つの配向塩基一対のすべてを含有する標的配列に適するサブユ ニットセットは、その塩基がＡ：Ｔ配向塩基一対する上記高い一特異性塩基の１ つであるサブユニットを含む。

表７は塩基一対特異性を示し、そしてグアニン、ジアミノプリンから成るサブユ ニット塩基及び図１５．１７及びＩ８の高い一特異性塩基に関するＲ２Ｏ及びＡ 値を概サブユニット塩基　塩基一対　特異性　Ｒ１θ、ＡＧ　Ｃ：０　５．８Ａ 　３３”　６０”Ｄ　Ｔ：Ａ　５．６Ａ　３２”　６０゜図１５の塩基　Ｇ：Ｃ ６，３Ａ　３６”　５５’図１７の塩基　Ｇ：Ｃ４，８Ａ　３８”　５０”図１ ８の塩基　Ａ：Ｔ　６．４Ａ　３６’　５５’表は、Ｒ２Ｏ及びＡ値に関してこ の塩基のセットの一般的適応性を示す。

１１、ポリマー製造 この項に、配列−特異性二重らせん一結合ポリマーを生じる上記サブユニットセ ットから成るサブユニットの集合を記載する。

Ａ、ポリマー配列及び長さ 本発明のポリマーを標的二重らせん配列、例えば所定の病原体に必須の配列に結 合し、通常のホスト遺伝子配列を不活性化することなく、及び不活性化するよう に作る。かくて、ポリマーによって認識される配列情報は、すべての通常のホス ト配列から病原体配列を厳密に区別するのに十分でなければならない。

二重らせん核酸−結合ポリマーが、通常の細胞配列上で共存攻撃を避けるために 、疾患−特異配列中に認められねばならない配列情報の量の適度の評価を、次の にうに算定することができる。ヒトゲノムは、独特−配列のおおよそ３０億塩基 一対を含有する。独特配列遺伝子材料の３０億塩基一対の細胞プール中に偶然標 的配列を含有しないことを予想する遺伝子−不活性化剤にとって、その標的中に すくなくともｎ塩基一対を認めなければならず、その際Ｎを４０・３刈０１とし て算定し、これは約１６塩基一対の最小標的確認要求を生じる。これは、その標 的配列中に過剰の１６塩基一対で確認される遺伝子−不活性化ポリマーが、固有 のＤＮＡの細胞プール中に標的を恐らく含有しないであろうことを示唆する。明 らかに標的配列中で認められる塩基一対の数がこの値以上に増加するので、固有 の細胞配列を攻撃するポリマーの確立は減少しつづける。この剤によって確認さ れる塩基一対の数が直線的に増加するので、この“安全因子′は指数関数的に増 加することが注目に値する。

説明するために、表８の標的配列中に認められる塩基一対の数及び独特〜配列遺 伝子材料の３０億塩基一対のプール中に偶然標的の対応して予想される数を、表 標的二重らせん中に認め　ヒトゲノム中で偶然られる塩基一対の数　標的の予想 される数８　４５、７７６ １０　２、８６１ １８　０、０４４ ２０　０、００２７ 表８の数は、病原体又は発病状態に十分な特異性を得るために、二重らせん核酸 に対する結合剤は少なくとも１６、及び好ましくは１８又はそれ以上の標的配列 の塩基一対を認めねばならないことを示す。

標的配列の長さに加えて、種々のウィルス性病原体の実質上の攻撃を可能にする ために、ポリマー塩基によって二重らせん核酸（即ち、ＡＣＴ、　ＣＯＧ、　Ｇ ：Ｃ及びＴ：Ａ）中の４つの可能な配向塩基一対がどれくらい特異的に認められ ねばならないかを考慮することが重要である。表８は、比較的小さいウィルスゲ ノム（Ｈ［Ｖプロウィルスのサイズについて）中に予想される標的のおおよその 数を１６−サブユニットポリマー中の異なる塩基一対一結合特異性の数の関数と して示す。表中の値を、病原体ゲノムの所定でのプリンとピリミジンの割合はほ ぼ１．０であること及び塩基は実際上不規則な順序であることを前提として算定 する。

表９ サブユニット塩基中の　塩基一対のウィルスゲノム中の連続塩基一対一結合特異 性の数　１６−塩基一対標的の予想される数１　０、０００００２ ４　１００．０００ 表で示された値は、一般に、ホモポリマー（即ちたった１つの配向塩基一対に特 異性を有するサブユニットから集められたポリマー）は、自然二重らせん遺伝子 配列ですべての実際的標的を有しそうもないことを示す。更に、４つの配向塩基 一対のたった２つに特異的である丁度２つのサブユニットタイプのコポリマーは 、極めて大きいウィルス（例えばヘルペス）のみに連続１６−標的を有すること が予想される。これとは対照的に、配向塩基一対の３又は４つに特異性を有する サブユニットセットから集められた結合ポリマーは最も小さいＤＮＡウィルス（ はんの３２００塩基一対のゲノムサイズを有するヘバチチスＢ）さえも極めて十 分な数の標的を有する。

１項に記載した様に、本発明にしたがって形成された塩基性の２−サブユニット セットは２つのサブユニットを含み、これは２つの異なる配向塩基一対、Ｃ：Ｇ 。

ＴＥＡ及びＵＳＡに特異的である。標的多面性を増加するために、別の具体例は 膨張したサブユニットセットを含み、これはｌ又は２個のスペーサーサブユニッ トを含む。また、別の具体例は、塩基性２−サブユニットセット　プラスその塩 基２つの異なる配向塩基一対のどちらかに水素結合することができる付加的なセ ミー特異性サブユニットを含有する。上述の様に、このセミー特異性サブユニッ ト塩基によって確認された配列情報のほんの半分を確認し、かくてその使用はそ の標的に十分な特異性を得るために、対応してより長いポリマーを要求する。も う一つの具体例は、塩基性２−サブユニットセット　プラスその高い一特異性塩 基が４つの配向塩基一対のたった１つに水素結合することができる付加的なサブ ユニットｌ又は２個を含有する。配向塩基一対のすべて４つに対するサブユニッ トを含有するこのようなサブユニットセットは、実際いずれの所望される二重ら せん遺伝子配列を攻撃することができる。

Ｂ、サブユニット活性化及びポリマー集合例１−５における様に製造された、サ ブユニットを活性化し、ついで調節された連続法で連結し、所望される結合ポリ マーとなす。デオキシリボース−含有及び２−０−メチルリボース−含有サブユ ニットに関する、代表的ポリマー集合処理例６に記載する。モルホリノ−含有サ ブユニットに関する、代表的活性化処理を例７に記載する：例８に、固−相段階 的添加によってされらの活性化されたサブユニットを集め、所望された結合ポリ マーとなす典型的な処理を記載する；そして例９にそれらの精製を記載する。図 ２０における様に製造されかっ例７Ａにおける様に活性化された代表的なモルホ リノサブユニットを用いて、この段階的集合処理の１つのサブユニット添加サイ クルを示す。図２１は、例４Ａ−４Ｄにおける様に製造されカリ例７Ａにおける 様に活性化されたサブユニットから集められた代表的ポリマーの４−サブユニッ ト−長さのセグメントを示す。

Ｃ９酸化／閉環／還元からなる新規ポリマー集合上記に加えて、新規カップリン グ処理を所望された核酸結合ポリマーを集めるのに使用することができ、その内 の１つの具体例を図２２に示す。この処理は次のことを含む ｉ）サブユニット、又は連結されたサブユニットのブロックを提供し、これはビ ノナク脂肪族ヒトロキンルを含有するが、第一アミンはない（例えば図２２の構 造１）：　ｉｉ）これらのヒシナルヒトロキシルを酸化し、ジアルデヒド成分と なす（例えば図２２の構造２）。

山）サブユニット、又はサブユニットのブロックを提供し、これは遊離の第一脂 肪族アミンを含有する（例えば図２２の構造３、及び例２Ｆ−２Ｉにおける様に 製造されたサブユニット）； ｉｖ）ジアルデヒド成分を第一アミン成分と接触さ化モルホリノ窒素の隣接した 炭素上にヒドロキシルを有する環状モルホリノ構造の形成によって、２つの成分 のカップリングを行う（例えば図２２の構造４）；Ｖ）カップリング反応の間又 はその後、ポリマー集合の完了後、還元剤を添加し、モルホリノ窒素の隣接した 炭素上にヒドロキシルを除き、所望されたモルホリノ環構造となす（例えば図２ ２の構造５）；ビシナル−ヒドロキシル−含有部分は、リボース、例えばガラク トース又はグルコース以外であることができる。更に、このカップリング法をポ リマー集合に関して溶液−相又は固−相モードのどちらかで使用することができ る。また、酸化段階及び次のカップリング段階をアルコール又は水又はその混合 物中で、及びほぼ中性のｐＨて実施するのが好ましい。還元をカップリングの間 又はその後に実施することができるが、最良の結果が還元剤、例えばＮａＣＮＢ Ｈａ　、がカップリング段階の間存在する時に得られる。ボラーキ錯体（ＮａＣ ＮＢＨ，を還元に使用する時に発生）の完全な還元が、３から５に及ぶｐＩ（を 有する最後の酸性洗浄−各カップリングの後に、又はすべてのカップリングが完 了した後に実施する−によって得られる。

例ＩＯには、結合ポリマーの段階的固−相集合のためのこの“酸化／閉環／還元 ”カップリング法の代表的適用を示す。

Ｄ　ポリマー変化 本発明のポリマータイプのいくつかは、約１５−２０サブユニツト以上のポリマ ーサイズに関して、たとえば低い一徹小分子範囲で比較的小さい溶解度を有する 。

かくて親水性部分の添加、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖の添加 によってポリマーの溶解度を増加させることが望まれる。ある方法によればポリ マー末端を脱たん白し、ポリマーと過剰の活性化された親水性化合物、たとえば ビス（Ｐ−ニトロフェニル）カルボナートによって活性化されたＰＥＧ　、と反 応させることによって、このことをなし遂げることができる。その後結合ポリマ ーを合成担体から切断させ、水酸化アンモニウムで処理し、塩基−保護基を除き 、次いで好ましくはｐＨｌ０．５でイオン交換クロマトグラフィーによって精製 する。１つの好ましい親水性分子はＰＥＧであり、これは約１０００ダルトンの 平均分子量を有する（ポリサイエンス、Ｉｎｃ、及びアルドリッチＣｈｅｍ、　 Ｃｏ、から市場で入手できる。）いくつかの適用に関して、エンドサイト−シス を経てその細胞吸収を助けるポリマーを変化させるのが望まれる。たとえばこれ は、ポリマーをポリカチオン性分子、たとえばポリリジンで誘導化して行われる 。第一アミン部分１又は数種を含有するこの様な分子のカップリングは、塩基− 保護されたポリマーと二官能性カップリング剤、たとえばジサクシンイミジルス ベラート又は他の市場で入手できる剤（たとえばＰｉｅｖｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）と反応させ、次いでアミン含有ポリカチオン性分子を加え ることによる。

ポリマー分子を固体担体に結合しなければならないので、診断システムで使用す るにあたり末端Ｎ−保護基を切断しく保護された状態でまた塩基を離脱する）、 次いて適する架橋剤、たとえばジサクシンイミジルスベラートと反応させること ができる。次いでこの調製物を担体材料、たとえば第一アミン部分で結合する、 適するリンカ−アームを有するラテックス微粒子に加える。

その代りに、結合ポリマーを担体に担持する前に精製することを望むならば、メ トキシドリトリル−保護された６−アミノカプロン酸をＤＣＣを用いて結合ポリ マーの非保ｆｆＮ−末端に連結することができる。次いで結合ポリマーを水酸化 アンモニウムで処理し、塩基を脱保護し、標準法で精製し、次いで末端メトキシ トリチルをアミノカプロン酸部分から切断する。最後に精製されたポリマーを、 ｐ−ニトロフェニルエステル部分で終結する適するリンカ−アームを有する担体 材料と混合し、ポリマー分子の共存結合を担体に付与する。

環状骨格部分を有するサブユニットから構成される結合ポリマーは、標準ホスホ ジエステル一連結されたポリヌクレオチドによって示された５′ないし３°鎖極 性と同様な鎖極性を有する。結果として、塩基対の所定の不均一な標的配列に関 して、２つの結合ポリマーを構成することができ、１つと５′から３′へ配列さ れた塩基の適切な配列を有し、もう１つは３′から５°へ配列されている。すべ ての選択された塩基対の標的配列にとって好ましいポリマーは、２つの可能な配 向で適切な塩基配列を含有する２つの結合ポリマーを集め、そしてこれら２つの ポリマーを選ばれた二重らせん標的配列に対するその夫々の結合親和性に関して テストして容易に決定される。標準ポリヌクレオチドに対する適切な結合配合を 決定する類似方法は、従来公知である。この結合ポリマーが２つの配向のどちら か又は両方でその標的二重らせんを結合する効力を育することを評価しなければ ならない。

ある適用で、本発明のポリマーを、被検体で二重らせん標的核酸配列を検出する 診断法に使用する。標的配列は、典型的に病原体−特異配列、たとえばウィルス 又は細菌ゲノム配列であり、これは生物サンプル、たとえば血液サンプル中に検 出することができる。

標的配列は、長さ１５ないし２５サブユニツトであるのが好ましく、上述の様な 必要な配列特異性を提供する。ある検定計画で、診断試薬は、二重らせん標的配 列に特異的に結合するのに有効な共有−結合ポリマーによって被覆された、固形 担体、たとえばマイクロビーズである。サンプルを遊離形で細菌又はウィルスか ら被検体二重らせんを離脱するために処理した後、場合により、担体−結合ポリ マーに被検体二重らせんの塩基一対一特異結合を行うのに十分な条件下で固形担 体とサンプルを接触させる。一般に、結合反応を２０−３７°Ｃで１０分ないし ２時間行う。

固形担体を洗滌し、非結合材料を除去した後、担体を捕捉された標的二重らせん に有効に結合するリポータ−試薬と接触させ、上記二重らせんを検出することが できる。

リポータ−は、本発明に従って形成された可溶性二重らせん一結合ポリマーであ って、これは被検体二重らせん中で第二被検体−特異標的配列に塩基一対一特異 的であり、かつこれは適するシグナル基、たとえば蛍光部分でシグナル検出のた めに標識する。シグナル基を第■項に記載した様に標準カップリング法によって ポリマーに結合させる。

担体を洗滌した後、結合されたリポータ−を調べる。これは配列−特異結合ポリ マーを介して担体に結合された被検体の量に比例する。

その代りに結合された被検体二重らせんを含有する洗滌担体を、核酸に特異的な 蛍光挿入剤、たとえば臭化エチジウムと反応させ、次いでポリマー−結合被検体 をその蛍光によって算定する。もう１つの変法は、結合された被検体二重らせん を含有する洗滌された担体を共願の公告されたＰＣＴ出願Ｎｏ、　ＰＣＴ／ＵＳ ８６１００５４５（Ｗ０８６１０５５１９）中に記載されている様に、リボ−タ ー−標識されたポリカチオン性分子、たとえば蛍光−標識されたオリゴ−カチオ ンと反応させることにある。リポータ−分子は負に電荷された被検体二重らせん 主体との静電相互作用によって結合するが、実質上非電荷のポリマー分子を固形 担体上で結合しない。担体を洗滌し、非結合材料を除去した後、配列−特異非検 体／ポリマーを介して固形担体に結合されたリポータ−を測定する。

Ｂ、その場でハイブリッド形成 多くの適用で、その場でハイブリッド形成は、二本鎖二重らせん核酸、一般に病 原体は又は選択された配列と関係があるＤＮＡ二重らせん中で標的配列に対して 向けられる。その方法で、前述の通り、標識された核酸試料を、透過性が上げら れた構造に加え、構造を標的二重らせん核酸を変性するのに十分な温度に加熱し 、次いて試料及び変性された核酸を適するハイブリッド形成条件下に反応させる ことができる。非結合（非−ハイプツト）試料の除去後、構造をリポータ−ラベ ルの存在について調べ、標的核酸に結合する試料の部位を生物構造中に局在化さ せる。

この方法は染色体ＤＮＡに広く適用され、特異遺伝子配列の局在化を地図作成し 、公知の遺伝子配列間の距離を決定し、サテライト又は（り返しＤＮＡの染色体 分布を研究し、核構成を調べ、染色体収差を分析し、単−細胞又は組織中でＤＮ Ａ損傷を局在化する。いくつかの研究は、ホスト−細胞染色体に組み込まれたウ ィルス配列の局在化について報告されている。その方法も染色体の位置を区分さ れた核の三次元構成によって、及び水銀化されかつビオチニラート化された試料 でその場で二重ハイブリット形成によって、静止期染色体トポグラフィ−（Ｅｍ ｍｅｒｉｃｈ）を調へるデジタルイメージ分析を用いて調査するのに使用される 。その場でのハンプリッド形成法の他の一般的適用は、診断手段としてホスト細 胞中のウィルスの存在を検出するためのものである。

現在の適用で、本発明のポリマーを、重要な細胞又は副細胞構造、たとえば染色 体製造と関係する特異的二重らせん遺伝子配列を攻撃するために作成する。ポリ マーを適する標識、たとえば蛍光タグ誘導化する。ポリマーを調べる構造を有す る細胞又は組織に、初め材料を浸透することなく、直接加えるのが好ましい。

ポリマーが非電荷なので、浸透処理を必要とすることなく生細胞により容易に浸 透することがてきる。これは更に耐又はフレアーゼ分解性である利点を示す。

一度、重要な二重らせん標的材料との接触で、塩基一対一特異結合を通常の生理 学的温度て生じ、再び通常の細胞活性の条件下、及び材料の熱崩壊を調べること なく二重らせん標的の検出をさせる。標的二重らせんへの結合に十分な時間の後 、及び非結合ポリマーの洗滌除去後、調べられる構造を直ちに、たとえば蛍光顕 微鏡によって調べ、二重らせん標的配列の部位−特異局在化及びその可能な動き を観察する。更に蛍光背景を減少させ、材料をたとえばエタノール処理によって 固定し、非結合リポータ−を洗滌除去し、顕微鏡で固定化形で検査する。

Ｃ１漂的配列を含有する二重らせんの単離ポリマー発明の他の一般的適用は、核 酸混合物、たとえばゲノムフラグメントの混合物、選ばれたウイルス二重らせん 又は異なる配向で異なる二重らせん挿入断片を有するプラスミドの混合物から二 重らせん核酸構造を単離することにある。

この方法で使用される結合ポリマーを、（ａ）選ばれた標的二重らせん配列への 塩基一対一特異結合及び（ｂ）標的二重らせんの捕獲後液体サンプルから単離す る能力を存する。この最後に、上述の様にポリマーを固形担体に結合させるか、 又はリガンド部分、たとえばビオチンで誘導化する。この部分は標的二重らせん に結合後、固形担体、又は免疫沈殿上で捕獲を許可する。

ポリマーをサンプル材料に加え、ポリマーのその標的配列への結合を可能にする 条件下で、一般に１０分ないし２時間、２０°−３７℃でインキュベートする。

結合が生した後、ポリマー及び結合材料をサンプルから単離する。単離された材 料をポリマーから加熱によって、又はカオトロピック剤によって離脱し、更に場 合によりポリメラーゼ鎖反応法、及び／又は適するクローニングベクター中でク ローン伝播によって増幅する。

Ｄ０部位特異ＤＮＡ修飾 本発明のポリマーは、また試験管内で二重らせんＤＮＡの選択された部位−特異 修飾を生じるのに作用である。これらは選択された部位で二重らせん種を切断す ること、又は制限に対する選択された位置を保護すること又は酵素をメチル化す ることを含むｏＲ後の適用は特に組換えＤＮＡＮ技術で有用である。その際しば しばベクター又は異ｆｌＤＮＡ配列を選択された制限エンドヌクレアーゼによる 切断に対して保護することができるのが育利であるか又は所定の制限部位でメチ ル化を選択的に妨げることが望まれる。

選ばれた塩基配列中に部位−特異切断を生じるために、ポリマーを切断部分、た とえばポリマー結合状部て二重らせんＤＮＡを切断することができる、キレート 化鉄基、で誘導化する。ポリマー配列を、切断基を配置するために選び、この基 は一般に切断される部位に隣接する１つのポリマー末端と結合する。制限又はメ チラーゼ酵素に対して二重らせん標的配列の選択域を守るために、ポリマーは選 択された制限酵素配列に特異的である、４〜８塩基一対配列への一プラス非反復 標的配列に対する増加された特異性を生じるのに有効ないかなる付加的基部塩基 への結合に対する配列を含む。ポリマーを二重らせん材料に添加後、材料を選択 された制限又はメチラート酵素で処理する。酵素処理後、処理された二重らせん を加熱によって”脱保護”する。

Ｅ、治療適用 本発明のポリマーは、二重らせん標的配列に結合するその能力によって、病原体 又は選ばれたゲノム配列、たとえば疾病に関係する腫瘍遺伝子を不活性化又は阻 害する効力を有する。復製の起源及びエンハンサ−及びプロモーター配列は、特 に二重らせん一配向結合剤による不活性化に敏感である。というのはその剤が複 製の開始又は攻撃される遺伝子の転写に要求される標的部位を占領するからであ る。この様な遺伝子−コントロール配列は、多くの病原性遺伝子、及びまたヒト で特徴づけられている多種の腫瘍遺伝子に関して知られている。

いくつかの治療適用に関して、特定細胞又は組織へのその引渡を促進するために 又は特定側細胞オルガネラ、たとえば核へのその引渡を促進するために結合ポリ マーを修飾することが望まれる（Ｃｈｅｌｓｋｙ）。これは、たとえば結合ポリ マーを適するシグナル構造、たとえば脱シアル化されたガラクトシル−含有たん 白質（Ｇｒｅｇｏｒｉａｌｓ、　１９７５）又は肝細によるガラクトース部分の クラスター；又はたとえばクツパー（Ｋｕｐｆｆｅｒ）細胞及びマクロファージ による吸収を促進するＤ−マンノ−す又はＬ−フルクトース、又はたとえば血液 ／脳バリヤーを活性に移動するインスリン又は関連するペプチドに結合ポリマー を連結するによって達成することができる。更に結合ポリマーを、界面活性剤ミ セルに脳−特異性抗体の存在下に導入し、血液の脳バリヤーを通る供給を高める 。

上記理由のために、ポリマーは一般に少なくとも１６塩基一対一特異サブユニッ トを含有し、目的とする標的配列以外の配列への望まれない結合の可能性を最小 にする。候補標的構造をゲノム配列の分析から決定することができ、たとえばそ れは種々の配列データベースで利用できる。好ましい標的構造は、（ａ）系統を 越えて十分に保護され、そして（ｂ）ポリマーを形成するのに利用できるサブユ ニットのセットと胸像できる塩基一対配列を有するものである。たとえばサブユ ニットセットはグアニン、ジアミノプリン及びｌ又は２個のスペーサーサブユニ ットを第１項に記載した様に含む場合、標的配列は、少なくとも約７０％Ｃ：Ｇ 及びＴＥＡ配向塩基一対を、及び残りはＧ、Ｃ及び／又はＴ：Ａを含有するのが 好ましい。

例として、系統及び主にグアニン及び２，６−ジアミツブリンー含有サブユニッ トから集められた結合ポリマーに適する標的を越えて両方に十分に保護された配 列に関して、検査は二重らせん前ウィルス段階で、ｔｔｔｖ−ｔゲノムから成る 。表１０はいくつかの、この様に選択された標的配列、それ上の位置づけ、第１ ．Ｅ２項に記載されたタイプの“２つのサブユニットプラススペーサー“から集 められた結ゲノム中の位置　遺伝子　Ｐｏｌｙｍｅｒ／Ｔａｒｇｅｔ　Ｃｏｍｐ ｌｅｘＤＤＤＤＤＵＧＤＵＤＧＧＧＧＧＤＤ　ポリマー２４３１　Ｐｏｌ　５° −ＡＡＡＡＡＴＧＡＴＡＧＧＧＧＧＡＡ　標的ＴＴＴＴＴＡＣＴＡＴＣＣＣＣＣ ＴＴ〜５゛　二重らせんＤＵＤＤＤＧＤＤＤＤＤＤＧＤＣＤＧ　ポリマー２７３ ５　Ｐｏｌ　５°−ＡＴＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧ　ｆｆ的ＴＡＴＴＴＣ ＴＴＴＴＴＴＣＴＧＴＣ−５’　二重らせんＧＧＤＤＤＧＧＵＧＤＤＧＧＧＧＣ ＤＧＵＤＧＵＤＤ　ポリマー−一−−−−−零−−−−−−−零−−零一一零− −４９５６　Ｐａｌ　５’−ＧＧＡＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＧＧＣＡＧＴＡＧＴＡ Ａ　標的ＣＣＴＴＴＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＧＴＣＡＴＣＡＴＴ−５’　二重らせ ん表中に、“−′は高い一特異性塩基一対結合を示し、そして“零“は低い一特 異性塩基一対結合を示す。

次の例は、本発明に従う種々のサブユニット、サブユニットセット及びポリマー の製造合成法を詳述する。例は本発明を説明するが、これによって本発明は限定 されない。

Ａ、サブユニットの塩基上で第一アミノ基の一般的保護処理他に明記しない限り 、化学製品はアルドリッチケミカル社、ミルウォーキー、ライスコンシン州から 購入される。サブユニット、一般にヌクレオシド又はヌクレオシド同族体（ＩＯ ｍｍｏｌ、これは数回ピリジンとの共蒸発によって乾燥されている）をピリジン （５０−１００ｍ１）中に溶解又は懸濁し、クロロトリメチルシラン（基敷く中 でヒドロキシル基につきシラン２−３当量）で処理する。溶液を１時間、又は溶 解が終了するまで（音波処理を難溶性基質で使用する）撹拌する。アルキルクロ ロホルマート、酸クロライド又は無水物、又は他の適する活性化されたカルボン 酸誘導体を加える（基質中でアミノ基につき１．０５−４．０当量）。室温で１ −２４時間撹拌後、反応をＯ″Ｃに冷却し、ピリジン／水のＩ：ｌ混合物（２０ ｍｌ）で徐々に処理する。１０分後、濃縮された水酸化アンモニウム（２０ｍｌ ）を加え、１５分間撹拌を続ける。溶液を減圧下に濃縮し、酢酸エチル（又はエ ーテル又はクロロホルム）中に溶解し、水で振とうする。有機相を除き、生成物 を結晶化する。結晶が生じない場合、溶剤を除き、残留物をシリカ上でクロマト グラフィー分離し、Ｎ−アシル化物を生じる。任用である典型的なりロロホルマ ートは、９−フルオレニルメトキシカルボニルクロライド、２−（ｐ−ニトロフ ェニル）エトキシカルボニルクロライト（Ｈｉｍｍｅｌｓｂａｃｈ）　、及び２ −（フェニルスルホニル）エトキシカルボニルクロライト（Ｂａ！ｇｏｂｉｎ） を含む。典型的な酸クロライドは、ベンジル、イソブチル及びトリクロロアセチ ルを含む。典型的な無水物は、酢酸、イソブチル酸及びトリフルオロ酢酸を含む 。他の酸誘導体はアシルヒドロキシベンシトリアゾリド（酸クロライドと乾燥ヒ ドロキシベンゾトリアゾールからアセトニトリル中で製造）を含む。後者はフェ ニルアセチル基の導入に有利に使用される。その代りに第一アミノ基をＭｃＢｒ ｉｄｅ等による処理によってアミジンとして保護する。

Ｂ、塩基−帯認識部分上で第一ジアミンの異なる保護処理２．６−シアミツプリ ンリポサイド（Ｐｆａｌｔｚ及びＢａｕｅｒ、　Ｉｎｃ、）を、例ＩＡでの一般 的処理によってＮ−２，Ｎ−６ビスー（フェニルアセチル）アミドに変える。Ｎ −６位のアシル基を、ピリジン／エタノール中でＯ″ＣでヌクレオドをＩＮ　Ｌ ｉｎｔ（で処理して選択的に切断する。反応混合物を水性ＨＣＩで中和し、溶剤 を蒸発する。残留物を酢酸エチル／エタノールから再結晶又はシリカゲルクロマ トグラフィーによって精製する。粗生成物又は精製されたヌクレオシドを再び一 般的処理でベンゾイルクロライドを用いてアシル化し、Ｎ−６ベンゾル基を導入 する。この第ニアシル化で、はんの少過剰のアシル化剤（１，０５−１，２当量 ）を使用する。

Ｃ８認識部分てオキソ基の保護処理 ２°、　３’、　５−）クー０−イソブチルＮ２−イソブチリルデオキシグアノ シンをＴｒｉＣｈｔｉｎｇｅｒ等の処理によってｏ６２−（ｐ−ニトロフェニル ）エチル誘導体に変える。

その代りグアノシンをキムテ等の方法によって０６ジフ工ニルカルバモイル誘導 体に変える。アンモニア（１：　１１水酸化アンモニウムＤＭＦ）又はＩＮ　Ｌ ｉＯＨでピリジン／エタノール中Ｏ℃で処理して、Ｎ２−プロピオニル０６−シ フエニルカルバモイルグアノシンを製造する。これらの処理を、Ｎ−２アシル化 され、０−４保護された２−アミノ−４（３８）−グアナゾリノン誘導体及びＮ −７アシル化され、Ｏ−９保護された７−アミノ−９（８Ｈ）−イミダゾ（４， ５−ｆ　）キナゾリノン誘導体の製造に適用できる。

Ｄ、第一アルコールにジメチルオキシトリチル置換基の一般的導入処理アルコー ル耐性基質（ＩＯｍｍｏｌ）をピリジン中に溶解又は懸濁し、４．４゛−ジメト キシトリチルクロライト、トリエチルアミン（２０ｍｍｏｌ）及び４−ジメチル アミノピリジン（０，５ｎｗｎｏｌ）で処理する。室温で数時間後、混合物を水 （５ｍｌ）で処理し、次いで冷たい飽和水性重炭酸ナトリウム溶液中に注ぐ。混 合物を酢酸エチル（又はクロロホルム）で抽出し、−緒にされた有機相を乾燥し く硫酸ナトリウム）蒸発する。

残留物をシリカ上でクロマトグラフィー分離し、純粋なジメトキシトリチル化さ れた化合物を生しる。

゛″２２−サブユニツトプラススペーサーットの製造Ａ　２−デオキシリボース 部分を含有するサブユニット次の５゛−０−ジメトキシトリチル保護された誘導 体はシグマ（セントルイス、ミズリー州、アメリカ）から入手できる：Ｎ−４ベ ンゾイルデオキシシチジン、Ｎ−２イソブチリルデオキシグアノシン、チミジン 。２．６−ジアミツプリンー２゛−デオキシサボシドはシグマから入手でき、例 １に於ける方法で第一アミノ基及び第一ヒドロキシ基が保護される。

８．２−０−メチルリポース部分を含有するサブユニットウラシル、シトシン、 グアニン、アデニン及び７−ジアザアデニンの２−０−メチルリボヌクレオシド が、ロビン等（＋９７４）又はセキネ等の方法によって得られる。

グアノシン及び２−アミノアデノシン２′−〇−メチルエーテルを、ロビン等の 方法によって製造するのが有利である。これらを例１に於ける一般的方法によっ てその塩基が保護された同族体に変える（たとえばグアノシン誘導体に対してＮ −２イソブチリル、Ｎ−アミノアデノシンに対してＮ−２フエニルアセチル、Ｎ −６ベンゾイル、シチジン誘導体に対してＮ−４ベンゾイル）。第一ヒドロキシ を例１に於ける様に保護する。

Ｃ８モルホリノ部分を含有するサブユニット保護された形で塩基を有するリボー ス含有サブユニットを、過ヨウ素酸塩で酸化し、２−３゛　ジアルデヒドとなす 。アルデヒドをアンモニア又は第一アミン及び２゛及び３°ヒドロキシル（親リ ポース中に於ける番号）上で閉環し、シアノボロヒトリトで還元して除去する。

この一般の合成法の例を、塩基−保護されたシトシン（Ｒｉ”）モルホリノサブ ユニットの合成に関連して以下に示す。メタノール１．６Ｌに撹拌しながら、水 １００ｍ１中に溶解されたＮ４−ベンゾイルシチジン０．１モル及び過酸化ヨウ 素ナトリウム０．１０５モルを加える。５分後、ニホウ酸アンモニウム０．１２ モルを加え、混合物を１時間室温で撹拌し、深冷し、濾過する。濾液にナトリウ ムシアノボロヒドリド０．１２モルを加える。１０分後、トルエンスルホン酸０ ．２モルを加える。もう３０分後、トルエンスルホン酸のもう０．２モルを加え 、混合物を深冷し、濾過する。

固形沈殿を減圧下に乾燥し、遊離アミンのトシラート塩を生じる。はどほどに強 い（ｐＫａ＜３）芳香酸、たとえばトルエンスルホン酸又は２−ナフタレンスル ホン酸の使用は、取扱いの容易さ、著しく改良された収率、及び生成物純度の高 いレベルを提供する。

２．６−ジアミツブリンー含有モルホリノサブユニットのトシラートの濾過も十 分に行う。しかしグアニン−含有及びウラシル−含有サブユニットのトシラート 塩は一般にメタノール中にもっと溶解する。かくてＧ及びＵサブユニットに対し てメタノールを減圧で除去し、残留物をブライン及びイソプロパツールに分配し 、−所望の生成物は有機相に移動する。

塩基−保護されたモルホリノサブユニットを、次いでトリチルクロライドを用い てモルホリノ環の境界窒素で保護する。

トリチル段階の例として、アセトニトリル０．２リツトルに、撹拌しながら上記 のトシラート塩０．１モルを、次いでトリエチルアミン０．２６モル及びトリチ ルクロライド０．１５モルを加える。混合物を被覆し、１時間室温で撹拌し、そ の後メタノール１００ｍ１を加え、次いで１５分間撹拌する。溶剤を減圧下に除 去し、次いでメタノール４００ｍ１を加える。固体をスラリーとして十分に懸濁 し、水５リットルを加え、混合物を３０分間撹拌し、濾過する。固体を水１リッ トルで洗滌し、濾過し、減圧下に乾燥する。固体をジクロロメタン１５０ｍ１中 に再懸濁し、濾過し、沈殿が始まるまで回転蒸発し、その後へキサン１リツトル を加え、１５分間撹拌する。固体を濾過によって除去し、減圧下で乾燥する。

上記処理は、モルホリノ窒素がトリチル化された及び遊離５′ヒドロキシル（親 リポース中での番号）を有する、塩基−保護されたモルホリノサブユニットを生 じる。

Ｄ、　Ｎ−カルボキシメチルモルホリノ−５゛−アミノ部分を含有するサブユニ ット保護された形で塩基一対認識部分を有するリボース−含有サブユニットを、 ５゛アミン及びそのトリチル化された５′アミンにスターチャフ、サマートン及 びウエラー（１９８７）に従って、又は以下の例２Ｅに示した方法によって変え る。上記例２Ｃの一般的処理の後に、リポースのビシナル２′及び３°ヒドロキ シルを過ヨウ素酸塩で酸化し、２°−３゛ジアルデヒドとなす。ジアルデヒドを トリエチルアミンの存注下にグリシン上で閉環する。２′及び３゛ヒドロキシル （親リボース中での番号）を次いでシアノボロヒドリドでの還元によって除去す る。

その代りに、ジアルデヒドをアンモニア上で閉環し、例２ｃの様に還元し、次い でＮ、Ｎ−ジエチルアニリンで緩衝されたブロモ酢酸でモルホリノ窒素をアルキ ル化することができる。

これらの処理は、モルホリノ窒素にトリチル化された５′アミン及びカルボキシ メチル基を有する塩基−保護されたモルホリノサブユニットを生じる。

Ｅ、Ｎ−カルボキシメチルモルホリノ−アルファ（５゛−アミノ）部分を含有す るサブユニット 例２Ｃ及び２Ｄは、モルホリノ−含有サブユニットの製造を示し、その際５°− メチレンはベータ配向であり、すなわち親リボースと同一の配向である。５゛メ チレンはベータ配向であり、すなわち親リボースと同一の配向である。５゛メチ レンがアルファ配向である、同族のモルホリノ−含有サブユニットを次の常法に よって製造することができる。

保護された形で塩基一対認識部分を有するリボース−含有サブユニットの５′ヒ ドロキシルは、既成の方法（上記例２Ｄ参照）によって第二アミンに変える。そ の後、上記例２Ｃの一般処理後、リボースのビシナル２′及び３゛ヒドロキシル を過ヨウ素酸塩で酸化し、２’−３’ジアルデヒドを生じる。２′アルデヒドは 速やかに第二アミン上で５゛位（親リボース中の番号）で閉じる。次いでシアノ ボロヒドリドでの還元は、モルホリノ環を有する構造を生じ、その際境界モルホ リノ窒素は第三級であり、アルファ配向で５゛アルデヒドを含有する。過剰のシ アンボロヒドリドの存在下でのアンモニア又は第一アミンの次の添加は５″アミ ン（夫々第−又は第二）をアルファ配向で生しる。

上記一般方法を、Ｎ−カルボキシメチルモルホリノ−アルファ（５−アミノ）部 分を含有するサブユニット、並びに多くの他の有用な変化を製造するのに適用す ることができる。リボース部分の５゛位に所望の第二アミンを導入する１つの方 法は次の通りである。

ａ）スミス、ラマー、ゴールドバーブ及びコラナ（１９６１）の方法に従って２ ゛、３°ヒドロキシルをアセタールに変換；　ｂ）　ＤＭＳＯ／ピリジン／トリ フルオロ酢酸／ジイソプロピルカルボジイミドを用いて５°ヒドロキシルを酸化 し、アルデヒドとなす（Ｍｏｆｆａｔ酸化）：Ｃ）シアノボロヒドリドの存在下 にこの５°アルデヒドとグリシン（又はグリシンのｔ−ブチルエステル）との反 応；そしてアセタールの酸開裂によって２’　、　３’ヒドロキシルの再生。

Ｆ、５゛−カルバザードを有するリボースを含有するサブユニットリボース−含 有サブユニットを、次の様に５゛−力ルバザードに変えることができる。保護さ れた状態で塩基一対認識部分の環外アミンを存する、リボース−含有サブユニッ ト１０ｍＭｏ１ｅにアニシルアルデヒド１００ｍ１及びトシル酸（ｔｏｓｉｃ　 ａｃｉｄ）０．５ｇを加える。室温４８時間撹拌する。反応混合物をヘキサン５ ００ｍ１に加え、沈殿を集める。生成物をエーテルで展開されたシリカゲルクロ マトグラフィーによって精製する。生じる精製物をビス（ｐ−ニトロフェニル） カルボナート２当量プラストリエチルアミン２当量とアセトニトリル中で８時間 ３０″Ｃで反応させる。精製物を５％ないし１５％アセトン／クロロホルム混合 物で展開されたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。生成物をｔ− ブチルカルバザード４当量とＤＭＦ中で４時間５０°Ｃて反応させる。反応混合 物を水に加え、沈殿を集め、ＤＭＦ／濃ＮＨ４ＯＨ、ｌ　：　ｌ容量中で一晩３ ０’Ｃて懸濁する。アンモニア溶液をブラインに加え、不溶性生成物を集め、減 圧で乾燥する。乾燥生成物をトリフルオロ酢酸中に溶解し、５分後エーテルを加 え、生成物を沈殿させ、これを２回エーテルで粉砕する。

生成物を残存するトリフルオロ酢酸すべてを中和するのに十分なＮ−エチルモル ポリンを含有するメタノール中に溶解し、生成物を再びエーテルの添加によって 沈殿させ、生成物を減圧で乾燥する。所望された５°カルバザード生成物を一般 にＮ−エチルモルホリン／メタノール／クロロポルム、Ｉ：４：６容量で、展開 されたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製する、又は適する水性／有機 混合物から再結晶して精製することができる。

０．５′−スルホニルヒドラジンを存するリボースを含有するサブユニットリボ ース−含有サブユニットを、次の様に５−スルホニルヒドラジドに変えることが できる。保護された状態で塩基一対認識部分の環外アミンを有する、リボース− 含有サブユニットＩＯｍ　ｍｏｌｅを、上記例２Ｆ中に示した様にアニシルアセ タール誘導体に変える。

ドライアイス上で深冷されたジクロロメタン中のスルホニルクロライド１０ｍ１ Ｊｏｌに、Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン１５ｗｄＪｏｌｅを加える。次いで迅速に 撹拌しながら、徐々にジクロロメタン中にＮ−アミノフタルイミドＩＯｍＭｏｌ ｅを存する希釈溶液を加える。

２０分後、アニシルアセタールサブユニット誘導体をこのクロロスルホニルヒド ラジド溶液に加える。急速に撹拌しながら、ジクロロメタン３０ｍ　ｌ中のジイ ソプロピルエチルアミン３０ｍＭｏｌｅを加える。１時間室温で撹拌後、溶剤を 減圧下に除去し、アセトン／クロロホルム混合物で展開されたシリカゲルクロマ トグラフィーによって生成物を精製する。

次いで生成物をメタノール中でヒドラジンアセタートで処理し、溶剤を減圧下に 除き、次いてＤＭＦ／濃ＮＨ，ＯＨ、Ｉ・１容量で、を加え、調製物を一晩３０ °Ｃでインキュベートする。最後に、生成物をトリフルオロ酢酸で処理し、例２ Ｆの様に後処理する。

Ｈ５−グリシンアミドを存するリボースを含有するサブユニット第一アミンを、 例２Ｅに示した酸化／還元アルキル化法に従って、但しグリシンの代りにアンモ ニアを使用して、リボース−含有サブユニットの５゛位に導入する。次いてこの ５゛第一アミンをＮ−ｔ、ブトキシカルボニルグリシン、ｐ−ニトロフェニルエ ステルでアシル化する。精製後、保護基をＤＭＦ／ｌｌＮＨ４ＯＨ、次いてトリ フルオロ酢酸を用いる処理で除去し、最終の５°−グリシンアミド誘導体を例２ Ｆの様に後処理する。

！、５°酸素に連結されたアミノメチルエチルホスファート基を有するリボース を含有するサブユニット アミノエチルホスホン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏ、）とトリチルク ロライドとをトリエチルアミンの存在下に反応させる。対イオンがトリエチルア ンモニウムであるジ−アニオン性ホスホナート精製物をエタノール中で懸濁し、 次いでカルボジイミド、たとえばジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）　 、を加える。生じるモノ−アニオン性生成物を水及びピリジニウムハイドロクロ ライドを有するクロロホルムの混合物と共に振とうする。この処理は、ピリジニ ウム対イオンを有するモノ−イオン性ホスホン酸を生じる。この生成物をクロロ ホルムに加え、リボース−含有サブユニットを添加する。その際塩基の環外アミ ンは保護された形であり、２′及び３′ヒドロキシルはアニシルアセタールとし て保護される。ＤＣＣを加え、ホスホナートをサブユニットの５゛酸素と結合す る。生成物を乾燥し、メタノール／クロロホルム混合物を用いてシリカゲル上で クロマトグラフィー分離する。次いて純粋生成物を、ＤＭＦ／濃ＮＨ，ＯＨ、１ ：　ｌ容量で、で塩基−脱保護し、トリフルオロ酢酸中に懸濁し、トリチル及び アニジル保護基を除く。

Ａ、２−デオキシリボース部分を含有するサブユニット１、Ｎ−グリコジルイソ インドールの製造４−アセチルアミノ−２−メチル安息香酸（Ｐｅｔｔｉｅｒ） を、冷発煙硝酸での処理によって５−二トロ化合物に変える。反応混合物をがき 氷上に注ぎ、固形生成物を濾過て集め、ＤＭＦ／水から再結晶して又はシリカク ロマトグラフィーによって精製する。

アセトアミドを９０％エタノール中で１−１０％ＮａＯＨ溶液でアルカリ性加水 分解して除く。反応混合物を過剰希ＨＣＩに加え、溶剤を蒸発する。粗酸を飽和 メタノール性ＨＣＩで室温て数日間エステル化する。溶剤の除去後、生成物を酢 酸エチルと飽和重炭酸ナトリウムに分配する。水洗後、有機相を蒸発し、残留物 をシリカクロマトグラフィーによって精製する。ニトロ基を水素及びパラジウム を用いて炭素上でエタノール又はＤＭＦ中で還元してアミノとなす。セライトに よる濾過及び蒸発の後、粗ジアミンをシアノゲンブロマイドを用いてメタノール 中で還流して、メチル２−アミノ−６−メチルベンズイミダゾール−５−カルボ キシラードに変える。

混合物を冷却し、飽和水性重炭酸ナトリウム中に注ぎ、固形精製物を濾過し、再 結晶して精製する。環外アミノ基をピリジン中でフタロイルジクロライドと共に 還流してアシル化し、ジアゼピンとピラゾールとをＫａｔｒｉｔｚｋｙの方法に 従ってアセトニトリルを還流して反応させる。化合物をブロミン又はＮ−プロモ サクシンイミド又は１．３−ジブロモ−５，５−ジメチルヒダントインのとれが と四塩化炭素又はクロロホルム又は１．１．１−　トリクロロエタンのそば又は その中で高い−強さサンランプ及び／又はベンゾイルパーオキサイドを用いて反 応させ、ベンシルブロマイドとなす。更にジアゼピンをイソブチルクロライドで ピリジン中でアシル化し、トリプルアシル化されたベンズイミダゾール化合物を 生じる。これは通常ブロム化の前に行われる。

粗ベンジル型ブロマイドとナトリウムアシドとを乾燥ＤＭＦ中で反応させ、白金 又はパラジウムを介して水素で還元し、ラクタムを生じる。これはトリメチルシ リルトリフルオロメタンスルホナート又はｔ−ブチルジメチルシリルトリフルオ ロメタンスルホナート１当量で０−シリル化し、０−シリルラフチムニ−チル／ ベンズイミダシールドリフルオロメタンスルホナート塩を生じる。これを３．５ −ジー０−トルイル−アルファー〇−エリスロペントファノシルクロライド（Ｈ ｏｆｆｅｒ）とＴＨＦ又はアセトニトリル中でｐ−二トロフェノールの存在下に アオヤマの方法によって反応させ、保護されたヌクレオシドを生じ、シリカクロ マトグラフィーによって精製する。アシル基を２つの行程処理によってすべて除 去し、それは先ずヒドラジン／エタノールを用いて室温でヒドラジン分解、次い で溶剤の蒸発、そして粗残留物を還流エタノール中で加熱し、十分にフタロイル 残留物を分解することから成る。アミノベンズイミダゾールを、４−（ジメトキ シメチル）−モルホリン（Ｂｒｅｄｅｒｅｃｋ等の一般の処理によって４−ホル ミルモルホリンから製造）とメタノール中で反応させ、アミジンを形成する。ベ ンズイミダゾールの残存反応部位を、例１の条件下にピバロイルクロライドとの 反応によって保護する。その代りに最終アシル化を（ジメチルアミノ）ベンゾイ ルクロライドを用いて行ってもよい。

別のアミノ保護基を、非保護ベンズイミダゾールと４−（ジメチルアミノ）ベン ズアルデヒドとをメタノール中でピペリジン（１０モル％）及びメタンスルホン 酸（５モル％）の存在下に反応させて生じる。生じるアミンをアミジンに対する 様にアシル化する。第一ヒドロキシル基を例１に従ってジメトキシメチル基で保 護する。

２２−グリコジルベンオキサゾールの製造３−アセトアミドフェノール（Ａｌｄ ｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）をニトロ化し、２−ニトロ−５−アセト アミドフェノールを生じる。水素及びパラジウム／炭素での還元及び無水トリフ ルオロ酢酸又は無水トリクロロ酢酸との反応は２−トリフ１０アセトアミド誘導 体を生じる。これをニトロ化し、４−ニトロ化合物となし、トリフ１０アセチル 基を簡単なアンモノリシスによって除去し、５−アセトアミド−２−アミノ−４ −ニトロフェノールを生しる。

２．５−アンヒドロ−３，４，６−トリー０−ベンゾイル−Ｄ−アロノチオアミ ド（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ）をヨウ化メチル及びナトリウムヒドリドで処理し、対 応するメチルトリフラ−トを生じる。更にチオアミドをジーｔ−プチルジカルボ ナート（Ａｌｄｒｉｃｈ）及び４−ジメチルアミノピリジンとジクロロメタン中 で反応させイミドを生じる。更にイミドをヨウ化メチル又はメチルトリフラート を用いてジイソプロピルエチルアミンの存在下に処理して、Ｎ−ｔ−ブトキシ力 ルポニルメチルチオイミダートを生じる。これらのいずれかは、芳香性１．２− ジアミン又はオルトアミノフェノールとの反応に適し、夫々デオキシリボースの ベンズイミダゾール又はベンズオキサゾール誘導体を生じる。

アミノフェノールと前記の適当に活性化されたチオアミドとを反応させ、２−（ トリーローベンゾイル−ベーターデオキシリボシル）ベンズオキサゾールを生じ る。Ｎ−アセチル及び０−ベンゾイル基をアンモノリシス又はヒドラジン分解に よって除去し、ニトロ基を水素及びパラジウム／炭素で還元する。芳香族ジアミ ンをブロモシアンと還流メタノール中で反応させ、生成物６−アミノ−２−（ト リーローベンゾイル−ベーターデオキシリボシル）イミダゾ（４，５−ｆ　）ベ ンズオキサゾール誘導体を例３Ａ１の様に保護し、次いで例１に従って第一ヒド ロキシを保護する。

Ｂ、リポース部分を含有するサブユニット１、Ｎ−グリコジルイソインドール リポースヌクレオシドを例３Ａ１に於てデオキシリボヌクレオシドに対する様に 製造するが、０−シリル化ラクタムを臭化水銀又はトリフルオロメタンスルホン 酸銀の存在下に、マエバラ等の処理に従ってベンゼン中１−０−アセチル−２， ３，５−トリー０−ベンゾイル−Ｄ−リボフラノースをＨＢｒで処理して製造さ れたリボシルブロマイドと反応させる。

２．２−グリコジルベンズオキサゾール２．５−アンヒドロ−３−デオキシ−４ ，６−ジー０−トルオイル−〇−リボーヘキサノチオアミド（Ｐｉｃｋｅｒｉｎ ｇ）をそのメチルトリフラ−ト、そのイミド又はそのＮ−ｔ−ブトキシ力ルポニ ルメチルチオイミダートに例３Ａ２の様に変える。これらのいずれかは、芳香族 １．２−ジアミン又はオルトアミノフェノールとの反応に適し、夫々リボシドの ベンズイミダゾール又はベンズオキサゾール誘導体を生じる。

例３Ａ２と同一の処理によって、アミノフェノールを前記活性化されたチオアミ ドと反応させて、ベンゾオキサゾールを生し、これは更に例３Ａ２の処理によっ て保護されたヌクレオシドに変えられる。

Ｃ０モルホリノ部分を含有するサブユニットモルホリンヌクレオシドを、例３Ａ １から００−シリル化ラクタムとテトラアセチルアルファー叶グルコピラノシル ブロマイド（シグマ）（臭化水銀又はトリフルオロメタンスルホン酸銀の存在又 は不在）と反応させて製造する。グリコシドを常法でモルホリノヌクレオシドに 変えるが、過ヨウ素酸ナトリウムの常置の２倍を使用する。Ｎ−トリチル化（例 ２Ｃ）及び塩基保護基のヒドラジン分解後、塩基を例３Ａ＋の襟に再保護する。

その代りに、モルホリノヌクレオシドを、例３Ａ１からのベンジル型ブロマイド とベーターローグルコピラノシルアミン（タムラ）とを反応させ、グリコジルラ クタムを直接生しることによって製造する。これを常法でモルホリノヌクレオシ ドに変えるが、過ヨウ素酸ナトリウムの２倍量を酸化工程で使用しなければなら ない。Ｎ−）リチル化（例２Ｃ）及び塩基のヒドラジン分解の後に、再保護を例 ３Ａｌの様に行う。

更に、例３Ａ＋からのメチル４−アセトイミド−２−メチル−５−二トロペンゾ アートを、例３Ａ＋に於ける様に臭素化し、ベーターローグルコピラノシルアミ ンと反応させる。Ｎ−アセチルを１−１０％ＮａＯＨで９０％エタノール中で除 き、ニトロをパラジウム／炭素及び水素で還元し、アミノベンズイミダゾールを 、ブロモシアンと還流エタノール中で反応させて形成する。アミノベンズイミダ ゾールを例３Ａ＋の様に保護する。

別に、例３Ｂｌで製造されたリポースを例２Ｃに於ける処理に従ってモルホリノ −含有サブユニットに変える。この処理を、アミノベンズイミダゾールからフタ ロイル基の脱アシル化前に行う。モルホリノ形成及びＮ−）リチル化合物として の保護の後、フタロイル基を例３ＡＩの様に除去する。

モルホリノ窒素を遊離アミン又はトリラート塩とトリチルクロライドとをトリエ チルアミン含有アセトニトリル中で反応させて、Ｎ−トリチルとして製造する。

反応混合物を水に注ぎ、固形生成物を濾過によって単離する。

２．２−グリコジルベンズオキサシールアーＤ−ガラクトピラノシルブロマイド を２．３．４．６−テトラ−０−アセチル−アルファー〇−がラクトピラノシル シアニドに変え、次いで対応するチオアミドにピッカリング等の方法によって変 え、次いで例３Ａ２の様にその活性化されたチオアミド誘導体に変える。これら は１．２−ジアミン又はオルトアミノフェノールとの反応に適し、夫々ガラクト シドのベンズイミダゾール又はベンズオキサゾール誘導体を生じる。同様な方法 を使用し、他のヘキサツースニトリルを用いて始める（マイヤー）。

例３Ｂ２と同一処理によって、アミノフェノールを前記の活性化チオアミドと反 応させてベンズオキサゾールを生じ、これは更に例３Ｂの処理によってＮ−保護 されたガラクトシドに更に変わる。これを常法でモルホリノヌクレオシドに変え るが、過ヨウ素酸塩の常置の２倍を酸化工程に使用しなければならない。Ｎ−） リメチル基を、例３Ｃ１の方法によって導入する。

例４ モルホリノ主体部分を含有する４−員成高い一特異性サブユニットセットの製造 Ａ、ＣＧ−特異サブユニット グアノシンを例１の方法によってその２−フェニルアセチル誘導体に変える。こ れを例２Ｃの方法でモルホリンヌクレオシドトシラート塩に変える。これをトリ フェニルメチルクロライドと、トリエチルアミンを含有するアセトニトリル中で 反応させてトリチル遇する。反応混合物を水中に注ぎ、生成物を濾過する。アセ トニトリルから再結晶して精製する。

Ｂ、ＴＡ−特異サブユニット ２．６−シアミツブリンリボシドを、例１の方法によってそのＮ２−フェニルア セチルＮ６−ベンゾイル誘導体に変える。これを例２Ｃの方法によってモルホリ ノヌクレオシドに変える。これを例５Ａの方法でトリチル化する。

Ｃ，ＡＴ−特異認識部分 １．２−グリコジルベンズオキサゾール５−ヒドロキシ−２（３Ｈ）−ベンズオ キサシロン（Ｏｚｄｏｗｓｋａ）を無水酢酸でアセチル化し、次いで冷発煙硝酸 でニトロ化し、６−ニトロ−５−アセトキシ化合物となす。これをエタノール中 に溶解し、炭酸カリウムで処理し、次いでパラジウムを介して水素化し、ニトロ 基をアミノ基に還元する。単離された了ミノフェノールを例３Ｃからの活性チオ アミド誘導体と反応させ、６−（２，３，４，６−テトラ−０−アセチル−ガラ クトシル）−才キサシ−（４，５，−ｆ）−２（３Ｈ）−ベンズオキサシロンと なす。ホスホリルクロライドとの反応、次いでアンモノリシスは、２−アミノベ ンズオキサゾールを生じる。これを常法でＮ−保護し、ベンゾイル、イソブチリ ル、アセチル、メトキシアセチル、フェノキシアセチル又はトリクロロアセチル アミドを製造する。

モルホリンヌクレオシドを、例２Ｃの処理で上記ガラクトシル化合物から製造す るが、還元アミノ化に必要なジアルデヒドを形成するために酸化工程で過ヨウ素 酸ナトリウムの常置の２倍を用いる。後者の工程を常法で行う。モルホリンを例 ５への様にトリチル化し、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。

２．２−グリコジルイソインドール ２−メチル−４−ヒドロキシ安息香酸（Ｋｉｎｇ）を冷発煙硝酸でニトロ化し、 ５−ニトロ誘導体を生じ、これをパラジウム触媒を用いて水素雰囲気中で還元し て、５−アミノ化合物となす。これを例３Ａ１の方法でメチルエステルに変える 。これをプロモソアンで２−アミノベンズオキサゾールに変え、環外アミノ基を 例１の方法てアセチル、メトキシアセチル、トリクロロアセチル、イソブチル又 はベンゾイルでアシル化する。化合物を例３Ａ＋の方法でベンジル型ブロマイド に変える。

モルホリンヌクレオシドを、先ずベンジル型ブロマイドとベーター〇−グルコピ ラノシルアミンとを例３Ｃの様に反応させて製造する。次いで過ヨウ素酸ナトリ ウムの常置の２倍を用いるメタノール性過ヨウ素酸塩分解及び還元アミノ過はモ ルホリノヌクレオシドを生じる。これを例５Ａの方法でトリチル化し、シリカゲ ルクロマトグラフィーで精製する。

その代りに、ベンジル型ブロマイドをアンモニアと反応させ、ラクタムを生し、 これはトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホナート又はｔ−ブチルジメチ ルシリルトリフルオロメタンスルホナート及び２，６−ジーｔ、ブチルピリジン で０−シリル化する。０−シリル化されたラクタムをテトラアセチルアルファー ローグルコピラノシルブロマイドと（トリフルオロメタンスルホン酸銀又は臭化 水銀の存在又は不在）反応させ、次いで例５Ｃ１の様にアンモノリシス及び第一 アミノ基を再保護を行う。グリコシドを常法でモルホリンヌクレオシドに変える が、過ヨウ素酸ナトリウムの常置の２倍を使用する。モルホリンを例５Ａの様に トリチル化し、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。

Ｄ、ＧＣ−特異サブユニット ５−クロロ−２，４−ジニトロフェノール（Ｃａｒｎｅｌｌｅｙ）をクロロメチ ルベンジルエーテル及びジイソプロピルエチルアミンで処理し、エーテルをメチ ルシアノアセタート（又はマロノニトリル）のナトリウム塩で処理し、酢酸中で 鉄により還元する。アセタールの分解（炭素上の水素／パラジウム）及び例３Ｃ からの活性化されたチオイミド誘導体との反応は、ピロロベンズオキサゾールを 生じ、これはアンモノリシス後例１の方法によって保護された塩基であり、ベン ゾイル、イソブチル、アセチル、メトキシアセチル、フェノキシアセチル又はチ オクロロアセチルアミドを製造する。

モルホリンヌクレオシドを、還元アミノ化に必要なジアルデヒドを形成するため に過ヨウ素酸ナトリウムの常置の２倍とガラクトシドを反応させて製造する。

後者の工程を常法で行う。分子を例５Ａの方法でトリチル化し、シリカゲルクロ マトグラフィーによって精製する。

２．２−グリコシルイ゛ツインドール ４−クロロ−２−メチル安息香酸（ＰｆａＬｔｚ及びＢａｎｅｒ　Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ　Ｃｏ、）を、そのメチルエステル（ＨＣＩ／メタノール）に変え、更に例 ３Ｃの方法でベンジル型ブロマイドに変える。アンモニア２当量との反応は、ラ クタムを生じ、発煙硝酸中でニトロ化し、４−ニトロ−５−クロロ−２−オキツ インドールを生じる。

上記ラクタムを例５Ｃの様に０−シリル化する。ラフチムニ−チルとテトラアセ チルアルファーローグルコピラノシルブロマイドとを（トリフルオロメタンスル ホン酸銀又は臭化水銀の存在又は不在）反応させる。これをメチルシアノアセタ ート（又はマロノニトリル）のナトリウム塩と反応させ、次いで酢酸中で鉄で還 元する。アシル基をアンモノリシスですべて除去し、塩基を常法でベンゾイル、 イソブチリル、アセチル、メトキシアセチル、フェノキシアセチル又はトリクロ ロアセチルアミドとして再保護する。

その代りに、４−クロロ−２−メチル安息香酸を濃硫酸中で発煙硝酸を用いてニ トロ化し、５−ニトロ誘導体となす。例３Ａの方法でエステル化後、これをメチ ルシアノアセタート（庶子はマロノニトリル）のナトリウム塩と反応させ、酢酸 中で鉄で還元する。アミンを無水トリクロロ酢酸、無水メトキシ酢酸、無水酢酸 、イソブチリルクロライド又はペンゾイルツロライドと反応させて保護する。こ れを例３Ｃの方法によってベンジル型ブロマイドに変える。ベンジル型ブロマイ ドをベーターＤ−グルコピラノシルアミンで処理してラクタムグルコシドに変え る。

上記グルコシドを、過ヨウ素酸ナトリウムの常置の２倍を用いてメタノール性過 ヨウ素酸塩と反応させ、還元アミノ化し、モルホノヌクレオシドとなす。これを 例５Ａの方法でトリチル化し、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する 。

Ｅ、ピリミドピリジンの合成 ５−ホルミル−２−デオキシウリジン（Ｂａｒｗｏｌｆｆ及びＬａｎｇｅｎ）を メタノール中に溶リフラードとジクロロメタン中でジイソプロピルエチルアミン の存在下に反応させ、アルコールを保護する。ヘテロ環をＢｉｓｃｈｏｆｂｅｒ ｇｅｒの方法によって（ＮａＨ，トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロライ ド、ＴＨＦ）活性化する。４−０−スルホン化されたヘテロ環を、ベンズヒドリ ルアラニンのトシラート塩（Ａｂｏｄｅｒｉｎ）でシイソプロピルエチルアミン の存在下にＤＭＦ中で処理し、シトシン誘導体となす。シトシニルアラニン誘導 体をＰｏ１ｓｅｌ及びＳｃｈｍｉｄｔの常法で（Ｔ）ＩＰ中ｔ−ブチルノ１イボ クロリド、次いてＴ）ＩＰ中でカリウムｔ−ブトキシド）酸化して、デヒドロア ミノ酸となす。生成物を触媒量のカリウムｔ−ブトキシドで熱Ｔ）ｔＰ中で処理 して、ピリミドピリジンとなす。ベンズヒドリルエステルを、パラジウム／炭素 を介して水素を用いて水素化分解によって除く。酸をジフェニルホスホリルアシ ドでシオイリ等によるトリエチルアミンを含有するベンジルアルコール（又はベ ンジルアルコ−ルンを分解し、シリル基を除いた後、分子を常法でトリクロロア セトアミド又（よフェニルアセトアミドとしてＮ−保護する。

同様な方法で、Ｂａｒｗｏｌｆｆ及びＬａｎｇｅｎの処理で５−メチルウリジン から製造される５−ホルミルウニジンを対応するピリミドピリジンリボシドに変 える。リボシドを常法でモルホリノヌクレオシドに変え、Ｎ−）リチル誘導体と して保護する。

リポース、ガラクトース又はグルコース部分を含有するサブユニットを例４の様 に製造し、その夫々の糖部分を、例２Ｄに記載した方法によってＮ−カルボキシ メチルモルホリノ−５°−トリチラート化アミンに変える。

矛された２゛−デオキシリボシド−含有サブユニット及び保護された２−０−メ チルリボシド−含有サブユニットを、対応する３°−Ｈ−ホスファート塩に、サ カタウエ、ヤマネ、タカク、ヤマモト、核酸Ｒｅｓ．　１９９０．　１８．　３ ３２７に示された方法で変え、この文献の方法で固形担体上で重合する。ポリマ ー鎖の集合が完了した時、担持された分子を第−又は第二アミンでヨード又は四 塩化炭素のとちらかの存在下にＦｒｏｅｈｌｅｒテトラヘドロンしｅｔｔ．　１ ９８６．　２７．　５５７５の方法に従って処理する。

ホスホルアミダート一連結ポリマーを担体から除き、アンモノリシス（第二文献 参照）を含む常法で脱保護する。

Ａ．モルホリノサブユニットの５゛−ヒドロキシルの活性ジメチルアミノジクロ ロホスファートを次の様に製造する一オキシ塩化リン０、２モル中にジメチルア ミンヒドロクロライド０．１モルを含有する懸濁液を、１２時間還流して、次い て蒸留する沸点は（０．　５ＨｗｎＨｇで３６°Ｃ）。

例２Ｃの様に製造されたモルホリノ−含有サブユニットの５′−ヒドロキシルの 活性化は、モルホリノ窒素上で塩基−保護されかつトリチル化された５′ヒドロ キシルセブユニット１モルをジクロロメタン２０ｍ１中に溶解して行う。この溶 液に、Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン４ｍｍｏｌ及び４−メトキシピリジン−Ｎ−オ キシト１ｍｍｏｌを加える。溶解後、ジメチルアミンジクロロホスフェ−）　２ ｍｍｏｌを加える。２時間後、生成物を１０％アセトン／９０％クロロホルムで 展開されたシリカゲル上でクロマトグラフィー分離して単離する。ジメチルアミ ンジクロロホスフアートの代りにエチルジクロロチオホスファートを使用する他 は同一処理は、同一利用を有する活性化サブユニットを生じる。

Ｂ１モルホリノ−含有サブユニットの５゛−アミンの活性化例１２Ｃの様に製造 された、保護された形で塩基一対確認された、保護された形で塩基一対認識部分 の環外アミノ基を有する、モルホリノ−含有サブユニットの５゛ヒドロキシルを 次の様にアミンに代える。ＤＭ３０５００ｍ１に、ピリジン（ｌｌＹｒ）１．０ モル及びモルホリノサブユニット０．１モルを加える。混合物を溶解するまで撹 拌し、次いでジイソプロピルカルボジイミド（ＤＥＣ）又はジシクロへキシルカ ルボジイミド（ＤＣＣ）０．５モルを加える。２時間後、反応混合物を急速にか つはんされたブライン８リツトルに加え、これを３０分間撹拌し、濾過する。固 体を簡単に乾燥し、氷冷ヘキサン１リツトル中でナトリウムシアノボロッドリド ０．２モルに加え、１０分間撹拌し、ベンゾトリアゾール又はｐ−ニトロフェノ ール０．４モルを加え、メチルアミン（Ｈ２Ｃ中で４％）０．２モル及び調製物 を４時間室温で撹拌する〔注：ベンゾトリアゾール又はｐ−ニトロフェノールは 反応混合物を緩衝し、還元アルキル化のイミニウム工程でコブユニットの４°炭 素でラセミ化を妨げる〕。最後に、反応混合物を水５リットル中に注ぎ、良好な 沈殿を形成するまで撹拌し、固体を集め乾燥する。次いでこの乾燥生成物をＤＭ Ｆ中に懸濁し、ＳＯ８／ピリジン４当量を加える。

数時間かけて、トリエチルアミン８当量を撹拌しながら滴加する。更に２時間後 、調製物をブライン大容量中に投入し、固体を濾過によって集め、乾燥する。次 いてこのスルファミン酸調製物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製す る。

認識部分及びモルホリノ環の窒素が保護された硫酸化サブユニットのトリエチル アミン塩１０ｍｍｏｌをジクロロメタンｌ０ｍ１中に溶解し、次いでピリジン４ ０ｍｍｏｌを加える。この溶液を１５分間、ドライアイス床上で深冷し、ホスゲ ン（トルエン中で２０％）　１．１ｍｍｏｌを、溶液を急速に撹拌しながら徐々 に加える。添加後、溶液を室温にし、次いて水性ＮａＨＣＯｓで洗滌し、乾燥し 、クロロホルムとアセトンの混合物で溶離されたシリカゲル上でクロマトグラフ ィー分離し、乾燥されたスルファモイルクロライドを生じる。

Ｃ９境界モノホリノ窒素の活性化 この例で、その５゛酸素が保護された及びそのモルホリノ環窒素が硫酸化された モルホリノサブユニットの製造を示す。例２Ｃの様に製造され、しかし最後のト リチル化工程は行われない。モルホリノ−含有サブユニットをその５°ヒドロキ シでｔ−ブチルジメチルシリルクロライドによってシリル化する。次いでこの生 成物をメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中でＳＯ３／ピリジン錯体（過剰ピリジン ）を用いて処理し、境界モルホリノ窒素上でスルファミン酸を生じる。

シリカを先ず２％トリエチルアミンでクロロホルム中で前−溶離した場合、スル ファミン酸の塩をトリエチルアミン／メタノール／クロロホルム混合物を用いて シリカゲル上でクロマトグラフィー分離することを述べねばならない。

モルホリノ窒素上のこのスルファミン酸をスルファモイルクロライドに変え、上 記例７Ｂの様に精製する。

Ｂ１モルホリノのＮ−カルボキシメチルの活性化カルボキシラード−含有サブユ ニット、たとえば例２Ｄ及び２Ｅで製造されたものを、次の様に活性化する。サ ブユニット１Ｏｎｖｎｏｌをｐ−ニトロフェノール２０ｍｍｏｌ及びジクロロへ キシルカルボジイミド１５ｍｍｏｌを含有するＤＭＦ中に溶解する。１時間後、 生成物を回転蒸発させ、次いでアセトンとクロロホルムの混合物で展開されたシ リカゲルクロマトグラフィーによって精製する。

この例で、例７Ａ及び７Ｂの様に製造された、活性化サブユニットの集合に一般 に適用し、ホスホロジアミダート一連結された、エチルチオホスホルアミダート 一連結された、及びスルファマート一連結された結合ポリマーを生じる方法を示 す。カップリング工程がトリフルオロメタンスルホン酸銀の添加、及びジイソプ ロピルエタノールアミンの代りにＮ、Ｎ−ジイソプロピル−２−メトキシエチル アミンの使用を含む同様な方法は、例７Ｃの様に製造されたサブユニットの集合 に適し、スルファマート一連結ポリマーを生じる。カップリング工程をジクロロ メタンの代りにジメチルホルムアミド中で実施する同様な方法は、例７Ｄの様に 活性化されたサブユニットの集合に適し、アミド一連結ポリマーを生じる。

Ａ、リンカ− アミノメチルポリスチレン樹脂（カタログＮｏ、Ａ１１６０、シグマケミカル社 ）、交叉連結された１％ジビニルベンゼン、２００ないし４００メツシユ、ｇあ たりＮ１．１ｍｍｏｌをジクロロメタン中に懸濁し、底部にフリットを有する直 径１ｃｍカラムに移し、２．５ｍｌ樹脂床容量を生じる。

ビス〔２−（サクシンイミドオキシ力ルポニルオキシ）−エチル〕スルホン１モ ル（ピアースケミカル社、ロックホード、イリノイ州、アメリカ）を、Ｎ−トリ チル化ピペラジン１ｍｍｏｌ含有ジクロロメタン溶液に加える。２時間後、反応 混合物を、アセトン／クロロホルム混合物で展開されたシリカゲル上でクロマト グラフィー分離し、モノ−活性化されたヘーター除去−切断リンカーを生じる。

上記リンカ−１３４マイクロモルを、ジクロロメタン１ｍｌ中に溶解し、合成カ ラム及び３時間３０″Ｃて撹拌された樹脂懸濁液に加える。次いでジイソプロピ ルアミノエタノールＩｍｍｏｌ及び無水酢酸を加え、撹拌を１０分間続け、ベン ジルメチルアミン２ｍｍｏｌを添加し、２０分間撹拌する。カラムをジクロロメ タン３０ｍ　ｌで洗滌する。

トリチルの離脱の基づき、上記処理は一般に結合されたリンカ−はぼ１００ない し１１０マイクロモルのを生じる。

Ｂ、カップリングサイクル（脱トリエチル化／カップリング／キャビング）下記 のカップリングサイクルを、使用して、所望のサブユニット配列を有するポリマ ーを生じるのに適する順序で夫々のサブユニットを添加する。

ノ酢酸１ｇを含有する溶液を加える。この溶液を通したあと、カラムをジクロロ メタン４０ｍ１で、次いてジイソプロピルアミノエタノール４ｍｍ０＋を含有す るジクロロメタン２０ｍ１て洗滌する。カラムをジクロロメタン１０ｍ１で洗滌 する。

存するジクロロメタン１ｍｌを活性化されたサブユニット０．２５ｎｖｎｏｌに 加え、カラムに加え、３７°Ｃて１時間撹拌する。ジクロロメタン３０ｍ１でカ ラムを洗滌する。注。

過剰の未反応の活性化されたサブユニットをヘキサン４容量のこの溶離液への添 加及び濾過によって簡単に好都合に回収することができる。

１ｉｉ）　キャビング、ジイソプロピルアミノエタノール１ｍｍｏｌ及び無水酢 酸１ｎｗｎｏｌを含有するジクロロメタン２ｍｌをカラムに加え、３７°Ｃで１ ０分間撹拌する。カラムにベンジルメチルアミン１ｎｖｎｏｌを含有するジクロ ロメタン１０ｍ１を加え、樹脂床を３７℃で２０分間撹拌する。ジクロロメタン ３０ｍ１でカラムを洗滌する。

Ｃ６担体からの切断及び脱保護 すべてのサブユニットを上記カップリング処理によって添加した後、全長ポリマ ーを担体からジエチルマロナート２．５ｍｌ　、　１．８−ジアザビシクロ（５ ，４，０）ウンデ−７一エン５ｍｌ、及びジクロロメタン４３ｍ１から成る溶液 でカラムを溶出して切断する。次いてポリマーをこの溶離液からエーテルの添加 によって沈殿する。

水性溶解度を増大する、又は標的結合親和性を増大する、又は特異細胞又は組織 タイプによる吸収を促進する部分を加えるのが望まれる場合、ポリスチレン担体 からの切断上に発生する第二脂肪族アミンは、ポリマー製造のこの工程で上記部 分の結合のための良好な部位を提供する。

次いでポリマー生成物をＤＭＦ中に溶解し、濃ＮＨ，ＯＨの等容量を加え、調製 物を密閉し、１８時間３７°Ｃでインキュベートする。次いで調製物を減圧下に 乾燥し、ポリマー調製物を生じ、その際塩基一対認識部分を脱保護し、ポリマー の１つの末端でトリチル部分を、そしてもう１つの末端で第二脂肪族アミンであ り、これは上述の様にアンモニア処理の前に誘導化する。

末端トリチル部分を有する全長ポリマー（一般に２４−サブユニットの長さのポ リマーに対する調製物の全量の５０％より大きい）を、キャップされた失敗配列 から低圧クロマトグラフィーによってアセトニトリル／水勾配て展開されたクロ マトグラフィーグレードのポリプロピレン（ポリサンエンス社からのカタログＮ ｏ。

４３４２）のカラム上て２５４ｎｍで光度分析で追跡された溶離側を用いて分離 することができる。ポリマーを水中に懸濁し、次いで溶液をｐ）１１１にジメチ ルアミンで調製し、溶離溶剤もｐＨ１１にジメチルアミンで調整する時、精製は 一般に良好に行われる。このシステムでトリチル化された全長ポリマーは、非− トリチルー含有キャップされた失敗配列よりもかなり遅く溶出する。

全長ポリマーを含有する分画を集め、減圧で乾燥する。次いでポリマー調製物を トリフルオロエタノール（２Ｓｍｌ　ＴＦＥ中で１ｇポリマー）中に懸濁して脱 トリチル化し、メルカプト酢酸１．５ｍｌを加える。ｌＯ分抜工−テル１００ｍ １を加え、最終純粋な生成物を遠心分離又は濾過によって集める。

例１０ 新規酸化／閉環／還元法を経るポリマー集合Ａ１合成担体 この固形担体は親水性でなければならないが、ジシナルヒドロキシルを含有して はならない。Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ　５０ＣＭの水性スラリー（パイオーラッド ラボラトリ−、リッチモンド、カルフォルニア、アメリカ）をフリットカラムに 加え、装填された床カラム５ｍ１（カルボキシラード約１ｎｖｎｏｌを含有する ）を生じる。この合成担体をＯ，ＩＮ　ＨＣＩｔＯＯｍＬ　、次いで水５０ｍ１ で洗滌する。ＤＭＰ（ジメチルホルムアミド）　５０ｍ１をカラムに通して、排 出する。ジイソプロピルカルボジイミド５ｍｍｏｌ及びｐ−ニトロフェノール５ ｍｍｏ＋を含有するＤＭＦ　５ｍｌを加え、３０°Ｃで３時間撹拌しながらイン キュベートする。カラムをＤＭＦ　１００ｍ１で洗滌し、ＤＭＰ　ｌ０ｍ１中の ピペリジン２０　ｍｍｏｌを加え、１５分間撹拌する。カラムをＤＭＦ　５０ｍ １で洗滌し、排出する。

Ｂ、リンカ−及び第一サブユニットの添加ＤＭＦ　Ｓｍｌ中にリボースの５゛に カルバザード部分を有するリボース−含有サブユニットＩｍｍｏｌ（例２Ｆの様 に製造）に、ビス〔２−（サクシンイミドオキシ力ルポニルオキソ）−エチル〕 スルホン３ｍｍｏ　Ｉ　（ピアースケミカル社、ロックフォード、イリノイ州、 アメリカ）を加え、３０°Ｃで３時間インキュベートする。反応混合物にエーテ ルを加え沈殿を集める。沈殿したリンカ−サブユニットをエーテルで洗滌し、Ｄ ＭＦ　Ｓｍｌ中に再懸濁し、合成担体に加え、３時間３０°Ｃて撹拌しながらイ ンキュベートする。担体をＤＭＦ　５０ｍ１で、次いで水１００ｍ１で洗滌する 。

する。カラムを水５０ｍ１で洗滌し排出する。

ｉｌ）モルホリノ閉環／還元 水５ｍｌ中にナトリウムシアノボロヒドリド２（財）Ｏｌを溶解し、ｐＨを７と ８の間にトリメチル酢酸を用いて調整し、次のリボース−含有５−カルバザード サブユニットｔ、ｓｍｍｏｌを加え、合成担体を含有するカラムに加える。９０ 分間３０°Ｃで撹拌しながらインキュベートする。ギ酸を加え、ＰＨを３と４の 間に調整し、３０°Ｃで１０分間インキュベートする。カラムを水１００ｍ１で 洗滌する。

すへてのサブユニットを加えて、所望の全長ポリマーが生しるまでこのカップリ ングサイクルをくり返す。

末端部分の添加 水性溶解度を増大する、又は標的結合親和性を増大する、又は特異細胞又は組織 タイプによる吸収を促進する部分を加えるのが望まれる場合、ポリマーの末端サ ブユニットのビシナルヒドロキシルを酸化し、上記モルホリノ閉環／還元処理、 第一脂肪族アミンを含有する上記部分を加えてこの工程でこれを好都合に達成す ポリマーのすべてのサブユニット及びすべての望まれる付加基を上記カップリン グ工程によって加えた後、ポリマーを、カラムをＤＭＦ　５０ｍ１で洗滌し、次 いでジエチルｖロナート２．５ｍｌ　、　１．８−ジアザビシクロ（５，４，０ ）ウンデ−７一エン５ｍｌ、及びＤＭＦ　４３ｍ１てカラムを溶出して担体から 切断する。

全長ポリマーを、低圧クロマトグラフィーでアセトニトリル／水勾配で展開され たクロマトグラフィーグレードのポリプロピレン（ポリサイエンス社からのカタ ログＮｏ、　４３４２）のカラム上で２５４ｎｍて光度分析で追跡された溶離剤 を用いて精製することができる。ポリマーを水中に懸濁し、次いで溶液をｐＨ１ １にジメチルアミンで調整し、溶離溶剤もｐＨ１１にジメチルアミンで調整する 時、精製は一般に良好すべてが重要な長さである場合、ＮＭＲ、及び２−次元Ｎ ＭＲでさえ、これらのヘテロポリマーに対してわずかに有用な構造情報を提供す ることが分る。同様１こ、元素分析は価値があることを示さない。

例８の様に製造された及び固形担体から切断されたポリマー、しかしまだ水酸化 アンモニウムで処理されていないポリマーは一般に比較的きれし１な親イオンを 約１６ないし１８サブユニツトまでの長さのポリマーに対して示す。この際陽性 の袋、速原子衝撃マススペクトルによって評価する。より長（１ポリマー（二つ （為て、及び塩基上で保護基欠損ポリマー（たとえば倒ｌＯで製造される）につ Ｉ、ｚて、有効な質量分析は、たとえばレーザー脱着又はエレクトロスプレーの 様な処理を必要とする。

本発明は、特別なポリマーサブユニット、サブユニツトの製造方法、及びボ１ツ マー集合に関して記載するが、種々の変更及び変化は本発明力）ら離れることな く可能である。

ＯＧ Ｇ：Ｃ 日９．２Ａ 口９．２８ 日９．４Ｃ Ｆｉｇ、　４０ 日９．５Ａ　日ａ、５８　Ｆｉｇ、ｓｃ口９．６Ａ　日９．６Ｂ 日９．６Ｃ日９．６Ｄ Ｆｉｇ、ｅＥ　日９．６Ｅ Ｆｉｇ、　７Ａ 日り、１３Ａ　日ｇ、１３８ 日ｇ、１３Ｃ日ｇ、１３Ｄ Ｇ：Ｃ 日ｇ、１８Ａ　Ｆｉｇ、１８Ｂ 日ｇ、１８０　日ｇ、１８Ｄ 日９．１９ 日９．　２０ 日９．２１ ０９．２２ 補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法第１８４条の８） 平成５年１２月２０日

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．形態： ▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼式中Ｙは ２−又は３−原子の長さの非電荷サブユニット連鎖基である；Ｒ′はＨ、ＯＨ又 は０−アルキルである：５′−メチレンは５員成環中でβ立体化学配向及び６員 成環中で均一な立体化学配向を有する；Ｒｉはβ立体化学配向を有する：そして ポリマー中のＲｉ基の少なくとも約７０％は次の塩基−対−特異性基２又は数種 から選択される： （ａ）Ｔ：Ａ又はＵ：Ａ配向された塩基−対に対して、Ｒｉは２，６−ジアミノ −プリンである； （ｂ）Ｃ：Ｇ配向された塩基−対に対して、Ｒｉはグアニン又は６−チオグアニ ンである； （ｃ）Ｇ：Ｃ配向された塩基−対に対して、Ｒｉは次の骨格環構造及び水素結合 配列を有する平面塩基から成る群から選ばれ、この際Ｂはポリマー骨格を示す： ▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、 化学式、表等があります▼式中＊環一は、水素−結合受容体基を有していてよい ；そして（ｄ）Ａ：Ｔ又はＡ：Ｕ配向された塩基−対に対して、Ｒｉは次の骨格 環構造及び水素結合配列を有する平面塩基から成る群から選ばれ、この際Ｂはポ リマー骨格を示す：▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等が あります▼▲数式、化学式、表等があります▼式中＊環位置は、水素結合供与を 有していてよい、を有するサブユニットの特 異配列から成る、標的配列中で選択された位置で少なくとも２個の異なって配向 されたワトソン−クリック塩基−対を含有する二重らせんポリヌクレオチドの標 的配列に、配列−特異方法で結合するのに有効なポリマー組成物。
2. ２．形態： ▲数式、化学式、表等があります▼ のサブユニット１又は数種を有する、請求の範囲１記載のポリマー組成物。
3. ３．形態： ▲数式、化学式、表等があります▼ のサブユニット１又は数種を有する、請求の範囲１記載のポリマー組成物。
4. ４．形態： ▲数式、化学式、表等があります▼ のサブユニット１又は数種を有する、請求の範囲３記載のポリマー組成物。
5. ５．Ｙ連結鎖は３原子の長さである、Ｂ−型ＤＮＡ−ＤＮＡ二重らせん核酸への 配列−特異結合に使用するための、請求の範囲１記載のポリマー組成物。
6. ６．ポリマーのサブユニット１又は数種は、▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、 化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼から成る群より選 ばれる、請求の範囲５記載のポリマー組成物。
7. ７．ポリマーのサブユニット１又は数種は、▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼から成る群より選ばれる、請求の範囲６記載 のポリマー組成物。
8. ８．Ｙ連鎖基は２原子の長さである、Ａ−型二重らせん核酸への配列−特異結合 に使用するための、請求の範囲１記載のポリマー組成物。
9. ９．ポリマーのサブユニット１又は数種は、▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼から成る群より選はれる、請求の範囲８記載 のポリマー組成物。
10. １０．ポリマーのサブユニット１又は数種は、▲数式、化学式、表等があります ▼▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼から成 る群より選ばれる、請求の範囲８記載のポリマー組成物。
11. １１．Ｒｉ構造は、 ▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、 化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、 表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があ ります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、 化学式、表等があります▼から成る群より選ばれる、請求の範囲１記載のポリマ ー組成物。
12. １２．Ｇ：Ｃ標的配向に特異的なＲｉ構造は、次の塩基：▲数式、化学式、表等 があります▼▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等がありま す▼からなる群より選ばれる、請求の範囲１記載のポリマー。
13. １３．Ａ：Ｔ標的配向に特異的なＲｉ構造は、次の塩基：▲数式、化学式、表等 があります▼▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等がありま す▼から成る群より選ばれる、請求の範囲１記載のポリマー。
14. １４．標的配列中でＧ：Ｃ塩基−対配向に対応するポリマーサブユニットでポリ マー中のＲｉ基の約３０％までがシトシン、そして標的配列中でＡ：Ｔ塩基−対 配向に対応するポリマーサブユニットでチミンである、請求の範囲１記載のポリ マー組成物。
15. １５．ポリマーは、水性媒体中でポリマーの溶解性を増大するのに有効な結合部 分１又は数種を含有する、請求の範囲１記載の組成物。
16. １６．次のサブユニット形の１つ： ▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼式中Ｒｉ は２つの数個の水素−結合部位を有する平面環構造である、を有する第一遊離又 はポリマー−末端サブユニットを次のサブユニット形の１つ： ▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、 化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼式中Ｚは２−原子 又は３−原子長さの部分である、を有する第二遊離又はポリマー−末端サブユニ ットとカップリングする方法に於て、その方法はｉ）第一サブユニットを酸化し て、ジアルデヒド中間体を発生する：ｉｉ）ジアルデヒド中間体と第二サブユニ ットとを第一アミンをジアルデヒドに連結するのに有効な条件下で接触させる； そして（ｉｉｉ）次の形：▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、 表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼から選択される連結された 構造を生じるのに有効な還元剤を加えることから成る上記方法。
17. １７．塩基−対の選択された配列を有する標的二重らせん核酸フラグメントを液 体サンプルから単離する方法に於て、その方法はｉ）溶液から試剤を単離するこ とができる構造を含有するポリマー試剤とサンプルとを接触させる、つまりこの 構造に付随して、請求の範囲１のポリマー組成物は配列−特異方法で選択された 塩基−対配列との結合に有効なサブユニット配列を塩基−対の選択された配列へ のポリマー組成物の配列−特異結合に有効な条件下に有する；そしてｉｉ）ポリ マー試剤を液体サンプルから分離することから成る、上記方法。
18. １８．分離されたポリマー試剤を、更に緒合された二重らせん核酸の存在に関し てテストすることを含む、液体サンプル中のこの様な標的フラグメントの仔在を 検出するのに使用する、請求の範囲１７記載の方法。
19. １９．上記ポリマー試剤は結合されたポリマー組成物を有する固形担体を含む、 そして上記テストは二重らせん核酸に、二重らせんＤＮＡに挿入するのに有効な 蛍光化合物を加えることを含む、請求の範囲１８記載の方法。
20. ２０．次のサブユニット構造の１つ： ▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、 化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼式中Ｒ′はＨ、Ｏ Ｈ、又はＯ−アルキルである；５′−メチレンは、サブユニット形（ａ），（ｃ ）及び（ｄ）中にβ立体化学配向及びサブユニット形（ｂ）中に均一立体化学配 向を有する；Ｘは保護基又は線状ポリマー中に、ある選択された順序でサブユニ ットを加えるのに適する連結基である；Ｙは線状ポリマーに、ある選択されて順 序でサブユニットを加えるのに適する求核又は親電子連結基である：そしてＸ及 びＹは一緒になって、サブユニットセットのサブユニット２個を連結する時に生 じるサブユニット間連鎖は２又は３原子長さの部分である及び非電荷であるもの である；Ｚは２−原子又は３−原子長さの部分である；そして保護された状態で 存在し、β立体化学配向を有するＲｉは次の骨格環構造及び水素結合配列を有す る平面塩基から成るグループから選ばれ、その際Ｂは脂肪族骨格部分を示す：▲ 数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化 学式、表等があります▼式中＊環位置は、水素−結合受容体基を有していてよい ：又はＲｉは次の骨格環構造及び水素結合配列を有する平面塩基から成る群から 選ばれ、この際Ｂはポリマー骨格を示す： ▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、 化学式、表等があります▼式中＊環位置は、水素結合供与基を有していてよい、 から成る二重らせんポリヌクレオチドに於て標的配列に配列特異方法で結合する のに有効なポリマー組成物を形成するのに使用するサブユニット組成物。