JP2007195440A - バキュロウイルスベクターを利用したhiv感染症治療薬 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】HIVウイルスタンパク質の産生を抑制し得る核酸およびp35をコードする核酸を含む発現ベクター、ならびにHIVウイルスタンパク質の産生を抑制し得る核酸およびp35をコードする核酸を含む発現ベクターを含有するHIV感染症治療薬を提供する。発現ベクターは、好ましくはバキュロウイルスベクターであり得る。HIVウイルスタンパク質の産生を抑制し得る核酸としては、例えば、リボザイム、RNAアプタマー、アンチセンス核酸、RNAi誘導性核酸などが挙げられる。
【選択図】なし
Description
Geleziunas et al., Nature 410: 834-838 (2001)
〔1〕HIVウイルスタンパク質の産生を抑制し得る核酸およびp35をコードする核酸を含む、発現ベクター。
〔2〕バキュロウイルスベクターである、上記〔1〕の発現ベクター。
〔3〕HIVウイルスタンパク質の産生を抑制し得る核酸が、リボザイム、アンチセンス核酸、RNAi誘導性核酸、RNaseP、tRNaseZL、RNAアプタマーからなる群より選択される、上記〔1〕の発現ベクター。
〔4〕HIVウイルスタンパク質の産生を抑制し得る核酸の標的が5’−LTRのU5領域である、上記〔1〕〜〔3〕のいずれかの発現ベクター。
〔5〕VSV−Gをコードする核酸をさらに含む、上記〔1〕の発現ベクター。
〔6〕HIVウイルスタンパク質の産生を抑制し得る核酸およびp35をコードする核酸を含む発現ベクターを含有する、医薬。
〔7〕HIVウイルスタンパク質の産生を抑制し得る核酸およびp35をコードする核酸を含む発現ベクターを含有する、HIV感染症治療薬。
細胞内RNAの抽出(Gene Elute mammalian total RNA miniprep kit)
(1)RNA抽出細胞溶解液は、Gene Elute mammalian total RNA miniprep kit(SIGMA)のLysis solution:2-Mercaptoethanol = 100:1で混合した。なお、用事調製した。
(2)Plasmid DNAをトランスフェクトした細胞を1×PBSで洗浄した。本操作は、2回繰り返した。
(3)1サンプルにつきRNA抽出細胞溶解液(500μl)を加え、室温で2minインキュベートした後、マイクロピペットにより細胞を回収し、サンプルごとにFiltration column tubeに移し、12000rpm、2min遠心し、不純物を除去した。
(4)Filtration columnを除去し、70%エタノールをRNA抽出細胞溶解液と等量(500μl)加えてよく撹拌して、RNA binding column tubeにすべて移し、13000rpm、15sec遠心する事によりカラムにRNAを吸着させた。
(5)RNA binding columnを新しいtubeに移し、Wash solution 1(500μl)を加えて、13000rpm、15sec遠心しカラムに通した後、溶液を破棄した。
(6)RNA binding columnを新しいtubeに移し、Wash solution 2(500μl)を加えて、13000rpm、15sec遠心しカラムに通した後、溶液を破棄した。本操作を2回繰り返した。
(7)RNA binding columnを新しいtubeに移し、Elution Solution(50μl)を加えて、13000rpm、1min遠心してRNAを抽出した。
回収したRNA(1ng)を鋳型として反応溶液(RNA:1ng, primer: 各20pmol, 5×RT buffer, dNTPs: 0.75μM, MgSO4: 6.25 mM, RNase Inhibitor, 1 Unit, rTth DNA polymerase: 0.5 Unit)(TOYOBO Co.)を作成した。このサンプルをサーマルサイクラーにセットし、60℃:30 min, 94℃: 2 min、94℃: 15 sec, x℃: 30 sec, 68℃: Y min 30〜40 サイクル, 68℃: 7 min, 4℃でRT-PCR 反応を行い、得られた溶液6μl を用いて1.0% Agarose電気泳動法により確認した。
LTR-RZ: TCACACAACACTGATGAGGC(配列番号1)(Length 46, Tm 60℃)
GTGTGCCCGTTTCGGCCTAACG(配列番号2)
HIV-1 RNA: GGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATA(配列番号3)(Length 205, Tm 60℃)
TTCAGCAAGCCGAGTCCTGC(配列番号4)
先ず、ピッカジーンの発光基質(粉末)(Toyo-inki, Tokyo, Japan)を緩衝液(Toyo-inki)と混合し、ルシフェラーゼ発光量測定機(ルミノメーター)にセットした。次いで、細胞溶解液により回収した細胞内タンパク質(10μl)を専用チューブに加え、ルミノメーターで測定した。
Huh-7細胞(105細胞/ディッシュ)にバキュロウイルスをMOI 100で感染させ、感染24時間後に細胞のみを遠心分離(1,500rpm, 5分)により回収した。細胞に-20℃エタノールを2ml注ぎ、-20℃で4時間インキュベートした。4時間後、遠心分離(1,500rpm, 5分)し、上清中のエタノールを除去した。PCB溶液を100μl添加し、室温で30分間放置した。RI-RNase溶液を1ml添加し、室温で20分間放置し、Flow cytometryにより非アポトーシス細胞の検出を行った。
HIV-1ゲノムRNAの両端には逆転写などに関与するウイルス転写制御配列であるLTRが存在する(図1)。LTRは転写開始部位、終結部位を有し、LTR間の遺伝子を発現させる。構造タンパク質群にはカプシド形成などに関与するgag、ウイルスゲノム修飾・輸送に関与するpol及びenvが存在する。その他、アクセサリータンパク質群としてvif、vpr、vpu、rev、tatまたはnefが存在するが、これらは細胞機能の調製、ウイルスタンパク質の発現制御など多くの機能を有しており、ウイルスの増殖制御には不可欠である。
抗HIV-1遺伝子の選択において、基本的にはどの領域を狙ってもウイルスゲノムRNAまたはmRNAを切断することでHIV-1の発現を阻害することが可能であると予想される。HIV-1遺伝子は全てLTRから転写が誘導されタンパク質に翻訳される。HIV-1には多くの遺伝子群が存在するが、これらは個々に開始コドンを有しており、それぞれが単体で発現する。このために、転写されたウイルスmRNAはスプライシングを起こし、それぞれの遺伝子のmRNAとなる。このスプライシングにはスプライシングドナー(SD)が関与していることが確認されている。つまり、SDより上流の配列をターゲットにすることにより、全ての遺伝子群の阻害が可能であり、遺伝子レベルでの抑制に比べ抑制効果が上昇することが予想される。SD配列はLTRとパッケージングシグナルとの中間に位置する。このSDより前方に位置するU5領域中の558〜580番目の塩基からなる遺伝子を標的遺伝子とするリボザイムLTR-Rz(図3)を設計し、その抗HIV-1タンパク質発現抑制効果を試験したところ、良好な結果が得られた。そこで、このLTR-Rzを以下の実験で使用した。
バキュロウイルスベクターを媒介とした遺伝子発現を行うことで、さらに高い抑制効果が得られるかどうかについて検討を行うため、バキュロウイルストランスファーベクターを構築した。
先ず、HIV-1 LTR U5の558-580残基を標的部位とするリボザイムを発現し (図3)、かつpSV2neoを基盤とするベクターであるpL6-LTR-Rz(Habu et al., Antivir Chem Chemother. 2002, 13: 273-81)(図4)から、EcoR IおよびBamH Iを用いて、tRNAmetプロモーターおよびターミネーターを含むリボザイム発現ユニットを切り出し、精製した。同時に、コントロールベクターとしてのリボザイム非発現ユニット(tRNAmet-terminator)も同様の方法で切り出した。これらのDNAフラグメントをpVL1393 MCS(BD Biosciences Clontech, NJ)(図5)のEcoR IおよびBamH Iサイトに挿入し、バキュロウイルストランスファーベクターpAc/LTR-Rz(図6)、pAc/L6-ter(図7)を作製した。さらに、pMD.G(BD Biosciences Clontech)よりBamH Iを用いてVSV-Gを切り出し・精製後、構築した2種のベクターのBamH Iサイトに挿入し、バキュロウイルストランスファーベクターpAcVSV-G/LTR-Rz(図8)、pAcVSV-G/L6-ter(図9)を作製した。
構築が確認された4種類のトランスファーベクター(pAc/L6-ter、pAcVSV-G/L6-ter、pAc/LTR-Rz及びpAcVSV-G/LTR-Rz)をバキュロウイルスゲノムDNAと共にSf9細胞に導入し、組換えウイルスを作成した。ウイルスを含んだ培養上清を回収し、超遠心(25000 rpm、60 min)を行い、200倍濃縮ウイルス液を作成した。得られた濃縮ウイルス液を0.45μmフィルターで精製し、精製ウイルス溶液とした。この精製ウイルス液のウイルス力価をプラークアッセイ法により測定した。結果を以下の表1に示す。
精製されたウイルス粒子内にVSV-Gが取り込まれているかを確認するため、クーマシー・ブリリアント・ブルー(CBB)染色及びウエスタンブロット法を用いて、ウイルス粒子を解析した。詳細には、ウイルス力価が算出された各ウイルス(1×107 PFU)を10% SDS-PAGEで直接電気泳動を行い、得られたPAGEをCBBにより染色した。さらに、メンブレンに転写後、抗AcMNPV抗体および抗VSV-G抗体によりウエスタンブロッティングを行った。
CBB染色の結果、VSV-G(-)ウイルスでは、野生型ウイルスと同様のウイルス構成タンパク質であることが確認され、VSV-G(+)ウイルスでは、野生型と比較して異なった傾向を示した(図10)。これによりウイルス粒子内へのVSV-Gの取込みが予想された。また、抗VSV-G抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果、VSV-G特異的なフラグメントがVSV-G(+)ウイルスのみ検出された(図11)。さらに、抗AcMNPV抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果、全てのウイルスにおいてGp64およびVp39の検出が確認できた(図11)。
以上より、作成した組換えウイルスの構築が確認された。
本実験では、各種組換えウイルスをHeLa CD4+細胞に感染させ、同時にpNL-4-3-Lucを導入することで、抗HIV-1タンパク質発現の抑制効果を検討した。先ず、4種のウイルスをMOI 50でHeLa CD4+細胞に感染させ、pNL-4-3-Luc(0.5μg)をFuGENE6により導入した。次いで、導入2日後の細胞内Luc量をルミノメーターにより測定し、HIV-1タンパク質発現の抑制効果を検討した。
その結果、LTR-Rzを発現しない全ての系では抑制効果が得られなかったのに対し、LTR-Rzを発現させた系では、大幅な抑制効果が得られた(図12)。また、AcVSV-G/LTR-Rzでは、Ac/LTR-Rzと比較し、その効果は増大し、約90%の抑制効果を示した(図12)。さらに、LDH法を用いて細胞毒性を検討したところ、全ての系において細胞毒性を示さなかった(図12)。
LTR-Rz発現ウイルスによるHIV-1タンパク質発現の抑制が確認されたため、この抑制がLTR-Rzによるものかどうか検討した。詳細には、細胞内LTR-Rz発現を、RT-PCR法により検討した。先ず、各種組換えウイルスをMOI 50でHeLa CD4+細胞に感染させ、感染2日後に細胞内全RNAを抽出した。次いで、これらのRNAを鋳型として、LTR-Rz特異的に結合するプライマーを用いてRT-PCR法を行った。
その結果、全てのLTR-Rz導入系において、LTR-Rz特異的なフラグメントが検出された(図13)。
以上より、HIV-1タンパク質発現の抑制は、LTR-Rzに起因することが示唆された。
LTR-Rz発現ウイルス感染によりLTR-Rzが発現していることが確認されたため、HIV-1タンパク質発現の抑制がLTR-Rzの切断活性によるものかを検討した。
先ず、各種ウイルスをMOI 50でHeLa CD4+細胞に感染させ、pNL4-3-LucをFuGENE6を用いて導入した。次いで、細胞全RNAを回収し、RT-PCRにより、HIV-1 RNAの切断および発現抑制を検討した。プライマーは、LTR-Rzにより切断されるヌクレオチド配列の前方および後方にアニールするように設計した。従って、切断が起こる場合、RT-PCRにより増幅されるフラグメント量は減少することが予想される。
その結果、LTR-Rz が発現している系のみ、HIV-1 RNA量が減少していることが確認された(図14)。
これまでの結果を考慮すると、LTR-Rz発現バキュロウイルス感染により、LTR-Rzが発現し、このLTR-RzによってHIV-1 RNAの切断が起こることで転写制御が行われ、ウイルスタンパク質の発現が低下していると考えられる。また、これらの効果は、バキュロウイルスの導入効率に依存し、野生型と比較してVSV-Gキメラシュードタイプではより効果が高いことが確認された。
次いで、各種ウイルスをMOI依存的(100, 50, 25, 12.5, 6.25, 1)にHeLa CD4+細胞に感染させ、バキュロウイルス濃度依存的なHIV-1タンパク質発現抑制を検討した。
その結果、L6-terを導入したウイルスは、pNL4-3のenv遺伝子の一部が欠損し、nef遺伝子の代わりにルシフェラーゼレポーター遺伝子を組み込んだpNL4-3-Lucのルシフェラーゼ(Luc)タンパク質発現を濃度依存的に抑制しなかったのに対し、LTR-Rz発現ウイルスは、Lucタンパク質発現を濃度依存的に抑制した(図15)。さらにAcVSV-G/LTR-RzをMOI 100で細胞に感染させた場合、Lucタンパク質発現は約95%抑制された(図15)。
以上より、LTR-Rz発現ウイルスは、HIV-1タンパク質発現を非常に効率的に抑制することから、遺伝子治療用ベクターとして非常に有用であることが示唆された。
上述した全ての系においてバキュロウイルス感染による細胞障害性は検出されなかった。本来、バキュロウイルスは哺乳動物細胞でウイルスタンパク質を発現しないため細胞毒性が無い。実際、バキュロウイルスは、最高MOI 100感染価で導入を行っても細胞毒性を示さなかった(データ示さず)。また、バキュロウイルス感染細胞は、未処理の細胞に比し、長時間細胞形態を保存し、また生存を示す傾向が確認された(データ示さず)。これらの結果より、バキュロウイルス感染により細胞死を阻害し得ると予想された。そこで、バキュロウイルスを哺乳動物細胞に感染させそのメカニズムについて検討した。
その結果、バキュロウイルス感染細胞において、バキュロウイルス内在性抗アポトーシスタンパク質p35の発現が確認された(図16)。このp35の発現により細胞のアポトーシスなどが阻害され、ひいては細胞の生存に繋がったと考えられる。
次いで、野生型ウイルスを感染させた系でアポトーシスが抑制されるかどうかを検討した。細胞としてはHuh-7を用いて、バキュロウイルスをMOI依存的(MOI 1, 10, 100)に感染させた。感染24時間後、放射線によるアポトーシスを誘導するため、UVイルミネーターにより10分間UV照射した。細胞死により培養上清中に遊離されるLDH脱水素酵素の活性を、アポトーシスの指標とした。
その結果、バキュロウイルス感染細胞は、UV照射によるアポトーシスに対して抵抗性を示し、また、その効果はバキュロウイルス濃度依存的に上昇したことから、野生型のウイルス感染により細胞死が軽減されたことが確認された(図17)。
以上より、バキュロウイルスによる遺伝子治療可能性が示された。
次いで、HIV-1感染に伴う細胞間でのアポトーシス誘導、及びそれに起因する細胞死が、p35により阻害可能か検討した。
ウイルスベクターを用いた遺伝子導入を生体内で行う場合、標的ウイルスの感染細胞は同種の正常細胞に比べはるかに少なく、大多数のウイルスベクターが標的ウイルス非感染細胞に導入されることが予想される。つまり、この非特異的な遺伝子導入を長所に変えることができれば治療効果は上昇し非常に有用なものになり得る。
そこで、HIV-1タンパク質によるアポトーシス誘導に注目した。HIV-1感染細胞は、Vprの発現によりアポトーシスを誘導することが報告されている(V. Ayyavoo et al, (1997), Nature Med., 3:1117-1123)。また、Nefは、感染細胞のFasリガンドの発現を上昇させる。このFasリガンドの発現は、Fasを介した系により、正常CD4陽性T細胞や細胞障害性T細胞などをアポトーシスに向かわせることが報告されている(R. Geleziunas et al, (2001), Nature, 410:834-838)。この正常免疫細胞のアポトーシスにより引き起こされる免疫機能の低下が免疫不全症の大きな原因となっている。つまり、この感染細胞が誘導するアポトーシスを抑制できれば免疫不全症を改善できると考えられる。
そこで、培養細胞において感染細胞、非感染細胞のアポトーシス誘導刺激を模すことで評価を行った。感染細胞モデルとしては、HIV-1刺激した細胞を用いた。非感染細胞モデルとしては、Fasを介して細胞死を誘導することが報告されている抗Fas抗体により刺激した細胞(Fas誘導型アポトーシスを示す細胞)を用いた。
その結果、バキュロウイルス感染細胞は、両アポトーシス刺激に対する抵抗性を獲得した(図18、19)。
以上より、バキュロウイルスベクターがHIV-1感染細胞に導入された場合、リボザイムによりウイルスタンパク質が阻害され、また、非感染細胞に導入された場合も感染細胞から誘導されるアポトーシスを阻害することが確認された。これらの複数効果を同一分子上で行えるウイルスは現存しない。従って、本バキュロウイルスベクターが、AIDS治療用ウイルスベクターとして非常に優れていることが示唆された。
Claims (7)
- HIVウイルスタンパク質の産生を抑制し得る核酸およびp35をコードする核酸を含む、発現ベクター。
- バキュロウイルスベクターである、請求項1記載の発現ベクター。
- HIVウイルスタンパク質の産生を抑制し得る核酸が、リボザイム、アンチセンス核酸、RNAi誘導性核酸、RNaseP、tRNaseZL、RNAアプタマーからなる群より選択される、請求項1記載の発現ベクター。
- HIVウイルスタンパク質の産生を抑制し得る核酸の標的が5’−LTRのU5領域である、請求項1〜3のいずれか1項記載の発現ベクター。
- VSV−Gをコードする核酸をさらに含む、請求項1記載の発現ベクター。
- HIVウイルスタンパク質の産生を抑制し得る核酸およびp35をコードする核酸を含む発現ベクターを含有する、医薬。
- HIVウイルスタンパク質の産生を抑制し得る核酸およびp35をコードする核酸を含む発現ベクターを含有する、HIV感染症治療薬。
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JP2000253882A (ja) * | 1999-03-10 | 2000-09-19 | Katakura Industries Co Ltd | カスパーゼタンパク製造用バキュロウイルスベクターおよびこれを用いるカスパーゼタンパクの製造法 |
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2006
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