CN104168888A - 靶向氨基酸脂质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含与一种或多种生物活性配体轭合和暴露于用于靶向递送的载体系统和/或抗原展示系统的表面上的醚-脂质载体系统。任选地一种或多种其它生物活性剂可囊化或嵌入载体系统内或与载体系统连接或吸附于载体系统上。本发明还涉及它们的制备方法和它们在医疗应用中的用途，如将生物活性剂靶向递送至特定组织或细胞和用于研究、诊断、和治疗对所述生物活性剂有反应的特征、疾病和病症的抗原展示系统。

Description

靶向氨基酸脂质
发明领域
本发明涉及用于靶向递送和/或抗原展示系统的包含与一种或多种的生物活性配体轭合(且暴露于载体系统的表面上)的醚-脂质的载体系统，该载体系统可包含一种或多种其它生物活性剂。本发明还涉及它们的制备方法和它们在医疗应用中的用途，如将所述生物活性剂靶向递送至特定组织或细胞和用于研究、诊断、和治疗对所述生物活性剂有反应的特征(traits)、疾病和病症的抗原展示系统。
发明背景
分子识别，如在受体配体、抗原-抗体、DNA-蛋白质、糖-凝集素、RNA-核糖体等之间的分子识别，是许多生物系统的一种重要的基础原理并应用于许多用于医疗应用的人工创造的生物系统中，如用于人造(微米或纳米)颗粒系统包括聚合物珠粒、囊泡状脂质、微乳等中。
基于分子识别的应用的一个重要实例是靶向递送诊断或治疗化合物如抗病毒、化学治疗或显影剂至特定位点的使用，这可以克服与非特异性递送(如体内清除时间、潜在毒性、与试剂的膜输送相关的问题等)相关的限制并因此极大地增强它们的效力。多种基于识别的策略已经用于改善递送化合物至靶细胞的细胞内环境(即递送至特定的细胞小室)中发挥其生物活性作用，尤其是通过涉及生物或人造载体应用的特定转运子(transporters)的递送，身世载体如病毒载体、阳离子聚合物如聚赖氨酸、聚精氨酸等(参见，例如WO 79/00515、WO 98/52614)、脂质载体、和各种其它共轭系统。
一种广泛应用的方法包括脂质囊泡作为人造载体的应用，例如脂质体和胶束，由于它们能减少生物活性剂的系统暴露，从而克服与降解、溶解性等有关的问题并提供血循环时间的增加，已经作为药物递送载体被广泛开发和分析。生物活性剂的主动靶向包括用靶向配体衍生脂质囊泡中的脂质(在囊泡形成之前或在囊泡形成之后)，其中靶向配体用来在体内施用之后将囊泡引导(或靶向)至特定的细胞类型如癌细胞或对特定的组织和器官特异性的细胞，如肝细胞(参见，例如，US 6,316,024和US 6,214,388；Allen et al.,Biochim.Biophys.Acta,1237:99-108(1995)；Blume等，Biochim.Biophys.Acta,1149:180-184(1993))。这可以通过利用在特定的细胞类型中过度表达的受体来完成，其中受体包括例如叶酸受体(FR)(在各种肿瘤组织包括乳房、卵巢、颈部、结直肠、肾、和鼻咽肿瘤中过度表达)，转铁蛋白受体(TfR)(在大多数癌症、肉瘤和一些淋巴瘤和白血病的转移性和药物抗性细胞上过度表达)，表皮生长因子受体(EGFR)(在甲状腺未分化癌以及乳房、肺和结直肠的肿瘤中过度表达)，血管内皮生长因子受体1和2(VEGFR-1/2)(在肿瘤新生血管的内皮细胞上高度表达)，转移抑制素(metastin)受体(在乳突状甲状腺癌中过度表达)，ErbB族受体酪氨酸激酶(在重要的乳腺癌亚型中过度表达)，人表皮生长因子受体-2(Her2/neu)(在乳房癌中过度表达)，酪氨酸激酶-18-受体(c-Kit)(在肉瘤样肾癌中过度表达)，HGF受体c-Met(在食管腺癌中过度表达)，CXCR4和CCR7(在乳腺癌中过度表达)，内皮素-A受体(在前列腺癌中过度表达)，过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPAR-δ)(在大多数结直肠癌肿瘤中过度表达)，PDGFR A(在卵巢癌中过度表达)，BAG-1(在各种肺癌中过度表达)，可溶性II型TGFβ受体(在胰腺癌中过度表达)，去唾液酸糖蛋白受体(在肝细胞中过度表达)，αvβ3整联蛋白受体(在生长的肿瘤脉管系统(vascularture)中过度表达)，legumain(一种在实体肿瘤组织中富集的clan CD半胱氨酸蛋白酶和在TAMs、肿瘤相关的巨噬细胞上过度表达)等。
选择性结合此种待治疗或试验的特异性受体细胞或组织的任何试剂都可以附着于脂质囊泡上并充当靶向配体或受体配体。典型地，此种靶向配体通过长链(例如聚合物)连接子附着于脂质或脂质囊泡表面。例如叶酸型轭合物已经用于提供靶向递送用于治疗和/或诊断疾病的治疗化合物的方法，允许治疗化合物的所需剂量的降低(参见例如WO 02/094185，US 6,335,434,WO 99/66063,US 5,416016)。同样，应用半乳糖-和半乳糖胺-型轭合物跨细胞膜转运外源性化合物可提供针对肝病如HBV和HCV感染或肝细胞癌治疗的靶向递送的方法，同时允许对治疗所需要的治疗化合物的所需剂量的降低(参见例如US6,030,954,…。)。
基于分子识别的应用的另一个重要实例是抗原展示系统的使用，其包括将“自体”和“外来”这两种蛋白(抗原)呈现至免疫系统以产生T细胞激活、调节或耐受。有助于期望的免疫应答的抗原呈递系统中的受体配体相互作用或其不存在是复杂的并难以评价，受各种参数如配体密度、共同受体的存在、受体配体亲和性和表面条件的影响。因此广泛应用的方法包括应用天然存在的人类细胞(或其部分)，其主要功能是抗原处理和呈递。但是，虽然基于活细胞的系统可能对实现期望的耐受或免疫应答的诱导的模拟细胞-细胞相互作用是最佳的，它们依赖于表面分子受调节的表达，包括其表面膜上其它“共刺激”分子和/或粘着分子以足够的治疗水平的可能地表达。目前已知的人工系统的范围从遗传工程亚细胞的抗原呈递囊泡(其载有对它们的表面(WO 03/039594)上抗原呈递和T-淋巴细胞活化或抑制需要的分子)到基于细胞大小、基于生物可降解的微球的抗原呈递系统的系统(WO07/087341)。
清楚的是，以上基于分子识别的技术还存在缺陷，对用于基于分子识别的应用如靶向递送或抗原呈递的通用且高效的人造载体系统包括制备它们的简单和经济的方法，本领域中仍然存在需要。
本申请提供包含具有一个或多个共价键连接的生物活性配体的醚-脂质的轭合物以及包含这些轭合物(和任选地还包含一种或多种生物活性剂)的各种载体系统，这可以克服上述的限制。
发明概述
本发明涉及包含醚-脂质的载体系统，其中醚-脂质与一种或多种用于靶向递送和/或抗原展示系统的生物活性配体轭合。所述一种或多种生物活性配体与通式I的醚-脂质共价键连接并暴露于载体系统的表面上。任选地至少一种生物活性剂可囊化或嵌入载体系统的表面内或与载体系统的表面连接或吸附于载体系统的表面上。
因此，一方面本发明涉及一种囊泡形式，如脂质体或胶束，的脂质载体系统，其包含至少一种式I的脂质-配体轭合物，任选地与其它辅助脂质混合。所述至少一种脂质-配体轭合物包含至少一种醚-脂质，其与至少一种生物活性配体，如抗原配体、靶向配体、治疗性配体或诊断性配体共价键连接。任选地，至少一种其它的生物活性剂被囊化或嵌入内空隙或双层(膜)内或与囊泡的表面连接或吸附于囊泡的表面上。在一些实施方案中囊泡为脂质体或胶束。
另一方面本发明涉及具有内空隙或实心芯的脂质-包被的颗粒形式的纳米颗粒载体系统，其中所述颗粒用至少一种式I的脂质-配体轭合物(任选地与其它辅助脂质混合)包被。所述至少一种式I的脂质-配体轭合物包含至少一种醚-脂质，其与至少一种生物活性配体，如抗原配体、靶向配体、治疗性配体或诊断性配体共价键连接。
在一些实施方案中纳米颗粒物质为脂质-包被的纳米颗粒或纳米球。任选地至少一种其它生物活性剂被囊化于内空隙中或嵌入或分散于实心芯中。
另一方面本发明还涉及根据式I的脂质-配体轭合物本身，包含以至少两个醚-连接的烃链和具有短、直链氨基酸的头基为特征的醚-脂质，其含最高6个碳原子和最高三个偶联位点，至少一种生物活性配体可与偶联位点共价键连接。
该脂质-配体轭合物涉及通式I化合物
其中
Y代表O、N、S或共价键，
S1、S2、S3彼此独立地代表共价键或间隔基，
X1、X2、X3彼此独立地代表H或配体基团
L为式(a)基团，
其中虚线代表与N连接，
R1代表H或式-(CH2)2-ORb1基团，
R1'代表H或式-(CH2)2-ORb2基团，
R2代表H或式-CH2-ORc基团，
R2'代表H或式-ORd或-CH2-ORd基团，
R3代表H或式-(CH2)2-ORe或-(CH2)3-ORe基团，
Ra、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re彼此独立地代表饱和或不饱和的、直链或分支的烃链，
m为1、2或3，
条件是R1、R1'、R2、R2'、R3中至少一个不是H且X1、X2、X3中至少一个是配体基团。
在具体的实施方案中配体基团为靶向配体或抗原性配体或治疗性配体或诊断性配体。
优选地，靶向配体为蝶酸衍生物、肽及其衍生物、多肽、蛋白或碳水化合物且抗原性配体为肽、蛋白或碳水化合物。
在其它方面，本发明还涉及本发明的载体系统作为药物递送系统、诊断系统或抗原展示系统的应用。本发明还提供制备含有本发明的脂质的载体系统和含有这些载体系统的药物制剂的试剂盒。
在其它方面本发明还涉及用于治疗或用于诊断疾病的方法，包括施用有效量的本发明的载体系统。
在其它方面本发明还涉及调节免疫应答的方法，包括施用有效量的本发明的载体系统。
本发明的其它方面包括采用本发明的载体系统跨膜输送生物活性物质的方法和/或将生物活性物质递送到细胞内的方法。
附图
附图1.RGD靶向脂质体(包含5％DMA-RGD)与非靶向脂质体(不包含DMA-RGD)相对比的细胞摄取。
附图2.RR11a修饰的脂质体(MS 15-4)与根据实施例20的对照脂质体(MS 15-0)相对比的Legumain靶向实验：
发明详述
本发明提供包含至少一种醚-脂质和至少一种与所述醚-脂质轭合形成本发明的脂质-配体轭合物的生物活性配体的载体系统。任何可由通式I的脂质-配体轭合物形成的或用通式I的脂质-配体轭合物包被的载体系统都可充当根据本发明的载体系统，其中通式I的脂质-配体轭合物任选地与其它脂质骨架化合物(或辅助脂质)组合。典型地，本发明的载体系统以各种形状和形式(如具有内空隙的囊泡或球，具有实心芯的颗粒，棒，簇等)的微粒或纳米颗粒物质为基础。在一些实施方案中，本发明的载体系统为脂质载体系统，如脂质体、胶束，其中脂质-配体轭合物，任选地与其它骨架脂质一起，形成囊泡的脂质壁。在其它实施方案中，本发明的载体系统为纳米颗粒载体系统，如纳米颗粒、纳米球、纳米簇、纳米管、聚合物珠粒等，其中脂质-配体轭合物，任选地与其它骨架脂质一起，作为包衣(coating)吸附于纳米颗粒载体系统的表面上。依赖于本发明的载体系统的特性和意欲的应用，一种或多种生物活性剂可被囊化或嵌入载体系统的表面内或吸附于载体系统的表面上。
如本申请中所用的，术语“生物活性的”指能激发在细胞、组织、系统、和/或受试者(包括人)中所寻求的(sought)生物响应。术语“生物响应”指细胞对刺激的生理反应，因此可能是受试者的任何细胞的、神经学上的化学的、炎症、免疫学的或病理的生物响应、过程或反应。响应、过程或反应可以是化学的、细胞的、神经学上的、心理学的等。
因此，如本申请中所使用的术语“生物活性配体或生物活性配体基团”或仅仅“配体”或“配体基团”指激发这种生物响应且用于直接或通过间隔基与通式I的醚-脂质共价连接(采用标准化学偶联技术)的配体。生物活性配体可以是靶向配体、抗原性配体、治疗性配体或诊断性配体。
如本申请中所使用的术语“生物活性剂”或仅仅“试剂”指具有生物学活性的任何合成或天然存在的化合物(为游离形式、盐形式或溶剂合物或水合物形式)，如靶向剂、抗原剂、治疗剂或诊断剂，优选为治疗剂或诊断剂。
可以理解各种生物活性剂基团和生物活性配体基团的定义可能交叉。
因此，表述“靶向”与“试剂”或“配体”(用于靶向递送系统中)连接使用时指能在期望的位置和/或在期望的条件下与互补结合部分相互作用的化合物。例如，互补结合部分可以是配体和抗配体(例如链霉抗生素和生物素，蛋白A或G和免疫球蛋白的Fc区)，配体和受体(例如小分子配体及其受体，或糖-外源凝集素相互作用)，噬菌体展示-衍生的肽，互补核酸(例如DNA杂交体、RNA杂交体、DNA/RNA杂交体等)，和适配子。其它示例性的互补结合部分包括但不限于，表现互补电荷的部分，疏水性，氢键合，共价键合，范德华力，反应性化学作用，静电相互作用，磁相互作用等。
对特定受体(受体试剂或配体)特异性的“靶向配体”或“靶向剂”指为特异性结合配对的特异性结合配偶体的任何化合物，其中另一个结合配偶体为受体。受体可与细胞膜或表面连接或以可溶的形式存在且可在受试者(优选哺乳动物受试者，例如人或动物)的细胞内和/或细胞外存在。受体的实例非限制性地包括，膜受体，可溶性受体，克隆或重组受体，clan CD半胱氨酸蛋白酶及其它蛋白酶和其它酶，激素受体，药物受体，递质受体，自泌物受体，细胞因子受体，抗体，抗体片段，工程抗体，抗体模拟物，分子识别单元，粘着分子，凝集素，整联蛋白，和选择蛋白。典型地，受体和其受体的配体的结合亲和性可以是至少10-5M，优选10-7M和更高，例如约10-8M至约10-12M。受体试剂或配体的实例非限制性地包括，肽或多肽，包括其衍生物如氮杂-肽衍生物或部分含有或仅含有D-氨基酸的衍生物，糖肽等，蛋白，包括糖蛋白或磷蛋白，碳水化合物，糖脂，磷脂，寡核苷酸，多聚核苷酸，适配子，spiegelmers，维生素(例如维生素B9或叶酸，维生素B12)，抗原及其片段，半抗原，受体激动剂，部分激动剂，混合型激动剂，拮抗剂，药物，趋化因子，激素(例如LH,FSH,TRH,TSH,ACTH,CRH,PRH,MRH,MSH，高血糖素和催乳素；转铁蛋白；乳铁传递蛋白；血管紧张素；组胺；胰岛素；外源凝集素)递质，内分泌物；生长因子(例如PDGF、VEGF、EGF、TGFa、TBFβ、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、FGF、IGF、铃蟾肽、血栓形成素、红细胞生成素、制瘤素和内皮素1)，细胞因子，包括白细胞介素类(例如白细胞介素1至15)，淋巴因子和细胞信号分子，如肿瘤坏死因子(例如肿瘤坏死因子α和β)和干扰素(例如干扰素α、β和γ)，辅基，辅酶，辅因子，调节因子，或任何其它可特异性结合受体的天然存在的或合成有机分子，包括保留同样结合性的其片段、类似物及其它衍生物。用于本发明中的受体试剂或配体的选择将根据疾病、病症、或待检测的和/或治疗的感染的特性来确定。优选的受体试剂或配体包括维生素(例如叶酸或其片段)，蝶酸衍生物，肽，包括衍生物如氮杂-肽衍生物，蛋白和碳水化合物。最优选为蝶酰衍生物和肽特别是氮杂-肽衍生物。
如本申请中所使用的术语“蝶酰”或“蝶酸”代表缩合的嘧啶杂环，其与氨基苯甲酰基部分连接。如本申请中所用的“缩合的嘧啶杂环”包括与其它5元或6元杂环稠合的嘧啶，产生蝶啶或吡咯并嘧啶双环。蝶酰基与醚脂质(N-或Y-基团)头基上的一个或多个反应位点轭合将产生叶酸结构，其中头基代表谷氨酸部分或其衍生物。示例性的叶酸结构以叶酸骨骼为基础，即蝶酰-谷氨酸，分别为N-[4-[[(2-氨基-1,4-二氢-4-氧代-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸、及其衍生物。此种叶酸衍生物包括以下叶酸：在反应位点或非反应位点上具有任选的取代基和/或其中所选的原子已经被置换，例如所选的杂原子，优选一个或两个，已经被碳原子置换(如在脱氮和二脱氮类似物中)。实例为任选地被取代的叶酸、亚叶酸、pteropolyglutamicacid、和结合叶酸受体的蝶啶类如四氢蝶呤类、二氢叶酸类、四氢叶酸类、及其脱氮和二脱氮类似物。叶酸、5-甲基-(6S)-四氢叶酸和5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸为用于本发明化合物优选的基本结构。术语“脱氮”和“二脱氮”类似物指本领域公认的在天然存在的叶酸结构中具有取代一个或两个氮原子的碳原子的类似物。例如，脱氮类似物包括1-脱氮、3-脱氮、5-脱氮、8-脱氮、和10-脱氮类似物。二脱氮类似物包括，例如，1,5-二脱氮、5,10-二脱氮、8,10-二脱氮、和5,8-二脱氮类似物。优选的脱氮类似物化合物包括N-[4-[2-[(6R)-2-氨基-1,4,5,6,7,8-六氢-4-氧吡啶[2,3-d]嘧啶-6-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(洛美曲索)和N-[4-[1-[(2,4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]丙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(依达曲沙)。在上述各叶酸结构中谷氨酸部分相应于醚脂质头基的部分因此上述各叶酸结构还可包括包含相应于头基的各种谷氨酸衍生物的结构。
如本申请中所使用的术语“肽”代表由1至30、优选2至20、最优选3至10个氨基酸构成的寡肽。肽典型地通过它们的N-端、C-端和/或通过它们的侧链与醚-脂质的头基(即N-和/或Y-基团)的反应位置连接。肽可含有二硫桥以及酯键。而且，肽可在N-端、C-端和在侧链中带保护基。术语“氨基酸”包括天然存在的L-氨基酸、D-氨基酸、合成氨基酸、β氨基酸及其同系物。
用于本申请中的如上定义优选的肽包括例如细胞特异性配体如RGD-肽、NGR-肽、ATWLPPR-肽、APRPG-肽、SMSIARL-肽、TAASGVRSMH-肽、LTLRWVGLMS-肽、CDSDSDITWDQLWDLMK-肽、GPLPLR-肽、HWGF-肽、及其衍生物(其中肽的标记以单个字母氨基酸代码给出)，优选为RGD肽(即三肽氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或Arg-Gly-Asp)及其衍生物。RGD肽的衍生物包括对该肽的结构修饰包括含有RGD序列的肽、以及包含RGD肽的非肽化合物。
如本申请中所使用的术语“氮杂-肽”指具有在天然存在的肽结构中取代一个或多个碳原子的氮原子的肽类似物。氮杂-肽典型地由1至30、优选2至20、最优选3至10个氨基酸构成，其具有取代至少一个sp3-杂化碳、取代氨基酸的α位上的碳原子、最优选取代C末端氨基酸的α位上碳原子的氮原子。氮杂-肽通过它们的N-端、C-端和/或通过它们的侧链与醚-脂质的头基(即N-和/或Y-基团)的反应位置连接。氮杂-肽可含有二硫桥以及酯键。而且，氮杂-肽可在N-端、C-端和在侧链中带保护基。优选的氮杂-肽为2-氮杂天冬酰胺的衍生物，如Cbz-丙氨酰基丙氨酰基-2-氮杂天冬酰胺(亦称RR11a)(Ekici等，2004,J.Med.Chem.47,1889-1892；WO 2012/031175A9)。
在其它实施方案中靶向剂或配体还可代表或包含至少一个阻塞部分。如本申请中所用的，术语“阻塞部分”指掩蔽、阻塞、覆盖(cloak)、和/或在空间上抑制互补结合部分的活性、自身识别、和/或自动装配。例如，阻塞部分在期望的条件或时间之前能阻塞互补结合部分彼此相互作用的能力，当阻塞部分脱除时。阻塞部分可包括聚合物实体，如polaxamines；泊洛沙姆；聚乙二醇(PEG)；聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)、肽；合成聚合物等。
如本申请中所用的，表述“抗原(的)”与“试剂”或“配体”连结使用时指激起抗自身或其部分的免疫应答的化合物。术语“免疫应答”指抗原或其一部分被免疫效应细胞识别。这包括T细胞介导的和/或受T细胞辅助刺激调节的影响的B细胞介导的免疫应答。术语免疫应答还包括间接地受T细胞激活如抗体产生(体液响应)和其它免疫效应细胞的激活影响的免疫应答，其中其它免疫效应细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)，例如CTL系、CTL克隆、和来自肿瘤、炎症、或其它渗透的CTLs。某些有疾病的组织表达特异性抗原且对这些抗原特异性的CTLs已经被鉴定。例如，约80％的黑色素瘤表达被称为gp-100的抗原。阻止微生物感染和致病过程因而对抗此种疾病的最有效的和期望的方法之一是疫苗，其导致在将抗原或免疫原引入到宿主机体中之前实际感染或疾病发作之前刺激宿主机体内的免疫应答。
技术人员将理解任何大分子，几乎包括任何生物分子(蛋白质，肽，脂质，脂蛋白，聚糖，糖蛋白，核酸衍生物，如寡核苷酸，多核苷酸，基因组或重组DNA)都可以充当抗原。抗原可化学或生物学合成，或可由重组或基因组DNA产生或可由生物样品，如组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体获得。抗原可包括但不限于，病毒抗原，细菌抗原，真菌抗原，原生动物及其它寄生抗原，肿瘤抗原，涉及自身免疫病、成瘾、过敏和移植排斥的抗原，及其它混杂性抗原。代表性的抗原实例可以是细菌、真菌、原生虫、或病毒的来源的蛋白或肽、或由这些抗原获得的片段，其包括但不限于，链球菌、念珠菌、布鲁氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、假单胞菌、博德特氏菌、梭状芽胞杆菌、诺沃克病毒(Norwalkvirus)、炭疽杆菌、结核杆菌、人类免疫缺陷性病毒(UV)、衣原体、人乳头瘤病毒、流感病毒、副粘病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)、肝炎病毒、疟原虫、毛滴虫、性传播疾病治疗剂、病毒性脑炎治疗剂、原虫病治疗剂、真菌病治疗剂、细菌病治疗剂、癌细胞、或它们的混合物。
受试者的免疫可通过利用以多价展示形式的抗原的多拷贝来增强且在由于半抗原-相关的尺寸问题难以给药和通常不能激发有效免疫应答的抗原配体如小肽或碳水化合物的情况下是期望的。因此，如本申请中所使用的，术语“多价”指一次以上的复制的展示或载体系统上的抗原类型。
如本申请中所使用的术语“抗原呈递系统”或“抗原展示系统”指天然存在的或合成的系统，其(i)可呈递至少一种抗原(或其一部分)使得至少一种抗原(或其一部分)能被免疫效应分子，例如T细胞表面上的T细胞抗原受体，识别或结合，或(ii)能呈递至少一种可被免疫系统的特异性效应细胞识别的抗原-MHC复合体形式的抗原(或其一部分)，从而诱导针对呈递的抗原(或其一部分)的有效的细胞免疫应答。在本发明的范围内，术语“识别”指(i)脂质化合物与至少一种被免疫效应细胞识别和结合的抗原性配体(或其组合物或制剂)轭合，其中这种结合足以激发有效的免疫应答，或指(ii)脂质化合物与至少一种被其相应的受体识别和结合的靶向配体(或其组合物或制剂)轭合，或指(a)和(b)两者的组合。测定靶向配体或抗原性配体是否分别被受体或免疫效应细胞识别的试验，是本领域已知的和在本申请中进行了描述。
如本申请中所用的，用于与“试剂”或“配体”连接的表述“治疗性”指能在体外和/或在体内发挥在性质上为治疗性的生物效应的化合物。治疗性配体可以是中性的或带正电荷或带负电荷。合适的生物活性剂的实例包括药物、合成有机分子、蛋白质、维生素、甾类、siRNA、miRNA、助剂和遗传物质。
术语“基因材料”通常指核苷、核苷酸、和多核苷酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。基因材料可通过本领域普通技术人员已知的化学方法、或通过利用重组技术、或通过两者的结合来制备。DNA和RNA可任选地包含非天然核苷酸且可以是单链或双链。“基因材料”还指正义和反义DNA和RNA，即，核苷酸序列，其与DNA和/或RNA中的特定核苷酸序列互补。
术语“药物的”或“药物”指任何用于预防、诊断、缓解、治疗或治愈患者的疾病或损伤的治疗性或预防性剂。可以理解要俘获或嵌入脂质组合物内或与本发明的脂质组合物的表面连接或吸附于本发明的脂质组合物表面上的生物活性剂就物理化学性质、分子大小或来源，即合成、生物技术物质等而言不限于任何具体类别的生物活性物质。因此药物可以是，例如，选自以下的任何治疗类别：镇痛剂、麻醉剂、抗阿尔茨海默氏病、抗哮喘剂、抗帕金森症、抗变应性药、抗心绞痛药、抗心律失常药、抗关节炎药、平喘药、抗菌剂、抗生素、抗癌剂、抗凝剂、抗抑郁药、抗糖尿病药、止吐剂、抗癫病药、抗真菌剂、抗青光眼药、抗痛风药、抗组胺剂、抗高脂蛋白血症药、抗高血压药、抗炎药、抗偏头痛药、抗肿瘤药、抗肥胖药、抗寄生虫药、抗原虫药、退热药、抗银屑病药、抗精神病药、抗血栓药、抗溃疡药、抗病毒剂、抗焦虑药、良性前列腺肥大、支气管扩张药、钙代谢、强心剂、心血管药物、螯合剂和解毒剂、化学预防剂、避孕、利尿剂、多巴胺剂、胃肠剂、胃动力药、造血剂、血友病、激素、激素替代治疗剂、安眠药、降胆固醇药、降血脂药、免疫调节剂、免疫刺激剂、免疫抑制剂、血脂调节剂、男性性功能障碍、多发性硬化症、肌肉松弛剂、安定药、益智药、骨质疏松症、植物雌激素、血小板聚集抑制剂、前列腺素、用于放疗放射增强剂(radioenhencer)、松弛剂和兴奋剂、呼吸窘迫综合征、尿失禁、血管扩张剂、维生素/营养剂、创伤药和黄嘌呤。属于这些类别的活性剂可用于前面提及的组合物中。
如本申请中所用的，表述“诊断”与“试剂”或“配体”连结使用时指能诊断患者的疾病存在或不存在的化合物。诊断试剂可以是中性的或带正电荷或带负电荷。合适的诊断试剂的实例包括，合成有机分子和重金属复合物，如用于与患者的磁共振成像、超声或计算机断层扫描有关的造影剂。
用于本发明载体系统的靶向或抗原性或治疗性或诊断性配体或试剂的选择将根据待检测的和/或治疗的疾病、病症、或感染的特性来确定。
这些和本发明的更多方面在下面段落中公开。
A.脂质-配体轭合物
如本申请中所使用的术语“脂质-配体轭合物”指本发明的化合物，其在头基包含直链、双官能的氨基酸，更具体地2-氨基-链烷二酸(具有最高六个碳原子)，如天冬氨酸、谷氨酸等，并且在头基的偶联位点与一种或多种生物活性配体轭合形成“脂质-配体轭合物”。如本申请中所使用的术语“醚-脂质(化合物)”或“脂质(化合物)”指前体，即在与一种或多种生物活性配体轭合之前相应的脂质。
因此一方面本发明涉及根据式I的脂质-配体轭合物
其中
Y代表O、N、S或共价键，
S1、S2、S3彼此独立地代表共价键或间隔基，
X1、X2、X3彼此独立地代表H或配体基团，
L为式(a)基团，
其中虚线代表与N连接，
R1代表H或式-(CH2)2-ORb1基团，
R1'代表H或式-(CH2)2-ORb2基团，
R2代表H或式-CH2-ORc基团，
R2'代表H或式-ORd或-CH2-ORd基团，
R3代表H或式-(CH2)2-ORe或-(CH2)3-ORe基团，
Ra、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re彼此独立地代表饱和或不饱和的、直链或分支的烃链，
m为1、2或3，
条件是R1、R1'、R2、R2'、R3中至少一个不是H且X1、X2、X3中至少一个是配体基团。
如本申请中所用的，术语“轭合的”(或“轭合”)、“连接的(linked)”、“连接的(attached)”，当就两个或更多部分而言使用时，指两个或更多部分通过共价键物理结合(或者直接或者通过间隔基)。
包括非衍生化(脂质)化合物的相应的(醚-)脂质化合物(其中头基(即N-和Y-基团)不载有配体基团而是处于游离形式，以保护的形式或以活化的形式)、以及衍生化的(脂质)化合物(其中头基(即N-和Y-基团)用一个或多个间隔基衍生化)是同时提交的申请的一部分，其在此全文引入。
在化合物I的第一实施方案中，基团R3为H。更具体而言，(i)R3为H且R1和R1'为H，或者(ii)R3为H且R2和R2'为H。
因此，在该第一实施方案本发明涉及式Ia化合物，
其中L为式(a)基团，
且其中S1、S2、S3、X1、X2、X3、Y、R1、R1'、R2、R2'、Ra、和m如上对于式I化合物的定义。
更具体而言，本发明涉及式Ia化合物，其中L为式(b)或(c)基团
其中R1、R1'、R2、R2'、Ra如上定义，
条件是式(b)中R2和R2'之一不是H，且式(c)中R1和R1'之一不是H，且X1、X2、X3中至少一个是配体基团。
在基团(b)的一个优选的实施方案中R2为H且R2'为-ORd或-CH2-ORd。在基团(b)的另一优选的实施方案中R2为-CH2-ORc且R2'为-ORd或R2'为-CH2-ORd。
因此，本发明优选涉及其中L为式(b1)、(b2)、(b3)或(b4)基团的化合物：
其中S1、S2、S3、X1、X2、X3、Y、m、Ra、Rc、Rd如上定义。
在基团(c)的一个优选的实施方案中，其中R1和R1'之一为H。在基团(c)的另一优选的实施方案中R1和R1'没有一个是H。
因此，本发明优选地还涉及其中L为式(c1)或(c2)基团的化合物：
其中S1、S2、S3、X1、X2、X3、Y、m、Ra、Rb1、Rb2如上定义。
在第二实施方案，R1、R1'、R2、R2'为H且R3为式-(CH2)2-ORe或-(CH2)3-ORe基团。
因此，在该第二实施方案中本发明涉及式Ib化合物，
其中R3为式-(CH2)2-ORe或-(CH2)3-ORe基团，
且S1、S2、S3、X1、X2、X3、Y、Ra、Re和m如上定义。
因此本发明最优选的实施方案为式I化合物，其为式II或III化合物
其中
Y代表O、N、S或共价键，
S1,S2,S3彼此独立地代表共价键或间隔基，
X1,X2,X3彼此独立地代表H或配体基团，
R1代表H或式-(CH2)2-ORb1基团，
R1'代表H或式-(CH2)2-ORb2基团，
R2代表H或式-CH2-ORc基团，
R2'代表H或式-ORd或-CH2-ORd基团，
Ra、Rb1、Rb2，Rc、Rd彼此独立地代表饱和或不饱和的、直链或分支的烃链，
m为1、2或3，
条件是(i)式II中R2和R2'之一不是H，且式III中R1和R1'之一不是H，和(ii)X1、X2、X3中至少一个是配体基团。
式II化合物的更具体的实施方案为式IIa、IIb、IIc或IId化合物，
其中S1、S2、S3、X1、X2、X3、Y、Ra、Rc、Rd和m如上对于式II化合物的定义。
式III化合物的更具体的实施方案为式IIIa或IIIb化合物，
其中S1、S2、S3、X1、X2、X3、Y、Ra、Rb1、Rb2和m如上对于式III化合物的定义。
其它式I化合物的最优选的实施方案为式IVa或IVb化合物，
其中
Y代表O、N、S或共价键，
S1,S2,S3彼此独立地代表共价键或间隔基，
X1,X2,X3彼此独立地代表H或配体基团，
Ra,Re彼此独立地代表饱和或不饱和的、直链或分支的烃链，且
m为1、2或3，
条件是X1、X2、X3中至少一个是配体基团。
本领域技术人员将理解本发明的配体-脂质(或本发明的化合物)含有一个或多个手性中心和/或双键，因此可以立体异构体，如双键异构体(即，几何异构体，例如Z/E异构体或顺式/反式异构体)、对映异构体或非对映异构体的形式存在。因此，当手性中心上的立体化学未标明时，本申请描述的化学结构包括在那些手性中心的所有可能的构型包括立体异构纯的形式(例如，几何纯、对映体纯或非对映体纯的)富集形式(例如，几何富集的、对映体富集的或非对映体富集的)以及对映体和立体异构体混合物。单独的异构体可使用起始原料相应的异构形式来获得。作为替代，对映体和立体异构体混合物可采用技术人员熟知的分离技术或手性合成技术拆分成它们的组分对映异构体或立体异构体。本申请中描述的本发明化合物也可以若干互变异构形式存在，包括烯醇形式、酮形式及其混合物。因此，本申请描述的结构包括举例说明的化合物的所有可能的互变异构形式。
本申请中所用的术语“饱和或不饱和的、直链或分支的烃链”指具有6至30个、优选10至22个碳原子的饱和或不饱和的、直链或分支的烃链。
术语“饱和”与烃链结合指含有6至30个、优选10至22个碳原子的、直链或分支的烷基链。实例包括但不限于，辛基(癸基)、十一烷基、月桂基(dodedecyl)、肉豆蔻基(十四烷基)、鲸蜡基(十六烷基)、硬脂基(十八烷基)、十九基、arachidyl(二十烷基)、二十一烷基、山嵛基(二十二烷基)、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基，包括其分支的异构体，例如异月桂基、反异月桂基、异肉豆蔻基、反异肉豆蔻基、异棕榈基、反异棕榈基、异硬脂基、反异硬脂基或植烷基(3,7,11,15-四甲基-十六烷基)。
术语“不饱和”与烃链结合表示比最大可能的数目少的氢原子与链中各个碳键合产生一个或多个碳-碳双键或三键。在优选的实施方案中，不饱和烃链中不饱和键的数目为1、2、3或4，优选为1或2。
链烯基的实例包括但不限于，单不饱和的链烯基，如癸烯基、十一碳烯基、十二烯基、棕榈油基、十七烯基、十八烯基(反油基、油基、蓖麻油烯基)、十九烯基、二十烯基、二十一烯基、二十二烯基(erucyl)、二十三烯基、二十四烯基、二十五烯基、及其分支链异构体，以及多不饱和链烯基如十八-9,12-二烯基(亚油基、elaidolinoleyl)、十八-9,12,15-三烯基(亚麻基、elaidolinolenyl)、9(Z),11(E),13(E)-十八碳三烯基(桐酸基(eleostearyl))、和二十-5,8,ll,14-四烯基。
炔基的实例包括但不限于十六-7-炔基和十八-9-炔基。
术语“分支的”与烃结合时指具有线性系列的碳原子作为主链、一个或多个碳原子的至少一个取代基作为次链(或分支基团)的烃链。次链的实例包括一种或多种(C1-6)烷基基团，如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等，一种或多种(C1-6)链烯基基团，如乙烯基、烯丙基、丙烯基、异丙烯基、2-丁烯基等，或一种或多种(C1-6)炔基基团，如乙炔基、丙炔基、丁炔基等。优选的次链为(C1-6)烷基基团，最优选为甲基和乙基。
本发明的化合物优选包含至少两个烃链，优选2、3、4、5或6个烃链，最优选2或3个烃链，其中烃链的主链相同或不同，优选相同，且选自烷基链、链烯基链、和炔基链，优选烷基和链烯基链。在一优选的实施方案中，本发明的化合物载有两个烷基链，它们可以相同或不同，优选相同。
在本发明化合物的一具体实施方案中烃链Ra、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re优选选自肉豆蔻基、棕榈基、硬脂基、油基、亚油基和植烷酰基。
本申请中所使用的术语“烷基”、“烷氧基”“链烯基”“炔基”具有以下含义：
术语“烷基指含有1至12、优选1至8个碳原子的、直链或分支的烷基链。烷基基团的实例包括但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、和叔丁基。术语“烷氧基”指-O-烷基基团。烷氧基基团的实例包括但不限于，甲氧基、乙氧基、和丁氧基。术语“链烯基”指具有一个或多个碳-碳双键的直链或分支的不饱和烷基基团。以上烷基、链烯基、和烷氧基基团可任选地被其它基团取代。取代基的实例包括但不限于，卤代、羟基、氨基、氰基、硝基、巯基、烷氧羰基、酰氨基、羧基、烷基磺酰基、烷基羰基、脲基、氨甲酰基、羧基、硫脲基、氰硫基、亚磺酰氨基、芳基、杂芳基、环基(cyclyl)、和杂环基。
术语“芳基”指含有约6至约10个、优选5至7个碳原子的芳族碳环基团。芳基基团可任选地被一个或多个可相同或不同的芳基基团取代基取代，其中“芳基基团取代基”包括烷基、链烯基、炔基、芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、羧基、芳酰基、卤代、硝基、三卤代甲基、氰基、烷氧羰基、芳氧基羰基、芳烷氧羰基、酰氧基、酰基氨基、芳酰氨基(aroylamino)、氨甲酰基、烷基氨甲酰基、二烷基氨甲酰基、芳基硫基、烷硫基、亚烷基和-NRR'，其中R和R'各自独立地为氢、烷基、芳基和芳烷基。示例性的芳基基团包括取代或未取代的苯基、萘基、芘基、蒽基、和菲基。
术语“杂芳基”指具有至少一个杂原子(例如，N、O或S)的如上定义的芳基部分。杂芳基部分的实例包括呋喃基、furylene、芴基、吡咯基、噻吩基、噁唑基、咪唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、喹唑啉基、喹啉基、异喹啉基和吲哚基。
术语“(杂)芳氧基”指(杂)芳基-O-基团，其中(杂)芳基基团如前所述。示例性的芳氧基包括苯氧基和萘氧基。术语“(杂)芳烷基”指(杂)芳基-烷基-基团，其中(杂)芳基和烷基如前所述。示例性的芳烷基基团包括苄基、苯基乙基和萘基甲基。术语“(杂)芳烷氧基”指(杂)芳烷基-O-基团，其中(杂)芳烷基如前所述。示例性的芳烷氧基基团是苄氧基。
术语“环烷基”指具有6至10个碳原子的饱和或不饱和的、非芳香环烃部分，如环己基或环己烯-3-基。术语“杂环烷基”指具有至少一个环杂原子(例如，N、O或S)的如本申请中定义的环烷基，如4-四氢吡喃基或4-吡喃基。
本申请提及的芳基、杂芳基、环烷基、杂环烷基既包括取代又包括未取代的部分，除非另有说明。环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基上可能的取代基包括(C1-C10)烷基、(C2-C10)链烯基、(C2-C10)炔基、(C3-C8)环烷基、(C5-C8)环烯基、(C1-C10)烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、氨基、(C1-C10)烷基氨基、(C1-C20)二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、羟基、卤素、硫基、(C1-C10)烷硫基、芳基硫基、(C1-C10)烷基磺酰基、芳基磺酰基、酰基氨基、氨酰基、脒基、胍、脲基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、羧基、和羧酸酯。环烷基、杂环烷基、芳基、和杂芳基也可以也相互稠合。
基团Y为O、N、S或共价连接，优选为O或N，最优选为N。应当理解如果基团Y为共价连接，那么-S1-X1与CO-基团直接连接。
如本申请中所使用的术语“间隔基”或“间隔基基团”(基团S1、S2、S3)指二价的有支链的或无支链的化学基团，其可以将本发明的醚-脂质与一种或多种生物活性配体X1、X2、X3以足够的距离连接以消除醚-脂质和配体之间的任何不期望的相互作用和/或减少可能影响配体的生物学活性(如配体与它们的靶标结合的亲和性)的任何位阻(由醚-脂质本身或任何其它邻近的分子引起的)。依赖于醚-脂质和生物活性配体的轭合物的应用，间隔基基团可具有不同的长度且可被(水解、酶解和化学)稳定的或可包括可裂解的连接。可选择本发明的可裂解的连接为经任何形式的可裂解化学过程，例如化学、酶解、水解等来裂解。示例性的可裂解的连接子包括但不限于，蛋白酶裂解的肽连接子、核酸酶敏感性核酸连接子、脂肪酶敏感性脂质连接子、糖苷酶敏感性碳水化合物连接子、pH敏感性连接子、低氧敏感性连接子、光裂解的连接子、热不稳定的连接子、酶可裂解的连接子、超声-敏感性连接子、x射线可裂解的连接子等。
应当理解间隔基可以是端基活化的或可以不是端基活化的以允许间隔基修饰的本发明化合物与其它部分，如生物活性基团连接。
在具体的实施方案中，“间隔基基团”(或基团S1、S2、S3)代表选自亚烷基链的短间隔基基团或长链间隔基基团，任选地包含一个或多个选自酮、酯、醚、氨基、酰胺、脒、酰亚胺、氨基甲酸酯或硫代氨基甲酸酯官能团、甘油、尿素、硫脲、双键或芳香环的基团。
更具体而言，短间隔基基团(或基团S1、S2、S3)可选自(C1-C12)烷基、(C2-C12)链烯基、芳基、芳烷基、杂芳基。
长链间隔基基团(或基团S1、S2、S3)可选自式-W-(CH2-)k-W′-的聚合物基团，其中k为13至3000之间的整数，且W和W′为能与氨基、羧基、羟基或硫基基团起反应的反应基团且其中一个或多个不相邻的CH2基团可独立地被芳基、杂芳基、-CH＝CH-、-C≡C-、或选自-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-NR'-、-NR'-CO-、-CO-NR'-、-NR'-CO-O-、-O-CO-NR'-、-NR'-CO-NR'-、和-O-CO-O-的亲水性(或极性)基团置换，其中R'代表氢或(C1-C12)烷基。应当理解以相同的基团置换一个以上的不相邻的CH2基团可在具有特定重复单元的聚合链(例如聚酯、聚醚、聚酰亚胺等)中产生。
优选的间隔基基团包括亲水性聚合物基团(对水溶液具有增强的亲和性)，即含有在它们的亚烷基骨架中包含一个或多个上述亲水性(或极性)基团的重复结构单位的聚合物。亲水性聚合物基团的典型实例包括聚氧(C2-C3)亚烷基(例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG))、多糖(例如右旋糖酐、芽霉菌糖、壳聚糖、透明质酸)、聚酰胺(例如聚氨基酸、半合成的肽和多聚核苷酸)；聚唾液酸、聚酯(例如聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA))、聚碳酸酯、聚乙烯亚胺(PEI)、聚酰亚胺、聚乙酸乙烯酯(PVA)。
优选的间隔基为“PEG”或“聚乙二醇”，其包括任何水溶性聚(氧化乙烯)。典型地，“PEG”指含有多数，例如>50％，的亚单位-CH2CH2O-的聚合物。不同形式的PEG可在分子量、结构或几何形状方面不同(例如，分支的、直链的、分叉的PEGs、多功能的等)。用于本发明中的PEGs优选地可包含两个以下结构之一：“-O(CH2CH2O)m-”或“-CH2CH2O(CH2CH2O)m-CH2CH2-”，其中m为3至3000，且整体PEG的端基和结构可变化。如上所述，依赖于其应用，PEG可以是封端的形式。当PEG被定义为“-O(CH2CH2O)m-”时封端基团通常为典型地由1-20个碳构成的含碳基团，优选为烷基(例如，甲基、乙基或苄基)，尽管还想象它们的饱和和不饱和形式、以及芳基、杂芳基、环基、杂环基、和任何前述的取代形式。当PEG被定义为“-CH2CH2O(CH2CH2O)m-CH2CH2-”时，封端基团通常为典型地由1-20个碳原子和以共价键结合的氧原子构成的含碳基团，且对与PEG的一端共价键键合是有效的。在这种情况下，该基团典型地为烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基或苄氧基)且就含碳基团而言可任选是饱和和不饱和的、以及芳基、杂芳基、环基、杂环基、和任何前述的取代形式。当PEG被定义为“-CH2CH2O(CH2CH2O)m-CH2CH2-”时其它(“非封端的”)端典型地为羟基、胺或可经受其它化学修饰的活化基团。此外，封端基团也可是硅烷。
关于各种端基官能化或活化的PEG的综述是本领域已知的(例如参见Zalipsky S.,Bioconjug.Chem.,6,150-165(1995))。
将生物活性配体(X1和/或X2和/或X3)与醚-脂质(即式I化合物其中X1、X2、X3为H)轭合的方法包括一个或多个生物活性配体X1、X2、X3与在一个或多个单独的醚-脂质的头基(即N-和/或Y-基团)的一个或多个反应位置的共价键合。因此，一个生物活性配体可与一个单独的醚-脂质的一个或多个位点连接或与一个以上单独的醚-脂质的一个以上的位点连接。作为替代，两个或三个生物活性配体与一个单独的醚-脂质的偶联位点连接。一个或多个生物活性基团可能与醚-脂质直接连接或通过间隔基连接。
典型地，连接的方法通常可包括步骤：
a)提供式I脂质化合物，其中X1、X2、X3为H，在一个或多个基团S1、S2、S3上载有一个或多个偶联位点，
b)提供载有适于与一个或多个偶联位点起反应的反应基团的抗原配体，和
c)使脂质化合物与抗原反应得到配体-脂质轭合物。
如本申请中所使用的，术语“偶联位点”或“偶联基团”，指在形成共价键(C-C,C-O,C-N,C-S-连接)的偶联反应中能与相应的反应基团或官能团(或两个偶联配偶体)起反应的反应基团或官能团。
轭合(或偶联)方法的选择依赖于各种因素，如要连接的生物活性配体的特性，即物理属性(例如尺寸、电荷等)、生物活性配体上存在的反应基团的特性等。
在一些实施方案中，轭合在双官能试剂(即，具有两个官能(端)基团的试剂)、优选双异官能团试剂(即，具有两个不同的官能(端)基团的试剂)的存在下进行。这种(异)双官能试剂的应用产生脂质-配体轭合物，其中脂质和配体可与相互直接连接或被间隔基分开。典型的官能团包括但不限于，诸如琥珀酰亚胺基酯、马来酰亚胺、和吡啶基二硫化物。在一些实施方案中，双官能试剂选自，但不限于，例如，碳二亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸(NHS-ASA)，庚二亚氨酸二甲酯二盐酸盐(DMP)，辛二亚氨酸二甲酯(DMS)，3,3′-dithiobispropionimidate(DTBP)，N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基联硫基]-丙酰氨基(SPDP)，琥珀酰亚胺α-甲基丁酸酯，生物素酰氨基己酰基-6-氨基-己酸N-羟基-琥珀酰亚胺酯(SMCC)，琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺丙酰氨基)-十二乙二醇]酯(NH S-PEO12)，N-琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)对氨基苯甲酸酯(SIAB)，N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)，间-马来酸亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)和N--马来酰亚胺丁酰氧基-琥珀酰亚胺酯(GMBS)，琥珀酰亚胺基二羰基戊烷或二琥珀酰亚胺基辛二酸酯。在其它实施方案中，双官能试剂为与SPDP组合的Traut试剂2-亚氨基硫代坊(iminothiolane)。在其它实施方案中连接子为。在其它实施方案中，双官能试剂选自ThePierce Products Catalogue(Pierce Chemical Company,USA)和the Double AgentsTM Cross-Linking Reagents Selection Guide(Pierce Chemical Company)中公开的那些，其在本申请中引入作为参考。
优选的轭合方法包括碳二亚胺-介导的酰胺形成和活性酯马来酰亚胺-介导的胺和巯基偶联等。
例如，可采用双异官能团的交联试剂，例如，含有琥珀酰亚胺基酯和马来酰亚胺、吡啶基二硫化物、或碘乙酰胺的试剂使含有硫羟的分子与含有胺的分子反应。可以使用胺-甲酸和硫羟-甲酸交联、马来酰亚胺-巯基偶联化学(例如，马来酸亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)方法)等。
多肽可分别经赖氨酸或半胱氨酸侧链中的胺或硫醇基团、或通过N-末端氨基方便地与醚脂质轭合。同样，寡核苷酸可通过3'或5'端上独特的反应基团，例如巯基、氨基、磷酸基等，方便地与醚脂质轭合。反应性巯基可通过使用试剂与具有游离氨基(例如基团N和Y)的式I的脂质偶联，其中试剂诸如(i)在脂质和寡核苷酸或多肽之间产生可裂解二硫键的N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基联硫基-)丙酸酯(SPDP)和长链SPDP(lc-SPDP)，或(ii)在脂质和寡核苷酸或多肽之间产生不可裂解键的琥珀酰亚胺基-碘乙酸酯。这些技术及其它轭合技术是本领域已知的(参见例如美国专利号5,512,439；WO 01/22995；Greg Hernanson"Bioconjugate Techniques,"Academic Press,1996；GordonBickerstaff"Immobilization of Enzymes和Cells,"Humana Press,1997)。
技术人员将知道根据上述轭合方法选择式I醚-脂质的头基的间隔基S1、S2、S3上的哪些官能团(例如，胺、羰基或羧基)可以与生物活性配体发生轭合。
其它的关于轭合方法的一般信息可见于例如“Cross-Linking,”Pierce Chemical Technical Library，可在Pierce网站和1994-95Pierce Catalog最初出版的、和其中引用的参考文献获得；Wong SS,Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking,CRC PressPublishers,Boca Raton,1991；和Hermanson,G.T.,BioconjugateTechniques,Academic Press,Inc.,San Diego,1996。
应用于轭合物中的一种或多种配体与式I的醚-脂质化合物的摩尔比可由技术人员容易最佳化。典型地，它可在约1：1至约10：1脂质化合物与配体的范围内。
在以上描述的一般方法中，任何合适的方法都可用于纯化中间体共轭化合物，如通过制备型反相HPLC(RP-HPLC)，通过膜滤法，如超滤或膜渗滤。未反应的反应物可通过尺寸排阻色谱法如凝胶过滤、或平衡透析除去。最终的轭合物也可采用任何合适的方法纯化，包括例如凝胶过滤，膜滤法，如超滤法，或离子交换色谱法，或其组合。
本发明的脂质-配体轭合物特别适用于制备脂质或纳米颗粒载体系统，如脂质体、胶束和纳米颗粒。
B.脂质载体系统
在其它方面本发明涉及一种脂质载体系统，其包含本发明的一种或多种脂质-配体轭合物，任选地与其它辅助脂质组合。
示例性的脂质载体系统优选地包括脂质囊泡。术语“脂质囊泡”(或本发明的囊泡)可与表述脂质载体系统互换使用，指以内空隙的存在为特征的球形实体。典型地，本发明的囊泡由一种或多种脂质-配体轭合物形成，任选地脂质-配体轭合物与其它合成或天然存在的脂质(辅助脂质)组合。在任何得到的本发明的囊泡中，脂质可以单层或双层的形式存在。在一个以上的单层或双层的情况下，单层或双层通常是同心的。本发明的囊泡包括通常称为脂质体(即包含一个或多个具有内空隙的同心排列的脂质双层的囊泡)、胶束(即包含具有内空隙的单脂质单层的囊泡)等这样的实体。因此，脂质可用于形成单层囊泡(包含一个单层或双层)、寡层(oligolamellar)囊泡(包含约两个或约三个单层或双层)或多层囊泡(包含约三个以上的单层或双层)。
囊泡的内空隙通常填充液体，包括，例如，含水液体、气体、气态前体、和/或固体物质，包括，例如，一种或多种生物活性剂，也参见下文。
在一些实施方案中脂质-配体轭合物的配体为靶向配体(产生靶向脂质载体系统或靶向脂质体的)。在其它实施方案中脂质-配体轭合物的配体为抗原性配体(产生抗原性脂质载体系统或抗原性脂质体的)。
因此本发明具体地说涉及一种包含式I的脂质-配体轭合物的靶向脂质囊泡(如靶向脂质体或胶束)，其中基团X1、X2、X3中的一个或多个为靶向配体，任选地与其它辅助脂质组合。
作为替代，本发明具体涉及一种包含式I的脂质-配体轭合物的抗原性脂质囊泡(如抗原性靶向脂质体或胶束)，其中基团X1、X2、X3中的一个或多个为抗原性配体，任选地与其它辅助脂质组合。
在具体的实施方案中本发明还涉及一种包含式I的脂质-配体轭合物的混合型脂质囊泡(如混合型脂质体或胶束)，其中基团X1、X2、X3中的一个或多为抗原性配体和靶向配体，任选地与其它辅助脂质组合。
在具体的实施方案中本发明的脂质囊泡(即靶向、抗原性或混合型)还包含一种或多种生物活性剂，如治疗剂或诊断剂或抗原剂，优选治疗剂或诊断剂。其中生物活性剂或者(a)包封在本发明脂质囊泡的内空隙内，(b)整合在本发明脂质囊泡的层或壁内，例如，通过散布于本发明脂质囊泡的层或壁中含的脂质中，或者(c)暴露于本发明的脂质囊泡表面上，藉此通过各种化学相互作用，如静电相互作用、氢键合、范德华力或共价键导致连接或吸附等获得表面暴露。.
技术人员将理解所有组合都考虑在本发明的范围内，如包含包封的抗原剂等的靶向脂质囊泡。
在具体的实施方案中本发明的包含抗原性配体和/或抗原剂的脂质囊泡还可包含一种或多种、优选一种佐剂，其中佐剂或者(a)包封在所述脂质囊泡的内空隙内，(b)整合在所述脂质囊泡层或壁内，例如，通过散布于所述脂质囊泡层或壁中含的脂质中，或者(c)暴露所述脂质囊泡的表面上，藉通过各种化学相互作用，如静电相互作用、氢键合、范德华力或共价键获得表面暴露。
优选地，一种或多种佐剂包封在内空隙内。
如本申请中所使用的术语“辅助脂质”或“形成囊泡的(辅助)脂质”指可任选地以本发明的脂质囊泡中其它脂质形式存在的脂质且可包括非环状和环状的、饱和或不饱和的天然或合成来源的脂质。如本申请中所用的辅助脂质可以是中性脂质、阳离子型脂质或阴离子型脂质。阳离子型脂质具有净正电荷并可包括脂质诸如N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵盐，例如硫酸二甲酯(DOTAP)，DDAB，二甲基双十八烷基溴化铵；1,2-二酰基氧基-3-三甲基铵丙烷，(包括但不限于：二油酰基，二肉豆蔻酰基，二月桂酰基，二棕榈酰基和二硬脂酰基；也可将两种不同的酰基链与甘油骨架连接)；N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N-二甲基胺(DODAP)；1,2-二酰基氧基-3-二甲基铵丙烷，(包括但不限于：二油酰基，二肉豆蔻酰基，二月桂酰基，二棕榈酰基和二硬脂酰基；也可将两种不同的酰基链与甘油骨架连接)；N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)；1,2-二烷基氧基-3-二甲基铵丙烷，(包括但不限于：二油基，二肉豆蔻基，二月桂基，二棕榈基和二硬脂基；也可将两种不同的烷基链与甘油骨架连接)；双十八烷基酰氨基甘氨酰基精胺(DOGS)；3β-[N-(N',N'-二甲基氨基-乙烷)氨甲酰基]胆固醇(DC-Chol)；2,3-二油酰氧基-N-(2-(精胺羧酰氨基)-乙基)-N,N-二甲基-1-丙铵三氟-乙酸(DOSPA)；β-丙氨酰胆固醇；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)；二C14-脒；N-叔丁基-N'-十四烷基-3-十四烷基氨基-丙脒；14Dea2；N-(α-三甲基氨基乙酰基)双十二烷基-D-谷氨酸盐氯化物(TMAG)；O,O'-双十四烷酰基-N-(三甲基氨基-乙酰基)二乙醇胺氯化物；1,3-二油酰氧基-2-(6-羧基-精氨基)-丙基酰胺(DOSPER)；N,N,N',N'-四甲基-N,N'-双(2-羟基乙基)-2,3-二油酰氧基-1,4-丁二铵碘化物；1-[2-(酰氧基)乙基]2-烷基(链烯基)-3-(2-羟乙基)-咪唑啉氯化物衍生物(如Solodin等(1995)Biochem.43:13537-13544所描述)，如1-[2-(9(Z)-十八烯酰基氧基)乙基]-2-(8(Z)-十七烯基-3-(2-羟乙基)咪唑啉氯化物(DOTIM)，1-[2-(十六烷酰基氧基)乙基]-2-十五烷基-3-(2-羟乙基)咪唑啉氯化物(DPTIM)，2,3-二烷基氧基丙基季铵化合物衍生物，在季胺上含有羟烷基部分(参见例如Felgner et al.J.Biol.Chem.1994,269,2550-2561)，如：1,2-二油酰基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORI)，1,2-二油酰氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)，1,2-二油酰氧基丙基-3-二甲基-羟丙基溴化铵(DORIE-HP)，1,2-二油酰氧基丙基-3-二甲基-羟丁基溴化铵(DORIE-HB)，1,2-二油酰氧基丙基-3-二甲基-羟戊基溴化铵(DORIE-Hpe)，1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟基乙基溴化铵(DMRIE)，1,2-二棕榈基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DPRIE)，1,2-二硬脂基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DSRIE)；阳离子型酰基卡尼汀的酯(由Santaniello等美国专利号5,498,633报道)；阳离子型磷脂酰胆碱的三酯，即1,2-二酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱，其中烃链可以是链长为C12至C24的饱和或不饱和的和分支或非分支的，两个酰基链不一定相同。中性或阴离子型脂质分别具有中性或阴离子净电荷。这些可选自甾醇类或脂质如胆固醇、磷脂、溶血脂质、溶血磷脂、神经鞘脂或带有中性或负净电荷的聚乙二醇化脂质。有用的中性和阴离子型脂质因此包括：磷脂酰丝氨酸，磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇(不限于特定的糖)，脂肪酸类，甾醇类，含有羧酸基团例如，胆固醇，胆固醇硫酸酯和胆固醇半琥珀酸酯，1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺，包括但不限于，DOPE，1,2-二酰基-甘油基-3-磷酸胆碱和鞘磷脂。与甘油骨架连接的脂肪酸不限于特定长度或数量的双键。磷脂也可含两种不同的脂肪酸。
技术人员将理解脂质-配体轭合物与辅助脂质的比例依赖于生物活性配体的特性、任选的包封或嵌入在脂质囊泡内或吸附于脂质囊泡上或与脂质囊泡连接的生物活性剂的特性、意欲的应用(疾病的治疗、诊断检测等)、药物组合物形式的制剂和给药途径。
在一实施方案中本发明的脂质囊泡可包含本发明的脂质-配体轭合物及其它形成囊泡的脂质(辅助脂质)，优选地为1:1'000至1:1,优选1:500至1:50的比例。
在本发明的其它实施方案中，脂质囊泡可包含一种或多种脂质-配体轭合物，其中轭合物的醚-脂质包含不饱和烃链，其可以交联或聚合形成聚合的脂质囊泡。
如本申请中所用的，术语“聚合的脂质囊泡”和(特别是聚合的脂质体)指其中构成的脂质通过分子间相互作用以共价键相互结合脂质囊泡。脂质可在单层脂质双层(叶状体)内结合在一起和/或在两层的双层之间结合在一起。聚合脂质层状结构使该装配更能抵抗由体内存在的酸、胆盐或酶引起的酶破坏。另外，控制聚合度和降解速率(通过选择具有可裂解或可聚合烃链的脂质-配体轭合物的特定比例)，稳定性以及“泄漏”(通过产生期望尺寸的孔)可根据任选封闭的生物活性剂的期望的逃逸速率来调整。因此脂质囊泡的设计可以调节例如特定免疫摄取位点上的任何囊化的抗原剂、或特定组织或细胞位点上任何囊化的治疗剂等的最佳逃逸速率。
本领域的技术人员将认识到，囊泡如脂质体、胶束、或其它囊泡形式的脂质载体系统可采用领域已知的标准条件由本发明的脂质-配体轭合物容易制备。
依赖于期望的物理性质，脂质囊泡可由任选地与一种或多种辅助脂质包括稳定化的脂质组合来制备。最终与本发明的脂质-配体轭合物组合的具体的稳定化的化合物可根据期望进行选择以使所得脂质囊泡的性质最佳化(且容易由本领域技术人员不经过度的实验可鉴别)。
本发明的胶束组合物可采用各种对本领域技术人员显而易见的常规的胶束制备方法中的任何一种方法来制备。这些方法典型地包括将脂质-配体轭合物悬浮于有机溶剂中、蒸发溶剂、再悬浮于含水介质中、超声处理和离心。前述方法、以及其它方法，例如，在Canfield等,Methods in Enzymology,第189卷，第418-422页(1990)；El-Gorab等，Biochem.Biophys.Acta，第306卷，第58-66页(1973)；Colloidal Surfactant,Shinoda,等，Academic Press,N.Y.(1963)(尤其是"The Formation of Micelles",Shinoda,第1章，第1-88页)；Catalysis in Micellar and Macromolecular Systems,Fendlerand Fendler,Academic Press,N.Y.(1975)中有论述。前述各出版物的公开内容在此全文引入作为参考。
任选的与脂质-配体轭合物以使由此制备的胶束组合物稳定的稳定化物质包括溴化月桂基三甲基铵、溴化鲸蜡基三甲基铵、溴化肉豆蔻基三甲基铵、(C12-C16)烷基二甲基-苄基氯化铵、十六烷基吡啶溴化物和氯化物、月桂基硫酸盐等。除上面示例的那些外，其它用于稳定胶束组合物的物质，基于本申请的公开对本领域技术人员将是显而易见的。
本发明的脂质体组合物是特别优选的，因为它们作为将生物活性剂递送至组织和细胞的载体或作为呈递抗原的载体特别有效。
脂质体组合物可包含一种或多种脂质-配体轭合物，任选地与一种或多种其它辅助脂质和/或一种或多种稳定化的化合物。脂质-配体轭合物(和辅助脂质)可以是单层或双层的形式，且该单层或双层脂质可用于形成一种或多种单层或双层。在一个以上的单层或双层的情况下，单层或双层通常是同心的。因此，脂质-配体轭合物(和辅助脂质)可用于形成单层脂质体(包含一个单层或双层)、寡层脂质体(包含两个或三个单层或双层)或多层脂质体(包含三个以上的单层或双层)。
基于本申请的公开，在本发明的脂质体脂质组合物的制备中选择合适的辅助脂质和稳定化化合物对本领域技术人员将是显而易见的且不需过度的实验能获得。
除上面示例的那些外，其它用于制备本发明的脂质体脂质组合物的物质，基于本申请的公开对本领域技术人员将是显而易见的。
稳定化物质，诸如与本发明化合脂质-配体轭合物组合的其它两亲性化合物的量可随多种因素而变化，包括所选择的本发明的特定脂质-配体轭合物、所选择的特定的稳定化物质、使用它的具体应用、递送模式等。与本发明的脂质-配体轭合物组合的稳定化物质的量、稳定化物质与脂质-配体轭合物的比例，将会变化并基于本申请的公开可由本领域技术人员容易地确定。典型地脂质-配体轭合物与稳定化脂质高于约4:1、3:1或2:1的比例为优选。
各种各样与本发明脂质体组合物的制备有关的方法都可利用。因此，脂质体可采用各种对本领域技术人员来说将是显而易见的常规的脂质体制备技术中的任何一种方法来制备。这些技术包括采用例如常规的微乳化装置，进行乙醇注入、薄膜技术、匀化、溶剂透析、加压水合(forced hydration)、反相蒸发、微乳化和简易的冻-融。其它由本发明的脂质-配体轭合物制备本发明的脂质体组合物的方法包括，例如，超声处理、螯合透析、匀化、溶剂输注、自发形成、溶剂气化、受控制的洗涤剂透析等，各种方法都涉及以不同的方式制备脂质体。典型地，在由本发明的脂质-配体轭合物制备本发明的脂质体组合物方面优选包括乙醇注入、薄膜技术、匀化和挤压的方法。
脂质体的尺寸可通过各种技术进行调整，如果期望，包括挤压、过滤、超声处理和匀化。其它的调整脂质体的尺寸和调节所得脂质体体内分布和脂质体的清除的方法基于本申请的公开对本领域技术人员将是显而易见的。优选地，脂质体的尺寸通过所定义尺寸的孔通过在压力下挤压调整。本发明的脂质体组合物可以是任意尺寸，优选外径小于约200纳米(nm)。
本领域的技术人员将认识到，任何本发明的脂质-配体轭合物和包含本发明脂质-配体轭合物的脂质载体系统都可被冻干用于储存、和在例如，含水介质(如无菌水或磷酸盐缓冲溶液、或盐水溶液)中，优选在剧烈搅动下重建。如有必要，可包含添加剂以阻止脂质由于冷冻干燥的凝集或融合。有用的添加剂非限制性地包括山梨醇、甘露醇、氯化钠、葡萄糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和聚(乙二醇)，例如，PEG400。
C.纳米颗粒载体系统
纳米颗粒载体系统可以任何形状和任何形态存在。纳米颗粒载体系统的实例包括纳米颗粒、纳米粉、纳米束、纳米晶体、纳米球、纳米纤维、纳米管及其它几何形状。纳米颗粒囊泡状组合物或纳米颗粒典型地为小颗粒，直径典型地小于1微米，优选在约25-1000nm的范围内，更优选在约50-300nm的范围内，最优选在约60-200nm的范围内。纳米球指一类在形状上大致为球形且具有空心芯的纳米颗粒。典型地，纳米颗粒具有基质芯结构，其可使用各种类型的物质和结构，包括无机物如金属，和有机物如聚合物包括生理学可接受的聚合物形成。此种聚合物的非限制性实例包括，例如，聚酯(如聚(乳酸)，聚(L-赖氨酸)，聚(乙醇酸)和聚(乳酸-乙醇酸)共聚物)，聚(乳酸-赖氨酸)共聚物，聚(乳酸-赖氨酸)接枝聚合物，聚酐类(如聚(脂肪酸二聚体)，聚(富马酸)，聚(皮脂酸)，聚(羧基苯氧基丙烷)，聚(羧基苯氧基己烷)，这些单体的共聚物等)，聚(酸酐-酰亚胺)共聚物，聚(酰胺)，聚(原酸酯)，聚(亚氨基碳酸酯)，聚(尿烷)，聚(organophasphazenes)，聚(磷酸酯)，聚(乙烯乙酸乙烯酯)和其它酰基取代的醋酸纤维素及其衍生物，聚(己内酯)，聚(碳酸酯)，聚(氨基酸)，聚(丙烯酸酯)，聚缩醛，聚(氰基丙烯酸酯)，聚(苯乙烯)，聚(氯乙烯)，聚氟乙烯)，聚乙烯咪唑)，氯磺化聚烯烃，聚氧乙烯，共聚物，聚苯乙烯，和它们的混合物或共聚物。纳米颗粒还可以包括羟丙基纤维素(HPC)、N-异丙基丙烯酰胺(NIPA)、聚乙二醇、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯亚胺、壳聚糖、壳多糖、硫酸右旋糖酐、肝素、硫酸软骨素、明胶等以及它们的衍生物、共聚物、及其混合物。制备纳米颗粒的非限制性方法描述于例如美国公开号2003/0138490。在另一实施方案中芯材可选自金属、合金、类金属、金属化合物如金属氧化物、无机化合物、和碳-基材，特别是碳纳米管、富勒烯C60的一维纳米颗粒、和富勒烯C70的三维纳米颗粒。金属的合适实例包括但不限于，贵重金属或铂族金属如Ag、Au、Pd、Pt、Rh、Ir、Ru和Os，过渡金属元素如Ti、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Zr、Nb、Mo、Ta、W、Re，主族金属如Al、Ga、In、Si、Ge、Sn、Sb、Bi、Te。应当理解一些主族金属，特别是Si和Ge，通常也称为类金属。合金的合适实例包括但不限于，贵重金属或铂族金属和过渡金属元素的合金，特别是银和过渡金属元素的合金如Ag/Ni、Ag/Cu、Ag/Co，和铂和过渡金属元素的合金如Pt/Cu，或贵重金属合金或铂合金如Ru/Pt。无机化合物的非限制性实例包括，但不限于，SiO2、金属化合物，特别是金属氧化物如TiO2和氧化铁。纳米颗粒还可包含原有的(intrinsic)荧光或发光部分、等离子体激元共振部分、和磁性部分，其为此种纳米颗粒提供可检测的电、磁、和/或光学性质。
技术人员将知道材料的选择可能依赖于纳米颗粒的使用意图。
在一实施方案中，本发明涉及一种包含一种或多种脂质-配体轭合物的纳米颗粒。一种或多种脂质轭合物可缠上、嵌入、掺入、囊化、吸附或结合表面，或以其它方式与纳米颗粒缔合。
在一具体的实施方案中脂质-配体轭合物可以包衣的形式，通过分子间作用力如范德华力、离子相互作用、疏水性相互作用与纳米颗粒缔合，任选地与其它辅助脂质组合。
作为替代，纳米颗粒可任选地包含一个或多个官能团，诸如，羧基、巯基(sulhydryl)、羟基、或氨基基团，用于将一种或多种脂质-配体轭合物(或其它化合物，如间隔基)与纳米颗粒的表面共价键连接，任选地与其它辅助脂质组合。
本发明的纳米颗粒也可集合在一起(任选地与分散剂一起)形成纳米簇。在团簇形成和团簇内纳米颗粒特定排列之前各种纳米颗粒类型的独立制剂可控制脂质-配体轭合物的和保留和浓度因而可以控制生物活性剂的保留和浓度。
在一些实施方案中，纳米颗粒可进一步包含其它生物活性剂，其被俘获、嵌入、或囊化在纳米颗粒的固体基质芯内。
在优选的实施方案中，脂质-配体包被的纳米颗粒可由纳米尺寸的芯颗粒和本发明的一种或多种脂质-配体轭合物和任选的一种或多种辅助脂质形成。在任何得到的脂质-配体包被的纳米颗粒中，脂质-配体轭合物可以单层或双层的形式存在。在一个以上的单层或双层的情况下，单层或双层通常是同心的。纳米颗粒的包被优选在包含本发明脂质-配体轭合物的溶液中和通过提供允许脂质-配体轭合物包被纳米颗粒的足够时间来进行。
在一些实施方案中，一种或多种脂质-配体轭合物中的一种或多种配体为一种或多种抗原性配体。
诱导免疫应答的每个纳米颗粒抗原性配体的量(或抗原性配体的表面密度)依赖于许多因素，如免疫应答本身的特性(体液对细胞-介导的)、抗原配体的免疫原性、受到挑战的机体的致免疫建立(immunogenic constitution)、和给药途径和暴露于抗原的时间。
清楚的是，受试者的免疫可通过利用抗原的多拷贝增强，其中抗原的多拷贝作为多价展示从而增加位点-特异性抗原浓度因而诱导持久的免疫应答。由于半抗原-相关的尺寸问题难以给药和通常不能激发有效免疫应答的抗原配体如小肽或碳水化合物的情况下这是特别期望的。
因此，在一些实施方案中纳米颗粒在其表面上展示一个抗原配体的单拷贝或多拷贝或不同的抗原配体的组合(以多价展示的形式)。如本申请中所用的，术语“多价”指一次以上拷贝的展示或载体系统上的抗原类型。
更具体而言，本发明涉及一种包含被至少一种式I的脂质-配体轭合物、和任选其它基质或辅助脂质包被的实心芯的纳米颗粒，其中X1、X2、X3中的一个或多个为抗原性配体。
免疫可通过包含将纳米颗粒引导至适宜的免疫细胞或位置的靶向配体而进一步改进。
可充当靶向配体的化合物为干扰病原体粘附至宿主细胞因而成功移殖(colonization)的化合物。此种化合物的实例可包括破伤风类毒素；大肠杆菌的P菌毛(P pili)；绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、奈瑟氏球菌(Neisseria species)、摩拉克氏菌(Moraxella species)、EPEC、或霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的IV型菌毛；菌毛基因和若干纤毛粘着素(fimbrial adhesins)，包括FHA、百日咳杆菌粘附素(pertactin)、百日咳杆菌的百日咳毒素BrkA；和鼠伤寒沙门氏菌的SipB-D；和腺病毒粘附；靶向M-细胞的呼肠孤病毒σ-1蛋白。
因此，本发明还涉及包含被至少一种式I的脂质-配体轭合物、和任选的其它基质或辅助脂质包被的实心芯的纳米颗粒，其中X1、X2、X3中的一个或多个为抗原性配体和/或靶向配体。
在其它实施方案中脂质-配体包被的纳米颗粒进一步包含包封或嵌入在纳米颗粒的实心芯内的单一的抗原剂或抗原剂的组合(多价)。
因此，本发明还涉及包含被至少一种式I的脂质-配体轭合物、和任选的其它基质或辅助脂质包被的实心芯的纳米颗粒，其中X1、X2、X3中的一个或多个为抗原性配体和/或靶向配体，其中实心芯任选地包含一种或多种其它抗原剂。
在其它的实施方案中纳米颗粒进一步包含一种或多种助剂，其被包封、嵌入、或分散在纳米颗粒的实心芯内。
如本申请中所用的术语“佐剂”指任何能增强对特异性抗原的体液和/或细胞免疫应答的任何物质。合适的佐剂可展示在纳米颗粒的表面上，嵌入到纳米颗粒壁内或囊化到纳米颗粒内部内。可用于促进血清和/或粘膜抗体的产生以及抗共同给予的抗原的细胞介导的免疫响应的佐剂的实例包括大肠杆菌(E.coli)热不稳定的肠毒素全毒素(LT)和霍乱弧菌肠毒素(CT)以及KPL佐剂(来源于明尼苏达沙门氏菌的细胞壁)。
如本申请中所用的，术语“展示的”或“表面暴露的”指任何存在于载体系统如脂质囊泡或纳米颗粒的外表面因此易接近识别的配体。
各种疾病和障碍可通过此种纳米颗粒疫苗构建物或装配物治疗，包括：炎性疾病、感染性疾病、癌症遗传病、器官移植排斥、自身免疫性疾病和免疫障碍。
因此本发明还包括包含多价纳米颗粒的疫苗，其中纳米颗粒包含实心芯和一种或多种表面暴露的脂质-配体轭合物、还任选地包含佐剂和/或嵌入纳米颗粒实心芯中的其它抗原剂，其中配体为一种或多种抗原和/或靶向配体。
在其它实施方案中，一种或多种脂质-配体轭合物中的一种或多种配体为一种或多种治疗剂或诊断剂。
包含表面暴露的脂质-配体轭合物的本发明纳米颗粒的生产方法包括步骤：(a)提供纳米颗粒和(b)使一种或多种脂质-配体轭合物通过吸附或连接与纳米颗粒缔合形成脂质-配体包被的纳米颗粒。作为替代该方法包括步骤：(a)提供纳米颗粒，(b)使一种或多种醚-脂质通过吸附或连接与纳米颗粒缔合形成脂质-包被的纳米颗粒和(c)使一种或多种生物活性配体与一种或多种醚-脂质共价键连接形成脂质-配体包被的纳米颗粒，其中醚-脂质与纳米颗粒的表面结合。(预成型的)脂质-包被的纳米颗粒是同时提交的申请的一部分，其在此全文引入。
制造合适尺寸的纳米颗粒的典型方法包括汽化法(例如，自由射流膨胀，激光汽化，电火花腐蚀，电爆炸和化学气相沉积)、包括机械磨碎的物理方法(例如，珠磨技术，Elan Nanosystems,Ireland)、和溶剂置换之后的界面沉积。
在其它实施方案中，本发明涉及一种包含一种或多种脂质-配体轭合物的纳米球。与纳米颗粒相反，空心内部形式的纳米球，可容易用于包封一种或多种生物活性剂并随后将其递送至目的细胞或组织。此种囊化的生物活性剂的释放速度可，例如，通过已知的技术调整。
D.药物组合物和制剂
本发明的载体系统可以药物组合物的形式存在，例如药物组合物进一步包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体，如生理盐水或磷酸盐缓冲液，根据给药途径和标准的药物实践进行选择。
因此在其它方面本发明涉及包含一种或多种脂质或纳米颗粒载体系统的药物组合物，其中脂质或纳米颗粒载体系统包含配体-脂质轭合物，任选地与其它辅助脂质和药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体组合。
优选地脂质载体系统为脂质囊泡，如脂质体或胶束且纳米颗粒载体系统为纳米颗粒或纳米球。
应当理解术语“一种或多种脂质-配体轭合物”指本申请中公开的所有可能的实施方案，即其中配体为一种或多种靶向、抗原性、治疗性和诊断性配体及其混合物的轭合物。任选地其它一种或多种生物活性剂为包封或嵌入脂质或纳米颗粒载体系统内或吸附于脂质或纳米颗粒载体系统上或与脂质或纳米颗粒载体系统连接。
本发明的药物组合物可用于体外应用，如细胞培养应用，或体内应用。关于体内应用，本发明的脂质制剂可以各种适应所选择的给药途径包括肠胃外、经口、或腹腔内给药的形成施用于患者。肠胃外给药包括静脉内、肌内、间质、动脉内、皮下、眼内、滑膜内、经上皮(包括透皮)、经肺吸入、眼用、舌下和颊内、局部地(包括眼用、皮肤、眼睛、直肠)、和经喷洒给药的鼻吸入，优选静脉给药。
要施用的有用剂量和特定的给药方式将随所考虑的治疗或诊断应用、所用的特定的生物活性剂和脂质化合物以及载体系统的形式，例如胶束、脂质体或纳米颗粒、以及诸如受治疗的受试者的年龄、体重、身体状况的因素而变化，这对本领域技术人员将是显而易见的。本发明的靶向药物组合物的应用允许施用较低的剂量以获得期望的治疗效果。
通过一般的指导，载体系统中脂质-配体轭合物的比例将在0.05至5摩尔％之间变化，其中0.1至2摩尔％的比例为更优选，且每千克患者体重约0.01mg至约10mg之间的特定的抗原剂、治疗剂或诊断剂，可以适于施用，尽管也可以使用较高的和较低的量。
E.应用方法
如上所述，在一具体的实施方案中包括这些的靶向脂质-配体轭合物特别是靶向囊泡(即脂质体和胶束)和靶向纳米颗粒、以及它们的各药物组合物特别适于用作靶向递送一种或多种生物活性剂、优选治疗剂、诊断剂和/或抗原剂的载体。
因此，本发明的靶向脂质-配体轭合物特别适用于治疗疾病的方法中的体外和/或体内应用，对于所述疾病将一种或多种特定的生物活性剂、优选治疗剂、诊断剂和/或抗原剂靶向递送至组织或细胞是期望的或需要的。
在靶向纳米颗粒及其药物组合物的情况下，一种或多种生物活性剂优选俘获于实心芯内。
在靶向脂质囊泡及其药物组合物的情况下，一种或多种生物活性剂优选包封于内空隙内、或掺入脂质双层中。
在其它方面，本发明还包括跨膜转运生物活性化合物的方法，特别是细胞内递送一种或多种生物活性剂的方法，该方法包括使细胞与本发明的药物组合物接触。
在另一具体的实施方案中包含这些的抗原囊泡(即脂质体和胶束)和抗原纳米颗粒、以及它们的各药物组合物，特别适于用作抗原展示系统。因此，本发明的抗原脂质-配体轭合物特别适用于例如免疫方法和/或适用于体外/体内诊断应用。
任选地抗原囊泡(即脂质体和胶束)和抗原纳米颗粒可进一步包含一种或多种生物活性剂。在抗原纳米颗粒的情况下，一种或多种生物活性剂优选被俘获于实心芯内。在靶向脂质囊泡及其药物组合物的情况下，一种或多种生物活性剂优选包封于内空隙内、或掺入脂质双层中。
因此，在另一方面本发明涉及一种用于预防性和治疗性疫苗的抗原展示系统，其包含含任选地与其它辅助脂质组合的一种或多种抗原脂质-配体轭合物的抗原脂质囊泡或抗原纳米颗粒，其中任选地包含一种或多种佐剂和/或一种或多种生物活性剂。
本发明还包括在受试者中触发或调节对抗原的免疫应答的方法，其包括将抗原展示给抗原呈递细胞，特别是树突细胞、巨噬细胞、B细胞和内皮细胞，随后将所述抗原呈递细胞施用于受试者。
本发明的其它方面包括采用本发明的载体系统跨膜转运生物活性物质的方法和/或将生物活性化合物递送到细胞内。
所考虑的其它应用包括例如体外应用于细胞的生长促进和分化以及表达特性的改变和生物反应器中制造的生物制品的翻译后修饰模式。
F.试剂盒
在其它方面，本发明涉及包含容器的试剂盒，所述容器被区室化用于存贮试剂盒的各种元件。一个区室可含有预定量的脂质-配体轭合物或由其制备的载体系统。在载体系统如脂质体的情况下，这些可以含或不含调节组合物pH至约7至约8的生理学范围的pH缓冲剂，或者为用于使用时重建的冻干或冷冻干燥的形式。在试剂盒内还包含其它试剂和使用说明书。
本发明在以下实施例中进一步描述。
实施例
材料：1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)得自Merck&Cie(Schaffhausen,Switzerland)。胆固醇、DOPE、DSPC、POPC、MPEG2000-DOPE(880130)、和荧光脂质NBD-DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)(铵盐))(810145P)和PhB-DOPE(810150)购自Avanti Polar Lipids(Alabaster,AL)。官能化的PEG丙酸(PA)衍生物Fmoc-NH-PEG12-PA-COOH(851024)得自Novabiochem，Fmoc-NH-PEG8-PA-COOH(PEG1830)、Fmoc-NH-PEG36-PA-COOH(PEG4400)和MPEG(2kDa)-胺(PEG1152)得自IRIS Biotech GmbH。二苯基重氮甲烷树脂(D-2230)得自Bachem AG，H-Thr(tBu)-2-ClTrt树脂(RRA-1251)得自CBLPatras，H-Gly-2-ClTrt树脂(856053)和Sieber树脂(855008)得自Novabiochem。所有其它的化学药品和溶剂都是A.R.级或A.R.级以上。
氮杂-肽Michael受体反式-Cbz-D-Ala-D-Ala-2-氮杂-Asn-丙烯酸(RR11a-OH)及其以N-羟基琥珀酰亚胺活化的酯(RR11a-NHS)由WuXiAppTec Co.Ltd.合成(Ekici等，2004,J.Med.Chem.47,1889-1892；Reisfeld等，Nanomedicine:Nanotechnology,Biology and Medicine7,Issue 6,2011,665-673)。
2,3-双(十四烷基氧基)丙-1-胺根据Kokotos等Chemistry-AEuropean Journal,2000,第6卷,#22,4211-4217合成。双(3-((Z)-十八-9-烯氧基)丙基)胺以类似的方式由油基甲磺酸酯和双(3-羟丙基)胺获得(参见MaGee等,J.Journal of Organic Chemistry,2000,第65卷，#24,8367-8371)。
细胞培养：将得自Cell Culture Strain Collection,Merck KGaA,Darmstadt,Germany的M21人黑素瘤细胞与DMEM中的5％CO2一起保持在37℃，其中DMEM含高葡萄糖培养基(Life Technologies,Carlsbad,CA)，补充以10％胎牛血清。在实验前将细胞有规律地通过并以2ml介质中0.3×106个细胞平铺在6孔的培养平板中16小时。将M21细胞用无Opti-MEM血清的培养基中的脂质体于37℃温育1小时，然后在用Opti-MEM洗涤一次后采用细胞解离缓冲液收获(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)。NBD-DOPE的辅助定位(Co-localization)由Guava easyCyte 8HT(EMD Millipore Corp.,Billerica,MA)测定。
统计分析：统计分析用学生t检验完成。在p值<0.01下平均值的差异被认为是在统计上显著的。
实施例1：(2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-谷氨酸-α -叔丁基酯-γ-2,3-双(十四烷基氧基)丙基-酰胺的合成
在室温下将15g的Fmoc-Glu(OSu)OtBu((2S)-N□-(9-芴甲基氧基羰基)-谷氨酸α-叔丁基-酯γ-N-羟基琥珀酰亚胺酯)溶解于二氯甲烷中。加入15.3g的2,3-双(十四烷基氧基)丙-1-胺之后，将混合物搅拌17小时并蒸干。将残余物溶解于最小量的二氯甲烷中并用SiO2作为固相和甲基叔丁基醚/己烷/7:3作为洗脱剂进行柱层析纯化。将产物级分蒸发之后得到无色固体形式的25.5g的(2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-谷氨酸-α-叔丁基酯-γ-2,3-双(十四烷基氧基)丙基-酰胺。在CDCl3中进行1H-NMR(TMS作为内标)，以ppm为单位的化学位移：7.76(d,2H,Fmoc),7.61(d,2H,Fmoc),7.25-7.43(m,4H,Fmoc),6.13(bs,NH,1H),5.60(bs,NH,1H),4.39,4.18-4.25(d和m,4H),3.21-3.62(m,9H),1.97-2.23(m,4H),1.51-1.60(m,4H),1.47(s,9H),1.25(m,44H,CH2),0.84-0.91(m,6H,2x烷基-CH3)。
实施例2：(2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-谷氨酸-γ -2,3-双(十四烷基氧基)丙基-酰胺的合成
在100ml烧瓶中将4.6g(5.1mmol)(2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-谷氨酸-α-叔丁基酯-γ-2,3-双(十四烷基氧基)丙基-酰胺溶解于25ml二氯甲烷中并用25ml三氟乙酸处理。在1h之后将酯基完全裂解并将溶液倒在50ml的冷水上。将有机层萃取，用水洗至中性pH并经Na2SO4干燥。将有机层滤出并蒸发溶剂得到4.2g期望的产物(5.0mmol，98％产率，TLC：MtBE/己烷7:3；Rf＝0.43。
实施例3：(2S)-谷氨酸-γ-(2,3-双(十四烷基氧基)丙基)酰胺的合成
将5g的(2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-谷氨酸-α-叔丁基酯-γ-2,3-双(十四烷基氧基)丙基-酰胺加入到85ml的N,N-二甲基甲酰胺中。向混合物中加入2.6ml的哌啶。将混合物于室温搅拌三小时然后在真空下蒸干得到5.2g的无色固体形式的(2S)-谷氨酸-γ-(2,3-双(十四烷基氧基)丙基)酰胺，其可用于制备脂质囊泡或用于用活性剂或间隔基基团的先前衍生化。
实施例4：(R)-2-氨基-N1-(2-(4-甲氧基苯甲酰氨基)乙 基)-N4,N4-双(3-((Z)-十八-9-烯氧基)丙基)琥珀酰胺的合成
(a)N-(2-氨基乙基)-4-甲氧基苯甲酰胺
将3.0g 4-甲氧基苯甲酰氯于-78℃加入到30mL在二氯甲烷中的1,2-二氨基乙烷中随后让其温热至23℃。以含水的酸-碱精制并在真空下蒸干得到1.65g浅黄色油状的N-(2-氨基乙基)-4-甲氧基苯甲酰胺。在CDCl3中进行1H-NMR(TMS作为内标)，以ppm为单位的化学位移：8.53(t,1H,NH),7.91(d,2H,Benz),6.99(d,2H,Benz),4.75(bs,2H,NH2),3.81(s,3H,CH3),3.39,(dd,2H,CH2),2.82(t,2H,CH2)。
(b)(R)-叔丁基3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-4-(2-(4-甲氧基苯甲酰氨基)乙氨基)-4-氧代丁酸酯的合成
将3.0g 2N-(2-氨基乙基)-4-甲氧基苯甲酰胺(步骤(a)中获得)和1.70mL在DMF(0℃)中的N-甲基吗啉加入到6.35gFmoc-Asp(OtBu)-OH、1.70mL N-甲基吗啉和2.00mL异丁基氯甲酸酯在乙酸乙酯(-12℃)中的溶液中并搅拌3h同时让其温热至23℃。用乙酸乙酯稀释所得悬浮液，之后以含水的酸-碱精制并在真空下蒸干产生9.55g(R)-叔丁基3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-4-(2-(4-甲氧基苯甲酰氨基)乙基氨基)-4-氧代丁酸酯。将此粗品悬浮于异丙醚中23h，然后滤出并干燥提供4.47g白色晶体形式的(R)-叔丁基3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-4-(2-(4-甲氧基苯甲酰氨基)乙基氨基)-4-氧代丁酸酯。在CDCl3中进行1H-NMR(TMS作为内标)，以ppm为单位的化学位移：8.28(t,1H,NH),8.07(t,1H,NH),7.89(d,2H,Fmoc),7.81(d,2H,Benz),7.71-7.60(m,2H,Fmoc和1H,NH),7.46-7.27(m,4H,Fmoc),6.96(d,2H,Benz),4.35-4.20(m,3H,Fmoc,和1H CH),3.78(s,3H,CH3),3.40-3.20,(m,4H,2xCH2),2.69(dd,1H,CH2),2.46(dd,1H,CH2),1.37(s,9H,3xCH3)。
(c)(R)-3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-4-(2-(4-甲氧基苯甲酰氨基)乙基氨基)-4-氧丁酸钠乙酸酯
在23℃下向3.0g在二氯甲烷中的(R)-叔丁基3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-4-(2-(4-甲氧基苯甲酰氨基)乙基氨基)-4-氧代丁酸酯(步骤(b)中获得)中加入30.0mL三氟乙酸。在反应完毕时加入NaHCO3水溶液中得到白色沉淀，将其以带有二氯甲烷洗涤并干燥产生白色粉末形式的2.55g(R)-3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-4-(2-(4-甲氧基苯甲酰氨基)乙基氨基)-4-氧丁酸钠乙酸酯。在SO(CD3)/CD3OD，1:1中进行1H-NMR(TMS作为内标)，以ppm为单位的化学位移：7.85-7.79(m,2H,Fmoc和2H,Benz),7.68(d,2H,Fmoc),7.45-7.29(m,4H,Fmoc),6.93(d,2H,Benz),4.51-4.17(m,3H,Fmoc和1H,CH),3.78(s,3H,CH3),3.47-3.34,(m,4H,2xCH2),2.82(dd,1H,CH2),2.63(dd,1H,CH2)。
(d)(9H-芴-9-基)甲基(R,Z)-1-(4-甲氧苯基)-10-(3-((Z)-十八-9-烯氧基)丙基)-1,6,9-三氧代-14-氧杂-2,5,10-氮杂三十二-23-烯-7-基氨基甲酸酯的合成
将0.48g在二甲基甲酰胺中(R)-3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-4-(2-(4-甲氧基苯甲酰氨基)乙基氨基)-4-氧丁酸钠乙酸酯(步骤(c)中获得)冷却至10℃然后随后加入0.46g双(3-((Z)-十八-9-烯氧基)丙基)胺、0.37g COMU和0.20g DIPEA。于23℃搅拌20h之后将溶液通过Alox垫料过滤并将此用少许二甲基甲酰胺冲洗。滤液用乙酸乙酯稀释，用水洗涤并在真空下蒸干得到1.12g橙色油，其经柱层析纯化产生0.41g(9H-芴-9-基)甲基(R,Z)-1-(4-甲氧苯基)-10-(3-((Z)-十八-9-烯氧基)丙基)-1,6,9-三氧代-14-氧杂-2,5,10-三氮杂三十二-23-烯-7-基-氨基甲酸酯。在CDCl3中进行1H-NMR(TMS作为内标)，以ppm为单位的化学位移：7.86(d,2H,Benz),7.69(d,2H,Fmoc),7.55(d,2H,Fmoc),7.42-7.23(m,4H,Fmoc和1H,NH),6.88(d,2H,Benz和1H,NH),6.12(bd,1H,NH),5.41-5.26(m,4H,4xCH),4.60-4.33(m,3H,Fmoc),4.17(t,1H,CH),3.82(s,3H,CH3),3.62-3.23,(m,16H,8xCH2和1H,CH2),2.73(dd,1H,CH2),2.05-1.95(m,8H,4xCH2),1.85-1.65(m,4H,2xCH2),1.57-1.45(m,4H,2xCH2),1.24(bs,44H,22xCH2),0.88(t,6H,2xCH3)。
(e)(R)-2-氨基-N1-(2-(4-甲氧基苯甲酰氨基)乙基)-N4,N4-双(3-((Z)-十八-9-烯氧基)丙基)琥珀酰胺的合成
向在二氯乙烷中的2.12g(9H-芴-9-基)甲基(R,Z)-1-(4-甲氧苯基)-10-(3-((Z)-十八-9-烯氧基)丙基)-1,6,9-三氧代-14-氧杂-2,5,10-三氮杂三十二-23-烯-7-基-氨基甲酸酯(步骤(d)中获得)中加入0.75g二乙胺，搅拌26h之后在真空下蒸干得到1.90g粗品，其通过吸附至20g Dowex Monosphere和随后通过在乙醇中的氨解吸附纯化产生1.09g(R)-2-氨基-N1-(2-(4-甲氧基苯甲酰氨基)乙基)-N4,N4-双(3-((Z)-十八-9-烯氧基)丙基)琥珀酰胺。在CDCl3中进行1H-NMR(TMS作为内标)，以ppm为单位的化学位移：7.88(d,2H,Benz和1H,NH),7.64(t,1H,NH),6.89(d,2H,Benz),5.42-5.26(m,4H,4xCH),3.82(s,3H,CH3),3.65-3.49,(m,4H,2xCH2),3.42-3.28(m,12H,6xCH2和1H,CH),2.99(dd,1H,CH2),2.71(dd,1H,CH2),2.10-1.92(m,8H,4xCH2和2H,NH2),1.85-1.67(m,4H,2xCH2),1.60-1.47(m,4H,2xCH2),1.28(bs,44H,22xCH2),0.90(t,6H,2xCH3).MS:947.9[M+Na]+。
实施例5：N 2 ,N,N-二甲基氨基亚甲基-10-甲酰基-叶酸-α-叔丁基 酯-γ-2,3双(十四烷基氧基)丙基酰胺的合成
将2.2g的N2,N,N-二甲基氨基亚甲基-10-甲酰基-蝶酸加入到46ml的N,N-二甲基甲酰胺中。加入3.2g的O-苯并三唑-N,N,N',N'-四甲基-脲-六氟-磷酸酯之后将混合物于室温搅拌20分钟。然后滴加5.0g的(2S)-谷氨酸-γ-(2,3-双(十四烷基氧基)丙基)酰胺和50ml N,N-二甲基甲酰胺的混合物。于室温搅拌17小时之后，通过过滤除去固体物并将滤液在真空中于40℃蒸干。将残余物溶解于100ml的二氯甲烷中。该二氯甲烷溶液用25ml的柠檬酸水溶液、25ml的5％碳酸氢钠水溶液和25ml的水洗涤。各水相用二氯甲烷萃取。将合并的二氯甲烷相经硫酸镁干燥、蒸干得到黄色泡沫，将其溶解于二氯甲烷/甲醇/95:5的混合物并于40℃搅拌15min。通过过滤除去固体物并将滤液采用SiO2作为固相和二氯甲烷/甲醇/95:5作为洗脱剂通过柱层析纯化。将产物级分蒸发之后得到2.7g的黄色泡沫，将其按照上面的描述再经柱层析纯化得到2.2g浅黄色泡沫状的N2,N,N-二甲基氨基亚甲基-10-甲酰基-叶酸-α-叔丁基酯-α-(2,3双(十四烷基氧基)丙基)酰胺。在CDCl3中进行1H-NMR(TMS作为内标)，以ppm为单位的化学位移：10.00(bs,1H,N3-H),8.96(s,1H,C7-H),8.76,8.72(2s,2H,CHN,CHO),7.88(d,2H,C2'-H,C6'-H),7.73(d,1H,NH(Glu)),7.35(d,2H,C3'-H,C5'-H),6.26(d,1H,C？-NH),5.32(s,2H,C6-H2),4.53(m,1H,CH-Glu),3.30-3.56(m,9H,m,4CH2,CH-O-烷基),3.22(s,3H,N-CH3),3.15(s,3H,N-CH3),2.03-2.40(m,4H,2CH2-Glu),1.54(m,s,4H,2CH2),1.46(s,9H,OC(CH3)3),1.24(s,44H,22CH2),0.87(m,6H,2x烷基-CH3)。
实施例6：叶酸-γ-(2,3双(十四烷基氧基)丙基)酰胺的合成
将2.1g的N2,N,N-二甲基氨基亚甲基-10-甲酰基-γ叶酸-α-叔丁基酯-γ-2,3双(十四烷基氧基)丙基酰胺溶解于105ml二氯甲烷中。加入105ml的三氟乙酸之后将混合物于室温搅拌1小时然后于40℃蒸干得到3.4g的黄色泡沫。将后者溶解于105ml的四氢呋喃中并滴加105ml的1M氢氧化钠水溶液，边滴加边搅拌。将混合物加热至50℃2.5小时。冷却至室温后将有机层分离并蒸干。向残余物中加入105ml的二氯甲烷和105ml的1M盐酸水溶液。将混合物于室温搅拌5分钟并将沉淀的产物吸出(sucked off)，用500ml的水洗涤然后在真空中于40℃干燥，得到1.76g黄色固体形式的叶酸-γ-(2,3双(十四烷基氧基)丙基)酰胺。在DMSO-d6中进行1H-NMR(TMS作为内标)，以ppm为单位的化学位移：11.59(bs,1H,N3-H),8.64(s,1H,C7-H),8.17(d,1H,NH),7.81(t,1H,NH),7.66(d,2H,C2'-H,C6'-H),7.01(bs,NH,1H),6.92(t,2H,NH),6.64(d,2H,C3'-H,C5'-H),4.49(d,2H,C6-H2),4.29(m,1H,CH-Glu),3.26-3.46(m,5H,2CH2,CH-O-烷基),3.08(s,2H,CH2),2.17-2.2.5(m,2H,CH2),1.84-2.11(2m,2H,CH2),1.42,1.23(m,s,44H,22CH2),0.85(m,6H,2x烷基-CH3)。
实施例7：(2S,47S)-47-[2-N-(二甲基氨基)亚甲基]-10-甲酰基 蝶酰基氨基-2-[3-[[2,3-双(十四烷基氧基)丙基]氨基]-3-氧代丙 基]-4,44-二氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-十二氧杂 -3,43-二氮杂四十八烷-1,48-二酸的合成
(a)Fmoc-Glu(DMA)-联苯甲基树脂的合成：
在100ml SPPS反应器中将3.85g的二苯基重氮甲烷树脂(3.3mmol)用30ml DCM洗涤两次并用4.2g的2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-谷氨酸-γ-2,3-双(十四烷基氧基)丙基-酰胺(参见实施例2，1.5当量，5.0mmol)在30ml DCM中的溶液处理过夜。将溶液滤出并将树脂用DCM洗涤四次。为了破坏最终未反应的二苯基重氮甲烷将树脂用125μl在30ml DCM中的乙酸(0.5当量，2.2mmol)处理15分钟，之后交替以30ml二甲基甲酰胺和异丙醇洗涤三次。树脂用二异丙醚洗涤两次并在真空中干燥过夜。得到6.7g的期望的产物(>100％的理论值，理论上产生6.5g)。通过在304nm下进行UV测量Fmoc裂解产物测定树脂的载荷为0.49mmol/g(理论上最大载荷为0.51mmol/g)。
(b)H-Glu-OtBu-NH-PEG12-PA-Glu(DMA)-联苯甲基树脂的合成：
H-Glu-OtBu-NH-PEG12-PA-Glu(DMA)-联苯甲基树脂通过常规的固相合成获得，包括以下反应顺序：
(1)用在DMF中的哌啶裂解Fmoc-Glu(DMA)-联苯甲基树脂的Fmoc基团，
(2)使用在DMF和DIPEA中的HBTU用Fmoc-NH-PEG12-COOH冷凝，
(3)用在DMF中的哌啶裂解Fmoc-NH-PEG12-PA-Glu(DMA)-联苯甲基树脂的Fmoc基团，
(4)使用在DMF和DIPEA中的HBTU用Fmoc-Glu-OtBu冷凝和最后
(5)用在DMF中的哌啶裂解Fmoc-Glu-OtBu-NH-PEG12-PA-Glu(DMA)-联苯甲基树脂的Fmoc基团。
(c)[2-N-(二甲基氨基)亚甲基]-10-甲酰基蝶酰基-Glu-OtBu-NH-PEG12-PA-Glu(DMA)-联苯甲基树脂的合成：
[2-N-(二甲基氨基)亚甲基]-10-甲酰基蝶酰基-Glu-OtBu-NH-PEG12-PA-Glu(DMA)-联苯甲基树脂通过常规的固相合成使在DMF中的H-Glu-OtBu-NH-PEG12-PA-Glu(DMA)-联苯甲基树脂与[2-N-(二甲基氨基)亚甲基]-10-甲酰喋酸、HATU和DIPEA反应获得。
(d)(2S,47S)-47-[2-N-(二甲基氨基)亚甲基]-10-甲酰基蝶酰基氨基-2-[3-[[2,3-双(十四烷基氧基)丙基]氨基]-3-氧代丙基]-4,44-二氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-十二氧杂-3,43-二氮杂四十八烷-1,48-二酸的合成：
将4.5g[2-N-(二甲基氨基)亚甲基]-10-甲酰基蝶酰基-Glu-OtBu-NH-PEG12-PA-Glu(DMA)-联苯甲基树脂用45ml二氯甲烷洗涤，滤出和再混悬于45ml二氯甲烷中。然后加入41.4ml的三氟乙酸(trifluaroacetic acid)之后加入2.25ml三异丙基硅烷。将悬浮液于室温搅拌1小时然后过滤。树脂每次用45ml二氯甲烷洗涤三次。将合并的滤液在真空中蒸干产生5.75g的琥珀油。HPLC：90.7％面积，ESI-MS：单同位素的MW计算值＝1718.1,MW[M-H]-＝1718.0。
实施例8：(2S,47S)-47-蝶酰基氨基-2-[3-[[2,3-双(十四烷基氧 基)丙基]氨基]-3-氧代丙基]-4,44-二氧代-7,10,13,16,19,22,25, 28,31,34,37,40-十二氧杂-3,43-二氮杂四十八烷-1,48-二酸的合成
将4.6g(2S,47S)-47-[2-N-(二甲基氨基)亚甲基]-10-甲酰基蝶酰基氨基-2-[3-[[2,3-双(十四烷基氧基)丙基]氨基]-3-氧代丙基]-4,44-二氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-十二氧杂-3,43-二氮杂四十八烷-1,48-二酸与460ml 1N NaOH一起于50℃搅拌2小时。通过加入59.2g 32％ic NaOH使反应混合物达到pH 12.5。棕色溶液用0.46g活性炭于50℃处理15min，趁热过滤并通过加入3.2g 37％ic HCl使达到pH 1。所得沉淀通过过滤收集，用水洗涤并在真空中于室温干燥产生1.2g的黄绿色固体。HPLC：89.9％面积，ESI-MS：单同位素的MW计算值＝1635.0,MW[M-H]-＝1634.1。
实施例9：RGD脂质五肽环[-Asp-hGlu(DMA)-D-Val-Arg-Gly-]的 合成：
(a)Fmoc-hGlu(OBzl)-OH的合成：
按照公开的方案将可商购获得的高谷氨酸(H-hGlu-OH)以δ-苄基酯的形式进行侧链保护(Benoiton L.,Can.J.Chem.,40,570(1962))(产量：19.8g，26％的理论值，TLC(CHCl3/MeOH/32％乙酸5:3：1)Rf＝0.62)。不经进一步纯化将H-hGlu(OBzl)-OH(19.7g，77.6毫摩尔)溶解于二噁烷/水的混合物(1：2，300ml)中通过加入NaHCO3(12.8g，155毫摩尔)和Fmoc-OSu(26.2g，77.6毫摩尔)进行Fmoc保护。完毕将反应混合物用二异丙醚萃取三次。将含有产物的水层用HCl调至pH 2并将产物用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机层用H2O洗涤至中性pH。蒸发乙酸乙酯并将残留水以与乙腈的共沸混合物的形式除去。因此获得干泡沫形式的产物：34.9g，73.7毫摩尔，95％的理论值，ESI-MS：单同位素的MW计算值＝473.2,MW[M+H]+＝474.1。
(b)H-Asp(OtBu)-hGlu(OBzl)-D-Val-Arg(Pbf)-Gly-OH的合成：
固相肽合成按照Fmoc/tBu策略进行(Atherton E.，等，J.Chem.Soc.,Chem.Comm.,539(1978))，H-Gly-2-ClTrt(46g,34.5毫摩尔)用作基料树脂，通过Fmoc-Xaa-OH/DIC/HOBt(2当量：4当量：3当量)进行偶联过夜，通过20％在DMF中的哌啶5和10min之后获得Fmoc保护的脱除。分别在每次偶联和脱保护之后用二甲基甲酰胺/异丙醇交替洗涤三次。依它们的时间次序使用的氨基酸衍生物为Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Val-OH、Fmoc-高Glu(OBzl)-OH和Fmoc-Asp(OtBu)-OH。Fmoc-SPPS产生73.4g的直链肽树脂(树脂增重27.4g，理论值的87％，理论值＝31.5g)。
将侧链保护的直链五肽通过1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇/二氯甲烷1：4(700ml)三次重复自树脂(72.0g)裂解。将合并的滤液的溶剂在减压下除去并在冷的甲基-叔丁基醚(1L)中搅拌所得到的油产生灰白色沉淀，将其滤出、用甲基叔丁基醚洗涤三次并在真空中干燥：23.6g，23.9毫摩尔，就基料树脂的载量而言为70％的理论值，在HPLC上>40面积％，保留时间为14.1min(HPLC条件：PeptideES-C18,4.6x150mm,2.7μm，梯度：在30min内线性乙腈梯度自25％至90％B，缓冲液A＝在水中的0.1％TFA和2％乙腈，缓冲液B＝在乙腈中的0.1％TFA，波长＝210nm)，ESI-MS：单同位素的MW计算值＝986.5,MW[M+H]+＝987.6。
(c)环[-Asp(OtBu)-hGlu(OBzl)-D-Val-Arg(Pbf)-Gly-]的合成：
将线性侧链保护的五肽H-Asp(OtBu)-hGlu(OBzl)-D-Val-Arg(Pbf)-Gly-OH(23.6g，23.9毫摩尔)和原位活化的试剂PyBOP(12.4g，23.9mmol)溶解于10L的二甲基甲酰胺(DMF)中并在3h内滴加至额外的PyBOP(24.9g，47.8毫摩尔)和Hünig's碱(16.4ml，95.6毫摩尔)在5L的DMF中的溶液中。将所得溶液搅拌过夜。在真空中除去DMF并将所得油在回流下溶解于1.8L乙醇中并通过于-18℃加入3.2L的水结晶。将沉淀滤出并用水和醚洗涤。另外将它通过硅胶色谱进一步纯化(150g硅胶60，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇9:1)，产生3.6g的环五肽，在HPLC上纯度>91面积％(HPLC条件： Peptide ES-C18,4.6x150mm,2.7μm，梯度：在30min内线性乙腈梯度自25％至90％B，缓冲液A＝在水中的0.1％TFA和2％乙腈，缓冲液B＝在乙腈中的0.1％TFA，波长＝210nm)；3.7毫摩尔，理论值的15％，保留时间15.8min，ESI-MS：单同位素的MW计算值＝968.4,MW[M+H]+＝969.5。
(d)环[-Asp(OtBu)-hGlu-D-Val-Arg(Pbf)-Gly-]的合成：
将苄基酯通过氢解特异性裂解。为此，将3.6g(3.7毫摩尔)的环[-Asp(OtBu)-hGlu(OBzl)-D-Val-Arg(Pbf)-Gly-]溶解于20ml DMF中并用2L甲醇稀释。在向该溶液中加入5g的5％活性炭载钯之后，将混合物氢化。完毕滤出催化剂并将溶液在减压下浓缩。将产物在甲基-叔丁基醚中沉淀产生3.0g的期望的产物：3.4毫摩尔，产量为理论值的93％，纯度：在HPLC上75面积％(HPLC条件：PeptideES-C18,4.6x150mm,2.7μm，梯度：在30min内线性乙腈梯度自25％至90％B，缓冲液A＝在水中的0.1％TFA和2％乙腈，缓冲液B＝在乙腈中的0.1％TFA，波长＝210nm)，保留时间13.8min。
(e)环[-Asp-hGlu(DMA)-D-Val-Arg-Gly-]的合成：
使1.5g(1.7毫摩尔)的环五肽环[-Asp(OtBu)-hGlu-D-Val-Arg(Pbf)-Gly-]通过PyBOP/DIPEA活化(0.9g，1.7mmol/0.6ml，3.4毫摩尔)与在100ml DMF中的2,3-二肉豆蔻基-1-氨基-sn-甘油(DMA；1.0g，2.0毫摩尔)轭合。将反应混合物搅拌过夜。然后加入200ml二氯甲烷并将有机相用50ml 2％KHSO4萃取三次和用水萃取三次。将有机层在减压下蒸发并将残留水以与乙腈的共沸混合物的形式除去。将所得到的泡沫用直接处理该最终的裂解混合物TFA/H2O/三异丙基硅烷/二硫赤藓醇(92.5：2.5：2.5：2.5)处理1.5小时，之后将溶液滴加至冷的二异丙醚中(5℃)以沉淀出期望的产物。然后通过过滤分离残余物，用二异丙醚洗涤两次，另外在真空中干燥得到0.5g的标题化合物：0.5毫摩尔，理论值的30％，在HPLC上>93.0面积％(HPLC条件：柱子＝Zorbax SB-C3,4.6x250mm,5□m，梯度：在25min内线性乙腈梯度自30％至100％B，缓冲液A＝在水中的0.1％TFA和2％乙腈，缓冲液B＝在乙腈中的0.1％TFA，波长＝210nm)，保留时间为22.0min，ESI-MS：单同位素的MW计算值＝1035.8,MW[M+H]+＝1037.1。
实施例10：含有叶酸修饰的脂质体的pVision-RFP-C载体的制备
将478.2mg POPC、58.8mg胆固醇、13.5mg叶酸-脂质(参见实施例8)和2μg 7-硝基苯并呋咱-标记的-DOPE于60℃溶解于750μL乙醇(96％)中并注射入4.25mL含有PBS pH 7.4的RFP质粒中(1.27mgRFP-质粒/mL)。所用脂质的摩尔比为77.99：18.83：1.02：0.27。通过200nm聚碳酸酯膜挤压5次和100nm聚碳酸酯膜挤压5次和膜渗滤之后脂质体的平均尺寸为161nm，PDI为0.13。POPC：胆固醇的摩尔比为77.99：15.76，根据HPLC分析叶酸-脂质含量为502μg/ml(靶向770μg/ml)。
实施例11：茴香(anis)酰胺修饰的脂质体的制备
在55℃下将470mg POPC、60mg胆固醇(Chol)和13.5mg茴香酰胺脂质(参见实施例4)溶解于750μL乙醇(96％)中并注射入4.25mL的PBS pH 7.4中。所用脂质的摩尔比为77.99：18.83：1.02：0.27。通过100nm聚碳酸酯膜挤压之后脂质体的平均尺寸为110nm，PDI为0.068。根据HPLC分析茴香酰胺脂质含量为理论值的72％。
实施例12：RGD修饰的脂质体的制备
使用DOPC、胆固醇、NBD-DOPE、和实施例9中获得的RGD-脂质以DOPC：胆固醇：NBD-DOPE：RGD-脂质66:33：0.5：0～5的摩尔比通过干膜法在HEPES缓冲液中制备脂质体，之后用Lipofast挤出机通过200nm聚碳酸酯膜挤压5次和通过100nm聚碳酸酯膜挤压21次(Avestin,Inc.,Ottawa,Canada)。在使用以前将获得的脂质体储存于4℃。
实施例13：RGD修饰的脂质体的细胞摄取
基于Guava easyCyte 8HT流式细胞仪检测到的NBD-DOPE信号评价在M21细胞上对RGD修饰的脂质体(实施例6中获得的)的细胞摄取程度并显示在附图1和表1中。
表1：
观察到与非靶向脂质体(0％DMA-RGD)相比较RGD靶向脂质体(5％DMA-RGD)的细胞摄取提高约16倍。x轴代表脂质体中DMA-RGD的摩尔比(％)。y轴代表NBD-阳性细胞(％)附图1显示RGD部分可识别M21细胞上表达的靶向受体(整联蛋白αvβ3受体)(*p<0.01)。
实施例14：(5S,8S,45S,E)-11-(2-氨基-2-氧代乙 基)-45-(3-((2,3-双(十四烷基氧基)丙基)氨基)-3-氧代丙基)-5,8- 二甲基-3,6,9,12,15,43-六氧代-1-苯基-2,19,22,25,28,31,34,37, 40-九氧杂-4,7,10,11,16,44-六氮杂四十六-13-烯-46-甲酸的合成
(a)Fmoc-Glu(DMA)-联苯甲基树脂的合成(参见实施例7，1.1当量，3.05mmol)。
(b)RR11a-NH-PEG8-PA-Glu(DMA)-联苯甲基树脂的合成：
RR11a-NH-PEG8-PA-Glu(DMA)-联苯甲基树脂通过常规的固相合成获得，包括以下反应顺序：
(1)用在DMF中的哌啶裂解Fmoc-Glu(DMA)-联苯甲基树脂的Fmoc基团，
(2)使用在DMF和DIPEA中的PyBOP用Fmoc-NH-PEG8-PA冷凝，
(3)用在DMF中的哌啶裂解Fmoc-NH-PEG8-PA-Glu(DMA)-联苯甲基树脂的Fmoc基团和最后
(4)使用在DMF和DIPEA中的PyBOP用RR11a-OH冷凝。
(c)(5S,8S,45S,E)-11-(2-氨基-2-氧代乙基)-45-(3-((2,3-双(十四烷基氧基)丙基)氨基)-3-氧代丙基)-5,8-二甲基-3,6,9,12,15,43-六氧代-1-苯基-2,19,22,25,28,31,34,37,40-九氧杂-4,7,10,11,16,44-六氮杂四十六-13-烯-46-甲酸的合成：
将7.15g RR11a-NH-PEG8-PA-Glu(DMA)-联苯甲基树脂每次用50ml二氯甲烷洗涤，滤出，再悬浮于50ml二氯甲烷中并在真空中干燥。然后加入70ml的5％三氟乙酸(trifluaroacetic acid)在二氯甲烷中的ic溶液。将悬浮液于室温搅拌3.5小时然后过滤到100ml冷二异丙醚中。树脂用二氯甲烷/二异丙醚(1/1)冲洗。将合并的滤液在真空中蒸干并由t-BuOH冻干(lyophilyzed)产生4.15g(92％)的琥珀固体。ESI-MS：单同位素的MW计算值＝1481.9,MW[M-H]-＝1480.2。
实施例15：(5S,8S,45S,E)-11-(2-氨基-2-氧代乙 基)-45-(3-((2,3-双(十四烷基氧基)丙基)氨基)-3-氧代丙基)-5,8- 二甲基-3,6,9,12,15,43-六氧代-1-苯基-2,19,22,25,28,31,34,37, 40-九氧杂-4,7,10,11,16,44-六氮杂四十六-13-烯-46-甲酸的合成
将7.15g RR11a-NH-PEG8-PA-Glu(DMA)-OH(实施例14的产物)和1.50ml DIPEA溶解于70ml二氯甲烷中。然后加入4.32g MeO-PEG-NH2和1.67g PyBOP并将溶液搅拌过夜。将棕色溶液蒸发并将残余物通过柱层析经300g硅胶(Merck 60，0.040-0.063mm)分别采用比例为16：3.1和17：2：1乙酸乙酯(ethylacetat)、甲醇和三乙基胺纯化。将含有产物的级分合并和蒸发并将所得到的粘性残余物由t-BuOH冻干产生4.5g(60％)的淡黄色固体。MALDI-MS：单同位素的MW计算值＝3476.2,MW[M+Na]+＝3500,Mn＝3363.2,MW＝3384.5,PDI＝1.01
实施例16：苄基((2S,5S,14S,E)-8-(2-氨基-2-氧代乙基)-14- 氨甲酰基-5-甲基-3,6,9,12,17-五氧基-20-(十四烷基氧基)-22-氧杂 -4,7,8,13,18-五氮杂三十六-10-烯-2-基)氨基甲酸酯的合成
(a)Fmoc-Glu(DMA)-Sieber树脂的合成：
在100ml SPPS反应器中将5.0g的Sieber树脂(3.1mmol)用50mlDMF洗涤两次，用20％哌啶在DMF中的ic溶液在15min内处理并用50ml DMF和用50ml iPrOH交替洗涤三次。然后3.2g的(2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-谷氨酸-γ-2,3-双(十四烷基氧基)丙基-酰胺(参见实施例2，1.25当量，3.8mmol)和2.48g PyBOP(1.5当量)在50ml DMF中的溶液、和1.62ml DIPEA(2.5当量)2.5h。将溶液滤出并将树脂交替用50ml DMF和用50ml iPrOH交替洗涤三次。
(b)RR11a-Glu(DMA)-Sieber树脂的合成：
将RR11a-Glu(DMA)-Sieber树脂通过常规的固相合成获得，包括以下反应顺序：
(1)用在DMF中的哌啶裂解Fmoc-Glu(DMA)-Sieber树脂的Fmoc基团(在真空中干燥之后5.6g树脂)。
(2)使用在DMF中的DIPEA用RR11a-NHS冷凝。
(c)产物由树脂分离：
将2.6g RR11a-Glu(DMA)-Sieber树脂用20ml在二氯甲烷中的5％ic三氟乙酸(trifluaroacetic acid)处理2h。将悬浮液过滤到100ml冷的二异丙醚中。将滤液在真空中蒸干并由t-BuOH冻干(lyophilyzed)产生660mg的淡黄色固体。ESI-MS：单同位素的MW计 算值＝1056.7,MW[M-H]-＝1056.0。
实施例17：苄基((2S,5S,42S,E)-8-(2-氨基-2-氧代乙基)-42- 氨甲酰基-5-甲基-3,6,9,12,40,45-六氧代-48-(十四烷基氧 基)-16,19,22,25,28,31,34,37,50-九氧杂-4,7,8,13,41,46-六氮杂 六十四-10-烯-2-基)氨基甲酸酯的合成
(a)Fmoc-Glu(DMA)-Sieber树脂的合成：(参见实施例16)。
(b)NH2-PEG8-PA-Glu(DMA)-Sieber树脂的合成：
NH2-PEG8-PA-Glu(DMA)-Sieber树脂通过常规的固相合成获得，包括以下反应顺序：
(1)用在DMF中的哌啶裂解Fmoc-Glu(DMA)-Sieber树脂的Fmoc基团，
(2)使用在DMF和DIPEA中的HBTU用Fmoc-NH-PEG8-PA冷凝和最后
(3)用在DMF中的哌啶裂解Fmoc-NH-PEG8-PA-Glu(DMA)-Sieber树脂的Fmoc基团。
(c)NH2-PEG8-PA-Glu(DMA)-酰胺的合成：
产物用在二氯甲烷中的三氟乙酸(trifluaroacetic acid)自NH2-PEG8-PA-Glu(DMA)-Sieber树脂裂解。ESI-MS：单同位素的MW计算 值＝1034.8,MW[M+H]+＝1035.9。
(d)苄基((2S,5S,42S,E)-8-(2-氨基-2-氧代乙基)-42-氨甲酰基-5-甲基-3,6,9,12,40,45-六氧代-48-(十四烷基氧基)-16,19,22,25,28,31,34,37,50-九氧杂-4,7,8,13,41,46-六氮杂六十四-10-烯-2-基)氨基甲酸酯：
向5ml配备有机械搅拌器的圆底烧瓶装入42mg在2ml二氯甲烷中的NH2-PEG8-PA-Glu(DMA)-酰胺(40.6mmol)。然后加入0.01ml三乙基胺(95mmol)。2-3分钟的搅拌之后产生淡黄色溶液并在3min的时间内加入23mg的RR11a-NHS(41mmol)。将溶液搅拌1小时并在减压下蒸发产生灰白色固体产物。产物在TLC中显示单个点。MW计算值＝1480.0,MW[M+H]+＝1482和MW[M+Na]+＝1504.0。
实施例18：苄基((2S,5S,126S,E)-8-(2-氨基-2-氧代乙基)-126- 氨甲酰基-5-甲基-3,6,9,12,124,129-六氧代-132-(十四烷基氧 基)-16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,7 0,73,76,79,82,85,88,91,94,97,100,103,106,109,112,115,118,12 1,134-三十七氧杂-4,7,8,13,125,130-六氮杂一百四十八-10-烯-2- 基)氨基甲酸酯的合成
(a)Fmoc-Glu(DMA)-Sieber树脂的合成：(参见实施例16)。
(b)RR11a-NH-PEG36-PA-Glu(DMA)-Sieber树脂的合成：
RR11a-NH-PEG36-PA-Glu(DMA)-Sieber树脂通过常规的固相合成获得，包括以下反应顺序：
(1)用在DMF中的哌啶裂解Fmoc-Glu(DMA)-Sieber树脂的Fmoc基团，
(2)使用在DMF和DIPEA中的PyBOP用Fmoc-NH-PEG36-PA冷凝，
(3)用在DMF中的哌啶裂解Fmoc-NH-PEG36-PA-Glu(DMA)-Sieber树脂的Fmoc基团和最后
(4)使用在DMF中的DIPEA用RR11a-NHS冷凝。
(c)苄基((2S,5S,126S,E)-8-(2-氨基-2-氧代乙基)-126-氨甲酰基-5-甲基-3,6,9,12,124,129-六氧代-132-(十四烷基氧基)-16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,79,82,85,88,91,94,97,100,103,106,109,112,115,118,121,134-三十七氧杂-4,7,8,13,125,130-六氮杂一百四十八-10-烯-2-基)氨基甲酸酯的合成：
7.0g RR11a-NH-PEG36-PA-Glu(DMA)-Sieber树脂用70ml的2％三氟乙酸(trifluaroacetic acid)在二氯甲烷中的ic溶液处理。将悬浮液于室温搅拌3h然后过滤到70ml冷二异丙醚中。将滤液在真空中蒸干并由t-BuOH冻干(lyophilyzed)产生1.25g的白色固体。ESI-MS：单同位素的MW计算值＝2713.7,MW[M+Na+H]2+＝1380.1。
实施例19：RR11a修饰的脂质体的制备
RR11a修饰的脂质体(MS 15-4)和对照脂质体(MS 15-0)由以下脂质溶液组成：
将3ml螺帽小玻璃管(特氟纶衬里的帽)装入上述脂质并简单地涡旋。将氯仿在氩气流下蒸发直至获得脂质的不透明膜。然后将小瓶置入在真空下的干燥器中10分钟。向干膜中加入1000uL的DPBS 1X并将内容物涡旋直至获得均匀的乳状悬浮液(3-4min)。这之后在Branson 1510模型中进行浴超声处理5分钟获得浑浊的悬浮液。然后将此悬浮液在Branson Model 4C15中以30％的满振幅进行探针超声处理30秒(避免发泡)获得几乎半透明的脂质体悬浮液。将悬浮液通过100nm聚碳酸酯膜高压压出的(Avanti No 610005)。最后将悬浮液通过0.22μm Millex-GV膜滤器进行无菌(steril)过滤并于4℃贮存在无菌(steril)小瓶中。MS-15-0和15-4的Z平均流体动力学直径分别为101和99um(Malvern ZetaSizer仪器)。
实施例20：RR11a修饰的脂质体的legumain靶向
legumain靶向实验根据以下方案采用实施例19的脂质体制剂进行：
第1天在未处理的载玻片上接种3.12x10e44T1细胞/cm2
第2天加入100uM CoCl2；温育24h
第3天加入100μl脂质体(10e12NPs/ml)；温育2h；加入5ug/ml Hoechst 33342；温育20min；固定(mount)和用荧光显微镜分析
细胞培养基：RPMI 16401x含L-谷氨酰胺，补充10％FBS，10mMHepes，0.075％w/v碳酸氢钠和1mM丙酮酸钠。
图片从随机区域由各portaobjects获得，采用63x物镜，2x2面元(bin)，对于Hoechst 500ms，对于RhodB 1000ms和透明区域100ms，对于图像解卷积分析(image deconvolution analysis)在核焦点周围以0.5um高焦距梯级的20-30图像栈。附图2代表解卷积之后由叠加获得的20-30图像之一，显示中间焦点。清楚的是该数据表明RhB-DOPE与细胞共定位因此证明与非靶向对照相比由RR-11a-8PEG-PA-Glu(DMA)-酰胺制备的脂质体有效地靶向这些细胞。
实施例21：抗体(Fc单元)靶向的脂质、二硫桥接的十(五 肽)H-Glu(DMA)-Ala-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-T rp-Cys-Thr-OH的合成
(a)直链H-Glu(DMA)-Ala-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu- Leu-Val-Trp-Cys-Thr-OH的合成：
固相肽合成按照Fmoc/tBu策略用固相合成器ABI 431A进行(Atherton E.,等，J.Chem.Soc.,Chem.Comm.,539(1978))，H-Thr(tBu)-2-ClTrt(0.5g,0.25毫摩尔)用作基料树脂。依它们的时间次序使用的氨基酸衍生物为Fmoc-Cys(Trt)-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Cys(Trt)-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Glu(DMA)-OH。偶联通过Fmoc-Xaa-OH/三甲基吡啶/HBTU(4当量：4当量：3.6当量)进行，除了采用DIPEA/PyBOP(4.8当量：7.2当量：4.8当量)偶联的Fmoc-Glu(DMA)-OH)之外。Fmoc保护的脱除通过20％在DMF中的哌啶获得。分别在每次偶联和脱保护步骤之后用二甲基甲酰胺交替洗涤三次。Fmoc-SPPS产生1.4g的直链肽树脂。
直链十(五肽)(decapentapeptide)通过三氟乙酸/三异丙基硅烷/二硫赤藓醇/水(92.5：2.5：2.5：2.5，14ml)的混合物在2.5小时内自树脂裂解。过滤后滤液用140ml二异丙醚稀释。将褐色固体滤出并在真空中干燥：485mg，37％的理论值，ESI-MS：单同位素的MW计 算值＝2198.2,MW[M+2H]2+＝1099.6。
(b)二硫桥接的H-Glu(DMA)-Ala-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu- Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-OH的合成：
将10mg的实施例21a)中获得的褐色固体溶解于10ml甲醇中并通过加入DIPEA使达到pH 8。将溶液在氧气氛下搅拌过夜。蒸发溶液得到定量产率的褐色固体形式的最终产物。ESI-MS：单同位素的MW计算值＝2196.2,MW[M+2H]2+＝1098.6。
实施例22：RR11a修饰的脂质体不进行挤压的制备
RR11a修饰的脂质体(MS-32-1至MS-32-10)由以下脂质溶液组成：
将3ml螺帽小玻璃管(特氟纶衬里的帽)装入上述脂质并简单地涡旋。将氯仿在氩气流下蒸发直至获得脂质的不透明膜。然后将小瓶置入在真空下的干燥器中10分钟。向干膜中加入1000uL的DPBS 1X并将内容物涡旋直至获得均匀的乳状悬浮液(10min)。这之后在Branson1510模型中进行浴超声处理5分钟获得浑浊的悬浮液。然后将此悬浮液在Branson Model 4C15中以40％的满振幅进行探针超声处理30秒(避免发泡)获得几乎半透明的脂质体悬浮液。最后将悬浮液通过0.22μm Millex-GV膜滤器进行无菌(steril)过滤并于4℃贮存在无菌(steril)小瓶中。Z平均流体动力学直径和PDI采用MalvernZetaSizer仪器测定。

Claims (18)

1.包含式I化合物的载体系统
其中
Y代表O、N、S或共价键，
S1、S2、S3彼此独立地代表共价键或间隔基，
X1、X2、X3彼此独立地代表H或配体基团
L为式(a)基团，
其中虚线代表与N连接，
R1代表H或式-(CH2)2-ORb1基团，
R1'代表H或式-(CH2)2-ORb2基团，
R2代表H或式-CH2-ORc基团，
R2'代表H或式-ORd或-CH2-ORd基团，
R3代表H或式-(CH2)2-ORe或-(CH2)3-ORe基团，
Ra、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re彼此独立地代表饱和或不饱和的、直链或分支的烃链，
m为1、2或3，
条件是R1、R1'、R2、R2'、R3中至少一个不是H且X1、X2、X3中至少一个是配体基团。
2.根据权利要求1的载体系统，其中R3为H，且L为式(b)或(c)基团
其中虚线代表与N连接，且
S1、S2、S3、X1、X2、X3、Y、Ra、和m如权利要求1中定义，
条件是式(b)中R2和R2'之一不是H，且式(c)中R1和R1'之一不是H，且X1、X2、X3中至少一个是配体基团。
3.根据权利要求2的载体系统，其中L为式(b1)、(b2)、(b3)或(b4)基团：
其中虚线代表与N连接，且
其中Ra、Rc和Rd彼此独立地为饱和或不饱和的、直链或分支的烃链。
4.根据权利要求2的载体系统，其中L为式(c1)或(c2)基团：
其中虚线代表与N连接，且
其中Ra、Rb1、Rb2彼此独立地为饱和或不饱和的、直链或分支的烃链。
5.根据权利要求1的载体系统，其中R1、R1'、R2、R2'为H，R3为式-(CH2)2-ORe或-(CH2)3-ORe基团，且S1、S2、S3、X1、X2、X3、Y、Ra、和m如权利要求1中定义。
6.根据前述任何权利要求的载体系统，其中Ra、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re彼此独立地为直链或分支的C(10-22)烷基、C(10-22)链烯基或C(10-22)炔基。
7.根据前述任何权利要求的载体系统，其中C(10-22)链烯基和C(10-22)炔基具有1、2、3或4个不饱和键，优选具有1或2个不饱和键。
8.根据前述任何权利要求的载体系统，其中载体系统为微粒或纳米颗粒物质。
9.根据权利要求8的载体系统，其中微粒或纳米颗粒物质为脂质囊泡，如脂质体或胶束、或纳米颗粒、纳米球和/或纳米棒，包含至少一种式I化合物和任选的一种或多种其它辅助脂质。
10.根据前述任何权利要求的载体系统，其中X1、X2、X3中至少一个为靶向配体或抗原性配体或治疗性或诊断性配体或其组合。
11.根据前述任何权利要求的载体系统，其中间隔基为聚乙二醇或封端的聚乙二醇。
12.根据权利要求9的载体系统，其中脂质囊泡进一步含有至少一种被包封或嵌入内空隙内或吸附于其表面上或与其表面连接的生物活性剂。
13.药物组合物，包含权利要求1至12任一项的载体系统。
14.根据权利要求1至12任一项的载体系统作为药物递送系统、诊断系统或作为抗原展示系统的用途。
15.式I化合物
其中
Y代表O、N、S或共价键，
S1、S2、S3彼此独立地代表共价键或间隔基，
X1、X2、X3彼此独立地代表H或配体基团
L为式(a)基团，
其中虚线代表与N连接，
R1代表H或式-(CH2)2-ORb1基团，
R1'代表H或式-(CH2)2-ORb2基团，
R2代表H或式-CH2-ORc基团，
R2'代表H或式-ORd或-CH2-ORd基团，
R3代表H或式-(CH2)2-ORe或-(CH2)3-ORe基团，
Ra、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re彼此独立地代表饱和或不饱和的、直链或分支的烃链，
m为1、2或3，
条件是R1、R1'、R2、R2'、R3中至少一个不是H且X1、X2、X3中至少一个是用于权利要求1至14的载体系统中的配体基团。
16.根据权利要求1至12任一项的载体系统，用于治疗对治疗剂作出反应的疾病，其中X1、X2、X3中至少一个为所述治疗剂。
17.根据权利要求1至12任一项的载体系统，用于采用疾病特异性的诊断剂诊断疾病，其中X1、X2、X3中至少一个为所述诊断剂。
18.根据权利要求1至12任一项的载体系统，用于调节免疫应答，其中X1、X2、X3中至少一个为一个抗原剂。
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