KR20170086638A

KR20170086638A - 약학 조성물, 이의 제조 및 용도

Info

Publication number: KR20170086638A
Application number: KR1020177017364A
Authority: KR
Inventors: 마리-에디뜨 메이르; 아네스 포띠에; 로랑 레비
Original assignee: 나노비오?스; 나노비오?笭?
Priority date: 2014-11-25
Filing date: 2015-11-24
Publication date: 2017-07-26
Also published as: CA2968473A1; SG11201704143YA; AU2015352688A1; MX2017006813A; TW201628639A; US20170258718A1; EA201791138A1; CN107106505A; JP2018500298A; WO2016083336A1; BR112017010933A2; AR102779A1; IL252397A0; HK1245086A1; EP3229781A1

Abstract

본 발명은 약학 화합물을 필요로 하는 대상체에 투여되는, (i) 하나 이상의 생체적합성 나노입자 및 (ii) 하나 이상의 약학 화합물의 조합을 포함하는 약학 조성물로서, 이때 나노입자가 약학 화합물 효율을 강력하게 하는 것에 관한 것이다. 생체적합성 나노입자의 가장 긴 치수는 전형적으로 약 4 내지 약 500 nm 이고, 그 절대 표면 전하 값은 10 mV (|10 mV|) 이상이고, 그 영 계수(Young modulus) 는 100 kPa 미만이다. 본 발명은 또한 상기 조성물을 필요로 하는 대상체에서 약학 조성물의 투여에 사용되는 조성물로서, 이때 하나 이상의 나노입자 및 하나 이상의 약학 화합물이 5 분 초과 내지 약 72 시간에 서로 하나씩 대상체에 투여되어야 하는 것에 관한 것이다.

Description

약학 조성물, 이의 제조 및 용도 {PHARMACEUTICAL COMPOSITION, PREPARATION AND USES THEREOF}

본 발명은 목적하는 화합물을 필요로 하는 대상체에게 투여되는, (i) 하나 이상의 생체적합성 나노입자 및 (ii) 하나 이상의 목적하는 화합물, 전형적으로 하나 이상의 약학 화합물의 조합을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이고, 여기서 나노입자는 목적하는 효능의 화합물(들) 을 강력하게 한다. 하나 이상의 생체적합성 나노입자의 가장 긴 치수는 전형적으로 약 4 내지 약 500 nm 이고, 이의 절대 표면 전하 값은 10 mV (|10 mV|) 이상이고, 이의 영 계수 (Young modulus) 는 100 kPa 미만이다.

본 발명은 또한 하나 이상의 목적하는 화합물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는데 사용하기 위한 상기 조성물에 관한 것이고, 여기서 하나 이상의 생체적합성 나노입자 및 하나 이상의 목적하는 화합물은 상기 대상체에서 순차적으로, 전형적으로 5 분 초과 내지 약 72 시간에 서로 하나씩 투여된다.

하나 이상의 생체적합성 나노입자 및 하나 이상의 목적하는 화합물의 대상체에 대한 조합된, 및 전형적으로는 순차적인 투여는, 표준 약학적 투여량으로 투여될 때 상기 화합물에 의해 유도된 약학적 혜택 및 독성과 비교하였을 때, 상기 대상체에서 그 감소된 독성을 위한 상기 목적하는 화합물의 약학적 (즉, 치료적, 예방적 또는 진단적) 혜택을 유지하거나, 등가 또는 감소된 독성을 위한 그 약학적 혜택을 증가시킨다.

본 발명의 약학 조성물은 전형적으로 대상체에 대하여 등가의 독성, 바람직하게는 감소된 독성을 위한 동일한 약학적 혜택을 유지하거나, 대상체에 대하여 등가 또는 감소된 독성을 위한 약학적 혜택을 증가시키면서, 상기 화합물의 표준 약학적 투여량과 비교했을 때 투여된 목적하는 화합물의 약학적 투여량의 10% 이상의 감소를 허용한다.

안전성 및 효능을 보장하기 위해, 약학 화합물은 이를 필요로 하는 대상체에서 최적의 비율로 그 표적 부위에 선택적으로 전달되는 것이 필요하다.

약물동력학 (pK) 은 생물에 외부적으로 투여된 성분의 운명을 결정짓는 약리학의 분야이다. 이러한 결정은 바람직하게는 화합물의 제거까지 충분히 긴 기간에 걸쳐 모든 주요 조직에서의 화합물 농도를 측정하는 단계를 포함한다. 약물동력학은 화합물의 생체내 거동, 예컨대 이의 흡수 및 분산 메커니즘 및 이의 유기체에서의 화학적 변화를 효율적으로 기재하는데 필요하다. 혈액에서 pK 프로파일은 다양한 프로그램을 사용하여 피팅되어, 어떻게 신체가 화합물을 다루는지를 정량적으로 기재하는 핵심 pK 매개변수를 얻을 수 있다. 중요한 매개변수는 최대 농도 (C_max), 반감기 (t_1/2), 클리어런스, 곡선 아래 면적 (AUC), 및 평균 체류 시간 (MRT), 즉 화합물이 생체에서 머무는 평균 시간을 포함한다. 화합물 제형의 연장된 혈액 순환이 관찰되는 경우, 이는 일반적으로 증가된 t_1/2, 감소된 클리어런스, 증가된 AUC, 및 증가된 MRT 와 관련된다. pK 데이터는 흔히 최소 부작용과 함께 치료제의 효율을 개선하는데 바람직한 혈액 농도를 유지하기 위한 최적 투여량 및 투여 요법을 결정하는데 사용된다. 또한, 당업자에 익히 공지된 바와 같이, 화합물의 혈액 농도는 대부분의 경우, 전형적으로 프리 드러그 (free drug) 에 대하여 그 효능 및 독성 모두와 관련이 있다.

치료적 및 예방적 화합물의 물리-화학적 특성은 신체에서 이의 약물동력학적 및 대사성 운명에 대해 중요한 영향을 갖는다. 따라서, 적절한 물리-화학적 특성의 선택은 상기 화합물을 설계할 때 핵심적이다. 그러나, 화합물이 생체 그 자체에 의해 항상 내재적으로 제공되지 않고 일반적으로 외부적으로 투여되므로, 이의 생물학적 분배 프로파일은 이의 원하는 약물동력학적 작용과 맞춰지고, 바람직하게는 이를 최적화하기 위해 최적화되어야 한다.

여러 접근이 화합물의 그 표적 부위에 대한 전달을 최적화하기 위해 탐색되었다. 전략은 이의 혈액 반감기를 연장시키고 이에 따라 표적 부위에 대한 이의 누적을 향상시키는 스텔스 특성 (stealth property) 을 갖는 치료적 화합물을 설계하는 것이다. 하나의 선호가능한 접근은 순환되는 화합물의 생체내 반감기 (t_1/2) 를 증가시키는데 승인된 치료적 화합물에 대한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 의 공유결합적 부착이고, 생체내 반감기의 수준은 부분적으로 화합물의 성질 및 코팅물의 성질에 따른 변화를 증가시킨다. 또한, 약물 담체, 예컨대 리포솜, 에멀션 또는 미셀은 대상체의 신체에서 이의 생물학적 분배 프로파일을 개질시켜 약물의 치료적 효능을 향상하기 위해 개발되었다.

그러나, 치료적 화합물의 생물학적 분배에서의 선택성 결여는 여전히 우려로 남아있다. 지금까지, 불량한 약물동력학 및 높은 독성은 치료 화합물 개발에서의 실패의 중요한 원인이다.

예로서, 암 치료의 맥락에서, 암 세포를 죽이기 위한 신체의 본질적 기능의 고의적인 저해는 정상 세포에서의 독성을 야기하고, 임상자는 가능한 치료 범위 (therapeutic window) 를 찾기 위해 종양과 정상 조직 사이에서 투여량-반응 및 치료 화합물 분포의 차이에 의존해야 한다. 중요하게는, 간독성은 간에서 약물-유도 세포 손상의 직접적 및 간접적 메커니즘으로 인하여 약학 개발 및 임상적 사용으로부터의 약물 철회의 주요 원인으로 남아있다.

나노미립자 화합물에 제안된 접근, 예컨대 약물 담체 [Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 11(1):31-59 1994] 는 세망내피계 시스템 (RES) 의 포식 세포 투여량을 감소시키거나, 포화시키거나, 심지어 불활성화하기 위해 유인 담체 (decoy carrier) 를 예비-주입하는 것이다. 손상 또는 봉쇄는 또한 옵소닌 분자의 감소된 혈장 수준과 관련될 수 있다. 시험 입자의 투여 이전에, 특정 작용제, 예컨대 지방산의 알킬 에스테르, 덱스트란 술페이트, 희토류 원소의 염 (예를 들어, GdCl₃), 약물 담체, 비어 있거나 캡슐화된 클로드로네이트의 정맥내 투여는 쿠퍼 세포 흡수에서 보통 내지 드라마틱한 감소를 유도하는 것으로 입증되었다.

예를 들어, "Biomimetic amplification of nanoparticle homing to tumors" [PNAS 2007] 의 저자들은 나노입자 "CREKA-SPIO" 의 클리어런스에서의 RES 의 역할을 보고하고 있다. 초기 실험은 정맥내 (IV) 주사된 "CREKA-SPIO" 나노입자가 MDA-MB-435 유방암 이종이식에서 효과적으로 누적되지 않았다는 것을 나타냈다. 대조적으로, 입자의 높은 농도는 RES 조직에서 보여졌다. 리포솜 클로드로네이트에 의해 간에서 RES 대식세포를 고갈시킴으로써, 이는 입자의 반감기의 5-배 연장을 밝혀냈다. 그러나, 클로드로네이트 작용제는 간 및 비장으로부터의 대식세포의 세포자멸사를 유도하고, 이는 대식세포 고갈이 면역억제 및 감염과 관련된 위험을 증가시키므로 전반적으로 해로운 것으로 여겨진다. 제 2 실험에서, 저자는 잠재적 유인 입자로서 킬레이트화 Ni (II) 로 코팅된 리포솜을 시험하여, 철 산화물 및 Ni (II) 가 유사한 혈장 옵소닌을 끌어당길 것이고 Ni-리포솜이 이에 따라 이를 체순환에서 고갈시킬 수 있었다는 가설을 세웠다. 실제로, 정맥내 (IV) 주입된 Ni-리포솜은, CREKA-SPIO 나노입자의 주입 5 분전에 투여되든지 또는 48 시간전에 투여되든지 간에, 나노입자의 혈액 반감기의 5-배 증가를 허용한다. 그러나, 종양 마우스 가운데 죽음을 야기하는 높은 독성이 관찰되었다. 평범한 리포솜을 또한 Ni-리포솜 대신에 시험하였다. 그러나, 상기 Ni-리포솜과 비교했을 때 독성을 감소시키는 동안, 평범한 리포솜은 이들보다 훨씬 덜 효과적이었다. 실제로, 혈액 반감기 증가는 오로지 인자 약 2 이었다.

WO2005086639 는, 전형적으로 초음파 또는 X-선 노출의 맥락에서 또는 자기 공명 이미징 (MRI) 의 맥락에서 및 치료의 맥락에서, 대상체에서 표적 부위에 선택적으로 원하는 작용제를 투여하는 방법에 관한 것이다. 기재된 방법의 목적은 유인 불활성 담체의 공동 투여로 인해 구체적으로 투여된 작용제의 총 투여량을 감소시키면서 목적하는 작용제의 효율을 개선 또는 유지시키는 것이다.

기재된 발명은 개연성-기반 접근을 사용한다. 비표적 불활성 작용제 ("불활성 담체") 는, ("불활성 조성물" 에 존재하는) 목적하는 표적 작용제와 함께 공동-투여되어 (즉, "실질적으로 동시에"), 유사한 물리적 특징을 나타내어, 목적하는 표적 작용제에 의한 RES 시스템의 회피를 촉진시킴으로써 원하는 부위에서의 목적하는 작용제의 개선된 흡수를 허용한다. 이러한 접근은 목적하는 작용제에 대한 환자의 낮은 노출을 야기하고, 그 결과로서 목적하는 상기 작용제의 투여 비용의 저하를 야기한다. 활성 조성물 및 유인 불활성 담체는 서로 5 분 이내, 바람직하게는 서로 2 분 이내에 또는 심지어는 그보다도 짧게 투여된다. 이러한 접근은, 매우 과량의 비표적 "담체" 또는 "유인" 비히클의 존재, 및 과량으로의 이러한 유인 담체가 원하는 위치에 표적화된 비히클의 존재 하에 공급될 때 세망내피계 시스템에 의한 흡수에 대하여 목적하는 표적 작용제와 경쟁할 것이라는 가능성에 의존한다. RES 에 의해 포획된 입자의 반감기는 투여량 의존적인데, 즉 입자의 순환 반감기는 투여량 증가에 따라 증가한다. 더 높은 투여량과 관련된 더 느린 클리어런스는, 높은 농도로 전체 작용제를 유지하여, 투여되어야 하는 목적하는 작용제의 투여량의 감소를 허용함을 선호하는 것으로 생각된다. 다른 말로는, 전체 작용제의 증가된 반감기는 이의 전반적으로 높은 투여량으로 인해 WO2005086639 의 저자에 따라 표적 작용제에 이로워야 한다. 이러한 접근에 의해 포함된 요건은 활성제 및 불활성제가 이의 각각의 조성물이 어떠하든지 간에 이의 RES 에서의 클리어런스 특징과 관련하여 유사하게 거동한다는 것이다.

이러한 접근에서, 불활성 작용제 및 활성 작용제의 유사-공동 주입은 혈액에 존재하는 작용제의 전반적 양을 증가시키고 이에 따라 그 혈액 반감기를 연장시키는데 필요하다. 명확히 개연성-기반 접근에 의존하는 상기 전략은, 불활성 작용제를 뛰어 넘는 이점을 상기 활성 작용제에 부여함으로써 표적 부위에서 이의 성공적인 누적을 달성하기 위해 표적 작용제와 활성제의 결합을 반드시 필요로 한다. 또한, 유사-공동 주입으로 인해, 불활성 담체의 특정 설계가 활성 조성물의 의도된 사용에 따라 요구될 수 있다.

WO2005/063305 는 가스-충전된 미소낭포 (microvesicle) (전형적으로, 0.5 ㎛ 이상의 크기를 가짐) 및 상기 미소낭포와 연관된 구성성분 (약 100 nm 미만의 크기를 가짐) 을 포함하는 어셈블리에 관한 것이다. 생성된 어셈블리는 진단적 및/또는 치료적 활성 제형에서 약학적으로 활성인 구성성분으로서 사용된다. 두 성분, 즉 가스-충전된 미소낭포 및 미소낭포 관련 구성성분은, 초음파 콘트라스트 이미징, 예컨대 표적화 초음파 이미징, 초음파-매개 약물 전달 및 기타 이미징 기술 분야에서 전형적으로 이미지화를 향상시키기 위해 동시에 투여된다.

선행 기술로부터 명백한 바와 같이 그리고 장기간의 의료적 필요에도 불구하고, 그 허용불가한 독성 또는 그 비선호 약물동력하적 매개변수로 인해 환자에서 최적으로 사용될 수 없는 화합물 (예컨대, 치료적, 예방적 및 진단적 화합물) 의 효율의 개선이 우려로 남아있다.

도 1: 화합물의 크기 (가장 긴 치수) 에 따라 혈액 순환으로부터 치료적 화합물 제거를 위한 가능한 경로의 도식도.
도 2: MDA-MB-231-lucD3H2LN 이종이식 내에 (i) 실시예 3 의 생체적합성 나노입자 및 (ii) Dox-NP® 를 포함하는 약학 조성물에 대한 치료 스케쥴의 도식적 묘사.
도 3: MDA-MB-231-lucD3H2LN 이종이식 내에 실시예 3 의 생체적합성 나노입자 및 Dox-NP® 를 포함하는 약학 조성물의 종양 재-성장 지연 (평균 RTV ± SD).
도 4: L-글루탐산,N-(3-카르복시-1-옥소프로필)-, 1,5-디헥사데실 에스테르 (SA-지질) 의 화학식

본 발명은 현재 치료, 예방 또는 진단의 맥락에서 그 의도된 사용이 어떠하든지 간에 목적하는 화합물(들) (본원에서 또한 간단히 "화합물(들)" 로서 식별됨) 의 효율의 최적화를 허용한다. (i) 하나 이상의 생체적합성 나노입자 및 (ii) 목적하는 하나 이상의 화합물, 전형적으로 하나 이상의 약학 화합물의 조합인 본원에 기재된 조성물은, 하나 이상의 목적하는 화합물의 약물동력학적 매개변수를 최적화하고, 그 결과 현재 예를 들어 이의 허용불가한 독성으로 인해 달리 개발될 수 없었던 약학 화합물의 개발을 가능하게 한다. 전형적으로 생체적합성 나노입자는, 예컨대 약학 화합물로서, 즉 치료적, 예방적 또는 진단적 화합물로서 사용되지 않는다.

본 발명의 전형적 조성물 (본원에서 일반적으로 "약학 조성물" 로 식별됨) 은 (i) 하나 이상의 생체적합성 나노입자 및 (ii) 하나 이상의 화합물 ("목적하는 화합물") 의 조합을 포함하는 조성물이고, 여기서 생체적합성 나노입자의 가장 긴 또는 가장 큰 치수는 전형적으로 약 4 nm 내지 약 500 nm 이고, 생체적합성 나노입자의 절대 표면 전하 값은 10 mV 이상이고, 생체적합성 나노입자의 영 계수는 100 kPa 미만이다.

전형적으로, (하나 이상의) 생체적합성 나노입자 및 목적하는 화합물 간의 비는 0.1/1 내지 1000/1 또는 0.5/1 내지 1000/1, 바람직하게는 0.5/1 내지 500/1, 보다 더욱 바람직하게는 0.5/1 내지 300/1 이다.

예를 들어, 나노입자의 크기 또는 시간 간격과 같은 값에 관련된 경우, 용어 "약" 및 "대략" 은 당업자에 의해 작은 변화로 인식될 수 있는 제시된 값에서의 변화가 실질적으로 관련된 주제의 특성에 영향을 주지 않고, 상기 주제가 청구된 발명의 취지 내에 있다는 것을 나타낸다.

본 발명의 바람직한 목적은 하나 이상의 약학 화합물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는데 사용하기 위한, (i) 하나 이상의 생체적합성 나노입자 및 (ii) 하나 이상의 약학 화합물의 조합을 포함하는 약학 조성물로서, 이때 생체적합성 나노입자의 가장 긴 또는 가장 큰 치수는 약 4 nm 내지 약 500 nm 이고, 생체적합성 나노입자의 절대 표면 전하 값은 10 mV (|10 mV|) 이상이고, 생체적합성 나노입자의 영 계수는 100 kPa 미만이고, 하나 이상의 나노입자 및 하나 이상의 약학 화합물은 상기 약학 화합물을 필요로 하는 대상체에게, 5 분 초과 내지 약 72 시간에 서로 하나씩 투여되고, 생체적합성 나노입자는, 예컨대 약학 화합물로서 사용되지 않는다.

본 발명의 조성물을 통한 생체적합성 나노입자(들) 및 약학 화합물(들)의 대상체로의 조합된 및 순차적인 투여는, 전형적으로는 임의의 나노입자 부재 하 상기 화합물(들)의 표준 약학적 투여량에 의해 유도된 약학적 혜택 및 독성과 비교하였을 때, 전형적으로 대상체에서 그 감소된 독성을 위한 화합물(들)의 동일한 약학적 (즉, 치료적, 예방적 또는 진단적) 혜택을 허용 (유지) 하거나, 대상체에서 그 등가 또는 감소된 독성 (바람직하게는, 감소된 독성) 을 위한 화합물(들)의 약학적 혜택을 증가시킨다.

본 발명의 약학 조성물은 전형적으로는 (i) 대상체에서 등가의 독성, 바람직하게는 감소된 독성을 위한 동일한 약학적 혜택을 유지하거나, (ii) 전형적으로는 임의의 나노입자 부재 하 대상체에서 등가 또는 감소된 독성을 위한 약학적 혜택을 증가시키면서, 상기 화합물(들)의 표준 약학적 투여량(들)과 비교했을 때 투여된 화합물(들) 약학적 (즉, 치료적, 예방적 또는 진단적) 투여량(들)의 10% 이상, 바람직하게는 15% 이상의 감소를 허용한다.

입자의 형태가 이의 "생체적합성" 에 영향을 줄 수 있음에 따라, 본원에서는 다소 균일 형태를 갖는 입자가 바람직하다. 약물동력학적 이유로 인해, 본질적으로 구형/원형 또는 타원형의 나노입자가 이에 따라 바람직하다. 이와 같은 형태는 또한 세포와 나노입자의 상호작용 또는 세포에 의한 흡수를 선호한다. 구형/원형이 특히 바람직하다.

본 발명의 취지상, 용어 "나노입자" 는 전형적으로 약 1 nm 내지 약 500 nm, 바람직하게는 약 4 nm 내지 약 500 nm, 약 4 내지 약 400 nm, 약 30 nm 내지 약 300 nm, 약 20 nm 내지 약 300 nm, 약 10 nm 내지 약 300 nm, 예를 들어 약 4 nm 내지 약 100 nm, 예를 들어 약 10 nm, 15 nm 또는 20 nm 내지 약 100 nm, 또는 약 100 nm 내지 약 500 nm, 전형적으로 약 100 nm 내지 약 300 nm 의 나노미터 범위의 크기를 갖는 생성물, 특히 합성 생성물을 의미한다.

본원에서, 용어 "나노입자의 크기", "나노입자의 가장 큰 크기" 및 "나노입자의 가장 긴 크기" 는 전형적으로 구형/원형 또는 타원형인 경우의 "나노입자의 가장 긴 또는 가장 큰 치수" 또는 "나노입자의 직경" 을 의미한다. 투과 전자 현미경 (TEM) 또는 Cryo-TEM 은 나노입자의 크기를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 동적 광 산란 (DLS) 은 용액 중 나노입자의 유체역학적 직경을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 두 방법은 추가로 상기 크기를 확인하기 위해, DLS 로 측정한 나노입자의 유체역학적 직경을 TEM 또는 Cryo-TEM 으로 측정한 상기 나노입자의 크기와 비교하여 서로 연이어 사용될 수 있다. 바람직한 방법은 DLS (참조. 국제 표준 ISO22412 입자 크기 분석 - 동적 광 산란, 국제 표준화 기구 (ISO) 2008) 이다.

본 발명의 맥락상 사용가능하기 위해, 생체적합성 나노입자의 절대 정전기 표면 전하 (본원에서 또한 "전하" 또는 "표면 전하" 로 식별됨) 는 |10 mV| (절대 값) 초과여야 한다. 나노입자의 표면 전하는 전형적으로 0.2 내지 10 g/L 의 나노입자 농도, 6 내지 8 의 pH, 및 전형적으로 0.001 내지 0.2 M, 예를 들어 0.01 M 또는 0.15 M 의 수성 매질 중 전해질 농도에 대한 수성 매질에서의 제타 전위 측정에 의해서 측정된다.

전형적으로, 본 발명의 생체적합성 나노입자는 정전기 표면 전하가 |10 mV| 이상, 즉 - 10 mV 미만 또는 + 10 mV 초과, 예를 들어 - 12 mV 또는 - 15 mV 미만 내지 - 20 mV 또는 +12 mV 또는 + 15 mV 초과 내지 + 20 mV, 전형적으로 - 15 mV 미만 또는 + 15 mV 초과이다. 바람직하게는, 본 발명의 생체적합성 나노입자는 절대 전자 표면 전하 값 ("절대 표면 전하 값") 이 10 mV 초과이고, 상기 전하는 보다 더욱 바람직하게는 음전하이다.

본 발명의 맥락상 사용가능하기 위해, 생체적합성 나노입자의 탄성을 반영하는 생체적합성 나노입자의 영 계수는 500 kPa 미만, 전형적으로 400 kPa 미만, 보다 바람직하게는 300 또는 200 kPa 미만, 바람직하게는 100 kPa 미만이어야 한다. 생체적합성 나노입자의 영 계수는, 예를 들어 70 kPa 미만, 또는 60, 50, 40, 30, 20 또는 10 kPa 미만일 수 있다.

영 계수는 전형적으로 원자력 현미경 (AFM) 기법을 사용하여 측정된다. 전형적인 실험에서, 생체적합성 나노입자는 보로실리케이트 판과 같은 편평한 표면에 부착 또는 고정된다. 표면에 고정된 생체적합성 나노입자는 적절한 배지, 전형적으로 PBS 또는 HEPES 완충액에 침지된다. 힘 측정은 전형적으로 "콜로이드성 탐침 방법" [Attachment of micro- and nano-particles on tipless cantilevers for colloidal probe microscopy. J. Colloid and Interface Science. 426 (2014) 190-198] (여기서, 콜로이드성 입자, 전형적으로 실리카 마이크로스피어는 원자력 현미경 (AFM) 캔틸레버에 부착되어 있음) 을 사용하여 수행된다. 본 발명의 맥락상, 캔틸레버의 스프링 상수는 나노입자의 탄성에 대해 조정되고, 전형적으로 500 mN.m^-1미만이다. 표면에 대한 나노입자의 국소화는 전형적으로 표면을 스캐닝함으로써 수행된다. 진입 및 수축 힘 곡선은 전형적으로 100 nm.s^-1미만의 일정한 속도의 팁을 사용하여 기록된다. 영 계수는 적절한 모델을 이용하여 힘 프로파일을 피팅함으로써 실험 곡선으로부터 얻어진다. "Herzt 모델" 은 전형적으로 산출을 위한 잘-확립된 모델이다 [Determining the elastic modulus of biological samples using atomic force microscopy. JPK Instruments Application Note].

또한, "개질된 hertz 모델" 이 생체적합성 나노입자의 영 계수를 산출하기 위해 사용될 수 있다. 문헌 "Young's moduli of surface-bound liposomes by atomic force microscopy force measurements" (Langmuir 2008, 24; 2009-2014) 에서, 저자는 전형적으로 40 kPa 미만, 바람직하게는 10 kPa 미만의 리포솜의 영 계수를 보고한다. 비교를 위해, 살아있는 세포는 전형적으로 영 계수 값이 100 kPa 미만이다. 겔의 영 계수는 가교도에 따라 가변적일 수 있다. 이들의 논문 "Effect of mechanical properties of hydrogel nanoparticles on macrophages cell uptake" (Soft Matter, 2009, 5;3984-3991) 에서, 저자는 N,N-디에틸 아크릴아미드 및 N,N'-메틸렌-비스-아크릴아미드와 가교된 2-히드록시에틸 메타크릴레이트로 이루어진 이의 생체적합성 나노입자에서 가교 증가 (mol%) 에 따라, 영 계수 값이 증가 (18.04 kPa 에서 211.39 kPa 까지) 한다는 것을 보고한다.

조합된 특성, 크기, 표면 전하, 및 나노입자의 탄성은 나노입자의 짧은 혈액 순환 및 간 장기 내로의 혈관외유출을 허용한다. 나아가, 기계적 방법은 세포 및 이의 미세환경 간의 복잡한 상호작용에서 중요한 조절제로 나타났다. 주변의 세포외 기질 (ECM) 과 세포의 상호작용은 이의 적절한 기능뿐 아니라 조직 구조 및 항상성의 유지에 필수적이다. 세포는 ECM 에 결합할 수 있는 수용체의 큰 레퍼토리를 개발하였다. 이들은 ECM 에 물리적 결합을 제공하고, 이러한 복잡한 환경의 특성에 대한 이의 거동을 조정함으로써 ECM 으로부터 발생되는 신호를 변환할 수 있도록 한다. 특히, 세포 거동은 ECM 의 조성, 토포그래피, 및 기계적 특성에 의해 영향을 받는다. 세포는 전형적으로 탄성 계수 (즉, 영 계수) 가 100 Pa 내지 100 kPa 이다 [Demichelis A. et al. Study of AFM Force Spectroscopy method for elastic modulus measurement of living cells. Journal of Physics: Conference Series 459 (2013) 012050]. 본 발명의 맥락상, 생체적합성 나노입자는 전형적으로 세포와의 안전한 상호작용 (즉, 세포의 기능에 영향을 미치지 않으면서) 을 위해 세포의 탄성 이하의 탄성 (즉, 탄성 계수 또는 영 계수) 을 갖는다. 따라서, 본 발명의 생체적합성 나노입자 및 목적하는 화합물(들)을 순차적으로 투여함으로써, 두 화합물 (즉, 생체적합성 나노입자 및 목적하는 화합물) 의 동시-순환이 달성되지 않거나, 제한된 동시-순환이 달성된다. 따라서, 생체적합성 나노입자의 조합된 특성, 크기, 표면 전하 및 탄성은 전형적으로는 임의의 나노입자 부재 하 상기 화합물(들)의 표준 약학적 투여량에 의해 유도된 약학적 혜택 및 독성과 비교하였을 때, 대상체에서 그 감소된 독성을 위한 화합물(들)의 동일한 약학적 (즉, 치료적, 예방적 또는 진단적) 혜택을 허용 (유지) 하거나, 즉 대상체에서 그 등가 또는 감소된 독성 (바람직하게는, 감소된 독성) 을 위한 화합물(들)의 약학적 혜택을 증가시키면서 목적하는 화합물(들)의 안전한 사용을 허용한다.

나노입자는 전형적으로 유기 나노입자, 예컨대 지질-기반 나노입자 (글리세롤지질, 인지질, 스테롤 지질 등), 예를 들어 고체 지질 나노입자, 또한 본원에서 "단백질-나노입자 (예를 들어, 알부민)" 로 식별된 단백질-기반 나노입자, 중합체-기반 나노입자 ("중합체성 나노입자"), 공중합체-기반 나노입자 ("공중합체성 나노입자"), 탄소-기반 나노입자, 바이러스-유사 나노입자 (예를 들어, 바이러스 벡터) 일 수 있다.

유기 나노입자는 추가로 나노스피어 (평면 나노입자) 또는 나노캡슐 (중공 나노입자), 예컨대 리포솜, 겔, 히드로겔, 미셀, 덴드리머 등일 수 있다. 본원에 기재된 유기 나노입자의 혼합물이 또한 사용될 수 있다. 중합체 또는 공중합체는 천연 또는 합성 기원일 수 있다.

유기 나노입자의 제조를 위한 본 발명의 맥락상 사용가능한 합성 (인공) 및 천연 중합체 또는 공중합체의 예는 폴리락트산 (PLA), 폴리 (락티드-코-글리콜)산 (PLGA), 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 폴리글락틴, 폴리락티드, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리소르베이트, 폴리비닐 알코올, 폴리아크릴아미드, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리락테이트-코-글리콜레이트, 폴리(아미도 아민), 폴리(에틸렌이민), 알기네이트, 셀룰로오스 및 셀룰로오스 유도체 중합체, 콜라겐, 히알루론산, 폴리글루탐산 (PGA), 액틴, 다당류, 및 젤라틴으로부터 선택될 수 있다.

본원에 기재된 조성물에 사용된 나노입자는 생체적합성, 즉 살아 있는 조직과 혼화가능할 것이다. 이의 조성물에 의해 요구되는 경우, 나노입자는 따라서 생체적합성 물질로 코팅되어 사용가능하게 된다. 본 발명의 특정 구현예에서, 본원에 언급된 나노입자는 따라서 생체적합성 코팅으로 커버된다.

생체적합성 물질은 생물학적 표적과의 상호작용을 가능하게 하는 작용제일 수 있다. 이러한 작용제는 통상, 나노입자의 절대 전하가 10 mV 이상인 경우 나노입자의 표면 상에 양성 또는 음성 전하를 유도할 것이다.

나노입자 표면 상에 양성 전하를 형성하는 작용제는, 예를 들어 아미노프로필트리에톡시실란 또는 폴리리신에서 선택될 수 있다. 나노입자 표면 상에 음성 전하를 형성하는 작용제는, 예를 들어 포스페이트 (예를 들어, 폴리포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 등), 카르복실레이트 (예를 들어, 시트레이트 또는 디카르복실산, 특히 숙신산) 또는 술페이트에서 선택될 수 있다.

특정 구현예에서, 나노입자의 절대 전하가 10 mV (|10 mV|) 이상인 한, 나노입자는 입체 기를 나타내는 작용제에서 선택되는 생체적합성 물질로 코팅될 수 있다. 이러한 기는, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); 폴리에틸렌옥시드; 폴리비닐알코올; 폴리아크릴레이트; 폴리아크릴아미드 (폴리(N-이소프로필아크릴아미드)); 폴리카르바미드; 생물중합체 (biopolymer); 다당류, 예컨대 덱스트린, 자일란 및 셀룰로오스; 콜라겐; 양쪽성 이온 화합물, 예컨대 폴리술포베타인; 등에서 선택될 수 있다.

생체적합성 코팅은 유리하게는 "전체 코팅" (완전한 단일층) 일 수 있다. 이는 나노입자의 모든 표면 상에 적절한 전하를 생성하는 매우 고밀도의 생체적합성 분자의 존재를 의미한다.

생체적합성 코팅은 표지화제, 통상 표준 영상화 장비를 사용하는 색상의 시각화를 가능하게 하는 작용제를 추가로 포함할 수 있다.

하나 이상의 생체적합성 나노입자를 하나 이상의 목적하는 화합물과 함께 병용 투여하는 것은, 통상 임의의 나노입자의 부재 하, 상기 화합물(들) 의 표준 약학적, 통상 치료적 투여량에 의해 유도된 독성 및 약학적 혜택과 비교하여, 통상 목적하는 화합물(들) 을 필요로 하는 대상체에게 5 분 초과 내지 약 72 시간에 서로 하나씩 투여시, 대상체에 대해, 감소된 독성을 위한 목적하는 화합물(들) 의 약학적 (즉, 치료적, 예방적 또는 진단적), 통상 치료적 혜택을 유지시키거나, 등가 또는 감소된 독성을 위한 화합물(들) 의 약학적 혜택을 증가시킨다.

특정 구현예에서, 하나 이상의 생체적합성 나노입자 및 하나 이상의 목적하는 화합물의 병용 투여는, 통상 임의의 나노입자의 부재 하, 상기 화합물(들) 의 표준 치료적 투여량과 비교하여, 통상 목적하는 화합물(들) 을 필요로 하는 대상체에게 5 분 초과 내지 약 72 시간에 서로 하나씩 투여시, 투여된 화합물(들) 치료적 투여량(들) 의 10% 이상, 바람직하게는 15% 이상 감소를 허용하면서, 대상체에 대한 화합물(들) 의 등가의 독성 또는 감소된 독성 (바람직하게는, 감소된 독성) 을 위한 동일한 치료적 혜택을 유지하거나; 대상체에 대한 화합물(들) 의 등가 또는 감소된 독성을 위한 치료적 혜택을 증가시킨다.

특정 구현예에서, 나노입자(들) 는 여러 목적하는 화합물, 통상 둘 이상의 목적하는 화합물과 함께 투여된다.

나노입자는 바람직하게는, 하나 이상의 목적하는 화합물을 필요로 하는 대상체에게 투여한 후 통상 1 시간 및 6 주 내, 예를 들어 1 개월 (4 주), 1 시간 및 1 개월 내, 예를 들어 1 시간 내지 3 주, 또는 1 시간 내지 2 주, 또는 1 시간 내지 1 주에, 이것이 투여된 대상체로부터 소거된다.

나노입자 (존재시, 이의 생체적합성 코팅을 포함) 를 구성하는 물질은 나노입자의 생체내지속성 (즉, 대상의 신체 내 지속성) 을 결정하는데 있어서 중요하다. 나노입자는, 예를 들어 PLGA 또는 PLA 와 같은 생분해성 중합체로 구성되는 경우, 생분해성인 것으로 간주될 수 있다. 생분해성은 대상으로부터의 신속한 나노입자(들) 클리어런스를 촉진시킨다.

상이한 분자 또는 작용제는 하나 이상의 목적하는 화합물로서, 통상 상기 기재한 바와 같은 하나 이상의 생체적합성 나노입자와 조합으로 투여된 하나 이상의 목적하는 약학 화합물로서 현 교시에 따라 사용될 수 있다. 이러한 화합물은 상기 설명한 바와 같은 치료적, 예방적 또는 진단적 화합물일 수 있다. 이는 유기 화합물 또는 무기 화합물일 수 있다.

목적하는 화합물로서 사용가능한 유기 화합물의 예는 생물학적 화합물, 항체, 올리고뉴클레오티드, 합성 펩티드, 소분자 표적화 치료제, 종양세포붕괴성 바이러스, 세포독성 화합물, 및 이의 임의의 상응하는 전구약물 또는 유도체 등에서 선택될 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 맥락에서 사용한 목적하는 화합물은 바람직하게는, 생물학적 화합물, 소분자 표적화 치료제, 종양세포붕괴성 바이러스 및 세포독성 화합물에서 선택되는 유기 화합물이다. 또 다른 특정 구현예에서, 목적하는 화합물은 항체, 올리고뉴클레오티드 및 합성 펩티드에서 선택된다.

생물학적 화합물은, 예를 들어 항체, 항체 약물 접합체, 바람직하게는 단일클론 항체 ("mAb"), 예컨대 인플릭시맙, 아달리무맙, 베바시주맙, 리툭시맙, 트라스투주맙, 라니비주맙, 세툭시맙, 파나티무맙; 단백질 또는 재조합 단백질, 예컨대 엔브렐 (에타네르셉트) 또는 인터페론 베타-1a; 펩티드 또는 재조합 펩티드, 예컨대 인슐린 글라진 (glargine) 또는 베타세론; 백신, 예컨대 프리베나 13 또는 가다실; 바이오시밀러 (biosimilar), 예컨대 에포진 (epogin); 효소 또는 재조합 효소, 예컨대 레플라갈 (replagal) 또는 크레온 (creon); 등이다.

올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, 예컨대 미포메르센 (mipomersen) 나트륨 또는 푸르세니드 (pursennid) 등이다.

합성 또는 인공 펩티드는, 예컨대 글라티라메르 (glatiramer) 아세테이트 또는 류프롤리드 아세테이트이다.

종양세포붕괴성 바이러스는 정상 세포에 해를 끼치지 않고 암 조직을 선택적으로 감염 및 손상시키는 치료적으로 유용한 바이러스이다. 종양세포붕괴성 바이러스는, 예를 들어 아데노바이러스, 예컨대 Onyx-015, 콕사키 바이러스, 예컨대 카타바크 (Catavak), 단순 포진 바이러스, 예컨대 탈리모겐 라허파렙벡 (talimogene laherparepvec), 홍역 바이러스, 예컨대 MV-CEA, 뉴캐슬병 바이러스, 파보바이러스, 폴리오바이러스, 레오바이러스, 세네카 밸리 바이러스 (Seneca valley virus), 레트로바이러스, 백시니아, 수포성 구내염 바이러스에서 선택된다.

소분자 표적화 치료제는 일반적으로 악성 세포 내의 돌연변이화된, 과발현된, 또는 다르게는 중요한 단백질 (암 치료 맥락에서 잠재적 표적) 상의 효소 도메인을 저해시킨다. 일부 치료제는 세포 분화를 표적화하는 것들 (예를 들어, 오로라-키나아제 저해제 또는 사이클린-의존적 키나아제 저해제) 뿐 아니라 기타 생물학적 메커니즘, 예컨대 단백질 턴오버 및 염색질 변형을 표적화하는 것들 (예를 들어, 히스톤-탈아세틸화효소 저해제) 을 포함한다. 소분자 표적화 치료제는, 예를 들어 이마티닙, 라파마이신, 게피티닙, 에를로티닙, 소라페닙, 수니티닙, 닐로티닙, 다사티닙, 라파티닙, 보르테조밉, 아토르바스타틴 등이다.

세포독성 화합물은, 예를 들어 DNA-변형제, 예컨대 안트라사이클린 (예를 들어, 독소루비신, 다우노루비신 등), 알킬화제 (예를 들어, 멜팔란 또는 테모졸로미드) 뿐 아니라, 규정된 생리학적 메커니즘, 예컨대 미세소관 중합 (예를 들어, 탁솔), 또는 대사산물 합성 (예를 들어, 메토트렉세이트) 을 매우 정확하게 방해하는 약물이다. 활성화가능한 세포독성 화합물은 통상 광역동 치료 (Photodynamic Therapy) 에서 사용되며 (예를 들어, 포토프린 (photofrin)), 레이저 공급원과 같은 외부 공급원에 의해 활성화되어 이의 치료적 효과가 생성된다. 기타 전형적인 세포독성 화합물은 통상 본원에 기재된 바와 같으며 숙련된 종양학자에 의해 공지되어 있는 화학요법제에서 선택된다.

전구약물 (예를 들어, 카페시타빈 또는 이리노테칸) 은 이의 활성 형태로 생체내 대사작용되어, 이의 예상된 치료 효과를 생성해낸다.

하나 이상의 목적하는 화합물로서 사용가능한 무기 화합물의 예는 전이 금속 배위 착물, 방사성 의약 화합물, 나노입자 등에서 선택될 수 있다.

목적하는 화합물이 나노입자인 경우, 상기 나노입자는 청구된 바와 같은 약학 조성물에서 나타내어진 "하나 이상의 생체적합성 나노입자" 와 다르다.

전이 금속 배위 착물은 광범위한 배위수 및 기하학적 구조, 접근가능한 산화환원 상태, 열역학의 '조화가능성 (tune-ability)' 및 리간드 대체물의 반응속도 뿐 아니라 광범위한 구조적 다양성을 비롯하여, 보다 흔한 유기-기반 약물에 대하여 잠재적 이점을 제공한다. 금속-기반 물질은 세포 분자 표적과 상호작용하여, 생화학적 기능에 영향을 줌으로써 악성 세포 파괴를 유도한다. 전이 금속 배위 착물은 통상 DNA 구조에 작용하는 세포독성제 (예를 들어, 백금 배위 착물: 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살로플라틴, 또는 루테늄 또는 금 배위 착물) 이다.

방사성 의약 화합물은 진단 목적으로, 또는 악성 세포를 선택적으로 파괴하기 위해 방사선을 방출한다. 통상적인 방사성 의약품은, 예를 들어 스트론튬-89, 탈륨-201, 테크네튬-99, 사마륨-83 등을 함유할 수 있다.

나노입자는 통상 금속 산화물 나노입자 (예를 들어, WO 2009/147214 및 WO 2007/118884 참조), 금속성 나노입자 (예를 들어, 금, 백금 또는 은 나노입자), 금속 술피드 나노입자 (예를 들어, Bi₂S₃), 및 이의 임의의 혼합물 (예를 들어, 산화하프늄 물질로 커버된 금 나노입자) 에서 선택될 수 있다. 나노입자는, 예를 들어 전자기 방사선 공급원, 초음파 공급원 또는 자성 공급원 등과 같은 외부 공급원을 통해 활성화될 수 있는 나노입자이다.

상기 기재된 바와 같은 생체적합성 나노입자와 조합으로 투여되는 목적하는 화합물 (통상 본원에서 기재한 바와 같이 순차적으로 투여됨) 은, 숙련자에 의해 공지되어 있는 수단에 따라 담체 중 캡슐화되거나 이러한 담체로 그래프트 (또는 결합) 될 수 있다. 통상의 담체는, 예를 들어 리포솜 (예컨대 감열성 지질을 사용하는 DOXIL 또는 ThermoDox), 미셀, 중합체성 (또는 "중합체") 담체, 히드로겔, 겔, 공중합체성 담체, 단백질 담체, 무기 담체이다.

본 발명의 약학 조성물 (목적하는 화합물(들) 과 나노입자(들) 의 조합에 의해 규정됨) 은 많은 분야, 특히 의학 또는 수의학에서 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 통상, 동물, 바람직하게는 포유류 (예를 들어, 수의학 맥락에서의), 보다 더 바람직하게는 인간 (연령 또는 성별에 관계없이) 으로서 확인되는 대상체에서 사용된다.

본 발명의 약학 조성물은 심혈관 질환, 중추 신경계 (CNS) 질환, 위장 질환, 유전 장애, 혈액학적 장애, 호르몬 장애, 면역 장애, 감염성 질환, 대사 장애, 근골격 장애, 암, 호흡기 질환 및 중독 (intoxication) 등에서 선택되는 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 약학 조성물은 심혈관 질환, CNS 질환, 암, 감염성 질환 및 대사 장애에서 선택되는 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는데 사용된다.

본 발명의 맥락에서, 하나 이상의 나노입자 및 약학 화합물(들) 은 유리하게는, 화합물(들) 약학 효능이 최적화되도록 5 분 초과 내지 약 72 시간, 통상 5 분 초과 내지 약 24 시간, 바람직하게는 5 분 또는 30 분 초과 내지 약 12 시간에 서로 하나씩 상기 화합물을 필요로 하는 대상체에게 투여된다.

본 발명에서, 하나 이상의 나노입자 및 화합물(들) 이 상기 화합물(들) 을 필요로 하는 대상체에 5 분 초과 내지 약 72 시간에 서로 하나씩 투여되는 경우, 생체적합성 나노입자의 절대 표면 전하 값은 10 mV (|10 mV|) 이상이다.

본 발명의 특정 구현예에서, 하나 이상의 나노입자 및 화합물(들) 이 상기 화합물(들) 을 필요로 하는 대상체에 5 분 초과 내지 약 24 시간에 서로 하나씩 투여되는 경우, 생체적합성 나노입자의 절대 표면 전하 값은 유리하게는 15 mV (|15 mV|) 이상이다.

본 발명의 또 다른 특별한 구현예에서, 하나 이상의 나노입자 및 화합물(들) 이 상기 화합물(들) 을 필요로 하는 대상체에 5 분 초과 내지 약 12 시간에 서로 하나씩 투여되는 경우, 생체적합성 나노입자의 절대 표면 전하 값은 유리하게는 20 mV (|20 mV|) 이상이다.

또한 본원에 기재된 것은 본원에 언급된 것과 같은 질환의 성향이 있는, 또는 질환을 겪을 것으로 의심되는 대상체의 예방 또는 치료 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 본 발명에 따른 약학 조성물, 전형적으로 하나 이상의 생체적합성 나노입자 및 하나 이상의 본원에 기재된 목적하는 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 한 면에는 생체적합성 나노입자(들) 및 다른 면에는 목적하는 화합물(들) 이 전형적으로 5 분 초과 내지 약 72 시간의 간격을 가지고, 개별적으로 투여되기만 하면, 하나 이상의 나노입자 또는 하나 이상의 목적하는 화합물 중 어느 것이든 상기 대상체에게 먼저 투여될 수 있다. 상기 하나 이상의 나노입자 또는 하나 이상의 목적하는 화합물의 투여는 각각의 단일 투여, 각각의 반복된 투여, 예를 들면 각각의 몇 개의 연속적인 투여일 수 있다. 하나 이상의 생체적합성 나노입자는 1 회 투여될 수 있고, 하나 이상의 목적하는 화합물은 1 회 초과로 투여될 수 있고, 그 역도 가능하다.

특정 구현예에서, 생체적합성 나노입자는 하나 이상의 목적하는 화합물의 몇 개의 투여를 포함하는 프로토콜의 시작 시에 적어도 투여되는데, 즉 적어도 상기 하나 이상의 목적하는 화합물의 제 1 투여 및 그 투여 전 또는 후에 투여된다.

또 다른 특별한 구현예에서, 하나 이상의 생체적합성 나노입자는 목적하는 화합물(들) 의 몇 개의 투여를 포함하는 프로토콜의 시작 시에 투여되지 않고, 관심의 상기 화합물(들) 의 제 2 또는 제 3 투여 전에, 및 이의 투여 전 또는 후에 투여되지 않는다.

이들 마지막 두 구현예의 문맥에서, 생체적합성 나노입자(들) 은 또한 상기 목적하는 화합물(들) 의 후속의 투여의 일부 또는 모두 동안 목적하는 화합물(들) 과 함께 (이전에 설명된 바와 같이 전 또는 후) 투여될 수 있다.

특정 구현예에서, 하나 이상의 본 발명의 나노입자는 대상체에게, 하나 이상의 목적하는 화합물의 상기 대상체에 대한 투여 전에, 전형적으로 하나 이상의 목적하는 화합물의 투여 전 5 분 초과 내지 약 72 시간에 투여된다.

본 문맥에서, 용어 "나노입자" 는 더 상세하게는, 약 4 nm 내지 약 100 nm, 예를 들면 약 10 nm, 15 nm 또는 20 nm 내지 약 100 nm 의 크기를 가진, 생성물, 특히 합성 생성물을 지칭한다. 그와 같은 나노입자와 함께 사용하고자 하는 목적하는 화합물의 예는 유기 화합물, 전형적으로 생물학적 화합물이다. 이것은 유리하게는 항체, 올리고뉴클레오티드, 합성 펩티드, 소분자 표적화 치료제, 종양용해 바이러스, 및 세포독성 화합물로부터 선택되고, 바람직하게는 항체, 소분자 표적화 치료제 및/또는 세포독성 화합물이다. 용어 "나노입자" 는 다르게는 약 100 nm 내지 약 500 nm, 전형적으로 약 100 nm 내지 약 300 nm 의 크기를 가진, 생성물, 특히 합성 생성물을 지칭할 수 있다. 그와 같은 나노입자와 함께 사용하고자 하는 목적하는 화합물의 예는, 전형적으로 금속 나노입자, 산화금속 나노입자, 금속 술파이드 나노입자 및 이들의 임의의 혼합물 또는 담체 내에 캡슐화된 또는 그와 같은 담체에 그래프트된 임의의 목적하는 화합물로부터 선택되는, 무기 화합물이다.

본 발명의 약학 조성물의 생체적합성 나노입자(들) 은 피하, 정맥내 (IV), 피부내, 동맥내, 기도 (흡입), 복막내, 근육내 및/또는 경구 경로 (per os), 바람직하게는 정맥내 (IV), 동맥내, 및/또는 복막내 경로와 같은 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 목적하는 화합물(들) 은 피하, 정맥내 (IV), 피부내, 동맥내, 기도 (흡입), 복막내, 근육내 및/또는 경구 경로 (per os) 와 같은 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다.

하기 예는 본 발명을 그 범위의 제한 없이 설명한다.

실시예

실시예 1 : 생체적합성 나노입자로서의 리포솜의 합성 n°1

리포솜을 지질막 재수화 방법을 사용하여 제조한다:

a) 지질을 클로로포름에 용해한다. 최종적으로, 클로로포름을 질소 유동 하에 증발시킨다. 지질 농도가 5 mM 가 되도록, HEPES 20 mM 및 NaCl 140 mM (pH 7.4) 로의 지질막의 재수화를 50℃ 에서 수행한다.

하기 지질 조성물을 하전된 리포솜의 제조를 위해 사용하였다: DPPC (디팔미토일포스파티딜콜린): 86% mol; MPPC (모노팔미토일포스파티딜콜린): 10% mol; DSPE-PEG (디스테아릴포스파티딜에탄올아민-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000]): 4% mol.

b) 그 다음, 액체 질소 내에 및 50℃ 로 조절된 수조 내에 샘플을 연속하여 플런징 (plunging) 함으로써, 동결-해동 사이클을 6 회 수행한다.

c) 써모배럴 (thermobarrel) 압출기 (LIPEX™ Extruder, Northern Lipids) 를 조절된 온도 및 압력 하에서 리포솜의 크기를 칼리브레이션하는데 사용한다. 모든 경우에, 압출은 10 bar 의 압력 하에, 50℃ 에서 수행하였다.

준비된 리포솜의 크기 분포는 Zetasizer NanoZS (Malvern 기기) 를 사용하여 90℃ 의 각도에서 633 nm HeNe 레이저로 동적 광 산란 (DLS) 에 의해 측정하였다. 리포솜 현탁물을 HEPES 20 mM 및 NaCl 140 mM (pH 7.4) 에서 100 배 희석하였다. 리포솜 크기 (즉, 유체역학적 직경) 는 약 170 nm (강도에 의한 분포) 와 같고, 다분산도 지수 (PDI) 는 약 0.1 과 같았다.

당업자에게 이해될 수 있는 바와 같이, 원하는 표면 전하가 선택된 지질 조성물 덕분에 수득되었고, 그 값은 Zetasizer NanoZS (Malvern 기기) 를 사용하는 제타 전위 측정에 의해 확인되었다.

리포솜을 물에 100 배 희석하였고, 수득한 현탁물의 pH 를 pH 7.4 로 조정하였다. 리포솜 표면 전하는 pH 7.4 에서 약 -14 mV 와 동일하였다.

실시예 2 : 대상체에서의 등가의 치료적 효능에 대해 대상체에 투여하는 치료적 화합물의 투여량을 10% 이상 감소시키는 방법.

이온화 방사선, 예컨대 X-선에 노출되는 경우 전자 및/또는 고 에너지 광자를 발생시킬 수 있는 항-암 요법을 위한 생체적합성 나노입자 및 활성화가능한 옥사이드 나노입자 ("화합물" 또는 "약학 화합물" 로서 사용됨) 를 포함하는 청구항 제 1 항에 따른 약학 조성물을, 하기 방식으로 이종이식된 종양을 가진 누드 마우스에 투여한다:

a) 각 누드 마우스에 (정맥내 주입에 의해) 생체적합성 나노입자를 투여하는 단계;

b) 단계 a) 후 5 분 초과 내지 72 시간에, 현재 사용된 투여량과 비교하였을 때 적은 투여량 (10%) 으로 단계 a) 의 각 마우스에 치료적 화합물을 (정맥내 주입에 의해) 투여하는 단계;

c) 각 마우스의 혈액 또는 혈장 샘플 내의 치료적 화합물 농도를 측정하여 치료적 화합물의 약물동력학적 파라미터를 수득하는 단계, 상기 농도는 치료적 화합물 투여 후 1 분 내지 24 시간 사이에 1 회 또는 바람직하게는 수 회 측정됨;

d) 약학 조성물의 투여 후 독성의 임의의 임상 징후를 평가하는 단계; 및

e) 정맥내 (IV) 투여 후 24 시간에 치료적 화합물의 종양 축적을 측정하는 단계.

실시예 3 : 생체적합성 나노입자로서의 리포솜의 합성 n°2

리포솜을 지질막 재수화 방법을 사용하여 제조한다:

a) 지질을 클로로포름에 용해한다. 최종적으로, 클로로포름을 질소 유동 하에 증발시킨다. 지질 농도가 25 mM 가 되도록, HEPES 20 mM 및 NaCl 140 mM (pH 7.4) 로의 지질막의 재수화를 60℃ 에서 수행한다.

하기 지질 조성물을 하전된 리포솜의 제조를 위해 사용하였다: DPPC (디팔미토일포스파티딜콜린) 62% mol; HSPC (수소화 대두 포스파티딜콜린) 20% mol; CHOL (콜레스테롤) 16% mol; POPS (1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜세린) 1% mol; DSPE-PEG (디스테아릴포스파티딜에탄올아민-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000]) 1% mol.

b) 그 다음, 액체 질소 내에 및 60℃ 로 조절된 수조 내에 샘플을 연속하여 플런징함으로써, 동결-해동 사이클을 6 회 수행한다.

c) 써모배럴 압출기 (LIPEX™ Extruder, Northern Lipids) 를 조절된 온도 및 압력 하에서 리포솜의 크기를 칼리브레이션하는데 사용한다. 먼저, 폴리에테르술폰 (PES) 0.45 ㎛ 기공-크기의 막을 통해 5 bar 의 압력에서 5 회 통과, 그 다음 PES 0.22 ㎛ 기공-크기의 막을 통해 10 bar 에서 12 회 통과, 및 마지막으로 0.1 ㎛ 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 막을 통해 15 bar 에서 12 회 통과를 수행하였다. 준비된 리포솜의 크기 분포는 Zetasizer NanoZS (Malvern 기기) 를 사용하여 90℃ 의 각도에서 633 nm HeNe 레이저로 동적 광 산란 (DLS) 에 의해 측정하였다. 리포솜 현탁물을 HEPES 20 mM 및 NaCl 140 mM (pH 7.4) 에서 100 배 희석하였다. 리포솜 크기 (즉, 유체역학적 직경) 는 약 145 nm (강도에 의한 분포) 와 같고, 다분산도 지수 (PDI) 는 약 0.1 과 같았다.

리포솜을 염화나트륨 용액 (1 mM) 에 100 배 희석하였고, 수득한 현탁물의 pH 를 pH 7.4 로 조정하였다. 리포솜 표면 전하는 pH 7.4, NaCl 1mM 에서 약 -25 mV 와 동일하였다.

실시예 4 : MDA-MB-231-lucD3H2LN 이종이식 내 Dox-NP® 및 실시예 3 의 생체적합성 나노입자 현탁물을 포함하는 약학 조성물의 종양 재성장 지연 (도 2 및 3)

본 연구를, 목적하는 치료 화합물로서 (i) 실시예 3 의 생체적합성 나노입자 및 (ii) Dox-NP® (리포솜 캡슐화된 독소루비신) 을 포함하는 약학 조성물의 효능을 NMRI 누드 마우스에 이종이식된 MDA-MB-231-luc-D3H2LN 종양 모델에서 연구하기 위해 수행했다.

인간 유방 선암 MDA-MB-231-luc-D3H2LN 세포주는 Caliper Life Science (Villepinte, France) 에서 구입했다. 세포는 10% 소태아혈청, 1% 비필수 아미노산, 1% L-글루타민, 및 1% 나트륨 피루베이트 (Gibco) 가 보충된 Earl's Balanced Salts Solution MEM/EBSS 배지를 포함하는 최소 필수 배지에서 배양했다.

6-7 주 (20-25g) 의 NMRI 누드 마우스는 Janvier Labs (France) 에서 주문했다. 마우스는 이종이식을 위한 암 세포의 접종 하루 전에 세슘-137 방사능 조사 장치를 이용하여 3Gy 의 전신 방사능 조사에 적용했다.

마우스의 우측 하단 옆구리에 50 μL 중 4.10⁶ 세포를 피하 접종함으로써 MDA-MB-231-luc-D3H2LN 종양을 수득했다. 종양은 부피가 약 100 ㎣ 에 도달할 때 까지 성장되었다. 종양 직경은 디지털 칼리퍼를 사용하여 측정했고, 종양 부피 (㎣) 는 하기 식을 사용하여 계산했다:

마우스는 분리 케이지로 랜덤화되었고, 숫자로 식별되었다 (발에 문신함). 4 개의 군을 도 2 에 나타낸 바와 같이 처리했다.

- 군 1: 멸균 글루코오스 5% (대조 (비히클) 군)

네 마리 (4) 의 마우스에게 멸균 글루코오스 5% 용액을 1 일, 7 일 및 14 일에 정맥내 (IV) 주입했다. 매 회 (일), 글루코오스 5% 의 2 회 주입을 실시했다. 글루코오스 5% 용액의 첫 번째 주입은 두 번째 주입 4 시간 전에 실시했다.

- 군 2: 실시예 3 의 생체적합성 나노입자 (대조군)

네 마리 (4) 의 마우스에게 멸균 글루코오스 5% 용액 및 실시예 3 의 생체적합성 나노입자 (10 ml/kg) 를 1 일, 7 일 및 14 일에 정맥내 (IV) 주입했다. 매 회 (일), 실시예 3 의 생체적합성 나노입자의 주입은 글루코오스 5% 용액의 주입 4 시간 전에 실시했다.

- 군 3: Dox-NP® (3mg/kg 독소루비신) (처리군)

다섯 마리 (5) 의 마우스에게 멸균 글루코오스 5% 용액 및 Dox-NP® (3mg/kg 독소루비신) 을 1 일, 7 일 및 14 일에 정맥내 (IV) 주입했다. 매 회 (일), 멸균 글루코오스 5% 용액의 주입은 Dox-NP® (3mg/kg 독소루비신) 의 주입 4 시간 전에 실시했다.

- 군 4: 약학 조성물, 즉 (i) 실시예 3 의 생체적합성 나노입자 및 (ii) Dox-NP® (3mg/kg 독소루비신) 의 조합 (처리군)

다섯 마리 (5) 의 마우스에게 실시예 3 의 생체적합성 나노입자 (10 ml/kg) 및 Dox-NP® (3mg/kg 독소루비신) 을 1 일, 7 일 및 14 일에 정맥내 (IV) 주입했다. 매 회 (일), 실시예 3 의 생체적합성 나노입자의 주입은 Dox-NP® (3mg/kg 독소루비신) 의 주입 4 시간 전에 실시했다.

Dox-NP® (Avanti Polar lipids - 10% w/v 수크로스를 포함하는, 10mM 히스티딘 완충제 중, pH 6.5-6.8 의 2 mg/ml 독소루비신 HCl 의 리포솜 제형) 이 추가적인 희석 없이 3mg/kg 의 주입된 독소루비신을 수득하는데 필요한 부피로 주입되었다.

실시예 3 의 생체적합성 나노입자 현탁물은 임의의 추가적인 희석 없이 사용되었다.

Dox-NP® 및 실시예 3 의 생체적합성 나노입자는 100U (0.3ml) 인슐린 시린지 (TERUMO, France) 를 사용하여 말단 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주입 (IV) 에 의해 투여되었다.

마우스는 임상적 징후, 체중 및 종양 크기에 대해 후속 조치되었다.

종양 부피는 하기 식을 사용하여 디지털 칼리퍼에 의한 2차원 종양 부피 측정으로부터 추정되었다.

각 군에서, 상대 종양 부피 (RTV) 는 V_t/V₀ 비 (V_t 는 치료 중 소정 일자의 종양 부피이고, V₀ 은 치료 시작 시의 종양 부피임) 로 표현되었다.

치료 효능은 2 배가 시간(doubling time) 동안의 특이적 성장 지연 (SGD) (1 배가 시간은 종양 부피가 2 배가 되는데 걸리는 시간의 양임) 및 최적 퍼센트 T/C 값 (%T/C) 을 이용하여 측정되었다.

2 배가 시간 동안의 SGD 는 다음과 같이 계산했다:

T4d 는 종양 부피가 2 배가 되는데 필요한 시간임 (평균 RTV 100 ㎣ 에서 400 ㎣ 까지).

퍼센트 T/C 값 ("%T/C") 은 1, 3, 7, 10, 13, 15, 18, 21 및 24 일에서의 대조군 (군 1) 에 대하여 처리군 (군 2, 3, 4) 의 상대 종양 부피의 중앙값을 나누고, 상기 나눗셈의 결과에 100 을 곱하여 계산했다 (표 2 참조). (본 발명의 맥락에서 사용되는 바와 같은 생체적합성 나노입자의 존재 또는 부재 하에) 치료 주입 후 2 주 이내에 수득된 가장 낮은 %T/C 값은 최적의 %T/C 값에 상응한다.

도 3 은 (앞서 기재한 조건에서) 하기를 IV 주입한 후 수득된 모든 군에 대한 평균 상대 종양 부피 (평균 RTV) 를 보여준다:

- 1, 7 및 14 일 째에 비히클 (멸균 글루코오스 5%) (군 1);

- 실시예 3 의 생체적합성 나노입자, 1, 7 및 14 일 째에 비히클 (멸균 글루코오스 5%) 주입 4 시간 전 (군 2);

- 1, 7 및 14 일 째에 Dox-NP® (3mg/kg 독소루비신) (군 3); 또는

- 실시예 3 의 생체적합성 나노입자, 1, 7 및 14 일 째에 Dox-NP® (3mg/kg 독소루비신) 주입 4 시간 전 (군 4).

도 3 에 나타낸 바와 같이, Dox-NP® (3mg/kg 독소루비신) 단독과 비교하여, (i) 실시예 3 의 생체적합성 나노입자 및 (ii) Dox-NP® (3mg/kg 독소루비신) 의 조합을 포함하는 약학 조성물의 첫 번째 주입 후에 뚜렷한 종양 성장 억제가 관찰되었다.

각각의 종양이 부피가 2 배가 되는데 필요한 시간 (일 단위로 표현) (T4d) 을 계산했다 (치료 효과 지속 기간의 측정으로서). 약학 조성물에 대한 T4d 는 약 31 일로 추정되었고, Dox-NP® 단독에 대해서는 약 14 일로 추정되었다 (표 1). 또한, 2 배가 시간 동안 (100 ㎣ 에서 400 ㎣ 까지의 평균 RTV 으로부터 개시) 의 종양 성장으로부터 추정된 특이적 성장 지연 (SGD) 은 약학 조성물의 경우 약 2 였고, Dox-NP® 단독의 경우는 약 0 이었다 (표 1).

표 1: 종양 부피가 2 배가 되는데 걸리는 시간 (T4d) 및 2 배가 시간 동안의 종양 성장으로부터 추정되는 특이적 성장 지연 (SGD). Td4 는 2 배가 시간 (평균 RTV 100 ㎣ 에서 400 ㎣ 까지) 에 도달하는 데 걸리는 일 수를 나타낸다. 대조군은 비히클 (글루코오스 5%) 단독 (-) 이다.

뿐만 아니라, 퍼센트 T/C (%T/C) (군 1 이 희생되는 날까지 계산함) 는 Dox-NP® 단독보다 약학 조성물에서 더 빨리 감소된다. 이는 약학 조성물의 뚜렷한 영향을 입증한다. 24 일에 관찰된 25 의 최적의 %T/C 는 실로 약학 조성물, 즉 (i) 실시예 3 의 생체적합성 나노입자 및 (ii) Dox-NP® (3mg/kg 독소루비신) 의 조합에서 수득되었으며, 반면 21 일에 관찰된 38 의 최적의 %T/C 는 군 Dox-NP® 단독에서 수득되었다 (표 2).

표 2: 퍼센트 T/C (%T/C) 는 1, 3, 7, 10, 13, 15, 18, 21 및 24 일에서의 대조군 (군 1) 에 대하여 처리군 (군 2, 3, 4) 의 상대 종양 부피의 중앙값을 나누고, 상기 나눗셈의 결과에 100 을 곱하여 계산했다. 대조군은 군 1 (비히클 멸균 글루코오스 5% 단독) 이었다. %T/C 는 군 1 (대조군) 이 희생되는 날에 해당하는 24 일까지 계산했다. 최적의 %T/C 는 각 군에 대해 회색 상자로 표시했다.

전반적으로, 이들 결과는 본 발명의 약학 조성물 [(i) 실시예 3 의 생체적합성 나노입자 및 (ii) Dox-NP® (3mg/kg 독소루비신) 의 조합에 해당함] 을 사용하는 경우 유리한 종양 성장 지연을 나타냈고, Dox-NP® (3mg/kg 독소루비신) 이 단독으로 사용되는 경우 (즉, 본 발명의 맥락에서 사용되는 생체적합성 나노입자의 부재 하에) 관찰되지 않았다. 이러한 종양 성장 지연은 관심의 대상인 실시예 3 의 생체적합성 나노입자 및 화합물 (Dox-NP®) 을 순차적으로 투여했을 때 관찰되었고, 생체적합성 나노입자는 Dox-NP® 의 4 시간 전에 대상체에게 투여되었다.

실시예 5: 생체적합성 나노입자로서의 리포솜의 합성 n°3

리포솜을 지질막 재수화 방법을 사용해 제조한다:

a) 지질을 클로로포름 중에 용해시킨다. 최종적으로, 클로로포름을 질소 유동 하에 증발시켜 Pyrex 관벽에 지질막을 형성한다. 지질 농도가 50 mM 가 되도록, HEPES 25 mM 및 NaCl 150 mM (pH 7.4) 을 사용한 지질막의 재수화를 60℃ 에서 수행한다.

하기 지질 조성물을 하전된 리포솜을 제조하는데 사용하였다: DPPC (디팔미토일포스파티딜콜린) 58% mol; HSPC (수소화 대두 포스파티딜콜린) 21% mol; CHOL (콜레스테롤) 16% mol; POPS (1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜세린) 5% mol.

b) 이후, 동결-해동 사이클을 연속하여 샘플을 액체 질소 내에 및 60℃ 로 조절된 수조 내에 플런징함으로써 6 회 수행한다. 리포솜 용액의 초음파처리를 압출 직전에 및 매 3 회의 동결-해동 사이클 마다 30s 동안 수행한다.

c) 써모배럴 압출기 (LIPEX^TM Extruder, Northern Lipids) 를 조절된 온도 및 압력 하에 리포솜의 크기를 칼리브레이션하는데 사용한다. 압출을 60℃ 에서 수행한다. 10 회 통과를 10 bar 의 압력 하에 0.1㎛ 기공 크기 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 막을 통해 적용한다.

제조된 리포솜의 크기 분포를 173℃ 의 각도에서 633 nm HeNe 레이저로 Zetasizer NanoZS (Malvern 기기) 를 사용해 동적 광 산란 (DLS) 에 의해 측정한다. 리포솜 용액을 HEPES 25 mM 및 NaCl 150 mM (pH 7.4) 중에서 200 배 희석한다. 리포솜 크기 (즉, 유체역학적 직경) 는 약 170 nm (강도에 의한 분포) 이며, 다분산 지수 (PdI) 는 약 0.2 이다.

당업자에 의해 이해가능한 바, 목적하는 표면 전하를 선택된 지질 조성물 덕분에 수득하고, 그 값을 Zetasizer NanoZS (Malvern 기기) 를 사용해 제타 전위 측정으로 확인한다. 리포솜을 1mM 의 염화나트륨 용액 중에서 200 배 희석하고, 용액의 pH 를 pH 7 로 조정한다. 리포솜 표면 전하는 약 -40 mV 이다 (pH 7, NaCl 1mM).

리포솜 용액의 최종 지질 농도를 비색 검정 (Bartlett 방법) 으로 측정한다. 방법은 인지질의 산성 소화를 통한 전체 인 측정을 기준으로 한다. 방출된 무기 포스페이트를 암모늄 몰리브데이트와 반응시킴으로 착물은 강한 청색을 제공한다. 지질 농도는 약 50 mM 이다.

실시예 6: 생체적합성 나노입자로서의 리포솜의 합성 n°4

리포솜을 지질막 재수화 방법을 사용해 제조한다:

하기 지질 조성물을 하전된 리포솜을 제조하는데 사용하였다: DPPC (디팔미토일포스파티딜콜린) 45.15% mol; CHOL (콜레스테롤) 45.15% mol; DSPE-PEG (디스테아릴포스파티딜에탄올아민-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000]) 0.60% mol; L-글루탐산, N-(3-카르복시-1-옥소프로필)-, 1,5-디헥사데실 에스테르 (SA-지질) 9.10% mol. SA-지질은 리포솜 표면에 COOH 기를 가져다 준다.

b) 이후, 동결-해동 사이클을 연속하여 샘플을 액체 질소 내에 및 60℃ 로 조절된 수조 내에 플런징함으로써 6 회 수행한다.

c) 써모배럴 압출기 (LIPEX^TM Extruder, Northern Lipids) 를 조절된 온도 및 압력 하에 리포솜의 크기를 칼리브레이션하는데 사용한다. 압출을 60℃ 에서 수행한다. 7 회 통과를 3 bar 의 압력 하에 0.45㎛ 기공 크기 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 막을 통해 적용하고, 10 회 통과를 10 bar 의 압력 하에 0.22㎛ 기공 크기 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 막을 통해 적용한다. 제조된 리포솜의 크기 분포를 173℃ 의 각도에서 633 nm HeNe 레이저로 Zetasizer NanoZS (Malvern 기기) 를 사용해 동적 광 산란 (DLS) 에 의해 측정한다. 리포솜 용액을 HEPES 25 mM 및 NaCl 150 mM (pH 7.4) 중에서 200 배 희석한다. 리포솜 크기 (즉, 유체역학적 직경) 는 약 230 nm (강도에 의한 분포) 이며, 다분산 지수 (PdI) 는 약 0.2 이다.

당업자에 의해 이해가능한 바, 목적하는 표면 전하를 선택된 지질 조성물 덕분에 수득하고, 그 값을 Zetasizer NanoZS (Malvern 기기) 를 사용해 제타 전위 측정으로 확인한다. 리포솜을 1mM 의 염화나트륨 용액 중에서 200 배 희석하고, 용액의 pH 를 pH 7 로 조정한다. 리포솜 표면 전하는 약 -60 mV 이다 (pH 7, NaCl 1mM).

실시예 7: 생체적합성 나노입자로서의 리포솜의 합성 n°5

리포솜을 지질막 재수화 방법을 사용해 제조한다:

a) 지질을 클로로포름 중에 용해시킨다. 최종적으로, 클로로포름을 질소 유동 하에 증발시켜 Pyrex 관벽에 지질막을 형성한다. 지질 농도가 50 mM 가 되도록, HEPES 25 mM 및 NaCl 150 mM (pH 7.4) 을 사용한 지질막의 재수화를 60℃ 에서 수행한다. 하기 지질 조성물을 전하 리포솜을 제조하는데 사용하였다: DSPC (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린) 60% mol, CHOL (콜레스테롤) 35% mol; 및 숙시닐 PE (1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-숙시닐) 5% mol.

c) 써모배럴 압출기 (LIPEX^TM Extruder, Northern Lipids) 를 조절된 온도 및 압력 하에 리포솜의 크기를 칼리브레이션하는데 사용한다. 압출을 60℃ 에서 수행한다. 12 회 통과를 12 bar 의 압력 하에 0.22㎛ 기공 크기 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 막을 통해 적용한다.

d) 숙시닐 PE 리포솜에 대한 p-아미노페닐-α-D-만노피라노시드 (MAN) 의 컨쥬게이션: 만노오스 컨쥬게이션된 리포솜의 생성을 위해 카르보디이미드 커플링을 이용함으로써 만노오스 유래 리간드 p-아미노페닐-α-D-만노피라노시드 (MAN) 로 숙시닐 PE 리포솜 표면을 개질한다. MAN 은 그 아미노기에 의해 수행된 숙시닐 PE 리포솜의 표면에 존재하는 숙시닐 PE 의 카르복실산기에 공유 결합된다. 요약해서, 수행된 숙시닐 PE 리포솜 용액에 EDC (1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카르보디이미드 히드로클로라이드), (숙시닐 PE/EDC 1:10 몰비) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS) (NHS/EDC 1:2.5 몰비) 를 첨가한다. 이후, 현탁물의 pH 를 NaOH 1M 을 사용해 6 으로 조정하고, 수득한 현탁물을 15 분 동안 실온에서 교반한다. 이어서, 용액의 pH 를 NaOH 1M 을 사용해 7 로 조정하고, MAN 수용액을 용액에 첨가한다 (숙시닐 PE/MAN 1:2 몰비). pH 를 NaOH 1M 을 사용해 7 로 재조정하고, 현탁물을 추가적인 2 시간 동안 실온에서 교반한다. 과잉의 미결합된 MAN, EDC 및 NHS 분자를 50 KDa 셀룰로오스 막을 사용해 희석 배율 (×500; ×500; ×500) 을 사용하는 투석의 3 단계로 제거한다.

중요하게는, 투석 시에 가능한 희석으로 인해, 리포솜 용액을 폴리에틸렌 술폰 (PES) 막을 갖고 컷-오프가 300 KDa 인 Vivaspin 농축기에서 막 한외여과를 사용해 원심분리 (전형적으로, Sigma 3-15K 원심분리기 (5℃); 1,200 rpm) 로 농축시킬 수 있다.

제조된 리포솜의 크기 분포를 173℃ 의 각도에서 633 nm HeNe 레이저로 Zetasizer NanoZS (Malvern 기기) 를 사용해 동적 광 산란 (DLS) 에 의해 측정한다. 리포솜 용액을 HEPES 25 mM 및 NaCl 150 mM (pH 7.4) 중에서 200 배 희석한다. 리포솜 크기 (즉, 유체역학적 직경) 는 약 230 nm (강도에 의한 분포) 이며, 다분산 지수 (PdI) 는 약 0.2 이다.

당업자에 의해 이해가능한 바, 목적하는 표면 전하를 선택된 지질 조성물 덕분에 수득하고, 그 값을 Zetasizer NanoZS (Malvern 기기) 를 사용해 제타 전위 측정으로 확인한다. 리포솜 용액을 1mM 및 pH 7 의 염화나트륨 용액 중에서 200 배 희석한다. 리포솜 표면 전하는 약 -70 mV 이다 (NaCl 1mM, pH 7).

Claims

치료, 예방 또는 진단 방법에서 약학 화합물을 필요로 하는 대상체에 사용되는, (i) 하나 이상의 생체적합성 나노입자 및 (ii) 하나 이상의 약학 화합물의 조합을 포함하는 약학 조성물로서, 이때 생체적합성 나노입자의 가장 긴 치수가 약 4 nm 내지 약 500 nm 이고, 생체적합성 나노입자의 절대 표면 전하 값이 |10 mV| 이상이고, 생체적합성 나노입자의 영 계수(Young modulus) 가 100 kPa 미만이고, 치료, 예방 또는 진단 방법이 하나 이상의 약학 화합물을 대상체에 투여하는 단계 및 하나 이상의 나노입자를 투여하는 별개의 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 나노입자를 대상체에 하나 이상의 약학 화합물의 이전 또는 이후 5 분 초과 내지 약 72 시간에 투여하고, 생체적합성 나노입자를 약학 화합물로서 그 자체로 사용하지 않는 약학 조성물.
제 1 항에 있어서, 나노입자가 10 mV 초과의 절대 표면 전하 값을 갖고, 상기 전하가 음전하인 약학 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 나노입자가 유기 나노입자인 약학 조성물.
제 3 항에 있어서, 나노입자가 지질-기재 나노입자, 단백질-기재 나노입자, 중합체-기재 나노입자, 공중합체-기재 나노입자, 탄소-기재 나노입자, 및 바이러스-유사 나노입자로부터 선택되는 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 생체적합성 코팅으로 추가 커버되는 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 생체적합성 나노입자 및 하나 이상의 약학 화합물의 병용 투여가, 임의의 나노입자의 부재 하의 표준 치료적 투여량의 상기 약학 화합물에 의해 유도되는 치료적 혜택 및 독성과 비교시, 대상체에 대해 감소된 독성을 위한 약학 화합물의 치료적 혜택을 유지하거나 또는 등가 또는 감소된 독성을 위한 약학 화합물의 치료적 혜택을 증가시키는 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 생체적합성 나노입자 및 하나 이상의 약학 화합물의 병용 투여가, 표준 치료적 투여량의 상기 약학 화합물과 비교시, 대상체에 대해 등가의 독성 또는 감소된 독성을 위한 동일한 치료적 혜택을 유지하거나 또는 대상체에 대해 등가 또는 감소된 독성을 위한 치료적 혜택을 증가시키면서 투여된 약학 화합물 치료적 투여량의 10% 이상의 감소를 가능하게 하는 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 항에 따른 목적하는 약학 화합물을 필요로 하는 대상체에 투여후 1 시간 및 6 주 내에 투여받았던 대상체로부터 하나 이상의 나노입자가 소거되는 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 약학 화합물이 바람직하게는 생물학적 화합물, 소분자 표적화 치료제, 종양세포붕괴성 바이러스, 및 세포독성 화합물로부터 선택되는 유기 화합물인 약학 조성물.
제 9 항에 있어서, 약학 화합물이 항체, 올리고뉴클레오티드, 및 합성 펩티드로부터 선택되는 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 약학 화합물이 금속성 나노입자, 금속 옥시드 나노입자, 금속 술파이드 나노입자 및 그 임의의 혼합물로부터 선택되는 무기 화합물인 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 약학 화합물이 담체 중에 캡슐화되는 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 약학 화합물이 담체에 결합되는 약학 조성물.