KR20200036033A - 표적화 아미노산 지질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 표적화된 전달 및/또는 항원 전시 시스템에서 사용하기 위한 담체 시스템의 표면 상에 노출되고 하나 이상의 생활성 리간드에 컨쥬게이션된 에테르-지질을 포함하는 담체 시스템에 관한 것이다. 임의로는, 하나 이상의 추가 생활성제가 담체 시스템 내부에 캡슐화 또는 내장되거나, 또는 그 위에 부착 또는 흡착될 수 있다. 본 발명은 또한 생활성제에 응답하는 형질, 질환 및 병태의 연구, 진단 및 치료를 위한 조직 또는 세포 및 항원 전시 시스템에 특이적인 생활성제의 표적화된 전달과 같은, 의학적 적용에서의 그의 용도 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

표적화 아미노산 지질 {TARGETING AMINOACID LIPIDS}
본 발명은 표적화된 전달 및/또는 항원 전시 시스템에서 사용하기 위한 하나 이상의 생활성 (bioactive) 리간드와 컨쥬게이션 (conjugation) 된 (그리고 담체 시스템 표면 상에 노출된) 에테르-지질을 포함하는 담체 시스템에 관한 것으로서, 상기 담체 시스템은 하나 이상의 추가 생활성제 (bioactive agent) 를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 생활성제에 반응하는 형질, 질병 및 병태의 연구, 진단 및 치료를 위한 특정 조직 또는 세포 및 항원 전시 시스템으로의 상기 생활성제의 표적화된 전달과 같은, 의학적 적용에서의 이의 용도 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
분자 인지, 예컨대 수용체 리간드간, 항원-항체, DNA-단백질, 당-렉틴, RNA-리보솜 등은 다수의 생물학적 시스템의 기저를 이루는 중요한 원리로서, 중합체성 비즈 (beads), 소포성 지질, 마이크로에멀젼 등을 비롯한 인위적 (마이크로- 또는 나노-) 미립자 시스템에서와 같이, 의학적 적용에 사용하기 위한 인위적으로 제조된 다수의 생물학적 시스템에서 적용되고 있다.
분자 인지를 바탕으로 한 적용의 한 가지 중요한 예는, 항바이러스제, 화학요법제 또는 이미징제와 같은 진단 또는 치료적 화합물의 특정 부위로의 표적화된 전달에서의 용도로, 이는 비(非)특이적 전달과 연관된 한계 (예, 생체 내 청소 시간, 잠재적 독성, 작용제 등의 막 이동과 연관된 문제점) 를 극복 가능하게 하고, 따라서 그의 효과를 크게 증대시킨다. 각종 인지-기반 전략이 그의 생물학적 활성을 발휘하도록, 표적 세포의 세포내 환경 (즉, 특이적 세포 구획) 으로 화합물의 전달, 특히 생물학적 또는 인위적 담체, 예컨대 바이러스 벡터, 양이온성 중합체, 예컨대 폴리리신, 폴리아르기닌 등 (예, WO 79/00515, WO 98/52614), 지질 담체 및 각종 기타 컨쥬게이트 시스템의 사용을 수반하는 특정 수송체를 통한 전달을 개선하는데 사용된 바 있다.
한 가지 널리 사용된 접근법은, 리포솜, 및 미셀과 같은 인위적 담체로서의 지질 소포의 사용을 포함하는 것으로, 이는 생활성제의 전신 노출을 감소시켜, 분해, 용해 등과 연계된 문제점을 극복하고 혈액 순환 시간을 늘리는 능력으로 인해, 약물 전달 비히클로서 광범위하게 개발되고 분석된 바 있다. 활성적으로 표적화된 생활성제의 전달은, 생체 내 투여 후에, 암 세포 또는 특정 조직 및 기관에 특이적인 세포, 예컨대 간세포 등의 특정 세포 타입으로의 소포를 안내 (또는 표적화) 하는 역할을 수행하는 표적화 리간드로의, 지질 소포 (소포 형성 전후) 의 지질을 유도체화하는 것을 포함한다 (예, US 6,316,024 및 US 6,214,388; Allen et al., Biochim. Biophys. Acta, 1237:99-108 (1995); Blume et al., Biochim. Biophys. Acta, 1149:180- 184 (1993) 참조). 이는, 특정 세포 타입에서 과발현된 수용체들을 이용함으로써 달성될 수 있으며, 여기에는 예를 들어 폴산 수용체 (FR) (유방, 난소, 경부, 직장결장, 신장 및 코인두 종양을 비롯한 각종 신생물 조직에서 과발현됨), 트랜스페린 수용체 (TfR) (대부분의 암종, 육종 및 일부 림프종 및 백혈병의 신진대사 및 약물 저항 세포 상 과발현됨), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) (역형성 갑상샘 암 및 유방, 폐 및 직장결장 종양에서 과발현됨), 혈관 내피 성장 인자 수용체 1 및 2 (VEGFR-1/2) (종양 신맥관 구조 (neovasculature) 에서 내피 세포 상에 고 발현됨), 메타스틴 수용체 (유두 갑상샘 암에서 과발현됨), ErbB 패밀리 수용체 티로신 키나아제 (유방암의 유의한 서브세트에서 과발현됨), 인간 표피 성장 인자 수용체-2 (Her2/neu) (유방암에서 과발현됨), 티로신 키나아제-18-수용체 (c-Kit) (육종의 신장 암종에서 과발현됨), HGF 수용체 c-Met (식도 샘암종에서 과발현됨), CXCR4 및 CCR7 (유방암에서 과발현됨), 엔도텔린-A 수용체 (전립선암에서 과발현됨), 퍼옥시좀 증식자 활성화 수용체 델타 (PPAR-델타) (대부분의 직장결장암 종양에서 과발현됨), PDGFR A (난소 암종에서 과발현됨), BAG-1 (각종 폐 암에서 과발현됨), 가용성 타입 II TGF 베타 수용체 (췌장암에서 과발현됨), 아시알로당단백질 수용체 (간세포에서 과발현됨), αvβ3 인테그린 수용체 (성장 종양 맥관구조에서 과발현됨), 레구마인 (고형 종양 조직에서 풍부한 클랜 CD 시스테인 프로테아제 및 TAM, 종양 연관 마이크로파지 상에서 과발현됨), 등이 포함된다.
치료 또는 분석될 이러한 특이적 수용체 세포 또는 조직과 선택적으로 결합하는 임의의 작용제 (agent) 는, 지질 소포에 부착되어 표적 또는 수용체 리간드로서 작용할 수 있다. 전형적으로, 이러한 표적화 리간드는 장쇄 (예, 중합체성) 링커를 통해 지질 또는 지질 소포 표면에 부착된다. 예를 들어 폴산 기재 컨쥬게이트가 질병의 치료 및/또는 진단에 유용한 치료적 화합물의 표적화된 전달 접근을 제공해, 치료적 화합물의 필요량을 감소시키는데 사용된 바 있다 (예, WO 02/094185, US 6,335,434, WO 99/66063, US 5,416016 참고). 마찬가지로, 세포 막을 통해 외인성 화합물을 수송하는 갈락토오스- 및 갈락토사민-기재 컨쥬게이트를 사용하여, 치료에 요구되는 치료적 화합물의 필요량을 감소시키면서 HBV 및 HCV 감염 또는 간세포 암종 등의 간 질병 치료에 대한 표적화된 전달 접근을 제공할 수 있다 (예를 들어, US 6,030,954).
분자 인지 기반 적용의 또 다른 중요한 예는, T 세포 활성화, 조절 또는 내성을 생성하기 위한 면역 시스템으로의 "자기" 및 "외래" 단백질 (항원) 의 제시를 포함하는, 항원 전시 시스템의 이용이다. 원하는 면역 반응 유무에 기여하는 항원-제시 시스템에서 수용체 리간드 상호작용은, 리간드 밀도, 보조수용체 (coreceptor) 의 존재, 수용체 리간드 친화도 및 표면 조건 등과 같은 다양한 매개변수에 의해 영향 받으므로 복합적이고 평가하기 어렵다. 따라서, 널리 이용되는 접근법은 1 차 기능이 항원 프로세싱 및 제시인 천연 발생 인간 세포 (또는 그의 일부) 를 이용하는 것을 수반한다. 그러나, 생세포 기반 시스템은 원하는 내성 또는 면역반응 유도를 달성하는 세포-세포 상호작용을 모방하는데 있어서 최적일 수 있지만, 가능하게는, 충분한 치료적 수준으로 그 표면 막 상에 추가적인 "동시자극적" 및/또는 부착 분자들의 발현을 비롯해, 표면 분자의 조절화된 발현에 의존한다. 현재 공지된 인위적 시스템은, 항원 제시 및 그의 표면 상 T-림프구 활성화 또는 저해에 요구되는 분자를 보유하는 유전 공학적 하위세포성 항원 제시 소포 (WO 03/039594) 에서부터, 세포-크기의, 생분해성 마이크로스피어 기재 항원 제시 시스템 기반의 시스템까지 이른다 (WO 07/087341).
분명히도, 상기의 분자 인지 기반 기술에는 여전히 단점이 존재하므로, 당업계에서는, 단순하고 경제적인 제조 방법을 포함해, 표적화된 전달 또는 항원 제시 등의 분자 인지 기반 적용에 사용될 다용도의 효율적인 인위적 담체 시스템에 대한 요구가 여전하다.
본 출원은 상술된 한계를 극복 가능하게 하는, 컨쥬게이트를 포함하고 (임의로는 추가적으로 하나 이상의 생활성제를 포함하는) 각종 담체 시스템뿐 아니라 하나 이상의 공유 부착된 생활성 리간드를 갖는 에테르-지질 포함 컨쥬게이트를 제공하는 것이다.
본 발명의 개요
본 발명은 표적화된 전달 및/또는 항원 전달 시스템에서 사용하기 위한 하나 이상의 생활성 리간드와 컨쥬게이션된 에테르-지질을 포함하는 담체 시스템에 관한 것이다. 하나 이상의 생활성 리간드는 하기 식 I 의 에테르-지질과 공유 부착되고, 담체 시스템의 표면 상에 노출된다. 임의로는 하나 이상의 생활성제가 캡슐화되거나 또는 담체 시스템의 표면 내에 내장되거나, 또는 표면 상에 부착 또는 흡착될 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 임의로는 추가의 보조-지질 (co-lipid) 과 혼합되어 하나 이상의 식 I 의 지질-리간드 컨쥬게이트를 포함하는 리포솜 또는 미셀 등의 소포 형태의 지질성 담체 시스템에 관한 것이다. 하나 이상의 지질-리간드 컨쥬게이트는, 항원성 리간드, 표적화 리간드, 치료적 리간드 또는 진단적 리간드와 같은 하나 이상의 생활성 리간드에 공유 연결된 하나 이상의 에테르-지질을 포함한다. 임의로는, 하나 이상의 추가 생활성제가 내부 공극 또는 이중층 (막) 에 캡슐화 또는 내장되거나, 또는 소포 표면 상에 부착 또는 흡착된다. 일부 구현예에서, 소포는 리포솜 또는 미셀이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 내부 공극 또는 고체 코어 (core) 를 갖는 지질-코팅된 입자 형태인 나노미립자 담체 시스템에 관한 것으로, 이때 상기 입자는 추가의 보조-지질과 혼합된, 하나 이상의 식 I 의 지질-리간드 컨쥬게이트로 코팅된다. 하나 이상의 식 I 의 지질-리간드 컨쥬게이트는 항원성 리간드, 표적화 리간드, 치료적 리간드 또는 진단적 리간드와 같은 하나 이상의 생활성 리간드에 공유 연결된 하나 이상의 에테르-지질을 포함한다.
일부 구현예에서, 나노미립자 물질은 지질-코팅된 나노입자 또는 나노스피어이다. 임의로는, 하나 이상의 추가 생활성제가 내부 공극에 캡슐화되거나 또는 고체 코어에 내장 또는 분산된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 식 I 에 따른 지질-리간드 컨쥬게이트 그 자체에 관한 것으로, 이는 하나 이상의 생활성 리간드가 공유 부착될 수 있는 3 개 이하의 커플링 부위 및 6 개 이하의 탄소 원자를 갖는 짧은 직쇄 아미노산을 가진 헤드기 및 2 개 이상의 에테르-연결된 탄화수소 사슬을 특징으로 하는 에테르-지질을 포함한다.
지질-리간드 컨쥬게이트는 하기 식 I 의 화합물에 관한 것이다:
Figure pat00001
[식 중,
Y 는 O, N, S 또는 공유 결합을 나타내고,
S1, S2, S3 는 서로 독립적으로 공유 결합 또는 스페이서 (spacer) 기를 나타내고,
X1, X2, X3 는 서로 독립적으로 H 또는 리간드기를 나타내고,
L 은 식 (a) 의 기를 나타내고:
Figure pat00002
식 중, 대시선은 N 과의 연결을 나타내고,
R1 은 H 또는 식 -(CH2)2-ORb1 의 기를 나타내고,
R1' 은 H 또는 식 -(CH2)2-ORb2 의 기를 나타내고,
R2 은 H 또는 식 -CH2-ORc 의 기를 나타내고,
R2' 은 H 또는 식 -ORd 또는 -CH2-ORd 의 기를 나타내고,
R3 은 H 또는 식 -(CH2)2-ORe 또는 -(CH2)3-ORe 의 기를 나타내고,
Ra, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re 는 서로 독립적으로 포화 또는 불포화, 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 나타내고,
m 은 1, 2 또는 3 이고,
단, R1, R1', R2, R2', R3 중 하나 이상은 H 가 아니고, X1, X2, X3 중 하나 이상은 리간드 기임].
특정 구현예에서, 리간드기는 표적화 리간드 또는 항원성 리간드 또는 치료적 리간드 또는 진단적 리간드이다.
바람직하게, 표적 리간드는 프테로산 유도체, 펩티드 및 그의 유도체, 폴리펩티드, 단백질 또는 탄수화물이고, 항원 리간드는 펩티드, 단백질 또는 탄수화물이다.
추가 측면에서, 본 발명은 또한 약물 전달 시스템, 진단 시스템 또는 항원 전시 시스템과 같은 본 발명의 담체 시스템의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 지질을 함유하는 담체 시스템 및 이들 담체 시스템을 함유하는 약학적 제형을 제조하기 위한 키트가 제공된다.
기타 측면에서, 본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 담체 시스템을 투여하는 것을 포함하는 질병의 치료 또는 진단 방법에 대한 것이다.
또한 추가 측면에서, 본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 담체 시스템을 투여하는 것을 포함하는 면역 반응 조정 방법에 관한 것이다.
본 발명의 기타 측면은 막을 통한 생물학적 활성 화합물의 운송 방법 및/또는 생물학적 활성 화합물의 세포로의 본 발명의 담체 시스템을 이용한 전달 방법을 포함한다.
도면
도 1: 비(非)표적 리포솜 (DMA-RGD 불포함) 과 비교되는, RGD 표적 리포솜 (5% DMA-RGD 포함) 의 세포 흡수.
도 2: 실시예 20 에 따른 대조군 리포솜 (MS 15-0) 과 비교되는, RR11a 데코레이션 리포솜 (MS 15-4) 의 레구마인 표적 실험:
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 지질-리간드 컨쥬게이트를 형성하도록, 하나 이상의 에테르-지질 및 상기 에테르-지질과 컨쥬게이션된 하나 이상의 생활성 리간드를 포함하는 담체 시스템을 제공한다. 임의로는 다른 지질 매트릭스 화합물 (또는 보조-지질) 과 조합된, 식 I 의 지질-리간드 컨쥬게이트로 코팅되거나 또는 이로 형성될 수 있는 임의의 담체 시스템은 본 발명에 따른 담체 시스템으로서 작용할 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 담체 시스템은 내부 공극이 있는 소포 또는 스피어, 고체 코어가 있는 입자, 막대, 튜브, 클러스터 (cluster) 등과 같은 각종 형상 및 형태의 마이크로미립자 또는 나노미립자 물질을 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 담체 시스템은 리포솜, 미셀과 같은 지질 담체 시스템으로, 이때 지질-리간드 컨쥬게이트는 임의로는 기타 매트릭스 지질과 함께 소포의 지질 벽을 형성한다. 기타 구현예에서, 본 발명에 따른 담체 시스템은 나노입자, 나노스피어, 나노클러스터, 나노튜브, 중합체 비즈 등과 같은 나노미립자 담체 시스템으로, 이때 지질-리간드 컨쥬게이트가 임의로는 기타 매트릭스 지질과 함께 나노미립자 담체 시스템의 표면 상 코팅물로서 흡착된다. 본 발명에 따른 담체의 성질 및 사용 용도에 따라, 하나 이상의 생활성제가 담체 시스템의 표면 상으로 부착 또는 흡착되거나, 또는 그 안에 캡슐화 또는 내장될 수 있다.
본원에서 이용된 바, 용어 "생활성"은 세포, 조직, 시스템 및/또는 대상 (인간 포함) 에서 추구되는 생물학적 반응을 이끌어내는 능력을 지칭한다. 용어 "생물학적 반응"이란, 세포의 자극에 대한 생리학적 반응을 지칭하고, 이에 따른 대상에 의한 임의의 세포, 신경, 화학, 염증, 면역학적 또는 병리학적 생물학적 응답, 과정 또는 반응일 수 있다. 상기 응답, 과정 또는 반응은 화학적, 세포적, 신경학적, 심리학적 등일 수 있다.
즉, 본원에서 이용된 바 용어 "생활성 리간드 또는 생활성 리간드기" 또는 간략히 "리간드" 또는 "리간드 기"는 생물학적 반응을 유도하고, 직접 또는 스페이서기를 통해 식 I 의 에테르-지질에 공유 부착 (표준 화학적 커플링 기술을 이용) 에 사용되는 리간드를 지칭한다. 생물학적 리간드는 표적화 리간드, 항원성 리간드, 치료적 리간드 또는 진단적 리간드일 수 있다.
본원에서 이용된 바 용어 "생활성제" 또는 단순히 "작용제"는 표적화제, 항원제, 치료제 또는 진단제, 바람직하게 치료제 또는 진단제 등의 생물학적 활성을 가진 임의의 합성 또는 천연 발생 화합물 (자유 형태, 염 형태 또는 용매화물 또는 함수 형태) 를 지칭한다.
각종 생활성제 기 및 생활성 리간드 기의 정의가 겹칠 수 있다는 점이 이해된다.
따라서, (표적화된 전달 시스템에서 사용되는) "작용제" 또는 "리간드"와 함께 사용되는 표현 "표적화"란 원하는 위치에서 및/또는 원하는 조건 하에서 상보적 결합 모이어티와 상호작용할 수 있는 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 상보적 결합 모이어티는 리간드 및 항-리간드 (예, 스트렙타비딘 및 비오틴, 단백질 A 또는 G 및 면역글로불린의 Fc 영역), 리간드 및 수용체 (예, 소분자 리간드 및 그의 수용체, 또는 당-렉틴 상호작용), 파아지 전시-유래 펩티드, 상보적 핵산 (예, DNA 하이브리드, RNA 하이브리드, DNA/RAN 하이브리드, 등) 및 압타머일 수 있다. 기타 예의 상보적 결합 모이어티에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 상보적 전하, 소수성, 수소 결합, 공유 결합, 반데르발스 힘, 반응적 화학, 정전기적 상호작용, 자기 상호작용 등을 나타내는 모이어티가 포함된다.
특정 수용체 (수용체 작용제 또는 리간드) 에 특이적인 "표적화 리간드" 또는 "표적화 작용제"는 특정 결합 쌍의 특이적 결합 파트너인 임의의 화합물을 지칭하며, 이때 나머지 결합 파트너가 수용체이다. 수용체는 세포막 또는 표면에 부착되거나 또는 가용 형태로 존재할 수 있고, 대상에, 바람직하게는 포유류 대상에, 예를 들어 인간 또는 동물에서 세포 내 및/또는 세포외 존재할 수 있다. 수용체의 예는 제한 없이 막 수용체, 가용성 수용체, 클로닝되거나 또는 재조합 수용체, 클랜 CD 시스테인 프로테아제 및 기타 프로테아제 및 기타 효소, 호르몬 수용체, 약물 수용체, 전달 수용체, 오토코이드 수용체, 사이토카인 수용체, 항체, 항체 단편, 공학적 항체, 항체 모방체, 분자 인지 유닛, 부착 분자, 응집소, 인테그린 및 셀렉틴을 포함한다. 전형적으로, 수용체 리간드의 그의 수용체에 대한 결합 친화도는 10-5M 이상, 바람직하게 10-7M 이상, 일례로 약 10-8M 내지 약 10-12M 이다. 수용체 작용제 또는 리간드의 예는 제한 없이 펩티드 또는 폴리펩티드, 그의 유도체, 예컨대 아자-펩티드 유도체 또는 부분 또는 단지 D-아미노산을 함유하는 유도체, 글리코펩티드 등, 당단백질 또는 인단백질 포함 단백질, 탄수화물, 당지질, 인지질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 압타머, 스피에겔머, 비타민 (예, 비타민 B9 또는 폴산, 비타민 B12), 항원 및 그의 단편, 헵텐, 수용체 아고니스트, 부분 아고니스트, 혼합 아고니스트, 안타고니스트, 약물, 케모카인, 호르몬 (예, LH, FSH, TRH, TSH, ACTH, CRH, PRH, MRH, MSH, 글루카곤 및 프로락틴; 트랜스페린; 락토페린; 안지오텐신; 히스타민; 인슐린; 렉틴), 전달자, 오토코이드; 성장 인자 (예, PDGF, VEGF, EGF, TGFα, TBFβ, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, FGF, IGF, 봄베신, 트롬보포이에틴, 에리트로포이에틴, 온코스타틴 및 엔도텔린 1), 인터류킨 (예, 인터류킨 1 내지 15) 포함 사이토카인, 림포카인 및 세포 신호 분자, 예컨대 종양 괴사 인자 (예, 종양 괴사 인자 α 및 β) 및 인터페론 (예, 인터페론 α,β,γ), 보결 분자단, 코엔자임, 공동인자, 조절 인자 또는 임의의 천연 발생 또는 합성 유기 분자 (특이적으로 수용체에 결합할 수 있음; 동일 결합 특성을 보유한 그의 단편, 유사체 및 기타 유도체 포함) 을 포함한다. 본 발명에서 사용되기 위한 수용체 작용제 또는 리간드의 선택은 검정되고 치료될 질병, 병태 또는 감염의 성질에 의해 결정될 것이다. 바람직한 수용체 작용제 또는 리간드는 비타민 (예, 폴산 또는 그 단편), 프테로산 유도체, 펩티드, 아자-펩티드 유도체와 같은 유도체를 포함, 단백질 및 탄수화물을 포함한다. 가장 바람직한 것은 프테로일 유도체 및 펩티드, 특히 아자-펩티드 유도체이다.
본원에서 이용된 바 용어 "프테로일" 또는 "프테로산"은, 아미노벤조일 모이어티에 연결되는, 축합 피리미딘 헤테로사이클을 나타낸다. 본원에서 이용된 바 "축합된 피리미딘 헤테로사이클"은, 추가 5- 또는 6-원 헤테로사이클과 융합되어, 프테리딘 또는 피롤로피리미딘 바이사이클을 도모하는 피리미딘을 포함한다. 에테르 지질의 헤드기 (N- 또는 Y-기) 상 반응성 부위 중 하나 이상에 대한 프테로일 기의 컨쥬게이션은 폴레이트 구조를 도모할 것이고, 이때 헤드기는 글루탐산 부분 또는 그의 유도체를 나타낸다. 예의 폴레이트 구조는 폴레이트 골격을 기반으로 하고, 즉, N-[4-[[(2-아미노-1,4-디히드로-4-옥소-6-프테리디닐)메틸]아미노]벤조일]-L-글루탐산을 나타내는 프테로일-글루탐산 및 그의 유도체이다. 이러한 폴레이트 유도체에는 반응성 또는 비반응성 부위 상에서 임의의 치환기를 갖고 및/또는 이때 선택된 원자가 대체되어 있고, 예를 들어 선택된 헤테로원자, 바람직하게, 1 또는 2 개가 탄소 원자에 의해 대체되어 있는 (예, 데아자 및 디데아자 유사체) 폴레이트가 포함된다. 그 예는 임의 치환된 폴산, 폴린산, 프테로폴리 글루탐산, 및 폴레이트, 수용체-결합 프테리딘, 예컨대 테트라히드로프테린, 디히드로폴레이트, 테트라히드로폴레이트 및 그의 데아자 및 디데아자 유사체이다. 폴산, 5-메틸-(6S)-테트라히드로폴산 및 5-포르밀-(6S)-테트라히드로폴산이 본 발명의 화합물에 사용되는 바람직한 염기성 구조이다. 용어 "데아자" 및 "디데아자" 유사체는 천연 발생 폴산 구조에서 1 또는 2 개의 질소 원자에 대해 치환된 탄소 원자를 갖는 당업계 인지된 유사체를 지칭한다. 예를 들어 데아자 유사체에는 하기가 포함된다: 1-데아자, 3-데아자, 5-데아자, 8-데아자, 및 10-데아자 유사체. 디데아자 유사체에는 예를 들어, 1,5-디데아자, 5,10-디데아자, 8,10-디데아자, 및 5,8-디데아자 유사체가 포함된다. 바람직한 데아자 유사체 화합물에는 N-[4-[2-[(6R)-2-아미노-1,4,5,6,7,8-헥사히드로-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-6-일]에틸]벤조일]-L-글루탐산 (Lometrexol) 및 N-[4-[1-[(2,4-디아미노-6-프테리디닐)메틸]프로필]벤조일]-L-글루탐산 (Edatrexate) 이 포함된다. 상기 폴레이트 구조 각각에서, 글루탐산 부분은 에테르지질의 헤드기에 상응하는 부분이고, 그에 따라 상기 폴레이트 구조 각각은 또한 헤드기에 상응하는 각종 글루탐산 유도체를 포함하는 구조를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바 용어 "펩티드"는 1 내지 30, 바람직하게 2 내지 20, 가장 바람직하게 3 내지 10 개의 아미노산으로 이루어진 올리고펩티드를 나타낸다. 펩티드는 전형적으로 그의 N-말단, C-말단 및/또는 그의 측쇄를 통해 에테르-지질의 헤드기 (즉, N-및/또는 Y-기) 에서의 반응 위치에 연결된다. 펩티드는 디술파이드 브릿지뿐 아니라 에스테르 연결을 포함할 수 있다. 더욱이, 펩티드는 N-말단, C-말단 및 측쇄에서 보호기를 지닐 수 있다. 용어 "아미노산"은 천연 발생 L-아미노산, D-아미노산, 합성 아미노산, 베타 아미노산 및 그의 상동체 (homologue) 를 포함한다. 본 출원에서 사용하기 위한 상기 정의된 바와 같은 바람직한 펩티드에는 예를 들어 하기가 포함된다: 세포-특이적 리간드 예컨대 RGD-펩티드, NGR-펩티드, ATWLPPR-펩티드, APRPG-펩티드, SMSIARL-펩티드, TAASGVRSMH-펩티드, LTLRWVGLMS-펩티드, CDSDSDITWDQLWDLMK-펩티드, GPLPLR-펩티드, HWGF-펩티드, 및 그 유도체 (이때, 펩티드의 지시는 단일의 문자 아미노산 코드로 제공됨), 바람직하게는 RGD 펩티드 (즉, 트리펩티드 아미노산 서열 아르기닌-글리신-아스파르트산 또는 Arg-Gly-Asp) 및 그 유도체. RGD 펩티드의 유도체는 RGD 펩티드를 포함하는 비(非)펩티드뿐 아니라 RGD 서열을 포함하는 펩티드를 포함하는, 펩티드에 대한 임의의 구조적 개질을 포함한다.
본원에서 이용된 바 "아자-펩티드"는 천연 발생 펩티드 구조에서 하나 이상의 탄소 원자에 대해 치환된 질소 원자를 갖는 펩티드 유도체를 지칭한다. 아자-펩티드는 sp3-하이브리드화 탄소 중 하나 이상에 대해, 바람직하게는 아미노산의 알파 위치에서 탄소 원자에 대해, 가장 바람직하게는 C-말단에서 아미노산의 알파 위치의 탄소 원자에 대해 치환된 질소 원자를 갖는, 전형적으로 1 내지 30 개, 바람직하게 2 내지 20 개, 가장 바람직하게 3 내지 10 개의 아미노산으로 이루어진다. 아자-펩티드는 그의 N-말단, C-말단을 통해 및/또는 그의 측쇄를 통해 에테르-지질의 헤드기 (즉, N- 및/또는 Y-기) 에서 반응성 위치에 연결된다. 아자-펩티드는 디술파이드 브릿지뿐 아니라 에스테르 연결을 포함할 수 있다. 더욱이, 아자-펩티드는 N-말단, C-말단, 및 측쇄에서 보호기를 가질 수 있다. 바람직한 아자-펩티드는 Cbz-알라닐알라닐-2-아자아스파라긴 (또한 RR11a 로 공지됨) 과 같은 2-아자아스파라긴의 유도체이다 (Ekici et al., 2004, J. Med. Chem. 47, 1889-1892; WO 2012/031175 A9).
기타 구현예에서, 표적화 작용제 또는 리간드는 또한 하나 이상의 블로킹 모이어티를 나타낼 수 있거나 또는 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바, 용어 "블로킹 모이어티"는 상보적 결합 모이어티의 활성, 자가-인지 및/또는 자가-어셈블리를 차폐, 차단, 은폐 및/또는 입체적 저해하는 모이어티를 지칭한다. 예를 들어, 블로킹 모이어티는 이것을 제거하는 경우, 원하는 조건 또는 시간 이전에 서로 상호작용하는 상보적인 결합 모이어티의 능력을 차단할 수 있다. 블로킹 모이어티는 중합체 실재물, 예컨대 폴락사민; 폴로옥사머; 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); 폴리(락트-co-글리콜산) (PLGA), 펩티드; 합성 중합체 등을 포함할 수 있다.
본원에서 이용된 바, "작용제" 또는 "리간드" 와 함께 사용되는 표현 "항원(성)" 은 그 자신 또는 이의 부분에 대항하는 면역 응답을 유발하는 화합물을 지칭한다. 용어 "면역 응답"은 면역 효과기 세포에 의한 항원 또는 그의 일부의 인지를 지칭한다. 이는 T 세포 공동-자극의 조절에 의해 영향받는 T 세포 매개 및/또는 B 세포 매개 면역 응답을 포함한다. 용어 면역 응답은 단핵구, 마이크로파아지, NK 세포 및 세포독성 T 림프구 (CTL), 예를 들어 CTL 라인, CTL 클론, 및 종양으로부터의 CTL, 염증 또는 침윤을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 면역 효과기 세포의 활성화 및 항체 생성 (체액 응답) 과 같은 T 세포 활성화에 의해 간접적으로 이루어지는 면역 응답을 추가로 포함한다. 특정 질환에 걸린 조직은 특이적 항원을 발현하고, 이들 항원에 대해 특이적인 CTL 이 동정된다. 예를 들어, 약 80% 의 흑색종은 gp-100 으로서 공지된 항원을 발현한다. 미생물 감염 및 발병 과정을 방지하고, 그에 따라 그 질병을 퇴치하는 가장 유효하고 바람직한 절차 중 하나는, 숙주 유기체에 항원 또는 면역원을 도입함으로써 질병의 개시 또는 실질적 감염 이전에 숙주 유기체 내 면역 응답 자극을 야기하는 백신이다.
당업자는 실질적인 임의의 생물학적 분자 (단백질, 펩티드, 지질, 지질단백질, 글리칸, 당단백질, 핵산 유도체, 예컨대 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 게놈 또는 재조합 DNA) 를 포함하는 임의의 거대분자가 항원으로서 역할할 수 있다는 점을 이해할 것이다. 항원은 화학적 또는 생물학적으로 합성될 수 있거나, 또는 재조합 또는 게놈 DNA 로부터 유래될 수 있거나, 또는 생물학적 샘플, 예컨대 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 유체로부터 유래될 수 있다. 항원은 이에 제한되는 것은 아니나, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균류 항원, 원충 및 기타 기생충 항원, 종양 항원, 면역 질환, 중독, 알레르기 및 이식 거부에 수반되는 항원, 및 기타 여러 종류의 항원을 포함할 수 있다. 항원의 대표예는 스트렙토코커스 종 (Streptoococcus species), 칸디다 (Candida) 종, 브루셀라 (Brucella) 종, 살모넬라 (Salmonella) 종, 시겔라 (Shigella) 종, 슈도모나스 (Pseudomonas) 종, 보르데텔라 (Bordetella) 종, 클로스티듐 (Clostridium) 종, 노르왈크바이러스 (Norwalkvirus), 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis), 마이크로박테리움 튜버큘로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 인간 면역결핍 바이러스 (human immunodeficiency virus; UV), 클라미디아 (Chlamydia) 종, 인간 유두종 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라믹소 바이러스 종, 헤르페스 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 바리셀라-조스터 바이러스, 엡스테인-바 바이러스, 간염 바이러스, 플라스모듐 (Plasmodium) 종, 트리초모나스 (Trichomonas) 종, 성적 접촉으로 전염된 질병 균 (agent), 바이러스 뇌염균, 원충 질병균, 진균류 질병균, 박테리아 질병균, 암 세포, 또는 그 혼합물을 포함하나 이에 제한되지 않는, 박테리아, 진균류, 원충 또는 바이러스 기원의 단백질 또는 펩티드일 수 있거나, 또는 이들 항원으로부터 유래된 단편일 수 있다.
대상체 면역화는 다가 전시물로서 많은 항원 카피를 이용함으로써 강화될 수 있고, 합텐-관련 크기 사안으로 인해 효과적인 면역 응답성 유발이 일반적으로 실패되고 투여하기에 곤란한 소형의 펩티드 또는 탄수화물과 같은 항원 리간드의 경우에서 바람직하다. 따라서, 본원에서 사용된 바, 용어 "다가"란, 1 초과의 카피 또는 타입의 항원의 담체 시스템 상 전시를 지칭한다.
본원에서 사용된 바 용어 "항원-제시 시스템" 또는 "항원 전시 시스템"은 (i) 하나 이상의 항원 (또는 그의 일부) 가 T 세포의 표면 상 T-세포 항원 수용체와 같은 면역 효과기 분자에 의해 인지 또는 결합될 수 있는 방식으로, 하나 이상의 항원 (또는 그의 일부) 를 제시할 수 있거나, 또는 (ii) 면역계의 특정 효과기 세포에 의해 인지가능한 항원-MHC 복합체의 형태로 하나 이상의 항원 (또는 그의 일부) 를 제시할 수 있고, 이로써 제시되는 항원 (또는 그의 일부)에 대항하는 효과적인 세포 면역 응답을 유도할 수 있는, 천연 발생 또는 합성 시스템을 지칭한다. 본 발명의 문맥에서, 용어 "인지된"이란, (i) 면역 효과기 세포에 의해 인지되고 결합되는 하나 이상의 항원성 리간드에 컨쥬게이션된 지질 화합물 (또는 그의 조성물 또는 제형물) (이때, 상기 결합은 효과적인 면역 반응을 개시시키는데 충분함) 또는 (ii) 상응하는 수용체에 의해 인지되고 결합되는 하나 이상의 표적화 리간드에 컨쥬게이션된 지질 화합물 (또는 그의 조성물 또는 제형물), 또는 (i) 와 (ii) 양자 모두의 조합물을 지칭한다. 표적화 또는 항원성 리간드가 수용체 또는 면역 효과기 세포에 의해 각각 인지되는지 여부를 결정하는 검정은 당업계에 공지되어 있으며 본원에 기재되어 있다.
본원에서 이용되는 바, "작용제" 또는 "리간드"와 함께 사용되는 용어 "치료적" 은 사실상 치료적인 시험관 내 및/또는 생체 내 생물학적 효과를 발휘할 수 있는 화합물을 지칭한다. 치료적 리간드는 중성 또는 양성 또는 음성 하전될 수 있다. 적합한 생활성제의 예에는 제약 및 약물, 합성 유기 분자, 단백질, 비타민, 스테로이드, siRNA, miRNA, 애쥬번트 (adjuvant) 및 유전 물질이 포함된다.
용어 "유전 물질"이란, 일반적으로, 데옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA) 를 비롯한, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 유전 물질은 당업자들에게 공지되어 있는 합성 화학 방법, 또는 재조합 기술을 이용함으로써, 또는 양자의 조합에 의해 제조될 수 있다. DNA 및 RNA 은 임의로는 비정상적 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. "유전 물질"은 또한 센스 및 안티-센스 DNA 및 RNA, 즉 DNA 및/또는 RNA 에서 뉴클레오티드의 특정 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "제약" 또는 "약물"이란, 환자의 질병 또는 손상의 예방, 진단, 경화, 처치 또는 치료에 사용되는 임의의 치료제 또는 예방제를 지칭한다. 지질 조성물 내에 내입 또는 내장되거나, 또는 본 발명의 지질 조성물의 표면 상에 부착 또는 흡착되는 생활성제는 물리화학적 특성, 분자 크기 또는 공급 기원 측면에서 임의의 특정 부류의 생물학적으로 활성인 물질, 즉 합성, 바이오테크니컬 물질 등에 제한되지 않는다는 점이 이해된다. 따라서, 제약은 예를 들어 하기의 치료적 부류 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다: 진통제, 마취제, 항-알츠하이머, 항-천식 작용제, 항-파킨슨병제, 항알레르기제, 항협심증제, 항부정맥제, 항관절염제, 천식약, 항바이러스약, 항생제, 항암제, 항응고제, 항우울제, 항당뇨병제, 구토방지제, 항간질제, 항진균제, 항녹내장제, 항통풍제, 항히스타민, 항고프로락틴혈증제, 항고혈압제, 항염증제, 항편두통제, 항-신생물제, 항비만제, 항기생충제, 항원충제, 항열병제, 항건선제, 항정신병제, 항혈전제, 항궤양제, 항바이러스제, 항불안제, 양성의 전립선비대증제, 기관지 확장제, 칼슘 대사, 강심제, 심혈관제, 킬레이터 및 해독제, 화학예방제, 피임제, 이뇨제, 도파민제, 위장약, 위장촉진제 (gastroprokinetic), 조혈제, 혈우병, 호르몬, 호르몬 대체 치료요법, 최면제, 저콜레스테롤제, 저지질혈제, 면역조절제, 면역자극제, 면역억제제, 지질 조절제, 남성의 성 기능 장애, 다발성 경화증, 근육 이완제, 신경이완제, 향정신제, 골다공증제, 식물성에스테로겐제, 혈소판 응고 저해제, 프로스타글란딘, 방사선치료용 방사능강화제 (radioenhencer), 이완 및 자극제, 호흡곤란증후군, 요실금제, 혈관확장신경제, 비타민/영양, 상처치료제 및 잔틴. 이들 부류에 속하는 활성제가 앞서 언급된 조성물 내에 이용될 수 있다.
본원에서 이용된 바, "작용제" 또는 "리간드"와 함께 이용되는 표현 "진단적"이란, 환자에게서 질병의 유무를 진단할 수 있는 화합물을 지칭한다. 진단제는 중성이거나 또는 양성 또는 음성 하전될 수 있다. 적합한 진단제의 예에는 합성 유기 분자 및 중금속 착물, 예컨대 환자의 자기 공명 영상, 초음파 또는 컴퓨터화 단층촬영과 함께 이용되는 콘트라스트 작용제이다.
본 발명의 담체 시스템과 함께 이용하기 위한 항원성 또는 치료적 또는 진단적 리간드 또는 작용제의 선택은 검정되고/되거나 치료될 질병, 병태 또는 감염의 성질에 의해 결정될 것이다.
본 발명의 상기 및 더 많은 측면들은 하기 문단에서 개시된다.
A. 지질-리간드 컨쥬게이트
본원에서 이용된 바 용어 "지질-리간드 컨쥬게이트"는 헤드기에서 선형, 2작용성 아미노산, 더욱 특히 2-아미노-알칸디오산 (6 이하의 탄소 원자), 예컨대 아스파르트산, 글루탐산 등을 포함하고, 헤드기의 커플링 부위에서 하나 이상의 생활성 리간드와 컨쥬게이션되어 "지질-리간드 컨쥬게이트"를 형성하는 본 발명의 화합물을 지칭한다. 본원에서 이용된 바, 용어 "에테르-지질 (화합물)" 또는 "지질 (화합물)" 은 전구체, 즉 하나 이상의 생활성 리간드와 컨쥬게이션되기 이전의 상응하는 지질을 지칭한다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 하기 식 I 에 따른 지질-리간드 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure pat00003
[식 중,
Y 는 O, N, S 또는 공유 결합을 나타내고,
S1, S2, S3 는 서로 독립적으로 공유 결합 또는 스페이서기를 나타내고,
X1, X2, X3 는 서로 독립적으로 H 또는 리간드기를 나타내고,
L 은 하기 식 (a) 의 기를 나타내고:
Figure pat00004
식 중, 대시선은 N 과의 결합을 나타내고,
R1 은 H 또는 식 -(CH2)2-ORb1 의 기를 나타내고,
R1'은 H 또는 식 -(CH2)2-ORb2 의 기를 나타내고,
R2 은 H 또는 식 -CH2-ORc 의 기를 나타내고,
R2'은 H 또는 식 -ORd 또는 -CH2-ORd 의 기를 나타내고,
R3 은 H 또는 식 -(CH2)2-ORe 또는 -(CH2)3-ORe 의 기를 나타내고,
Ra, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re 는 서로 독립적으로 포화 또는 불포화, 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 나타내고,
m 은 1, 2 또는 3 이고,
단, R1, R1', R2, R2', R3 중 하나 이상은 H 가 아니고, X1, X2, X3 중 하나 이상은 리간드기임].
본원에서 이용된 바, 2 개 이상의 모이어티와 관련해 이용시, 용어 "컨쥬게이션된" (또는 "컨쥬게이션"), "연결된", "부착된" 은 공유 결합 (직접적으로 또는 스페이서를 통함) 에 의한 2 개 이상의 모이어티의 물리적 연합을 지칭한다.
비유도체화된 (지질) 화합물 (여기서, 헤드기 (즉, N- 및 Y-기) 가 리간드기를 갖는 것이 아닌 자유 형태, 보호화 형태, 또는 활성화 형태임) 뿐 아니라 유도체화 (지질) 화합물 (여기서, 헤드기 (즉, N-및 Y-기) 이 하나 이상의 스페이서기로 유도체화됨) 을 포함하는 상응하는 (에테르-)지질 화합물은 본원에 그 전문이 통합되어 있는 동시 제출된 출원의 일부이다.
I 의 화합물의 제 1 구현예에서, 기 R3 은 H 이다. 더욱 특히, (i) R3 은 H 이고, R1 및 R1'은 H 이거나, 또는 (ii) R3 는 H 이고 R2 및 R2'은 H 이다.
즉, 제 1 구현예에서, 본 발명은 하기 식 Ia 의 화합물에 관한 것이다:
Figure pat00005
[식 중, L 은 식 (a) 의 기이고:
Figure pat00006
식 중, S1, S2, S3, X1, X2, X3, Y, R1, R1', R2, R2', Ra, 및 m 은 상기 식 I 의 화합물에 대해 상기에 정의된 바와 같음].
더욱 특히, 본 발명은,
L 이 식 (b) 또는 (c) 의 기이고:
Figure pat00007
[식 중, R1, R1', R2, R2', Ra 은 상기에서와 같이 정의됨],
단, 식 (b) 에서, R2 및 R2' 중 하나는 H 가 아니고, 식 (c) 에서 R1 및 R1' 중 하나는 H 가 아니고, X1, X2, X3 중 하나 이상은 리간드기인
식 Ia 의 화합물에 관한 것이다.
기 (b) 의 한 바람직한 구현예에서, R2 는 H 이고 R2'는 -ORd 또는 -CH2-ORd 이다. 기 (b) 의 또 다른 바람직한 구현예에서, R2 는 -CH2-ORc 이고, R2' 는 -ORd 이거나, 또는 R2' 는 -CH2-ORd 이다.
따라서, 본 발명은 바람직하게 L 이 식 (b1), (b2), (b3) 또는 (b4) 의 기인 화합물에 관한 것이다:
Figure pat00008
[식 중, S1, S2, S3, X1, X2, X3, Y, m, Ra, Rc, Rd 은 상기에서와 같이 정의됨].
기 (c) 의 하나의 바람직한 구현예에서, R1 및 R1' 중 하나는 H 이다. 기 (c) 의 또 다른 바람직한 구현예에서, R1 및 R1' 모두 H 가 아니다.
따라서, 본 발명은 바람직하게 또한 L 이 식 (c1) 또는 (c2) 의 기인 화합물에 관한 것이다:
Figure pat00009
[식 중, S1, S2, S3, X1, X2, X3, Y, m, Ra, Rb1, Rb2 는 상기에서와 같이 정의됨].
제 2 구현예에서, R1, R1', R2, R2' 은 H 이고, R3 은 -(CH2)2-ORe 또는 -(CH2)3-ORe 의 기이다.
따라서, 제 2 구현예에서, 본 발명은 식 Ib 의 화합물에 관한 것이다:
Figure pat00010
[식 중, R3 은 식 -(CH2)2-ORe 또는 -(CH2)3-ORe 의 기이고,
S1, S2, S3, X1, X2, X3, Y, Ra, Re 및 m 은 상기와 같이 정의됨].
본 발명의 가장 바람직한 구현예는 이에 따라 식 II 또는 III 의 화합물인 식 I 의 화합물이다.
Figure pat00011
[식 중,
Y 는 O, N, S 또는 공유 결합을 나타내고,
S1, S2, S3 는 서로 독립적으로 공유 결합 또는 스페이서 기를 나타내고,
X1, X2, X3 는 서로 독립적으로 H 또는 리간드기를 나타내고,
R1 은 H 또는 식 -(CH2)2-ORb1 의 기를 나타내고,
R1' 은 H 또는 식 -(CH2)2-ORb2 의 기를 나타내고,
R2 은 H 또는 식 -CH2-ORc 의 기를 나타내고,
R2' 은 H 또는 식 -ORd 또는 -CH2-ORd 의 기를 나타내고,
Ra, Rb1, Rb2, Rc, Rd 은 서로 독립적으로 포화 또는 불포화, 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 나타내고,
m 은 1, 2 또는 3 이고,
단, (i) 식 II 에서, R2 및 R2' 중 하나는 H 이 아니고, 식 III 에서, R1 및 R1' 중 하나는 H 가 아니고, (ii) X1, X2, X3 중 하나 이상은 리간드기임].
식 II 의 화합물의 더욱 특정한 구현예는 하기 식 IIa, IIb, IIc 또는 IId 의 화합물이다:
Figure pat00012
[식 중, S1, S2, S3, X1, X2, X3, Y, Ra, Rc, Rd 및 m 은 식 II 의 화합물에 대한 상기에서와 같이 정의됨].
식 III 의 화합물의 보다 특정 구현예는 식 IIIa 또는 IIIb 의 화합물이다:
Figure pat00013
[식 중, S1, S2, S3, X1, X2, X3, Y, Ra, Rb1, Rb2 및 m 은 식 III 의 화합물에 대한 상기에서와 같이 정의됨].
식 I 의 화합물의 기타 가장 바람직한 구현예는 식 IVa 및 IVb 의 화합물이다:
Figure pat00014
Figure pat00015
[식 중,
Y 는 O, N, S 또는 공유 결합을 나타내고,
S1, S2, S3 는 서로 독립적으로 공유 결합 또는 스페이서기를 나타내고,
X1, X2, X3 는 서로 독립적으로 H 또는 리간드기를 나타내고,
Ra, Re 는 서로 독립적으로 포화 또는 불포화, 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 나타내고,
m 은 1, 2 또는 3 이고,
단, X1, X2, X3 중 하나 이상은 리간드기임].
당업자는 본 발명의 리간드-지질 (또는 본 발명의 화합물) 이 하나 이상의 키랄 중심 및/또는 이중 결합을 포함할 수 있고, 따라서 이중-결합 이성질체 (즉, 기하 이성질체, 예, Z/E 이성질체 또는 시스/트랜스 이성질체), 거울상 이성질체 또는 부분입체이성질체와 같은 입체이성질체로서 존재할 수 있다는 점을 인지할 것이다. 그에 따라, 키랄 중심에서 입체화학이 명기되지 않은 경우, 본원에서 도시된 화학 구조는 입체이성질체적으로 순수한 형태 (예, 기하학적 순수, 거울상 순수 또는 부분입체적 순수), 풍부 형태 (예, 기하학적 풍부, 거울상 풍부 또는 부분입체적 풍부) 및 거울상 및 입체이성질체 혼합물을 포함한 이들 키랄 중심에서 모든 가능한 구조를 포함한다. 각 이성질체는 해당하는 출발 물질의 이성질체 형태를 이용해 수득될 수 있다. 대안적으로, 거울상 및 입체이성질체 혼합물은 그들의 성분인 거울상체 또는 입체이성질체로 분리 기술 또는 키랄 합성 기술뿐 아니라 당업자에게 공지된 기술을 이용해 분할할 수 있다. 본원에서 기재된 본 발명의 화합물은 에놀 형태, 케토 형태 및 그의 혼합물을 포함하는 몇몇의 호변이성질체 형태로 존재할 수 있다. 따라서, 본원에서 묘사된 구조는 예시된 화합물의 모든 가능한 호변이성질체 형태를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "포화 또는 불포화, 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬"은 6 내지 30 개, 바람직하게 10 내지 22 개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화, 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 지칭한다.
탄화수소 사슬과 조합되는 용어 "포화"는 6 내지 30 개, 바람직하게 10 내지 22 개의 탄소 원자를 포함하는, 직쇄 또는 분지형 알킬 사슬을 지칭한다. 그 예는 이에 제한되는 것은 아니나, 카프릴 (데실), 운데실, 라우릴 (도데데실), 미리스틸 (테트라데실), 세틸 (헥사데실), 스테아릴 (옥타데실), 노나데실, 아라키딜 (에이코실), 헤네이코실, 베헤닐 (도코실), 트리코실, 테트라코실, 펜타코실, 그 분지형 이성질체, 예를 들어, 이소라우릴, 안테이소라우릴, 이소미리스틸, 안테이소미리스틸, 이소팔미틸, 안테이소팔미틸, 이소스테아릴, 안테이소스테아릴 또는 피타닐 (3,7,11,15-테트라메틸-헥사데카닐) 을 포함한다.
탄화수소 사슬과 조합된 용어 "불포화"는 수소 원자의 최대 가능한 개수 미만이 사슬 내 각 탄소에 결합되어, 하나 이상의 탄소-탄소 이중 또는 3중 결합을 야기하는 것을 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 불포화 탄화수소 사슬 내 불포화 결합(들)의 개수는 1, 2, 3 또는 4, 바람직하게 1 또는 2 이다.
알케닐기의 예는 이에 제한되는 것은 아니나, 모노불포화 알케닐, 예컨대 데세닐, 운데세닐, 도데세닐, 팔미톨레일, 헵타데세닐, 옥타데세닐 (엘라이딜, 올레일, 리시놀레닐), 노나데세닐, 에이코세닐, 헤네이코세닐, 도코세닐 (에루실), 트리코세닐, 테트라코세닐, 펜타코세닐, 및 그 분지형 사슬 이성질체뿐 아니라 다불포화 알케닐, 예컨대 옥타데크-9,12-디에닐 (리놀레일, 엘라이도리놀레일), 옥타데크-9,12,15-트리에닐 (리놀레닐, 엘라이도리놀레닐), 9(Z),11(E),13(E)-옥타데카트리에닐 (엘레오스테아릴), 및 에이코스-5,8,ll,14-테트라에닐이 포함된다.
알키닐기의 예는 이에 제한되는 것은 아니나 헥사데크-7-이닐 및 옥타데크-9-이닐이 포함된다.
탄화수소와 조합된 용어 "분지형"은 부차적인 사슬로서 하나 이상의 탄소 원자의 하나 이상의 치환기 (또는 분지기) 와 주 사슬로서 선형 시리즈의 탄소 원자들을 갖는 탄화수소 사슬을 지칭한다. 부차적인 사슬의 예는 하나 이상의 (C1-6)알킬기, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸기, tert-부틸, 펜틸, 헥실 등, 하나 이상의 (C1-6)알케닐기, 예컨대 비닐, 알릴, 프로페닐, 이소프로페닐, 2-부테닐 등, 또는 하나 이상의 (C1-6)알키닐기, 예컨대 에티닐, 프로피닐, 부티닐 등을 포함한다. 바람직한 부차적인 사슬은 (C1-6)알킬기이고, 가장 바람직한 것은 메틸 및 에틸이다.
본 발명의 화합물은 바람직하게 2 개 이상의 탄화수소 사슬, 바람직하게, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개의 탄화수소 사슬, 가장 바람직하게 2 또는 3 개의 탄화수소 사슬을 포함하고, 이때 탄화수소 사슬의 주 사슬은 동일 또는 상이하고, 바람직하게 동일하고, 알킬 사슬, 알케닐 사슬 및 알키닐 사슬로부터 선택되고, 바람직하게 알킬 및 알케닐 사슬로부터 선택된다. 하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 화합물은 2 개의 알킬 사슬을 보유하고, 이는 상동 또는 상이할 수 있고, 바람직하게 상동이다.
본 발명의 화합물의 특정 구현예에서, 탄화수소 사슬 Ra, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re 은 바람직하게 미리스틸, 팔미틸, 스테아릴, 올레일, 리놀레일 및 피타노일로부터 선택된다.
본원에서 이용된 바 용어 "알킬", "알콕시", "알케닐", "알키닐"은 하기의 의미를 가진다:
용어 "알킬"은 1 내지 12 개, 바람직하게 1 내지 8 개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지형 알킬 사슬을 지칭한다. 알킬기의 예는 이에 제한되는 것은 아니나, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸, 및 t-부틸을 포함한다. 용어 "알콕시"는 -O-알킬 라디칼을 지칭한다. 알콕시기의 예는 이에 제한되는 것은 아니나, 메톡시, 에톡시 및 부톡시를 포함한다. 용어 "알케닐" 은 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지형 불포화 알킬기를 지칭한다. 상기 알킬, 알케닐 및 알콕시기는 추가 기들로 임의 치환될 수 있다. 치환기의 예는 이에 제한되는 것은 아니나 하기가 포함된다: 할로, 히드록실, 아미노, 시아노, 니트로, 메르캅토, 알콕시카르보닐, 아미도, 카르복시, 알킬술포닐, 알킬카르보닐, 카르바미도, 카르바밀, 카르복실, 티오우레이도, 티오시아나토, 술폰아미도, 아릴, 헤테로아릴, 시클릴, 및 헤테로시클릴.
용어 "아릴"은 약 6 내지 약 10, 바람직하게 5 내지 7 개의 탄소 원자를 포함하는 방향족 카르보시클릭 라디칼을 지칭한다. 아릴기는 상동 또는 상이할 수 있는 하나 이상의 아릴기 치환기로 임의 치환될 수 있고, 이때 "아릴기 치환기"는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 아르알콕시, 카르복시, 아로일, 할로, 니트로, 트리할로메틸, 시아노, 알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, 아르알콕시카르보닐, 아실옥시, 아실아미노, 아로일아미노, 카르바모일, 알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 아릴티오, 알킬티오, 알킬렌 및 -NRR' (식 중, R 및 R' 은 각각 독립적으로 수소, 알킬, 아릴 및 아르알킬임) 을 포함한다. 예의 아릴기는 치환 또는 비치환된 페닐, 나프틸, 피레닐, 안트릴, 및 페난트릴을 포함한다.
용어 "헤테로아릴"은 하나 이상의 헤테로원자 (예, N, O, 또는 S) 을 갖는 상기 정의된 바와 같은 아릴 모이어티를 지칭한다. 헤테로아릴 모이어티의 예는 푸릴, 푸릴렌, 플루오레닐, 피롤릴, 티에닐, 옥사졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 피리딜, 피리미디닐, 퀴나졸리닐, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴 및 인돌릴을 포함한다. 용어 "(헤테로)아릴옥시"는, (헤테로)아릴-O-기를 지칭하고, 이때 (헤테로)아릴기는 앞서 기술한 바와 같다. 예의 아릴옥시기는 페녹시 및 나프톡시를 포함한다. 용어 "(헤테로)아르알킬"은 (헤테로)아릴-알킬-기를 지칭하고, 이때 (헤테로)아릴 및 알킬은 앞서 기술한 바와 같다. 예의 아르알킬기는 벤질, 페닐에틸 및 나프틸메틸을 포함한다. 용어 "(헤테로)아르알킬옥시"는 (헤테로)아르알킬-O-기를 지칭하고, 이때 (헤테로)아르알킬기는 앞서 기재한 바와 같다. 예의 아르알킬옥시기는 벤질옥시이다.
용어 "시클로알킬" 은 시클로헥실 또는 시클로헥센-3-일과 같은 6 내지 10 개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화, 비(非)방향족, 시클로 탄화수소 모이어티를 지칭한다. 용어 "헤테로시클로알킬"은, 4-테트라히드로피라닐 또는 4-피라닐과 같은 하나 이상의 고리 헤테로원자 (예, N, O, 또는 S) 를 갖는 본원에서 정의된 바와 같은 시클로알킬을 지칭한다.
본원에서 기재된 바, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬은 달리 명기되지 않는 한 치환 및 비치환된 모이어티를 포함한다. 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 및 헤테로아릴 상 가능한 치환기는 하기를 포함한다: (C1-C10)알킬, (C2-C10)알케닐, (C2-C10)알키닐, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C1-C10)알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 아미노, (C1-C10)알킬아미노, (C1-C20)디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노, 히드록실, 할로겐, 티오, (C1-C10)알킬티오, 아릴티오, (C1-C10)알킬술포닐, 아릴술포닐, 아실아미노, 아미노아실, 아미디노, 구아니딘, 우레이도, 시아노, 니트로, 아실, 아실옥시, 카르복실, 및 카르복실 에스테르. 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 및 헤테로아릴은 또한 서로 융합될 수 있다.
기 Y 는 O, N, S 또는 공유 결합, 바람직하게 O 또는 N, 가장 바람직하게 N 이다. 기 Y 가 공유 결합인 경우, -S1-X1 은 직접 CO-기에 연결되는 것으로 이해된다.
본원에서 사용된 바 용어 "스페이서" 또는 "스페이서기" (또는 기 S1, S2, S3) 는 에테르-지질과 리간드간의 임의의 원하지 않은 상호 작용을 제거하고 및/또는 리간드의 생물학적 활성 (예, 리간드의 그의 표적과의 친화도 결합) 에 영향을 미칠 수 있는 임의의 입체 장애 (에테르-지질 그 자체에 의하거나 또는 임의의 기타 이웃하는 분자들에 의해 초래됨) 를 감소시키기에 충분한 거리에서 하나 이상의 생활성 리간드 X1, X2, X3 와 본 발명의 에테르-지질을 연결 허용하는 2가 분지형 또는 비분지형 화학적기를 지칭한다. 생활성 리간드 및 에테르-지질의 컨쥬게이트의 목적 용도에 따라, 스페이서기는 상이한 길이일 수 있고 (가수분해적, 효소적 및 화학적) 안정적일 수 있거나 또는 절단가능한 결합을 포함할 수 있다. 본 발명의 절단가능한 결합은 예를 들어 화학적, 효소적, 가수분해적 등과 같이 임의 형태의 절단가능한 화학을 통해 절단되도록 선택될 수 있다. 예의 절단가능한 링커에는 이에 제한되는 것은 아니나 하기가 포함된다: 프로테아제 절단가능성 펩티드 링커, 뉴클레아제 민감성 핵산 링커, 리파아제 민감성 지질 링커, 글리코시다아제 민감성 탄수화물 링커, pH 민감성 링커, 저산소증 민감성 링커, 광 (photo-)- 절단성 링커, 열-불안정성 링커, 효소 절단가능 링커, 초음파-민감성 링커, x-선 절단성 링커 등.
스페이서는 생활성기와 같은 추가의 모이어티에 대한 본 발명의 스페이서 개질된 화합물의 결합을 허용하도록 말단기 활성화될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다는 점은 자명하다.
특정 구현예에서, "스페이서기" (또는 기 S1, S2, S3) 는 케톤, 에스테르, 에테르, 아미노, 아미드, 아미딘, 이미드, 카르바메이트 또는 티오카르바메이트 작용기, 글리세롤, 우레아, 티오우레이, 이중 결합 또는 방향족 고리로부터 선택되는 군 중 하나 이상을 임의 포함하는 알킬렌 사슬로부터 선택되는 단쇄 스페이서 기 또는 장쇄 스페이서기를 나타낸다.
더욱 구체적으로, 단쇄 스페이서기 (또는 기 S1, S2, S3) 는 (C1-C12)알킬, (C2-C12)알케닐, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴로부터 선택될 수 있다.
장쇄 스페이서기 (또는 기 S1, S2, S3) 는 식 -W-(CH2-)k-W'- 의 중합체 라디칼로부터 선택될 수 있고, 이때 k 는 정수 13 내지 3000 이고, W 및 W' 은 아미노, 카르복실, 히드록시 또는 티오기와 반응가능한 반응성기이고, 이때 비인접 CH2 기 중 하나 이상이 독립적으로 아릴, 헤테로아릴, -CH=CH-, -C≡C-, 또는 -O-, -CO-, -CO-O-,-O-CO-, -NR'-, -NR'-CO-, -CO-NR'-, -NR'-CO-O-, -O-CO-NR'-, -NR'-CO-NR'-, 및 -O-CO-O- 로부터 선택되는 친수성 (또는 극성) 기 (이때, R' 은 수소 또는 (C1-C12)알킬을 나타냄) 에 의해 대체될 수 있다. 동일한 기에 의해 하나 초과의 비인접 CH2 기를 대체하면, 특정 반복 단위 (예, 폴리에스테르, 폴리에테르, 폴리아미드 등) 을 가진 중합체 사슬이 수득될 수 있음이 자명하다.
바람직한 스페이서기는 친수성 중합체 라디칼 (수성 용액에 대해 친화도가 증가함), 즉 그의 알킬렌 백본에서 상기 친수성 (또는 극성) 기 중 하나 이상을 포함하는 반복 구조 단위를 포함하는 중합체를 포함한다. 친수성 중합체 라디칼의 전형적인 예에는 하기가 포함된다: 폴리옥시(C2-C3)알킬렌 (예, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜 (PPG)), 다당류 (예, 덱스트란, 풀루란, 키토산, 히알루론산), 폴리아미드 (예, 폴리아미노산, 반합성 펩티드 및 폴리뉴클레오티드); 폴리시알산, 폴리에스테르 (예, 폴리락티드 (PLA), 폴리락티드-co-글리콜리드 (PLGA)), 폴리카르보네이트, 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리이미드 폴리비닐 아세테이트 (PVA).
바람직한 스페이서는 임의의 수용성 폴리(에틸렌 옥시드) 를 포함하는 "PEG" 또는 "폴리에틸렌 글리콜" 이다. 전형적으로, "PEG" 는 대다수의, 예를 들어 > 50% 의 -CH2CH2O- 인 서브유닛을 포함하는 중합체를 의미한다. 상이한 형태의 PEG 는 분자량, 구조 또는 기학형태 (예, 분지형, 선형, 포크형 PEG, 다작용, 등) 에서 차이를 보일 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 PEG 는 바람직하게 2 개의 하기 구조 중 하나를 포함할 수 있다: "-O(CH2CH2O)m-" 또는 "-CH2CH2O(CH2CH2O)m-CH2CH2-" (식 중, m 은 3 내지 3000 이고, 말단기 및 전체 PEG 의 구조는 가변적일 수 있음). 상기 지시된 바와 같이, PEG 는 그 용도에 따라 말단-캡핑 (capping) 형일 수 있다. PEG 가 "-O(CH2CH2O)m-" 로서 정의되는 경우, 말단 캡핑기는 전형적으로 1 내지 20 개의 탄소로 이루어진 탄소-포함기가 일반적이고, 바람직하게 알킬 (예, 메틸, 에틸 또는 벤질) 이나, 그의 포화 및 불포화 형태뿐 아니라 아릴, 헤테로아릴, 시클릴, 헤테로시클릴, 및 치환 형태의 임의의 앞서 언급된 기 또한 상상된다. PEG 가 "-CH2CH2O(CH2CH2O)m-CH2CH2-" 로서 정의되는 경우, 말단 캡핑기는 PEG 의 한쪽 말단과의 공유 결합에 이용가능하고 상기 기에 공유 결합된 산소 원자 및 1 내지 20 개의 탄소 원자로 전형적으로 이루어진 탄소-포함기가 일반적이다. 이 경우, 상기 기는 전형적으로 알콕시 (예, 메톡시, 에톡시 또는 벤질옥시) 이고, 탄소-포함기 뿐 아니라, 아릴, 헤테로아릴, 시클릴, 헤테로시클릴 및 치환 형태의 임의의 앞서의 것과 관련해서, 임의로는 포화 및 불포화될 수 있다. 기타 ("비(非)-말단 캡핑") 말단은 전형적으로 PEG 가 "-CH2CH2O(CH2CH2O)m-CH2CH2-" 로서 정의되는 경우 추가 화학적 개질에 적용될 수 있는 활성화기, 히드록실, 또는 아민이다. 추가적으로, 말단-캡핑기는 또한 실란일 수 있다.
각종 말단-기 작용화 또는 활성화 PEG 에 대한 논문이 당업계에 공지되어 있다 (예, Zalipsky S., Bioconjug. Chem., 6, 150-165 (1995) 참조).
에테르-지질 (즉, X1, X2, X3 이 H 인 식 I 의 화합물) 과의 생활성 리간드 (X1 및/또는 X2 및/또는 X3) 의 컨쥬게이션 방법에는, 하나 이상의 생활성 리간드 X1, X2, X3 의, 하나 이상의 각 에테르-지질의 헤드기 (즉, N- 및/또는 Y-기) 에서의 각 위치 중 하나 이상과의 공유 결합을 포함한다. 따라서, 하나의 생활성 리간드는 하나 초과의 각 에테르-지질의 하나 이상의 부위에, 또는 하나의 각 에테르-지질의 하나 이상의 부위에 부착될 수 있다. 대안적으로, 2 또는 3 개의 생활성 리간드가 하나의 각 에테르-지질의 커플링 부위에 부착된다. 1 이상의 생활성 기는 직접적으로 에테르-지질에 또는 스페이서기를 통해 부착될 수 있다.
전형적으로, 결합 방법은 일반적으로 하기 단계를 포함할 수 있다:
a) X1, X2, X3 이 H 인, 기 S1, S2, S3, 중 하나 이상에서 하나 이상의 커플링 부위를 갖는 식 I 의 지질 화합물을 제공,
b) 하나 이상의 커플링 부위와 반응하기에 적합한 반응성기를 갖는 항원 리간드를 제공, 및
c) 리간드-지질 컨쥬게이트를 수득하도록 항원과 지질 화합물의 반응.
본원에서 이용된 바, 용어 "커플링 부위" 또는 "커플링기"는 공유 결합 (C-C, C-O, C-N, C-S-결합) 을 형성하도록 커플링 반응에서 상응하는 반응성 또는 작용성기 (또는 2 개의 커플링 파트너) 와 반응 가능한 반응성 또는 작용성기를 지칭한다.
컨쥬게이션 (또는 커플링) 방법의 선택은 각종 인자, 예컨대 부착될 생활성 리간드의 성질, 즉, 물리적 속성 (예, 크기, 전하 등), 생활성 리간드에 존재하는 반응성기의 성질 등에 좌우된다.
일부 구현예에서, 컨쥬게이션은 2작용성제 (즉, 2 개의 작용성 (말단)기를 갖는 작용제), 바람직하게는 헤테로2작용성제 (즉, 2 개의 상이한 작용성 (말단)기를 갖는 작용제) 의 존재 하에서 실시된다. 이러한 (헤테로)2작용제의 사용으로, 지질-리간드 컨쥬게이트가 도모되고, 이때 지질 및 리간드는 직접 서로 연결될 수 있거나 또는 스페이서에 의해 분리될 수 있다. 전형적인 작용성기는 이에 제한되는 것은 아니나, 숙신이미딜 에스테르, 말레이미드 및 피리딜디술파이드와 같은 기를 포함한다. 일부 구현예에서, 2작용성제는 이에 제한되는 것은 아니나 예를 들어 하기로부터 선택된다: 카르보디이미드, N-히드록시숙신이미딜-4-아지도살리실산 (NHS-ASA), 디메틸 피멜이미데이트 디히드로클로라이드 (DMP), 디메틸수버이미데이트 (DMS), 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트 (DTBP), N-숙신이미딜 3-[2-피리딜디티오]-프로피온아미도 (SPDP), 숙신이미딜 α-메틸부타노에이트, 비오틴아미도헥사노닐-6-아미노-헥산산 N-히드록시-숙신이미드 에스테르 (SMCC), 숙신이미딜-[(N-말레이미도프로피온아미도)-도데카에틸렌글리콜]에스테르 (NH S-PEO12), N-숙신이미딜 (4-요오도아세틸) 아미노벤조에이트 (SIAB), N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트 (SATA), m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (MBS) 및 N-감마-말레이미도부티릴옥시-숙신이미드 에스테르 (GMBS), 숙신미딜 디카르보닐 펜탄 또는 디숙신이미딜 수베레이트. 기타 구현예에서, 2작용성제는 SPDP 와 조합된 Traut 시약 2-이미노티올란이다. 또한 추가의 구현예에서, 2작용성제는 본원에서 모두 참조로 삽입되어 있는 The Pierce Products Catalogue (Pierce Chemical Company, USA) 및 Double Agents™Cross-Linking Reagents Selection Guide (Pierce Chemical Company) 에 기재된 것들 중에서 선택된다.
바람직한 컨쥬게이션 방법은 카르보디이미드-매개 아미드 형성 및 활성 에스테르 말레이미드-매개 아민 및 술프히드릴 커플링 등을 포함한다.
예를 들어, 티올-함유 분자는, 헤테로2작용성 교차-결합 시약, 예를 들어 숙신이미딜 에스테르와, 말레이미드, 피리딜디술파이드 또는 요오도아세트아미드 중 하나를 포함하는 시약을 이용해 아민-함유 분자와 반응할 수 있다. 아민-카르복실산 및 티올-카르복실산 교차-결합, 말레이미드-술프히드릴 커플링 화학 (예, 말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (MBS) 방법), 등이 이용될 수 있다.
폴리펩티드는 편리하게 리신 또는 시스테인 사슬 각각에서 아민 또는 티올기를 통해 또는 N-말단 아미노기에 의해 에테르지질에 컨쥬게이션될 수 있다. 마찬가지로, 올리고뉴클레오티드는 편리하게도 예를 들어 술프히드릴, 아미노, 포스페이트기 등과 같이 3' 또는 5' 말단 상 독특한 반응성기를 통해, 에테르 지질에 컨쥬게이션될 수 있다. 반응성 술프히드릴기는 (i) 지질과 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이에 절단가능 디술파이드 결합을 도모하는, N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 및 장쇄 SPDP (lc-SPDP), 또는 (ii) 지질과 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이의 비절단가능 결합을 만드는 숙신이미딜-요오도아세테이트와 같은, 시약 사용을 통해 자유 아미노기 (예, 기 N 및 Y) 를 가진 식 I 의 지질에 커플링될 수 있다. 이들 및 기타 컨쥬게이션 기술은 당업계에 공지되어 있다 (예, U.S. Pat. No. 5,512,439; WO 01/22995; Greg Hernanson "Bioconjugate Techniques," Academic Press, 1996; Gordon Bickerstaff "Immobilization of Enzymes and Cells," Humana Press, 1997 참조).
당업자는 상기 기술된 컨쥬게이션 방법에 따라 생활성 리간드와 컨쥬게이션을 허용하도록 선택될, 식 I 의 에테르-지질의 헤드기의 스페이서기 S1, S2, S3 상의 작용기 또는 작용기들 (예, 아민, 카르보닐 또는 카르복실기) 를 알 것이다.
추가적인 컨쥬게이션 방법에 대한 일반 정보는 예를 들어 1994-95 Pierce Catalog, 및 이에 인용된 문헌에서 본래 간행되고, Pierce 웹 사이트에서 이용가능한 "Cross-Linking", Pierce Chemical Technical Library; Wong SS, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press Publishers, Boca Raton, 1991; and Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, Inc., San 디ego, 1996 에서 찾아볼 수 있다. 식 I 의 에테르-지질 화합물에 대해 하나 이상의 리간드를 컨쥬게이션하는데 사용되는 몰비는 당업자에 의해 용이하게 최적화될 수 있다. 전형적으로, 이것은 약 1:1 내지 약 10:1 지질 화합물 대 리간드 범위일 수 있다.
상기 제시된 일반적인 방법에서, 임의의 적합한 방법이 중간체 컨쥬게이션된 화합물을, 예컨대 제조용 역상 HPLC (RP-HPLC), 막 여과, 예컨대 한외여과 또는 디아필트레이션으로써 정제하는데 사용될 수 있다. 미반응된 반응물은 크기 배제 크로마토그래피, 예컨대 겔 여과, 평형 투석에 의해 제거될 수 있다. 최종 컨쥬게이트는 또한 예를 들어 겔 여과, 막 여과, 예컨대 한외여과 또는 이온 교환 크로카토그래피 또는 그 조합을 포함해 임의의 적합한 수단을 이용해 정제될 수 있다.
본 발명의 지질-리간드 컨쥬게이트는 리포솜, 미셀 및 나노입자와 같은 지질성 또는 나노미립자 담체 시스템의 제조에서 사용하기에 특히 적합하다.
B. 지질성 담체 시스템
추가 측면에서, 본 발명은 임의로는 기타 보조-지질과 조합되는 본 발명의 하나 이상의 지질-리간드 컨쥬게이트를 포함하는 지질성 담체 시스템에 관한 것이다.
예의 지질성 담체 시스템은 바람직하게 지질(성) 소포를 포함한다. 용어 "지질(성) 소포" (또는 본 발명 소포 또는 본 발명의 소포) 은 지질성 담체 시스템의 표현과 상호교환적으로 사용되고, 이는 내부 공극의 존재를 특징으로 하는 구체의 실재물을 지칭한다. 전형적으로, 본 발명의 소포는 기타 합성 또는 천연-발생 지질 (보조-지질) 과 임의 조합된 하나 이상의 지질-리간드 컨쥬게이트로부터 형성된다. 임의의 주어진 본 발명의 소포에서, 지질은 단층 또는 이중층 형태일 수 있다. 1 개 초과의 단층 또는 이중층의 경우에서, 단층 또는 이중층은 일반적으로 동축이다. 본 소포는 리포솜 (즉, 내부 공극을 가진 하나 이상의 원심적으로 정연된 지질 이중층(들)을 포함하는 소포), 미셀 (즉, 공극을 가진 단일 지질 단층을 포함하는 소포) 등으로서 통상 지칭되는 실재물을 포함한다. 즉, 지질은 단일박막 소포 (하나의 단층 또는 이중층으로 이루어짐), 올리고박막 소포 (약 2 또는 약 3 개의 단층 또는 이중층으로 이루어짐) 또는 다박막 소포 (약 3 개 초과의 단층 또는 이중층으로 이루어짐) 을 형성하는데 사용될 수 있다.
소포의 내부 공극은 일반적으로 예를 들어 수성 액체, 기체, 기체 전구체, 및/또는 고체 물질 (예를 들어 하나 이상의 생활성제 포함, 이하 참조) 를 포함하는 액체로 충전된다.
일부 구현예에서, 지질-리간드 컨쥬게이트의 리간드는 표적 리간드 (표적화된 지질성 담체 시스템 또는 표적화된 리포솜 도모) 이다. 기타 구현예에서, 지질-리간드 컨쥬게이트의 리간드는 항원성 리간드 (항원성 지질성 담체 시스템 또는 항원성 리포솜 도모) 이다.
따라서, 본 발명은 특히 보조-지질과 임의 조합된 식 I 의 지질-리간드 컨쥬게이트 (이때 기 X1, X2, X3 중 하나 이상은 표적 리간드임) 를 포함하는 표적화된 지질 소포 (예, 표적화된 리포솜 또는 미셀) 에 관한 것이다.
대안적으로, 본 발명은 특히 임의로는 기타 보조-지질과 조합된, 기 X1, X2, X3 중 하나 이상이 항원성 리간드인 식 I 의 지질-리간드 컨쥬게이트를 포함하는 항원성 지질 소포 (예, 항원성 리포솜 또는 미셀) 에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 또한 기타 보조-지질과 임의 조합된, 기 X1, X2, X3 중 하나 이상이 항원성 리간드 및 표적화 리간드인 식 I 의 지질-리간드 컨쥬게이트를 포함하는 혼합 지질 소포 (예, 혼합 리포솜 또는 미셀) 에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 지질 소포 (즉, 표적화, 항원성 또는 혼합) 는 (a) 본 발명의 지질 소포의 내부 공극 내포되어 있거나, (b) 본 발명의 지질 소포의 층(들) 또는 벽(들) 내에, 예를 들어 본 발명의 지질 소포의 층(들) 또는 벽(들) 내에 함유되어 있는 지질들 중에 배치됨으로써 통합되거나, 또는 (c) 부착 또는 흡착 등을 도모하는 정전기 상호작용, 수소 결합, 반 데르 왈스힘 또는 공유결합과 같은 각종 화학적 상호작용을 통해 표면 노출이 달성되는, 본 발명의 지질 소포의 표면 상 노출된, 하나 이상의 생활성제, 예컨대 치료제 또는 진단제 또는 항원제, 바람직하게 치료제 또는 진단제를 추가로 포함한다.
당업자는 내포된 항원제 등을 포함하는 표적화된 지질 소포과 같이 모든 조합들이 본 발명 내에서 고려된다는 점을 이해할 것이다.
특정 구현예에서, 항원성 리간드 및/또는 작용제를 포함하는 본 발명의 지질 소포는 (a) 본 발명의 지질 소포의 내부 공극 내에 내포되어 있거나, (b) 본 발명의 지질 소포의 층(들) 또는 벽(들) 내에, 예를 들어 본 발명의 지질 소포의 층(들) 또는 벽(들) 내에 함유되어 있는 지질들 중에 배치됨으로써 통합되거나, 또는 (c) 정전기 상호작용, 수소 결합, 반 데르 왈스힘 또는 공유결합과 같은 각종 화학적 상호작용을 통해 표면 노출이 달성되는, 하나 이상, 바람직하게 하나의 애쥬번트를 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게, 하나 이상의 애쥬번트는 내부 공극 내에 내포된다.
본원에서 사용된 바 용어 "보조-지질" 또는 "소포-형성 (공동-)지질"은 본 발명의 지질 소포 내 추가적인 지질로서 임의 존재할 수 있고 비(非)환형 및 환형의, 포화 또는 불포화, 천연 또는 합성 기원의 지질을 포함할 수 있는 지질을 지칭한다. 본원에서 사용된 바, 보조-지질은 천연 지질, 양이온성 지질 또는 음이온성 지질일 수 있다. 양이온성 지질은 양 순전하를 갖고, 하기와 같은 지질을 포함한다: N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸 암모늄 염, 예를 들어 메틸술페이트 (DOTAP), DDAB, 디메틸디옥타데실 암모늄 브로마이드; 1,2-디아실옥시-3-트리메틸암모늄 프로판, (비제한적으로 하기 포함: 디올레오일, 디미리스토일, 디라우로일, 디팔미토일 및 디스테아로일; 또한 글리세롤 백본에 2 개의 상이한 아실 사슬이 연결될 수 있음); N-[1-(2,3-디올로일옥시)프로필]-N,N-디메틸 아민 (DODAP); 1,2-디아실옥시-3-디메틸암모늄 프로판, (비제한적으로, 하기 포함: 디올레오일, 디미리스토일, 디라우로일, 디팔미토일 및 디스테아로일; 또한 2 개의 상이한 아실 사슬이 글리세롤 백본에 연결될 수 있음); N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA); 1,2-디알킬옥시-3-디메틸암모늄 프로판, (비제한적으로 하기 포함: 디올레일, 디미리스틸, 디라우릴, 디팔미틸 및 디스테아릴; 또한, 2 개의 상이한 알킬 사슬은 글리세롤 백본에 연결될 수 있음); 디옥타데실아미도글리실스퍼민 (DOGS); 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노-에탄)카르바모일]콜레스테롤 (DC-Chol); 2,3-디올레오일옥시-N-(2-(스퍼민카르복스아미도)-에틸)-N,N-디메틸-1-프로파나미늄 트리플루오로-아세테이트 (DOSPA); β-알라닐 콜레스테롤; 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드 (CTAB); 디C14-아미딘; N-tert-부틸-N'-테트라데실-3-테트라데실아미노-프로피온아미딘; 14Dea2; N-(알파-트리메틸암모니오아세틸)디도데실-D-글루타메이트 클로라이드 (TMAG); O,O'-디테트라데카노닐-N-(트리메틸암모니오-아세틸)디에탄올아민 클로라이드; 1,3-디올레일옥시-2-(6-카르복시-스퍼밀)-프로필아미드 (DOSPER); N,N,N',N'-테트라메틸-N,N'-비스(2-히드록실에틸)-2,3-디올레오일옥시-1,4-부탄디암모늄 요오다이드; 1-[2-(아실옥시)에틸]2-알킬(알케닐)-3-(2-히드록시에틸)-이미다졸리늄 클로라이드 유도체 (Soldin et al. (1995) Biochem. 43:13537-13544 기재된 바와 같음), 예컨대 1-[2-(9(Z)-옥타데세노닐옥시)에틸]-2-(8(Z)-헵타데세닐-3-(2-히드록시에틸) 이미다졸리늄 클로라이드 (DOTIM), 1-[2-(헥사데카노일옥시)에틸]-2-펜타데실-3-(2-히드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드 (DPTIM), 2,3-디알킬옥시프로필 4차 암모늄 화합물 유도체 (4차 아민 상 히드록시알킬 모이어티를 포함) (예, Felgner et al. J. Biol. Chem. 1994, 269, 2550-2561 참조), 예컨대: 1,2-디올레오일-3-디메틸-히드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DORI), 1,2-디올레일옥시프로필-3-디메틸-히드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DORIE), 1,2-디올레일옥시프로필-3-디메틸-히드록시프로필 암모늄 브로마이드 (DORIE-HP), 1,2-디올레일옥시프로필-3-디메틸-히드록시부틸 암모늄 브로마이드 (DORIE-HB), 1,2-디올레일옥시프로필-3-디메틸-히드록시펜틸 암모늄 브로마이드 (DORIE-Hpe), 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸-히드록실에틸 암모늄 브로마이드 (DMRIE), 1,2-디팔미틸옥시프로필-3-디메틸-히드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DPRIE), 1,2-디스테릴옥시프로필-3-디메틸-히드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DSRIE); 아실 카르니틴의 양이온성 에스테르 (Santaniello et al. U.S. Pat. No. 5,498,633 보고); 포스파티딜콜린의 양이온성 트리에스테르, 즉, 1,2-디아실-sn-글리세롤-3-에틸포스포콜린, 이때 탄화수소 사슬은 포화 또는 불포화일 수 있고, 사슬 길이 C12 내지 C24 의 분지형 또는 비분지형이며, 2 개의 아실 사슬은 반드시 동일한 것은 아님. 중성 또는 음이온성 지질은 중성 또는 음이온성 순전하를 각각 가진다. 이들은 하기로부터 선택될 수 있다: 스테롤 또는 지질, 예컨대 콜레스테롤, 인지질, 리소지질, 리소인지질, 스핑고지질 또는 PEG화 지질 (중성 또는 음성 순전하를 지님). 유용한 중성 및 음이온성 지질은 그에 따라 하기를 포함한다: 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨 (특정 당에 제한되는 것은 아님), 지방산, 스테롤, 카르복실산기 함유의 것, 예를 들어 콜레스테롤, 콜레스테롤 술페이트 및 콜레스테롤헤미숙시네이트, 1,2-디아실-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (비제한적으로, DOPE, 1,2-디아실-글리세로-3-포스포콜린 및 스핀고미엘린 포함). 글리세롤 백본에 결합된 지방산은 특정 길이 또는 이중 결합 개수에 제한되지 않는다. 인지질은 또한 2 개의 상이한 지방산을 가질 수 있다.
당업자는 지질-리간드 컨쥬게이트 대 보조 지질의 비율이 생활성 리간드의 성질, 지질 소포에 부착되거나 이에 흡착되거나 또는 그 내부에 내포되거나 내장된 임의의 생활성제의 성질, 의도된 용도 (질환 치료, 진단 검정 등), 제약 조성물로서의 제형 및 투여 경로에 따라 다르다는 점을 이해할 것이다.
한 구현예에서, 본 발명의 지질 소포는 본 발명의 지질-리간드 컨쥬게이트 및 기타 소포-형성 지질 (보조-지질) 을, 바람직하게 1:1'000 내지 1:1, 바람직하게 1:500 내지 1:50 의 비율로 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 구현예에서, 지질 소포는 하나 이상의 지질-리간드 컨쥬게이트를 포함할 수 있고, 이때 컨쥬게이트의 에테르-지질은 불포화 탄화수소 사슬을 포함하고, 이는 가교 또는 중합되어 중합화 지질 소포를 형성할 수 있다.
본원에서 사용된 바, 용어 "중합화 지질 소포" 및 (특히 중합화 리포솜) 은 구성성분 지질이 분자간 상호작용에 의해 서로 공유 결합된 지질 소포를 의미한다. 지질은 지질 이중층 (리플릿; leaflet) 의 단일 층 내에서 함께 결합될 수 있고, 있거나 이중층의 2 개의 층들 사이에서 함께 결합될 수 있다. 지질 층 구조를 중합화하는 것은 어셈블리가 생체 내 존재하는 산, 담즙염 또는 효소에 의한 효소적 분쇄에 대해 극적으로 보다 저항적이게 만든다. 게다가, 중합화도 및 분해 속도 (절단가능성 또는 중합성 탄화수소 사슬을 가진 지질-리간드 컨쥬게이트의 특정비를 선택함에 의함), 안정성뿐 아니라 "누출" (원하는 크기의 다공을 생산함에 의함) 을 조절하는 것은 임의로 동봉된 생활성제의 원하는 탈출 속도에 따라 전환될 수 있다. 따라서, 지질 소포의 디자인은 예를 들어 특정 면역 흡수 부위에서 임의의 포장된 항원제, 또는 특정 조직 또는 세포 부위 등에서의 임의의 포장 치료제의 최적 탈출 속도를 조절 허용한다.
당업자가 리포솜, 미셀, 또는 기타 소포과 같은 소포 형태의 지질 담체 시스템을 인지함에 따라, 이는 당업계에 공지된 표준 조건을 이용해 본 발명의 지질-리간드 컨쥬게이트로부터 실제로 제조될 수 있다.
원하는 물리적 특성에 따라, 지질 소포는 안정화 지질을 포함해 임의로는 하나 이상의 보조-지질과 조합된 지질-리간드 컨쥬게이트로부터 제조될 수 있다. 본 발명의 지질-리간드 컨쥬게이트와 궁극적으로 조합된 특정 안정화 화합물은 결과로서 생성된 지질 소포의 특성을 최적화하도록 원하는 바와 같이 선택될 수 있다 (그리고, 과도한 실험 없이 당업자에 의해 실제로 식별가능하다).
본 발명에 따른 미셀 조성물은 당업자에게 명백한 통상의 각종 미셀 제조 방법 중 어느 하나를 이용해 제조될 수 있다. 이들 방법은 전형적으로 유기 용매 중 지질-리간드 컨쥬게이트의 현탁, 용매 증발, 수성 매질 중 재현탁, 초음파 처리 및 원심분리를 수반한다. 상술된 방법뿐 아니라 다른 방법도 예를 들어 Canfield et al., Methods in Enzymology, Vol. 189, pp. 418-422 (1990); El-Gorab et al, Biochem. Biophys. Acta, Vol. 306, pp. 58-66 (1973); Colloidal Surfactant, Shinoda, et al, Academic Press, N.Y. (1963) (especially "The Formation of Micekkes", Shinoda, Chapter 1, pp. 1-88); Catalysis in Micellar and Macromolecular Systems, Fendler and Fendler, Academic Press, N.Y. (1975) 에 논의되어 있다. 상기 간행물 각각의 개시는 본원에서 그 전문이 참조로 삽입되어 있다.
그로부터 제조된 미셀 조성물을 안정화하기 위해 지질-리간드 컨쥬게이트와 조합되는 임의의 안정화 물질은 하기를 포함한다: 라우릴트리메틸암모늄 브로마이드, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, 미리스틸트리메틸암모늄 브로마이드, (C12-C16)알킬디메틸벤질암모늄 클로라이드, 세틸피리디늄 브로마이드 및 클로라이드, 라우릴 술페이트, 등. 상기 예시된 것들에 덧붙여 미셀 조성물을 안정화하기 위한 기타 물질은 본 개시를 기반으로 해 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명의 리포솜 조성물은 항원 제시 담체로서 또는 조직 및 세포로의 생활성제의 전달을 위한 담체로서 특히 유효하기 때문에 특히 바람직하다.
리포솜 조성물은 하나 이상의 추가 보조-지질 및/또는 하나 이상의 안정화 화합물과 임의 조합된 하나 이상의 지질-리간드 컨쥬게이트를 포함할 수 있다. 지질-리간드 컨쥬게이트 (및 보조-지질) 는 단층 또는 이중층 형태일 수 있고, 단- 또는 이중층 지질은 하나 이상의 단층 또는 이중층 형성에 사용될 수 있다. 1 초과의 단 또는 이중층 경우, 단 또는 이중층은 일반적으로 동축이다. 즉, 지질-리간드 컨쥬게이트 (및 보조-지질) 는 단일박막 리포솜 (하나의 단층 또는 이중층으로 이루어짐), 올리고박막 리포솜 (약 2 또는 약 3 개의 단층 또는 이중층으로 이루어짐) 또는 다박막 리포솜 (약 3 개 초과의 단층 또는 이중층으로 이루어짐) 을 형성하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 리포솜 지질 조성물의 제조에 있어서 적합한 보조-지질 및 안정화 화합물의 선택은 당업자에게 자명할 것이고, 현 개시를 바탕으로 지나친 실험 없이 달성될 수 있다.
상기 예시된 것 이외에 본 발명의 리포솜 지질 조성물의 제조에서 사용하기 위한 기타 물질은 본 개시를 바탕으로 당업자에게 자명할 것이다.
예를 들어 본 발명의 지질-리간드 컨쥬게이트와 조합된, 추가적인 양친매성 화합물과 같은 안정화 물질의 양은 선택된 본 발명의 특정 지질-리간드 컨쥬게이트(들), 선택된 특정 안정화 물질, 활용되는 특정 용도, 전달 양식 등을 비롯한 각종 인자에 따라 가변적일 수 있다. 본 발명의 지질-리간드 컨쥬게이트와 조합될 안정화 물질의 양 및 안정화 물질 대 지질-리간드 컨쥬게이트의 비율은 다양하고 실제로 본 개시를 기초로 당업자에 의해 결정될 수 있다. 전형적으로, 약 4:1, 3:1 또는 2:1 보다 큰 지질-리간드 컨쥬게이트 대 안정화 지질의 비율이 바람직하다.
각종 방법이 본 발명의 리포솜 조성물의 제조와 연결되어 가능하다. 그에 따라, 리포솜은 당업자에게 자명한 종래의 리포솜 각종 제조 기술 중 어느 하나를 이용해 제조될 수 있다. 이들 기술은 에탄올 주입, 박막 기술, 균질화, 용매 투석, 수화 강행 (forced hydration), 역상 증발, 마이크로에멀젼화, 단순 동결-융해를 포함한다. 예를 들어, 종래의 마이크로에멀젼화 장치를 이용한다. 본 발명의 지질-리간드 컨쥬게이트로부터 본 발명의 리포솜 조성물의 제조를 위한 추가의 방법은 예를 들어 초음파처리, 킬레이트 투석, 균질화, 용매 투입, 자발적 형성, 용매 기화, 제어된 세제 투석 등을 포함하고, 각각은 각종 방식으로 리포솜의 제조를 수반한다. 전형적으로, 에탄올 주입, 박막 기술, 균질화 및 압출을 수반하는 방법이 본 발명의 지질-리간드 컨쥬게이트로부터 본 발명의 리포솜 조성물의 제조와 연결해 바람직하다.
리포솜의 크기는 바람직한 경우 압출, 여과, 초음파 처리 및 균질화를 포함한 각종 기술에 의해 조절될 수 있다. 리포솜의 크기 조절 및 생성된 리포솜 생전달 및 리포솜 청소 조정을 위한 기타 방법은 본 개시를 바탕으로 당업자에게 자명할 것이다. 바람직하게, 리포솜의 크기는 규정된 크기의 다공을 통해 가압 하 압출에 의해 조절된다. 본 발명의 리포솜 조성물은 외부 직경에서 임의 크기일 수 있고, 바람직하게는 약 200 나노미터 (nm) 미만일 수 있다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 본 발명의 지질-리간드 컨쥬게이트를 포함하는 지질성 담체 시스템 및 지질-리간드 컨쥬게이트 중 임의의 것이 저장을 위해 동결건조될 수 있고, 예를 들어 수성 매질 (예컨대, 멸균수 또는 인산염완충액, 또는 수성 식염수 용액) 에서, 바람직하게는 강렬한 교반 하에서 재구성화될 수 있다. 필요한 경우, 첨가제가 동결건조 결과로서 지질의 융합 또는 유착을 방지하도록 포함될 수 있다. 유용한 첨가제는 제한 없이 소르비톨, 만니톨, 염화나트륨, 글루코오스, 트레할로오스, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리(에틸렌 글리콜), 예를 들어 PEG 400 를 포함한다.
C. 나노미립자 담체 시스템
나노미립자 담체 시스템은 임의의 모양 및 임의의 형태로 존재할 수 있다. 나노미립자 담체 시스템의 예는 나노입자, 나노분말, 나노클러스터, 나노결정, 나노스피어, 나노섬유, 나노튜브 및 기타 기학을 포함한다. 나노미립자 소포성 조성물 또는 나노입자는 전형적으로 1 마이크론 미만, 바람직하게 약 25-1000 nm, 더욱 바람직하게 50-300 nm, 가장 바람직하게 약 60-200 nm 범위의 직경을 가진 소형 입자이다. 나노스피어는 형태가 대략적으로 구형이고 중공 코어를 가진 나노입자 타입을 지칭한다. 전형적으로 나노입자는 생리적으로 허용가능한 중합체를 포함하는 중합체와 같은 유기 물질 및 금속과 같은 무기 물질을 포함하는 모든 유형의 물질 및 구조를 이용해 형성될 수 있는 매트릭스 코어 구조를 가진다. 이러한 중합체의 비제한적인 예는 예를 들어 하기를 포함한다: 폴리에스테르 (예컨대 폴리(락트산), 폴리(L-리신), 폴리(글리콜산) 및 폴리(락틱-co-글리콜산)), 폴리(락트산-co-리신), 폴리(락트산-그라프트-리신), 폴리안히드리드 (예컨대, 폴리(지방산 다이머), 폴리(푸마르산), 폴리(세바식산), 폴리(카르복시페녹시 프로판), 폴리(카르복시페녹시 헥산), 이들 모노머의 공중합체 등), 폴리(안히드리드-co-이미드), 폴리(아미드), 폴리(오르토에스테르), 폴리(이미노카르보네이트), 폴리(우레탄), 폴리(오르가노파스파젠), 폴리(포스페이트), 폴리(에틸렌 비닐 아세테이트) 및 기타 아실 치환된 셀룰로오스 아세테이트 및 그의 유도체, 폴리(카프로락톤), 폴리(카르보네이트), 폴리(아미노산), 폴리(아크릴레이트), 폴리아세탈, 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(스티렌), 폴리(비닐 클로라이드), 폴리비닐 플루오리드), 폴리비닐 이미다졸), 클로로술폰화 폴리올레핀, 폴리에틸렌 옥시드, 공중합체, 폴리스티렌, 및 그의 블렌드 또는 공중합체. 나노입자는 또한 히드록시프로필 셀룰로오스 (HPC), N-이소프로필아크릴아미드 (NIPA), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리에틸렌이민, 키토산, 키틴, 덱스트란 술페이트, 헤파린, 콘드로이틴 술페이트, 겔라틴, 등뿐 아니라 그의 유도체, 그의 공중합체 및 혼합물을 포함할 수 있다. 나노입자 제조를 위한 비제한적인 방법은 예를 들어 U.S. 공보 2003/0138490 에 기재되어 있다. 또 다른 구현예에서, 코어 물질은 금속, 합금, 준금속 (metalloid), 금속 화합물, 예컨대 금속 산화물, 무기 화합물 및 탄소-기재 물질, 특히 탄소 나노튜브, 풀러렌 C6o 의 1-차원 나노입자 및 풀러렌 C70 의 3차 나노입자로부터 선택될 수 있다. 금속의 적합한 예에는 이에 제한되는 것은 아니나, 귀금속 또는 플라티늄 금속, 예컨대 Ag, Au, Pd, Pt, Rh, Ir, Ru, 및 Os, 전이 금속, 예컨대 Ti, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Zr, Nb, Mo, Ta, W, Re, 및 주족 금속, 예컨대 Al, Ga, In, Si, Ge, Sn, Sb, Bi, Te 를 포함한다. 일부 주족 금속, 특히 Si 및 Ge 는 또한 통상 준금속으로서 지칭된다는 점은 인지되어 있을 것이다. 적합한 합금의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 귀금속 또는 플라티늄 금속 및 전이 금속의 합금, 특히 은 및 전이 금속의 합금, 예컨대 Ag/Ni, Ag/Cu, Ag/Co 및 플라티늄 및 전이금속, 예컨대 Pt/Cu 또는 귀금속 또는 플라티늄 합금, 예컨대 Ru/Pt 을 포함한다. 무기 화합물의 비제한적 예는 이에 제한되는 것은 아니나, 하기를 포함한다: SiO2, 금속 화합물, 특히 금속 산화물, 예컨대 TiO2 및 산화철. 나노입자는 또한 검출가능한 전기, 자기 및/또는 광학 특성을 나노입자에 제공하는 고유 형광 또는 발광 모이어티, 플라스몬 공명 모이어티, 및 자기 모이어티를 포함할 수 있다.
당업자는 물질의 선택이 나노입자의 사용 용도에 따라 좌우될 것이라는 점을 알 것이다.
한 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 지질-리간드 컨쥬게이트를 포함하는 나노입자에 관한 것이다. 하나 이상의 지질 컨쥬게이트는 표면에 얽히거나, 내장, 혼입, 포장, 흡착 또는 결합될 수 있거나, 또는 달리 나노입자와 연합될 수 있다.
한 특정한 구현예에서, 지질-리간드 컨쥬게이트는 반데르왈스 힘, 이온 상호작용, 소수성 상호작용과 같은 분자간 힘을 통해 기타 보조-지질과 임의 조합되어 코팅물 형태의 나노입자로 연합될 수 있다.
대안적으로, 나노입자는 하나 이상의 작용성기, 예컨대 예를 들어 카르복실, 술히드릴, 히드록실 또는 아미노기를, 임의로는 기타 보조-지질과의 조합되어, 나노입자의 표면에 대한 하나 이상의 지질-리간드 컨쥬게이트 (또는 기타 화합물, 예컨대 스페이서) 의 공유 결합을 위해 임의 포함할 수 있다.
본 발명의 나노입자는 또한 함께 그룹화되어 (임의로는 분산제와 함께) 나노클러스터를 형성할 수 있다. 독립적인 각 나노입자 유형의 제형은 클러스터 형성 및 클러스터 내 나노입자들의 특정 배열 전에 지질-리간드 컨쥬게이트 및 그에 따른 생활성제의 체류 및 농축을 조절할 수 있다.
일부 구현예에서, 나노입자는 나노입자의 고체 매트릭스 코어 안에 포획, 내장, 또는 캡슐화된 추가적인 생활성제를 추가로 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 지질-리간드 코팅된 나노입자는 나노크기의 코어 입자 및 하나 이상의 본 발명의 지질-리간드 컨쥬게이트 및 임의로는 하나 이상의 보조-지질로부터 형성될 수 있다. 임의의 주어진 지질-리간드 코팅된 나노입자에서, 지질-리간드 컨쥬게이트는 단층 또는 이중층 형태일 수 있다. 1 개 초과의 단 또는 이중층의 경우에서, 단- 또는 이중층은 일반적으로 동축이다. 나노입자의 코팅은 바람직하게 본 발명의 지질-리간드 컨쥬게이트를 포함하는 용액에서 및 상기 지질-리간드 컨쥬게이트가 나노입자를 코팅하기에 충분한 시간을 허용함으로써 실시된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 지질-리간드 컨쥬게이트의 하나 이상의 리간드는 하나 이상의 항원성 리간드이다.
면역 응답을 유도하기 위한 나노입자 당 항원성 리간드의 양 (또는 항원 리간드의 표면 밀도) 은 많은 인자, 예컨대 면역 응답 그 자체의 성질 (체액성 또는 세포-매개성), 항원 리간드의 면역원성, 챌린지된 유기체의 면역원성 구성, 및 투여 루트 및 항원의 노출 기간에 좌우된다.
분명하게, 대상의 면역화는 다가 전시로서 다수 카피의 항원을 이용하고, 이로써 부위-특이적 항원 농축을 증가시키고 그에 따라 오래지속되는 면역 응답을 유도함으로써 강화될 수 있다. 이는 투여하기 곤란하고 일반적으로 합텐-관련 크기 사안으로 인해 효과적인 면역 응답을 도출하는데 실패하는 소형의 펩티드 또는 탄수화물과 같은 항원 리간드의 경우에 특히 바람직하다.
따라서, 일부 구현예에서, 나노입자는 그의 표면 상에 단일 또는 다수 카피의 한 항원 리간드 또는 상이한 항원 리간드의 조합 (다가 디스플레이 형태) 을 전시한다. 본원에서 이용된 바, 용어 "다가"란, 1 카피 초과 또는 유형의 담체 시스템 상 항원의 전시를 지칭한다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 X1, X2, X3 중 하나 이상이 항원성 리간드인 식 I 의 하나 이상의 지질-리간드 컨쥬게이트 및 임의로는 기타 매트릭스 또는 보조지질에 의해 코팅된 고체 코어를 포함하는 나노입자와 관련된다.
면역화는 적절한 면역 세포 또는 위치에 나노입자를 지시하는 표적화 리간드를 포함함으로써 추가로 개선될 수 있다.
표적화 리간드로서 작용할 수 있는 화합물은 숙주 세포로의 병원체의 부착을 방해하고 이로써 콜로니화가 성공적인 화합물이다. 이러한 화합물의 예는 하기를 포함할 수 있다: 파상풍 톡소이드; 대장균의 P pili; 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 의 유형 IV pili, 네이세리아 (Neisseria) 종, 모락셀라 (Moraxella) 종, EPEC, 또는 비브리오 콜레래 (Vibrio cholerae); 가는털 (fimbrial) 유전자 및 수 가지의 가는털 부착소, FHA, 퍼탁틴 (pertactin), 보르데텔라 퍼튜시스 (Bordetella pertussis) 의 퍼튜시스 톡시난드 BrkA ; 및 살모넬라 티피무륨의 SipB-D; 및 아데노바이러스 부착물; 레오바이러스 시그마-1 단백질 (M-세포 표적).
따라서, 본 발명은 또한 X1, X2, X3 중 하나 이상이 항원성 리간드 및/또는 표적화 리간드인 식 I 의 하나 이상의 지질-리간드 컨쥬게이트 및 임의로는 기타 매트릭스 또는 보조지질에 의해 코팅된 고체 코어를 포함하는 나노입자를 나타낸다.
기타 구현예에서, 지질-리간드 코팅된 나노입자는 그 나노입자의 고체 코어 내에 둘러싸이거나 내장된 단일의 항원제 또는 항원제 (다가) 의 조합물을 추가로 포함한다.
따라서, 본 발명은 또한 X1, X2, X3 중 하나 이상이 항원성 리간드 및/또는 표적화 리간드인 식 I 의 하나 이상의 지질-리간드 컨쥬게이트 및 임의로는 기타 매트릭스 또는 보조지질에 의해 코팅된 고체 코어를 포함하는 나노입자에 관한 것으로서, 이때 상기 고체 코어는 임의로는 하나 이상의 추가의 항원제를 포함한다.
또한 기타 구현예에서, 나노입자는 그 나노입자의 고체 코어 내에 내포되거나, 내장되거나 또는 분산된 하나 이상의 애쥬번트를 추가로 포함한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "애쥬번트"는 특정 항원에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 응답을 증대시킬 수 있는 임의의 물질을 지칭한다. 적합한 애쥬번트는 나노입자의 표면 상에 전시될 수 있거나, 나노입자 벽 내로 개재되거나, 또는 나노입자 내부 내에 포장될 수 있다. 동시 투여된 항원에 대항하는 세포-매개 면역 응답뿐 아니라 혈청 및/또는 점막 항체의 생성을 촉진하는데 사용될 수 있는 애쥬번트의 예에는 대장균 열 불안정성 엔테로톡신 홀로톡신 (LT) 및 비브리오 콜레래 엔테로톡신 (CT) 뿐 아니라 KPL 애쥬번트 (살모넬라 민네소타의 세포 벽에서 유래) 가 포함된다.
본원에서 이용된 바, 용어 "전시된" 또는 "표면 노출된"이란, 지질성 소포 또는 나노입자와 같은 담체 시스템의 외부 표면에 존재하고, 그에 따라 인지하도록 접근가능한 임의의 리간드를 지칭한다.
각종 질환 및 장애는 하기를 포함하는 나노입자 백신 구축물 또는 어셈블리에 의해 치료될 수 있다: 염증성 질환, 전염성 질환, 암, 유전성 장애, 장기 이식 거부, 자가면역 질환 및 면역 질환.
따라서, 본 발명은 또한 고체 코어 및 하나 이상의 표면 노출된 지질-리간드 컨쥬게이트를 포함하고, 추가로 임의로는, 나노입자의 고체 코어 안에 내포된 애쥬번트 및/또는 추가의 항원제를 포함하는, 다가 나노입자를 포함하는 백신을 포함하고, 이때 상기 리간드는 하나 이상의 항원성 및/또는 표적화 리간드이다.
추가 구현예에서, 하나 이상의 지질-리간드 컨쥬게이트의 하나 이상의 리간드는 하나 이상의 치료제 또는 진단제이다.
표면 노출된 지질-리간드 컨쥬게이트를 포함하는 본 발명의 나노입자의 제조 방법은, (a) 나노입자를 제공하는 단계, 및 (b) 하나 이상의 지질-리간드 컨쥬게이트를 흡착 또는 부착을 통해 나노입자에 결합시켜 지질-리간드 코팅된 나노입자를 형성하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 상기 방법은 (a) 나노입자를 제공하는 단계, (b) 하나 이상의 에테르-지질을 흡착 또는 부착을 통해 나노입자에 결합시켜 지질-코팅된 나노입자를 형성하는 단계 및 (c) 하나 이상의 생활성 리간드를 나노입자의 표면과 결합된 하나 이상의 에테르-지질과 공유 결합시켜 지질-리간드 코팅된 나노입자를 형성하는 단계를 포함한다. (예비형성된) 지질-코팅된 나노입자는 그 전문이 본원에 혼입된 동시 제출된 출원의 일부이다.
적합한 크기의 나노입자를 제작하는 전형적인 방법은 기화 방법 (예, 자유 분사 확대, 레이져 기화, 방전 가공, 전자 폭발 (electro explosion), 및 화학 증착), 기계적 마모를 수반하는 물리적 방법 (예, 펄밀링 (pearlmilling), Elan Nanosystems, Ireland) 및 계면 퇴적 후 용매 대체를 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 또한 하나 이상의 지질-리간드 컨쥬게이트를 포함하는 나노스피어에 관한 것이다. 나노입자와는 반대로, 중공 내부로서 나노스피어는 내포되어 관심 세포 또는 조직에 하나 이상의 생활성제를 후속해서 전달하는데 용이하게 사용될 수 있다. 이러한 캡슐화된 생활성제(들)의 방출 속도는 예를 들어 공지된 기술로써 조정될 수 있다.
D. 제약 조성물 및 제형물
본 발명의 담체 시스템은 예를 들어 제약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 담체, 예컨대 생리적 식염수 또는 인삼염 완충제를 투여 경로 및 표준 제약 관행에 따라 선택하여 추가로 포함하는, 제약 조성물로서 존재할 수 있다.
따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 제약학적으로 허용가능한 희석제, 부형제 또는 담체, 및 임의로는 다른 보조-지질과 조합된 리간드-지질 컨쥬게이트를 포함하는 하나 이상의 지질성 또는 나노미립자 담체 시스템을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
바람직하게, 지질성 담체 시스템은 지질 소포, 예컨대 리포솜 또는 미셀이고, 나노미립자 담체 시스템은 나노입자 또는 나노스피어이다.
용어 "하나 이상의 지질-리간드 컨쥬게이트"가 본원에 기재된 바와 같은 모든 가능한 구현물, 즉 리간드가 표적화된, 항원성, 치료적 및 진단적 리간드 및 그 혼합물인 컨쥬게이트를 지칭한다는 점이 이해된다. 임의로는 추가 하나 이상의 생활성제가 지질성 또는 나노미립자 담체 시스템에 부착 또는 흡착되거나 또는 그 안에 내포 또는 내장되어 있다.
본 발명의 제약 조성물은 세포 배양 적용과 같이 시험관 내, 또는 생체 내 적용에 사용될 수 있다. 생체 내 적용과 관련하여, 본 발명의 지질 제형물은 비경구, 경구 또는 복강내 투여를 포함해, 선택된 투여 경로에 적합된 각종 형태로 환자에게 투여될 수 있다. 비경구 투여에는 정맥내, 근육내, 세포 사이에, 동맥내, 피하, 안내, 활액내, 상피통과 (경피 포함), 흡입을 통한 폐 내, 안, 설하 및 구강, 국소 (안구 피하, 안내, 직장 포함) 및 흡입제 투여를 통한 비강 흡입, 바람직하게 정맥내 투여를 포함한다.
유용한 투여 용량 및 특정 투여 양식은 고려되는 치료 또는 진단 용도, 사용된 특정 생활성제 및 지질 화합물뿐 아니라 담체 시스템의 형태, 예를 들어 미셀, 리포솜 또는 나노입자, 및 치료될 대상체의 체중, 신체 상태와 같은 인자에 따라 다양할 것이고, 이는 당업자에게 손쉽게 자명할 것이다. 본 발명에 따른 표적화 제약 조성물의 용도 적은 용량의 투여로 바람직한 치료 효과를 발휘 가능하게 한다.
일반적인 유도 방식으로써, 담체 시스템 내 지질-리간드 컨쥬게이트의 비율은 0.05 내지 5 mole % 로 변동적일 것이며, 그 비율이 0.1 내지 2 mole % 인 것이 바람직하고, 비록 더 많고 적은 양이 사용될 수 있지만 환자 체중 1 kg 당 각각 약 0.01 mg 내지 약 10 mg 의 특정 항원성, 치료 또는 진단제가 투여하기에 적합할 수 있다.
E. 사용 방법
상기 지시된 바와 같이, 하나의 특정 구현예에서, 표적화 지질-리간드 컨쥬게이트 및 특히 이들을 포함하는 표적화 소포 (즉, 리포솜 및 미셀) 및 표적화 나노입자뿐 아니라 그의 각 제약 조성물이 특히 하나 이상의 생활성제, 바람직하게 치료, 진단 및/또는 항원제의 표적화된 전달을 위한 담체로서 사용하기에 적합하다.
따라서, 본 발명의 표적화 지질-리간드 컨쥬게이트는, 하나 이상의 특이적 생활성제, 바람직하게는 치료제, 진단제 및/또는 항원제를 조직 또는 세포로의 표적화된 전달이 바람직하거나 또는 요구되는 질환 치료를 위한 방법에서 시험관 내 및/또는 생체 내 사용하기에 특히 적용가능하다.
표적화 나노입자 및 그 제약 조성물의 경우, 하나 이상의 생활성제가 바람직하게 고체 코어 내에 포획된다.
표적화 지질 소포 및 그 제약 조성물의 경우, 하나 이상의 생활성제가 바람직하게 내부 공극 내에 내입 또는 지질 이중층 안에 혼입되어 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 또한 막을 건너는 진단적 또는 생물학적 활성 화합물의 수송 방법, 특히 세포에 본 발명의 제약 조성물을 접촉하는 것을 포함하는 하나 이상의 생활성제의 세포내 전달 방법을 포함한다.
또 다른 특정 구현예에서, 항원성 소포 (즉, 리포솜 및 미셀) 및 이들을 포함하는 항원성 나노입자뿐 아니라 그의 각 제약 조성물이 항원 전시 시스템으로서 사용하기에 특히 적합하다. 따라서, 본 발명의 항원성 지질-리간드 컨쥬게이트가 예를 들어 면역화 방법 및/또는 시험관 내/생체 내 진단 적용에서 사용하기에 특히 적용가능하다.
임의로는 항원성 소포 (즉, 리포솜 및 미셀) 및 항원성 나노입자는 하나 이상의 생활성제를 추가로 포함할 수 있다. 항원성 나노입자의 경우, 하나 이상의 생활성제가 바람직하게 고체 코어 내에 포획되어 있다. 표적화된 지질 소포 및 그 제약 조성물의 경우, 하나 이상의 생활성제는 바람직하게 내부 공극 내에 내포되어 있거나 또는 지질 이중층 내로 혼입된다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 임의로는 다른 보조-지질과 조합된 하나 이상의 항원성 지질-리간드 컨쥬게이트를 포함하는 항원성 지질 소포, 또는 항원성 나노입자를 포함하고, 이때 임의로는 하나 이상의 애쥬번트 및/또는 하나 이상의 생활성제를 포함하는, 예방 및 치료 백신을 위한 항원 전시 시스템에 관한 것이다.
또한, 항원 전시 세포에, 특히 수지상 세포에, 마크로파지에, B-세포 및 내피 세포에 항원의 전시 및 후속해서 상기 항원 전시 세포를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체 내 항원에 대한 면역 응답을 촉진 또는 조절하기 위한 방법이 본 발명에 포함된다.
본 발명의 기타 측면은 막을 통한 생물학적으로 활성인 화합물의 수송 방법 및/또는 생물학적으로 활성인 화합물의 본 발명의 담체 시스템을 이용한 세포 내로의 전달 방법을 포함한다.
고려되는 추가 적용은, 예를 들어 세포의 성장 촉진 및 분화뿐 아니라 생반응기에서 제조된 생물학적 생성물의 발현 프로파일 및 번역후 개질 패턴의 변경에 대한 시험관 내 적용을 포함한다.
F. 키트
또한 추가 측면에서, 본 발명은 키트의 각 요소를 유지하기 위한 구획화된 용기로 이루어진 키트에 관한 것이다. 한 구획은 소정량의 지질-리간드 컨쥬게이트 또는 이로부터 제조된 담체 시스템을 포함할 수 있다. 리포솜과 같은 담체 시스템의 경우, 이들은 조성물 pH 를 약 7 내지 약 8 로 조절하기 위한 pH 완충액 유무하에 존재할 수 있거나, 또는 사용시에 재구성하기 위한 동결건조 또는 냉동 건조 형태로 존재할 수 있다. 또한, 사용하기 위한 기타 시약 및 지시사항이 키트 내에 포함될 것이다.
본 발명은 하기의 실시예에서 추가 기술된다.
실시예
재료: 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC) 은 Merck & Cie (Schaffhausen, Switzerland) 의 것이다. 콜레스테롤, DOPE, DSPC, POPC, MPEG2000-DOPE (880130), 및 형광 지질 NBD-DOPE (1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(7-니트로-2-1,3-벤족사디아졸-4-일) (암모늄 염)) (810145P) 및 PhB-DOPE (810150) 은, Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) 에서 구입한다. 작용화 PEG 프로피온산 (PA) 유도체 Fmoc-NH-PEG12-PA-COOH (851024) 는, Novabiochem 에서, Fmoc-NH-PEG8-PA-COOH (PEG1830), Fmoc-NH-PEG36-PA-COOH (PEG4400) 및 MPEG(2kDa)-아민 (PEG1152) 은 IRIS Biotech GmbH 에서 입수했다. 디페닐디아조메탄 레진 (D-2230) 은 Bachem AG 에서, H-Thr(tBu)-2-ClTrt 레진 (RRA-1251) 는 CBL Patras 에서, H-Gly-2-ClTrt 레진 (856053) 및 Sieber 레진 (855008) 은 Novabiochem 에서 수득한다. 모든 기타 화학품 및 용매는 A.R. 등급 이상이다.
아자-펩티드 Michael 수용체 트랜스-Cbz-D-Ala-D-Ala-2-아자-Asn-아크릴산 (RR11a-OH) 및 그의 N-히드록시숙신이미드 (RR11a-NHS) 와의 활성화 에스테르는, WuXi AppTec Co. Ltd. (Ekici et al, 2004, J.Med.Chem. 47, 1889-1892; Reisfeld et al., Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Me디cine 7, Issue 6, 2011, 665-673) 에 의해 합성되었다.
2,3-비스(테트라데실옥시)프로판-1-아민은 [Kokotos et al. Chemistry-A European Journal, 2000, vol. 6, #22, 4211-4217] 에 따라 합성한다. 유사 방식으로, 비스(3-((Z)-옥타데크-9-에닐옥시)프로필)아민은, 올레일 메탄술포네이트 및 비스(3-히드록시프로필)아민으로부터 수득한다 (see MaGee et al., J. Journal of Organic Chemistry, 2000, vol. 65, #24, 8367-8371).
세포 배양: M21 인간 흑색종 세포 (Cell Culture Strain Collection, Merck KGaA, Darmstadt, Germany 에서 수득) 를, 10% 소태아 혈청으로 보충된 고 글루코오스 배양 배지 (Life Technologies, Carlsbad, CA) 로 DMEM 중 5% CO2 로 37℃ 에서 유지한다. 세포를 2 ml 배지에서 0.3 x 106 세포에서 실험 전 16 시간 동안 6-웰 배양 플레이트에서 규칙적으로 계대 및 플레이팅한다. M21 세포를 1 시간 동안 37℃ 에서 Opti-MEM 혈청 자유 배양 배지에서 리포솜과 함께 인큐베이션한 다음 세포 분해 완충액 (Life Technologies, Carlsbad, CA) 을 이용해 Opti-MEM 로 1 회 세정 후 수확한다. NBD-DOPE 의 공동-국소화를, Guava easyCyte 8HT (EMD Millipore Corp., Billerica, MA) 로써 결정한다.
통계 분석: 통계 분석을, 스튜던트 t-테스트로 수행한다. 평균차는 p 값 <0.01 에서 통계학적으로 유의한 것으로 고려한다.
실시예 1: (2S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-글루탐산-α- tert -부틸에스테르-γ-2,3-비스(테트라데실옥시)프로필-아미드의 합성
Figure pat00016
15 g 의 Fmoc-Glu(OSu)OtBu ((2S)-Nα-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)-글루탐산 α-tert-부틸-에스테르 γ-N-히드록시숙신이미드 에스테르) 를, 실온에서 디클로로메탄에서 용해한다. 15.3 g 의 2,3-비스(테트라데실옥시)프로판-1-아민 첨가 후, 혼합물을 17 시간 동안 교반하고, 증발 건조한다. 잔류물을 최소량의 디클로로메탄에서 용해하고, 고체상으로서 SiO2 및 용리액으로서 메틸 tert. 부틸에테르 / 헥산 / 7:3 을 이용한 컬럼 크로마토그래피로써 정제한다. 생성물 분획 증발 후, 25.5 g 의 (2S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-글루탐산-α-tert-부틸에스테르-γ-2,3-비스(테트라데실옥시)프로필-아미드를, 무색 고체로서 수득한다. 1H-NMR, CDCl3 (내부 표준 TMS), 화학적 이동, ppm: 7.76 (d, 2H, Fmoc), 7.61 (d, 2H, Fmoc), 7.25-7.43 (m, 4H, Fmoc), 6.13 (bs, NH, 1H), 5.60 (bs, NH, 1H), 4.39, 4.18-4.25 (d 및 m, 4H), 3.21-3.62 (m, 9H), 1.97-2.23 (m, 4 H), 1.51-1.60 (m, 4H), 1.47 (s, 9 H), 1.25 (m, 44H, CH2), 0.84-0.91 (m, 6H, 2x 알킬-CH3).
실시예 2: (2S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-글루탐산-γ-2,3-비스(테트라데실옥시)프로필-아미드의 합성
Figure pat00017
100 ml 플라스크에서, 4.6 g (5.1 mmol) (2S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-글루탐산-α-tert-부틸에스테르-γ-2,3-비스(테트라데실옥시)프로필-아미드를, 25 ml 디클로로메탄에서 용해하고, 25 ml 트리플루오로아세트산으로 처리한다. 1 시간 후, 에스테르기를 완전히 절단하고, 용액을 50 ml 의 냉수에 붓는다. 유기층을 추출하고, 중성 pH 로 물로 세정하고, Na2SO4 상 건조한다. 유기층을 여과제거하고, 용매를 증발시켜, 4.2 g 의 원하는 생성물 (5.0 mmol, 98 % 수율, TLC: MtBE/헥산 7:3; Rf = 0.43) 을 수득한다.
실시예 3: (2S)-글루탐산-γ-(2,3-비스(테트라데실옥시)프로필)아미드의 합성
Figure pat00018
5 g 의 (2S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-글루탐산-α-tert-부틸에스테르-γ-2,3-비스(테트라데실옥시)프로필-아미드를, 85 ml 의 N,N-디메틸포름아미드에 첨가한다. 혼합물에, 2.6 ml 의 피페리딘을 첨가한다. 혼합물을 3 시간 동안 실온에서 교반한 다음 진공 하 증발 건조시켜, 5.2 g 의 (2S)-글루탐산-γ-(2,3-비스(테트라데실옥시)프로필)아미드를 무색 고체로서 수득하고, 이를 활성제 또는 스페이서기로의 사전 유도체화에 또는 지질성 소포의 제조에 사용할 수 있다.
실시예 4: ( R )-2-아미노-N1-(2-(4-메톡시벤즈아미도)에틸)-N4,N4-비스(3-(( Z )-옥타데크-9-에닐옥시)프로필)숙신아미드의 합성
(a) N-(2-아미노에틸)-4-메톡시벤즈아미드의 합성
Figure pat00019
3.0 g 4-메톡시벤조일 클로라이드를, 디클로로메탄 중 30 mL 1,2-디아미노에탄에 -78℃ 에서 첨가하고, 후속해서 23℃ 로 가온되게 정치한다. 수성 산-염기 워크업 및 진공 하 증발 건조로, 1.65 g 의 N-(2-아미노에틸)-4-메톡시벤즈아미드, 담황색 오일을 수득한다. 1H-NMR, CDCl3 (TMS, 내부 표준), 화학적 이동, ppm: 8.53 (t, 1H, NH), 7.91 (d, 2H, Benz), 6.99 (d, 2H, Benz), 4.75 (bs, 2H, NH2), 3.81 (s, 3H, CH3), 3.39, (dd, 2H, CH2), 2.82 (t, 2H, CH2).
(b) (R)-tert-부틸 3-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-4-(2-(4-메톡시벤즈아미도)에틸아미노)-4-옥소부타노에이트의 합성
Figure pat00020
3.0 g 2 N-(2-아미노에틸)-4-메톡시벤즈아미드 (단계 (a) 에서 수득) 및 DMF (0℃) 중 1.70 mL N-메틸모르폴린을, 6.35 g Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 1.70 mL N-메틸모르폴린 및 2.00 mL 이소부틸클로로포르메이트의 에틸아세테이트 (-12℃) 중 용액에 첨가하고, 23℃ 로 가온되게 하면서 3 시간 동안 교반한다. 생성된 현탁액을 에틸 아세테이트로 희석한 후, 수성 산-염기 워크업 및 진공 하 증발로, 9.55 g (R)-tert-부틸 3-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-4-(2-(4-메톡시벤즈아미도)에틸아미노)-4-옥소부타노에이트를 수득한다. 상기 미정제 물질을 23 시간 동안 이소프로필에테르에서 현탁한 다음, 여과 제거하고, 건조시켜 4.47 g (R)-tert-부틸 3-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-4-(2-(4-메톡시벤즈아미도)에틸아미노)-4-옥소부타노에이트를 백색 결정으로서 수득한다. 1H-NMR, CDCl3 (TMS, 내부 표준), 화학적 이동 (ppm): 8.28 (t, 1H, NH), 8.07 (t, 1H, NH), 7.89 (d, 2H, Fmoc), 7.81 (d, 2H, Benz), 7.71-7.60 (m, 2H, Fmoc 및 1H, NH), 7.46-7.27 (m, 4H, Fmoc), 6.96 (d, 2H, Benz), 4.35-4.20 (m, 3H, Fmoc, 및 1H CH), 3.78 (s, 3H, CH3), 3.40-3.20, (m, 4H, 2xCH2), 2.69 (dd, 1H, CH2), 2.46 (dd, 1H, CH2), 1.37 (s, 9H, 3xCH3).
(c) (R)-3-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-4-(2-(4-메톡시벤즈아미도)에틸아미노)-4-옥소부타노익 나트륨 아세테이트의 합성
Figure pat00021
디클로로메탄 중 3.0 g (R)-tert-부틸 3-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-4-(2-(4-메톡시벤즈아미도)에틸아미노)-4-옥소부타노에이트 (단계 (b) 에서 수득) 에, 30.0 mL 트리플루오로아세트산을 23℃ 에서 첨가한다. 반응 완료 되자마자, 수성 NaHCO3 를 첨가해 백색 침전물을 제공하고, 이를 디클로로메탄으로 세정 및 건조시켜, 2.55 g (R)-3-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-4-(2-(4-메톡시벤즈아미도)에틸아미노)-4-옥소부타노익 나트륨 아세테이트를 백색 분말로서 수득한다. 1H-NMR, SO(CD3)/CD3OD, 1:1, (내부 표준으로서 TMS), 화학적 이동 (ppm): 7.85-7.79 (m, 2H, Fmoc 및 2H, Benz), 7.68 (d, 2H, Fmoc), 7.45-7.29 (m, 4H, Fmoc), 6.93 (d, 2H, Benz), 4.51-4.17 (m, 3H, Fmoc 및 1H, CH), 3.78 (s, 3H, CH3), 3.47-3.34, (m, 4H, 2xCH2), 2.82 (dd, 1H, CH2), 2.63 (dd, 1H, CH2).
(d) (9H-플루오렌-9-일)메틸 (R,Z)-1-(4-메톡시페닐)-10-(3-((Z)-옥타데크-9-에닐옥시)프로필)-1,6,9-트리옥소-14-옥사-2,5,10-트리아자도트리아콘트-23-엔-7-일 카르바메이트의 합성
Figure pat00022
디메틸포름아미드 중 0.48 g (R)-3-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-4-(2-(4-메톡시벤즈아미도)에틸아미노)-4-옥소부타노익 나트륨 아세테이트 (단계 (c) 에서 수득) 를, 10℃ 로 냉각한 다음, 0.46 g 비스(3-((Z)-옥타데크-9-에닐옥시)프로필)아민, 0.37 g COMU 및 0.20 g DIPEA 를 연속해서 첨가한다. 20 시간 동안 23℃ 에서 교반 후, 용액을 Alox 패드를 통해 여과하고, 이것을 소량 디메틸포름아미드으로 린스한다. 여과물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 물로 세정하고, 진공 하 증발 건조해, 1.12 g 오렌지색 오일을 제공하고, 이를 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제해 0.41 g (9H-플루오렌-9-일)메틸 (R,Z)-1-(4-메톡시페닐)-10-(3-((Z)-옥타데크-9-에닐옥시)프로필)-1,6,9-트리옥소-14-옥사-2,5,10-트리아자도트리아콘트-23-엔-7-일-카르바메이트를 수득한다. 1H-NMR, CDCl3 (내부 표준으로서 TMS), 화학적 이동 (ppm): 7.86 (d, 2H, Benz), 7.69 (d, 2H, Fmoc), 7.55 (d, 2H, Fmoc), 7.42-7.23 (m, 4H, Fmoc 및 1H, NH), 6.88 (d, 2H, Benz 및 1H, NH), 6.12 (bd, 1H, NH), 5.41-5.26 (m, 4H, 4xCH), 4.60-4.33 (m, 3H, Fmoc), 4.17 (t, 1H, CH), 3.82 (s, 3H, CH3), 3.62-3.23, (m, 16H, 8xCH2 및 1H, CH2), 2.73 (dd, 1H, CH2), 2.05-1.95 (m, 8H, 4xCH2), 1.85-1.65 (m, 4H, 2xCH2), 1.57-1.45 (m, 4H, 2xCH2), 1.24 (bs, 44H, 22xCH2), 0.88 (t, 6H, 2xCH3).
(e) (R)-2-아미노-N1-(2-(4-메톡시벤즈아미도)에틸)-N4,N4-비스(3-((Z)-옥타데크-9-에닐옥시)프로필)숙신아미드의 합성
Figure pat00023
디클로로에탄 중 2.12 g (9H-플루오렌-9-일)메틸 (R,Z)-1-(4-메톡시페닐)-10-(3-((Z)-옥타데크-9-에닐옥시)프로필)-1,6,9-트리옥소-14-옥사-2,5,10-트리아자도트리아콘트-23-엔-7-일-카르바메이트 ((d) 에서 수득) 에, 0.75 g 디에틸아민을 첨가하고, 26 시간 동안 교반 후, 진공 하 증발 건조시켜, 1.90 g 미정제 물질을 수득하고, 이를 20 g Dowex Monosphere 로의 흡착으로써 정제 및 후속의 에탄올 중 암모니아에 의한 탈착으로, 1.09 g (R)-2-아미노-N1-(2-(4-메톡시벤즈아미도)에틸)-N4,N4-비스(3-((Z)-옥타데크-9-에닐옥시)프로필)숙신아미드를 수득한다. 1H-NMR, CDCl3 (내부 표준으로서 TMS), 화학적 이동 (ppm): 7.88 (d, 2H, Benz 및 1H, NH), 7.64 (t, 1H, NH), 6.89 (d, 2H, Benz), 5.42-5.26 (m, 4H, 4xCH), 3.82 (s, 3H, CH3), 3.65-3.49, (m, 4H, 2xCH2), 3.42-3.28 (m, 12H, 6xCH2 및 1H, CH), 2.99 (dd, 1H, CH2), 2.71 (dd, 1H, CH2), 2.10-1.92 (m, 8H, 4xCH2 및 2H, NH2), 1.85-1.67 (m, 4H, 2xCH2), 1.60-1.47 (m, 4H, 2xCH2), 1.28 (bs, 44H, 22xCH2), 0.90 (t, 6H, 2xCH3). MS: 947.9 [M+Na]+.
실시예 5: N 2 ,N,N-디메틸아미노메틸렌-10-포르밀-폴산-α- tert. 부틸 에스테르-γ-2,3 비스(테트라데실옥시) 프로필아미드의 합성
Figure pat00024
2.2 g 의 N2,N,N-디메틸아미노메틸렌-10-포르밀-프테로산을, 46 ml 의 N,N-디메틸포름아미드에 첨가한다. 3.2 g 의 O-벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸-우로늄-헥사플루오로-포스페이트의 첨가 후, 혼합물을 20 분 동안 실온에서 교반한다. 이어서, 5.0 g 의 (2S)-글루탐산-γ-(2,3-비스(테트라데실옥시)프로필)아미드 및 50 ml N,N-디메틸포름아미드의 혼합물을 적가한다. 실온에서 17 시간 동안 교반 후, 고체를 여과로써 제거하고, 여과물을 진공 하 40℃ 에서 증발 건조시킨다. 잔류물을 100 ml 의 디클로로메탄 중 용해한다. 디클로로메탄 용액을 25 ml 의 수성 시트르산 용액, 25 ml 의 수성 5% 탄산수소나트륨 용액 및 25 ml 의 물로 세정한다. 수성 상들 각각을 디클로로메탄으로 추출한다. 조합된 디클로로메탄 상들을 황산마그네슘 상 건조하고, 증발 건조시켜, 황색의 폼을 수득하고, 이를 디클로로메탄/메탄올의 95:5 혼합물 중 용해하고, 15 분 동안 40℃ 에서 교반한다. 고체를 여과로써 제거하고, 여과물을 고체상으로서 SiO2 및 용리액으로서 디클로로메탄/메탄올/ 95:5 를 이용한 컬럼 크로마토그래피로써 정제한다. 생성물 분획 증발 후, 2.7g 의 황색 폼을 수득하고, 이를 다시 상기 기술된 바와 같은 컬럼 크로마토그래피로써 정제해 2.2 g 의 N2,N,N-디메틸아미노메틸렌-10-포르밀-폴산-α-tert. 부틸 에스테르-α-(2,3 비스(테트라데실옥시)프로필) 아미드를 담황색 폼으로써 수득한다. 1H-NMR, CDCl3 (내부 표준으로서 TMS), 화학적 이동 (ppm): 10.00 (bs, 1H, N3-H), 8.96 (s, 1H, C7-H), 8.76, 8.72 (2s, 2H, CHN, CHO), 7.88 (d, 2H, C2'-H, C6'-H), 7.73 (d, 1H, NH(Glu)), 7.35 (d, 2H, C3'-H, C5'-H),6.26 (d, 1H, Cα-NH), 5.32 (s, 2H, C6-H2), 4.53 (m, 1H, CH-Glu), 3.30-3.56 (m, 9H, m, 4CH2, CH-O-알킬 ), 3.22 (s, 3H, N-CH3), 3.15 (s, 3H, N-CH3), 2.03-2.40 (m, 4H, 2 CH2-Glu), 1.54 (m, s, 4H, 2CH2), 1.46 (s, 9H, OC(CH3)3), 1.24 (s, 44H, 22 CH2), 0.87 (m, 6H, 2x 알킬-CH3).
실시예 6: 폴산-γ-(2,3 비스(테트라데실옥시)프로필)아미드의 합성
Figure pat00025
2.1 g 의 N2,N,N-디메틸아미노메틸렌-10-포르밀-γ폴산-α-tert. 부틸 에스테르-γ-2,3 비스(테트라데실옥시)프로필아미드를, 105 ml 디클로로메탄에 용해한다. 105 ml 의 트리플루오로아세트산 첨가 후, 혼합물을 1 시간 동안 실온에서 교반한 다음 40℃ 에서 증발건조시켜 3.4 g 의 황색 폼을 수득한다. 후자를 105 ml 의 테트라히드로푸란 중 용해하고, 105 ml 의 1M 수성 나트륨 히드록시드 용액을 교반하면서 적가한다. 혼합물을 2.5 시간 동안 50℃ 로 가열한다. 실온에서 냉각 후, 유기층을 분리하고 증발 건조시킨다. 잔류물에, 105 ml 의 디클로로메탄 및 105 ml 의 1M 수성 염산을 첨가한다. 혼합물을 5 분 동안 실온에서 교반하고, 침전된 생성물을 흡입 제거해, 500 ml 의 물로 세정한 다음 진공 하 40℃ 에서 건조시켜, 1.76 g 의 폴산-γ-(2,3 비스(테트라데실옥시)프로필)아미드를 황색 고체로서 수득한다. 1H-NMR, DMSO-d6 (내부 표준으로서 TMS), 화학적 이동 (ppm): 11.59 (bs, 1H, N3-H), 8.64 (s, 1H, C7-H), 8.17 (d, 1H, NH), 7.81 (t, 1H, NH), 7.66 (d, 2H, C2'-H, C6'-H),7.01 (bs, NH, 1H), 6.92 (t, 2H, NH), 6.64 (d, 2H, C3'-H, C5'-H), 4.49 (d, 2H, C6-H2), 4.29 (m, 1H, CH-Glu), 3.26-3.46 (m, 5H,2CH2, CH-O-알킬), 3.08 (s, 2H, CH2), 2.17-2.2.5 (m, 2H, CH2), 1.84-2.11 (2m, 2H, CH2), 1.42, 1.23 (m, s, 44H, 22 CH2), 0.85 (m, 6H, 2x 알킬-CH3).
실시예 7: (2S,47S)-47-[2-N-(디메틸아미노)메틸렌]-10-포르밀프테로일아미노-2-[3-[[2,3-비스(테트라데실옥시)프로필]아미노]-3-옥소프로필]-4,44-디옥소-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-도데카옥사-3,43-디아자옥타테트라콘탄-1,48-디오산의 합성
Figure pat00026
(a) Fmoc-Glu(DMA)-디페닐메틸 레진의 합성:
100 ml SPPS 반응기에서, 3.85 g 의 디페닐디아조메탄 레진 (3.3 mmol) 을, 30 ml DCM 으로 2 회 세정하고, 4.2 g 의 2S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-글루탐산-γ-2,3-비스(테트라데실옥시)프로필-아미드 (실시예 2 참조, 1.5 eq., 5.0 mmol) 의 30 ml DCM 중 용액으로 하룻밤 처리한다. 용액을 여과 제거하고, 레진을 DCM 으로 4 회 세정한다. 결국 미반응된 디페닐디아조메탄을 제거하기 위해, 레진을 15 분 동안 30 ml DCM 중 125 ㎕ 아세트산 (0.5 eq., 2.2 mmol) 으로 처리하고, 이후 30 ml 디메틸포름아미드 및 이소프로판올로 번갈아 3 회 세정한다. 레진을 2 회 디이소프로필 에테르로 세정하고, 진공 하 밤새 건조한다. 6.7 g 의 원하는 생성물을 수득한다 (> 100 % 의 이론, 이론치 수율6.5 g). 레진의 로딩은, 304 nm 에서 Fmoc 절단 생성물의 UV 측정에 의해 0.49 mmol/g 로 결정된다 (이론치 최대 로딩: 0.51 mmol/g).
(b) H-Glu-OtBu-NH-PEG12-PA-Glu(DMA)-디페닐메틸 레진의 합성:
H-Glu-OtBu-NH-PEG12-PA-Glu(DMA)-디페닐메틸 레진을 하기의 반응 순서에 의해 종래의 고체 상 합성법을 통해 수득한다:
(1) Fmoc-Glu(DMA)-디페닐메틸 레진의 Fmoc 기의 DMF 중 피페리딘으로의 절단,
(2) DIPEA 및 DMF 중 HBTU 를 이용한 Fmoc-NH-PEG12-PA-COOH 와의 축합,
(3) Fmoc-NH-PEG12-PA-Glu(DMA)-디페닐메틸 레진의 Fmoc 기의 DMF 중 피페리딘으로의 절단,
(4) DIPEA 및 DMF 중 HBTU 를 이용한 Fmoc-Glu-OtBu 로의 축합 및 최종적으로
(5) Fmoc-Glu-OtBu-NH-PEG12-PA-Glu(DMA)-디페닐메틸 레진의 Fmoc 기의 DMF 중 피페리딘으로의 절단.
(c) [2-N-(디메틸아미노)메틸렌]-10-포르밀프테로일-Glu-OtBu-NH-PEG12-PA-Glu(DMA)-디페닐메틸 레진의 합성:
[2-N-(디메틸아미노)메틸렌]-10-포르밀프테로일-Glu-OtBu-NH-PEG12-PA-Glu(DMA)-디페닐메틸 레진을, DMF 중 H-Glu-OtBu-NH-PEG12-PA-Glu(DMA)-디페닐메틸 레진을 [2-N-(디메틸아미노)메틸렌]-10-포르밀프테로산, HATU 및 DIPEA 와 반응시켜 종래의 고체 상 합성법을 통해 수득한다.
(d) (2S,47S)-47-[2-N-(디메틸아미노)메틸렌]-10-포르밀프테로일아미노-2-[3-[[2,3-비스(테트라데실옥시)프로필]아미노]-3-옥소프로필]-4,44-디옥소-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-도데카옥사-3,43-디아자옥타테트라콘탄-1,48-디오산의 합성:
4.5 g [2-N-(디메틸아미노)메틸렌]-10-포르밀프테로일-Glu-OtBu-NH-PEG12-PA-Glu(DMA)-디페닐메틸 레진을, 45 ml 디클로로메탄으로 세정하고, 여과제거하고 다시 45 ml 디클로로메탄 중에서 현탁한다. 이후, 41.4 ml 의 트리플루아로아세트산을 첨가하고, 2.25 ml 트리이소프로필실란을 첨가한다. 현탁액을 실온에서 1 시간 동안 교반한 다음 여과한다. 레진을 45 ml 디클로로메탄으로 각각 3회 세정한다. 조합된 여과물을 진공 하 증발시켜, 5.75 g 의 앰버 (amber) 오일을 수득한다. HPLC: 90.7 %area, ESI-MS: 모노이소토픽 MW calc.= 1718.1, MW [M-H]- = 1718.0.
실시예 8: (2S,47S)-47-프테로일아미노-2-[3-[[2,3-비스(테트라데실옥시)프로필]아미노]-3-옥소프로필]-4,44-디옥소-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-도데카옥사-3,43-디아자옥타테트라콘탄-1,48-디오산의 합성
Figure pat00027
4.6 g (2S,47S)-47-[2-N-(디메틸아미노)메틸렌]-10-포르밀프테로일아미노-2-[3-[[2,3-비스(테트라데실옥시)프로필]아미노]-3-옥소프로필]-4,44-디옥소-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-도데카옥사-3,43-디아자옥타테트라콘탄-1,48-디오산을, 460 ml 1N NaOH 로 50℃ 에서 2 시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 59.2 g 32% NaOH 의 첨가에 의해 pH 12.5 로 만든다. 갈색 용액을 0.46 g 활성화 탄소로 15 분 동안 50℃ 에서 처리하고, 고온 여과하고, 3.2 g 37% HCl 의 첨가에 의해 pH 1 로 만든다. 생성 침전물을 여과로써 수집하고, 물로 세정하고, 실온에서 진공 하 건조시켜, 1.2 g 의 녹황색 고체를 수득한다. HPLC: 89.9 %면적, ESI-MS: 모노이소토픽 MW calc.= 1635.0, MW [M-H]- =1634.1.
실시예 9: RGD 지질 펜타펩티드 시클로[-Asp-hGlu(DMA)-D-Val-Arg-Gly-] 의 합성:
Figure pat00028
(a) Fmoc-hGlu(OBzl)-OH 의 합성:
시판중인 호모 글루탐산 (H-hGlu-OH) 은, 공개된 프로토콜 (Benoiton L., Can. J. Chem., 40, 570 (1962)) 에 따라
Figure pat00029
-벤질 에스테르로서 측쇄 보호화한다 (수율: 19.8 g, 26 % 의 이론치, TLC (CHCl3/MeOH/32 % 아세트산 5:3:1) Rf = 0.62). 추가 정제 없이, H-hGlu(OBzl)-OH (19.7 g, 77.6 mmole) 를, 디옥산/물 (1:2, 300 ml) 의 혼합물 중 용해하고, NaHCO3 (12.8 g, 155 mmole) 및 Fmoc-OSu (26.2 g, 77.6 mmole) 의 첨가로써 Fmoc 보호화한다. 완료 후, 반응 혼합물을 3 회 디이소프로필에테르로 추출한다. 생성물 함유 수성층을 HCl 로 pH 2 로 조절하고, 생성물을 에틸 아세테이트로 3 회 추출한다. 조합된 유기층들을 중성 pH 로 H2O 를 이용해 세정한다. 에틸 아세테이트를 증발시키고, 잔류수를 아세토니트릴과의 공비혼합물로서 제거한다. 따라서, 생성물을 건조 폼으로서 수득한다: 34.9 g, 73.7 mmole, 95 % 의 이론치, ESI-MS: 모노이소토픽 MW calc. = 473.2, MW [M+H]+= 474.1.
(b) H-Asp(OtBu)-hGlu(OBzl)-D-Val-Arg(Pbf)-Gly-OH 의 합성:
고체 상 펩티드 합성을, 하기의 Fmoc/tBu 전략에 따라 실시하고 (Atherton E., et.al., J.Chem. Soc., Chem. Comm. , 539 (1978)), H-Gly-2-ClTrt (46 g, 34.5 mmole) 를 베이스 레진으로서 이용하고, 커플링을 하룻밤 Fmoc-Xaa-OH/DIC/HOBt (2 eq. : 4 eq. : 3 eq.) 에 의해 수행하고, Fmoc 보호 제거를 5 및 10 분 후 DMF 중 20% 피페리딘에 의해 달성한다. 디메틸포름아미드/이소프로판올을 이용한 3회 교대 세정 단계를 각 커플링 및 탈보호화 단계 각각 후에 이용한다. 시간 순서대로 사용된 아미노산 유도체는 Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-D-Val-OH, Fmoc-homoGlu(OBzl)-OH 및 Fmoc-Asp(OtBu)-OH 이다. Fmoc-SPPS 로, 73.4 g 의 선형 펩티드 레진 (레진 27.4 g 의 증중량 , 87 % 의 이론치, 이론 = 31.5 g) 를 수득한다.
측쇄 보호화된 선형 펜타펩티드를, 레진 (72.0 g) 로부터, 3 회 반복으로 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올/디클로로메탄 1:4 (700 ml) 의 혼합물에 의해 절단한다. 조합된 여과물의 용매를, 감압 하 제거하고, 생성된 오일을 냉 메틸- t-부틸에테르 (1 L) 에서 교반해, 회백색의 침전물을 수득하고, 이를 여과해내고, 3 회 메틸 t-부틸에테르로 세정하고, 진공 하 건조한다: 23.6 g, 23.9 mmole, 70 % 의 이론치, 베이스 레진의 로딩 기준, HPLC 상 > 40 면적 %, 체류 시간 14.1 분 (HPLC 조건: 컬럼 = Halo® Peptide ES-C18, 4.6x150 mm, 2.7 ㎛, 구배: 30 분 간 25 % 에서 90 % B 의 선형 아세토니트릴 구배, 완충액 A = 0.1 % TFA 및 2 % 수 중 아세토니트릴, 완충액 B = 아세토니트릴 중 0.1 % TFA, 파장 = 210 nm), ESI-MS: 모노이소토픽 MW calc. = 986.5, MW [M+H]+ = 987.6.
(c) 시클로[-Asp(OtBu)-hGlu(OBzl)-D-Val-Arg(Pbf)-Gly-] 의 합성:
선형 측쇄 보호화된 펜타펩티드 H-Asp(OtBu)-hGlu(OBzl)-D-Val-Arg(Pbf)-Gly-OH (23.6 g, 23.9 mmole) 및 인-시츄 활성화 시약 PyBOP (12.4 g, 23.9 mmol) 을, 10 L 의 디메틸포름아미드 (DMF) 중 용해하고, 3 시간 이내에 추가의 PyBOP (24.9 g, 47.8 mmole) 및 Huenig 염기 (16.4 ml, 95.6 mmole) 의 5 L DMF 중 용액에 적가한다. 생성된 용액을 하룻밤 교반한다. DMF 를 진공 하 제거하고, 수득된 오일을 환류 하 1.8 L 에탄올 중 용해하고, -18 ℃ 에서 3.2 L 의 물의 첨가로써 결정화한다. 침전물을 여과해내고, 물 및 에테르로 세정한다. 또한, 이것을 추가로 실리카 겔 크로마토그래피로써 (150 g 실리카 겔 60, 용리액: 디클로로메탄/메탄올 9:1) 정제해, 순도 > 91 HPLC 상 면적 % 의 3.6 g 의 시클릭 펜타펩티드 (HPLC 조건: 컬럼 = Halo® Peptide ES-C18, 4.6x150 mm, 2.7 ㎛, 구배: 30 분에서, 25 % 에서 90 % B 의 선형 아세토니트릴 구배, 완충액 A = 0.1 % TFA 및 2 % 수중 아세토니트릴, 완충액 B = 아세토니트릴 중 0.1 % TFA, 파장 = 210 nm) 를 수득한다; 3.7 mmole, 15 % 의 이론치, 체류 시간 15.8 min, ESI-MS: 모노이소토픽 MW calc. = 968.4, MW [M+H]+ = 969.5.
(d) 시클로[-Asp(OtBu)-hGlu-D-Val-Arg(Pbf)-Gly-] 의 합성:
벤질 에스테르를, 가수소분해로써 특이적으로 절단한다. 이를 위해, 3.6 g (3.7 mmole) 의 시클로[-Asp(OtBu)-hGlu(OBzl)-D-Val-Arg(Pbf)-Gly-] 를, 20 ml DMF 중 용해하고, 2 L 메탄올로 희석한다. 5 g 의 활성화탄 상 5 % 팔라듐을 상기 용액에 첨가 후, 혼합물을 수소화한다. 완료되자마자, 촉매를 여과해내고, 용액을 감압 하 농축한다. 생성물을 메틸- t-부틸에테르에서 침전시켜, 3.0 g 의 원하는 생성물을 수득한다: 3.4 mmole, 수율 93 % 의 이론치, 순도: HPLC 상 75 면적 % (HPLC 조건: 컬럼 = Halo® Peptide ES-C18, 4.6x150 mm, 2.7 ㎛, 구배: 30 분 내 25 % 에서 90 % B 의 선형 아세토니트릴 구배, 완충액 A = 0.1 % TFA 및 2 % 수 중 아세토니트릴, 완충액 B = 0.1 % 아세토니트릴 중 TFA, 파장 = 210 nm), 체류 시간 13.8 min.
(e) 시클로[-Asp-hGlu(DMA)-D-Val-Arg-Gly-] 의 합성:
1.5 g (1.7 mmole) 의 시클로 펜타펩티드 시클로[-Asp(OtBu)-hGlu-D-Val-Arg(Pbf)-Gly-] 를, PyBOP/DIPEA 활성화 (0.9 g, 1.7 mmol/0.6 ml, 3.4 mmole) 에 의해, 100 ml DMF 중 2,3-디미리스틸-1-아미노-sn-글리세롤 (DMA; 1.0 g, 2.0 mmole) 에 컨쥬게이션한다. 반응 혼합물을 밤새 교반한다. 이어서, 200 ml 디클로로메탄을 첨가하고, 유기 상을 3 회 50 ml 2 % KHSO4 로 추출하고, 3 회 물로 추출한다. 유기층을 감압 하 증발시키고, 잔류수를 아세토니트릴과의 공비 혼합물로서 제거한다. 생성된 폼을 직접 최종 절단 칵테일 TFA/H2O/트리이소프로필실란/디티오에리트리톨 (92.5:2.5:2.5:2.5) 로 1.5 시간 동안 처리하고, 이후 용액을 냉 디이소프로필에테르 (5 ℃) 에 원하는 생성물을 침전시키도록 적가한다. 이후, 잔류물을 여과로써 분리하고, 2 회 디이소프로필에테르로 세정하고, 나아가 진공 하 건조해 0.5 g 의 표제 화합물을 수득한다: 0.5 mmole, 30 % 의 이론치, > 93.0 HPLC 상 면적 % (HPLC 조건: 컬럼 = Zorbax SB-C3, 4.6x250 mm, 5㎛, 구배: 25 분에서 30% 에서 100% B 로의 선형 아세토니트릴 구배, 완충액 A = 0.1 % TFA 및 2 % 수중 아세토니트릴, 완충액 B = 0.1 % 아세토니트릴 중 TFA, 파장 = 210 nm), 체류 시간 22.0 min, ESI-MS: 모노이소토픽 MW calc. = 1035.8, MW [M+H]+ = 1037.1.
실시예 10: 폴레이트 데코레이션된 리포솜을 함유하는 pVision-RFP-C 벡터의 제조
478.2 mg POPC, 58.8 mg Chol, 13.5 mg 폴레이트-지질 (실시예 8 참조) 및 2 ㎍ 7-니트로벤조푸라잔-라벨링된-DOPE 를, 750 ㎕ 에탄올 (96 %) 중 60℃ 에서 용해하고, PBS pH 7.4 를 함유하는 4.25 mL 의 RFP 플라스미드 (1.27 mg RFP-Plasmid/mL) 에 주입한다. 사용된 지질의 몰비는 77.99:18.83:1.02:0.27 이다. 5 회의 200 nm 폴리카르보네이트 막 및 5 회의 100 nm 폴리카르보네이트 막을 통한 압출 및 정용여과 후, 리포솜은 0.13 의 PDI 의 161 nm 의 평균 크기를 가진다. POPC:Chol 의 몰비는 77.99:15.76 이고, HPLC 분석에 따르면 폴레이트-지질 함량은 502 ㎍/ml (표적화 770 ㎍/ml) 이다.
실시예 11: 아니스 (anis) 아미드 데코레이션된 리포솜의 제조
470 mg POPC, 60 mg Chol 및 13.5 mg 아니스 아미드 지질 (실시예 4 참조) 을, 55℃ 에서 750 ㎕ 에탄올 (96 %) 중 용해하고, 4.25 mL 의 PBS pH 7.4 에 주입한다. 사용된 지질의 몰비는 77.99:18.83:1.02:0.27 이다. 100 nm 폴리카르보네이트 막을 통한 압출 후, 리포솜은 0.068 의 PDI 및 110 nm 의 평균 크기를 가진다. HPLC 분석에 따르면, 아니스 아미드 지질 함량은 72% 의 이론값이다.
실시예 12: RGD 데코레이션된 리포솜의 제조
DOPC, Chol, NBD-DOPE, 및 실시예 9 에서 수득된 RGD-지질의 혼합물 (DOPC:Chol:NBD-DOPE:RGD-지질의 몰비: 66:33:0.5:0~5) 를 이용해, HEPES 완충액 중 건조 필름 방법 후, 5 회의 200 nm 폴리카르보네이트 막 및 21 회 동안의 100 nm 폴리카르보네이트 막을 통하고 Lipofast 압출기 (Avestin, Inc., Ottawa, Canada) 를 이용한 압출로써 리포솜을 제조한다. 수득된 리포솜을 사용때까지 4℃ 에서 보관한다.
실시예 13: RGD 데코레이션된 리포솜의 세포 흡수
M21 세포 상 RGD 데코레이션된 리포솜 (실시예 6 에서 수득) 에 대한 세포 흡수 정도를, Guava easyCyte 8HT 유세포분석기로써 검출된 NBD-DOPE 시그널을 바탕으로 평가하고, 도 1 및 표 1 에 나타낸다.
Figure pat00030
세포 흡수에서 약 16 배 강화가, 비(非)표적화 리포솜 (0% DMA-RGD) 과 대조시, RGD 표적화 리포솜 (5% DMA-RGD) 에서 관찰된다. x-축은 리포솜에서 DMA-RGD 의 몰 비 (%) 를 나타낸다. y-축은 NBD 양성 세포를 나타낸다 (%). 도 1 은 RGD 모이어티가 M21 세포에서 발현된 표적 수용체 (인테그린 αvβ3 수용체) 를 인지할 수 있음을 나타낸다 (* p < 0.01).
실시예 14: (5S,8S,45S,E)-11-(2-아미노-2-옥소에틸)-45-(3-((2,3-비스(테트라데실옥시)프로필)아미노)-3-옥소프로필)-5,8-디메틸-3,6,9,12,15,43-헥사옥소-1-페닐-2,19,22,25,28,31,34,37,40-노나옥사-4,7,10,11,16,44-헥사아자헥사테트라콘트-13-엔-46-산의 합성
Figure pat00031
(a) Fmoc-Glu(DMA)-디페닐메틸 레진 (실시예 7 참조, 1.1 eq., 3.05 mmol) 의 합성.
(b) RR11a-NH-PEG8-PA-Glu(DMA)-디페닐메틸 레진의 합성:
RR11a-NH-PEG8-PA-Glu(DMA)-디페닐메틸 레진을, 하기의 반응 순서로써 종래의 고체 상 합성법을 통해 수득한다:
(1) Fmoc-Glu(DMA)-디페닐메틸 레진의 Fmoc 기의 DMF 중 피페리딘으로의 절단,
(2) DIPEA 및 DMF 중 PyBOP 를 이용한 Fmoc-NH-PEG8-PA 와의 축합,
(3) Fmoc-NH-PEG8-PA-Glu(DMA)- 디페닐메틸 레진의 Fmoc 기의 DMF 중 피페리딘으로의 절단 및 최종적으로
(4) DIPEA 및 DMF 중 PyBOP 을 이용한 RR11a-OH 와의 축합.
(c) (5S,8S,45S,E)-11-(2-아미노-2-옥소에틸)-45-(3-((2,3-비스(테트라데실옥시)프로필)아미노)-3-옥소프로필)-5,8-디메틸-3,6,9,12,15,43-헥사옥소-1-페닐-2,19,22,25,28,31,34,37,40-노나옥사-4,7,10,11,16,44-헥사아자헥사테트라콘트-13-엔-46-산의 합성:
7.15 g RR11a-NH-PEG8-PA-Glu(DMA)-디페닐메틸 레진을, 50 ml 디클로로메탄 각각으로 세정하고, 여과해내고, 다시 50 ml 디클로로메탄으로 현탁하고, 진공 하 건조한다. 이어서, 70 ml 의 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산의 5% 용액을 첨가했다. 현탁액을 실온에서 3.5 시간 동안 교반한 다음 100 ml 냉 디이소프로필에테르에 여과한다. 레진을 디클로로메탄/디이소프로필에테르 (1/1) 로 린스한다. 조합된 여과물을 진공 하 증발시키고, t-BuOH 로부터 동결건조해 4.15 g (92%) 의 앰버 고체를 수득한다. ESI-MS: 모노이소토픽 MW calc.= 1481.9, MW [M-H]- = 1480.2.
실시예 15: (5S,8S,45S,E)-11-(2-아미노-2-옥소에틸)-45-(3-((2,3-비스(테트라데실옥시)프로필)아미노)-3-옥소프로필)-5,8-디메틸-3,6,9,12,15,43-헥사옥소-1-페닐-2,19,22,25,28,31,34,37,40-노나옥사-4,7,10,11,16,44-헥사아자헥사테트라콘트-13-엔-46-산의 합성
Figure pat00032
7.15 g RR11a-NH-PEG8-PA-Glu(DMA)-OH (실시예 14 의 생성물) 및 1.50 ml DIPEA 를, 70 ml 디클로로메탄 중에 용해한다. 이어서, 4.32 g MeO-PEG-NH2 및 1.67 g PyBOP 를 첨가하고, 용액을 하룻밤 교반한다. 갈색 용액을 증발시키고, 잔류물을 300 g 실리카 겔 (Merck 60, 0.040-0.063 mm) 상 에틸아세테이트, 메탄올 및 트리에틸아민의 16:3.1 및 17:2:1 의 비율의 혼합물을 이용해 컬럼 크로마토그래피로써 2 회 정제한다. 분획을 함유하는 생성물을 조합하고, 증발시키고, 생성 점성 잔류물을 t-BuOH 로부터 동결건조해 4.5 g (60%) 의 황색 고체를 수득한다. MALDI-MS: 모노이소토픽 MW calc.= 3476.2, MW [M+Na]+ = 3500, Mn = 3363.2, MW = 3384.5, P디 = 1.01
실시예 16: 벤질 ((2S,5S,14S,E)-8-(2-아미노-2-옥소에틸)-14-카르바모일-5-메틸-3,6,9,12,17-펜타옥소-20-(테트라데실옥시)-22-옥사-4,7,8,13,18-펜타아자헥사트리아콘트-10-엔-2-일)카르바메이트의 합성
Figure pat00033
(a) Fmoc-Glu(DMA)-Sieber 레진의 합성:
100 ml SPPS 반응기에서, 5.0 g 의 Sieber 레진 (3.1 mmol) 를, 50 ml DMF 로 2 회 세정하고, DMF 중 피페리딘의 20% 용액으로 15 분에 걸쳐 처리하고, 50 ml DMF 및 50 ml iPrOH 로 교대로 3 회 세정한다. 이어서, 2.5 시간 동안의, 3.2 g 의 (2S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-글루탐산-γ-2,3-비스(테트라데실옥시)프로필-아미드 (실시예 2 참조, 1.25 eq., 3.8 mmol) 및 2.48 g PyBOP (1.5 equ.) 의 50 ml DMF, 및 1.62 ml DIPEA (2.5 equ.) 중의 용액. 상기 용액을 여과해내고, 레진을 3 회 50 ml DMF 및 50 ml iPrOH 로 번갈아 세정한다.
(b) RR11a-Glu(DMA)-Sieber 레진의 합성:
RR11a-Glu(DMA)-Sieber 레진을 하기 반응 순서에 의해 종래의 고체 상 합성법을 통해 수득한다:
(1) DMF 중 피페리딘으로의 Fmoc-Glu(DMA)-Sieber 레진의 Fmoc 기의 절단 (진공 하 건조 후 5.6 g 레진).
(2) DMF 중 DIPEA 를 이용한 RR11a-NHS 로의 축합.
(c) 레진로부터의 생성물의 절단:
2.6 g RR11a-Glu(DMA)-Sieber 레진을, 디클로로메탄 중 5% 트리플루오로아세트산 20 ml 로 2 시간 처리한다. 현탁액을 100 ml 냉 디이소프로필에테르로 여과한다. 여과물을 진공 하 증발시키고, t-BuOH 로부터 동결건조시켜, 660 mg 의 황색 고체를 수득한다. ESI-MS: 모노이소토픽 MW calc.= 1056.7, MW [M-H]- = 1056.0.
실시예 17: 벤질 ((2S,5S,42S,E)-8-(2-아미노-2-옥소에틸)-42-카르바모일-5-메틸-3,6,9,12,40,45-헥사옥소-48-(테트라데실옥시)-16,19,22,25,28,31,34,37,50-노나옥사-4,7,8,13,41,46-헥사아자테트라헥사콘트-10-엔-2-일)카르바메이트의 합성
Figure pat00034
(a) Fmoc-Glu(DMA)-Sieber 레진의 합성: (실시예 16 참조).
(b) NH2-PEG8-PA-Glu(DMA)-Sieber 레진의 합성:
NH2-PEG8-PA-Glu(DMA)-Sieber 레진을, 하기의 반응 순서에 의해 종래의 고체 상 합성을 통해 수득한다:
(1) Fmoc-Glu(DMA)-Sieber 레진의 Fmoc 기의 DMF 중 피페리딘으로의 절단,
(2) DIPEA 및 DMF 중 HBTU 를 이용한 Fmoc-NH-PEG8-PA 로의 축합, 및 마지막으로
(3) DMF 중 피페리딘으로의 Fmoc-NH-PEG8-PA-Glu(DMA)-Sieber 레진의 Fmoc 기의 절단.
(c) NH2-PEG8-PA-Glu(DMA)-아미드의 합성:
생성물을 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산을 이용해 NH2-PEG8-PA-Glu(DMA)-Sieber 레진로부터 절단한다. ESI-MS: 모노이소토픽 MW calc.= 1034.8, MW [M+H]+ = 1035.9.
(d) 벤질 ((2S,5S,42S,E)-8-(2-아미노-2-옥소에틸)-42-카르바모일-5-메틸-3,6,9,12,40,45-헥사옥소-48-(테트라데실옥시)-16,19,22,25,28,31,34,37,50-노나옥사-4,7,8,13,41,46-헥사아자테트라헥사콘트-10-엔-2-일)카르바메이트의 합성:
기계적 교반기가 구비된 5 ml 둥근 바닥 플라스크에, 2 ml 디클로로메탄 중 42 mg 의 NH2-PEG8-PA-Glu(DMA)-아미드 (40.6 mmol) 로 충전한다. 이어서, 0.01 ml 트리에틸아민 (95 mmol) 을 첨가한다. 2-3 분의 교반 후 옅은 황색 용액이 생기고, 23 mg 의 RR11a-NHS (41 mmol) 를 3 분의 시간에 걸쳐 첨가한다. 용액을 1 시간 동안 교반하고, 감압 하 증발시켜, 회백색 고체 생성물을 수득한다. 생성물은 TLC 에서 단일 스폿을 나타낸다. MW calc.= 1480.0, MW [M+H]+ = 1482 및 MW [M+Na]+ = 1504.0.
실시예 18: 벤질 ((2S,5S,126S,E)-8-(2-아미노-2-옥소에틸)-126-카르바모일-5-메틸-3,6,9,12,124,129-헥사옥소-132-(테트라데실옥시)-16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,79,82,85,88,91,94,97,100,103,106,109,112,115,118,121,134-헵타트리아콘타옥사-4,7,8,13,125,130-헥사아자옥타테트라콘타헥트-10-엔-2-일)카르바메이트의 합성
Figure pat00035
(a) Fmoc-Glu(DMA)-Sieber 레진: (실시예 16 참조).
(b) RR11a-NH-PEG36-PA-Glu(DMA)-Sieber 레진의 합성:
RR11a-NH-PEG36-PA-Glu(DMA)-Sieber 레진을 하기 반응 순서로써 종래의 고체 상 합성법을 통해 수득한다:
(1) Fmoc-Glu(DMA)-Sieber 레진의 Fmoc 기의 DMF 중 피페리딘으로의 절단,
(2) DIPEA 및 DMF 중 PyBOP 를 이용한 Fmoc-NH-PEG36-PA 로의 축합,
(3) DMF 중 피페리딘으로의 Fmoc-NH-PEG36-PA-Glu(DMA)-Sieber 레진의 Fmoc 기의 절단, 마지막으로
(4) DMF 중 DIPEA 를 이용한 RR11a-NHS 로의 축합
(c) 벤질 ((2S,5S,126S,E)-8-(2-아미노-2-옥소에틸)-126-카르바모일-5-메틸-3,6,9,12,124,129-헥사옥소-132-(테트라데실옥시)-16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,79,82,85,88,91,94,97,100,103,106,109,112,115,118,121,134-헵타트리아콘타옥사-4,7,8,13,125,130-헥사아자옥타테트라콘타헥트-10-엔-2-일)카르바메이트의 합성:
7.0 g RR11a-NH-PEG36-PA-Glu(DMA)-Sieber 레진을, 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산의 2% 용액 70 ml 로 처리한다. 현탁액을 실온에서 3 시간 교반한 다음 70 ml 냉 디이소프로필에테르에 여과한다. 여과물을 진공 하 증발시키고, t-BuOH 로부터 동결건조시켜 1.25 g 의 백색 고체를 수득한다. ESI-MS: 모노이소토픽 MW calc.= 2713.7, MW [M+Na+H]2+= 1380.1.
실시예 19: RR11a 데코레이션된 리포솜의 제조
RR11a 데코레이션된 리포솜 (MS 15-4) 및 대조군 리포솜 (MS 15-0) 은 하기의 지질 용액으로 구성한다:
Figure pat00036
3 ml 스크류 캡 유리 바이알 (Teflon 라인드 (lined) 캡) 에, 상기 지질로 충전하고, 간략히 보르텍싱한다. 클로로포름을 지질의 불투명 필름이 수득될 때까지 아르곤 스팀 하 증발시킨다. 이어서, 바이알을. 진공 하 10 분 동안 데시케이터에 놓는다. 건조 필름에, 1000 uL 의 DPBS 1X 를 첨가하고, 함유물을 균질의 우유빛 현탁액이 수득될 때까지 (3-4 분) 보르텍싱한다. 이후, 5분간 Branson 1510 모델에서 배쓰 (bath) 초음파처리하여 탁한 현탁액을 수득한다. 이 현탁액을 이후 Branson Model 4C15 에서 30% 의 완전 진폭에서 30 초간 (포밍 방지) 프로브 (probe) 초음파처리해 거의 반투명한 리포솜 현탁액을 수득한다. 현탁액을 100 nm 폴리카르보네이트 막 (Avanti No 610005) 을 통해 고압 압출한다. 최종적으로, 현탁액을 0.22 ㎛ Millex-GV 막 필터를 통해 멸균 여과하고, 멸균 바이알에서 4 ℃ 에서 보관한다. MS-15-0 및 15-4 의 Z 평균 수력학적 직경은 각각 101 및 99 um 이다 (Malvern ZetaSizer 장치).
실시예 20: RR11a 데코레이션된 리포솜의 레구마인 표적화
레구마인 표적화 실험을, 실시예 19 의 리포솜 제형물을 이용해 하기 프로토콜에 따라 수행한다:
제 1 일 비(非)처리된 유리 슬라이드 상 3.12x10e4 4T1 세포 /cm2 시딩
제 2 일 100 uM CoCl2 첨가; 24 시간 인큐베이션
제 3 일 100 ul 리포솜 첨가 (10e12 NPs/ml); 2 시간 인큐베이션;
5ug/ml Hoechst 33342 첨가; 20 분 인큐베이션; 형광 현미경에 올려 놓아 분석함.
세포 배양 배지: 10% FBS, 10 mM Hepes, 0.075% w/v 중탄산나트륨 및 1mM 나트륨 피루베이트로 보충된 L-글루타민 함유 RPMI 1640 1x
이미지 디콘불루션 분석을 위해 핵 포커스 포인트 주위 0.5 um 높이 포커스 단계로 20-30 이미지 더미 (stack) 및 100 ms 투명 필드와, 63x 대물렌즈, 2x2 빈 (bin), Hoechst 에 대해서는 500 ms, RhodB 에 대해서는 1000 ms 를 이용해, 각 포트대상 (portaobject) 으로부터 랜덤 필드로부터 사진을 획득한다. 도 2 는 디콘불루션 후 더미에서 20-30 이미지들 중 하나를 나타내는데, 이는 중간 포커스 포인트를 나타낸다. 분명히도, 상기 데이타는 RhB-DOPE 와 세포의 공동국소화를 나타내고, 그에 따라 RR-11a-8PEG-PA-Glu(DMA)-아미드를 가진 리포솜이 이들 세포를 비표적화된 대조군과 비교시 효과적으로 표적한다는 점을 입증한다.
실시예 21: 항체 (Fc 단위) 표적화 지질, 디술파이드 브릿지화 데카펜타펩티드 H-Glu(DMA)-Ala-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-OH의 합성
Figure pat00037
(a) 선형 H-Glu(DMA)-Ala-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-OH 의 합성:
고체 상 펩티드 합성을, Fmoc/tBu 전략을 따라 고체 상 합성기 ABI 431A 로 실시하고 (Atherton E., et.al., J.Chem. Soc., Chem. Comm. , 539 (1978)), H-Thr(tBu)-2-ClTrt (0.5 g, 0.25 mmole) 를 베이스 레진으로서 이용한다. 시간 순서 대로 사용되는 아미노산 유도체는 Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc- Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH 및 Fmoc-Glu(DMA)-OH 이다. 커플링은, DIPEA/PyBOP 을 이용해 커플링된 Fmoc-Glu(DMA)-OH (4.8 eq. : 7.2 eq. : 4.8 eq.) 을 제외하고, Fmoc-Xaa-OH/트리메틸피리딘/HBTU (4 eq. : 4 eq. : 3.6 eq.) 으로써 수행한다. Fmoc 보호기의 제거는 DMF 중 20% 피페리딘에 의해 달성한다. 디메틸포름아미드로의 3 회 교대의 세정 단계를, 각 커플링 및 탈보호화 단계 각각 이후에 활용한다. Fmoc-SPPS 로, 1.4 g 의 선형 펩티드 레진을 수득한다.
선형 데카펜타펩티드를, 레진으로부터 트리플루오로아세트산/트리이소프로필실란/디티오에리트리톨/물 (92.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5, 14 ml) 의 혼합물에 의해 2.5 시간 동안 절단한다. 여과 후, 여과물을 140 ml 디이소프로필에테르로 희석한다. 갈색 고체를 여과해내고, 진공 하 건조한다: 485 mg, 37 % 의 이론치, ESI-MS: 모노이소토픽 MW calc. = 2198.2, MW [M+2H]2+ = 1099.6.
(b) 디술파이드 브릿지화 H-Glu(DMA)-Ala-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-OH 의 합성;
실시예 21 a) 에서 수득한 10 mg 의 갈색 고체를 10 ml 메탄올에서 용해하고, DIPEA 를 첨가함으로써 pH 8 로 만든다. 용액을 산소 분위기 하 밤새 교반한다. 용액 증발로, 최종 생성물을 정량적 수율로 갈색 고체로서 수득한다. ESI-MS: 모노이소토픽 MW calc. = 2196.2, MW [M+2H]2+ = 1098.6.
실시예 22: 압출 없이 RR11a 데코레이션된 리포솜의 제조
RR11a 데코레이션된 리포솜 (MS-32-1 내지 MS-32-10) 은 하기의 지질 용액으로 구성된다:
3 ml 스크류 캡 유리 바이알 (Teflon 라인드 캡) 에, 상기 지질로 충전하고 간략히 보르텍싱한다. 클로로포름을 지질의 불투명 필름이 수득될 때까지 아르곤 스팀 하 증발시킨다. 이어서, 바이알을 진공 하 10 분 동안 데시케이터에 놓는다. 건조 필름에, 1000 uL 의 DPBS 1X 를 첨가하고, 함유물을 균질의 우유빛 현탁액이 수득될 때까지 (10 분) 보르텍싱한다. 이후, 5분간 Branson 1510 모델에서 배쓰 초음파처리하여 탁한 현탁액을 수득한다. 이 현탁액을 이후 Branson Model 4C15 에서 40% 의 완전 진폭에서 30 초간 (포밍 방지) 프로브 초음파처리해 거의 반투명한 리포솜 현탁액을 수득한다. 최종적으로, 현탁액을 0.22 ㎛ Millex-GV 막 필터를 통해 멸균 여과하고, 멸균 바이알에서 4 ℃ 에서 보관한다. Z 평균 수력학적 직경 및 PDI 를 Malvern ZetaSizer 장치를 이용해 측정한다:
Figure pat00038
1. 하기 식 I 의 화합물을 포함하는 담체 시스템:
Figure pat00039
[식 중,
Y 는 O, N, S 또는 공유 결합을 나타내고,
S1, S2, S3 는 서로 독립적으로 공유 결합 또는 스페이서 (spacer) 기를 나타내고,
X1, X2, X3 는 서로 독립적으로 H 또는 리간드기를 나타내고,
L 은 하기 식 (a) 의 기를 나타내고:
Figure pat00040
대시선은 N 과의 연결을 나타내고,
R1 은 H 또는 식 -(CH2)2-ORb1 의 기를 나타내고,
R1' 은 H 또는 식 -(CH2)2-ORb2 의 기를 나타내고,
R2 은 H 또는 식 -CH2-ORc 의 기를 나타내고,
R2' 은 H 또는 식 -ORd 또는 -CH2-ORd 의 기를 나타내고,
R3 은 H 또는 식 -(CH2)2-ORe 또는 -(CH2)3-ORe 의 기를 나타내고,
Ra, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re 는 서로 독립적으로 포화 또는 불포화, 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 나타내고,
m 은 1, 2 또는 3 이고,
단, R1, R1', R2, R2', R3 중 하나 이상은 H 가 아니고, X1, X2, X3 중 하나 이상은 리간드기임].
2. 제 1 항에 있어서, R3 은 H 이고, L 은 하기 식 (b) 또는 (c) 의 기인 담체 시스템:
Figure pat00041
[식 중, 대시선은 N 과의 연결을 나타내고,
S1, S2, S3, X1, X2, X3, Y, Ra, 및 m 은 제 1 항에서와 같이 정의되고,
단, 식 (b) 에서, R2 및 R2' 중 하나는 H 가 아니고, 식 (c) 에서 R1 및 R1' 중 하나는 H 가 아니고, X1, X2, X3 중 하나 이상은 리간드기임].
3. 제 2 항에 있어서, L 은 하기 식 (b1), (b2), (b3) 또는 (b4) 의 기인 담체 시스템:
Figure pat00042
[식 중, 대시선은 N 과의 연결을 나타내고,
Ra, Rc 및 Rd 은 서로 독립적으로 포화 또는 불포화, 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬임].
4. 제 2 항에 있어서, L 은 하기 식 (c1) 또는 (c2) 의 기인 담체 시스템:
Figure pat00043
[식 중, 대시선은 N 과의 연결을 나타내고,
Ra, Rb1, Rb2 은 서로 독립적으로 포화 또는 불포화, 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬임].
5. 제 1 항에 있어서, R1, R1', R2, R2' 은 H 이고, R3 은 식 -(CH2)2-ORe 또는 -(CH2)3-ORe 의 기이고, S1, S2, S3, X1, X2, X3, Y, Ra, 및 m 은 제 1 항에서와 같이 정의되는 담체 시스템.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, Ra, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re 은 서로 독립적으로 직쇄 또는 분지형 C(10-22)알킬, C(10-22)알케닐 또는 C(10-22)알키닐인 담체 시스템.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, C(10-22)알케닐 및 C(10-22)알키닐은 1, 2, 3 또는 4 개, 바람직하게 1 또는 2 개의 불포화 결합을 갖는 담체 시스템.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 시스템은 마이크로미립자 또는 나노미립자 물질인 담체 시스템.
9. 제 8 항에 있어서, 마이크로미립자 또는 나노미립자 물질은 하나 이상의 식 I 의 화합물 및 임의로는 하나 이상의 기타 보조-지질을 포함하는, 리포솜 또는 미셀과 같은 지질 소포, 또는 나노입자, 나노스피어 및/또는 나노막대인 담체 시스템.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, X3 중 하나 이상은 표적화 리간드 또는 항원성 리간드, 또는 치료적 또는 진단적 리간드, 또는 그 조합물인 담체 시스템.
11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서기가 폴리에틸렌 글리콜 또는 말단-캡핑된 폴리에틸렌 글리콜인 담체 시스템.
12. 제 9 항에 있어서, 지질 소포는 그의 내부 공극 내에 내입 또는 내장되거나, 또는 그의 표면에 흡착 또는 부착된 하나 이상의 생활성제를 추가로 함유하는 담체 시스템.
13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 담체 시스템을 포함하는 제약 조성물.
14. 약물 전달 시스템, 진단 시스템 또는 항원 전시 시스템으로서의 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 담체 시스템의 용도.
15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 담체 시스템에서 사용되기 위한 하기 식 I 의 화합물:
Figure pat00044
[식 중,
Y 는 O, N, S 또는 공유 결합을 나타내고,
S1, S2, S3 는 서로 독립적으로 공유 결합 또는 스페이서기를 나타내고,
X1, X2, X3 는 서로 독립적으로 H 또는 리간드기를 나타내고,
L 은 하기 식 (a) 의 기이고:
Figure pat00045
대시선은 N 과의 연결을 나타내고,
R1 은 H 또는 식 -(CH2)2-ORb1 의 기를 나타내고,
R1' 은 H 또는 식 -(CH2)2-ORb2 의 기를 나타내고,
R2 은 H 또는 식 -CH2-ORc 의 기를 나타내고,
R2' 은 H 또는 식 -ORd 또는 -CH2-ORd 의 기를 나타내고,
R3 은 H 또는 식 -(CH2)2-ORe 또는 -(CH2)3-ORe 의 기를 나타내고,
Ra, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re 은 서로 독립적으로 포화 또는 불포화, 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 나타내고,
m 은 1, 2 또는 3 이고,
단, R1, R1', R2, R2', R3 중 하나 이상은 H 가 아니고, X1, X2, X3 중 하나 이상은 리간드기임].
16. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, X3 중 하나 이상은 치료제인, 상기 치료제에 응답하는 질환 치료에서 사용되기 위한 담체 시스템.
17. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, X3 중 하나 이상은 질환 특이적 진단제인, 상기 진단제를 이용한 질환 진단에서 사용되기 위한 담체 시스템.
18. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, X3 중 하나 이상은 항원제인, 면역 응답 조절에 사용되기 위한 담체 시스템.

Claims (1)

  1. 하기 식 I 의 화합물을 포함하는 담체 시스템:
    Figure pat00046

    [식 중,
    Y 는 O, N, S 또는 공유 결합을 나타내고,
    S1, S2, S3 는 서로 독립적으로 공유 결합 또는 스페이서 (spacer) 기를 나타내고,
    X1, X2, X3 는 서로 독립적으로 H 또는 리간드기를 나타내고,
    L 은 하기 식 (a) 의 기를 나타내고:
    Figure pat00047

    대시선은 N 과의 연결을 나타내고,
    R1 은 H 또는 식 -(CH2)2-ORb1 의 기를 나타내고,
    R1' 은 H 또는 식 -(CH2)2-ORb2 의 기를 나타내고,
    R2 은 H 또는 식 -CH2-ORc 의 기를 나타내고,
    R2' 은 H 또는 식 -ORd 또는 -CH2-ORd 의 기를 나타내고,
    R3 은 H 또는 식 -(CH2)2-ORe 또는 -(CH2)3-ORe 의 기를 나타내고,
    Ra, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re 는 서로 독립적으로 포화 또는 불포화, 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 나타내고,
    m 은 1, 2 또는 3 이고,
    단, R1, R1', R2, R2', R3 중 하나 이상은 H 가 아니고, X1, X2, X3 중 하나 이상은 리간드기임].
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