CN105462932A - 一种采用慢病毒技术构建的抗肿瘤迁移药物筛选细胞模型及其应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种表达绿色荧光蛋白的哺乳动物肿瘤细胞系的制备方法和应用，该细胞系与亲本细胞系相比具有类似的生长曲线，在细胞迁移实验中，HGF引起的细胞迁移效应显著，小分子特异性抑制剂对HGF引起的细胞迁移效应抑制效应显著，以上生物学活性与亲本细胞系一致。本发明制备的细胞模型，是将绿色荧光蛋白（GFP）基因通过慢病毒感染的方式插入哺乳动物肿瘤细胞系的基因组内，获得的稳定表达绿色荧光蛋白的细胞系，该细胞模型在细胞迁移实验中可以通过直接荧光显微镜观察的方式来显示实验结果，简化了该细胞模型应用于高通量药物筛选的步骤。

Description

一种采用慢病毒技术构建的抗肿瘤迁移药物筛选细胞模型及其应用方法
技术领域
本发明涉及药物筛选领域，具体涉及一种表达绿色荧光蛋白的Hep-G2细胞系。
背景技术
肿瘤已成为目前威胁人类健康的头号杀手，抗肿瘤药物的研发和肿瘤的临床治疗成为科研的热点，因此建立有效的抗肿瘤药物筛选模型刻不容缓，肿瘤本身特有的迁移性和侵袭性是肿瘤逃避机体免疫应答的重要机制，因此抑制肿瘤迁移性和侵袭性的药物备受人们关注。
高通量药物筛选技术是将多种技术方法有机结合而形成的新的技术体系，它以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理。它的正常开展需要有一个高容量的化合物库、自动化的操作系统、高灵敏度的检测系统、高效率的数据处理系统以及高特异性的药物筛选模型。
绿色荧光蛋白（GreenFluorescentProtein，简称GFP）的基因是从Aequoreavictoria水母的基因组中提取获得的，蛋白全长238AA，其65-67氨基酸残基（丝氨酸—酪氨酸—甘氨酸）可自发的形成荧光发色团，在蓝色波长范围的光线激发下，可以发出绿色荧光，吸收光谱的最大峰值为395nm，发射光谱最大峰值为509nm。如今GFP已作为报告基因被广泛应用于免疫学，神经生物学，遗传学，器官移植等各个领域。而在肿瘤相关的基础研究和药物研发领域，GFP也发挥了极大的作用。
目前在真核细胞转染和稳定细胞株构建领域，病毒载体正越来越受到重视。目前常用的病毒载体包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体和逆转录病毒载体等，其中逆转录病毒中的慢病毒载体因其表达的稳定性，包装容量大以及能够实现多基因共感染等优势被广泛使用于科研中。慢病毒感染能够将目的基因整合入细胞的基因组，所以不用再培养基中加入筛选压力就能稳定表达目的蛋白，大大简化了实验过程，降低了成本。
目前使用的慢病毒包装体系是由HIV病毒的基因组改造而成的。使用最广泛的为第三代慢病毒，是一种三质粒系统，能用于感染非分裂期的细胞。通过改造去除了不相关基因序列，并使用异源的部分基因代替同源基因（如：envelope-coding质粒）来增加其安全性，同时对启动子等序列进行修饰改造提高了病毒滴度和转染效率。最后通过改造得到了自身失活型慢病毒载体（self-inactivation,SIN）有着较高的滴度，转染效率和安全性。而病毒获得后除了能用于细胞的感染外，也能用于基因治疗。
原发性肝癌(primarycarcinomaofliver，以下简称肝癌)是我国常见的恶性肿瘤之一。在恶性肿瘤死亡顺位中占第2位，在城市中仅次于肺癌；农村中仅次于胃癌。Hep-G2细胞系来源于人类肝癌组织，是研究肝癌的常用细胞系。本发明使用慢病毒系统包装绿色荧光蛋白（GFP）基因，通过慢病毒感染Hep-G2细胞，获得稳定表达GFP的Hep-G2细胞株。这一细胞株的建立大大简化了体外药物筛选的检测手段，同时可以应用于药物对动物肿瘤模型的疗效方面的研究，实现肿瘤大小和分布的实时监控和数据收集。。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能高通量筛选抗细胞迁移药物的细胞模型。
解决本发明技术问题的技术方案为：一种筛选抗细胞迁移药物的细胞模型，是通过慢病毒将绿色荧光蛋白基因转入到Hep-G2细胞系的基因组内，获得的稳定表达绿色荧光蛋白的Hep-G2细胞株。
其中，上述细胞模型中的GFP基因能够稳定表达。
其中，上述细胞模型中的GFP序列为SEQIDNO:1。
本发明还提供了一种制备上述筛选抗细胞迁移药物细胞模型的方法，该方法包括以下步骤：将GFP基因克隆至prrl质粒内，构建成prrl-CMV-GFP重组质粒，将该质粒和慢病毒包装质粒共转染对数期的293T细胞，收获纯化病毒，病毒感染对数期Hep-G2细胞，经有限稀释法和荧光筛选，获得本发明所述的细胞模型。
本发明还提供了一种抗细胞迁移药物的筛选方法，该方法包括以下步骤：
a．取上述的用于筛选抗细胞迁移药物的Hep-G2细胞模型接种于transwell小室的上室，筛选组的上室加入含待筛选物的维持培养基，下室加入含HGF的维持培养基；阳性对照组上室为维持培养基，下室加入含HGF的维持培养基；阴性对照组上室和下室均为维持培养基；
b．培养各组细胞，计数各组迁移细胞数量，根据细胞迁移数的多少确定待筛选物是否为需要的潜在药物，其中，上述的抗细胞迁移药物筛选方法的细胞迁移数为从上室迁移至下室的细胞数量。
根据本发明的第一个方面，在仔细分析不同感染技术的基础上，选择慢病毒包装系统来制备稳定表达绿色荧光蛋白的Hep-G2细胞株。本发明细胞模型中含有整合到基因组上的GFP基因的编码序列，且该序列能够稳定表达。该细胞模型通过检测荧光信号来直接进行细胞计数，简化了细胞迁移实验的步骤和流程，为实现抗细胞迁移药物高通量筛选奠定基础。
根据本发明的第二个方面，建立了制备上述筛选抗细胞迁移药物的细胞模型的方法。该方法具体可通过以下步骤实施：
将Hep-G2细胞培养至对数生长期；
将装载有GFP基因的慢病毒在polybrene的介导下感染Hep-G2细胞；
经有限稀释法和荧光显微镜筛选得到本细胞模型。
根据本发明的第三个方面，建立起了以本发明细胞模型为基础的抗细胞迁移药物筛选方法，步骤如下：
a．取上述的用于筛选的细胞模型接种于transwell小室内，细胞接种数目为2.5×104/孔-2×105/孔，优选为5×104/孔。分组为筛选组、阳性对照组和阴性对照组。其中筛选组的上室加入含待筛选物的维持培养基，下室加入含HGF的维持培养基；阳性对照组上室为维持培养基，下室加入含HGF的维持培养基；阴性对照组上室和下室均为维持培养基。
b.细胞孵育4-24h，优选为24h，细胞固定后，无菌棉签擦掉上室细胞，荧光显微镜下计数小室下表面4个固定视野区域的迁移细胞总数，根据迁移细胞数量确定待筛选物是否为需要的潜在药物。
其中，上述方法步骤a中加入的HGF的用量为12.5ng/ml-200ng/ml，优选为100ng/ml。
本发明中涉及的常规细胞培养及常规分子生物学的试验操作，都是本领域普通技术人员参考现有的相关试验指南或仪器、试剂的使用说明能够完成的。
本发明的有益效果在于：本发明细胞模型通过荧光显微镜可以直接观察迁移细胞数，能够高通量、高灵敏的准确筛选抗细胞迁移药物；本发明细胞模型的制备方法简单可控，成本低廉；本发明抗细胞迁移药物筛选方法步骤简单，成本低廉，准确性高，可实现高通量的筛选，具有很好的稳定性和可靠性。为抗细胞迁移药物的筛选提供了新的思路，具有很好的市场前景。
附图说明
图1：prrl-CMV-GFP重组质粒的酶切电泳图。
图2：Hep-G2-GFP细胞系稳定性分析。其中第1代和第30代分别指第1代和第30代Hep-G2-GFP细胞系，明场是指明场下细胞照片，荧光场是指荧光场下细胞照片。
图3：Hep-G2-GFP细胞系与野生型Hep-G2细胞系生长曲线比较。其中横坐标为细胞生长时间（培养时间），纵坐标为450nm单波长条件下测定的光度吸收值（波长450nm）。
图4：Hep-G2-GFP细胞系与野生型Hep-G2细胞系在HGF作用下细胞迁移结果分辨率；
A为明场条件下HGF作用下Hep-G2-GFP细胞系迁移照片；
B为荧光场条件下HGF作用下Hep-G2-GFP细胞系迁移照片，A与B为同一区域不同光场下照片；
C为荧光场条件下无HGF作用下Hep-G2-GFP细胞系迁移照片；
D为明场下野生型Hep-G2细胞系在HGF作用下细胞迁移照片（经结晶紫染色）；
B与A比较，细胞分辨率明显升高，B与D比较，细胞分辨率没有显著差异，证明Hep-G2-GFP细胞系在无需染色的情况下即可达到野生型Hep-G2细胞系经结晶紫染色后的细胞分辨率。
图5：Hep-G2-GFP细胞系与野生型Hep-G2细胞系在HGF作用下细胞迁移效应比较。其中横坐标为不同细胞系名称，纵坐标为细胞迁移率（迁移率）。Hep-G2-GFP细胞系与野生型Hep-G2细胞系比较，在HGF作用下细胞迁移效应更加显著，证明Hep-G2-GFP细胞系具有良好的生物学活性，对照为不含HGF对照组。
图6：Hep-G2-GFP细胞系在不同浓度HGF作用下的细胞迁移效应及细胞活性；
A为Hep-G2-GFP细胞系在不同浓度HGF作用下的细胞迁移数量，其中横坐标为HGF浓度（HGF:ng/ml），纵坐标为迁移细胞数量（细胞数量）；
B为Hep-G2-GFP细胞系在不同浓度HGF作用下的细胞活性，其中横坐标为HGF浓度（HGF:ng/ml），纵坐标为450nm单波长条件下测定的光度吸收值（波长450nm）。
图7：Hep-G2-GFP细胞系在不同浓度PF04217903作用下的细胞迁移效应及细胞活性；
A为Hep-G2-GFP细胞系在不同浓度PF04217903作用下的细胞迁移数量，其中横坐标为PF04217903浓度（PF04217903:μM），纵坐标为迁移细胞数量（细胞数量），对照为不含HGF，不含PF04217903对照组，其他各组均含有100ng/ml的HGF；
B为Hep-G2-GFP细胞系在不同浓度PF04217903作用下的细胞活性：其中横坐标为PF04217903浓度（PF04217903:μM），纵坐标为450nm单波长条件下测定的光度吸收值（波长450nm）。
图8：不同细胞接种数量对细胞迁移效应的影响；
A为不同细胞接种数量对细胞迁移率的影响，其中横坐标为Hep-G2-GFP细胞系每孔铺板细胞数（铺板细胞数量），纵坐标为细胞迁移率（迁移率），对照为不含HGF对照组；
B为不同细胞接种数量对细胞迁移数量的影响，其中横坐标为Hep-G2-GFP细胞系每孔铺板细胞数，纵坐标为迁移细胞数量（细胞数量）。
图9：不同孵育时间对细胞迁移效应的影响；
A为不同孵育时间对细胞迁移率影响，其中横坐标为Hep-G2-GFP细胞系不同孵育时间（孵育时间），纵坐标为细胞迁移率（迁移率），对照为不含HGF对照组；
B为不同孵育时间对细胞迁移数量影响，其中横坐标为Hep-G2-GFP细胞系不同孵育时间（孵育时间），纵坐标为迁移细胞数量（细胞数量）。
图10：不同浓度DMSO对细胞迁移效应和细胞活性的影响；
A为不同浓度DMSO对细胞迁移数量的影响，其中横坐标为不同浓度（体积比）DMSO（DMSO:浓度），纵坐标为迁移细胞数量（细胞数量），对照为含HGF（100ng/ml），不含DMSO对照组；
B为不同浓度DMSO对细胞活性的影响，其中横坐标为不同浓度DMSO（DMSO:浓度），纵坐标为450nm单波长条件下测定的光度吸收值（波长450nm）。
具体实施方式
药品与试剂：各种限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶购自NEB公司，胶回收试剂盒、小量质粒抽提试剂盒购自MN公司；转染试剂M40为实验室自主制备；DMEM培养基，抗生素，胰酶，D-PBS购自hyclone公司，胎牛血清购自GIBCO公司；HGF，PF04217903购自RD公司，CCK-8试剂盒购自Dojindo公司；其他试剂均为进口和国产分析纯试剂。
仪器：倒置荧光显微镜Ti，尼康公司。
本发明的高效表达细胞模型可稳定表达绿色荧光蛋白，因此可以在荧光显微镜下直接观察。
实施案例一绿色荧光蛋白（GFP）基因载体的选择
绿色荧光蛋白（GreenFluorescentProtein，简称GFP）的基因是从Aequoreavictoria水母的基因组中提取获得的，蛋白全长238AA，其65-67氨基酸残基（丝氨酸—酪氨酸—甘氨酸）可自发的形成荧光发色团，在蓝色波长范围的光线激发下，可以发出绿色荧光，吸收光谱的最大峰值为395nm，发射光谱最大峰值为509nm。如今GFP已作为报告基因被广泛应用于免疫学，神经生物学，遗传学，器官移植等各个领域。而在肿瘤相关的基础研究和药物研发领域，GFP也发挥了极大的作用。
本发明中使用慢病毒表达载体prrl-CMV作为GFP的表达载体，制备方法使用现有的公认技术，其中GFP的CDNA序列为SEQIDNO.1所示。
实施案例二装载GFP基因的慢病毒的包装和纯化
在真核细胞转染和基因治疗领域，病毒载体正越来越受到重视。目前常用的病毒载体包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体和逆转录病毒载体等，其中逆转录病毒中的慢病毒载体因其表达的稳定性，包装容量大以及能够实现多基因共感染等优势被广泛使用于科研中。慢病毒感染能够将目的基因整合入细胞的基因组，所以不用再培养基中加入筛选压力就能稳定表达目的蛋白，大大简化了实验过程，降低了成本。因此本发明使用慢病毒包装、感染的方法获得最终的稳定转染细胞株。
目前使用的慢病毒包装体系是由HIV病毒的基因组改造而成的。使用最广泛的为第三代慢病毒，是一种三质粒系统，能用于感染非分裂期的细胞。通过改造去除了不相关基因序列，并使用异源的部分基因代替同源基因（如：envelope-coding质粒）来增加其安全性，同时对启动子等序列进行修饰改造提高了病毒滴度和转染效率。最后通过改造得到了自身失活型慢病毒载体（self-inactivation,SIN）有着较高的滴度，转染效率和安全性。而病毒获得后除了能用于细胞的感染外，也能用于基因治疗。
本发明中以人肾上皮细胞（293T）为受体细胞进行慢病毒的包装。
使用prrl-CMV-GFP为重组包装质粒。
使用的包装质粒为pMD2.G，pMD-PRRE和pRSV-REV。
试验过程如下：
（1）细胞培养
用含抗生素和10%血清的完全DMEM培养基接种细胞于35mm细胞培养皿，细胞浓度为6×105/孔。待细胞完全贴壁后，用转染试剂M40进行转染。
（2）转染过程
DNA和转染试剂混合物的配制
A溶液：
prrl-CMV-GFP1.7μg
包装质粒混合物1.8μg
无血清无抗生素DMEM培养基补充至100μl，震荡混匀。
B溶液：
转染试剂16μl
无血清无抗生素DMEM培养基补充至100μl，轻柔混匀。
将A液与B液轻柔混匀，室温静置10min，将混合液加入到细胞中。37℃，5%CO2培养箱内培养，次日换为含血清含抗生素的DMEM培养基。
（3）慢病毒的收集和纯化
收集转染后第4天和第5天的细胞上清，将第四天和第五天收集的病毒液4000g，室温离心10min；离心后的病毒液经0.45μm滤膜过滤后转入超滤管内（ufc910024，MILLIPORE），常温，4000g，离心15min；收集病毒浓缩液，分装，冻存于-80度。
实施案例三本发明细胞模型的建立
在本实验中使用人肝癌细胞（Hep-G2）为受体细胞。
使用的慢病毒为装载GFP基因的慢病毒。
试验过程如下：
（1）细胞培养
用含抗生素和10%血清的完全DMEM培养基接种细胞于35mm细胞培养皿，细胞浓度为6×105/孔。待细胞完全贴壁后，用转染试剂M40进行转染。
（2）感染过程
慢病毒用完全DMEM培养基（含6μg/mlpolybrene）稀释至合适倍数后，加入到弃去上清的Hep-G2细胞表面；慢病毒感染24h后，换用含抗生素和10%血清的完全DMEM培养基继续培养。
（3）细胞克隆化
取饲养细胞。实验小鼠脱臼致死，75%酒精浸泡10min，无菌解剖，剪开腹部皮肤，不要损伤腹膜，用注射器吸取6-8ml完全培养基，用镊子夹起腹膜，进针，注意不要戳到内脏和脂肪，进针方位可以在腹部中间，避开腹部下方的脂肪。
反复吹打腹腔数次，期间用酒精棉球轻揉小鼠腹部，待吸出培养基变黄时将培养基吸出，转移到离心管内备用。（一只成年小鼠的腹腔巨噬细胞可以满足6-8块96孔细胞培养板的铺板需要）。
取感染后Hep-G2细胞，消化，计数，每20ml培养基（含相应浓度的饲养细胞）加入150个细胞，分96孔板，200μl/孔。
细胞培养1天后观察是否有污染，培养3-5天后计数细胞亚克隆数目，并做记录。细胞培养10天，选择单克隆细胞孔在荧光显微镜下进行观察，选择发绿色荧光的细胞克隆进行消化和扩大培养。
实施案例四阳性克隆细胞的筛选和细胞迁移体系建立
由于外源基因随机整合到宿主细胞的染色体上，根据整合位点的随机性，可能存在宿主细胞状态差、对信号分子反应弱和目的基因表达稳定性差等问题。因此将所有挑出的阳性克隆细胞扩大培养后，进行细胞生长曲线对比试验和GFP表达稳定性分析。
试验例一GFP表达稳定性分析
在本实验中共筛选得到了4个阳性克隆。对这4个阳性克隆进行连续传代培养，连续传代培养试验方案：细胞汇合度达到80%时，弃去细胞上清，用D-PBS洗涤一遍，加入适量胰酶进行消化，倒置显微镜下观察，待大部分细胞变为圆形时使用有血清有抗生素的完全DMEM培养基终止消化，吹下细胞，1000rpm离心10分钟，留1/4的细胞在原培养体系中继续培养，待细胞汇合度达到80%时重复上述操作。
每传代5次，荧光显微镜下观察荧光细胞的比例和细胞的荧光强度，拍照记录。结果如图2所示：Hep-G2-GFP细胞系在第30代时其荧光率仍然保持100%，证明Hep-G2-GFP细胞系具有良好的稳定性。
试验例二本发明细胞模型与野生型细胞生长曲线比较
从上部试验筛选获得的4株细胞中选择细胞生长状态最好的1株，对这株细胞与野生型Hep-G2细胞进行扩大培养，待细胞数量达到一定规模时进行生长曲线分析。生长曲线分析试验方案：细胞汇合度达到80%时进行细胞消化和计数，按照1.5×103/孔的细胞密度铺板96孔细胞培养板，每组设立3个复孔，使用有血清有抗生素的完全DMEM培养基进行培养，每孔200μl，分别在24h，48h，72h，96h，120h和144h进行细胞活力分析，具体步骤为：弃去细胞上清，加入含10%CCK-8试剂的无血清无抗生素DMEM培养基100μl，37℃，5%CO2培养箱内孵育2h后，取出细胞，在酶标仪OD450条件下进行读数，对结果进行分析，结果如图3所示：Hep-G2-GFP细胞系与野生型Hep-G2细胞系生长曲线基本一致，证明Hep-G2-GFP细胞系具有良好的生长活性。
试验例三本发明细胞模型与野生型细胞在HGF作用下细胞迁移效应比较
试验例一和试验例二证明我们筛选获得的细胞模型GFP稳定性好，生长曲线与野生型一致，是良好的稳转细胞株。
试验例三从生物学活性角度分析本发明细胞模型是否具有由HGF引起的细胞迁移效应，以及这种效应与野生型Hep-G2细胞的比较。HGF是肝细胞生长因子，其能够促进野生型Hep-G2细胞的细胞迁移效应。
细胞迁移效率计算公式为：
细胞迁移效率=给药孔的迁移细胞数÷不含药孔的迁移细胞数
其中不含药孔的细胞迁移效率定为1.0。
试验方案：
1）细胞分孔：细胞汇合度达到80%时进行细胞消化和计数，将细胞用低血清（1%FBS）DMEM培养基稀释至目标浓度，加入小室内，0.5ml/well，5×104cell/well，贴壁培养；
2)加药：加入含100ng/ml浓度的HGF至小室下层，HGF使用低血清（1%FBS）DMEM培养基进行稀释，0.75ml/well；
3)培养：37℃，5%CO2培养箱内孵育24h；
5)洗涤：取出小室，弃去培养基，PBS0.5ml。1time，RT；
6)固定：小室内加入甲醛，0.5ml，10min，RT；
7)擦拭：取出小室，用棉签擦掉小室上层细胞，并用PBS淋洗一次；
8)染色：结晶紫染色液置于24孔板0.5ml，将小室置于其中，>30min，RT（步骤8-9为野生型Hep-G2细胞操作步骤，本发明细胞模型无需染色，直接在荧光显微镜下观察）
9)洗涤：大量自来水置于500ml烧杯中，漂洗小室；
10)成像计数：显微镜下成像，计数。
结果分析
结果如图4和图5所示：
A为明场条件下HGF作用下Hep-G2-GFP细胞系迁移照片；
B为荧光场条件下HGF作用下Hep-G2-GFP细胞系迁移照片，图A与图B为同一区域不同光场下照片；
C为荧光场条件下无HGF作用下Hep-G2-GFP细胞系迁移照片；
D为明场下野生型Hep-G2细胞系在HGF作用下细胞迁移照片（经结晶紫染色）；
图5为Hep-G2-GFP细胞系与野生型Hep-G2细胞系在HGF作用下细胞迁移效应比较；
B与A比较，细胞分辨率明显升高，B与D比较，细胞分辨率没有显著差异，证明Hep-G2-GFP细胞系在无需染色的情况下即可达到野生型Hep-G2细胞系经结晶紫染色后的细胞分辨率。
图5：Hep-G2-GFP细胞系与野生型Hep-G2细胞系比较，在HGF作用下细胞迁移效应更加显著，证明Hep-G2-GFP细胞系具有良好的生物学活性。
试验例四Hep-G2-GFP细胞系在不同浓度HGF作用下的细胞迁移效应及细胞活性分析
试验例一和试验例二证明我们筛选获得的细胞模型GFP稳定性好，生长曲线与野生型细胞一致，是良好的稳转细胞株。试验例三从生物学活性角度分析本发明细胞模型具有与野生型Hep-G2细胞一致的对HGF敏感的细胞迁移效应。
试验例四通过加入不同浓度的HGF，分析不同浓度HGF引起的细胞迁移效应以及细胞活性分析。
细胞迁移效应试验方案：分别在小室下部加入不同浓度的HGF。
细胞活性分析试验方案：细胞汇合度达到80%时进行细胞消化和计数，按照5×103/孔的细胞密度铺板96孔细胞培养板，每组设立3个复孔，使用含1%FBS的DMEM培养基进行培养，每孔200μl，次日加入含不同浓度HGF的1%FBS的DMEM，加药后72h时进行细胞活力分析，具体步骤为：弃去细胞上清，加入含10%CCK-8试剂的无血清无抗生素DMEM培养基100μl，37℃，5%CO2培养箱内孵育2h后，取出细胞，在酶标仪OD450条件下进行读数，对结果进行分析，
结果如图6所示：
A为Hep-G2-GFP细胞系在不同浓度HGF作用下的细胞迁移数量，其中横坐标为HGF浓度（HGF:ng/ml），纵坐标为迁移细胞数量（细胞数量）。HGF浓度在100ng/ml时Hep-G2-GFP细胞系的细胞迁移效应最显著，因此选择此浓度建立抗细胞迁移药物筛选方法。
B为Hep-G2-GFP细胞系在不同浓度HGF作用下细胞活性，其中横坐标为HGF浓度（HGF:ng/ml），纵坐标为450nm单波长条件下测定的光度吸收值（OD450）。Hep-G2-GFP细胞系在不同浓度HGF作用下的细胞活性无变化，证明HGF对Hep-G2-GFP细胞系增殖活性没有影响。
试验例五Hep-G2-GFP细胞系在不同浓度PF04217903作用下的细胞迁移效应及细胞活性分析
试验例一和试验例二证明我们筛选获得的细胞模型GFP稳定性好，生长曲线与野生型细胞一致，是良好的稳转细胞株。试验例三从生物学活性角度分析本发明细胞模型具有与野生型Hep-G2细胞一致的对HGF敏感的细胞迁移效应。
试验例五通过加入HGF抑制剂PF04217903，分析PF04217903对HGF引起细胞迁移效应的抑制效应。PF04217903是一种选择性的，ATP竞争性c-Met抑制剂，IC50为4.8nM。
细胞迁移效应试验方案：分别在小室上部加入不同浓度的PF04217903，小室下部加入100ng/ml的HGF。对照为不含HGF，不含PF04217903对照组。
细胞活性分析试验方案：参照试验例四步骤，分别加入不同浓度的PF04217903和100ng/ml的HGF。对照为不含HGF，不含PF04217903对照组。
结果如图7所示：
A为Hep-G2-GFP细胞系在不同浓度PF04217903作用下的细胞迁移数量，其中横坐标为PF04217903浓度（PF04217903:μM），纵坐标为迁移细胞数量（细胞数量），对照为不含HGF，不含PF04217903对照组。其他各组均含有100ng/ml的HGF。HGF浓度在100ng/ml时，不同浓度PF04217903对HGF引起的Hep-G2-GFP细胞系的细胞迁移效应完全抑制。
B为Hep-G2-GFP细胞系在不同浓度PF04217903作用下的细胞活性，其中横坐标为PF04217903浓度（PF04217903:μM），纵坐标为450nm单波长条件下测定的光度吸收值（OD450）。Hep-G2-GFP细胞系在不同浓度PF04217903和100ng/ml的HGF共同作用下的细胞活性无变化，证明PF04217903对Hep-G2-GFP细胞系增殖活性没有影响。
试验例六基于上述细胞模型的药物筛选方法的确定
（1）细胞接种密度
为了检验不同细胞接种密度对抗细胞迁移药物筛选体系的影响，寻求一个最适的细胞接种密度。分别接种2.5×104，5×104，1×105，2×105/孔的细胞于transwell小室，每组设3个重复。参照试验例三的细胞迁移试验方法进行试验操作，分析细胞迁移效率。
试验结果如图8所示：
A图显示细胞接种密度为2.5×104和5×104时，细胞迁移效率明显高于1×105和2×105，B图显示5×104组迁移细胞数量明显高于2.5×104组，综合考虑，选择5×104/孔作为筛选体系的细胞接种密度。
（2）细胞孵育时间
为了检验不同细胞孵育时间对抗细胞迁移药物筛选体系的影响，寻求一个最适的细胞孵育时间。分别在细胞接种4，6，8，10，24h后进行迁移细胞计数，每组设3个重复。参照试验例三的细胞迁移试验方法进行试验操作，分析细胞迁移效率。
试验结果如图9所示：
A图显示细胞孵育时间为24h时，细胞迁移效率高于其他组，B图显示细胞孵育时间为24h时，迁移细胞数高于其他组，综合考虑，选择24h作为筛选体系的细胞孵育时间。
（3）不同浓度DMSO对药物筛选方法的影响
抗细胞迁移药物可能溶于DMSO。因此有必要检测不同浓度DMSO对药物筛选方法的影响。
细胞迁移效应试验方案：分别在小室上部加入不同浓度的DMSO，小室下部加入100ng/ml的HGF。对照为不含HGF，不含DMSO对照组。
细胞活性分析试验方案：参照试验例四步骤，分别加入不同浓度的DMSO和100ng/ml的HGF。对照为不含HGF，不含DMSO对照组。
试验结果如图10所示：
A图显示不同浓度的DMSO对HGF引起的细胞迁移效率没有显著影响，B图显示DMSO浓度为0.5%时，细胞活性略有下降，DMSO浓度为1%和2%时，细胞活性显著下降，考虑到加药浓度，筛选体系最终含有的DMSO浓度不会高于0.1%，因此DMSO对筛选体系没有显著影响。
SEQUENCELISTING
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atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggac60
ggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctac120
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gaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccac600
tacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtc660
ctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa720

Claims (7)

1.一种筛选抗肿瘤迁移药物的细胞模型，其特征在于：所述细胞模型是克隆了GFP基因的哺乳动物肿瘤细胞；所述哺乳动物肿瘤细胞可选但不限于HepG2、MCF-7、U-87-MG、MDA-MB-231中的一种。
2.根据权利要求1所述的用于筛选抗肿瘤迁移药物的细胞模型，其特征在于：所述GFP基因能够稳定表达。
3.根据权利要求1所述的用于筛选抗肿瘤迁移药物的细胞模型，其特征在于：所述GFP基因序列为SEQIDNO:1。
4.根据权利要求1所述的用于筛选抗肿瘤迁移药物的细胞模型，其特征在于：所述细胞模型由慢病毒系统制备完成，包括以下步骤：将GFP基因克隆至prrl质粒内，构建成prrl-CMV-GFP重组质粒，将该质粒和慢病毒包装质粒共转染对数期的293T细胞，收获纯化病毒，病毒感染对数期细胞，经有限稀释法和荧光筛选，获得本发明所述的细胞模型。
5.根据权利要求1所述的用于筛选抗肿瘤迁移药物的细胞模型，其特征在于与亲本细胞系相比具有类似的生长曲线。
6.根据权利要求1所述的用于筛选抗肿瘤迁移药物的细胞模型，其特征在于在细胞迁移实验中，HGF引起的细胞迁移效应显著，特异性小分子抑制剂对HGF引起的细胞迁移效应抑制效应显著，以上生物学活性与亲本细胞系一致。
7.一种细胞迁移筛选模型的方法，其特征在于包括以下步骤：
a．取上述的用于筛选的细胞模型接种于transwell小室内，其中筛选组的上室加入含待筛选物的维持培养基，下室加入含促细胞迁移药物的维持培养基；
b.细胞孵育4-24h，细胞固定后，无菌棉签擦掉上室细胞，荧光显微镜下计数小室下表面4个固定视野区域的迁移细胞总数，根据迁移细胞数量确定待筛选物是否为需要的潜在药物。
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