JP2003513619A - 自己免疫疾患および免疫病因を含む疾患を治療するための遺伝子導入ベクター - Google Patents

自己免疫疾患および免疫病因を含む疾患を治療するための遺伝子導入ベクター

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、アポトーシスを誘導する１つ以上のリガンドをコードする第１の核酸配列と、１つ以上の抗原をコードする第２の核酸配列と、任意選択的に、１つ以上の抗アポトーシス分子をコードする第３の核酸配列と、任意選択的に、１つ以上の自殺酵素をコードする第４の核酸配列とを含む、遺伝子導入ベクターに関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、１つ以上のアポトーシス誘導性リガンドをコードする第１の核酸配
列、１つ以上の抗原をコードする第２の核酸配列、および、適切な場合には、１
つ以上の抗アポトーシス分子をコードする第３の核酸配列、および、適切な場合
には、１つ以上の自殺酵素をコードする第４の核酸配列を含む少なくとも１個の
核酸分子を含む遺伝子導入ベクターに関する。
【０００２】 多発性硬化症(ＭＳ)または糖尿病(１型）等の、自己免疫疾患の発生は、体内
の健康な細胞を攻撃して破壊する、免疫細胞の無制御活性化に起因する。Ｔリン
パ球は、内因性ＭＨＣ(主要組織適合複合体)分子と一緒に内因性タンパク質のフ
ラグメントを認識し、自己免疫疾患の病因に決定的に関与する。Ｔヘルパー細胞
(ＣＤ４+／ＣＤ８-)は、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩとの組合せを認識し、様々
なサイトカイン類を分泌することによって自己反応性抗体および免疫細胞の誘導
を刺激するため、免疫病因において重要な作用を有する。細胞起源またはウイル
ス起源のタンパク質、および細胞内で合成されるタンパク質は、プロテアソーム
で細胞内分解され、細胞表面上で、ＭＨＣクラスＩ分子と一緒に、Ｔリンパ球に
提示される。これらの細胞は、細胞溶解Ｔ細胞(ＣＤ４-／ＣＤ８+)により特異的
に認識され、除去される。
【０００３】 通常、内因性タンパク質を認識するＴ細胞は、除去(クローン除去)されるか、
または不活性化される(アネルギー)。その結果が、身体に固有の細胞および構造
に対する寛容である。自己免疫疾患では、この寛容が、乱れているかまたは不十
分である。自己免疫疾患は、ウイルス感染または細菌感染によって誘導されるこ
ともある。病原体特異的タンパク質と細胞型特異的タンパク質とは類似している
ため、非感染細胞も、病原体特異的抗体またはＴ細胞によって攻撃されることが
推測される。その免疫応答が主として病原体特異的構造に向けれられるものであ
っても、慢性持続性ウイルス感染と関連して、炎症経過（その一部は、肝臓等の
極めて重要な器官に影響を及ぼす（肝炎)）も起こる。損傷および症状は、病原
体ではなく、主として身体自身の免疫系によって引き起こされるため、このよう
な場合は、免疫病因を含むと言われる。移植された器官が拒絶されるとき、類似
した状況がみられる。この場合、ドナーの外来ＭＨＣ分子と、その分子が複合体
を形成する対象である細胞タンパク質との組合せは、レシピエントのＴ細胞によ
り、外来であると認識される。
【０００４】 現今の知識によれば、自己免疫疾患および免疫病因を含む他の疾患は、強力な
免疫抑制および／またはインターフェロン−β等の、制御作用を有するサイトカ
イン類を投与することによって、処置される。様々な製造会社によって提供され
る多数の異なる製剤を、免疫抑制剤を使用する伝統的な化学療法に使用すること
ができ、重要なことには、これらの製剤は、その適用領域およびその作用機序が
異なる。これらの物質の特に重大な不都合は、多くの且つ様々な、場合によって
は、生命を脅かす、副作用(特に、腎損傷、肝臓損傷、膵臓の炎症、貧血および
発熱)が発生することであり、これらの副作用は、多数の患者で認められている
。このような免疫系の非特異的阻害(たとえば、シクロスポリンまたはＦＫ５０
６を使用した場合)は、免疫防御の大幅な減弱、従って、感染症罹患性の増大に
つながるばかりでなく、腫瘍発生に有利である。たとえば、器官移植後、エプス
タインバーウイルス関連の腫瘍による影響を受けるリスクが何倍も高くなり、生
涯にわたって免疫抑制を必要とする。免疫治療薬(たとえば、インターフェロン
類)を使用すると副作用が少なくなるため、免疫治療薬の使用によって、伝統的
な化学療法が著しく改善される。しかし、これらの新規な免疫治療薬は特異的に
作用しないため、これらを使用しても、自己免疫疾患を治療することはできない
。
【０００５】 抗原提示細胞(ＡＰＣ)は、Ｔ細胞応答の誘発においても、Ｔ細胞寛容の誘導に
おいても、重要な役割を果たす。Ｔ細胞の大幅な活性化および増加の誘導は、Ｔ
細胞が受けなければならない２つのシグナルに依存する。第１のシグナルは、Ａ
ＰＣの表面上のＭＨＣと共に、抗原を認識するＴ細胞受容体によって、Ｔ細胞内
に伝えられる。第２のシグナル、すなわち、共刺激シグナルと呼ばれるものがな
ければ、Ｔ細胞は免疫低下状態になる。アネルギーは、Ｔ細胞が反応せず、増殖
しない状態を表す。ＡＰＣは、さらに、Ｔヘルパー細胞の作用に影響を及ぼして
、それらの特性を、Ｔｈ(Ｔヘルパー細胞)１表現型の方かまたはＴｈ２表現型の
方のいずれかに向け、その結果、たとえば、自己免疫疾患の発生を促進すること
ができる。ＡＰＣの抗原提示特性の種々の作用の組合せによって、Ｔヘルパー細
胞応答の概要が決まる。このような理由から、ＡＰＣは、免疫応答が免疫原性的
に進行するかまたは免疫寛容原性的に進行するかを支配することができる。
【０００６】 Ｆａｓは、細胞表面上に発現され、特異的リガンドＦａｓＬと相互に反応した
後、またはアゴニスト作用を有する抗Ｆａｓ抗体を結合した後、アポトーシスを
仲介する。Ｔ細胞の「活性化誘導性細胞死」(ＡＩＣＤ)と呼ばれるもの、すなわ
ち、細胞が活性化された後のそれらのプログラム細胞死は、同一の活性化Ｔ細胞
上で、ＦａｓおよびＦａｓＬの相互作用に続くオートクリンフィードバックによ
って誘導されるが、これは、Ｔ細胞寛容を維持するためのＦａｓ関連のアポトー
シスの重要性を示す事象である。
【０００７】 ＡＰＣのＦａｓ仲介アポトーシスは、免疫応答のダウンレギュレーションにお
いて、ある一定の役割を果たす。活性化Ｔ細胞は、増量したＦａｓリガンドを発
現させ、この方式で、ＡＰＣでアポトーシスを誘導する。一方、活性化マクロフ
ァージもＦａｓリガンドを発現させるが、活性化マクロファージの場合、Ｔ細胞
でアポトーシスを誘導することができる。従って、ＨＩＶ感染マクロファージ上
の大量のＦａｓリガンドが、たとえば、ＨＩＶ特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の枯渇と関
係があると考えられる。
【０００８】 Ｔ細胞寛容を維持し、自己免疫疾患を回避するためにＦａｓ依存性アポトーシ
スが重要なことは、特に、それぞれ、ＦａｓおよびＦａｓのリガンド、すなわち
、ＦａｓＬに関する遺伝子に影響を与える突然変異が、それぞれ、ｌｐｒ／ｌｐ
ｒおよびｇｌｄ／ｇｌｄマウスで自己免疫疾患を発生させることによって、証明
されている。ｇｌｄ／ｇｌｄおよびｌｐｒ／ｌｐｒは、それぞれ、ＦａｓＬおよ
びＦａｓに対する不活化突然変異について同型であるマウスを示す。ｌｐｒ／ｌ
ｐｒマウスでは、身体の末梢におけるＴ細胞のクローン除去も、身体独自の抗原
(自己抗原)および超抗原に対するＴ細胞寛容の維持も乱れている。これらの細胞
の欠点であるＦａｓ関連のアポトーシスを修正するために、Ｔ細胞内に人工的に
導入され、次いで、Ｔ細胞で発現されるＦａｓ遺伝子を使用することにより、ｌ
ｐｒ／ｌｐｒマウスにおける自己免疫疾患の発生を防止することができる。
【０００９】 Ｆａｓ仲介アポトーシスは、体内の免疫特権部位の維持においても極めて重要
な役割を果たす。精巣および前眼房の免疫特権状態には、これらの器官の対応す
る柔組織細胞上で、Ｆａｓリガンドが強く発現されることが必要である。こうし
た場合、柔組織細胞上でＦａｓリガンドが発現することによって、Ｔ細胞におけ
るアポトーシスが誘導されることにより、これらの組織は、Ｔ細胞により破壊さ
れることから保護されると推測される。前眼房におけるウイルス感染は、ウイル
スに対する全身性Ｔ細胞寛容を来たす。ＡＰＣは、特権細胞に由来する特権抗原
と一緒にＦａｓリガンドをその細胞表面上に提示し、身体の末梢領域にけるＴ細
胞のアポトーシスを誘導し、それによって、全身性Ｔ細胞寛容をもたらす。
【００１０】 １９９８年に、Ｚｈａｎｇら(Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．(１９９８)Ｎａｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：１０４５−１０４９)は、マウスモデルで、Ｆａ
ｓリガンド(ＦａｓＬ)産生抗原提示細胞(ＡＰＣ)が、抗原特異的Ｔ細胞寛容を誘
導することをはじめて示した。アデノウイルスベクターに感染した結果として、
ＦａｓＬのほかにもアデノウイルスタンパク質をコードした抗原提示細胞を使用
して、マウスでＴ細胞寛容を引き起こすことができた。このＴ細胞寛容は、アデ
ノウイルスタンパク質に特異的で、マウスサイトメガロウイルス感染に対する作
用はなかった。その後のアデノウイルス感染で、ＡＰＣ処置マウスは、アデノウ
イルス感染細胞に対する抑制されたＴ細胞応答と一致して、肝臓でのウイルスの
著しく長い持続を示した。さらに、Ｆａｓ陰性マウスでは、寛容誘導することが
できなかったため、このＴ細胞寛容は、Ｆａｓリガンドの機能に依存していた。
１年後、同研究グループが、マウスモデルで同様に行った、同種抗原に対するＴ
細胞寛容の誘導に関する実験を発表した(Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．(１９９９)
Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６２： １４２３−１４３０)。さらに１年後、この研
究グループは、たとえば、Ｆａｓ欠損マウスのマウスサイトメガロウイルス感染
後に発生する炎症性疾患を予防または慢性的に治療するために、ＦａｓＬ発現性
抗原提示細胞を使用ことができることを示す実験を発表した(Ｚｈａｎｇ ｅｔ
ａｌ．(２０００)Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０５： ８１３−８２１)
。この実験的アプローチも同様に、治療は、抗原特異的（この場合、マウスサイ
トメガロウイルス特異的）Ｔ細胞寛容の誘導に基づいていた。上述の実験では、
Ｚｈａｎｇらは、高感染率という利点を有し、遺伝子発現を確実にする、アデノ
ウイルスベクターを使用した。
【００１１】 しかし、アデノウイルスベクターは、ヒトで正確に使用するには、非常に重大
な不都合を持っている。その第１は、抗原性ウイルスタンパク質の発現であり、
これが、アデノウイルスベクターを使用した遺伝子療法アプローチを今まで妨害
してきた。アデノウイルスベクターは、調節タンパク質および構造タンパク質を
発現させるため、形質導入細胞は免疫系により認識され、故意に発現させた抗原
と無関係に、除去される。この反応を避けるために、アデノウイルスタンパク質
を発現する適切なＦａｓＬ陽性ＡＰＣを使用して、実験に記載のマウスを前もっ
てアデノウイルスタンパク質に寛容にしておいた。潜在的ウイルス病原体に対し
て免疫系を寛容にするための対応するアプローチは、ヒトには適さない。
【００１２】 人工的に発現させたＦａｓＬ分子と、ＡＰＣの表面上の対応するアポトーシス
受容体との相互作用によるアポトーシスのオートクリン誘導の問題は、上述の実
験では無視された。Ｚｈａｎｇらの実験(Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．(１９９８)
Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６： １０４５−１０４９；Ｚｈａｎｇ ｅ
ｔ ａｌ．(１９９９)Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｌ １６２： １４２３−１４３０；
Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．(２０００)Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０５：８
１３−８２１)では、Ｆａｓ欠損ＡＰＣに、Ｆａｓリガンドを発現させるベクタ
ーを感染させた。能率的な治療的利用のためには、変化した抗原提示細胞を、ア
ポトーシスのオートクリン刺激から保護すること、同時に、制御できない不滅化
または腫瘍細胞に向かう細胞の形質転換を回避できることが絶対必要である。
【００１３】 さらに、先の実験は全て、アポトーシス誘導性リガンドが同時に発現しない、
Ｔ細胞寛容が誘導される対象である抗原の発現に起因する免疫系の意図しない刺
激という問題を無視している。
【００１４】 従って、本発明の目的は、自己免疫疾患および免疫病因を含む疾患を予防また
は治療する手段を提供することである。
【００１５】 この目的は、特許請求の範囲に明示された主題事項によって実現される。
【００１６】 本明細書で使用された表現「ベクター」または「遺伝子導入ベクター」は、天
然のまたは人為的に作られた、細胞における核酸の取込み、複製、発現または導
入用の生物および構築物を意味する。レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ
随伴ウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルスまたはヘルペスウイルス等
のウイルスが、ベクターの例である。リステリア菌、赤痢菌またはサルモネラ菌
等の細菌も、ベクターの例である。リポソームまたは裸のＤＮＡ、たとえば、細
菌プラスミド、ウイルス由来のプラスミド、ファジミド、コスミド、バクテリオ
ファージまたは人為的に作製された核酸、たとえば、人工染色体は、ウイルスの
さらなる例である。
【００１７】 本明細で使用される表現「アポトーシス受容体」は、細胞の細胞質膜内にあっ
て、特異的リガンドとの相互作用および特異的リガンドによる活性化に続く細胞
でのアポトーシスを開始するポリペプチドを意味する。アポトーシス受容体の例
は、細胞質死ドメイン、たとえばＣＤ９５／Ｆａｓ／Ａｐｏ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ
１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２およびＡｐｏ３を特徴とする腫瘍壊死因子受容体のサブフ
ァミリーに属するポリペプチドである。
【００１８】 本明細書で使用される表現「リガンド」または「アポトーシス誘導性リガンド
」または「アポトーシスリガンド」は、アポトーシス受容体と相互に作用するこ
とができる膜在ポリペプチドを意味する。リガンドがアポトーシス受容体に結合
することによって、受容体が活性化され、受容体を有する細胞におけるアポトー
シスを誘導する。アポトーシスリガンドの例は、ＣＤ９５Ｌ／ＦａｓＬ／Ａｐｏ
１Ｌ、ＴＲＡＩＬおよびＡｐｏ３Ｌである。
【００１９】 本明細で使用される表現「抗アポトーシス分子」は、細胞におけるアポトーシ
スを阻止するポリペプチドを意味する。こうしたポリペプチドは、細胞起源のも
のであってもウイルス起源のものであってもよい。抗アポトーシス分子はさらに
、アポトーシス誘導性ポリペプチドをコードする、核酸に相補的な核酸を含む、
核酸分子を意味する。
【００２０】 本明細で使用される表現「抗原」は、全タンパク質あるいは１個または数個の
Ｔ細胞エピトープを含むタンパク質の一部を含むポリペプチドを意味し、細胞に
よるタンパク質分解処理後、ＭＨＣ分子によって提示され、Ｔ細胞受容体によっ
て結合される。
【００２１】 本明細で使用される表現「自殺酵素」は、僅かに有毒であるに過ぎないかまた
は有毒ではない物質を有毒物質に転換するか、あるいは細胞内で酵素によって使
用されるか転換されることができる方法でそれらを変える、ポリペプチドを意味
する。
【００２２】 本明細で使用される表現「ＩＲＥＳ」は、５’キャップ構造等の細胞調節配列
と関係無く、機能的に活性なリボソームが結合できるようにするウイルスの核酸
配列を意味する。ＩＲＥＳ配列は、強い二次構造を特徴とする。ＩＲＥＳ配列は
、たとえば、ピコルナウイルスのＩＲＥＳ配列に記載されている。
【００２３】 本発明の目的は、自己免疫疾患および免疫病因を含む疾患の症例で実現すべき
選択的抗原特異的免疫療法を可能にすることである。細胞タンパク質または病原
体特異的タンパク質に対して明示された特異性を有する個々のＴ細胞クローンを
除去し、それによって、抗原に対する免疫学的寛容を発生または回復させる。
【００２４】 本発明は、１つ以上のアポトーシス誘導性リガンドをコードする第１の核酸配
列を含む少なくとも１個の核酸分子、１つ以上の抗原をコードする第２の核酸配
列、および、適切な場合には、１つ以上の抗アポトーシス分子コードする第３の
核酸配列、および、適切な場合には、１つ以上の自殺酵素をコードする第４の核
酸配列を含む遺伝子導入ベクターに関する。最初の３つ、または４つ全部、また
は最初の２つと第４の、核酸配列を含む核酸分子を含む遺伝子導入ベクターが好
ましい。２つの核酸分子を含み、第１および第２の核酸配列が第１の核酸分子上
に存在し、第３および第４の核酸配列が第２の核酸分子上に存在する、遺伝子導
入ベクターがさらに好ましい。第２の核酸配列の発現が、第１の核酸配列の発現
に依存するように、第１の核酸配列と第２の核酸配列が互いに機能的に連結され
ており、及び／又は第４の核酸配列の発現が第３の核酸配列の発現に依存するよ
うに、第３の核酸配列と第４の核酸配列が互いに連結されている、遺伝子導入ベ
クターが特に好ましい。
【００２５】 本発明による遺伝子導入ベクターは、自己免疫疾患および免疫病因に起因する
他の疾患の治療に使用することができる。免疫病因は、細胞性免疫機構または体
液性免疫機構、すなわち、リンパ球または抗体または補体仲介機構によって引き
起こされる、細胞、組織または器官への損傷を意味する。本発明によるベクター
を使用して、ｅｘ ｖｉｖｏで、身体の細胞を組換え的に変えることができる。
これらの遺伝子療法用ベクターを使用することにより、修飾すべき細胞は、細胞
を、自己免疫疾患および免疫病因に起因する他の疾患の治療に適応させる多数の
新しい特性を獲得する。本発明の意味の範囲内で、適応するは、修飾された細胞
が、病気の発生に関与する免疫細胞を誘引し、これらの細胞を特異的に認識し、
アポトーシスを誘導することによってそれらを破壊できることを意味する。
【００２６】 本発明によるベクターは、現在利用することができ、且つ多数の異なる遺伝子
または機能領域を担持して、対応する遺伝子産物を真核細胞で発現させることが
できる多数のベクター系に基礎を置くことができる。ウイルス系に基づくベクタ
ーの場合、パッケージング細胞系または他のｉｎ ｖｉｔｒｏ系を使用して、核
酸配列をこれらのベクター内にパッケージする。次いで、このベクターを能動的
に細胞内に貫入させてもよく、または、これらの細胞によって取り込まれてもよ
い。非ウイルスベクターは、物理学的機構および生物学的機構に基づく様々な導
入方法によって標的細胞内に導入される。本発明によるベクターの重要な特性は
、ベクター系によって修飾される細胞の機能を妨害しかねない、ウイルスタンパ
ク質またはベクター系と関係がある他のタンパク質が、修飾された細胞内で全く
合成されないことである。本発明の意味の範囲内で、ウイルスタンパク質または
他のタンパク質の発現は、これらのタンパク質を産生する修飾された細胞が免疫
細胞によって認識され、破壊される場合、有害であろう。本発明の意味の範囲内
で、この認識は、それによって、ウイルス性病原体または細菌性病原体の認識お
よび破壊に際して、免疫系の正常な機能を損なう場合、有害であり、通常、免疫
系によって認識される細胞または他の細胞または病原体を変性させるであろう。
この認識は、免疫病因となる免疫細胞の破壊に際して、細胞の有効性を制限する
場合、やはり有害であろう。
【００２７】 本発明によるベクターであって、核酸配列の本発明による組合せを含むベクタ
ーによって修飾された細胞は、免疫病因となる免疫細胞によって認識される抗原
を発現する。こうした免疫病因となる細胞は、(内因性)抗原を特異的に認識し、
これらの抗原および抗原発現細胞に対する免疫反応を調整するため、明示された
疾患の病原性に特別の役割を果たす。本発明によるベクターと一緒に細胞内に導
入される抗原は、特定の疾患に特異的であってもよく、冒された器官または組織
あるいは冒された細胞型に特異的であってもよい。本発明によるベクターは、さ
らに、アポトーシス誘導性リガンドをコードする。これらのアポトーシス誘導性
リガンドは、抗原を認識する、免疫病因となる免疫細胞における自然細胞死を誘
導する。本発明によるベクターは、１つ以上の異なるアポトーシス誘導性リガン
ドをコードしてもよい。修飾された細胞は、人為的に合成された抗原性エピトー
プを認識する、従って、修飾された細胞と物理的に接触する、免疫細胞を認識し
て破壊するに過ぎない。
【００２８】 アポトーシス(アポトーシス誘導性リガンド)の誘導に関与する核酸配列および
抗原性ポリペプチド(抗原)をコードする核酸配列を、アポトーシス誘導性リガン
ドが発現されなければ抗原が発現できないように、機能的に結合させるかまたは
転写レベルで互いに連結させることができる。こうすることによって、疾患を引
き起こす免疫細胞は、変化した細胞を認識することができなくなり、また、これ
らの後者の細胞でアポトーシスが同時に誘導されることなく免疫細胞を刺激する
ことができなくなるため、本発明によるベクターの安全性が大きく向上する。
【００２９】 本発明によるベクターにおける核酸配列は、本発明によるベクターによって変
化した細胞が、それ自身がアポトーシスを開始し、この方法で、それ自身を破壊
するのをオートクリン機構によって妨げる遺伝子または機能領域もさらに担持し
てもよい。これによって、ベクターおよび変化した細胞の効果が増大する。この
遺伝子または機能領域は、ポトーシス誘導因子の活性のレギュレーターをコード
するか、またはそれらが発現されるのを妨げるかのいずれかである。
【００３０】 適切な場合には、本発明によるベクターは、必要に応じて、体内に再注入され
た後、組換え的に修飾された細胞の除去を可能にするポリペプチドをコードする
核酸配列(自殺遺伝子)をさらに含むことができる。抗アポトーシス分子および自
殺酵素をコードする核酸配列の場合、抗原およびアポトーシス誘導性リガンドを
コードする核酸配列の機能的結合と類似した機能的結合が存在してもよい。この
結合は、抗アポトーシス分子のために、もはや身体から除去することができない
細胞を、自殺酵素の作用によって確実に除去することができる。
【００３１】 抗アポトーシス分子および自殺酵素に関する核酸配列は、アポトーシス誘導性
リガンドおよび抗原に関する核酸配列がある核酸分子と同一の核酸分子上にあっ
てもよく、異なる核酸分子上にあってもよい。
【００３２】 本発明はさらに、治療薬としての遺伝子導入ベクターに関する。本発明はさら
に、自己免疫疾患、たとえば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェー
グレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、リウマチ性多発性筋痛、側頭動脈炎、ベ
ヒテレフ（Ｂｅｃｈｔｅｒｅｗ）病等の脊椎関節症、クローン病、潰瘍性大腸炎
、セリアック病、自己免疫肝炎、Ｉ型糖尿病、副腎機能不全、甲状腺炎、乾癬、
皮膚炎、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡、脱毛症、多発性硬化症および重症筋無力
症を予防または治療するため、免疫病因に起因する炎症経過、たとえばウイルス
感染または細菌感染に続く慢性炎症、たとえば、Ｂ型肝炎ウイルス感染またはＣ
型肝炎ウイルス感染の場合の慢性肝炎、または麻疹ウイルス感染に続く脳炎を慢
性的に予防または治療するため、および移植拒絶を予防または治療するための、
治療用組成物を製造するための遺伝子導入ベクターの使用に関する。
【００３３】 本発明はさらに、真核細胞、特に動物または哺乳類細胞、特にヒト細胞をｅｘ
ｖｉｖｏ修飾するための遺伝子導入ベクターの使用に関する。
【００３４】 レトロウイルスベクター 遺伝子導入ベクターは、レトロウイルスベクター、特に、レンチウイルスに基
づくベクターであることが好ましい。これらは、核酸を細胞内に導入するのに効
果的なベクターを開発するのに適した基盤を構成する。望ましい外来遺伝子を適
当なベクター内に挿入し、レトロウイルス粒子内にパッケージすることは、既に
詳細に記述されている、到達水準である方法を使用して、実行することができる
。その後、産生される組換えウイルスを単離し、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖ
ｉｖｏで、望ましい標的細胞と共にインキュベートする。これまで、多数の異な
るレトロウイルス系について説明してきたが、これらの系は、本発明による核酸
の組合せを導入するのに適している。従って、レトロウイルス遺伝子導入ベクタ
ー、特に、レンチウイルス遺伝子導入ベクターを、本発明による核酸配列の組合
せを真核細胞に導入するのに使用することが好ましい。
【００３５】 本発明によるレトロウイルス遺伝子導入ベクターは、様々なレトロウイルス、
たとえば、Ｂ型、Ｃ型またはＤ型レトロウイルスおよびスプマウイルスおよびレ
ンチウイルス等を基礎とすることができる。
【００３６】 適当なレトロウイルスファミリーの代表例は、「ＲＮＡ腫瘍ウイルス」の２〜
７ページに記載されているもの、多数の非相同栄養レトロウイルス、たとえば、
ＮＺＢ−Ｘ１、ＮＺＢ−Ｘ２およびＮＺＢ９−１、ならびに多栄養（ｐｏｌｙｔ
ｒｏｐｈｉｃ）レトロウイルス、たとえば、ＭＣＦおよびＭＣＦ−ＭＬＶなどで
ある。これらのレトロウイルスは、ストックまたはコレクション、たとえば、Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ("ＡＴＣ
Ｃ"，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．)から得ることができ、あるいは、一般に行われ
ている公表された分子生物学的技法を使用して、生物材料から単離することもで
きる。
【００３７】 レトロウイルス遺伝子導入ベクターを作製するのに特に適したレトロウイルス
は、トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク
細胞フォーカス誘導ウイルス、マウス肉腫ウイルス、テナガザル白血病ウイルス
、ネコ白血病ウイルス、細網内皮ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスの群からの
代表を含む。マウス白血病ウイルス、たとえば、代表的な４０７０Ａおよび１５
０４Ａ、アベルソン（Ａｂｅｌｓｏｎ；ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ−９９９)、フレ
ンド（Ｆｒｉｅｎｄ；ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ−２４５)、グラフィ（Ｇｒａｆｆ
ｉ）、グロス（Ｇｒｏｓｓ；ＡＴＣＣ Ｎｏ．５９０)、クリステン（Ｋｉｒｓ
ｔｅｎ）、ハーベー（Ｈａｒｖｅｙ）肉腫ウイルスおよびラウシャー（Ｒａｕｓ
ｃｈｅｒ；ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ−９９８)、およびモロニーマウス白血病ウイ
ルス(ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ−１９０)も、特に適する。ブラティスラバ（Ｂｒａ
ｔｉｓｌａｖａ）、ブライアン（Ｂｒｙａｎ）高力価(たとえば、ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．ＶＲ−３３４、ＶＲ−６５７、ＶＲ−７２６、ＶＲ−６５９およびＶＲ−７
２８)、ブライアン標準、カー・ジルバ（Ｃａｒｒ−Ｚｉｌｂｅｒ）、エンゲル
ブレス・ホーム（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ）、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）
、プラハ（Ｐｒａｇｕｅ；たとえば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ−７７２および４５
０３３)およびスミット・ラピン（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｒｕｐｐｉｎ；たとえば、
ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ−７２４、ＶＲ−７２５およびＶＲ−３５４)を含むラウ
ス肉腫ウイルスも、やはり特に適する。
【００３８】 本発明に記載の、ある特定の用途の場合、レトロウイルス遺伝子導入ベクター
における核酸分子の成分は、列挙されているもの以外のレトロウイルスに由来し
てもよい。たとえば、レトロウイルスベクター長末端反復(ＬＴＲ)領域は、マウ
ス肉腫ウイルスから誘導でき、ｔＲＮＡ結合部位は、ラウス肉腫ウイルスから誘
導でき、パッケージングシグナルは、マウス白血病ウイルスから誘導でき、第２
鎖ＤＮＡ合成のための起点は、トリ白血病ウイルスから誘導することができる。
【００３９】 さらに、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、１つ以上
の非相同配列、第２鎖ＤＮＡ合成の起点、および３’ＬＴＲを含む核酸分子を、
Ｇａｇ／ＰｏｌまたはＥｎｖをコードする配列を含まない核酸分子と一緒に、レ
トロウイルスベクターに使用することができる。ＬＴＲは３つのエレメント、す
なわち、Ｕ５領域、Ｒ領域およびＵ３領域を含む。これらのエレメントは、レト
ロウイルスの生物学的活性に重要な多数のシグナル、たとえばＵ３領域に位置す
るプロモーターエレメントおよびエンハンサエレメントを含む。プロウイルス内
のＬＴＲは、ゲノム末端における独特の配列重複を用いて、明白に特性決定する
ことができる本発明で使用されることが好ましい５’ＬＴＲは、５’プロモータ
ーエレメント、およびベクター核酸を逆転写して、標的細胞のゲノムに組み込む
のを可能にする最小限のＬＴＲ配列を含む。３’ＬＴＲ領域は、ポリアデニル化
シグナル、およびベクター核酸を逆転写して標的細胞のゲノムに組み込むのに必
要なＬＴＲ配列を含む。
【００４０】 ｔＲＮＡ結合部位および第２鎖ＤＮＡ合成起点は、生物学的活性に必要であり
、これらの成分の同定は、到達水準である。たとえば、レトロウイルスｔＲＮＡ
は、ワトソンクリック塩基対形成によって、ｔＲＮＡ結合部位に結合し、レトロ
ウイルスゲノムと一緒にウイルス粒子内にパッケージされる。次いで、このｔＲ
ＮＡは、逆転写酵素により、ＤＮＡ合成用のプライマーとして使用される。ｔＲ
ＮＡ結合配列は、５’ＬＴＲのすぐ下流に位置し、その位置によって容易に同定
することができる。同様にし、第２鎖ＤＮＡ合成起点は、レトロウイルスの第２
鎖ＤＮＡ合成に非常に重要である。ポリウリジン領域と呼ばれるこの領域は、３
’ＬＴＲのすぐ上流に位置する。
【００４１】 レトロウイルス遺伝子導入におけるベクターにおける核酸配列は、５’ＬＴＲ
、３’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合配列および第２鎖ＤＮＡ合成の起点に加えて、パッ
ケージングシグナル、およびこれに加えて、以下に詳述する１つ以上の非相同配
列を含むことができる。
【００４２】 たとえば、Ｇａｇ／ＰｏｌまたはＥｎｖをコードする核酸配列を持たないレト
ロウイルス遺伝子導入ベクターが使用される。たとえば、伸長パッケージングシ
グナルを有するベクター構築物を作製することによって、Ｇａｇ／Ｐｏｌまたは
Ｅｎｖをコードする配列を持たないレトロウイルス遺伝子導入ベクターを作製す
ることができる。用語「伸長パッケージングシグナル」は、核酸の特異的パッケ
ージングに必要な最小配列を超えるヌクレオチド配列を意味する。伸長パッケー
ジング配列を使用することにより、高力価を有するウイルスストックの作製が可
能になるが、これは、パッケージされるＲＮＡの量が増加するためである。たと
えば、モロニーマウス白血病ウイルス(Ｍｏ−ＭＬＶ)の最小パッケージングシグ
ナルは、５’ＬＴＲの終端で開始し、且つＰｓｔＩ切断部位を含む配列によって
コードされる。Ｍｏ−ＭＬＶの伸長パッケージングシグナルは、Ｇａｇ／Ｐｏｌ
遺伝子(ヌクレオチド６２１)の起始点を含む、ヌクレオチド５６７以上の配列を
含み、ヌクレオチド１５６０を越えて終わる。従って、ヌクレオチド５６７を越
えて伸長する配列を削除することによって、伸長パッケージングシグナルを持た
ないレトロウイルス遺伝子導入ベクターを、Ｍｏ−ＭＬＶから作製することがで
きる。さらに、パッケージングシグナルが、レトロウイルスのＧａｇ／Ｐｏｌ配
列と部分的にまたは完全にオーバーラップするが、それにもかかわらず完全に削
除されるかまたはＧａｇ／Ｐｏｌ遺伝子の出発コドンの上流が切断されている核
酸配列を、レトロウイルス遺伝子導入ベクターに使用することも可能である。さ
らに、Ｇａｇ／Ｐｏｌ遺伝子の起始点の５’領域上流で伸長したパッケージング
シグナルを含む核酸配列を、レトロウイルス遺伝子導入ベクターに使用すること
も可能である。これらのレトロウイルスベクターを使用する場合、組換えウイル
ス粒子を作製するためには、Ｇａｇ／Ｐｏｌ発現カセット内のＧａｇ／Ｐｏｌ遺
伝子の５’末端が、修飾されていて、野生型ＨＩＶ−１Ｇａｇ配列と異なる、Ｇ
ａｇ遺伝子におけるコドン使用を示すように、修飾されている、パッケージング
細胞系を好んで選択すべきである。
【００４３】 さらに、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖Ｄ
ＮＡ合成の起点および３’ＬＴＲ領域を有する核酸配列を、５’ＬＴＲの上流に
レトロウイルス核酸配列を持たない核酸配列と共に、レトロウイルス遺伝子導入
ベクターに使用することも可能である。これらのベクターは、５’ＬＴＲの上流
にＥｎｖコード配列を持たない。さらに、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合配列、パッ
ケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成起点および３’ＬＴＲを含むが、３’Ｌ
ＴＲの下流にレトロウイルスパッケージングシグナル配列を含まない核酸配列を
レトロウイルス遺伝子導入ベクターに使用することが可能である。本明細で使用
される用語「パッケージングシグナル配列」は、ＲＮＡゲノムのパッケージング
に必要な配列を意味する。
【００４４】 上述のレトロウイルス遺伝子導入ベクターの確立に適したパッケージング細胞
系は既に入手でき、組換えベクター粒子を作製するための細胞系(ベクター細胞
系とも呼ばれる)の作製に何度も使用されている。
【００４５】 レトロウイルスベクターの中で、レンチウイルスベクターは、核酸配列を多数
の休止細胞および有糸分裂後細胞、たとえば、ニューロン細胞、肝細胞、筋細胞
および造血幹細胞に挿入して配列を発現させることができるため、核酸配列の本
発明による組合せを導入するのに特に適する。レンチウイルスベクター粒子は、
(ｉ)Ｇａｇ／Ｐｏｌ発現ベクター、(ｉｉ)パッケージングシグナル、外来核酸配
列およびフランキングＬＴＲを含む導入構築物、および(ｉｉｉ)コートタンパク
質用発現ベクターによる哺乳類細胞の三重感染によって作製することができる。
この点に関して、様々な広宿主性または異種栄養性のレトロウイルスおよび他の
ウイルスからのコートタンパク質、たとえば、モロニーマウス白血病ウイルス(
Ｍｏ−ＭＬＶ)およびＭＬＶ単離４０７０Ａのコートタンパク質を使用すること
ができ、水疱性口内炎ウイルス(ＶＳＶ)Ｇ糖タンパク質または狂犬病Ｇ糖タンパ
ク質も使用することができる。このようにして作製されたレンチウイルスベクタ
ーは、多数の異なる細胞をしっかりトランスフェクトすることができる。ＨＩＶ
Ｐｏｌ遺伝子の中央ポリウリジン領域およびターミネーター配列を含むレンチ
ウイルスベクターは、高い形質導入効率を示し、この高い効率は、ベクターの改
良された核転座による。レンチウイルス遺伝子療法用ベクターの安全性を向上さ
せるために、アクセサリーＨＩＶ−１および／またはＳＩＶ−１遺伝子Ｖｉｆ、
Ｖｐｒ、ＶｐｕおよびＮｅｆに欠失を含む異なる機能的パッケージング構築物を
作製することが可能である。さらに、ウイルスのトランス活性化因子タンパク質
Ｔａｔをもはや必要としない機能的レンチウイルスベクターを開発することが可
能である。さらに、複製有能組換え体の出現を最小限に抑えるために、たとえば
、ＴＡＴＡボックスおよび転写因子ＳＰ１およびＮＦ−κＢを結合するための部
位を含む、５’ＬＴＲおよび／または３’ＬＴＲにおけるＵ３領域の広域断片が
、ベクター内で欠失している自己不活化ベクター系を開発することが可能である
。これらの修飾は、ウイルス転写エレメントの大部分を除去する。さらに、Ｕ３
領域を削除することにより、ＬＴＲにあるプロモーターと内部プロモーターとの
間の起こりうる干渉を防止し、レンチウイルスベクターの組込み部位にて、隣接
する細胞遺伝子を活性化する危険性を徹底的に減少させる。合成的に作製された
、コドン改変ＨＩＶおよび／またはＳＩＶの Ｇａｇ／Ｐｏｌ遺伝子およびＥｎ
ｖ遺伝子を使して、たとえば、レンチウイルスＧａｇ／Ｐｏｌ遺伝子およびＥｎ
ｖ遺伝子のＲｅｖ依存性を回避する。あるいは、ＨＩＶ／ＳＩＶＧａｇ、Ｇａｇ
／ＰｏｌおよびＥｎｖ遺伝子転写物をＲｅｖ独立方式で輸出できるようにするた
めに、たとえば、メーソン・フィッツェル（Ｍａｓｏｎ−Ｐｆｉｔｚｅｒ）サル
ウイルスＣＴＥまたはサルレトロウイルス１型(ＳＲＶ−１)ＣＴＥ等の他のウイ
ルスからの構成的輸送エレメント(ＣＴＥ)を使用することが可能であり、また、
Ｂ型肝炎ウイルス転写後制御エレメント(ＰＲＥ)およびラウス肉腫ウイルス転写
後ダイレクトリピート(ＤＲ)エレメントを使用することも可能である。これらの
方法を使用することにより、トランス活性なＲｅｖタンパク質をレンチウイルス
ベクターから除外することができ、その結果、このベクター型の安全性を高める
一助となる。現在使用されているレンチウイルスベクター系の編集物は、たとえ
ば、Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ ａｎｄ Ｗｏｎｇ Ｓｔａａｌによる総説 (
Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．(２０００)Ｂｌｏｏｄ ９５：２４９
９−２５０４)にある。
【００４６】 レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターに加えて、本発明によ
る核酸配列組合せの導入に同様に使用することができる多数の他のウイルス遺伝
子導入ベクターおよび非ウイルス遺伝子導入ベクターを使用することも可能であ
る。これらのベクター系は、治療的に利用可能な、組換え的に修飾された細胞系
の作製に使用されるため、安全上の理由から、もはや溶解的に複製することがで
きないように、ウイルスベクター系を修飾する。遺伝子導入ベクターは、アデノ
ウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルスまたはヘ
ルペスウイルスを基礎とするベクターであることが好ましい。
【００４７】 アデノウイルスベクター Ｅ１／Ｅ３、Ｅ１／Ｅ４およびガトレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）ベクターを含む、
組換えアデノウイルスベクター(Ａｄベクター)の作製は、到達水準であり、公表
されたプロトコールに従って実行することができる。たとえば、(１)２９３細胞
のトランスフェクションおよび次の細胞内組換えに続いて組換えＥ１／Ｅ３欠失
Ａｄベクターを作製するために、望ましいヌクレオチド配列をｐＢＨＧ１１プラ
スミドに挿入することができる。(２)望ましいヌクレオチド配列を、まず第１に
、多数のＥ１欠失ＡｄベクターのＥ１領域内に組込み、ＣｌａＩ消化Ｈ５ｄ１１
０１４ベクターと共に共トランスフェクトすることができ、２９３Ｅ４細胞のト
ランスフェクションおよび次の細胞内相同組換えに続いて、組換えＥ１／Ｅ４欠
失Ａｄベクターを単離することができる。(３)次に、２９３細胞へのトランスフ
ェクションおよびＨ５．ＣＢＡＬＰヘルパーウイルス感染に続いて、組換えガト
レスアデノウイルスベクターゲノムの効果的なパッケージングを確実にするため
に、まず第１に、望ましいヌクレオチド配列を、たとえば、バクテリオファージ
λＤＮＡに由来する、スタッファー配列の適量と一緒にＡｒＡｄプラスミドに挿
入する。塩化セシウム勾配における平衡沈降を使用して、たとえば、ヘルパーウ
イルスより低い密度を有するベクター粒子が原因で汚染しているヘルパーウイル
スから組換えガトレスアデノウイルスベクター粒子を除去することができる。
【００４８】 アデノ随伴ウイルス さらに、既に開発されている様々なアデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)ベクター系を
遺伝子導入に使用することが可能である。ＡＡＶベクターの構築に関する詳細な
説明は公表されており、到達水準である。
【００４９】 組換えＡＡＶベクターの場合、通常、全てのコード配列が、望ましい非相同核
酸配列と置き換えられる。組換えＡＡＶは、所望の遺伝子を担持するＡＡＶベク
ター、および必須のＡＡＶ遺伝子全てを有するヘルパーＡＡＶプラスミドを、Ａ
ＡＶ複製およびベクター粒子の産生に必要なヘルパー機能全てを提供するアデノ
ウイルス感染細胞内に共トランスフェクトすることによって作製される。しかし
、このベクター系を遺伝子療法で使用する際の不都合は、組換えベクターが低力
価であること、およびベクターが野生型ＡＡＶおよび伝染性ヘルパーウイルスで
汚染されている恐れがあることである。さらに、ＡＡＶベクターに組み込むべき
外来配列のサイズが５ｋｂに限定されていることである。
【００５０】 ポックスウイルス 所望の外来遺伝子をコードする核酸を導入するための代替アデノウイルスベク
ター系は、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルスを含む、ポックスウ
イルスファミリーを代表するものに基礎を置く。この種のベクター系は、組換え
ワクシニアウイルスの例を使用して次に説明する通りに作製される。まず第１に
、所望の遺伝子が、ワクシニアプロモーターおよびチミジンキナーゼ(ＴＫ)をコ
ードする配列等のフランキングワクシニアＤＮＡ配列の近くに位置するように、
所望の遺伝子をコードするＤＮＡを、適当なベクターに組み込む。次いで、この
ベクターを細胞にトランスフェクトし、同時に、これらの後者をワクシニアウイ
ルスに感染させる。次いで、相同組換えを使用して、外来遺伝子を含む挿入物を
、ウイルスゲノムに組換える。このようにして得られたＴＫ陽性組換え体は、５
−ブロモデオキシウリジンの存在下でウイルスを細胞で培養し、次にプラークを
単離することによって確立することができる。
【００５１】 あるいは、他のトリポックスウイルス、たとえば、鶏痘ウイルスおよびカナリ
ア痘ウイルスを遺伝子導入に使用することが可能である。ヒトに対して病原とな
る生物に由来する免疫原を発現する組換えトリポックスウイルスは、哺乳動物へ
の投与後、防護的免疫応答を誘導することができる。トリポックス属を代表する
ものは、受容性トリ種において複製するのみで、哺乳類細胞では複製しないため
、トリポックスウイルスの使用は、ヒトおよび他の哺乳動物での利用に特に有利
である。組換えトリポックスウイルスを作製する方法は到達水準であり、組換え
ワクシニアウイルスの製造に関して前述したものと類似した遺伝子組換え機構に
基づく。
【００５２】 アルファ・ウイルス アルファ・ウイルス属を代表するもの、たとえば、シンドビスおよびセムリキ
森林熱ウイルスに由来するベクターを、選択された遺伝子のヌクレオチド配列の
導入に使用することもできる。シンドビスウイルスに基づくベクターの作製およ
び使用は到達水準であり、何度も公表されている。
【００５３】 細菌 さらに、遺伝子導入ベクターは細菌、特にＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔ
ｏｇｅｎｅｓ(Δｍｐｌ、ΔａｃｔＡ、ΔｐｌｃＢ)、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅ
ｘｎｅｒｉ（ΔａｒｏＡ、ΔｖｉｒＧ)およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈ
ｉｍｕｒｉｕｍであることが好ましい。抗原特異的細胞を補充し活性化するため
の非常に有望なＤＮＡデリバリーシステムは、たとえば、弱毒化したＬｉｓｔｅ
ｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ(Δｍｐｌ、ΔａｃｔＡ、ΔｐｌｃＢ)、Ｓ
ｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ(ΔａｒｏＡ、ΔｖｉｒＧ)およびＳａｌｍｏ
ｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍｉｓｏｌａｔｅｓを基礎とする細菌自殺ベ
クターを使用する。このような細菌遺伝子導入システムの作製および使用は詳細
に発表されており、到達水準である。従って、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ
の「自殺」株は、たとえば、プロフェッショナル抗原提示細胞を選択的に感染す
ることができる。この細菌は、標的細胞の細胞質内に取込まれた後、Ｌｉｓｔｅ
ｒｉａ 特異的ファージ溶解素によって破壊され、その結果として、細菌によっ
て輸送されたプラスミドＤＮＡが放出され、次にこのＤＮＡと一緒に、細胞核に
侵入する。この細菌系の重要な利点は、細菌の経口投与、および細胞の免疫応答
の導入において中心的な役割を担う、ＡＰＣへのプラスミドの選択的導入である
。侵襲的細菌Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの自殺株を、細胞壁合成に関与する代謝産物の産生に
不可欠な遺伝子を欠失させることによって弱毒化させておく。哺乳類細胞を感染
させた後、これらの細菌株は、代謝産物がないため、溶解する。
【００５４】 プラスミドＤＮＡ さらに、遺伝子導入ベクターがプラスミドであることは好ましい。裸のプラス
ミドＤＮＡは、本発明による核酸配列組合せ用のベクターとして適当である。こ
れらの発現ベクターは、例として、以下の必須エレメントを含む。１つ以上の強
い構成プロモータおよび／または誘導プロモータ、転写ターミネーター、たとえ
ば、ウシ成長ホルモンの転写ターミネーター、抗生物質耐性または形質転換生物
を選択するための別のマーカー、本発明による第１、第２および／または第３お
よび／または第４の核酸配列、および適当な宿主生物でのプラスミドの産生を可
能にする複製起点。第２世代の線状ＤＮＡプラスミド、すなわち、ＭＩＤＧＥト
ランスフェクションベクターと呼ばれるものは、本発明による核酸配列の効果的
な導入に特に適する。ＭＩＤＧＥベクターは、不定数の所望のコード配列、およ
び外来遺伝子の発現に必要なプロモーター配列およびターミネーター配列を含む
２本のＤＮＡポリマー鎖からなり、その鎖は、共有結合的に閉鎖した分子が形成
されるように、両端で、１本鎖デオキシリボヌクレオチドのループと連結してい
る。医療用途に望ましい外来遺伝子を除き、ＭＩＤＧＥＳは、効果的な発現に必
要な制御ユニットと一緒に、通例のＤＮＡ導入ベクターの増幅および選択に必要
なさらなるコード配列を含まない。従って、これらのベクターは、たとえば、潜
在的組込み部位を含むＯｒｉ配列、または選択マーカーとして抗生物質をコード
する配列をもたず、後者の配列は、哺乳類細胞でたびたび完全に停止させること
ができないプロモーターの調節下にある。
【００５５】 哺乳類およびヒト細胞で、遺伝子を導入して、外来遺伝子の改良された発現を
実現するための本システムの効率は、特に、非相同クラスのペプチド、すなわち
、核局在シグナル(ＮＬＳ、核局在配列)と呼ばれるものを付けることによって高
めることができる。たとえば、ＳＶ−Ｔ抗原由来のＮＬＳを使用することによっ
て、ＭＩＤＧＥ様構築物の核への移入を増進し、外来遺伝子の発現を高めること
ができる。さらに、ＭＩＤＧＥＳを組特異的リガンドに結合することにより、特
異的ターゲティングを実現することができる。さらに、裸のＤＮＡと同様に、よ
り効果的に標的細胞内に確実に取込むために、ＭＩＤＧＥＳを多数の非ウイルス
遺伝子導入システムに結合してもよい。
【００５６】 さらに、真核ＤＮＡトランスポゾンの成分を含む遺伝子導入ベクターを使用す
ることが可能である。トランスポゾンは、染色体のある位置から次の位置に移動
することができる天然の遺伝因子である。たとえば、Ｔｃ１／マリナー（ｍａｒ
ｉｎｅｒ）ファミリーを代表するもの、たとえば、スリーピングビューティー（
ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ）トランスポゾンを、哺乳類細胞で使用するの
に適したベクターの作製に使用することができる。これらのベクターの利点は、
多数の調節配列をベクターに組込むことが可能なことである。これらのベクター
は、宿主細胞ゲノムに組込まれ、所望の外来配列を長期にわたって連続的に発現
させることができる。
【００５７】 核酸を真核細胞内に導入するためのシステム さらに、非ウイルス系に基づいて、遺伝子を哺乳類細胞内に導入するための多
数の方法が記載されている。非ウイルスベクターは、粒子仲介遺伝子導入または
アデノウイルスベクター系と組合せて使用されることが多い。
【００５８】 簡単に説明すると、本発明による核酸配列組合せを、所望の外来遺伝子を効果
的に高収率で発現できるようにするのに適した調節要素を有する従来の遺伝子導
入ベクターまたは幾つかの従来の遺伝子導入ベクターの組合せに組込むことがで
きる。次いで、本発明によるベクターを、合成遺伝子導入分子、たとえばポリリ
ジン、プロタミンおよびアルブミン等のポリマーＤＮＡ結合性陽イオンに結合し
てもよく、あるいは、特異的細胞ターゲティングを仲介するリガンド、たとえば
、アシアロオロソムコイド、インスリン、ガラクトース、乳糖またはトランスフ
ェリンに結合してもよい。
【００５９】 さらに、生物分解性ラテックスビーズを使用することによって、裸のＤＮＡの
取込み効率を高めることができる。ラテックスビーズが仲介するエンドサイトー
シスによって、ＤＮＡ負荷ラテックスビーズが効率よく標的細胞内に取込まれる
。ビーズの疎水性上昇、およびこれに伴うエンドソームにおけるビーズの分解増
進によってこの方法の効率を高めることができ、結果として、ＤＮＡがより効果
的に細胞質内に放出される。
【００６０】 さらに、様々なリポソーム組成物および免疫刺激性の再構成インフルエンザヴ
ィロソーム(ＩＲＩＶ、免疫強化再構成インフルエンザヴィロソーム)も、本発明
によるベクターを哺乳類およびヒト細胞に導入するための媒体として適する(米
国特許第５，８７９，６８５号)。さらに、外来核酸配列を、ポリマーＤＮＡ結
合性陽イオン(たとえば、ポリリジン、プロタミンおよびアルブミン)等の合成遺
伝子導入分子に結合した、適当な調節配列を含むベクターに組込み、アシアロオ
ロソムコイド、インスリン、ガラクトース、乳糖またはトランスフェリン等の細
胞ターゲティングリガンドに結合させることができる。別の投与システムは、異
なる組織特異的および／または構成的なプロモータの調節下にある所望の遺伝子
を含む配列の、リポソーム内へのパッケージングに基づく。さらに、光重合ヒド
ロゲル材料との組合せによって、前述の核酸の導入を増進することができる。核
酸を導入するための別の通例使用される方法は、携帯用粒子銃を使用した核酸投
与、および遺伝子導入を活性化するための電離放射線の使用である。
【００６１】 アデノウイルスベクター形質導入の効率を最適化するための他の方法は、感染
(Ｍ．Ｏ．Ｉ)の多様性を変えること、リン酸イオン等のイオンを除去すること、
硫酸プロタミン等のポリカチオン物質を加えること、接触時間温度およびｐＨを
変えること、ならびに細胞とウイルスストックまたはベクターストックとを互い
に一緒に遠心分離することとを含む。
【００６２】 上述の遺伝子導入システムを、単離したヒトまたは哺乳類細胞、特に抗原提示
細胞(単球、マクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞)の遺伝子操作に使用するこ
とができる。レトロウイルス遺伝子導入ベクターを使用する場合、これらの細胞
を感染させることができるように、刺激によって細胞をＳ期に変化させることが
できる。Ｓ期の最初の４分の１ないし半分にある細胞は、特に、レトロウイルス
によるトランスフェクションを受けやすい。
【００６３】 抗原性エピトープを有するポリペプチド 本発明によるベクターは、免疫細胞により認識される、タンパク質、またはタ
ンパク質もしくはポリペプチドの一部(抗原)をコードする核酸配列を含むことを
特徴とする。本発明の意味の範囲内で、免疫細胞は、制御特性または細胞溶解特
性を有するリンパ球、たとえば、ＣＤ８+／ＣＤ４-Ｔ細胞またはＣＤ８-／ＤＣ
４+Ｔ細胞、あるいはＣＤ８-／ＣＤ４-／ＣＤ５６+キラー細胞(ＮＫ細胞)である
。本発明の意味の範囲内で、タンパク質またはポリペプチドは、ヒトまたは動物
細胞に由来するタンパク質である。これらのタンパク質またはポリペプチドは、
攻撃される細胞の表面上に位置する（たとえば、それらの作用の結果としての細
胞膜上の糖タンパク質）か、または細胞内部に位置する（たとえば、制御タンパ
ク質）かのいずれかである。これらのタンパク質またはポリペプチドは、細胞内
で処理され、クラス１またはクラス２ ＭＨＣ分子の関連で、身体の免疫細胞に
提示される。本発明の意味の範囲内のタンパク質またはポリペプチドは、内因性
免疫細胞により認識され、これらの細胞の刺激、すなわち、細胞の増加につなが
り、この増加は、メッセンジャー物質(特に、ＩＦＮ−γ、ＩＬ２、ＴＮＦ)の放
出または免疫細胞の細胞溶解活性によって測定することができる。
【００６４】 本発明によるベクターは、１つ以上の線状エピトープまたは構造的エピトープ
を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むことを特徴とする。これらの
エピトープは、ＭＨＣ分子によって提示された後、免疫病因となるＴ細胞により
認識される。これらのペプチド領域およびエピトープは、他の、免疫原性ポリペ
プチドまたは非免疫原性ポリペプチドの関連で、たとえば融合タンパク質として
、あるいはタンパク質における交換可能なカセットの形態で、コードされ発現さ
れてもよく、このカセットは、タンパク質の領域またはエピトープまたはエピト
ープの組合せをコードする。本発明の意味の範囲内で、タンパク質のエピトープ
は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞等の免疫細胞により認識され得る、タンパク質の領域
、またはアミノ酸配列である。これらのエピトープは、健康な個体に由来する免
疫細胞によっても、自己免疫疾患にも罹患している個体に由来する免疫細胞によ
っても、認識され得る。
【００６５】 本発明によるベクターは、たとえば、自己免疫疾患、免疫病因による慢性的炎
症経過、および組織および器官拒絶反応の処置に使用することができる。たとえ
ば、内因性タンパク質および構造を認識する自己反応性Ｔ細胞は、多くの自己免
疫疾患に関与することが知られている。本発明によるベクターは、これらの内因
性タンパク質および構造をコードして発現させる核酸配列を含むことができる。
Ｔ細胞が病因に関与し、タンパク質および構造がＴ細胞によって攻撃されるする
全ての疾患が、処置に適すると認定されている。
【００６６】 リウマチ学的疾患は、１つの自己免疫疾患群である。たとえば、関節リウマチ
の場合、関節が攻撃され、臨床上の併発症は、関節破壊、腎損傷およびアミロイ
ドーシスである。全身性エリテマトーデスは、様々な器官および組織、たとえば
、中枢神経系および腎を冒し、損傷を与える。シェーグレン症候群は、唾液腺等
の外分泌腺を冒す。多発性筋炎および皮膚筋炎は、筋系および皮膚の自己免疫疾
患であり、および筋無力症および麻痺を来たす。多発性筋痛リウマチおよび側頭
動脈炎は、血管の炎症性疾患であり、筋無力症および失明を引き起こす。ベヒテ
レフ病等の脊椎関節症は、さらに加えて関節を冒し、硬直を来たす。
【００６７】 多数の胃腸疾患は、さらなる自己免疫疾患群を構成する。クローン病は、腸管
全体を冒して、出血、狭窄およびフィステルを来たし、往々にして、腫瘍疾患を
発症する結果となる。潰瘍性大腸炎は、大腸の炎症性疾患であり、穿孔および出
血を来たす。セリアック病は、小腸および大腸の両者を冒し、体重減少を招く。
自己免疫肝炎は、肝硬変および結果として肝臓移植を伴う肝臓の炎症性疾患であ
る。
【００６８】 内分泌学的疾患は、同様に、自己免疫反応に原因があると考えられる。Ｉ型糖
尿病は、膵臓の炎症性疾患であり、たとえば、腎、末梢神経系および眼の障害を
伴い、次には腎および膵臓の移植を必要とする可能性がある、糖尿病および血管
に対する損傷を来たす。副腎不全および甲状腺炎も、Ｔ細胞病原性を含む自己免
疫疾患である。さらに、多数の皮膚疾患が、自己免疫疾患群に属するとして分類
されている。幾つかの例として、乾癬、皮膚炎疱疹状皮膚炎および尋常性天疱瘡
等が挙げられる：これらの疾患では、感染が併発症を引き起こすことがある。脱
毛症は毛髪喪失を来たす。最後に、自己免疫反応に原因があると考えられる神経
学的疾患もある。たとえば、多発性硬化症は、中枢神経系および末梢神経系を冒
し、重症筋無力症は筋系を冒す。これらの両神経学的自己免疫疾患関連の併発症
として、麻痺が発生することもある。
【００６９】 本発明によるベクターは、免疫病因に起因する慢性的炎症経過、たとえばウイ
ルス感染または細菌感染後の慢性炎症（たとえば、Ｂ型肝炎ウイルス感染または
肝炎Ｃウイルス感染の場合の慢性肝炎、または麻疹ウイルス感染後の脳炎）の処
置に使用することもできる。
【００７０】 さらに、本発明によるベクターは、組織および器官拒絶反応の処置に使用する
ことができる。一般に、移植される器官の細胞の表面上の外来構造（その構造は
、全ての細胞上に存在するＭＨＣ(主要組織適合複合体)分子によって本質的に形
成される）に対する免疫応答は、ドナーとレシピエントが互いに適合しないとき
、またはドナーの免疫応答が抑制されないとき、組織および器官の移植を許さな
い。器官移植の意味で、適合するは、ドナーおよびレシピエントにおけるクラス
Ｉ ＭＨＣおよびクラスＩＩ ＭＨＣに対する異なる対立遺伝子が、炎症性反応
が全く起きない十分な程度まで一致することを意味する。
【００７１】 通常、Ｔ細胞は、それらのＴ細胞受容体によって、内因性ＭＨＣと関係のある
非内因性タンパク質のフラグメントを認識する。内因性ＭＨＣと一緒にタンパク
質の内因性フラグメントを認識するＴ細胞は、様々な経路で不活化されるか、ま
たは活性化されないかのいずれかである。移植される器官に対する免疫応答の場
合、内因性ＭＨＣとの組合せで抗原が認識されななくても、レシピエントのＴ細
胞は、同じ抗原と外来ＭＨＣとの組合せを認識する。
【００７２】 移植されるかまたは既に移植された器官に対する寛容を誘導する目的で、移植
と関連して使用される本発明によるベクターは、移植されるかまたは既に移植さ
れた器官型のタンパク質および構造をコードして発現させる。たとえば、膵臓移
植と関連して使用されるベクターは、膵臓由来の独特のタンパク質をコードする
。腎移植または肝臓移植と関連して使用されるベクターは、肝臓細胞または腎細
胞に由来する独特のタンパク質をコードする。コードされるタンパク質は、内皮
細胞等の、器官特異的でないタンパク質も含むが、移植される器官に存在し、器
官拒絶の場合に、炎症性反応の標的を構成するタンパク質は含まない。
【００７３】 次に、本発明によるベクターによりコードされ、発現される、可能な抗原性タ
ンパク質の選択を、例として、３種の自己免疫疾患、すなわち、多発性硬化症、
重症筋無力症、関節リウマチ、およびＩ型糖尿病について、さらに詳細に説明す
る。
【００７４】 多発性硬化症 ヒト中枢神経系の疾患である多発性硬化症(ＭＳ)は、血管周囲の炎症および脱
髄を特徴とする。白髄質体（ｗｈｉｔｅ ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｂｏｄｙ）の、
早期ＭＳ病変および周囲の未だ冒されていない領域における活性化Ｔ細胞の蓄積
は、多発性硬化症の発生における細胞仲介免疫(Ｔ細胞)の役割の重要性を示すも
のである。一般に認められている動物モデル、すなわち、ミエリン成分で免疫化
することにより誘導することができる実験的自己免疫脳脊髄炎(ＥＡＥ)で行われ
た調査研究で、活性化されたミエリン特異的Ｔ細胞によって、ＥＡＥをある動物
から別の動物に導入できることが証明された。一般に、多発性硬化症に罹患して
いる患者で、ミエリンの種々の成分、星状膠細胞の成分、および中枢神経系の細
胞に由来しないタンパク質に向けられた免疫細胞を検出することができる。さら
に、種々の免疫細胞が、成分(エピトープ)の様々な領域を認識し、認識されるエ
ピトープ数の増加は疾患の悪化と相互に関係がある。
【００７５】 ミエリン塩基性タンパク質(ＭＢＰ)は、分離して比較的容易に精製することが
できるミエリンの成分である。中枢神経系(ＣＮＳ)におけるミエリンの約３０％
は、ＭＰＢで構成される。ＭＢＰは、炎症誘導特性を有することが証明されたミ
エリンの第１のタンパク質構成成分であった。例として、本発明によるベクター
は、以下のエピトープを、単独でまたは組合せて、コードして発現させる：ＡＡ
１〜２０、ＡＡ ７〜２６、ＡＡ １６〜３８、ＡＡ ３８〜５５、ＡＡ ５
０〜６８、ＡＡ ６１〜８２、ＡＡ ７１〜８９、ＡＡ ８３〜１０２、ＡＡ
９４〜１１７、ＡＡ １０８〜１３１、ＡＡ １２４〜１４１、ＡＡ １３１〜
１４５、ＡＡ １３９〜１５３、ＡＡ １４８〜１６２、ＡＡ １５３〜１７０
、ＡＡ ８０〜１０２、ＡＡ ８１〜９９、ＡＡ ８２〜１００、ＡＡ ８３〜
９９、ＡＡ ８５〜９９、ＡＡ ８６〜９９およびＡＡ １５９〜１６９。
【００７６】 ミエリンタンパク脂質タンパク質(ＰＬＰ)は、５０％を越える含有率を有し、
中枢神経系におけるミエリンの最大の構成成分である。ＰＬＰは強い疎水特性を
有する膜タンパク質である。ＰＬＰは、主として、ＣＤ４+、ＰＬＰ特異的Ｔ細
胞であり、増殖実験によって、多発性硬化症に罹患している患者の血液中で同定
されている。例として、本発明によるベクターは、単独でまたは組合せて、以下
のエピトープをコードして発現させる：ＡＡ ４０〜６０、ＡＡ ８９〜１０６
、ＡＡ １０３〜１２０、ＡＡ １２５〜１４３、ＡＡ １３９〜１５４、ＡＡ
１〜２７５、ＡＡ ９５〜１１７、ＡＡ １３９〜１５１およびＡＡ １８５
〜２０６。
【００７７】 ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質(ＭＯＧ)は、ミエリンの比較的小さ
い構成成分である。(０．０１〜０．０５％)。ＭＯＧは、２６〜２８ｋＤａの分
子量を有し、免疫グロブリン様可変ドメインおよび２つの疎水性(潜在的)貫膜ド
メインで構成される。ＭＯＧがＴ細胞仲介炎症性反応および脱髄抗体の両者を誘
導する動物モデルで行われた調査研究、および多発性硬化症と関連して行われた
調査研究によって、糖タンパク質は、中枢神経系の脱髄自己免疫疾患における重
要な抗原であると同定された。例として、本発明によるベクターは、個々にまた
は組合せて、ＭＯＧの以下のエピトープをコードして発現させる：ＡＡ １〜２
２、ＡＡ ３５〜５５、ＡＡ ３６〜４５、ＡＡ ３４〜５６、ＡＡ ４３〜５
７、ＡＡ ６４〜９６、ＡＡ ９２〜１０６、ＡＡ １３４〜１４８、ＡＡ １
〜２６、ＡＡ １４〜３９、ＡＡ ２７〜５０、ＡＡ ３８〜６０、ＡＡ ５０
〜７４、ＡＡ ６３〜８７、ＡＡ ７６〜１００、ＡＡ ８９〜１１３、ＡＡ
１０１〜１２５、ＡＡ １６２〜１７８、ＡＡ １６８〜１８２およびＡＡ １
４〜３６。
【００７８】 オリゴデンドロサイト上のミエリン関連の塩基性タンパク質(ミエリン関連オ
リゴデンドロサイト塩基性タンパク質、ＭＯＢＰ)は、ミエリンの主構成成分の
１つである。段階的に進行する多発性硬化症に罹患している患者は、ＭＯＢＰに
対して細胞性免疫反応を示す。例として、本発明によるベクターは、以下のエピ
トープを、個々にまたは組合せて、コードして発現させる：ＡＡ １〜１９、Ａ
Ａ １１〜２９、ＡＡ ２１〜３９、ＡＡ ３１〜４９、ＡＡ ３７〜６０、Ａ
Ａ ４１〜５９、ＡＡ ５１〜６９、ＡＡ ８３〜９９、ＡＡ １〜６０および
ＡＡ ２７〜５０。
【００７９】 オリゴデンドロサイト特異的タンパク質(ＯＳＰ)は、総ミエリンの約７％を示
す。ＯＳＰは、２０７アミノ酸の長さを有する貫膜タンパク質である。ＯＳＰの
第三次構造の比較によって、ＣＮＳにおける末梢ミエリンタンパク質２２との相
同性が明らかにされた。段階的に進行する萎縮多発性硬化症を有する患者の髄液
で、ＯＳＰに対する抗体を検出することができた。ＯＳＰ特異性を有するＴ細胞
は、ヒトに存在することが証明されている。例として、本発明によるベクターは
、以下のエピトープを、個々にまたは組合せて、コードして発現させる：ＡＡ
５２〜７１、ＡＡ ７２〜９１、ＡＡ ８２〜１０１、ＡＡ １０２〜１２１、
ＡＡ １３１〜１５１、ＡＡ １４２〜１６１、ＡＡ １８２〜２０１およびＡ
Ａ １９２〜２０７。
【００８０】 ミエリン関連糖タンパク質(ＭＡＧ)は、中枢神経系および末梢神経系における
ミエリンの構成成分である。ＭＡＧは、１００ｋＤａの分子量を有する膜タンパ
ク質であり、細胞外免疫グロブリン様ドメイン５個、貫膜ドメイン１個および細
胞質ドメイン１個を含む。交互スプライシングによって形成される２つのアイソ
フォーム(Ｌ形およびＳ形)が記載されており、これらの形は、ミエリン形成中の
異なる時期に検出される。ＭＡＧは、ミエリン形成性シュワン細胞の軸索周膜お
よびオリゴデンドロサイトにあり、グリア−軸索相互作用と関係があると考えら
れる。例として、本発明によるベクターは、以下のエピトープを、個々にまたは
組合せてコードして発現させる：ＡＡ ２０〜３４、ＡＡ １２４〜１３７、Ａ
Ａ ３５４〜３７７およびＡＡ ５７０〜５８２。
【００８１】 次に説明するタンパク質は、病原性免疫細胞の他の標的を構成する。末梢神経
系およびシュワン細胞の構成成分としての、糖タンパク質Ｐ０。Ｐ０は、３０ｋ
Ｄａの分子量を有し、末梢神経系におけるコンパクトミエリン（ｃｏｍｐａｃｔ
ｍｙｅｌｉｎ）の量の５０％以上を構成する。末梢ミエリンタンパク質２２(
ＰＭＰ−２２／ＰＡＳ−ＩＩ)は、２２ｋＤａの分子量を有する。ＰＭＰ−２２
は、シュワン細胞特異的ではないが、肺、胃および心臓等の他の組織でも発現さ
れる。ｐ１７０ｋ／ＳＡＧ(シュワン細胞膜糖タンパク質)は、１７０ｋＤａの分
子量を有する糖タンパク質である。ＳＡＧは、有髄化シュワン細胞および非有髄
化シュワン細胞によって産生される。オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク
質(ＯＭｇｐ)は、専ら中枢神経系で発現されるＭＰＢと相同性を有する糖タンパ
ク質である。シュワン細胞ミエリンタンパク質(ＳＭＰ)は、シュワン細胞で形成
される別の糖タンパク質であり、ニワトリで発見された。この糖タンパク質は、
ＭＡＧと４４％の相同性を示す。自己免疫反応性細胞の標的として同定されてい
る他のポリペプチドは、トランスアルドラーゼ、Ｓ１００β、αＢクリスタリン
、２’，３’−サイクリックヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ(ＣＮＰ)
およびＧＦＡＰである。例として、本発明によるベクターは、これらのタンパク
質、またはそのフラグメント、特にＴ細胞エピトープを担持する領域、または領
域の組合せをさらにコードする。
【００８２】 重症筋無力症 進行性筋衰弱を来たす自己免疫疾患である重症筋無力症は、筋細胞上のアセチ
ルコリン受容体に向けられた自己抗体によって引き起こされる。自己抗体の産生
は、特異的Ｔヘルパー細胞に依存する。重症筋無力症患者の１０％は、胸腺の上
皮腫瘍に罹患している。この腫瘍細胞は、アセチルコリン受容体の(サブユニッ
トおよびεサブユニットをコードするｍＲＮＡを合成し、また、ことによると、
このような方式で、胸腺におけるＴ細胞、または循環Ｔ細胞を、誤ってアセチル
コリン受容体のエピトープに対して感作する可能性がある。成熟中の胸腺細胞で
は、寛容誘導機構もことによると混乱している。細胞およびＴ細胞に対するエピ
トープを構成するアセチルコリン受容体のサブユニットにおける領域は、何度も
記載されている。例として、本発明によるベクターは、アセチルコリン受容体の
サブユニット、またはこれらのサブユニットのフラグメント、特に、以下の領域
を、個々にまたは組合せて、コードして発現させる：ＡＡ (１〜４３７、ＡＡ
(３〜１８１、ＡＡ (３７〜１１４、ＡＡ (３７〜１８１、ＡＡ (６２〜９
０、ＡＡ (７３〜９０、ＡＡ (７５〜９０、ＡＡ (７５〜１１５、ＡＡ (１
３０〜１７８、ＡＡ (１３８〜１６７、ＡＡ (１４４〜１５６、ＡＡ (１４
９〜１５８、ＡＡ (１４９〜１６３、ＡＡ (１４６〜１６０およびＡＡ ε２
０１〜２１９。
【００８３】 関節リウマチ 関節リウマチは、自己免疫機構に原因があると考えられる最初の全身性疾患の
１つであった。関節リウマチの本質的に２つの様相から、免疫系の基本的な乱れ
が疾患の原因であることが示唆される。その第１は、多くの場合、炎症性の肥大
性滑膜組織における、ＣＤ４+Ｔ細胞を含むリンパ球の、非常に広範囲の浸潤で
あり、その第２は、滑膜におけるＢ細胞およびプラズマ細胞による大量のリウマ
チ因子の産生である。リウマチ因子は、ＩｇＧの重鎖の構造付与領域に向けられ
た抗体である。関節および関節外構造における特異的組織損傷は、炎症性パンヌ
スおよびリウマチ結節と呼ばれる顆粒細胞の沈着に原因があると考えられる。関
節リウマチ発生に関与するＴ細胞を支持する最も重要な議論は、疾患と特定のＭ
ＨＣクラスＩＩハプロタイプとの強い関連性と、マウスモデルで、単離されたＴ
細胞によって適応可能に疾患が導入されるという観察結果である。結合組織にお
ける構造物（たとえば、コラーゲン、プロテオグルカン類および軟骨細胞上の抗
原）、熱ショックタンパク質および外因性ウイルス抗原または細菌性抗原を含む
非常に多種多様の抗原が、自己反応性免疫細胞の可能な標的であると記載されて
いる。例として、本発明によるベクターは、これらのタンパク質またはそのフラ
グメント、特に、Ｔ細胞エピトープ（たとえばＩＩ型コラーゲン(ＣＩＩ)）を担
持する領域または領域の組合せをコードする。
【００８４】 Ｉ型糖尿病 Ｉ型糖尿病は、遺伝学的疾病素質を含む多因性の自己免疫疾患である。インス
リン産生性β細胞の破壊がＴリンパ球によって引き起こされる。ＢｏｔｈＣＤ４ + Ｔ細胞もＣＤ８+Ｔ細胞も病因に関与し、炎症性反応の発生には、両サブタイプ
が同程度に必要である。糖尿病用の動物モデルである、ＮＯＤマウスを用いた実
験で、ＣＤ８+Ｔ細胞は機能的エフェクター細胞であると同定された。前糖尿病
ＮＯＤマウスから、遺伝学的疾病素質を示すが、免疫細胞を持たないＳＣＩＤ−
ＮＯＤマウスにＣＤ８+Ｔ細胞を導入することによって、疾患を伝達することが
できた。
【００８５】 既に、多数の可能な自己抗原が、糖尿病で同定されている。前糖尿病患者およ
び糖尿病が最近診断された患者で、様々な自己抗原に向けられた抗体が検出され
ている。さらに、ある程度、異なる特異性を有するＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞
が検出されている。本明細書に記載の本発明の関連の中で、遺伝子療法用ベクタ
ーは、ＣＤ４+Ｔ細胞および／またはＣＤ８+Ｔ細胞の標的となる抗原性タンパク
質、タンパク質フラグメント、またはエピトープおよびエピトープの組合せをコ
ードして発現させる機能領域または遺伝子を担持する。本発明の意味の範囲内で
、抗原性タンパク質は、糖尿病に罹患している個体のＴ細胞によって、ＭＨＣク
ラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩと共に、シンジェニック細胞上で認識されるタン
パク質である。
【００８６】 Ｉ型糖尿病における自己免疫機構の１つの標的は、チロシンホスファターゼＩ
Ａ−２である。このタンパク質に対する自己抗体（この自己抗体は、ほとんど常
に、このタンパク質の細胞内ドメインに向けられている）を、糖尿病に罹患して
いる患者で検出することができる。糖尿病に対する遺伝学的疾病素質を有する個
体では、ＩＡ−２に対する自己抗体は、疾患の急速な悪化の明白なマーカーであ
る。糖尿病におけるＴ細胞の抗原性標的として、本ベクターは、ＩＡ−２タンパ
ク質全体、またはそのタンパク質フラグメントをコードして発現させることがで
きる。例として、本発明によるベクターは、以下の領域を、個々にまたは組合せ
て、コードして発現させる（この領域は、ＭＨＣ−ＤＲ４と共に、エピトープ担
持領域として同定されている）：ＡＡ ６５４〜６７４、ＡＡ ７０９〜７３２
、ＡＡ ７５３〜７７１、ＡＡ７９７〜８１７、ＡＡ ８５４〜８７２およびＡ
Ａ ９５５〜９７５。
【００８７】 Ｉ型糖尿病における可能な自己抗原の中で、インスリンおよびその前駆体、す
なわち、プロインスリンは、β細胞で独占的に合成される唯一のタンパク質であ
る。前糖尿病患者および糖尿病患者で、プロインスリンに向けられた自己抗体を
検出することができる。プロインスリン特異的Ｔ細胞を導入することによって、
ＮＯＤマウスで糖尿病を引き起こすことができ、この観察結果から、細胞の免疫
応答の標的としてのプロインスリンの重要性がわかる。糖尿病におけるＴ細胞の
抗原性標的として、本ベクターは、全α鎖、全β鎖、連結ペプチド、全プロイン
スリンタンパク質またはタンパク質フラグメントを、個々にまたは組合せて、コ
ードして発現させる。例として、本発明によるベクターは、エピトープ担持領域
と同定されている、以下の領域をコードして発現させる：α鎖とβ鎖との間の連
結ペプチドの領域からの、ＡＡ １〜１５(ｐ１〜１５)およびＡＡ ３５〜５０
(ｐ３５〜５０)；α鎖の領域からのＡＡ ６〜８０(ａ６〜８０)；β鎖の領域か
らのＡＡ ９〜２３およびＡＡ １０〜２５(ｂ１０〜２５)。
【００８８】 グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５(ＧＡＤ６５)は、Ｉ型糖尿病に罹患して
いる患者における、自己免疫反応の標的構造の１つである。患者の血中の単核細
胞は、細胞分裂と共にタンパク質に反応し、さらに、患者の７０％以上が、ＧＡ
Ｄ６５に向けられた抗体を有する。ＭＨＣ型のため、糖尿病に対する遺伝学的疾
病素質を示す個体では、ＧＡＤ６５およびＩＡ−２に向けられた抗体の組合せは
、Ｉ型糖尿病が発生かけているという強力な兆候である。糖尿病におけるＴ細胞
の抗原性標的として、本ベクターは、全ＧＡＤ６５タンパク質またはそのタンパ
ク質フラグメントをコードして発現させることができる。例として、本発明によ
るベクターは、以下の領域（この領域は、ＭＨＣ−ＤＱ８と共に、エピトープ担
持領域として同定されている）を、個々にまたは組合せて、コードして発現させ
る：ＡＡ １〜６０、ＡＡ ５１〜１２０、ＡＡ １０１〜１１５、ＡＡ １１
１〜１８０、ＡＡ １７１〜２４０、ＡＡ ２０６〜２２０、ＡＡ ２３１〜３
００、ＡＡ ２９１〜３６０、ＡＡ ３５１〜４２０、ＡＡ ４１１〜４８０、
ＡＡ ４３１〜４４５、ＡＡ ４６１〜４７５、ＡＡ ４７１〜５３０、ＡＡ
５２１〜５８５、ＡＡ ５３６〜５５０、ＡＡ １２１〜１４０、ＡＡ ２０１
〜２２０、ＡＡ ２３１〜２５０およびＡＡ ４７１〜４９０。ＧＡＤ６５は、
ＣＤ８+Ｔ細胞の標的でもある。従って、ベクターは、領域ＡＡ １５〜２３も
コードして発現させる。他の可能な領域は、ＡＡ ５０５〜５１９およびＡＡ
５２１〜５３５である。
【００８９】 Ｉ型糖尿病において、熱ショックタンパク質Ｈｓｐ６０は、活性化免疫細胞の
別の標的を構成する。このベクターは、たとえば、Ｔ細胞エピトープであるとＮ
ＯＤマウスで同定されているＡＡ４３７−４６０領域(ペプチド２７７)をコード
して発現させる。Ｔ細胞エピトープを含むＨｓｐ６０タンパク質における多数の
エピトープまたは領域が、糖尿病罹患者および健康な対照個体で同定されている
。例として、本発明によるベクターは、全Ｈｓｐ６０タンパク質またはそのフラ
グメント、特に、Ｔ細胞エピトープを担持する以下の領域、または領域の組合せ
をコードする：ＡＡ １〜２０、ＡＡ １６〜３５、ＡＡ ３１〜５０、ＡＡ
４６〜６５、ＡＡ ６１〜８０、ＡＡ １０６〜１２５、ＡＡ １２１〜１４０
、ＡＡ １３６〜１５５、ＡＡ １５１〜１７０、ＡＡ １６６〜１８５、ＡＡ
１９５〜２１４、ＡＡ ２４０〜２５９、ＡＡ ２５５〜２７５、ＡＡ ２７
１〜２９０、ＡＡ ２８６〜３０５、ＡＡ ３０１〜３２０、ＡＡ ３４６〜３
６５、ＡＡ ４２１〜４４０、ＡＡ ４３６〜４５５、ＡＡ ４６６〜４８５お
よびＡＡ ５１１〜５３０。Ｉ型糖尿病における自己免疫反応の他の標的は、β
細胞の細胞膜内の、未だ特性決定されていないタンパク質によって構成される。
島細胞タンパク質ＩＣＡ６９および分泌顆粒内の３８ｋＤａという分子量を有す
るタンパク質(Ｒｏｅｐ ｅｔ ａｌ．(１９９１)Ｌａｎｃｅｔ ３３７：１４
３９−１４４１)がさらなる抗原であるとして同定されている。例として、本発
明によるベクターは、これらのタンパク質、またはそのフラグメント、特に、Ｔ
細胞エピトープを担持する領域、または領域の組合せをコードする。
【００９０】 アポトーシス誘導性リガンドの発現 本発明によるベクターは、１つ以上のアポトーシス誘導性リガンドをコードす
る核酸配列を含むことを特徴とする。アポトーシスは、遺伝子レベルで制御され
る過程であり、ホメオスタシスの制御、組織および器官の発生、およびもはや必
要とされない免疫系の細胞の除去に関与する過程である。アポトーシスは、染色
体に対する損傷またはウイルス病原体感染によって変化を受けた細胞の除去にも
関与する。正常細胞は、「生存シグナル」と呼ばれるものによってアポトーシス
から保護される。しかし、損傷または感染によって誘発される前アポトーシスシ
グナルは、細胞死で終わる一連の事象を開始する。アポトーシスによる細胞死は
、クロマチンの肥厚、染色体ＤＮＡの断片化、膜の一種の水膨れ、細胞の収縮、
および、最後に、膜に包囲された小胞内の死細胞の分解(アポトーシス体)を特徴
とする。
【００９１】 細胞には、アポトーシスの誘発を来たす、本質的に２つのシグナル経路が存在
する。この２つの経路は、異なるインデューサーに反応する。本発明に関する経
路は、ＣＤ９５／Ｆａｓ／Ａｐｏ１、ＴＲＡＩＬまたはＡｐｏ３等の、細胞の表
面上のアポトーシス受容体の刺激、ならびにＦＡＤＤおよびＴＲＡＤＤ等のアダ
プター分子による仲介によって、制御作用を有するカスパーゼ８(ＦＬＩＣＥ、
イニシエーターカスパーゼ)の活性化、および次のカスパーゼ、たとえば、アポ
トーシスを誘導するカスパーゼ３(エフェクターカスパーゼ)の活性化を来たす。
それに対して、他のシグナル、たとえば、ＤＮＡ損傷、成長因子の欠如、欠陥細
胞付着または活性化腫瘍遺伝子は、ミトコンドリアからの因子、たとえば、チト
クロームＣおよびＡＰＡＦ１、およびＢｃｌファミリーの因子が含まれる、シグ
ナルカスケードの誘導につながる。このカスケードは、カスパーゼ９(イニシエ
ーターカスパーゼ)の活性化、および、次に、カスパーゼ３の活性化につながる
。
【００９２】 アポトーシス受容体は、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)受容体スーパーファミリーの一
部を形成する、「死受容体」と呼ばれるもののサブファミリーに属する。このフ
ァミリーのメンバーは、システインリッチ胞外ドメインの２〜４個のコピーを特
徴とする。アポトーシス受容体は、言い換えれば、アポトーシスシグナルのさら
なる伝達に不可欠な細胞内「死ドメイン」(ＤＤ)を有する。アダプタータンパク
質によって、アポトーシスシグナルは、多数の段階を経て、最終的にアポトーシ
スを開始するカスパーゼに伝達される。
【００９３】 アポトーシス誘導性リガンドは、膜在タンパク質または可溶性タンパク質、た
とえばＣＤ９５Ｌ／ＦａｓＬ／Ａｐｏ１Ｌ、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬまたはＡｐ
ｏ３Ｌであって、他の細胞上、または同一細胞上の、特異的受容体分子、たとえ
ば、ＣＤ９５／Ｆａｓ／Ａｐｏ１、ＴＲＡＩＬまたはＡｐｏ３と相互に作用し、
それにによって、受容体担持細胞におけるアポトーシスを誘導する。アポトーシ
ス誘導性リガンドは、たとえば、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)スーパーファミリーに属
する。ＴＮＦファミリーのメンバーは、構造特性および生化学的特性を特徴とす
る。メンバーは、タンパク質分解的切断によって可溶性リガンドに転換すること
もできるリンホトキシン(ＬＴ)(およびβを除き、ＩＩ型貫膜タンパク質である
。リガンドは、その特異的アポトーシス受容体との相互作用によって、これらの
受容体を三量体化させる、３個の同一サブユニットを有する三量体として存在す
る。
【００９４】 カスパーゼは、一群のシステインプロテアーゼである。１４種のカスパーゼが
今までに哺乳動物(ヒトを含む)で同定されている。カスパーゼは、アミノ酸アス
パラギン酸のカルボキシル側で切れるアミノ酸４個からなるモチーフを認識する
。カスパーゼは、酵素原、すなわち、非常に低い活性を有する前駆体タンパク質
として合成され、これらの酵素原は、タンパク質分解的切断によって活性化され
る。活性化された酵素は、いずれの場合にも、切断した、同一のサブユニット２
個を含むヘテロ四量体である。多数のカスパーゼが自己タンパク分解的切断によ
って活性化されるが、さらなるカスパーゼによって活性化されるものもある。イ
ニシエーターカスパーゼと呼ばれるもの(カスパーゼ８およびカスパーゼ９)は、
エフェクターカスパーゼ(カスパーゼ３)と呼ばれるものをタンパク質分解的切断
によって活性化することにより、自己増大性カスパーゼ活性の雪崩を開始する。
【００９５】 アダプタータンパク質は、アポトーシスのエフェクター(カスパーゼ)とレギュ
レーター(Ｂｃｌ−２ファミリー受容体)との間の連結を構成する。アダプターは
、死ドメイン(ＤＤ)、死エフェクタードメイン(ＤＥＤ)およびカスパーゼ補充ド
メイン(ＣＡＲＤ)と呼ばれるものにより、同形相互作用によって、３群の因子と
物理学的に相互に作用する。
【００９６】 本発明によるベクターは、アポトーシス誘導性リガンドをコードする核酸配列
を含む。たとえば、本ベクターは、受容体分子ＣＤ９５／Ｆａｓ／Ａｐｏ−１に
結合するリガンドＣＤ９５Ｌをコードする。ＣＤ９５は、約４５〜５２ｋＤａの
分子量を有する(３３５アミノ酸)グリコシル化膜タンパク質(Ｉ型)である。タン
パク質の幾つかの可溶性形も、メッセンジャーＲＮＡのディファレンシャルスプ
ライシングの結果として生じる。ＣＤ９５分子の発現は、インターフェロン−γ
(ＩＦＮ−γ)、ＴＮＦおよびＴ細胞活性化によって刺激される。自然状態では、
ＣＤ９５仲介アポトーシスは、天然リガンドＣＤ９５Ｌ(ＦａｓＬ、Ａｐｏ−１
−Ｌ)と結合するＣＤ９５によって誘導される。ＣＤ９５Ｌは、同様に、タンパ
ク質分解的切断の結果として、可溶性形で存在するＴＮＦ関連膜タンパク質(Ｉ
Ｉ型)であり、ＣＤ９５に結合することができる。ＣＤ９５ＬとＣＤ９５との相
互作用は、ＣＤ９５担持細胞のＣａ2+−非依存的(すなわち、パーフォリン／グ
ランザイムによる誘導と異なる)アポトーシスを来たす。
【００９７】 さらに、本発明によるベクターは、特異的受容体分子ＴＲＡＩＬ−Ｒ１(ＤＲ
４)、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２(ＫＩＬＬＥＲ、ＤＲ５、ＴＲＩＣＫ２)、ＴＲＡＩＬ−
Ｒ３(ＬＩＴ、ＤｃＲ１)およびＴＲＡＩＬ−Ｒ４(ＴＲＵＮＤＤ、ＤｃＲ２)に結
合する、タンパク質ＴＲＡＩＬ(ＡＰＯ−２Ｌ)をコードする核酸配列を含むこと
ができる。ＴＲＡＩＬは、多数の細胞、たとえば、ＩＩ型インターフェロン刺激
単球、サイトメガロウイルス感染線維芽細胞、Ｉ型インターフェロン刺激Ｔ細胞
またはＮＫ細胞および抗原刺激Ｔ細胞またはＮＫ細胞上に、自然に存在すること
が証明されている。ＴＲＡＩＬは、多数の形質転換腫瘍細胞系および活性化Ｔ細
胞で、アポトーシスを誘導する。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２受容体をコードするｍＲＮＡ
を、多種多様な組織、たとえば、脾臓、胸腺および末梢血中のリンパ球で検出す
ることができた。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に関するｍＲＮＡを発現させる細胞および組
織は、ＴＲＡＩＬ仲介アポトーシスを受けやすい。
【００９８】 さらに、本発明によるベクターは、ＡＰＯ−３リガンド(Ａｐｏ３Ｌ／ＴＷＥ
ＡＫ)をコードする核酸配列を含むことができる。Ａｐｏ３Ｌは、１４９アミノ
酸の長さを有するＩＩ型貫膜タンパク質である。ＡｐｏＬ３の細胞外領域は、Ｔ
ＮＦと高度の相同性を示す。Ａｐｏ３ＬｍＲＮＡは、多種多様な類リンパ組織お
よび非類リンパ組織で検出されている。ＡｐｏＬ３は、受容体分子Ａｐｏ３(Ｄ
Ｒ３、ＷＳＬ−１、ＴＲＡＭＰ、ＬＡＲＤ)に結合し、受容体担持細胞における
アポトーシスを誘導する。Ａｐｏ３Ｌに対する受容体は、主としてリンパ球の細
胞表面上、たとえば、末梢血(ＰＢＬ)中の非刺激休止リンパ球、フィトヘマグル
チニン(ＰＨＡ)処理ＰＢＬ、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞およびＢ細胞上に発
現される。Ａｐｏ３Ｌによるアポトーシスの誘導は、ＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１によ
り仲介される。ＡｐｏＬ３仲介アポトーシスは、牛痘ウイルスから得られるウイ
ルスのカスパーゼインヒビターＣｒｍＡ、およびバキュロウイルスｐ３５タンパ
ク質によって、ブロックされる。
【００９９】 組換え的に修飾された細胞におけるアポトーシスの阻害 本発明によるベクターは、適切な場合には、１つ以上の抗アポトーシス分子を
コードする核酸配列を含むことを特徴とする。ＣＤ９５、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＭ
Ｐ、ＴＮＦまたはリンホトキシンと、それらの特異的受容体との相互作用は、異
なる細胞間のみならず、同一の細胞上でも起こり、それによって、オートクリン
様式で、アポトーシスを誘導させる。この１例は、活性化された免疫細胞のアポ
トーシス、すなわち、活性化誘導性細胞死と呼ばれるものであり、もはや必要と
されない免疫細胞の除去につながる。Ｔ細胞受容体によって増殖するように刺激
されたＴ細胞は、それらの細胞表面上にＣＤ９５を発現させ、このＣＤ９５は膜
上のＣＤ９５Ｌと相互に作用する。
【０１００】 本発明によるベクターで修飾された細胞における、他の（たとえば、出発細胞
を修飾するときは細胞培養中の）細胞による、このようなオートクリン誘導、ま
たはパラクリン誘導を防止するために、ベクターは、アポトーシスの細胞内イン
ヒビター(抗アポトーシス分子)をコードする核酸配列を含むことができる。これ
らのインヒビターは、細胞膜内の異なる受容体分子、受容体とカスパーゼとの間
で死シグナルを伝達するアダプター分子、またはカスパーゼ自身のいずれかと相
互に反応する。これらのインヒビターは、細胞自身に由来して、アポトーシスの
制御に関与するか、あるいは、十分なウイルスの子孫が産生され、放出されるま
で、ウイルス感染細胞で起きるアポトーシスを防止するウイルスタンパク質であ
るかのいずれかである。
【０１０１】 アポトーシスの誘導は、受容体、アダプターおよびカスパーゼを含むカスケー
ドの様々な段階で、阻害することができる。特に、ウイルスは、免疫機構として
、アポトーシスに対して自分自身を守るために考案された多数の方策を有する。
本発明は、ベクターによって変更された細胞を、アポトーシスのオートクリン誘
導から保護するために、ウイルスおよび細胞の機構を使用する。
【０１０２】 本発明によるベクターは、たとえば、ウイルスのＥ３領域からのアデノウイル
スタンパク質をコードする核酸配列含むことができる。これらのタンパク質は、
ＴＮＦＲが活性化されるとき誘導される膜結合生化学的過程を阻害する。タンパ
ク質Ｅ３−１４．７Ｋは、ＴＮＦ受容体による刺激の結果として、ホスホリパー
ゼＡ２(ＰＬＡ2)によるアラキドン酸の放出を阻害する。アデノウイルスタンパ
ク質Ｅ３−１４．５ＫおよびＥ３−１０．４Ｋは、ＴＮＦＲの刺激後、ＰＬＡ2
の細胞質から細胞膜への転位置を防止する、複合体ＲＩＤを形成する。さらに、
ＲＩＤは、膜結合ＣＤ９５の急速なインターナリゼーションおよびリソソーム分
解を引き起こす。
【０１０３】 さらに、本発明によるベクターは、ＤＥＤドメインと高度の相同性を示すタン
パク質をコードする核酸配列を含むことができる。これらのタンパク質は、ＦＬ
ＩＰと呼ばれ、ウイルスタンパク質は、υＦＬＩＰと呼ばれる。一方では、シグ
ナルは、受容体とＦＡＤＤとの間をなだれ落ち、他方では、カスパーゼ８(ＦＬ
ＩＣＥ)がブロックされ、その結果、ＤＥＤドメインにより、ＦＬＩＰｓ／υＦ
ＬＩＰとアダプタータンパク質ＦＡＤＤとの間の同形相互作用によって、アポト
ーシスが防止される。
【０１０４】 さらに、本発明によるベクターは、次に説明するタンパク質をコードする核酸
配列を含むことができる。伝染性軟属腫ウイルスからのタンパク質ＭＣ１５９(
Ｂｅｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．(１９９７)Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
Ｕ Ｓ Ａ ９４：１１７２−１１７６)およびＭＣ１６０は、ＦＡＤＤに結
合し、それによって、カスパーゼ８およびＦＡＤＤが補充されるのを妨げる。ヘ
ルペスウイルスＢＨＶ−４からのタンパク質ＢＯＲＦＥ２(Ｅ１．１)およびウマ
ヘルペスウイルスＥＨＶ−２(Ｂｅｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．(１９９７)Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９４：１１７２−１１７６)から
のＥ８は、不活性なプロカスパーゼ８に結合し、このような方式で、ＦＡＤＤと
の相互作用および結果として活性化を妨げる。ＨＨＶ−８からのタンパク質Ｋ１
３およびヘルペスウイルスサイミリ（ｓａｉｍｉｒｉ）からのＯＲＦ７１も、Ｄ
ＥＤドメインを有し、同じ方式で作用する。さらに、アポトーシスカスケードに
おけるシグナル因子(ＦＡＤＤ、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ)を結合し、それによって
、不活化する、ウイルスタンパク質をコードすることができる。細胞タンパク質
Ｂｃｌ−２と相同性を示すアデノウイルスタンパク質Ｅ１Ｂ−１９Ｋは、ＦＡＤ
Ｄと相互に作用し、それによって、ＴＮＦＲおよびＣＤ９５からのシグナル導入
をブロックする。加えて、Ｅ１Ｂ−１９Ｋは、さらに、Ｂｃｌ−２を機能的に置
き換えて、ミトコンドリア(カスパーゼ９を介する)による活性化を妨げることが
できる。エプスタインバーウイルスＬＭＰ−１タンパク質は、様々なＴＲＡＦ分
子(ＴＮＦＲ関連の因子)と相互に作用し、それによってＴＮＦＲからのシグナル
導入をブロックする。さらに、ＬＭＰ−１は、ＴＲＡＤＤも結合する。しかし、
たぶん、ＴＲＡＤＤ用の結合部位が修飾されているため、アポトーシスシグナル
カスケードは誘導されない。ＬＭＰ−１はさらに、抗アポトーシスタンパク質Ａ
２０、Ｂｃｌ−２およびＭｃｌ−１の発現を誘導する本発明によるベクターは、
たとえば、プロテインキナーゼＣ仲介経路を経て、Ｆａｓ誘導性アポトーシスに
対する抵抗性を仲介するＳＶ４０ＬＴタンパク質を、さらに発現させる。たとえ
ば、本発明によるベクターは、ポリオーマタンパク質ＳＴおよびＭＴ（両者とも
、ＣＤ９５仲介および／またはＴＮＦＲ仲介アポトーシスに対する抵抗性を仲介
する）をコードする。ＳＴタンパク質は、タンパク質ＰＰ２Ａを結合して阻害す
ることにより、これを実現する。ＭＴタンパク質は、細胞の生存を促進するシグ
ナル経路を直接活性化する。これらの経路は、ＰＩ３キナーゼを含み、これが、
前アポトーシス作用を有するタンパク質Ｂａｄを次にリン酸化し、それによって
不活化する。
【０１０５】 同様に、本発明によるベクターは、修飾された細胞におけるアポトーシスのオ
ートクリン誘導を防止するために、カスパーゼインヒビターをコードすることが
できる。バキュロウイルスＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ
核多面性ウイルス症ウイルス(ＡｃＮＰＶ)およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＨ
Ｖ(ＢｍＮＰＶ)からのｐ３５タンパク質は、ウイルス複製早期に合成され、多数
の非常に様々の刺激によるアポトーシスを防止する。ｐ３５は、ＴＮＦおよびＣ
Ｄ９５のリガンドによるアポトーシスの誘導をブロックする。ｐ３５は、多数の
カスパーゼ(カスパーゼ１、３、６、７、８および１０)によって切断される。し
かし、切断生成物は放出されないが、結合されたままであり、カスパーゼと一緒
に、安定した阻害性複合体を形成する。ｐ３５は、たとえば、本発明によるベク
ターによりコードされることができる。本発明によるベクターは、細胞セルピン
（ｓｅｒｐｉｎ）と相同性を示すウイルスタンパク質もコードすることができる
。セルピンは、キモトリプシン様セリンプロテアーゼであり、多数の異なるカス
パーゼを阻害する。牛痘ウイルスからのＣｒｍＡは、カスパーゼ１および８をブ
ロックすることによって、ＣＤ９５Ｌ誘導性およびＴＮＦＲ誘導性アポトーシス
を阻害する。兎痘ウイルスからのＳＰＩ−１およびＳＰＩ−２タンパク質、およ
びワクシニアウイルスからのタンパク質Ｂ１３Ｒは、ＣｒｍＡと高度の相同性を
示し、同様に、ＣＤ９５ＬおよびＴＮＦによるアポトーシスを阻害する。粘液腫
ウイルスのＳｅｒｐ−１およびＳｅｒｐ−２タンパク質および兎痘ウイルスのＳ
ＰＩ−４タンパク質は、対応する抗アポトーシス特性を有する。さらに、ｖＩＡ
Ｐ等の細胞性ｃＩＡＰと相同なタンパク質、あるいはＦＬＡＭＥ−１またはＩ−
ＦＬＩＣＥ等の細胞性タンパク質をコードすることができる。
【０１０６】 Ｃｙｄｉａ ｐｏｍｐｎｅｌｌａ顆粒症ウイルス(ＣｐＧＰ)、Ｏｒｇｙｉａｐ
ｓｅ ａｕｄｏｔｓｕｇａｔａ多面性ウイルス症ウイルス(ＯｐＭＮＰＶ)および
ＡｃＮＰＶは、上記ｐ３５のシグナルカスケードで作用するウイルスＩＡＰｓ(
ｖＩＡＰ)をコードする。ｖＩＡＰは、不活性なプロカスパーゼおよびカスパー
ゼ８を結合して阻害する（ｖＩＡＰは、既に活性化されたカスパーゼを阻害する
ことはできないが、ｐ３５はできる）。ｃＩＡＰは、ＴＲＡＦ分子と相互に作用
して、非ＴＮＦＲ関連の過程に起因するアポトーシスを阻害することもできる。
保存されたＲＩＮＧ Ｆｉｎｇｅｒモチーフおよび少なくとも１個のいわゆるＢ
ＩＲモチーフ(バキュロウイルスＩＡＰ反復)が、抗アポトーシス活性に必要であ
る。ＦＬＡＭＥ−１は、ＣＤ９５／ＴＮＦ受容体によるアポトーシスを阻害する
細胞タンパク質である(Ｓｒｉｎｉｖａｓｕｌａ ｅｔ ａｌ．(１９９７)Ｊ
Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：１８５４２−１８５４５)。ＦＬＡＭＥ−１は、
カスパーゼ１０およびカスパーゼ８(ＦＬＩＣＥ)に対して高度の相同性を示す。
アミノ末端領域には、他のＤＥＤタンパク質との同形相互作用を可能にするＦＡ
ＤＤのＤＥＤドメインと相同性を示す２つの隣接した領域がある。第３の隣接領
域は、カスパーゼ８および１０の機能的カスパーゼドメインと相同性を示す。Ｆ
ＬＡＭＥ−１は、ＦＡＤＤ、カスパーゼ８およびカスパーゼ９と直接相互に作用
するが、カスパーゼ活性を持たない。従って、ＦＬＡＭＥ−１は、ＣＤ９５／Ｔ
ＮＦ受容体によるアポトーシスの支配的なネガティブなレプレッサーの役割をす
る。阻害作用は、ＣＤ９５／ＴＮＲ受容体／ＦＡＤＤからなる受容体複合体をブ
ロックする、機能的に不活性なＦＬＡＭＥ−１タンパク質の結果として起こる。
Ｉ−ＦＬＩＣＥは、組換え的に修飾された細胞におけるアポトーシスを防止する
ために、本発明によるベクターがコードして発現させることができる、もう１つ
の細胞性インヒビターである(Ｈｕｅｔ ａｌ．(１９９７)Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈ
ｅｍ ２７２：１７２５５−１７２５７)。Ｉ−ＦＬＩＣＥは、ＦＬＩＣＥ／カ
スパーゼ８およびカスパーゼ１０と構造的相同性を示す。アミノ末端領域には、
ＦＡＤＤ ＤＥＤドメインと相同性を有する２つの隣接したドメインがある。カ
ルボキシ末端領域には、カスパーゼドメインと相同性を示すドメインが存在する
。しかし、Ｉ−ＦＬＩＣＥは、カスパーゼ活性を全く示さず、ＣＤ９５／ＴＮＦ
受容体によるアポトーシスの支配的なネガティブなインヒビターの役割をする。
ＦＬＡＭＥ−１と対照的に、Ｉ−ＦＬＩＣＥは、ＦＬＩＣＥ／カスパーゼ８およ
びカスパーゼ１０に結合するだけで、ＦＡＤＤに結合しない。従って、ＣＤ９５
Ｌ／ＴＮＦが、ＣＤ９５／ＴＮＲ受容体／ＦＡＤＤからなる受容体複合体に結合
することによって、Ｉ−ＦＬＡＭＥは補充されない。カスパーゼ８および１０と
複合体を形成し、それによって不活化することにより、阻害作用がもたらされる
。
【０１０７】 本発明によるベクターによって修飾された細胞におけるアポトーシスの阻害は
、たとえば、アンチセンスアプローチ、誘導に関与するタンパク質(アポトーシ
ス受容体、アダプターおよびカスパーゼ)の発現を阻害することによって引き起
こすこともできる。
【０１０８】 一方では、本発明によるベクターによりコードされて合成されるアンチセンス
ＲＮＡは、専らアポトーシスシグナル鎖におけるタンパク質に向けることができ
、ある特定の経路によって、たとえば、膜関連の受容体またはミトコンドリア仲
介経路によって、およびアポトーシスを阻害することができる。他方では、アン
チセンスＲＮＡは、アポトーシスを誘導するためのシグナルカスケードにおける
異なる標的に特異的な様々な領域を含むことができる。アンチセンスＲＮＡにお
けるこれらの異なる領域は、受容体タンパク質、アダプタータンパク質および／
またはカスパーゼに特定期である。本発明によるベクターは、たとえば、個々の
アポトーシス受容体、カスパーゼまたはアダプター分子に特異的に向けられる、
１つのアンチセンスＲＮＡかまたは異なるアンチセンスＲＮＡの組合せのいずれ
かを合成する。あるいは、ベクターは、それぞれ、個々のアポトーシス受容体、
カスパーゼまたはアダプター分子に特異的な幾つかの領域を含む１つのアンチセ
ンスＲＮＡを発現させ、組合せて、アポトーシスに関与する幾つかのタンパク質
の発現を防止する。
【０１０９】 本発明に関して、ベクターは、たとえば、真核細胞におけるアポトーシス受容
体に関するアンチセンスＲＮＡを合成する機能領域を担持する。前アポトーシス
作用を有するシグナルカスケードを開始する受容体分子の発現をブロックするこ
とにより、可能な最も早い段階で、遺伝子療法用ベクターで修飾された細胞にお
けるアポトーシスのオートクリン刺激がブロックされる。
【０１１０】 本発明によるベクターは、たとえば、ＣＤ９５特異的アンチセンスＲＮＡをコ
ードし、ＣＤ９５／Ｆａｓの発現をブロックすることができる。ＣＤ９５をブロ
ックすることにより、ＣＤ９５Ｌ／ＦａｓＬによるアポトーシスの誘導が防止さ
れる。たとえば、遺伝子療法用ベクターは、ＴＮＦＲの発現をブロックし、細胞
をＴＮＦ仲介アポトーシスから保護するＴＮＦＲ特異的アンチセンスＲＮＡをコ
ードして発現させる。あるいは、本ベクターは、たとえば、それぞれ、ＴＲＡＩ
Ｌ−Ｒ１および／またはＴＲＡＩＬ−Ｒ２受容体の発現を防止する、ＴＲＡＩＬ
−Ｒ１特異的および／またはＴＲＡＩＬ−Ｒ２特異的アンチセンスＲＮＡをコー
ドして発現させる。こうすることによって、細胞を、ＴＲＡＩＬ仲介アポトーシ
スに対して抵抗性にさせる。あるいは、遺伝子療法用ベクターは、変化した細胞
におけるＴＲＡＭＰ受容体の発現を防止するＴＲＡＭＰ受容体特異的アンチセン
スＲＮＡをコードして発現させる。こうすることによって、細胞を、ＴＲＡＭＰ
仲介アポトーシスに対して抵抗性にさせる。
【０１１１】 本発明によるベクターは、たとえば、真核細胞におけるアダプタータンパク質
に関するアンチセンスＲＮＡをコードする核酸配列をさらに含むことができる。
これらのアダプター分子は、アポトーシス受容体より下のあるレベルで作用し、
１個のアダプター分子が幾つかのアポトーシス受容体で使用され、１つのアダプ
タータンパク質の発現をブロックすることによって、１つより多いアポトーシス
シグナル経路をブロックすることができる。１つのアダプター分子をブロックす
ることによって、異なるアポトーシス誘導性リガンドに対する抵抗性を実現する
ことができる。本発明によるベクターは、個々のアダプタータンパク質に特異的
に向けられた１つのンチセンスＲＮＡまたは異なるアンチセンスＲＮＡの組合せ
のいずれかを合成する。あるいは、本ベクターは、それぞれ、アダプタータンパ
ク質に特異的な個々の領域を含むアンチセンスＲＮＡを発現させ、組合せて、幾
つかのアダプタータンパク質の発現を防止する。
【０１１２】 本発明に関して、遺伝子療法用ベクターは、たとえば、ＦＡＤＤの発現を防止
するＦＡＤＤ特異的アンチセンスＲＮＡをコードすることができる。ＦＡＤＤ発
現の阻害によって、アポトーシス受容体ＣＤ９５、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１
、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２およびＴＲＡＭＰによるシグナル導入がブロックされる。そ
の結果、細胞は、ＣＤ９５Ｌ、ＴＮＦ、ＴＲＡＩＬおよびＣＤ３によるアポトー
シスの誘導に対して抵抗性になる。さらに、ベクターは、たとえば、ＴＲＡＤＤ
の発現を防止するＴＲＡＤＤ特異的アンチセンスＲＮＡをコードすることができ
る。ＴＲＡＤＤは、ＴＮＦ／ＴＮＦＲによるアポトーシスの誘導に特異的に関与
する。ＲＡＤの発現を阻害することにより、ＴＮＦ／ＴＮＦＲによるアポトーシ
スの誘導が特異的にブロックされる。さらに、本ベクターは、ＡＰＡＦ１特異的
アンチセンスＲＮＡをコードすることができる。ＡＰＡＦ１は、ミトコンドリア
関連経路によるアポトーシスの誘導において中心的な役割を果たすアダプタータ
ンパク質であ。ＡＰＡＦ１はチトクロームＣと一緒にミトコンドリアから放出さ
れ、細胞の細胞質内で、ｄＡＴＰと会合して、カスパーゼ９を活性化する三量体
複合体を形成する。ＡＰＡＦ１の合成を阻害することによって、ミトコンドリア
関連経路によるアポトーシスがブロックされる。
【０１１３】 本発明に関して、遺伝子療法用ベクターは、真核細胞における、カスパーゼ、
たとえば、カスパーゼ１、３、８または９に対するアンチセンスＲＮＡをさらに
コードすることができる。本発明によるベクターは、１つのアンチセンスＲＮＡ
、または個々のカスパーゼに特異的に向けられた異なるアンチセンスＲＮＡから
なる組合せのいずれかを合成するあるいは、本ベクターは、それぞれ、カスパー
ゼに特異的な個々の領域を含むアンチセンスＲＮＡを発現させ、組合せて、幾つ
かのカスパーゼの発現を阻害する。
【０１１４】 自殺酵素 本発明によるベクターは、適切な場合には、組換え的に修飾された細胞を、い
つでも、たとえばｉｎ ｖｉｖｏで、除去することができる、自殺酵素をコード
する核酸配列を含むことを特徴とする。たとえば、自殺遺伝子は、体外から身体
に供給される生物学的基質(プロドラッグ)を有毒物質に転換する酵素および／ま
たは物質を、細胞の酵素によりこれらの物質が基質として使用されるような方式
で修飾する酵素を、コードして発現させる。あるいは、自殺酵素は、それ自身が
誘導な物質をコードするが、組換え的に修飾された細胞でのこれらの遺伝子の発
現は厳しく制御されている。本発明に関して、それ自身が有毒である物質をコー
ドする遺伝子は、細胞で強く抑制され、合成されない。生物学的物質または化学
物質を加えることにより、有毒なタンパク質をコードする遺伝子は活性化され、
次いで、細胞が死ぬ。本発明に関して記載されているベクターは、有毒でないか
または僅かに有毒であるにすぎないプロドラッグを、有毒な物質に転換する自殺
遺伝子をコードすることが好ましい。
【０１１５】 使用されるプロドラッグは、活性化された物質より著しく低い毒性を示さなけ
ればならず、また、酵素を活性化するためのすぐれた基質を構成しなければなら
ない。さらに、これらの物質は、生理的条件下で、十分に化学的に安定でなけれ
ばならず、また、すぐれた薬理学的および薬物動態学的特性をもたなければなら
ない。種類によって、幾つかのプロドラッグが細胞内に取込まれ、有毒物質に細
胞内転換される。他のプロドラッグは、細胞外活性化される。従って、プロドラ
ッグまたは活性化された有毒物質が細胞により容易に取込まれなければならない
。
【０１１６】 たとえば、本発明によるベクターは、単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)チミジン
キナーゼ(ＴＫ)をコードして発現させる。ＨＳＶ ＴＫは、アシクロビルをリン
酸化してアシクロビルジホスフェートにし、これを、細胞性キナーゼがさらにリ
ン酸化する。基質の特異性のため、真核細胞チミジンキナーゼは、アシクロビル
をリン酸化することができず、そのため、非感染細胞またはＨＳＶ ＴＫ陰性細
胞は、グアノシン類似体に耐性がある。たとえば、本発明の治療用ベクターで修
飾されていたＨＳＶ感染および／またはチミジンキナーゼ陽性細胞は、アシクロ
ビルまたはガンシクロビルの全身投与によって選択的に除去することができる。
【０１１７】 さらに、本発明によるベクターは、水痘帯状疱疹ウイルス(ＶＺＶ)チミジンキ
ナーゼをコードすることができる。ＶＺＶ ＴＫの作用は、ＨＳＶ ＴＫの作用
と類似しているが、ＶＺＶ ＴＫは６−メトキシプリンアラビノヌクレオシドを
使用するという違いがある。
【０１１８】 さらに、本発明で述べるベクターは、以下のプロドラッグ／酵素系を活性化す
る酵素をコードすることができる：カルボキシルエステラーゼ(ＣＡ)は、イリノ
テカンを活性化し；シトシンデアミナーゼ(ＣＤ)は、５−フルオロシトシン(５
−ＦＣ)を活性化する；カルボキシペプチダーゼＧ２(ＣＰＧ２)は、２−クロロ
エチル−２−メシルオキシエチルアミノベンゾイル−Ｌ−グルタミン酸(ＣＭＤ
Ａ)およびＣＪＳ２７８Hを活性化し、また、自己活性化プロドラッグドキソルビ
シンおよびダウノルビシンも活性化する；チトクロームＰ４５０(Ｃｙｔ４５０)
は、シクロホスファミド(ＣＰ)、イホスファミド(ＩＦ)、イポメアノール（ｉｐ
ｏｍｅａｎｏｌ）および２−アミノアントラセン(２−ＡＡ)を活性化する；デオ
キシシチジンキナーゼ(ｄＣＫ)は、シトシンアラビノース(ａｒａ−Ｃ)を活性化
する；ニトロリダクターゼ(ＮＲ)は、ＣＢ１９５４(５−アジリジニル−２、４
−ジニトロベンズアミド)を活性化する；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(Ｐ
ＮＰ)は、６−メチルプリン−２’−デオキシリボヌクレオシド(６−ＭｅＰｄＲ
)を活性化する；チミジンホスホリラーゼ(ＴＰ)は、５’−デオキシ−５−フル
オロウリジン(５’−ＤＦＵＲ)を活性化する；キサンチングアニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ(ＸＧＰＲＴ)は、６−チオキサンチン(６−ＴＸ)および６
−チオグアニン(６−ＴＧ)を活性化する。さらに、本発明によるベクターは、５
−フルオロウラシルを活性化する細菌性ウラシルホスホリボシルトランスフェラ
ーゼをコードすることができるか、または、フルオロシトシン(５−ＦＣ)を活性
化する、シトシンデアミナーゼ(ＦＣＹ１)およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＦＵＲ１)か
らなる融合タンパク質をコードすることができる。
【０１１９】 遺伝子療法用の、本発明によるベクター 本発明は、１つ以上のアポトーシス誘導性リガンドをコードする第１の核酸配
列、１つ以上の抗原をコードする第２の核酸配列、および、適切な場合には、１
つ以上の抗アポトーシス分子をコードする第３の核酸配列、および、適切な場合
には、１つ以上の自殺酵素をコードする第４の核酸配列を含む、少なくとも１個
の核酸分子を含む、遺伝子導入ベクターに関する。
【０１２０】 第２の核酸配列の発現が、第１の核酸配列の発現に依存する、すなわち、抗原
の発現が、アポトーシス誘導性リガンドの発現に物理学的に連関し、且つ後者に
依存するように、第１および第２の核酸配列が互いに機能的に連結されている遺
伝子導入ベクターが特に好ましい。さらに、第３の核酸配列の発現が、第４の核
酸配列の発現に依存する、すなわち、抗アポトーシス分子の発現が、常に自殺酵
素の発現に連関し、且つ自殺酵素の発現に依存するように、第３および第４の核
酸配列が機能的に互いに連結している遺伝子導入ベクターが特に好ましい。
【０１２１】 自己免疫疾患、または免疫病因に起因する疾患または移植された組織または器
官の拒絶に基づく疾患等の疾患を治療するために、本発明によるベクターの１つ
で、抗原提示細胞(ＡＰＣ)を処理することができる。ＡＰＣを、たとえば、抗原
、アポトーシス誘導性リガンド、抗アポトーシス分子および自殺酵素をコードす
る核酸配列を含む遺伝子導入ベクターで処理することができる。さらに、ＡＰＣ
を、任意のタイプのベクターの組合せ、たとえば、本発明によるベクター（これ
らのベクターは、異なる抗原をコードする）の幾つかで処理することができる。
ＡＰＣを、たとえば、抗原をコードする本発明によるベクターと、抗アポトーシ
ス分子をコードする本発明によるベクターとの組合せで処理することもできる。
たとえば、ベクターにおける個々の核酸領域が非常に大きく、たとえば、ベクタ
ーの作製または使用にネガティブな影響を及ぼすとき、またはＡＰＣを、異なる
抗原、アポトーシスリガンド、抗アポトーシス分子または自殺酵素をコードする
ベクターで処理するとき、ベクターの組合せが有益である。
【０１２２】 遺伝子情報を発現させるための調節要素 本発明による遺伝子導入ベクターは、第１〜第４の、上述の核酸配列以外に、
たとえば、哺乳類細胞における、たとえば、遺伝子の発現を調節および制御する
ための、さらなる配列および機能領域を含むことができる核酸を含む。これらの
配列および機能領域は、プロモーターおよび／またはプロモーターエレメントで
あってもよく、哺乳類細胞で遺伝子配列を発現させるためのウイルスプロモータ
ー配列であることが好ましい。ウイルスプロモーター配列の例としては、初期Ｓ
Ｖ４０プロモーター、マウス乳癌ウイルス(ＭＭＴＶ)ＬＴＲプロモーター、Ｉ型
ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ−１)ＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後
期プロモーター(Ａｄ ＭＬＰ)および単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)プロモータ
ーなどがある。さらに、非ウイルス遺伝子のプロモーター、たとえばネズミ３−
ホスホグリセリンキナーゼのプロモーター、ヒトユビキチンＣのプロモーターお
よびネズミメタロセイオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｅｉｏｎｅｉｎ）遺伝子の
プロモーターも、哺乳動物で遺伝子配列を効果的に発現させるのに適する。これ
に関して、構成的プロモータまたは制御可能な(誘導可能な)プロモーターを使用
して、発現を実行することができる。従って、例として、ホルモン刺激可能細胞
等の、ある一定の細胞型で、グルココルチコイド誘導プロモータを使用すること
ができる。
【０１２３】 発現率は、通常、上述のプロモーターエレメントを、エンハンサエレメントと
呼ばれるものと組合せることによって高めることができる。これに関して、ウイ
ルスのエンハンサエレメントは、通常、哺乳類細胞由来のエンハンサーより、広
い宿主スペクトルを有するため、多くの場合、特に効果的である。非常に効果的
な代表的なウイルスエンハンサーとしては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサおよ
びラウス肉腫ウイルスＬＴＲおよびヒトサイトメガロウイルスからのプロモータ
ー／エンハンサ組合せなどがある。さらに、たとえば、ホルモン類または金属イ
オン等の、インデューサーの存在下で活性あるにすぎない、制御可能なエンハン
サエレメントを使用することも可能である。
【０１２４】 さらに、これらの配列および機能領域は、リーダー配列および／またはプロセ
ッシング配列、たとえば、プロテアーゼ 切断部位であってもよく、哺乳類
細胞からの外来タンパク質の効果的な分泌を仲介するためには、アデノウイルス
の３部リーダー配列および哺乳類タンパク質の多数のリーダー配列、たとえば、
エリトロポイエチン遺伝子のリーダーおよびｔＰＡリーダーであることが好まし
い。
【０１２５】 さらに、これらの配列および機能領域は、転写終結配列およびポリアデニル化
配列であってもよい。哺乳類発現ベクターで使用するための、幾つかの非常に効
果的なポリＡシグナルは、たとえば、ウシ成長ホルモン、マウスβ−グロビン、
初期ＳＶ４０転写ユニットおよび単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子に由来す
る。原核細胞転写ターミネーターについて詳細に記載されており、それらを組込
むことは、遺伝子発現に多数のポジティブな影響与える。真核細胞では、ヌクレ
オチド配列ＡＴＣ ＡＡＡ（Ａ７Ｔ) ＴＡＧ ＧＡＡ ＧＡを有するコンセン
サス配列が、９遺伝子の終結領域で同定されている。
【０１２６】 さらに、これらの配列および機能領域は、翻訳調節要素であってもよい。従っ
て、最適なＫｏｚａｋ配列(ＣＣ(Ａ／Ｇ)ＣｃａｕｇＧ)は、真核ｍＲＮＡの翻訳
の開始を促進する。これに関して、最適な翻訳開始に特に重要なことは、−３位
のプリンＡまたはＧおよび出発コドンのすぐ上流のＧに結合していなければなら
にことである。
【０１２７】 さらに、イントロンを含まないｃＤＮＡ遺伝子配列を発現させることができる
効率は、ＯＲＦの５′領域でイントロンを融合させることによって、１０〜２０
倍、有意に上昇する場合がある。これに関して、多数の異なるイントロンの例と
して、アデノウイルススプライスドナーを免疫グロブリン遺伝子スプライスアク
セプターに融合することによって作製された合成イントロンＳＩＳ、またはＳＶ
４０ １９Ｓ後期ｍＲＮＡイントロンは、様々な細胞で、ある特定の効力を有す
る。
【０１２８】 さらに、正確な出発コドンにおける翻訳開始は、５′−未翻訳領域にさらなる
ＡＵＧコドンが存在することによってひどく損なわれることがある。このような
阻害は、上流ＡＵＧとインフレームである翻訳終結コドンが存在することによっ
て最小限に抑えることができる。さらに、翻訳は、５′−未翻訳領域(ＵＴＲ)に
おける明確に定められた配列が二次構造を形成する傾向によって損なわれること
が多い。さらに、外来遺伝子配列内の不安定モチーフは、発現率に対してネガテ
ィブな作用を有することがある。この種の代表的な配列は、例として、多くの不
安定な哺乳類ｍＲＮＡの３′ＵＴＲ領域のＡＵ−リッチ配列である。ＵＵＡＵＵ
ＵＡＵＵおよびＵＵＡＵＵＵＡ(Ｕ／Ａ)(Ｕ(／Ａ)は、非常に効果的な不安定配
列モチーフである。所望の外来遺伝子の発現を高めるために、これらの配列モチ
ーフは、除去するかまたは不活化すべきである。
【０１２９】 さらに、適当な宿主特異的コドンを選択して使用すること(コドン使用)によっ
て、所望の核酸配列を発現させる効率を高めることができる。
【０１３０】 発現ベクターは、通常、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよび転写終
結配列の組合せを含む。さらに、エンハンサー、機能的スプライスドナーおよび
アクセプター部位を有するイントロン、およびリーダー配列も、必要に応じて、
モジュラー様式で、構築物内に組込むことができる。発現構築物は、レプリコン
、たとえば、哺乳類細胞等の宿主内で安定して生存することができる染色体外エ
レメント(たとえば、プラスミド)内に含まれることが多い。 哺乳類複製システ
ムは、動物ウイルス由来のものを含み、複製には、トランス活性な因子を必要と
する。たとえば、ＳＶ４０またはポリオーマウイルス等のパポバウイルスの複製
システムを含むプラスミドは、付属するウイルスＴ抗原の存在下で、極めて多い
コピー数で複製する。哺乳類レプリコンの他の例としては、ウシ乳頭腫ウイルス
およびエプスタインバーウイルス由来のものなどがある。さらに、レプリコンは
、宿主での生存を保証する２つの複製システム、たとえば、哺乳動物における遺
伝子発現用の複製システムおよび細菌内でベクターを増幅するためのシステムを
含むことができる。プラスミドｐＭＴ２は、このような哺乳類／細菌シャトルベ
クターの１例である。
【０１３１】 アポトーシス誘導性リガンドの発現制御 リガンドの発現の、スイッチを入れたり切ったりすることができるように、ア
ポトーシス誘導性リガンドをコードする核酸配列を制御することができる。形質
導入細胞では、アポトーシス誘導性リガンド発現のスイッチを完全に切ることが
できる。これは、安定なベクター産生細胞系の作製またはおとり細胞の作製に特
に重要である。ほとんどの細胞は、ウイルス遺伝子導入ベクターの作製に使用す
ることができるパッケージング細胞系および形質導入される抗原提示細胞も含め
、その表面上にアポトーシス受容体を構成的に担持するため、アポトーシス誘導
性リガンドに関する遺伝子を有するこれらの細胞の形質導入により、アポトーシ
スのパラクリンおよびオートクリン誘導を招くであろう。培養において、パッケ
ージング系および／または形質導入細胞におけるリガンドの発現のスイッチを切
ることにより、これらの細胞間の非特異的な相互作用が防止され、培養が可能に
なる。
【０１３２】 次に説明する方法を使用して、リガンドの発現をスイッチ・オフすることが好
ましい。１．ＣｌｏｎＴｅｃｈ，ＵＳＡ．により供給されるＲｅｖＴｅｔシステ
ムを使用することによる。２．発現ベクターおよび制御ベクターによる二重感染
の原理に基づくもう１つの可能性は、真核細胞の細菌の制御システム使用に基づ
く。アポトーシス誘導性リガンドに関する遺伝子は、強い原核細胞Ｔ７プロモー
ターの調節下にある。Ｔ７ポリメラーゼは、パッケージング系または次に形質導
入される細胞のいずれにも存在しないため、リガンドは発現されない。次いで、
リガンドが二重形質導入細胞で発現されるのは、Ｔ７ポリメラーゼに関する遺伝
子を共形質導入するために、第２の制御ベクターが使用されるときだけである。
３．別の適当なシステムは、バクテリオファージＰ１からのＣｒｅ−ｌｏｘＰシ
ステムである。
【０１３３】 抗原およびアポトーシス誘導性リガンドまたは抗アポトーシス分子および自殺酵
素の共発現 アポトーシス作用を有するリガンドと関連した免疫細胞により認識される抗原
、または抗原の構成成分のみを発現する本発明によるベクターが好ましい。この
同時発現は、合同転写物上で核酸配列を連結することにより実現される。これは
、Ｔ細胞を破壊せずに、抗原の構成成分を提示することにより、形質導入細胞が
ｉｎ ｖｉｖｏで特異的Ｔ細胞を刺激するのを防止する。
【０１３４】 構成的プロモーターまたは制御可能プロモーターの転写調節下で、２つ以上の
遺伝子を発現させるために、内部リボソームエントリー部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ：ＩＲＥＳ)を使用することがで
きる。たとえば、ピコルナウイルス、肝炎ＣウイルスまたはＢｉＰ(免疫グロブ
リン重鎖結合性タンパク質)からのＩＲＥＳ、またはレトロウイルスのＩＲＥＳ
配列が使用される。
【０１３５】 強いプロモーターの転写調節下で２つ以上の遺伝子を発現するもう１つの可能
性は、翻訳中にリボソームリーディングフレームにおけるシフトを必要とする配
列を使用することにあり、その結果として、停止コドンが見逃される。通常、Ｒ
ＮＡレベルでのこれらのフレームシフトシグナルは、リボソームが、特異的部位
にて、−１リーディングフレーム内に(５′配向性で)転置され、新しいリーディ
ングフレームで翻訳を続けることを必要とする。このような−１フレームシフト
シグナルは、多数の異なるウイルスファミリー、たとえば、レトロウイルス、コ
ロナウイルス、アストロウイルス、トチウイルス（ｔｏｔｉｖｉｒｕｓ）、ポド
ウイルス（ｐｏｄｏｖｉｒｕｓ）、シホウイルス（ｓｉｐｈｏｖｉｒｕｓ）、ル
テオウイルス（ｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓ）およびダイアンソウイルス（ｄｉａｎｔ
ｈｏｖｉｒｕｓ）で記載されている。例として、ラウス肉腫ウイルス(ＲＳＶ)に
おけるフレームシフト配列は、２つの必須成分、すなわち、配列(ＡＡＡＵＵＵ
Ａ)からなるホモポリマースリペリー（ｓｌｉｐｐｅｒｙ）配列、および数ヌク
レオチド下流にあるＲＮＡ二次構造から成る。以下のスリペリーコンセンサス配
列は、異なるウイルスにおけるスリペリー配列を比較することによって構築され
ており、７ヌクレオチドを含み、且つ２つのホモポリマートリプレット(Ｘ−Ｘ
ＸＹ−ＹＹＺ)を含む配列から成る(Ｂｒｉｅｒｌｅｙ（１９９５）Ｊ Ｇｅｎ
Ｖｉｒｏｌ ７６（Ｐｔ ８)：１８８５−１８９２)。
【０１３６】 たとえば、細菌または真核細胞におけるベクターの複製を可能にするベクター
特異的核酸配列、またはコード領域の発現を可能にする制御核酸配列、またはベ
クターのパッケージングまたは核酸のベクター内へのパッケージングを可能にす
る核酸配列に加えて、本発明によるベクターは、たとえば、１つ以上の自殺酵素
および１つ以上の抗アポトーシス分子をコードする核酸も含む。抗アポトーシス
分子の発現は、常に自殺酵素およびの発現と連結しており、この後者の発現に依
存している。
【０１３７】 治療的に有効な核酸による治療の標的細胞 抗原提示細胞(ＡＰＣ) 自己免疫疾患または免疫病因を含む疾患を治療するために、治療すべき患者か
らのシンジェニックな抗原提示細胞が、おとり細胞の作製に使用される。抗原提
示細胞および反応性細胞のＭＨＣパターンは、必然的に全く同じであり、自己攻
撃的に反応するか、または外来抗原を内因性ＭＨＣと一緒に認識するのはＴ細胞
のみであり、これを、引きつけて除去する。移植拒絶を処置または予防するとき
、器官ドナーから抗原提示細胞を精製する。これらの細胞は、レシピエントを基
準にして、アロジェニック(異なるＭＨＣパターン)である。この場合、ドナーか
らの外来ＭＨＣと一緒に細胞抗原を認識するＴ細胞を認識して除去することが必
要である。
【０１３８】 リンパ球、アクセサリー細胞およびエフェクター細胞は、獲得免疫系の最も傑
出した代表である。リンパ球は、外来抗原を特異的に認識して、特異的体液性免
疫応答および細胞仲介免疫応答を刺激することができる。異なるリンパ球亜集団
は、それらの抗原認識機能および特異的エフェクター機能の性質が異なることが
知られている。Ｂリンパ球は、抗体のプロデューサーである。Ｂリンパ球は、細
胞外抗原およびおよび細胞の表面上に提示される抗原を認識し、抗原との接触後
、抗体分泌プラズマ細胞に分化する。細胞仲介免疫応答のメディエーターである
Ｔリンパ球は、幾つかのサブタイプに細分することができ、そのうちＣＤ４+Ｔ
ヘルパー細胞およびＣＤ８+細胞障害性Ｔ細胞が最も重要である。ヘルパーＴ細
胞および細胞障害性Ｔ細胞は、抗原に対して制限された特異性を示す。ヘルパー
Ｔ細胞および細胞障害性Ｔ細胞は、それぞれ、ＭＨＣクラスＩＩまたはＭＨＣク
ラスＩと一緒に、内因性細胞の表面上に提示されるペプチド抗原を認識するに過
ぎない。特異的ＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド複合体を特異的に認識した後、Ｔヘ
ルパー細胞は、Ｔ細胞および他の免疫細胞、たとえば、Ｂ細胞およびマクロファ
ージを刺激して、増殖および分化させる、サイトカイン類を分泌する。細胞障害
性Ｔ細胞(ＣＴＬ)は、非内因性タンパク質からのペプチドを、ＭＨＣクラスＩタ
ンパク質と一緒にの表面上に提示している細胞を溶解する。これに対して、サプ
レッサーＴ細胞と呼ばれるものは、免疫機能を抑制するサイトカイン類を産生す
るＴヘルパー細胞のサブタイプである。第３のクラスのリンパ球、すなわち、ナ
チュラルキラー(ＮＫ)細胞は、ウイルスおよび細胞内病原体と闘うための固有の
免疫応答成分である。
【０１３９】 抗原提示細胞(ＡＰＣ)は、免疫系の制御に非常に重要である。これらの細胞は
、外来抗原を取込み、小さいペプチドに処理し、ＭＨＣタンパク質と一緒に、細
胞表面上に提示する。２つのクラスのＡＰＣが有名である。プロフェッショナル
ＡＰＣは、生成したペプチドをＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩタンパク質上に
提示し、さらに、Ｂ７．１およびＢ７．２等の共刺激タンパク質を発現させる。
これらのＡＰＣの最も重要な代表は、樹状細胞およびマクロファージ、ならびに
Ｂ細胞である。これらの細胞は、それぞれ、ＭＨＣクラスＩＩおよびＭＨＣクラ
スＩと複合体形成するペプチドを、それらのＴ細胞受容体によって認識する、Ｔ
ヘルパー細胞および細胞障害性Ｔ細胞を刺激する。一方、ＭＨＣ／ペプチド複合
体を提示するが共刺激タンパク質を提示しない非プロフェッショナルＡＰＣは、
既に活性化されたＴ細胞によって認識されるに過ぎない。プロフェッショナルＡ
ＰＣは、ｅｘ ｖｉｖｏで本発明によるベクターが優先的に挿入される対象であ
る主標的細胞である。
【０１４０】 異なる血液リンパ球集団の精製は、多数の集団で記載されており、到達水準で
ある。単核細胞は、たとえば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離
によって、末梢血から精製することができる。さらに、免疫細胞の抗体仲介認識
に基づく他の方法を、細胞集団の陽性選択および陰性選択に使用することができ
る。例として、このような方法は、免疫磁気選択、固定化モノクローナル抗体上
での「パニング」、抗体／補体仲介細胞溶解および蛍光標識細胞の細胞選別であ
る。ＣＤ３は、Ｔ細胞の選択に適した表面マーカーである。特異的Ｔヘルパー細
胞は、ＣＤ４マーカーを用いて選択され、細胞障害性Ｔ細胞は、ＣＤ８マーカー
を用いて選択される。他のＴ細胞亜集団は、マーカーＣＤ３０、ＣＤ４５ＲＡ(
ナイーブＴ細胞)およびＣＤ４５ＲＯ(活性化Ｔ細胞およびメモリーＴ細胞)を用
いて、（前）選択することができる。活性化Ｔ細胞は、ＣＤ６９マーカータンパ
ク質を用いて分離することができる。単球は、表面マーカーＣＤ１４およびＣＤ
１１ｂに向けられた特異的抗体(ＡＢ)を使用して精製することができるが、ナチ
ュラルキラー細胞は、抗ＣＤ１６ＡＢを使用して精製することができ、Ｂ細胞は
、マーカーＣＤ１９およびＣＤ２２を精製することができる。ＡＰＣは、ＨＬＡ
−ＤＲに向けられた特異的抗体を使用して精製することができる。
【０１４１】 単核細胞集団からＴ細胞を分離するのに適した方法は、たとえば、ヒツジ赤血
球(ＳＲＢＣ)を使用したロゼット形成性Ｔ細胞に基づく。さらに、この方法は、
非ロゼット形成細胞集団(Ｂリンパ球、単球およびマクロファージ)の単離を可能
にする。これに関して、ノイラミニダーゼまたは２−アミノエチルイソチオウロ
ニウムブロミド(ＡＥＴ)で処理しておいたＳＲＢＣを使用することが好ましいが
、その理由は、これらの処理済ＳＲＢＣが、高いＴ細胞を示すためである。特異
的表面マーカーを認識するための抗体使用に基づいた前述の方法を使用して、異
なるＴ細胞集団を確実に同定することができる。
【０１４２】 Ｂ細胞は、例として、ＣＤ１９特異的抗体を使用する既述の方法に従って、非
常に能率的に精製することができる。ＦＡＣＳを用いた細胞選別方法および免疫
磁気ビーズの使用方法は、特に適する。例として、単球は、Ｌ−ロイシンメチル
エステルマトリクスへの付着、たとえば、コロイド状シリカ粒子による勾配沈降
法およびフルーサイトメトリーにより単離することができる。しかし、前者の方
法は、単球を活性化する。大量の非活性化単球の精製に非常に適した別の方法は
、水簸機を用いたカウンターフロー遠心分離(カウンターフロー遠心分離水簸、
ＣＣＥ)である。
【０１４３】 例として、ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ１
９抗体、抗ＣＤ１４抗体および抗赤血球抗体を使用したネガティブ選択を用いて
、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配−精製リンパ球集団から単離することがで
きる。
【０１４４】 免疫細胞は、サイトカイン刺激を用いて、他の細胞集団から生成することもで
きる。たとえば、白血球ならびに分化中の前駆細胞および幹細胞を、多数の成長
因子で刺激することができる。特に、活性化Ｔヘルパー細胞および活性化マクロ
ファージにより産生されるサイトカインＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−
６、ＩＬ−９、ＣＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦは、骨髄系幹細胞を
刺激し、次いで、多能性幹細胞、顆粒球−単球前駆細胞、好酸性前駆細胞、好塩
基性前駆細胞、巨核球および赤血球系前駆細胞に分化する。分化は、ＧＭ−ＣＳ
Ｆ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１およびエリトロポイエチン(ＥＰＯ)等の成
長因子によって調整される。次いで、多能性幹細胞は、リンパ系幹細胞、骨髄ス
トロマ細胞、前駆体Ｔ細胞、前駆体Ｂ細胞、胸腺細胞、Ｔヘルパー細胞、細胞障
害性Ｔ細胞およびＢ細胞に分化する。この分化は、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−
６、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−
５等の成長因子によって調整される。顆粒球単球前駆体は、単球、マクロファー
ジおよび好中球に分化する。この分化は、成長因子ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦお
よびＩＬ−８によって調整される。好酸球前駆体は、好酸球に分化する。この過
程は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−５によって調整される。好塩基球前駆体の肥満
細胞および好塩基球への分化は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＩＬ−９により
刺激される。ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯおよびＩＬ−６による刺激後、巨核球は血小
板を産生する。ＥＰＯに刺激されて、赤血球系前駆細胞は赤血球に分化する。単
離された細胞集団の純度は、特異的抗体を使用したＦＡＣＳ分析でモニタリング
される。
【０１４５】 血液中の樹状細胞の比率は０．２％未満である。このため、この細胞集団をｄ
ｉｒｅｃｔｌｙ直接精製する必要はない。しかし、例として、サイトカイン類を
使用して、比較的大量の樹状細胞をＣＤ１４陽性血液単球から生成することがで
きる。サイトカインＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ４は、単球からの分化
中の樹状細胞に適した濃度で使用される。この方法は、多くの場合に公表されて
おり、到達水準である。
【０１４６】 単核細胞全てを細胞培地に取込んで、非特異的に刺激することが可能である。
たとえば、Ｂ細胞は、Ｂ細胞受容体に向けられた架橋抗体を使用するか、あるい
はレクチン(ヨウシュヤマゴボウマイトジェン)またはＩＬ−４を使用して、増幅
するように刺激される。たとえば、Ｔリンパ球は、たとえば、モノクローナル抗
体ＯＣＴ−３等のＣＤ３結合剤と共にインキュベートすることにより、優先的に
刺激することができる。ＣＤ３結合剤は、細胞表面上のＣＤ３分子を結合するリ
ガンドである。リガンドは、２つ以上のＣＤ３分子を架橋することができる、Ｏ
ＣＴ−３等の抗体であってもよい。この架橋は、Ｔリンパ球等のＣＤ３+細胞の
、増殖および活性化を誘導する。さらに、ＣＤ３結合剤によるＴリンパ球の活性
化は、結合剤の濃度、インキュベーション時間、細胞数、インキュベーション温
度、結合剤の結合アフィニティ、親和力および細胞活性化の効率等の個々のパラ
メーターを変えることによって増強することができる。さらに、末梢血単球中の
Ｔ細胞は、ファイトヘマグルチニン(ＰＨＡ)で刺激することができる。例として
、他のリンパ球スティミュレーターは、破傷風毒素、コンカナバリンＡ(Ｃｏｎ
Ａ)、イオノマイシンおよびＰＭＡである。
【０１４７】 さらに、配列モチーフＰｕｒ−Ｐｕｒ−ＣＧ−Ｐｙｒ−Ｐｙｒと一緒に非メチ
ル化ＣｐＧモチーフ配列を含む核酸は、哺乳類Ｂ細胞、単球、マクロファージお
よび樹状細胞ｎ活性化に特に適する。これに関して、ＣｐＧ含有細菌または昆虫
のＤＮＡ、および８ヌクレオチドという最小長を有するＣｐＧ含有合成オリゴオ
キシヌクレオチド(ＯＤＮｓ)も、上述の細胞集団の刺激に適当な可能性がある。
増強された作用は、例として、化学的に修飾され、それによって安定化された、
オリゴヌクレオチド、たとえば、ホスホロチオエート連結ＯＤＮを使用して実現
することができる。哺乳類免疫細胞、たとえば、Ｂ細胞、単球、マクロファージ
および樹状細胞は、ＣｐＧ含有核酸との接触後、直接活性化され、ＭＨＣクラス
ＩＩ分子および共刺激分子の増強された表面発現および明確に定められたサイト
カインｍＲＮＡの増大した転写、ならびにＴＮＦ−(、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１２お
よびＩＬ６等の、プロ炎症性サイトカイン類の分泌という事実。特に、ＣｐＧ含
有ＯＤＮの免疫学的特性の調整は、ＣｐＧモチーフと隣接する配列を特異的に選
択または変更することにより、実現することができる。
【０１４８】 一方では、たとえば、レトロウイルスベクターが細胞ゲノム内に組込まれるた
めに、その後形質導入される細胞の増殖が必要である。他方では、レトロウイル
スベクターを用いた形質導入後に細胞が増加することにより、これらの細胞が適
切なＴ細胞によって認識される可能性が高まる。
【０１４９】 自己免疫疾患または免疫病因を含む疾患を治療するために、治療すべき患者か
らのシンジェニックな抗原提示細胞が、おとり細胞の作製に使用される。抗原提
示細胞および反応細胞のＭＨＣパターンは、必然的に全く同じであり、自己攻撃
的に反応するか、または外来抗原を内因性ＭＨＣと一緒に認識するのはＴ細胞の
みであり、これを、引きつけて除去する。移植拒絶を処置または予防するとき、
器官ドナーの末梢血から抗原提示細胞を精製する。これらの細胞は、レシピエン
トを基準にして、アロジェニック(異なるＭＨＣパターン)である。この場合、ド
ナーからの外来ＭＨＣと一緒に細胞抗原を認識するＴ細胞を認識して除去するこ
とが必要である。
【０１５０】 ＡＰＣの培養 哺乳類またはヒト細胞を、少なくとも１種の明確に定められた成長因子を加え
た適当な栄養培地で培養することができる。異なる細胞型の成長を促進する多数
の成長因子はが記載されている。このような成長因子の典型的な代表は、たとえ
ば、リンパ球の成長および活性化を促進するＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２
およびＩＬ−１５等のサイトカインミトゲンである。その他の細胞型は、特に、
ヒト妊娠ホルモン絨毛性性腺刺激ホルモン(ｈＣＧ)およびヒト成長ホルモンを含
む、ホルモン類等の、異なるクラスの成長因子が［脱落］している。明確に定め
られた細胞集団に適した成長因子の選択は、詳細に記載されており、到達水準で
ある。
【０１５１】 以下の実施例は、本発明の説明を助けるものであって、限定するものと考えて
はならない。
【０１５２】 動物実験データ リガンド遺伝子を用いてネズミ抗原提示細胞(ＡＰＣ)をトランスフェクトする
ためのアデノウイルス遺伝子導入の使用 Ｆａｓ(ＣＤ９５)欠損Ｃ５７ＢＬ(Ｂ６)マウスで腹膜洗浄を実施し、腹膜マク
ロファージを単離した。６ウェルプレートの完全ＤＭＥＭ培地で、ウェル当たり
５(１０6個のマクロファージを２４時間培養し、続いて、Ｆａｓリガンド(Ｆａ
ｓＬ、ＣＤ９５Ｌ)遺伝子の発現を招くアデノアデノウイルスベクター(ＡｄＦａ
ｓＬ)か、または対照ベクター(ＡｄＬａｃＺ、β−ガラクトシダーゼの発現)を
用いて、トランスフェクトした。４８時間後、トランスフェクトされたマクロフ
ァージを、ＦａｓＬの発現および機能性について試験した。Ｆａｃｓ分析で、Ａ
ｄＦａｓＬトランスフェクトマクロファージ(ＡｄＦａｓＬ−ＡＰＣ)のほぼ９０
％が細胞表面上にＦａｓＬ遺伝子を発現していたが、ＡｄＬａｃＺを用いてトラ
ンスフェクトしておいたマクロファージ上で、問題のＦａｓＬ発現を確認するこ
とはできなかった(ＡｄＬａｃＺ−ＡＰＣ)(図１Ａ)。ＦａｓＬ発現が機能的でも
あるかどうかを調査するために、Ｆａｓ発現性Ａ２０標的細胞を使用した細胞障
害性試験で、ＡｄＦａｓＬトランスフェクトマクロファージを使用した。次いで
、標的細胞の濃度依存性細胞溶解が、ＡｄＦａＬ−ＡＰＣを含む培養で確認され
たが、ＡｄＬａｃＺ−ＡＰＣおよびＡ２０標的細胞の培養では、溶解を検出する
ことができなかったか、または自発性溶解を検出できただけであった(図１Ｂ)。
【０１５３】 リガンド発現性ＡＰＣによるＴ細胞のアロジェニック増殖の阻害 ＡｄＦａｓＬ−ＡＰＣ上のＦａｓＬ発現が、Ｔ細胞との相互作用を調節できる
かどうか、また同種異系特異的Ｔ細胞応答を抑制するかどうかを確定するために
、ＡｄＦａｓＬ−ＡＰＣおよびＡｄＬａｃＺ−ＡＰＣをＢ６−ｌｐｒ／ｌｐｒマ
ウス(Ｈ−２Ｄb)から作製し、混合リンパ球反応(ＭＬＲ)で、Ｆａｓ欠損ＭＲＬ
−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス(Ｈ−２Ｄk)またはＦａｓ発現性ＭＲＬ−＋／＋対照マ
ウス(Ｈ−２Ｄk)からのＴ細胞と共に共培養した。アロジェニックＴ細胞増殖は
、［3Ｈ］−チミジンの取込みによって決定した。Ｈ−２ＤkＴ細胞のアロジェニ
ック増殖は、Ｈ−２ＤkＴ細胞のＨ−２ＤbＬａｃＺ−ＡＰＣとの共培養と比較し
たとき(図２Ａ)、Ｈ−２ＤbＦａｓＬ−ＡＰＣとの共培養で有意に減少していた
。さらに、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスからのＦａｓ欠損Ｔ細胞を使用するこ
とによって、この抑制作用は、ＦａｓとＦａｓリガンドとの相互作用に起因し、
必然的に、両分子の機能的発現を必要とすることを証明することができた(図２
Ｂ)。
【０１５４】 ウイルス誘導性自己免疫疾患のマウスモデルにおけるＦａｓリガンド発現性抗原
提示細胞の治療的使用 Ｆａｓリガンド欠損Ｃ５７／ＢＬ６(Ｂ６)ｇｌｄ／ｇｌｄマウスをネズミサイ
トメガロウイルス(ＭＣＭＶ)に感染させることにより、慢性自己免疫炎症反応を
誘導する。ＡｄＦａｓＬ−ＡＰＣによるＴ細胞の抗原特異的抑制が、ｉｎ ｖｉ
ｖｏでも達成されるかどうかを試験するために、慢性自己免疫疾患のマウスモデ
ルで、ＡｄＦａｓＬ−ＡＰＣおよびＡｄＬａｃＺ−ＡＰＣを治療的に試験した。
使用したマウスモデルで、欠損Ｂ６−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスまたはＦａｓＬ欠損
Ｂ６−ｇｌｄ／ｇｌｄマウスを１(１０6ＰＦＵのマウスサイトメガロウイルス(
ＭＣＭＶ)に腹腔内感染させることにより、様々な器官における慢性炎症反応を
誘導したが、ウイルス感染細胞が消失した後、Ｂ６−＋／＋マウスで、関連器官
の変化を検出することができなかった。Ｂ６−ｌｐｒ／ｌｐｒおよびＢ６−ｇｌ
ｄ／ｇｌｄマウスにおける慢性炎症の原因は、ウイルス感染細胞の消失の遅延で
はなく、むしろ、器官における炎症性浸潤物の主たる原因であるＴ細胞の持続的
活性化であり、このため、このマウスモデルは、新規な治療コンセプトの有効性
を試験するのに非常に適していた。さらに、自己抗体の増加を検出することがで
きたため、慢性炎症は、著明な自己免疫成分を示した。図３は、ＭＣＭＶ感染Ｂ
６−＋／＋およびＦａｓＬ欠損Ｂ６−ｇｌｄ／ｇｌｄマウスにおける肺、腎臓お
よび肝臓での炎症反応の組織学的重症度を、経時的に、示す。
【０１５５】 Ｆａｓリガンド発現性ＡＰＣで処理することにより達成されるＭＣＭＶ誘導性慢
性炎症反応の有意な改善 ＭＣＭＶ感染の２８日後、Ｂ６−ｇｌｄ／ｇｌｄおよびＢ６−ｌｐｒ／ｌｐｒ
マウスにＡｄＬａｃＺ−ＡＰＣまたはＡｄＦａｓＬ−ＡＰＣ(１(１０6 ＡＰＣ
ｉ．ｐ．、３日ごとに１２日間)を投与した。さらに、投与前に、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏで、これらのＡＰＣの一部にＭＣＭＶを間欠的に投与した。処置開始の４週
間後、器官を切除して、炎症反応の重症度を判定した(図４)。ＡｄＦａｓＬ−Ａ
ＰＣ投与Ｂ６−ｇｌｄ／ｇｌｄマウスの場合、炎症の有意な改善が認められ、こ
の改善は、先にＭＣＭＶが間欠的に投与されたＡＰＣによって、なおいっそう増
大した。さらに、Ｆａｓ欠損Ｂ６−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスでは、治療効果を検出
することができなかったため、確認された治療効果は、Ｆａｓ仲介性であること
を証明することができた。
【０１５６】 Ｆａｓリガンド発現性ＡＰＣ投与後の、脾臓におけるＭＣＭＶ特異的Ｔ細胞の有
意な減少 同時に、Ｂ６−ｇｌｄ／ｇｌｄマウスから脾臓も切除し、混合リンパ球反応(
ＭＬＲ)で、脾臓細胞を、４８時間にわたって、Ｂ６マウスに由来するＭＣＭＶ
間欠投与ＡＰＣと共に共培養した。ＡｄＦａｓＬ−ＡＰＣ(図５)を投与しておい
た動物から得た脾臓細胞の場合、ＩＬ−２分泌の有意な減少が見られた。この結
果として、ＡｄＦａｓＬ−ＡＰＣは、ｉｎ ｖｉｖｏで、Ｔ細胞を抗原特異的様
式で抑制したことが証明された。
【０１５７】 Ｆａｓリガンド発現性ＡＰＣを投与した結果としての、ＭＣＭＶ感染Ｂ６−ｇｌ
ｄ／ｇｌｄマウスにおける自己抗体の産生減少 ＭＣＭＶ感染Ｂ６−ｇｌｄ／ｇｌｄマウスは、高濃度の自己抗体が発生するた
め、ＡｄＦａｓＬ−ＡＰＣを投与することによって、自己抗体産生に影響を与え
ることができるかどうかを調査するために、実験を実行した。このために、Ａｄ
ＬａｃＺ−ＡＰＣ、ＡｄＦａｓＬ−ＡＰＣまたはＭＣＭＶ間欠投与ＡｄＦａｓＬ
−ＡＰＣのいずれかを投与しておいたマウスの血清中の、リウマチ因子ＩｇＧ１
および抗二本鎖ＤＮＡＩｇＧ１自己抗体のレベルを決定した。ＡｄＦａｓＬ−Ａ
ＰＣを投与した動物で、自己抗体産生の有意な減少が認められ、ＡｄＦａｓＬ−
ＡＰＣにＭＣＭＶを予め間欠投与しておくことによって、抑制をなおいっそう増
大することが可能であった(図６)。
【０１５８】 一次ヒト細胞を使用した実施例 アデノアデノウイルスベクターを用いた一次ヒトマクロファージの有効なトラン
スフェクション 白血球分離法によって単離しておいた一次単球を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで７日間
にわたって、マクロファージに分化させるか、または、ＩＬ−４およびＧＭ−Ｃ
ＳＦを培地に加えることによって、樹状細胞(ＤＣ)に分化させた。次に、様々な
濃度のＡｄＬａｃＺを用いて、マクロファージおよびＤをＣトランスフェクトし
た。他の細胞(たとえば、線維芽細胞またはネズミマクロファージ)と対照的に、
マクロファージもＤＣも、トランスフェクトすることが、著しく困難であった。
しかし、高ＭＯＩ(５００)を使用すると、７２時間後に、ｘ−Ｇａｌ染色を用い
てβ−ガラクトシダーゼを検出することにより、マクロファージのおよそ３０％
で、申し分のないトランスフェクションを示すことができた(図７)。様々なサイ
トカイン類およびリポフェクタミンを使用することによって、トランスフェクシ
ョン率を著明に上昇させることができた。
【０１５９】 寛容原樹状細胞を用いたＴ細胞のアロジェニック増殖阻害 アデノウイルストランスフェクションから切り離して、寛容原ＤＣ表現型も調
査した。他の研究グループは、５日に、ＩＬ−１０をＤＣ培養に加えることによ
り、抑制ＤＣ表現型が作製されるが、同一時期にＴＮＦを付加するとＤＣ表現型
を強く活性化することを示し、この観察結果は、特に、共刺激性分子のディファ
レンシャル発現に原因があると考えられた。従って、これらの２つのＤＣ集団は
、ＭＬＲで、アロジェニックＴ細胞刺激を誘導する能力が異なるかどうかを決定
するために、調査研究を実施した(図８)。ＩＬ−１０−成熟ＤＣは、ＴＮＦ投与
ＤＣより小さいアロジェニックＴ細胞増殖を誘導することが判明した。抗Ｆａｓ
抗体(クローンＣＨ−１１)を加えることによってこの作用をなおいっそう増大す
ることができた。
【０１６０】 ＡＰＣ寛容化によってもたらされる同種異系特異的抑制の証明 確認されたＴ細胞増殖抑制が同種異系特異的であるかどうかを調査するために
、ＭＬＲ開始の５日後にＴ細胞を単離し、次いで、第３のドナー(第３のパーテ
ィー)に由来するＡＰＣに対する第２のＭＬＲで使用した(図９)。これに関して
、最初に、ＩＬ−１０−成熟ＤＣと共に共培養しておいたＴ細胞の反応は、第３
のドナーから得たＡＰＣで、損傷されない様式で進行したため、ＩＬ−１０−成
熟ＤＣは、Ｔ細胞の同種異系特異的抑制をもたらすことを証明することができた
。
【０１６１】 本発明によるベクターの構築 ベクターｐｃＤＮＡ３−ＴＫ−ＩＲＥＳ−ｃｒｍＡ(図１０Ａ)およびｐｃＤＮ
Ａ３−ＦａｓＬ−ＩＲＥＳ−ＰＬＰ(図１０Ｂ)を、本発明によるベクターの例に
とってみる。
【０１６２】 ｐｃＤＮＡ３−ＦａｓＬ−ＩＲＥＳ−ＰＬＰ(図１０Ａ)は、たとえば、アポト
ーシス誘導性リガンドＦａｓＬ、および、例として、抗原タンパク脂質タンパク
質(ＰＬＰ)をコードする核酸配列を含む。アポトーシス誘導性リガンドと同一の
ｍＲＮＡから抗原が翻訳されるように、２つの領域がＩＲＥＳ配列によって連結
されている。このクターは、クローニングベクターｐｃＤＮＡ３に基礎を置く。
ＦａｓＬおよびＰＬＰをコードする核酸領域を、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ
）により、ＲＮＡからｃＤＮＡに転写させる。細胞からＲＮＡを単離する方法、
および特異的ＲＮＡ分子をｃＤＮＡに転写するためのＰＣＲの使用法は、到達水
準である。ＰＣＲ用のプライマーとして使用したオリゴヌクレオチドは、５′末
端に、エンドヌクレアーゼ用の切断部位を含み、これを、次に、ｃＤＮＡをベク
ターｐｃＤＮＡ３にクローニングするために使用した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢ
ａｍＨＩ用の切断部位を用いて、ＦａｓＬをコードする領域を、第１の領域と同
様に、ベクターｐｃＤＮＡ３にクローニングした。続いて、ＢａｍＨＩおよびＥ
ｃｏＲＩ用の切断部位を用いて、ＰＬＰをコードするフラグメントを挿入した。
最後に、ＢａｍＨＩ用認識配列を用いて、ＦａｓＬとＰＬＰとの間に、ＩＲＥＳ
を含む核酸フラグメントをクローニングした。核酸を単離する技法、核酸を切断
する技法、核酸切断生成物を精製する技法、個々の核酸フラグメントのライゲー
ション、および細菌で人為的に作製される核酸の複製は、到達水準である。
【０１６３】 ｐｃＤＮＡ３−ＴＫ−ＩＲＥＳ−ｃｒｍＡ(図１０Ｂ)は、チミジンキナーゼ等
の自殺酵素、およびｃｒｍＡ等の抗アポトーシス分子をコードする核酸配列を含
む。ｃｒｍＡは、ＴＫと一緒に発現できるに過ぎないように、ｃｒｍＡの発現は
、ＩＲＥＳ配列によって、ＴＫの発現と連結されている。このベクターは、クロ
ーンベクターｐｃＤＮＡ３に基礎を置き、クローニング方法、および本発明によ
るベクターの作製方法は、ｐｃＤＮＡ３−ＦａｓＬ−ＩＲＥＳ−ＰＬＰに関する
ものに類似している。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ用の切断部位を用いて、
チミジンキナーゼをコードする領域を、第１の領域と同様に、ベクターｐｃＤＮ
Ａ３にクローニングした。続いて、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ用の切断部位を用
いて、ｃｒｍＡをコードするフラグメントを挿入した。最後に、ＢａｍＨＩ用認
識配列を用いて、ＦａｓＬとＰＬＰとの間に、ＩＲＥＳを含む核酸フラグメント
をクローニングした。２つのベクターｐｃＤＮＡ３−ＦａｓＬ−ＩＲＥＳ−ｃｒ
ｍＡおよびｐｃＤＮＡ３−ＴＫ−ＩＲＥＳ−ＰＬＰの核酸配列を、それぞれ、配
列番号１および配列番号２として記載する。 本発明を以下の図で説明する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＦａｓＬを発現するアデノウイルスに、マウスマクロファージを感染させた結
果を、図表形式で示す図である。ＣＤ９５欠損Ｂ６マウスからのマクロファージ
を精製し、ＬａｃＺ(ＡｄＬａｃＺ、Ａｄ／ＣＶ；ＦａｓＬ対照)またはＦａｓＬ
(ＡｄＦａｓＬ、Ａｄ／ＦＬ)のいずれかを発現しているアデノウイルスに感染さ
せた。(Ａ)ＡｄＦａｓＬ感染マクロファージおよび非感染マクロファージ上での
ＦａｓＬの発現を調査するために、ＦＡＣＳを使用した。Ｔｈｅヒストグラムは
、感染細胞数およびＦａｓＬ発現の強さを示す(Ｙ軸、蛍光性細胞数；Ｘ軸、蛍
光結合抗ＦａｓＬ抗体を使用して決定した蛍光の強さ)。(Ｂ)感染した、Ｆａｓ
Ｌ発現性細胞が、標的細胞においてアポトーシスを誘導する能力を決定するため
の51Ｃｒ放出テスト。２種の異なるアデノウイルスに感染したマクロファージ、
および／または非感染対照マクロファージを、51クロム−標識したＦａｓ+標的
細胞(Ａ２０細胞)と共にインキュベートし、培養上澄への51Ｃｒ放出によって、
標的細胞の溶解を定量した。カウント：ＦａｓＬ発現性細胞数；ＦＬ２−Ｈ／Ｐ
Ｅ：ＦａｓＬ発現の強さ；特異的溶解(％)：ＳＤＳで細胞を溶解することによっ
て最大51Ｃｒ放出が達成された陽性対照を基準にした51Ｃｒの放出；Ｅ／Ｔ比：
エフェクター細胞(感染マクロファージ)の標的細胞(Ａ２０細胞)に対する比率；
Ｍφ−Ａｄ／ＣＶ：ＡｄＬａｃＺ(ＬａｃＺを発現しているアデノウイルス)に感
染したマクロファージ；Ｍφ−Ａｄ／ＦＬ：Ａｄ−ＦａｓＬ(ＦａｓＬを発現し
ているアデノウイルス)に感染したマクロファージ；Ｍφ−ＦＬ：ＦａｓＬ発現
性プラスミドを用いてトランスフェクトしたマクロファージ。
【図２】 ＦａｓＬ発現性抗原提示細胞で、Ｔ細胞のアロジェニック刺激を阻害した結果
を、図表形式で示す図である。マクロファージは、Ｂ６ｌｐｒ／ｌｐｒマウスか
ら単離し、ＬａｃＺ(ＡｄＬａｃＺ)またはＦａｓＬ(ＡｄＦａｓＬ)のいずれかを
発現しているアデノウイルスに感染させた。感染したマクロファージを、(Ａ)Ｆ
ａｓ発現性Ｂ６＋／＋マウスまたは(Ｂ)Ｆａｓ欠損Ｂ６ｌｐｒ／ｌｐｒマウスの
いずれかからのＴ細胞と共に共培養し、3Ｈ−チミジンの取込み(混合リンパ球反
応、ＭＬＲ)によってＴ細胞の刺激を測定した。Ｍφ−ＣＶ：ＡｄＬａｃＺ(Ｌａ
ｃＺを発現しているアデノウイルス)に感染したマクロファージ；Ｍφ−ＦＬ：
Ａｄ−ＦａｓＬ(ＦａｓＬを発現しているアデノウイルス)に感染したマクロファ
ージ。
【図３】 肺、腎臓および肝臓における炎症反応を定量的に分析した結果を、図表形式で
示す図である。Ｂ６+/+およびＢ６ｇｌｄ／ｇｌｄマウスを、マウスサイトメガ
ロウイルス(１(１０5ｐｆｕ)に腹腔内感染させ、次いで、肺(上のパネル)、腎臓
(中間のパネル)および肝臓(下のパネル)における、炎症および組織損傷の程度を
、０(炎症および／または損傷なし)から４(最強の炎症および／または損傷)まで
の相対的スケールで評価した。表示の太線は、各調査時における、少なくとも５
匹のマウスの結果の平均値±標準偏差を示す。
【図４】 感染前に、ＡｄＦａｓＬ感染抗原提示細胞(ＡＰＣ)を投与しておいたマウスサ
イトメガロウイルス感染マウスの肺、腎臓および肝臓における炎症の減少結果を
、図表形式で示す図である。Ｂ６ｇｌｄ／ｇｌｄマウスおよびＢ６ｌｐｒ／ｌｐ
ｒマウスをマウスサイトメガロウイルスに感染させ、感染後２８日に、Ａｄ−Ｃ
ＭＶＬａｃＺ(ＦａｓＬ陰性対照)、マウスサイトメガロウイルス(ＡＰＣ＋ＭＣ
ＭＶ)、ＡｄＦａｓＬ(ＦａｓＬ陽性対照)、またはマウスサイトメガロウイルス
およびＡｄＦａｓＬ(ＭＣＭＶ＋ＡｄＦａｓＬ)のいずれかに感染させておいたＡ
ＰＣを投与した。このマウスに、ＡＰＣを３日間隔で４回投与し、ＡＰＣ治療を
開始した４週間後に検査した。肺、腎臓および肝臓をヘマトキシリン・エオシン
で染色し、独立した３人が評価した。表示の太線は、様々に投与したマウスの異
なる器官における炎症反応の平均値±標準偏差を示す。肺ｇｌｄおよび肺ｌｐｒ
：それぞれ、Ｂ６ｇｌｄ／ｇｌｄマウスおよびＢ６ｌｐｒ／ｌｐｒマウスからの
肺；肝臓ｇｌｄおよび肝臓ｌｐｒ：それぞれ、Ｂ６ｇｌｄ／ｇｌｄマウスおよび
Ｂ６ｌｐｒ／ｌｐｒマウスからの肝臓；腎臓ｇｌｄおよび腎臓ｌｐｒ：それぞれ
、Ｂ６ｇｌｄ／ｇｌｄマウスおよびＢ６ｌｐｒ／ｌｐｒマウスからの腎臓；ＡＰ
Ｃ−ＡｄＬａｃＺ：ＬａｃＺを発現しているアデノウイルスに感染した抗原提示
細胞；ＡＰＣ＋ＭＣＭＶ：マウスサイトメガロウイルスに感染した抗原提示細胞
；ＡＰＣ−ＡｄＦａｓＬ：ＦａｓＬを発現しているアデノウイルスに感染した抗
原提示細胞；ＡＰＣ−ＡｄＦａｓＬ＋ＭＣＭＶ：マウスサイトメガロウイルスお
よびＦａｓＬを発現しているアデノウイルスに感染した抗原提示細胞：＊は、９
５％信頼区間(Ｐ<０．０５)に基づいて、対照群と有意に異なる平均値を示す。
【図５】 感染前にＡｄＦａｓＬ感染抗原提示細胞(ＡＰＣ)を投与しておいたサイトメガ
ロウイルス(ＭＣＭＶ)感染マウスからの、マウスサイトメガロウイルスに特異的
な反応性Ｔ細胞の量を確認する実験の結果を、図表形式で示す図である。Ｂ６ｌ
ｐｒ／ｌｐｒマウスをマウスサイトメガロウイルスに感染させ、図４に記載の種
々のＡＰＣを投与した。ＡＰＣ治療の４週後に、脾臓細胞をＭＣＭＶ感染マウス
から単離した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで、Ｔ細胞をＭＣＭＶ感染ＡＰＣで刺激し、４
８時間後に、ＩＬ−２含有上澄を単離した。ＡＰＣ−ＡｄＬａｃＺ：ＬａｃＺを
発現しているアデノウイルスに感染した抗原提示細胞；ＡＰＣ−ＡｄＦａｓＬ：
ＦａｓＬを発現しているアデノウイルスに感染した抗原提示細胞；ＡＰＣ−Ａｄ
ＦａｓＬ＋ＭＣＭＶ：マウスサイトメガロウイルスおよびＦａｓＬを発現してい
るアデノウイルスに感染した抗原提示細胞ｓ；＊は、９５％信頼区間(Ｐ<０．０
５)に基づいて、対照群と有意に異なる平均値を示す。
【図６】 感染前にＡｄＦａｓＬ感染抗原提示細胞(ＡＰＣ)を投与しておいたサイトメガ
ロウイルス(ＭＣＭＶ)感染マウスにおける、減少した自己抗体産生の結果を、図
表形式で示す図である。Ｂ６ｇｌｄ／ｇｌｄマウスをマウスサイトメガロウイル
スに感染させ、図４に記載の種々のＡＰＣを投与した。ＡＰＣ治療の４週後に、
ＭＣＭＶ感染マウスから血清を単離した。ＲＦＩｇＧ１：リウマチ因子；ｄｓＤ
ＮＡ ＩｇＧ１：二本鎖ＤＮＡに向けられた自己抗体；ＡＰＣ−ＡｄＬａｃＺ：
ＬａｃＺを発現しているアデノウイルスに感染した抗原提示細胞；ＡＰＣ−Ａｄ
ＦａｓＬ：ＦａｓＬを発現しているアデノウイルスに感染した抗原提示細胞；Ａ
ＰＣ−ＡｄＦａｓＬ＋ＭＣＭＶ：マウスサイトメガロウイルスおよびＦａｓＬを
発現しているアデノウイルスに感染した抗原提示細胞；＊は、９５％信頼区間(
Ｐ<０．０５)に基づいて、対照群と有意に異なる平均値を示す。
【図７】 ＬａｃＺを発現しているアデノウイルスに感染させておいたヒトマクロファー
ジ。感染細胞内のβ−ガラクトシダーゼ(ＬａｃＺ)を、その触媒特性によって検
出するＸ−Ｇａｌ染色を使用して、ウイルス感染マクロファージを同定した。
【図８】 抗原提示細胞としての樹状細胞(ＤＣ)の機能に対する、ＩＬ−１０および腫瘍
壊死因子(ＴＮＦ)の調整作用を証明するための実験結果を、図表形式で示す図で
ある。末梢血単核細胞にＩＬ−４およびＧＭ−ＣＦＳを投与することによって、
ｉｎ ｖｉｔｒｏで、樹状細胞を末梢血単核細胞から作製した。ＤＣに、ＴＮＦ
またはＩＬ−１０のいずれかを投与し、次に、アロジェニックＴ細胞と共にイン
キュベートした；次いで、Ｔ細胞の刺激および増加を、3Ｈ−標識チミジンの取
込みによって測定した。ＡＰＣ：抗原提示細胞；ＤＣ(ＴＮＦ)：腫瘍壊死因子(
ＴＮＦ)で刺激しておいた樹状細胞；ＤＣ(ＩＬ−１０)：インターロイキン−１
０で刺激しておいた(ＩＬ−１０)樹状細胞；アロＴ細胞：アロジェニックＭＨＣ
パターン、すなわち、ＤＣとは異なるＭＨＣパターンを有するドナーからのＴ細
胞。Ｘ軸は、反応に使用されたＡＰＣの量を示す。Ｙ軸は、放射標識ヌクレオチ
ドの取込みの尺度またはＴ細胞の刺激の尺度としての、分当たりの放射性崩壊(
ＣＰＭ)を示す。
【図９】 抗原提示細胞(ＡＰＣ)を寛容化することによる同種異系特異的抑制を証明する
ための実験結果を、図表形式で示す図である。末梢血単核細胞にＩＬ−４および
ＧＭ−ＣＦＳを投与することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、末梢血単核細胞か
ら樹状細胞を作製した。ＤＣに、ＴＮＦまたはＩＬ−１０のいずれかを投与し、
続いてアロジェニックＴ細胞と共にインキュベートした。５日後、この反応から
のＴ細胞を、第３のアロジェニックドナーからの抗原提示細胞と共にインキュベ
ートし、Ｔ細胞の刺激および増加を、3Ｈ−標識チミジンの取込によって測定し
た。Ａ、ＢおよびＣは、異なる(アロジェニック)ＭＨＣパターンを有するドナー
を示す；ＭＬＲ：混合リンパ球反応。Ｙ軸は、放射標識ヌクレオチドの取込の尺
度またはＴ細胞の刺激の尺度としての、分当たりの放射性崩壊(ＣＰＭ)を示す。
第１の刺激反応(第１のＭＬＲ)および第２の反応(第２のＭＬＲ)の組成を、個々
のバーの下に示す。
【図１０】 本発明によるベクターの構築物、すなわち、(Ａ)ｐｃＤＮＡ３−ＴＫ−ＩＲＥ
Ｓ−ｃｒｍＡおよび(Ｂ)ｐｃＤＮＡ３−ＦａｓＬ−ＩＲＥＳ−ＰＬＰを図表形式
で示す図である。Ｆａｓリガンド(ＦａｓＬ)、タンパク脂質タンパク質(ＰＬＰ)
、チミジンキナーゼ(ＴＫ)およびｃｒｍＡに関する核酸配列、およびネオマイシ
ンおよびアンピシリン等の抵抗性タンパク質に関する核酸配列等の、コーディン
グリーディングフレームに、薄い矢印で印をつけてある。制御活性を有する真核
細胞プロモーターエレメント、たとえば、ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０プ
ロモーターを、濃い矢印で印をつけてある。ＳＰ６プロモーターおよびｅＴ７プ
ロモーター等の原核細胞プロモーターは、細い曲がった矢印で示す。選択された
制限エンドヌクレアーゼ、たとえば、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩ用の切断部位は、ヌクレアーゼの名称で確認される。制御核酸配
列、たとえば、ＳＶ４０ウイルスポリアデニル化配列(ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ)およ
びＩＲＥＳ、すなわち、内部リボソーム結合部位には、細いバーで印をつけてあ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/12 Ａ６１Ｐ 1/16 1/16 3/10 3/10 5/14 5/14 5/38 5/38 17/00 17/00 17/06 17/06 17/14 17/14 19/02 19/02 21/00 21/00 21/04 21/04 25/00 25/00 29/00 29/00 37/00 37/00 37/02 37/02 37/06 37/06 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA07 BA21 CA04 DA03 EA02 GA11 HA17 4C084 AA13 NA14 ZA02 ZA33 ZA66 ZA72 ZA75 ZA89 ZA92 ZA94 ZA96 ZB05 ZB08 ZB11 ZB15 ZC06 ZC08 ZC35 4C087 AA01 AA02 BC35 BC38 BC76 BC83 ZA02 ZA33 ZA66 ZA72 ZA75 ZA89 ZA92 ZA94 ZA96 ZB05 ZB08 ZB11 ZB15 ZC06 ZC08

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ａ）１つ以上のアポトーシス誘導性リガンドをコードする第
    １の核酸配列と、 ｂ）１つ以上の抗原をコードする第２の核酸配列と、 適切な場合には、 ｃ）１つ以上の抗アポトーシス分子をコードする第３の核酸配列と、 適切な場合には、 ｄ）１つ以上の自殺酵素をコードする第４の核酸配列と を含む、少なくとも１個の核酸分子を含む遺伝子導入ベクター。
  2. 【請求項２】 第１および第２の核酸配列が１つの核酸分子上に存在し、か
    つ第３および第４の核酸配列が別の核酸分子上に存在するか、あるいは最初の３
    つの核酸配列、または４つ全ての核酸配列、または最初の２つと第４の核酸配列
    とが、１つの核酸分子上に存在することを特徴とする請求項１に記載の遺伝子導
    入ベクター。
  3. 【請求項３】 第２の核酸配列の発現が、第１の核酸配列の発現に依存し、
    及び／又は第３の核酸配列の発現が第４の核酸配列の発現に依存するように、第
    １および第２の核酸配列及び／又は第３および第４の核酸配列が互いに機能的に
    連結されていることを特徴とする請求項１または２のいずれか１項に記載の遺伝
    子導入ベクター。
  4. 【請求項４】 ベクターが、ウイルス、特にレトロウイルス、アデノウイル
    ス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルスまたはヘルペス
    ウイルス、あるいは細菌、特にリステリア菌、赤痢菌、またはサルモネラ菌、あ
    るいはリポソーム、プラスミド、ファジミド、コスミド、バクテリオファージま
    たは人工染色体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺
    伝子導入ベクター。
  5. 【請求項５】 第１の核酸配列が、ＣＤ９５Ｌ／ＦａｓＬ／Ａｐｏ１Ｌ、Ｔ
    ＲＡＩＬまたはＡｐｏ３Ｌをコードすることを特徴とする請求項１〜４のいずれ
    か１項に記載の遺伝子導入ベクター。
  6. 【請求項６】 第２の核酸配列が、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンタ
    ンパク脂質タンパク質、オリゴデンドロサイト上のミエリン関連塩基性タンパク
    質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質、ミエリン関連糖タンパク質、糖タ
    ンパク質Ｐ０、末梢ミエリンタンパク質２２、ｐ１７０ｋ／ＳＡＧ、シュワン細
    胞ミエリンタンパク質、トランスアルドラーゼ、Ｓ１００β、αＢクリスタリン
    、２’，３’−サイクリックヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ(ＣＮＰ)
    、ＧＦＡＰ、アセチルコリン受容体のαまたはεサブユニット、ＩＩ型コラーゲ
    ン、チロシンホスファターゼＩａ−２、プロインスリン、ＧＡＤ６５、Ｈｓｐ６
    ０またはＩＣＡ６９の１つ以上のエピトープをコードすることを特徴とする請求
    項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子導入ベクター。
  7. 【請求項７】 第３の核酸配列が、Ｅ３−１４．７Ｋ、Ｅ３−１４．５Ｋ、
    Ｅ３−１０．４Ｋ、ＦＬＩＰ、ｖＦＬＩＰ、ＭＣ１５９、ＭＣ１６０、ＢＯＲＦ
    Ｅ２、ウマヘルペスウイルスＥＨＶ−２からのＥ８、ＨＨＶ−８からのＫ１３、
    ヘルペスウイルスサイミリからのＯＲＦ７１、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ、ＬＭＰ−１、Ｓ
    Ｖ４０からのＬＴタンパク質、ポリオーマタンパク質ＳＴおよびＭＴ、カスパー
    ゼのインヒビターまたはアンチセンスＲＮＡをコードすることを特徴とする請求
    項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子導入ベクター。
  8. 【請求項８】 第４の核酸配列が、チミジンキナーゼ、カルボキシルエステ
    ラーゼ、シトシンデアミナーゼ、カルボキシペプチダーゼＧ２、チトクロームＰ
    ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、ニトロリダクターゼ、プリンヌクレオシド
    ホスホリラーゼ、チミジンホスホリラーゼ、キサンチン−グアニン−ホスホリボ
    シルトランスフェラーゼ、細菌のウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、
    またはシトシンデアミナーゼおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
    ｓｉａｅウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼからなる融合タンパク質を
    コードすることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子導入ベ
    クター。
  9. 【請求項９】 配列番号１または配列番号２で示される核酸配列。
  10. 【請求項１０】 治療薬としての、請求項１〜９のいずれか１項に記載の遺
    伝子導入ベクター。
  11. 【請求項１１】 自己免疫疾患、特に関節リウマチ、全身性エリテマトーデ
    ス、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、リウマチ性多発性筋痛、一過
    性関節炎、脊椎関節症、ベヒテレフ病、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック
    病、自己免疫肝炎、Ｉ型糖尿病、副腎機能不全、甲状腺炎、乾癬、皮膚炎、疱疹
    状皮膚炎、尋常性天疱瘡、脱毛症、多発性硬化症および重症筋無力症を予防また
    は治療するための治療剤、あるいは、免疫病因に起因する炎症経過、特に、ウイ
    ルス感染または細菌感染に続く慢性炎症、特に、Ｂ型肝炎ウイルス感染またはＣ
    型肝炎ウイルス感染に関連した慢性肝炎、または麻疹ウイルス感染に続く脳炎を
    慢性的に予防または治療するための治療剤、あるいは移植拒絶を予防または治療
    するための治療剤を製造するための請求項１〜９のいずれか１項に記載の遺伝子
    導入ベクターの使用。
  12. 【請求項１２】 動物または哺乳類細胞、特にヒト細胞をｅｘ ｖｉｖｏで
    修飾するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子導入ベクターの
    使用。
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