ES2434169T3 - Entrega in vivo de ARN bicatenario a una célula objetivo - Google Patents

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Abstract

Un ácido nucleico o vector de expresión para usar en el tratamiento o prevención de una enfermedad que involucra el hígado o para el tratamiento o prevención de una afección que involucra el hígado mediante la entrega de un ácido nucleico o vector de expresión a una célula del hígado en un animal en donde la entrega comprende: transfectar al menos una célula de la piel o del músculo en dicho animal con el ácido nucleico o vector de expresión, en donde dicha transfección resulta en que dicho ácido nucleico o vector de expresión se entrega a al menos una célula en el hígado.

Description

Entrega in vivo de ARN bicatenario a una celula objetivo.
Campo de la invencion
La invencion se relaciona con metodos para la inhibicion de polinucleotidos objetivo mediada por ARN en celulas de mamifero. Estos incluyen ARNip, ARNhc, miARN, acidos nucleicos antisentidos, y ribozimas que se expresan endogenamente, asi como moleculas de ARNip, ARNhc, miARN, acidos nucleicos antisentidos y ribozima sinteticos que se expresan endogenamente. Los metodos se aplican ademas para proporcionar ARN funcional que incluye ARNm para indicaciones en terapia genica . Mas particularmente, se relaciona con metodos para inhibir la funcion de un polinucleotido objetivo en una celula de mamifero objetivo in vivo que comprende introducir en la primera celula tal como, una celula de la piel, celulas de tejido muscular, que incluyen celulas del musculo esqueletico o estriado (miocito
o mioblasto), o cualquier otra celula competente ARN bicatenario (ARNbc) del mamifero o constructo de expresion del polinucleotido que codifica uno o mas agente(s) ARNbc o iARN que incluyen ARNip, ARNhc, miARN u otros ARNbc, de manera que el agente iARN se entrega distalmente a la celula objetivo.
Antecedentes de la invencion
La capacidad del ARN bicatenario para silenciar eficazmente la expresion genica, un fenomeno que se conoce ahora comunmente como interferencia por ARN (iARN), ha sido uno de los mayores hallazgos cientificos de la pasada decada. Recientemente, los cientificos Andrew Fire y Craig Mello fueron galardonados con el Premio Nobel de Medicina 2006 por su trabajo pionero en el campo de iARN. Sin embargo, quedan aun muchos retos para mover el iARN del laboratorio a la clinica. El mayor reto de la inhibicion de la expresion genica objetivo mediada por iARN en animales y particularmente en humanos es la entrega eficiente del agente iARN a un numero suficiente de celulas objetivo. Una variedad de mecanismos de entrega se estan explorando actualmente en el campo del iARN. Por ejemplo, una serie de grupos demostraron exito y entrega eficiente de ARN bicatenario (bc) al higado de raton por inyeccion en la vena de la cola. McCaffrey y otros (Nature Biotechnol. (2003) 21(6): 639-44) reportaron inhibir la produccion de intermedios replicativos del virus de la hepatitis B en ratones despues de la inyeccion en la vena de la cola de plasmidos que expresan ARN de horquilla pequena especificos del HBV (ARNhc). Giladi y otros (Mol. Therapy (2003) 8(5): 769-76) ademas reportan la inhibicion de la replicacion de HBV en ratones despues de la inyeccion en la vena de la cola del ARN interferente pequeno especifico del HBV (ARNip), y Song y otros (Nature Med. (2003) 9(3): 347-51) reportan la interferencia por ARN de hepatitis fulminante en ratones despues de la inyeccion en la vena de la cola de ARNip especifico para el gen fas. Aunque la inyeccion en la vena de la cola es adecuada para inhibir en los ratones la expresion genica, no es una tecnica clinicamente relevante que se puede usar en los humanos. Sin embargo, diversos grupos han demostrado tambien la entrega exitosa de agentes terapeuticos del ARNbc sin la inyeccion en la vena de la cola usando los ARNbc sinteticos con estabilidad mejorada por administracion sistemica. Ver Soutschek y otros Nature (2004) 432(7014): 173-8; ver ademas Morrissey y otros Hepatol. (2005) 41(6): 1349-56. La administracion local en el higado se demostro ademas inyectando el ARN bicatenario directamente en el sistema circulatorio que rodea el higado usando la cateterizacion de la vena renal. Ver Hamar y otros PNAS (2004) 101(41): 14883-8. Tambien otros reportaron una entrega exitosa de ARNbc y particularmente ARNip usando complejos cationicos o formulaciones liposomales. Ver, por ejemp/o, Landen y otros Cancer Biol. Ther. (2006) 5(12); ver ademas Khoury y otros Arthritis Rheumatol. (2006) 54(6): 1867-77. Ademas de la inyeccion en el sistema circulatorio y medios a base de lipidos para la entrega de ARN bicatenario, diversos grupos han reportado el uso de vectores retrovirales y adenovirales para la introduccion de ARNbc en mamiferos. Por ejemplo, Van den Haute y otros (Human Gene Therapy (2003) 14: 1799-1807) reportaron la entrega del vector lentiviral de horquilla pequena (ARNhc) contra la GFP reportera mejorada (EGFP) que mostraron reducir la expresion genica de la EGFP en el cerebro de raton hasta seis meses despues de la transduccion. McCaffrey y otros (Resumen num. 039, Keystone Symposia on siRNAs and miRNAs, Abril 14-19, 2004) reportaron la infusion intravenosa de adenovirus recombinantes que expresan ARNhc especificos del HBV en ratones infectados con HBV como una posible aproximacion contra la infeccion por el virus de la hepatitis en animales. De este modo, aunque algunos exitos se han demostrado usando la entrega localizada, o mediante el uso de la administracion sistemica del ARNbc estabilizado o complejo, existe todavia una gran necesidad de mecanismos de entrega de iARN in vivo que no requieren de formulaciones especializadas o procedimientos de entrega invasivos. Ademas, los presentes inventores demostraron que la entrega de ARNbc endogeno a base de ADN es especialmente ventajosa en que permite evitar la respuesta de interferon/PKR al proporcionar un suministro prolongado de ARNbc expresados, ver US 2004/0152117. En consecuencia, existe una necesidad en particular de mecanismos de entrega especificos de vectores de expresion de iARN a base de ADN que no requieren el uso de virus. La interferencia por ARN se descubrio primero en el nematodo C. e/eganspor los premios Nobel laureados Andrew Fire y Craig Mello y sus colegas, ver patente de los Estados Unidos 6,506,559. En la patente US '559, Fire y Mello y otros reportan la inhibicion mediada por ARNbc mostro una sorprendente capacidad para cruzar los limites celulares. Esta observacion ya se describio como un fenomeno que es particular de los nematodos o invertebrados, y generalmente los modos correspondientes de dicho trafico de iARN en organismos vertebrados se han diseminado.
Los presentes inventores descubrieron sorprendentemente, sin embargo, que la entrega de constructos de expresion que codifican ARN bicatenarios por via intramuscular, subcutanea e intradermica resulta en la inhibicion especifica de la expresion genica in vivo en el higado y potencialmente otros organos y tejidos de los organismos de mamiferos. Sin deseos de estar limitado por ninguna teoria, los inventores postulan que la entrega de ARNbc al higado del musculo o la piel, por ejemplo, puede estar mediado por vesiculas extracelulares (exovesiculas) que contienen las moleculas de ARN expresadas tales como ARNbc, antisentido, miARN, o ARNm o moleculas de ARN inyectadas/introducidas tales como ARNip, ARNhc, etc. que brotan de la superficie de las celulas del musculo transfectadas. La extrusion de dichas exovesiculas se ha mostrado por diversos tipos de celulas incluyendo el musculo.
Existe evidencia en la tecnica de que ciertas lectinas se exportan de las celulas del musculo y mioblastos a traves de evaginaciones de la membrana celular que se estrangulan para formar vesiculas extracelulares llamadas exovesiculas. Dichas lectinas que incluyen, las beta galectinas se conocen por estar en la superficie de las exovesiculas extrudidas. Ver Cooper y Barondes, Evidence of export of a muscle lectin from cytosol to extracellular matrix and for a novel secretory mechanism. J. Cell Sci. (1990) 110: 1681-91; ver ademas Harrison y Wilson, The 14 kDa beta-galactoside binding lectin in myoblast and myotube cultures: localization by confocal microscopy, J. Cell Sci. (1992) 101(Pt. 3): 635
46. Las vesiculas extracelulares se han observado ademas en la periferia de los fibroblastos, que estan presentes en grandes cantidades en la capa dermica de la piel. Ver Mehul y Hughes, 1997, Plasma membrane targeting, vesicular budding, and release of galectin 3 from the cytoplasm of mammalian cells during secretion, J. Cell Sci. 110: 1169-78. Existe ademas evidencia que las lectinas y ciertas glicoproteinas pueden aclararse a partir de la circulacion por receptores especificos en la superficie de las celulas del higado. Ver, por ejemp/o, Park y otros, The asialoglycoprotein receptor clears glycoconjugates terminating with sialic acid alpha 2,6GaINAc. PNAS (2005) 102(47): 17125-9; ver ademas Nagaoka y otros. Los receptores de galectina se conocen para expresarse en la superficie de los hepatocitos. Ademas, los receptores de betagalectina han demostrado que se expresan de una manera polarizada en el lateral sinusoidal de los hepatocitos, "A quantitative analysis of lectin binding to adult rat hepatocytes cell surfaces", In Vitro Cellular and Developmental Biology (1988) 24: 401-412; "Participation of a galectin-dependent mechanism in the hepatic clearance of tissue-type plasminogen activator and plasma kallikrein." Thromb Res (2003) 108: 257-262. Prud'homme y otros describen la electroporacion del ARN en las celulas del musculo en "Electroporation-enhanced nonviral gene transfer for the prevention or treatment of immunological, endocrine and neoplastic diseases." Current Gene Therapy, vol. 6 num. 2: 243-273.
Asi, los presentes inventores proponen que el contenido citosolico incluyendo los ARN, por ejemplo, ARNm, ARNip/ARNhc/miARN expresado, asi como ARNip/ARNhc/miARN inyectado/introducido, o incluso ADN transfectado presente posiblemente en el citosol se puede empaquetar dentro de estas exovesiculas y se pueden transportar a sitios distales tal como el higado. Otros mecanismos de transferencia no se excluyeron. Sea cual sea el mecanismo, al conocimiento de los presentes inventores, nadie ha reconocido o propuesto la administracion intramuscular, intradermica o subcutanea de ARNbc y ARNbc particularmente expresado in vivo en organismos mamiferos como un mecanismo terapeutico de entrega de acido nucleico para las enfermedades hepaticas asi como enfermedades que afectan otros organos y tejidos distales.
Resumen de la invencion
En consecuencia, la invencion proporciona un acido nucleico o vector de expresion para usar en el tratamiento o prevencion de una enfermedad que involucra el higado o para el tratamiento o prevencion de una afeccion que involucra el higado mediante la entrega de un acido nucleico o vector de expresion a una celula del higado en un animal en donde la entrega comprende transfectar al menos una celula de la piel o del musculo en dicho animal con el acido nucleico o vector de expresion, en donde dicha transfeccion resulta en que dicho acido nucleico o vector de expresion se entrega a al menos una celula en el higado. La invencion proporciona ademas el uso de un acido nucleico o vector de expresion en la fabricacion de un medicamento para entregar un acido nucleico o vector de expresion a una celula del higado en un animal en donde la entrega comprende transfectar al menos una celula de la piel o del musculo en dicho animal con el acido nucleico o vector de expresion, en donde dicha transfeccion resulta en que dicho acido nucleico o vector de expresion se entrega a al menos una celula en el higado.
Las referencias a los metodos de la invencion abarcan su uso en los metodos. Correspondientemente, las referencias a los metodos de la invencion son referencias a los usos en los metodos descritos.
La presente invencion abarca metodos para entregar acidos nucleicos, que incluyen moleculas de ARN bicatenario y/o constructos de expresion de polinucleotidos que codifican moleculas de ARN, por ejemplo, ARNm, antisentido, ribozima
o ARNbc que incluyen agentes iARN tales como ARNip, ARNhc, o miARN, a una celula del higado in vitro o ex vivo mediante la entrega de un acido nucleico a o expresando un acido nucleico en una celula que es competente para dirigirla a la celula distal. La celula puede utilizarse despues para la produccion en cultivo celular de exovesiculas que
contienen ARN, o para trasplante autologo o heterologo en un organismo mamifero receptor. La celula puede ser una celula madre, pero excluyendo las celulas madre embrionarias humanas. En una modalidad, entre otros, la invencion incluye metodos para entregar al menos un ARN bicatenario (ARNbc) a una celula objetivo del higado en un animal que comprende transfectar una primera celula en el animal distinta de dicha celula objetivo con un acido nucleico que codifica dicho ARNbc, en donde dicha transfeccion resulta en que el ARNbc se entrega a la celula objetivo. El acido nucleico que codifica el ARNbc se puede cotransfectar con un acido nucleico que expresa un ligando de transmembrana
o superficie especifico de dicha celula objetivo, ya sea en un vector simple o a traves de constructos de acido nucleicos separados.
Los metodos de la presente invencion se pueden usar para entregar cualquier acido nucleico que es capaz de ser entregado de la celula transfectada a la celula objetivo distal. En algunas modalidades, el acido nucleico es un constructo de expresion del polinucleotido, por ejemp/o, un ADN de plasmido o vector viral, que codifica una molecula efectora de ARN, por ejemp/o, una molecula de iARN que comprende una region de ARNbc homologa y complementaria a un gen objetivo en dicho organo o tejido distal (por ejemplo, para mediar la interferencia por ARN o iARN), u otro ARN biologicamente activo. Moleculas adecuadas de ARNbc o iARN expresadas incluyen ARNhc, ARNip y miARN y se encuentran tipicamente aproximadamente entre 34 a aproximadamente 500 bases de longitud e incluyen regiones bicatenarias o parcialmente bicatenarias de aproximadamente al menos 15 pares de base, tipicamente 19 a 29 pares de base; tamanos de ARNm tipicamente en el intervalo de aproximadamente 700 nts a aproximadamente 15,000 nts de longitud.
En una parte, de otras, la presente descripcion describe los metodos para entregar los acidos nucleicos a los organos y tejidos distales a traves de la administracion intramuscular y transfeccion in vivo de las celulas del musculo con al menos un tipo de acido nucleico. Por ejemplo, la descripcion divulga un metodo para entregar al menos un ARN bicatenario (ARNbc) a un organo o tejido objetivo en un animal que comprende transfectar las celulas del musculo esqueletico en dicho animal con un acido nucleico que codifica dicho ARNbc, en donde dicha transfeccion resulta en que dicho ARNbc se entrega a dicho tejido u organo objetivo. Cuando se transfectan celulas del musculo esqueletico, el organo o tejido objetivo es un organo o tejido o celula diferente al musculo esqueletico. En algunas partes, una celula de musculo esqueletico se transfecta con un constructo de expresion que codifica una molecula de ARNbc, la molecula de ARNbc se expresa en la celula del musculo esqueletico, y la molecula de ARNbc se entrega a una celula objetivo que no es una celula de musculo esqueletico.
En otra parte, entre otros, la presente descripcion describe los metodos para administrar acidos nucleicos a los organos y tejidos distales a traves de la administracion intradermica o subcutanea y la transfeccion in vivo de celulas de la piel incluyendo fibroblastos con al menos un tipo de acido nucleico. Por ejemplo, la invencion incluye un metodo para entregar al menos un ARN bicatenario (ARNbc) a un organo o tejido objetivo en un animal, que comprende transfectar las celulas de la piel de dicho animal con un acido nucleico que codifica dicho ARNbc, en donde dicha transfeccion resulta en dicho ARNbc que se entrega a dicho tejido u organo objetivo. Cuando las celulas de la piel se transfectan, el organo o tejido objetivo es un organo o tejido o celula diferente de la piel. En algunas modalidades, una celula de la piel se transfecta con un constructo de expresion que codifica una molecula de ARNbc, la molecula de ARNbc se entrega a una celula objetivo que no es una celula de la piel.
Mientras que algunas modalidades abarcan transfectar con un acido nucleico que codifica un ARNbc las celulas del musculo esqueletico, o celulas de la piel en un animal, se abarcan ademas los metodos en donde el ARNbc se transfecta directamente en las celulas del musculo, o celulas de la piel. Estas moleculas de ARNbc incluyen moleculas de ARNip, ARNhc y o miARN sinteticas y transcritas exogenamente preparadas, incluyendo ARN quimicamente modificados. Por ejemplo, la descripcion incluye un metodo para entregar al menos un ARNbc al organo o tejido objetivo de un animal, que comprende transfectar celulas del musculo esqueletico, celulas de la piel, u otras celulas competentes especificas en dicho animal con dicho ARNbc, en donde dicha transfeccion resulta de que se entrega dicho ARNbc a dicho otro organo o tejido objetivo. Las moleculas adecuadas de ARNbc incluyen los ARNhc, ARNip y miARN y estan tipicamente entre aproximadamente 34 y aproximadamente 500 nucleotidos, preferentemente comprenden al menos 15 a 29 pares de bases en la conformacion bicatenaria, incluyendo en algunas solicitudes ciertos desajustes como los miARN . Los metodos de la invencion se pueden realizar para no inducir una respuesta de interferon/PKR, por ejemplo usando moleculas de ARNbc mas cortas entre 19 a 29 pares de bases, o usando otros metodos conocidos en la tecnica ver publicacion de los Estados Unidos 2004/0152117. Los ARN se pueden modificar quimicamente como conocido en la tecnica para aumentar la estabilidad y disminuir la toxicidad y efectos no especificos.
Los solicitantes demostraron ademas que las moleculas de ARNbc, que incluyen moleculas de ARNbc largas (por ejemp/o, al menos aproximadamente 60, aproximadamente 75, aproximadamente 100, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 300, aproximadamente 400, aproximadamente 500, aproximadamente 600 bp y mayores), pueden expresarse intracelularmente en celulas de mamifero competentes para la respuesta al estres (por ejemp/o, celulas adultas, diferenciadas o no embrionarias) sin evidencia de su induccion de respuesta al interferon, estres, o "panico", ver US 2004/0152117A1. Adicionalmente, los metodos de la invencion pueden servir para reducir al minimo o evitar la induccion de una respuesta al estres en la celula objetivo a la que el ARNbc se entrega con independencia de la longitud o naturaleza del ARNbc; por ejemplo, los ARNbc entregados a las celulas distal dentro de "protuberancias" puede evitar la induccion de una respuesta al estres, a diferencia de los mismos ARNbc que entran a traves de la membrana celular sin la cubierta de la "protuberancia" alrededor. Cualquier molecula puede conjugarse con ARNbc, cotransfectarse o co-expresarse con este, e incluso puede entregarse con este a la celula objetivo.
La presente descripcion abarca ademas los metodos para tratar o prevenir las enfermedades en los organos o tejidos distales en un animal a traves de la administracion intramuscular, intradermica o subcutanea o transfeccion in vivo de otras celulas competentes especificas, con al menos un acido nucleico. Por ejemplo, la descripcion incluye un metodo para tratar o prevenir la enfermedad en el organo o tejido objetivo en un animal, que comprende transfectar las celulas del musculo esqueletico, celulas de la piel u otras celulas competentes no-objetivo en dicho animal con un acido nucleico que codifica un ARNbc correspondiente con un gen objetivo en una celula de dicho organo o tejido objetivo, en el que dicha transfeccion dijo ARNbc resultados en ser entregado a dicho tejido u organo objetivo, y en donde la entrega de dicho ARNbc a dicho tejido u organo objetivo inhibe o reduce la expresion de dicho gen objetivo en dicho organo o tejido objetivo tratando o mejorando de ese modo dicha enfermedad. La entrega "intramuscular", "intradermica", o "subcutanea" como se define en la presente incluye cualquier metodo que logra la transfeccion de celulas dentro del tejido identificado, incluyendo, sin limitarse a la inyeccion con aguja del propio tejido o entrega en un vaso sanguineo que abastece el tejido, entrega intravascular en un vaso que tiene permeabilidad mejorada, inyeccion sin aguja, proyeccion de pistola de genes o biolistica en una celula o tejido, cualquiera de las diversas tecnologias conocidas de inyeccion/electroporacion, parche transdermico, etc.
La administracion puede ser a traves de cualquier metodo o dispositivo que puede lograr la introduccion deseada del polinucleotido, por ejemp/o aguja, jeringa, cateter o canula de inyeccion o inyeccion sin aguja, por ejemp/o, un dispositivo de inyeccion sin aguja Bioject, que se puede ajustar para entregar una medicacion liquida a diferentes profundidades incluyendo intradermica, subcutanea, y/o intramuscular. Un parche transdermico se puede emplear tambien, asi como un inyector biolistico o dispositivo de "pistola de genes" capaz de disparar un vector de expresion plasmido en las celulas. Cualquiera de los diferentes dispositivos y tecnologias de inyeccion/electroporacion (Inovio/Genetronics, Ichor, VGX etc.) pueden usarse tambien, como lo pueden los metodos hidrodinamicos intravasculares que utilizan diferentes medios por ejemp/o,permeabilidad aumentada/presion aumentada, para promover la entrega a las celulas, incluyendo musculo, por ejemp/o, los metodos de entrega genica Mirus Pathway IVT (Mirus, Madison, WI) que utilizan un puno o torniquete para restringir el flujo de sangre y aumentar la presion dentro del vaso para facilitar la entrega intravascular de acidos nucleicos tales como vectores de expresion de plasmidos a los tejidos perfundidos por el vaso, por ejemp/o, el musculo de extremidades. Una jeringa, bomba u otro dispositivo adecuado se puede usar para efectuar la entrega rapida intravascular, mientras que el flujo sanguineo se ocluye transitoriamente, promoviendo de ese modo la transfeccion de las celulas del musculo adyacentes.
Los metodos de la presente invencion son particularmente adecuados para tratamiento o prevencion de enfermedades o afecciones de o que involucran el higado incluyendo las enfermedades virales del higado, cancer de higado y las enfermedades geneticas del higado, o afecciones que se pueden modular direccionando un ARN o gen en el higado a traves de por ejemp/o interferencia por ARN o antisentido, o terapia genica en donde se sustituye el ARNm funcional. Los ARNm terapeuticos expresados y las proteinas se pueden entregar tambien a las celulas objetivo a traves de los metodos de la presente descripcion. Los metodos son apropiados tambien para el direccionamiento de genes responsables de ciertas enfermedades o trastornos metabolicos en el higado tal como niveles altos de colesterol, por ejemplo, incluyendo pero sin limitarse a la apolipoproteina B y pcsk9. Los metodos se pueden usar ademas para entregar agentes terapeuticos basados en acido nucleico a otras celulas y organos o tejidos, incluyendo las celulas cancerosas o celulas infectadas con VIH, por ejemplo, mediante la expresion de receptores u otros ligandos adecuados en la superficie de las celulas objetivo, y/o mediante la co-expresion de ligandos especificos exovesiculares o de la superficie celular en celulas competentes especificas transfectadas. Los metodos se pueden usar ademas profilacticamente, por ejemplo, para entregar los ARNbc u otros agentes terapeuticos basados en acidos nucleicos a las celulas objetivo para proteger contra la futura infeccion o enfermedad.
Breve descripcion de las figuras
Figura 1. Grafico que demuestra la disminucion del por ciento en la expresion de HBsAg mediada por el vector NUC050, que expresa cuatro ARNbc de horquilla pequena dirigidos a HBV (experimento 183-9) en comparacion con el vector control (183-10) en ratones NODscid. Los ratones se administraron ya sea con el plasmido NUC050 (183-9) o plasmido control negativo NUC049 (183-10), formulados con bupivacaina e inyectados via intramuscular (IM) en dia 0. Ambos grupos de ratones recibieron una inyeccion hidrodinamica (HDI) del plasmido de expresion de HBsAg NUC054 en el dia
5. Los niveles sericos de sAg se midieron en diferentes dias despues de la dosificacion. Los valores representan el promedio de sAg como un por ciento del valor de sAg presangrado para cada grupo de animales.
Figura 2. Grafico que muestra la relacion de luciferasa de Renilla:luciernaga (RLU) en respuesta a la electroporacion del musculo de NUC050 contra NUC049 en ratones C57B1/6. Los ratones se administraron ya sea con el plasmido NUC050 o el plasmido control negativo NUC049 a traves de inyeccion intramuscular (IM) simultaneamente con la electroporacion (EP) en el dia 0. En el dia 6, ambos grupos de ratones recibieron una inyeccion hidrodinamica (HDI) del plasmido reportero doble de la luciferasa NUC060. Los valores representan el promedio de la relacion RLU de Renilla/RLU de Luciernaga para cada grupo de animales. La diferencia de 34.9% es estadisticamente significativa mediante la prueba no parametrica de Wilcoxon para dos muestras (p<0,05).
Figura 3. Diagrama de cajas y bigotes de las relaciones de NUC050 contra NUC049 de ratones individuales ND-300. La distribucion de los valores de la relacion Renilla:Luciernaga entre los animales individuales de cada grupo respectivo se puede visualizar mediante el diagrama de cajas y bigotes. La porcion "caja" representa el intervalo intercuartilico (0103). La linea vertical dentro de la caja representa el promedio de la mediana.
Figura 4. Descripcion esquematica de los ensayos ARN TaqMan, cuantificacion de ARNip en tiempo real basada en TaqMan incluidas dos etapas, tallo-lazo RT y PCR en tiempo real. Los iniciadores de tallo-lazo RT unidos a la porcion 3' de moleculas miARN y se transcriben inverso con la transcriptasa inversa. Despues, el producto RT se cuantifico usando PCR TaqMan convencional que incluye el iniciador directo especifico a miARN, iniciador inverso y las sondas TaqMan marcadas con colorante. El proposito del iniciador directo de cola en 5' es aumentar su temperatura de fusion (Tm) en funcion de la composicion de la secuencia de moleculas de miARN.
Figura 5. Fotos de protuberancias musculares publicadas tenidas inmunologicamente por �-galectina (Fig. 5, paneles B, C y D) en comparacion con con un tiempo fotografico transcurrido por los inventores de la presente de unas protuberancias secretoras de mioblastos (panel A).
Figura 6. Diagrama de cajas y bigotes que muestra la distribucion de los valores de la relacion Renilla:Luciernaga entre los animales individuales de cada grupo respectivo se puede visualizar mediante el diagrama de cajas y bigotes. La porcion "caja" representa el intervalo intercuartilico (01-03). La linea vertical dentro de la caja representa el promedio de la mediana.
Figura 7. Grafico que muestra los valores medios de HBsAg seguida la electroporacion intramuscular del plasmido NUC050. Los niveles medios de sAg de los tres grupos de dosis (10ug, 5ug, y 2ug) se representan en el grafico (A) dia +2, (B) dia+7, y (C) dia+16. La reduccion de sAg en el grupo NUC050 es significativa (p<0.05) en el grupo dia+2 10ug, el grupo dia+7 10ug, y el grupo dia+7 5ug.
Figura 8. Grafico que muestra la relacion ND-360 de luciferasa de Renilla:Luciernaga (RLU) en respuesta a la entrega/administracion subcutanea de NUC050 contra NUC049 en los ratones C57B1/6. Los ratones se administraron ya sea con el plasmido NUC050 o el plasmido control negativo NUC049 a traves de la inyeccion subcutanea (SC) en el dia 0. Ambos grupos de ratones recibieron una inyeccion hidrodinamica (HDI) del plasmido reportero doble de la luciferasa NUC060 en el dia 6. Los valores representan el promedio de la relacion RLU de Renilla/ RLU de Luciernaga en el higado de cada grupo de animales en el dia 11. La diferencia de 16.7% es estadisticamente significativa mediante la prueba no parametrica de Wilcoxon para dos muestras (p<0,05).
Figura 9. Distribucion de las relaciones de actividad de la luciferasa de Renilla/Luciernaga del raton individual ND-360 para NUC050 versus NUC049. La distribucion de las relaciones de actividad Renilla:Luciernaga entre los animales individuales de ND-360 en los grupos experimentales (NUC050) y control (NUC049) se muestran mediante el diagrama de cajas y bigotes. La porcion 'caja' representa el intervalo intercuartilico (01-03). La linea vertical dentro de la caja representa la mediana y las lineas horizontales se extienden en los extremos inferior y superior de la distribucion.
Figura 10 . Distribucion de los niveles de HBsAg normalizados en el raton individual para NUC 049 contra NUC050 en el dia 6 (13 dias despues de la inyeccion del vector) y dia 11 (18 dias despues de la inyeccion del vector).
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion abarca metodos para entregar ARN incluyendo ARN bicatenario (ARNbc) a una celula objetivo distal del higado expresando el ARN (por ejemp/o, un ARNbc) en, o introduciendo el ARN en, una primera celula de la piel o musculo que es competente para la entrega inter-organo o inter-tejido o intercelular. Por "distal" se entiende el RNA, por ejemp/o, un ARNbc se transporta a un organo, tejido o celula diferente de la celula en la que se introduce o expresa inicialmente. "Competente para la entrega inter-organo o inter-tejido o intercelular" o "competente para dirigir una celula u organo o tejido distal" se refiere a que la celula en la que el ARNbc se expresa o introduce es capaz de facilitar la entrega del ARNbc al organo, tejido o celula distal, por ejemp/o, a traves de extrusion vesicular. Tales celulas incluyen las celulas del musculo y celulas de la piel.
La presente invencion se basa en el sorprendente descubrimiento de que la inyeccion intramuscular, intradermica o subcutanea de un acido nucleico que codifica un ARNbc correspondiente a un gen objetivo resulta en la inhibicion de la expresion del gen objetivo en el higado. Como consecuencia, en una parte, la descripcion abarca los metodos para entregar in vivo los acidos nucleicos a los organos y tejidos distales, los metodos para tratar o prevenir enfermedades y trastornos en los organos o tejidos distales a traves de la administracion intramuscular, intradermica o subcutanea y la transfeccion de celulas del musculo o piel con al menos un ARNbc, o al menos un acido nucleico que expresa el ARNbc correspondiente a un gen objetivo en una celula de dicho organo o tejido distal .
Segun reportado en la presente, los presentes inventores han demostrado que la entrega intramuscular, intradermica o subcutanea de un vector o constructo de ADN que expresa las moleculas de ARNbc especificas al objetivo, por ejemp/o, moleculas de ARNhc (iARN), es sorprendentemente capaz de reducir la expresion del antigeno de superficie de la hepatitis B (sAg), asi como otros genes objetivo en el higado. Si bien no se desea estar limitado por ningun mecanismo, se postula que las moleculas de ARN bicatenario codificadas (por ejemp/o, las ARNhc o ARNbc bicatenario) se transcriben a partir de constructos de expresion transfectados en celulas del musculo o piel y las moleculas de iARN se entregan despues en el higado. Aunque no se encontro evidencia de que cualquier cantidad significativa de ADN plasmidico de expresion de ARNbc intacto se introduce por si solo en los hepatocitos de higado, todavia no se puede descartar de que el ADN que codifica las moleculas bicatenarias de la invencion se transfiere al higado, ya sea solo o en combinacion con el ARNbc expresado.
Las celulas del musculo son un tipo de celula conocida para extruir vesiculas de membrana plasmatica, o exovesiculas, tambien conocidas como "protuberancias" de la membrana. Por ejemplo, la galectina es una proteina expresada a altos niveles en celulas del musculo esqueletico y liso, que carece de una secuencia senal y se ha mostrado que se secreta por un mecanismo diferente de la exocitosis clasica. Previo a la secrecion, se ha observado la galectina volverse especificamente concentrada bajo la membrana plasmatica de mioblastos y en evaginaciones de la membrana plasmatica que aparecen para estrangular y formar vesiculas extracelulares ricas en galectina. Cooper y Barondes, 1990; Cooper, 1997, Galectin-1: Secretion and Modulation of Cell Interactions with Laminin, Trends in Glycoscience and Glycotechnol. 9(45): 57-67; Harrison y Wilson, 1992, The 14 kDa �-galactosidase binding lectin in myoblast and myotube cultures: localization by confocal microscopy, J. Cell Sci. 101: 635-46.
Aunque el proceso de formacion de protuberancias de la membrana y la extension en la que contribuye la formacion de protuberancias de la membrana a exportar proteinas en otros tipos de celulas aun no estan claros, la formacion de de protuberancias de la membrana se ha observado ademas en celulas distintas a las celulas del musculo. Claramente, se han detectado una variedad de diferentes genes de galectina en diferentes tipos de celulas, que carecen de la secuencia senal y contienen una secuencia de nucleo altamente conservada de aproximadamente 130 aminoacidos. Ver Cooper y Barondes, 1999. La galectina-1, la mejor caracterizada de la familia de galectina, se expresa en muchos tejidos ademas del musculo esqueletico y liso, incluyendo higado, pulmon, corazon, bazo, intestino, cerebro, linfocitos, timocitos y otras celulas vasculares, el sistema olfativo, y los sistemas nerviosos central y periferico. Inagaki y otros 2000, Oxidized galectin-1 promotes axonal regeneration in peripheral nerves but does not possess lectin properties, European J. Biochem. 267(10): 2955-64. La galectina-1 se expresa y secreta ademas por las celulas CHO por un mecanismo no clasico. Ver Seelenmeyer y otros, 2005, Cell surface counter receptors are essential components of the unconventional export machinery of galectin-1, J. Cell Biol. 171: 373-81. La galectina-3, que ha demostrado ademas secretarse en las exovesiculas que estrangulan la membrana plasmatica, se detecto en macrofagos activados, eosinofilos, neutrofilos, mastocitos, el epitelio de las vias respiratorias y gastrointestinales, los rinones y algunas neuronas sensoriales, asi como muchos tumores. Krzeslak y Lipinska, 2004, Galectin-3 as a multifunctional protein, Cell. Mol. Biol. Letts. 9: 305-28.
La protuberancia de la membrana, denominada a veces como ectocitosis, se ha observado en la periferia de muchos tipos de celulas, incluyendo fibroblastos, neutrofilos y condrocitos. Ver Mehul y Hughes, 1997, Plasma membrane targeting, vesicular budding, and release of galectin 3 from the cytoplasm of mammalian cells during secretion, J. Cell Sci. 110: 1169-78. Ademas, se ha postulado que el derramamiento de exovesiculas membrana puede ser tambien un mecanismo para la secrecion de FGF-2 de una variedad de otros tipos de celulas. Ver Walter Nickel 2005 Unconventional Secretory Routes: Direct Protein Export Across the Plasma Membrane of Mammalian Cells, Traffic 6: 607-14. Ademas, las protuberancias de membrana se han propuesto como un mecanismo potencial de secrecion para ciertas proteinas apocrina-sintetizadas, incluyendo la transglutaminasa secretora. Ver Aumuller y otros 1999 Apocrine secretion-- Fact or artifact? Ann. Anat. 181(5): 437-46. Dado que la protuberancia de membrana esta involucrada en los efectos reportados en la presente invencion, los metodos de la presente invencion pueden realizarse usando cualquier celula productora de exovesicula que se conoce en la actualidad o que sera identificada en el futuro. Debido a que las exovesiculas extrudidas como promedio son de aproximadamente 80 nm de diametro y se recubren con galectinas de superficie, tienen el potencial de interactuar con los tipos de celulas que contienen receptores de galectina. Tales celulas incluyen los hepatocitos, cuyos receptores de galectina estan posicionados para enfrentar los sinusoides y exponerse asi a las moleculas y particulas en la sangre.
Las exovesiculas, que se generan como un proceso de formacion de protuberancia o derrame de la membrana, se deben distinguir de los exosomas o cuerpos multivesiculares. Ver Walter Nickel 2005; ver ademas Cooper, 1997. Los exosomas son producidos desde el reticulo endoplasmico y tienen muy poco o ningun contenido citosolico, aunque tienen algunas de las moleculas MHC en su superficie se pueden usar y los que presentan los vehiculos de antigeno. Por el contrario, exovesiculas brote de la superficie de las celulas del musculo e incluir el contenido citosolico se ha demostrado por los inventores. Claramente, en el proceso de ARN de interferencia expresado (eiARN), se produce la transcripcion en el nucleo, pero el ARN se transporta despues al compartimiento citoplasmatico, donde los inventores postulan que despues se incorpora en protuberancias de exovesiculas fuera de la superficie de la membrana.
A pesar del mecanismo actual, la presente descripcion divulga los metodos para entregar al menos un acido nucleico a una celula objetivo en un animal, que comprende transfectar una primera celula en el animal distinta de dicha celula objetivo que es competente para direccionar la celula distal con un acido nucleico que codifica un ARN de interes, por ejemp/o, una "molecula de ARN efectora" que tiene una actividad biologica deseada, por ejemp/o, un ARN antisentido , ARN de triple formacion, ribozima, un ligando de ARN de alta afinidad seleccionado artificialmente (aptamero), un ARN bicatenario (por ejemp/o, ARNip, ARNhc, miARN) u otro ARN de regulacion o un ARNm, en donde dicha transfeccion resulta ya sea en ADN o el ARN codificado que se entrega a la celula objetivo. El ARN puede o no ser poliadenilado. El ARN puede o no ser capaz de ser traducido. La primera celula competente puede transfectarse ademas in vitro o ex vivo, y despues de eso introducir la celula competente en el animal. Los metodos de la presente descripcion pueden usarse para suministrar cualquier acido nucleico que este presente en el citoplasma de la celula transfectada y es capaz de ser entregado a la celula objetivo distal. Adicionalmente a los ARNbc transfectados y expresados, la presente invencion incluye ademas metodos para entregar ARNm expresados a partir de genes terapeuticos. Los ARN que pueden entregarse a la celula objetivo distal incluyen, pero sin limitarse a, moleculas de ARN antisentido, ARN ribozima, ARNbc que incluyen ARNbc horquilla, MicroARN y ARNbc bicatenario, asi como tambien ARNm.
Las celulas "competentes" adecuadas para usar en los metodos de la invencion incluyen celulas del musculo, celulas de la piel y cualquier otra celula competente capaz de entregar acidos nucleicos a una celula objetivo distal. Otras celulas competentes pueden identificarse usando uno de los ensayos de transferencia de ARN descritos en WO 00/63364. Por ejemplo, el Ejemplo 2 de WO 00/63364 describe dos ensayos diferentes in vitroque pueden usarse para detectar la transferencia de moleculas de ARN entre celulas objetivo y donadoras co-cultivadas.
Por "ARN bicatenario" o "ARNbc" se entiende un acido ribonucleico que contiene al menos la region de los nucleotidos que se encuentra en una conformacion bicatenaria. El ARNbc puede ser un ARNip, ARNhc o miARN convencional (incluyendo el transcripto primario o pri-miARN, pre-miARN, o miARN funcional) o un ARN que contiene mas de una estructura de horquilla. El ARN bicatenario puede ser una sola molecula con una o mas region(es) de autocomplementariedad de manera que los nucleotidos en un segmento de la molecula formen pares de base con nucleotidos en otro segmento de la molecula de ARN bicatenario. En diversas modalidades, un ARN bicatenario que consiste de una sola molecula esta compuesta en su totalidad de ribonucleotidos, una combinacion de ribonucleotidos y bases modificadas, o incluye una region que es de ribonucleotidos complementaria a una region de desoxirribonucleotidos. Alternativamente, el ARN bicatenario puede incluir dos hebras diferentes que tienen una o mas region(es) de complementariedad entre ellos. De forma deseada, la region del ARN bicatenario que esta presente en una configuracion bicatenaria incluye al menos aproximadamente 15 a 20, 20 a 25, 25 a 30, 50, 75, 100, 200, 500, 1000, 2000 o 5000 nucleotidos que participan en una hebra de la estructura bicatenaria, o incluye todos los nucleotidos que estan representados en el ARN bicatenario. En algunas modalidades, el ARN bicatenario es totalmente complementario y no contiene regiones de hebras sencillas, tales como los extremos de hebra sencilla. En otras modalidades, como por ejemp/o, las moleculas de ARNbc de tipo miARN, las regiones bicatenarias se pueden intercalar con uno o mas nucleotidos o zonas de hebra sencilla. En algunas modalidades el ARNbc es un ARNhc. Todos estos ARN sinteticamente preparados y exogenamente entregados, incluyendo los ARNhc y bicatenarios o ARNip, se pueden estabilizar quimicamente y modificar quimicamente, usando uno o mas de los metodos y modificaciones quimicas conocidas por los expertos en la tecnica. Tales modificaciones que se pueden usar en conjunto incluyen la modificacion quimica del azufre tales como enlaces de fosforotioato que hacen el farmaco mas resistentes a la degradacion, modificaciones de 2'-O-metoxietilo, etc. Ver por ejemp/oChiu y Rana, ARNip function in iARN: A chemical modification analysis, RNA (2003), 9:1034-1048. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
En algunas modalidades, la region de ARNbc de la molecula de ARN corresponde a un gen objetivo en dicho organo o tejido objetivo (por ejemplo, para mediar la interferencia de ARN o iARN). En tales ejemplos, la region de ARNbc es preferentemente, no traducidas, y es sustancialmente homologa y complementaria a una region del gen objetivo. Cuando se usa el ARNbc para la interferencia de ARN, una hebra de la estructura o region de ARNbc, es decir, la hebra antisentido, tendra al menos aproximadamente 70, 80, 90, 95, 98, o 100% de complementariedad con un acido nucleico objetivo, y la otra hebra o region, es decir,el secuenciador o region tendra al menos aproximadamente 70, 80, 90, 95, 98, o 100% de identidad con un acido nucleico objetivo. En tales modalidades, el ARNbc se considera que tanto es sustancialmente homologo como complementario al gen objetivo, lo que significa que el ARNbc no necesita ser totalmente identico y complementario al gen objetivo siempre que sea aun eficaz para mediar la interferencia de ARN especifica de la secuencia. Tales ARNbc generalmente tendran una secuencia de al menos 19 nucleotidos contiguos 100% complementarios y homologos a un acido nucleico objetivo. Aplicaciones preferidas para el iARN son las moleculas de ARNbc de horquilla pequena (ARNhc) y moleculas de microARN (miARN). Por ARNhc (ARN de horquilla pequena) se entiende una molecula de ARN de menos aproximadamente 400 a 500 nucleotidos (nt), preferentemente menos de 100 a 200 nt, en el cual al menos una extension de al menos 15 a 100 nucleotidos (preferentemente 17 a 50 nt, con mayor preferencia 19 a 29 nt) se aparea de base con una secuencia complementaria, localizada en la misma molecula de ARN, y donde dicha secuencia y la secuencia complementaria se separan por una region no pareada de al menos aproximadamente 4 a 7 nucleotidos (preferentemente de aproximadamente 9 a aproximadamente 15 nucleotidos) que forma un lazo monocatenario por encima de la estructura de tallo creada por las dos regiones de complementariedad de bases. Las moleculas ARNhc comprenden al menos una estructura tallo-lazo que comprende una region tallo bicatenaria de aproximadamente 17 a aproximadamente 100 bp; aproximadamente 17 a aproximadamente 50 bp; aproximadamente 40 a aproximadamente 100bp; aproximadamente 18 a aproximadamente 40 bp; o de aproximadamente 19 a aproximadamente 29 bp; homologa y complementaria a una secuencia objetivo a inhibir; y una region lazo no pareada de al menos aproximadamente 4 a 7 nucleotidos, preferentemente aproximadamente 9 a aproximadamente 15 nucleotidos, que forma un lazo de una sola hebra por encima de la estructura de tallo creada por las dos regiones de complementariedad de base. Ademas de los ARNhc simples, los ARNhc incluidos pueden ser dobles o bi-dedos y ARNbc de horquilla multi-dedos, en la que la molecula de ARN comprende dos o mas de tales estructuras de tallo-bucle separadas por una region espaciadora de simple hebra. Un vector recombinante puede ser disenado mediante ingenieria genetica para codificar multiples, por ejemp/o, tres, cuatro, cinco o mas ARNbc de horquilla pequena y/u otros ARNs tal como ARNm. El ARNbc horquilla puede ser un ARNbc horquilla simple o un un ARNbc horquilla de dos dedos o de multiples dedos como se describe en PCT/US03/033466 o WO 04/035766 o una estructura de horquilla parcial o forzada como se describe en WO 2004/011624, o el ARNbc puede ser polinucleotido que comprende una o mas moleculas efectoras de ARNbc codificadas en un contexto de miARN como se describe en PCT/US2007/81103 presentada el 11 de octubre de 2007.
Un ARNip se puede expresar o sintetizar y se compone de dos hebras de ARN que se aparean de base entre si para formar un ARNbc, es decir, ARN bicatenario. El apareamiento de bases no necesita ser 100% y por lo tanto la complementariedad de una hebra con la segunda no necesita ser 100%. La complementariedad debe ser suficiente para mantener las hebras en la confirmacion bicatenaria. La cantidad de complementariedad necesaria es dependiente de la secuencia y longitud y puede calcularse facilmente por un experto en la tecnica. La longitud de ARNip mas optima es 19-29 pb, cercana a la preferida es 30-40 bp. Un numero limitado de desajustes dentro de la region bicatenaria, especialmente en el secuenciador, es compatible con la actividad de iARN. Los ARNip se pueden estabilizar quimicamente y modificar quimicamente, usando uno o mas de los metodos y modificaciones quimicas conocidas por los expertos en la tecnica.
Por "acido nucleico objetivo" se entiende la secuencia de acido nucleico en el organo, tejido o celula objetivo distal, cuya expresion se modula como resultado de la inhibicion basada en el acido nucleico especifica de secuencia, por ejemp/o, silenciamiento genico transcripcional o post-transcripcional, inhibicion antisentido, escision ribozimal, etc. La secuencia de acido nucleico objetivo puede ser cualquier acido nucleico en la celula objetivo, ADN, ARN o hibrido de ADN/ARN, cuya expresion se desea modular, e incluyen sin limitarse a las secuencias genicas o secuencias cromosomicas endogenas a la celula, asi como secuencias introducidas, secuencias genomicas, ADNc, secuencias de ARNm, secuencias de patogenos intracelulares tales como los acidos nucleicos virales presentes en la celula, secuencias transcritas y no transcritas, secuencias codificantes y no codificantes, secuencias traducidas y no-traducidas incluyendo los UTR 3' y/o 5', y secuencias reguladoras tales como el sitio de union al factor de transcripcion, secuencias de promotor, potenciador, y represor. Las secuencias de acidos nucleicos objetivo adecuadas se asocian con el cancer o el crecimiento anormal de las celulas, tal como oncogenes, y las secuencias de acido nucleico asociadas con trastornos autosomicos dominantes o recesivos, asi como las secuencias de acido nucleico asociadas con patogenos, incluyendo los virus. "Modular" significa disminuir la expresion de un acido nucleico objetivo en una celula, o la actividad biologica del polipeptido objetivo codificado en una celula, por al menos aproximadamente 20%, mas preferentemente en al menos aproximadamente 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o aun 100%. En algunos ejemplos, la expresion de los genes en la celula objetivo se puede aumentar tambien, por ejemplo donde el gen dirigido por el ARNbc es un gen represor transcripcional u otro regulador negativo. En algunos ejemplos el acido nucleico objetivo no estara presente en la primera celula transfectada. En algunos ejemplos el acido nucleico objetivo estara presente en la primera celula transfectada, asi como en la celula objetivo distal .
Tipicamente con el ARN de interferencia expresado (eiARN), el ARNbc se expresa en la primera celula transfectada de un vector de expresion. En un vector tal, el secuenciador y la hebra no codificante del ARNbc se pueden transcribir a partir de la misma secuencia de acido nucleico usando por ejemp/o, dos promotores convergentes ya sea en el extremo de la secuencia de acido nucleico o promotores separados que transcriben una secuencia codificante o antisentido. Alternativamente, dos plasmidos se pueden co-transfectar, con uno de los plasmidos disenados para transcribir una hebra del ARNbc, mientras que el otro esta disenado para transcribir la otra hebra. Alternativamente, la secuencia de acido nucleico que codifica el ARNbc comprende una repeticion invertida, de manera que despues de la transcripcion a partir de un unico promotor, el ARN expresado forma un ARN bicatenario, es decir que tiene una horquilla o estructura "tallo-lazo", por ejemp/o, un ARNhc. El lazo entre las regiones de repeticion invertida, o regiones codificantes o antisentido, tipicamente es de al menos cuatro pares de bases, pero puede ser al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 50, o al menos aproximadamente 75, o mas, o cualquier tamano que permita la formacion de la estructura bicatenaria. Multiples estructuras de tallo-lazo se pueden formar a partir de un solo transcrito de ARN para generar un ARNbc multi-objetivo, ver WO 00/63364, y WO2004/035765. Las estructuras de horquilla pueden ser parciales o estructuras de horquilla forzadas como se describio en WO2004/011624.
Por "vector de expresion "se entiende un vector recombinante que incluye un constructo de ADN o ARN o vector viral que contiene al menos un promotor enlazado operativamente a una secuencia que codifica un ARN regulador tal como un ARNip, ARNhc, miARN, antisentido, o un gen corriente abajo o region codificante u otra secuencia de acido nucleico que se transcribe (por ejemp/o, un ADNc o fragmento de ADN genomico que codifica una proteina, opcionalmente, enlazado operativamente a la secuencia situada fuera de una region codificante, o una region codificante de ARN sentido y/o una antisentido, y/o secuencias de ARN situadas fuera de una region codificante). La secuencia(s) que se transcribe puede incluir cualquier secuencia de acido nucleico objetivo cuya expresion se desea modular. La transfeccion o transformacion del vector de expresion en una celula receptora permite a la celula expresar el ARN codificado por el vector de expresion. Un vector de expresion puede ser un plasmido disenado mediante ingenieria genetica, vector viral que incluye pero sin limitarse a AAV, adenovirus, virus de la viruela, herpesvirus, retrovirus, lentevirus, y alfavirus, o cromosoma artificial derivado de, por ejemplo, un bacteriofago, adenovirus, virus adenoasociado, retrovirus, virus de la viruela, o herpesvirus. Preferido para la expresion de moleculas efectoras de ARNbc en los metodos de la invencion son la ARN polimerasa III tipo 3 o promotores de ARN polimerasa III " tipo U6" y multiples constructos de expresion del promotor de la RNA polimerasa III como se ensena en WO 06/033756. Los promotores de ARN polimerasa II, incluyendo promotores virales de mamiferos, y promotores celulares de mamiferos, incluyendo humanos se pueden utilizar para la expresion de los ARN mas largos, incluyendo los ARNm. Un constructo de expresion se puede replicar en una celula viva, tales como una bacteria o celula eucariota o puede se puede hacer sinteticamente. Para los propositos de esta solicitud, los terminos "vector de expresion", "constructo de expresion", "vector", y "plasmido" se usan indistintamente en el sentido ilustrativo general y no pretenden limitar la invencion a un tipo particular de constructo de expresion.
Por "enlazado operativamente" se entiende que un gen y una o mas secuencias reguladoras de la transcripcion, por ejemp/o, un promotor o potenciador, estan conectados de tal de forma que permitan la expresion genica cuando las moleculas apropiadas (por ejemp/o, proteinas activadoras de la transcripcion) se unen a las secuencias reguladoras.
Por "promotor" se entiende una secuencia minima suficiente para dirigir la transcripcion de un gen. Se incluyen tambien en esta definicion los elementos de control de transcripcion (por ejemp/o, potenciadores) que son suficientes para controlar la expresion genica dependiente del promotor de una manera especifica al tipo de celulas, tejido-especifico, o temporal especifica, o que son inducibles mediante senales o agentes externos; tales elementos, que son bien conocidos por los artesanos expertos, se puede encontrar en una region 5' o 3' de un gen o dentro de un intron. Se incluyen los promotores ARN pol I, ARN pol II y ARN pol III, incluyendo los promotores de ARN polimerasa III Tipo 3 tales como H1, 7SK, y U6. Los promotores de la polimerasa III Tipo 3 se pueden usar ventajosamente para expresar oligonucleotidos cortos tales como los ARNhc, ARNip, y otras moleculas efectoras de oligonucleotidos de ARN de no mas de 300 a 400 nucleotidos de longitud (ver US 5,624,802, Noonberg y otros). Un promotor preferido de ARN pol III 7SK (7SK 4A) y constructos de expresion que comprenden multiples promotores de la polimerasa III se ensenan en WO 06/033756. Se incluyen tambien los promotores que permiten la sobreexpresion de los ARNm en el citoplasma de la celula transfectada, por ejemplo para optimizar la incorporacion de las moleculas de ARNm expresados en exovesiculas de membrana.
Los plasmidos de expresion que transcriben las moleculas efectoras de ARN incluyendo las ARNbc, ya sea en el citoplasma o el nucleo se pueden utilizar. Los vectores de expresion se pueden disenar para integrarse en el cromosoma de las celulas transfectadas, por ejemplo por recombinacion homologa. Alternativamente, los vectores de expresion pueden replicarse en las celulas transfectadas extracromosomicamente. Los vectores de transcripcion nuclear para la expresion de proteinas estan disenados preferentemente para expresar ARN terminal 5' poliadenilado (por ejemplo, un vector que contiene un promotor de la ARN polimerasa II y un sitio poli A) para facilitar la exportacion desde el nucleo. La transcripcion intracelular puede utilizar tambien los promotores del bacteriofago T7 y SP6, es decir, mediante la transfeccion de un vector que coexpresa el gen de la ARN polimerasa apropiada, que se puede disenar para transcribir en el citoplasma o en el nucleo. Se pueden usar tambien los promotores para las ARN polimerasas virales, ya sea dependiente de ADN y ARN. Alternativamente, las polimerasas replicadoras de ARNbc pueden usarse. Los promotores para las polimerasas celulares tales como ARN polimerasa I, II, o III o ARN polimerasa mitocondrial se pueden utilizar tambien. Los promotores especificos de tejido o celulas pueden usarse para limitar la expresion del ARNbc en la primera celula transfectada. Los promotores de la polimerasa III son especialmente deseables para laexpresion de los ARN pequenos disenados mediante ingenieria genetica, ver WO 06/033756, Multiple Polymerase III Promoter Expression Constructs. Se prefieren los promotores de la polimerasa III tipo 3, incluyendo varios promotores de mamiferos U6, H1 y 7SK, incluyendo la secuencia promotora 7SK 4A modificada ensenada en el. Ver ademas, por ejemplo, US 2005/0130184 A1, Xu y otros, dirigido a los promotores de polimerasa III modificados que utilizan elementos potenciadores de la polimerasa II, asi como US 2005/0130919 A1, Xu y otros, dirigida a promotores reguladores de la polimerasa III y polimerasa II. En algunas modalidades se puede desear incluir uno o mas promotores de la polimerasa I, y/o uno o mas de la polimerasa II, y/o uno o mas de la polimerasa III en un constructo de expresion simple, como, por ejemp/o, donde se desee utilizar los promotores de la pol III para expresar una o mas moleculas efectoras de ARN tales como los ARNbc y uno o mas promotores de la pol II para expresar uno o mas ligandos de direccion.
Un enfoque deseable para la expresion citoplasmica es usar polimerasas endogenas tales como la ARN polimerasa mitocondrial para fabricar el ARNbc en el citoplasma. Estos vectores se forman disenando los constructos de expresion de ADN que contienen promotores mitocondriales corriente arriba de la secuencia que codifica el ARNbc. Como se describio anteriormente para los vectores de transcripcion nuclear, el ARNbc se puede generar usando dos de tales promotores situados a cada lado de la secuencia objetivo, tal que la direccion de transcripcion de cada promotor se opone mutuamente. Alternativamente, dos plasmidos se pueden co-transfectar. Uno de los plasmidos se disena para transcribir una hebra de la secuencia objetivo, mientras que el otro se disena para transcribir la otra hebra. Los constructos de promotor unico se pueden desarrollar tal que dos unidades de la secuencia objetivo se transcriben en tandem, de tal manera que la segunda unidad esta en la orientacion inversa con respecto a la otra. Las estrategias alternativas incluyen el uso de secuencias de relleno entre las secuencias objetivo en tandem.
La expresion citoplasmatica de ARNbc puede lograrse ademas mediante la transcripcion de un molde de ARN de hebra sencilla en el nucleo de la celula transfectada, que se transporta despues al citoplasma donde sirve como un molde para la transcripcion de moleculas de ARNbc, utilizando un unico promotor subgenomico opuesto en la orientacion con respecto al promotor nuclear. El promotor nuclear genera una hebra de ARN que se transporta en el citoplasma, y el promotor subgenomico singular en el extremo 3' del transcripto es suficiente para generar su copia antisentido por una ARN polimerasa dependiente de ARN para dar lugar a una especie de ARNbc citoplasmatico. Tanto los vectores de transcripcion nuclear como citoplasmatica pueden contener un gen reportero que permite monitorear las celulas que adoptaron el plasmido. Cualquier tipo de vector puede usarse, incluyendo plasmidos, vectores virales, vectores retrovirales, vectores adenovirales, vectores de AAV, etc. El uso de vectores de expresion para expresar el ARN bicatenario se discute tambien en detalle en US 20040152117.
Si se desea, los sistemas de transcripcion inducible y reprimible se pueden usar para controlar el momento de la sintesis de moleculas efectoras de ARN incluyendo los ARNm. Los sistemas de regulacion inducible y reprimible implican el uso de elementos del promotor que contienen secuencias que se unen a factores de transcripcion procariotico o eucariotico corriente arriba de la secuencia de codificacion del ARNbc. Adicionalmente, estos factores portan tambien dominios de la proteina que transactiva o transreprime la ARN polimerasa II. El sistema de regulacion tambien tiene la capacidad de unirse a una molecula pequena (por ejemp/o., un coinductor o un correpresor). La union de la molecula pequena a la molecula de proteina reguladora (por ejemp/o, un factor de transcripcion) resulta ya sea en un aumento o disminucion de la afinidad por el elemento de la secuencia. Ambos sistemas inducibles y reprimibles se pueden desarrollar usando cualquiera de las combinaciones de inductor/factor de transcripcion mediante el posicionamiento apropiado del sitio de union con respecto a la secuencia del promotor. Los ejemplos de sistemas inducibles/reprimible descritos anteriormente incluyen lac, ara, esteroide-RU486, y ecdisona Rheogene, Lac (Cronin y otros Genes & Development 15: 1506-1517, 2001), ara (Khlebnikov y otros, J. Bacteriol. 2000 diciembre; 182(24):7029-34), ecdisona (Rheogene, www.rheogene.com), RU48 (esteroide, Wang X J, Liefer K M, Tsai S, O'Malley B W, Roop D R., Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Julio 20;96(15):8483-8), promotor tet (Rendal y otros, Hum Gene Ther. 2002 enero; 13(2):335-42. y Lamartina y otros, Hum Gene Ther. 2002 enero;13(2):199-210), o un promotor descrito en WO 00/63364, presentada en abril 19, 2000.
En una modalidad, entre otros, la presente descripcion divulga los metodos para entregar acidos nucleicos al higado a traves de la administracion intramuscular, intradermica o subcutanea y transfeccion in vivo de las celulas del musculo o de la piel con al menos un acido nucleico. Al transfectar las celulas del musculo, el constructo de expresion comprende las secuencias de polinucleotidos que codifican el ARN bicatenario que se enlaza operativamente a elementos de regulacion operables en la celula del musculo. Al transfectar las celulas de la piel, el constructo de expresion comprende secuencias de polinucleotidos que codifican el ARN bicatenario que se enlaza operativamente a elementos de regulacion operables en la celula de la piel. Los promotores y otros elementos de regulacion operables en las celulas del musculo y/o de la piel se conocen en la tecnica, y por ejemplo incluyen, pero sin limitarse a los promotores de la polimerasa I, polimerasa II, y polimerasa III (por ejemp/o, preferentemente promotores de pol III tipo 3 incluyendo los promotores humanos y otros mamiferos U6, 7SK, y H1), asi como promotores mitocondriales, por ejemp/o, promotores mitocondriales de cadena pesada y ligera humano y de otros mamiferos. Los ARN cortos (ARN modificados mediante ingenieria genetica inferiores a 300-400 nt tal como los ARNhc) se expresan mejor por los promotores de pol I y/o pol III. Las ARN mas largas, incluyendo los ARNm, se expresan mejor por los promotores de pol II, incluyendo los promotores virales tales como CMV IEP, RSV LTR, SV40, etc. Los promotores de bacteriofagos tales como T7, T3, SP6, etc. se pueden utilizar tambien si la celula se proporciona ademas con la(s) polimerasa(s) analogas T7, T3, SP6. Para la expresion en las celulas del musculo y/o de la piel, tales promotores de la polimerasa III se pueden usar para expresar los ARNbc pequenos y promotores de la polimerasa II, tales como CMV (promotor temprano de citomegalovirus) incluyendo HCMV (humano), MCMV (murino), SCMV (simio), SV40, RSV, vaccinia, y otros promotores virales; eucariotico incluyendo los promotores de la polimerasa II de mamifero, tales como el promotor de B-actina, se puede usar para expresar una ARNm traducible que codifica una proteina de la superficie celular, receptor, o ligando especifico u otra proteina deseada. El ARNm se puede traducir en la primera celula y/o una celula distal en la que entrega.
Las celulas del musculo incluyen miocitos estriados o esqueletico de mamiferos, incluyendo miocitos diferenciados, asi como mioblastos indiferenciados. El musculo cardiaco es tambien musculo estriado. Un mioblasto es un tipo de celula madre que existe en los musculos. Las celulas del musculo esqueletico se llaman fibras musculares o miocitos y se producen cuando los mioblastos se fusionan juntos. Por lo tanto, las fibras del musculo pueden tener multiples nucleos. Los mioblastos que no forman fibras musculares se diferencian en celulas satelites. Estas celulas satelites permanecen adyacentes a una fibra muscular, separadas solo por su membrana celular y por el endomicio (el tejido conectivo de colageno que rodea la fibra muscular).
Administracion "intramuscular" significa que el acido nucleico se administra al tejido muscular y cualquier celula del musculo en el animal, incluyendo pero sin limitarse al musculo esqueletico tales como los musculos deltoide, vasto lateral, ventrogluteo, tibial y dorsogluteo. El medio por el que se puede lograr la administracion intramuscular incluye la inyeccion por aguja, inyeccion sin aguja, electroporacion, enfoques biolisticos, y cualquier otro metodo que puede lograr la entrega en una celula del musculo o una celula en el tejido muscular. Tal entrega puede ser directamente en el tejido muscular o a traves de la entrega intravascular en las celulas del musculo o en las celulas en el tejido muscular suministrados por esos vasos sanguineo(s). En los metodos de la invencion, que comprenden la administracion intramuscular, el agente iARN o ARNbc expresado u otro agente terapeutico basado en acido nucleico se disena para inhibir la funcion de un polinucleotido objetivo en una celula de mamifero que no es una celula del musculo.
En un aspecto de la invencion, un constructo de expresion de este tipo que codifican secuencias homologas y complementarias a una o mas secuencias de polinucleotidos objetivos presente en una celula del higado se introduce en una celula del musculo esqueletico u otro y la funcion de uno o mas polinucleotidos objetivos en un hepatocito de higado se inhibe, por ejemp/o, polinucleotidos de un patogeno del higado tal como un virus de la hepatitis, incluyendo el HBV y/o HCV y HDV y HAV. En otro aspecto, la invencion implica introducir en una celula del musculo un constructo de expresion que codifica las secuencias de los genes especificos en el higado responsables de enfermedades o trastornos metabolicos tales como niveles altos de colesterol, por ejemplo, incluyendo pero sin limitarse a la apolipoproteina B y pcsk9. Otro objetivo potencial en el higado es el trastorno genetico de la deficiencia alfa 1antitripsina (deficiencia de a1-antitripsina, A1AD o alfa-1), causado por una mutacion que resulta en la produccion defectuosa de la alfa 1-antitripsina (A1AT), que conduce a la actividad disminuida de A1AT en la sangre y pulmones, y la deposicion excesiva de proteina A1AT anormal en las celulas del higado. El tratamiento utilizando los metodos de la invencion puede incluir proporcionar un ARNbc inhibidor que dirige la secuencia de A1AT mutada, mientras que se coexpresa un ARNm que codifica la A1AT funcional. Esto se puede lograr proporcionando a las celulas del musculo un vector(es) de expresion que co-expresa el ARNbc inhibidor y un ARNm que codifica la proteina funcional, ambos se entregan a las celulas del higado.
La administracion "intradermica" significa en o dentro de la piel, y puede incluir la administracion a cualquier capa de la dermis o epidermis, y la entrega en cualquier celula de las mismas. La administracion "subcutanea" significa justo debajo de la piel, o en la capa subcutanea de la piel, y la entrega en cualquier celula de la misma. Se abarca tambien las formas epicutaneas de administracion, es decir,con "epicutanea" que significa sobre la superficie de la piel (por ejemplo, usando un parche transdermico, pomada, locion o cualquier otro medio adecuado). Las celulas de la piel incluyen las celulas de la epidermis, incluyendo, por ejemplo, las celulas basales, melanocitos, celulas de Langerhans, celulas de Merkel, nervios sensoriales, queratinocitos, y cualquier otra celula que se encuentra en el diversas capas de la epidermis, incluyendo la capa basal, la capa de celulas escamosas, el estrato granuloso, el estrato lucido y estrato corneo. Se incluyen tambien las celulas de la piel, incluyendo celulas vasculares, celulas de la linfa, celulas de glandulas sudoriparas y sebaceas, celulas nerviosas, fibroblastos, y cualquier otra celula que se encuentra en las distintas capas de la dermis, incluyendo la capa papilar y la capa reticular. Las celulas de la piel incluyen tambien las de la hipodermis, es decir la capa mas interna de la piel, que incluye las celulas de la grasa y colageno.
La presente invencion abarca los regimenes de entrega donde los ARNbc o vectores de acidos nucleicos que expresan el mismo se entregan tanto a las celulas de la piel como celulas del musculo simultanea o secuencialmente. El medio por el que se puede lograr la administracion intradermica, subcutanea, y/o intramuscular incluye la inyeccion por aguja, inyeccion sin aguja, electroporacion, metodos biolisticos, y cualquier otro metodo que puede lograr la entrega en una celula del musculo o de la piel o una celula en el tejido muscular o de la piel.
En una parte, la presente descripcion divulga los metodos para entregar los acidos nucleicos, incluyendo moleculas de ARN bicatenario y/o constructos de expresion de polinucleotidos que codifican las moleculas de ARN, por ejemp/o,ARNm, antisentido, ribozima o ARNbc incluyendo los agentes de iARN tales como ARNip, ARNhc, o miARN, a una celula objetivo in vitro o ex vivo entregando un acido nucleico a o expresando un acido nucleico en una celula que es competente para la celula distal especifica. Las celulas competentes donadoras pueden utilizarse tambien para la produccion en cultivo de celulas de exovesiculas que contienen ARN, o para el trasplante autologo o heterologo en un organismo mamifero receptor. La celula puede ser una celula del musculo, celula de la piel, celulas madre, o cualquier celula competente adecuada. Una celula que es competente para la celula distal especifica se puede obtener por ejemp/o, a partir de un potencial receptor mamifero, por ejemp/o, un receptor humano o de otro donante, transfectadas in vitro o ex vivo con un constructo de expresion del polinucleotido seleccionado o con moleculas de ARN seleccionadas, e implantadas, por ejemp/o,via subcutanea o intramuscular, en un organismo mamifero receptor. La celula(s) trasplantada(s) puede ser autologa o heterologa con respecto al receptor. El mamifero receptor puede ser un mamifero inmunocomprometidos o un mamifero administrados con inmunosupresores. Las celulas implantadas pueden entonces servir como una "fabrica" para la produccion in vivo de moleculas efectoras de ARN, por ejemp/o, moleculas de iARN y/o ARNm, para el transporte a una celula distal. Tales celulas pueden expresar tambien ligandos u otras proteinas que mejoran la produccion transporte, direccion, y/o absorcion de exovesiculas, tal como el receptor para el VIH. La celula distal puede ser una celula del higado tales como un hepatocito u otra celula. La molecula efectora de ARN puede reprimir un gen objetivo en el higado, por ejemp/o, un gen de un patogeno tal como un virus de la hepatitis o un gen endogeno asociado con la enfermedad encontrado en el higado. La celula objetivo distal puede ser tambien una celula no hepatica, incluyendo cualquiera de las celulas objetivo descritas en la presente.
En un aspecto, la invencion se refiere a un metodo de inhibicion genica mediada por el ARNbc o iARN que comprende entregar in vivo a las celulas del musculo o la piel de un mamifero un vector de expresion de acido nucleico que codifica un agente de iARN o ARNbc. Como se describe anteriormente, el(os) agente(s) iARN puede ser una o mas moleculas de ARNbc de horquilla o bicatenario, incluyendo uno o mas agentes ARNbc de horquilla pequena . El vector de expresion de ARNbc puede ser ADN o ARN, incluyendo ADN plasmidico. El vector de expresion puede ser un vector viral tal como, por ejemplo AAV. El vector de expresion de polinucleotido puede ser suministrado al musculo como ADN o ARN "desnudo"(libre de asociacion con un agente facilitador de la transfeccion) o en asociacion con un agente que facilita la transfeccion o la transferencia en las celulas de la piel o celulas del musculo o miocitos de mamiferos, incluyendo miocitos diferenciados, asi como mioblastos indiferenciados. En otro aspecto, la invencion se refiere a un metodo de iARN que implica la entrega por transfeccion intramuscular in vivo mediada por la electroporacion del musculo esqueletico o miocitos, o celulas de la piel de un mamifero con un vector o constructo que expresa las moleculas de ARNbc .
Numerosos agentes se pueden usar para facilitar la transfeccion de las celulas del musculo de mamifero in vivo incluyendo pero sin limitarse a complejos de polimeros o peptidos, anfifilos cationicos, lipidos cationicos, formulaciones liposomicas cationicas, incluyendo la bupivacaina anestesico local de amida amino, particulas incluyendo las particulas de oro utilizadas para la entrega biolistica o de "pistola de genes", agentes anfifilo policationico o cationico, incluyendo espermina y/o derivados de la espermidina, incluyendo varios compuestos de colesterilo espermina. El vector de expresion de polinucleotido que se entrega frecuentemente al tejido muscular o de la piel de mamiferos formulado en asociacion con o como un complejo con uno o mas de tales agentes facilitadores de la transfeccion.
La bupivacaina es uno de los agentes anestesicos locales anfifilicos de amida amino conocidos para actuar como un agente facilitador de la transfeccion para la entrega a los tejidos incluyendo el musculo esqueletico, de polinucleotido, incluyendo ADN plasmidico, que codifica las proteinas inmunogenicas, por ejemp/o, antigenos de patogenos, para su uso en el campo de las vacunas de ADN. Las proteinas se expresan en las celulas del musculo, induciendo respuestas inmunes tanto humorales como celulares. Ver por ejemp/o, patente de los Estados Unidos 6,217,900 y 6,383,512, "Vesicular Complexes and Methods of Making and Using the Same." Los metodos para inyectar el ADN "desnudo" que codifica los polipeptidos inmunogenicos y otros biologicamente activos en el musculo o en la piel son tambien conocidos, ver por ejemp/o, patente de los Estados Unidos 5,580,859; 5,589,466. US 6,413,942describe entregar a las celulas del musculo el ADN "desnudo" que codifica un polipeptido terapeutico secretable, por ejemp/o, hormona de crecimiento, que se libera en la circulacion para lograr un efecto terapeutico. Entre los numerosos compuestos anfifilo policationicos o cationicos utiles para facilitar la transfeccion de polinucleotidos in vivo en celulas de mamifero son diversos compuestos de espermina de colesterilo o espermidina de colesterilo , incluyendo carbamatos de espermina de colesterilo y sus combinaciones usadas como se ensena por ejemp/o en la patente de los Estados Unidos 5,837,533; 6,127,170; 6,379,965; 5,650,096; y5,783,565; y US 2006/0084617, publicada el 20-Abril-2006. Estos son solo ejemplos ilustrativos de los muchos agentes quimicamente diferentes conocidos por los expertos en la tecnica que se puede emplear para facilitar la transfeccion de acidos nucleicos que incluyen constructos de expresion de ARNbc en las celulas del musculo o de la piel de mamifero de acuerdo con la ensenanza de la invencion.
Tales acidos nucleicos desnudos y complejos se pueden usar en metodos de entrega, incluyendo la inyeccion con aguja y/o sin aguja directamente en el tejido de la piel y/o muscular, por ejemp/o, vector de expresion de ADN en complejo con 0.25% de bupivacaina en un vehiculo adecuado para inyeccion como se enseno anteriormente, asi como la entrega a celulas del musculo o de la piel por via vascular, tales como el metodo hidrodinamico mediante el que la presion intravascular aumentada produce aumento de la permeabilidad vascular para el paso de moleculas, incluyendo acidos nucleicos en el espacio intersticial del tejido muscular y, de la piel y la absorcion aumentada de tales moleculas por las celulas de la piel y musculo. Tal presion intravascular aumentada se puede lograr a traves de una combinacion de la presion aplicada externamente por ejemp/o torniquete o puno, y/o volumen aumentado de la administracion del farmaco, y/o la velocidad aumentada de la administracion. Los volumenes administrados a la extremidad de un mamifero puede ser de 250 ml, 500 ml, hasta un litro o mas. En un aspecto, el acido nucleico es un vector de expresion de ADN plasmidico que se puede administrar en dosis relativamente grandes sin toxicidad,por ejemp/o 100mg, 200mg, 350mg, 500mg hasta 1, 2, o 5 gramos o mas. De ese modo por ejemp/oun vehiculo de entrega se puede formular que comprende 350-500mg del vector de expresion de ADN desnudo o en complejo en 100 a 500 ml (por ejemp/o 2mg/ml) de tampon de citrato con dextrosa al 5% en agua para inyeccion (D5W). Cuando se administra rapidamente en el sistema vascular aferente o eferente que suministra a una extremidad del mamifero sometido a la presion aplicada externamente, una formulacion tal proporciona una gran cantidad de agente en el espacio intersticial de las celulas del musculo, facilitando de ese modo la transfeccion de las celulas por accion de masas. La formulacion puede ser hipotonica, isotonica o hipertonica. La administracion de un vehiculo de entrega hipertonico puede aumentar el transporte de moleculas tales como ADN u otros acidos nucleicos en las celulas del musculo adyacentes. Ver la discusion adicional mas abajo. Otros vehiculos de entrega, excipientes y metodos adecuados para su uso en los metodos de la invencion pueden formularse por aquellos expertos en la tecnica de las ciencias farmaceuticas, ver por ejemp/o, las ensenanzas de Remington's Pharmaceutical Sciences 18va Ed. (1990); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ma Ed. (2000), 21ra Ed. (2005).
En otro aspecto, los acidos nucleicos que incluyen los constructos de expresion de ARNbc se entregan in vivo en celulas de la piel de mamiferos o miocitos estriados o esqueleticos y/o mioblastos a traves de electroporacion. Ver, por ejemp/o, las formulaciones y metodologia de electroporacion de constructos de acido nucleico en las celulas del musculo de mamifero tal como se ensena en US 2004/0014645 A1 "Increased delivery of a nucleic acid construct in vivo by the poly-L-glutamate ('PLG') system" y los metodos y dispositivos para la electroporacion se ensenan en por ejemp/o, US 2005/0052630A1 "Constant current electroporation device and methods of use." Ver ademas US 2005/0070841A1 y US 2004/0059285A1"Electroporation device and injection apparatus" y US 2004/0092907A1"Method for muscle delivery of drugs, nucleic acids and other compounds." Los diversos parametros, que incluyen la resistencia del campo electrico requerida para la electroporacion de cualquier tipo de celula conocida incluyendo musculo y la piel son generalmente conocidos en la literatura relevante de la investigacion, asi como en numerosas patentes y solicitudes en el campo . Ver por ejemp/o, US 6,678,556 "Electrical field therapy with reduced histopathological change in muscle"; US 7,171,264 "Intradermal delivery of active agents by needle-free injection and electroporation"; y US 7,173,116, que ensena formulaciones para la entrega de genes a traves de la electroporacion, incluyendo las formulaciones de varios polimeros anionicos, que incluyen el poli-L-glutamato. El aparato para la aplicacion terapeutica de la electroporacion se encuentra comercialmente disponible, por ejemp/o, el sistema de electroporacion de ADN MedPulser® (Inovio/Genetronics, San Diego, CA), y se describen en las patentes tales como US 6,567,694; US 6,516,223, US 5,993,434, US 6,181,964, US 6241,701, y US 6,233,482 ; la electroporacion tambien puede usarse para la transfeccion de celulas in vitro como se describe por ejemp/o. en US20070128708A1. La electroporacion in vivo en las celulas del musculo de mamifero presenta una alternativa atractiva para aplicaciones experimentales, asi como un metodo de entrega prometedor para aplicaciones terapeuticas en mamiferos, incluyendo los humanos, con los ensayos clinicos en curso en el campo de las vacunas de ADN. La electroporacion puede utilizarse tambien para entregar acidos nucleicos en celulas in vitro. En consecuencia, la administracion mediada por electroporacion en las celulas del musculo y de la piel de acidos nucleicos que incluyen constructos de expresion que utilizan cualquiera de los muchos dispositivos disponibles y sistemas de electroporacion conocidos por los expertos en la tecnica representa un nuevo medio sorprendente para la entrega de un ARN de interes a una celula, tejido, u organo objetivo distal, tal como un hepatocito o otra celula del higado.
En otra modalidad, la administracion puede ser a traves de la inyeccion con aguja, inyeccion sin aguja, por ejemp/o, el dispositivo de inyeccion sin aguja Biojector® 2000 (Sistemas libre de aguja Bioject, Tualatin, Oregon), que puede ajustarse para entregar un medicamento liquido a varias profundidades incluyendo las vias intradermica, subcutanea, y/o intramuscular. Otros sistemas de inyeccion sin aguja comercialmente disponibles incluyen el Dermo-jet (Robbins Instruments, Chatham, NJ). La inyeccion sin aguja se basa en una corriente de alta presion de la propia medicacion para penetrar la piel. A medida que la corriente de fluido se abre camino a traves del tejido, sigue el camino de menor resistencia, lo que resulta en una distribucion de la medicacion muy dispersa, tipo tela de arana. Un parche transdermico se puede emplear tambien, asi como un inyector de biolistica o dispositivo de "pistola de genes" capaz de disparar un vector de expresion plasmidica en las celulas, incluyendo las celulas de la piel, la region subcutanea, y/o el tejido muscular. Los dispositivos de pistola de genes o biolistica para la entrega in vivo a mamiferos se encuentran comercialmente disponibles, como por ejemp/o, la pistola Helios Gene Gun (Bio-Rad, Hercules, CA) ver, por ejemp/o, las patentes de Estados Unidos 5,830,877 y 6,723,077.
En otro aspecto, la administracion intramuscular puede lograrse a traves de metodos intravasculares hidrodinamicos que utilizan diversos medios,por ejemp/o, presion aumentada, para promover la entrega a las celulas incluyendo el musculo, por ejemp/o,los metodos de entrega de genes Mirus Pathway IVT (Mirus, Madison, WI) que utilizan un torniquete o puno para restringir el flujo de sangre y aumentar la presion dentro del vaso para facilitar la entrega intravascular de acidos nucleicos tales como vectores de expresion de plasmidos para el extremo muscular. Una variedad de metodos conocidos en la tecnica se pueden usar para aumentar el paso de un acido nucleico a partir de vasos sanguineos aferentes o eferentes en las celulas, incluyendo las celulas del parenquima de los tejidos adyacentes. Por ejemplo, la permeabilidad aumentada de los vasos a los acidos nucleicos y otras moleculas se pueden lograr mediante la aplicacion externa de presion con un puno tal como un puno o torniquete de la presion arterial en una ubicacion distal al sitio de la administracion del acido nucleico y/o a traves de la presion intravascular aumentada lograda mediante la administracion de una formulacion farmaceutica seleccionada en un volumen de inyeccion relativamente grande y/o a traves de una entrega rapida y/o la administracion de agentes biologicamente activos, tales como la papaverina, hialuronidasa, etc. Los parametros especificos para lograr optimos aumentos en la permeabilidad vascular en sujetos de prueba, tales como animales de laboratorio, asi como los sujetos humanos estan dentro del nivel de experiencia en las tecnicas de la ciencia animal, anatomia, fisiologia, farmacologia y medicina clinica. Por ejemplo, el volumen de inyeccion optimo esta relacionado con el tamano del animal a inyectar, asi como el volumen de tejido objetivo, por ejemp/o,se pueden necesitar volumenes de 0.03ml/g a 0.1ml/g de peso corporal o superior, con volumenes de inyeccion de 70 a 200 ml reportado para los primates La entrega al tejido de musculo esqueletico de una extremidad se puede lograr por inyeccion intravascular rapida o la entrega a traves de la aguja, cateter, etc de un volumen relativamente grande (por ejemp/o, > 5ml por extremidad de la rata o > 70 ml para un primate) con aplicacion externa concomitante de una presion por ejemp/o con un puno o torniquete, tal que la presion dentro del vaso se aumenta y se mejora la permeabilidad al movimiento hacia fuera de oligonucleotido, polinucleotido, etc. Ver por ejemp/o, US 2004/0259828, US 6,379,966; US 2007/0244067; Hagstrom y otros, Molecular Therapy (2004) Vol. 10 (num. 2), 386398; Herweijer y Wolff, Gene Therapy (2007) 14, 99-107; Lewis y Wolff, Advanced Drug Delivery Reviews 59 (2007) 115-123. Tales metodos se pueden emplear para entregar acidos nucleicos, incluyendo los ARN, ADN, y mezclas de estos, a diversas celulas del parenquima de los tejidos en un mamifero, incluyendo las celulas del musculo estriado como por ejemp/o, mioblastos, celulas satelite, miotubulos y miofibras, mediante la entrega en un vaso sanguineo aferente o eferente suministrando al tejido, preferentemente a un vaso del sistema arterial tales como una arteria, arteriola, sinusoides, y/o capilar, pero en algunas modalidades un vaso del sistema venoso, incluyen una vena, venulas y capilares. La transfeccion aumentada de tales celulas, incluyendo las celulas del musculo, puede lograrse por ejemp/o mediante el aumento de la permeabilidad de un vaso aferente proximal al tejido objetivo en el que un acido nucleico seleccionado se administra como se ensena por ejemp/o en US 7,148,205, "Intravascular delivery of non-viral nucleic acid". El acido nucleico, por ejemp/o, un un vector de expresion de ARN o ADN, puede ser "desnudo" (es decir, libre de agentes que se asocian o forman complejo con el acido nucleico y promueven la transfeccion) o se asocian o forman complejo con uno o mas agentes, incluyendo compuestos anfipaticos o anfifilicos tales como anfifilos cationicos, colesterol y/o espermina que contienen complejos como se describe en otra parte de la presente invencion. Varios medios se pueden usar para aumentar la permeabilidad de los vasos, por ejemp/o, el acido nucleico desnudo o en complejo se puede suministrar en un volumen de solucion relativamente grande, y/o con medidas fisicas para aumentar la presion dentro del vaso aplicando la presion distal y/o disminuyendo la luz del vaso, como por ejemp/o, con un torniquete o puno
Aunque algunas modalidades abarcan transfectar las celulas de la piel o del musculo esqueletico o de otras celulas competentes en un animal con un acido nucleico que codifica un ARNbc, tambien se abarcan los metodos en donde el ARNbc se transfecta directamente en las celulas del musculo o de la piel u otras celulas competentes especificas. Por ejemplo, la invencion incluye un metodo para proporcionar al menos un ARNbc al higado en un animal que comprende transfectar las celulas de la piel o del musculo esqueletico en animales con dicho ARNbc, en el que dicha transfeccion resulta en dicho ARNbc que se entrega a dicho higado.
Las moleculas de ARNbc adecuadas para la entrega a celulas de la piel y del musculo u otras celulas objetivo competentes incluyen los ARNhc y ARNip para modalidades de iARN y estan tipicamente entre aproximadamente 15 y aproximadamente 50 pares de bases, y mas particularmente entre aproximadamente 19 y aproximadamente 29 pares de bases. El ARNbc y complejos u otras formulaciones que contienen la misma se pueden entregar a las celulas de la piel o del musculo u otras celulas usando cualquier metodo conocido en la tecnica, incluyendo los descritos anteriormente con respecto a los vectores de expresion.
Algunas secuencias de ARNbc, posiblemente en ciertos tipos de celulas y mediante ciertos metodos de entrega, pueden resultar en una respuesta de interferon. Los metodos de la invencion se pueden realizar para no inducir una respuesta de interferon/PKR, por ejemplo mediante el uso de moleculas de ARNbc corta entre 20 a 25 pares de bases, expresando moleculas de ARNbc intracelularmente, o usando otros metodos conocidos en la tecnica, ver solicitud de los Estados Unidos 20040152117. Por ejemplo, uno de los componentes de una respuesta del interferon es la induccion de la proteina quinasa PKR inducida por interferon. Para prevenir una respuesta de interferon, las respuestas de interferon y PKR se pueden silenciar en las celulas transfectadas y objetivo usando especies de ARNbc dirigidas contra los ARNm que codifican las proteinas involucradas en la respuesta Como alternativa, los promotores de la respuesta de interferon se silencian usando ARNbc, o la expresion de proteinas o factores de transcripcion que unen secuencias del elemento de respuesta de interferon (IRE) usando ARNbc u otras tecnicas conocidas.
Por "bajo condiciones que inhiben o previenen una respuesta de interferon o una respuesta al estres por ARNbc" se entiende las condiciones que previenen o inhiben una o mas respuestas de interferon o respuestas de estres por ARN celular que involucran toxicidad celular, muerte celular, una respuesta anti-proliferativa, o una capacidad disminuida de una ARNbc para llevar a cabo un evento PTGS. Estas respuestas incluyen, pero sin limitarse a, la induccion de interferon (tanto Tipo 1 como Tipo II), induccion de uno o mas genes estimulados con interferon, activacion de PKR, activacion 2'5'-OAS, y cualquier secuela organismal y/o corriente abajo celular que resultan de la activacion/induccion de una o mas de estas respuestas. Por "secuela organismal" se entiende cualquier efecto en un animal completo, organo, o mas localmente (por ejemp/o, en el sitio de la inyeccion) causada por la respuesta al estres. Las manifestaciones ilustrativas incluyen produccion elevada de citocinas, inflamacion local y necrosis. Deseablemente las condiciones que inhiben estas respuestas son tales que no mas de aproximadamente 95%, 90%, 80%, 75% , 60% , 40% , o 25% , y lo mas deseablemente no mas de aproximadamente 10 % de las celulas se someten a toxicidad celular, muerte celular, o una capacidad disminuida para llevar a cabo el evento PTGS, en comparacion con una celula no expuesta a tales condiciones que inhiben la respuesta de interferon, todas las otras condiciones que sean iguales (por ejemp/o, mismo tipo de celula, misma transformacion con el mismo ARNbc).
La apoptosis, induccion de interferon, la activacion/induccion de 2'5' OAS, induccion/activacion de PKR, respuestas antiproliferativas, y los efectos citopaticos son todos indicadores de la via de respuesta al estres por ARN. Los ensayos ilustrativos que se pueden usar para medir la induccion de una respuesta de estres por ARN como se describe en la presente incluyen un ensayo TUNEL para detectar las celulas apoptoticas, ensayos ELISA para detectar la induccion de alfa, beta y gamma interferon, analisis de la fragmentacion de ARN ribosomal para detectar la activacion de 2'5' OAS, medicion de eIF2a fosforilado como un indicador de activacion de PKR (proteina quinasa inducible por ARN), ensayos de proliferacion para detectar cambios en la proliferacion celular, y el analisis microscopico de las celulas para identificar los efectos citopaticos celulares, ver por ejemp/o, solicitud de Estados Unidos 20040152117.
Como se senalo anteriormente, aunque no desea estar vinculado por cualquier mecanismo particular, los presentes inventores plantean la hipotesis que las moleculas de ARN de doble hebras transcritas a partir de constructos de expresion en celulas de musculo y piel se entregan al higado, posiblemente dentro de exovesiculas formadas a partir de protuberancias o desprendimiento de la membrana en la superficie de la celula transfectada. En linea con esta hipotesis, la presente descripcion incluye ademas co-transfectar o co-expresar, junto con un ARN de interes, que incluye ARNbc
o ARNm terapeutico en las celulas del musculo u otras celulas competentes, los genes que codifican ligandos de superficie o transmembrana especificos para la celula objetivo, organo o tejido de interes. Los genes que codifican ligandos especificos se pueden expresar en el mismo vector como el ARNbc, por ejemplo, a partir de un promotor separado, o se pueden expresar a partir de un vector separado. En algunas modalidades, entre otros, el ARNbc se expresa a partir de un promotor pol III y el ligando especifico se expresa a partir del promotor poIII. La incorporacion de dichos ligandos de superficie en exovesiculas podrian mejorar mas aun la entrega al higado, o facilitar la entrega a otros objetivos, tales como las celulas cancerosas o celulas inmunes.
Por ejemplo, la presente invencion abarca metodos por los cuales las celulas de la piel o musculo se transfectaron con
(1) eiARN o ARNbc o complejos de ARNbc y (2) un vector de expresion que codifica un ligando de la superficie de la celula que se une especificamente a un receptor en la celula del higado. El vector de expresion eiARN y el vector de expresion que codifica el ligando pueden ser un solo vector de expresion o dos vectores de expresion diferentes. Como un ejemplo, expresar una glicoproteina viral (tal como la glicoproteina gp120 de la envoltura del VIH) en celulas de musculo o la piel adicionalmente a los ARNbc especificos a VIH podria conducir a la formacion de exovesiculas de musculo que contienen ARNbc anti-VIH que comprende la glicoproteina del VIH en la superficie. Estas exovesiculas ahora tienen el potencial para ser absorbidas por las celulas T y otros inmunocitos CD4+ que infecta el VIH Otros ligandos de la superficie de la celula adecuados y celulas objetivo incluyen el dominio de union del receptor a la hemaglutinina (HA) de la influenza A que reconoce e interactua con un oligosacarido en la superficie de las celulas epiteliales respiratorias. Desde que los virus de influenza A aviar y virus de la influenza A humana preferentemente se dirigen a receptores diferentes de oligosacaridos de superficie de la celula epitelial ( por ejemp/o., receptores de la celula epitelial identificados como glicanos terminados por un acido sialico unido por a 2,3 (SA) que unen preferentemente cepas aviares y glicanos terminados por un SA unido por a2,6 que unen cepas humanas. J. Virol., agosto 2006, p. 7469-7480, Vol. 80, num. 15), los constructos de expresion se pueden disenar para expresar ARNbc activos contra los virus de la influenza A humana y/o aviar, asi como los dominios de union del receptor de la influenza A que preferentemente se dirigen al receptor humano y/o receptor aviar. Aun otros ejemplos de ligandos de la superficie de la celula y las celulas objetivo seran facilmente evidentes para aquellos expertos en la tecnica de la virologia. Por ejemplo, el HBsAg se puede codificar para facilitar aun mas la entrega a los hepatocitos. Cualquier proteina de union al receptor viral codificada por un virus se puede expresar para dirigir las protuberancias o exovesiculas a las celulas infectadas por o capaces de ser infectadas por los virus respectivos. Las celulas se pueden dirigir profilacticamente o terapeuticamente.
Cualquier ligando de la superficie de la celula adecuado que tiene especificidad a un receptor de superficie de la celula objetivo se puede expresar en las celulas transfectadas, clonando el gen para el ligando de superficie de la celula detras de un promotor operativo en la celula transfectada tal que el ligando de superficie de la celula se expresa y se muestra en la superficie de la celula transfectada. Para localizar preferentemente los ligandos expresados en la superficie de la celula en las exovesiculas, el gen para el ligando de la superficie de la celula se puede fusionar a, o modificar para incorporar senales especificas adecuadas a partir de proteinas conocidas que se incorporan dentro de las exovesiculas en la superficie de la celula transfectada.
Por ejemplo, como se discutio anteriormente, la galectina es una proteina que se expresa a altos niveles en celulas del musculo esqueletico y liso, y se observo que se vuelve especificamente concentrado en las evaginaciones de la membrana plasmatica y extrudidas en las vesiculas extracelulares Cooper y Barondes, 1990; Cooper, 1997; Harrison y Wilson, 1992. Se detecto una variedad de otros genes de galectina en diferentes tipos de celulas, cada una que carecen de una secuencia senal y que contienen una secuencia del nucleo altamente conservada de aproximadamente 130 a 135 aminoacidos que contienen un dominio de reconocimiento de carbohidratos (CRD) entre aproximadamente 30 y 90 residuos. Ver Cooper y Barondes, 1999. Walter Nickel y colaboradores encontraron que el dominio CRD en la galectina es necesario para la exportacion, sugiriendo que la maquinaria de exportacion de galectina hace uso de moleculas de superficie que contienen -galactosidasa como receptores de exportacion para galectina-1 intracelular. Seelenmeyer y otros, 2005. En consecuencia, puede ser posible dirigir otros ligandos de la superficie de la celula a evaginaciones de exovesiculas en la membrana celular fusionando las regiones codificantes para dichos ligandos de superficie de la celula en el marco para todo o parte de la region de codificacion del dominio CRD de galectina. La secuencia completa de aminoacidos de la galectina-1 se determino a partir de humanos, asi como algunas otras especies incluyendo vaca , rata, raton, pollo y anguila electrica Inagaki y otros, 2000; Hirabayashi y otros, 1988, Complete amino acid sequence of a
�-galactosidase-binding lectin from human placenta, J. Biochem. (Tokyo) 104:1-4; Abbott y Feizi, 1989, Evidence that the 14 kDa soluble beta-galactosidase-binding lectin in man is encoded by a single gene, Biochem. J. 259: 291-94; Couraud y otros, 1989, Molecular cloning, characterization, and expression of a human 14 kDa lectin, J. Biol. Chem. 264: 1310-16.
La galectina-3 es otro miembro de la familia galectina que muestra que se secreta por las estrangulaciones de los dominios de evaginacion de membrana y la liberacion de vesiculas extracelulares donde se protege de la proteolisis. Krzeslak y Lipinska, 2004. La microscopia electronica demostro que las vesiculas son morfologicamente heterogeneas y tienen un tamano pequeno (hasta aproximadamente 0.5 micras). La galectina-3 es unica en la familia galectina al poseer un dominio N -terminal adicional que consiste de 100 a 150 aminoacidos dependiendo de la especie de origen, que se propuso por contener informacion especifica para la secrecion no clasica. Mas aun, al menos un grupo ha demostrado que la adicion de este segmento N-terminal a una proteina citosolica normalmente, tal como cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) resulto en la exportacion eficiente de la proteina de fusion a partir de celulas Cos transfectadas. Ver Mehul y Hughes, 1997. En consecuencia, deberia ser posible dirigir otros ligandos de la superficie de la celula a evaginaciones de exovesiculas en la membrana celular mediante la fusion de las regiones de codificacion para dichos ligandos de la superficie de la celula en el marco para todo o parte de la region codificante para este dominio N-terminal de galectina-3. Ademas, se pueden usar otros metodos clasicos para expresar ligandos especificos sobre la superficie de la celula.
La descripcion abarca ademas los metodos en donde los genes de los receptores de la superficie de la celula que tienen especificidad de union para ligandos de superficie de la celula en la celula competente se clonan, transfectan en y expresan in vivo. en las celulas objetivo. Como alternativa, los genes recombinantes se pueden introducir en las celulas objetivo que sobrerregulan la expresion de receptores especificos de superficie de la celula. Administrar ciertos farmacos al paciente puede resultar ademas en la sobrerregulacion de los receptores de la superficie de la celula objetivo en funcion del receptor de superficie de la celula objetivo de interes.
En algunas modalidades, los metodos de la presente descripcion pueden comprender aislar ademas al menos una exovesicula a partir de una celula transfectada, en donde la exovesicula aislada contiene el acido nucleico, por ejemplo, un ARNbc, y contactar dicha celula objetivo con la exovesicula aislada. Las celulas productoras de exovesiculas se pueden transfectar in vitro o in vivo, y las exovesiculas que contienen ARNbc despues de eso se aislan y usan para contactar las celulas objetivo. Los metodos para transfectar las celulas productoras de exovesiculas y lineas celulares in vitro con vectores de expresion y las composiciones de ARNbc son conocidos en la tecnica, como son los metodos para aislar exovesiculas. Por ejemplo, Mehul y Hughes describieron un metodo para aislar una fraccion vesicular enriquecida con galectina-3 a partir de macrofagos murinos y celulas Cos-7 transfectadas con el plasmido que expresa la galectina-3. Mehul y Hughes, 1997, Plasma membrane targeting, vesicular budding, and release of galectin 3 from the cytoplasm of mammalian cells during secretion, J. Cell Sci. 110: 1169-78.
Los metodos de la presente invencion se pueden usar en metodos para tratar y prevenir las enfermedades en los mamiferos, particularmente humanos. Cualquier mamifero se puede tratar por los procedimientos de la presente invencion, que incluyen pero sin limitarse a humanos, primates, animales de laboratorio tales como ratones, ratas, conejos, cobayos, etc., animales de granja, tales como vacas, ovejas, cerdos, caballos, cabras, etc., asi como animales domesticos, que incluyen gatos, perros, etc. Los experimentos descritos en la presente muestran que las enfermedades se pueden tratar terapeuticamente o profilacticamente. Particularmente, la presente invencion demuestra que el ARNbc expresado en o justo debajo de la piel, o en el musculo esqueletico se pueden entregar a otros organos o tejidos. En consecuencia, la presente invencion se puede usar para tratar o prevenir cualquier enfermedad de un organo o tejido en el que una reduccion en la expresion genica es eficaz. Por ejemplo, la descripcion incluye un metodo para tratar un paciente que sufre de una infeccion de un organo o tejido, por ejemplo una infeccion viral, por la entrega de ARNbc especifico viral y farmacos virales que contienen ARNbc a la celula objetivo infectada.
En el caso de la infeccion viral por hepatitis B y/o C, por ejemplo, los ARNbc especificos a HBV y/o HCV u otros farmacos especificos a HBV o HCV que contienen ARNbc se entregan al higado por via intramuscular, intradermica o subcutanea o por la administracion a cualquier otra celula competente especifica. Cualquier secuencia genica de HBV y/o HCV puede ser especifica. Otras enfermedades virales del higado tratables por los metodos de la presente invencion incluyen la hepatitis inducidas por CMV y HAV, HBV y/o, HDV, y HEV y HAV.
En el caso de la infeccion por VIH, por ejemplo, los ARNbc especificos del VIH u otros farmacos especificos al VIH que contienen ARNbc se entregan a las celulas T, progenitores de celulas T u otras celulas susceptibles a la infeccion por el VIH por administracion intramuscular, intradermica o subcutanea o por administracion a cualquier otra celula competente especifica. Cualquier secuencia genica de VIH adecuada puede ser especifica, incluyendo, pero sin limitarse a env (gp12), gag, y pol. Como con cualquier virus altamente mutable, es deseable suministrar una pluralidad de moleculas de ARNbc que se dirigen a dos, tres, cuatro, cinco o mas secuencias genicas virales diferentes de VIH y/o diferentes genes virales de VIH por ejemp/o., una o mas secuencias de env de VIH (gp 120 y gp 41), gag de VIH (p24 , p17, etc.), y/o pol de VIH (incluyendo proteasa, integrasa p31, ribonucleasa p15, transcriptasa inversa p51) que codifican para proteinas estructurales, y/o una o mas secuencias de genes reguladores del VIH tat, rev, nef , vif, vpr y vpu, que codifican para proteinas que controlan la capacidad del VIH para infectar una celula, producir nuevas copias de virus, o causar la enfermedad. En el caso del VIH, como se discutio anteriormente, que expresan la glicoproteina gp120 del VIH en las celulas del musculo u otras celulas competentes, adicionalmente a ARNbc especifica a VIH deben conducir a la formacion de exovesiculas que contienen ARNbc que comprenden la glicoproteina del VIH en la superficie. Estas exovesiculas ahora tienen el potencial para ser absorbidas por las celulas T y otros inmunocitos CD4+ que infectan el VIH. Cualquier otro ligando que se une a un receptor sobre la superficie de las celulas T se podria ademas usar para los ARNbc objetivos o ARNm terapeuticos para las celulas T.
Otros virus que pueden ser especificos por la presente invencion incluyen, pero sin limitarse a, influenza, RSV, rabia, picomavirus, polio, coxsacchie, virus herpes simple Tipo I y 2, encefalitis San Luis, virus de Epstein -Barr, mixovirus, JC, coxsakievirus B, togavirus, sarampion, paramixovirus, echovirus, buniavirus, citomegalovirus, varicela- zoster, paperas, encefalitis equina, coriomeningitis linfocitica, rhabodovirus que incluyen la rabia, virus de simio 40, virus de polioma humano, parvovirus, virus del papiloma, adenovirus de primates, coronavirus, retrovirus, Dengue, fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa, y/o BK o cualquiera de las especies/familias de Astoviridae, Togaviridae, Flaviviridae, paramyxoviridae, arterivirus, Rhabdoviridae, Filoviridae, orthomyxoviridae, bunyaviridae, arenaviridae , reoviridae, Birnaviridae, circoviridae, Adenoviridae, Iridoviridae, Retrovirus , Herpesvirus, Hepadenovirus, Poxvirus, Parvovirus, Papilomavirus, y Papovavirus.
El ARN prion, por ejemp/o, ARNm, puede ser dirigido ademas para la represion.
Las infecciones por otros patogenos se pueden prevenir o tratar ademas usando los metodos de la presente invencion, incluyendo protozoos, bacterias, levaduras, e infecciones fungicas. Por ejemplo, para los parasitos intracelulares, tal como Plasmodio, farmacos que contienen ARNbc especificos a patogenos u otros ARNbc efectivos contra el patogeno se pueden entregar a las celulas susceptibles a la infeccion por administracion intramuscular, intradermica o subcutanea
o por administracion a cualquier otra celula competente especifica. Los metodos de la presente invencion son especialmente utiles para tratar la infeccion de hepatocitos por especies de Plasmodio por administracion intramuscular, intradermica o subcutanea y/o expresion y entrega de ARNbc especifico a Plasmodium para el higado.
Como se discutio anteriormente, los presentes inventores plantean la hipotesis que los ARNbc expresados en las celulas de musculo y piel se entregan a los organos o tejidos distales despues que se incorporan dentro de exovesiculas en la superficie de la celula transfectada. Esta incorporacion podria ser un mecanismo pasivo basado en los numeros verdaderos de moleculas de ARNbc expresadas en el citoplasma de la celula, donde los ARNbc se capturan como resultado de un proceso natural, y llevado adelante en la vesicula. En este sentido, como se describio anteriormente, la invencion podria abarcar los metodos para entregar cualquier acido nucleico u otro componente celular expresado en niveles suficientes para que se incorporen en exovesiculas de membrana como protuberancias de la superficie de la celula, que incluyen los ARNm expresados a partir de genes terapeuticos, es decir, terapia genica.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir e ilustrar la presente invencion. Como tal, estos no deben interpretarse para limitar el alcance de la invencion. Aquellos en la tecnica apreciaran bien que muchas otras modalidades tambien caen dentro del alcance de la invencion, como se describio anteriormente y en las reivindicaciones.
Ejemplos
Como se reporta en la presente descripcion los presentes inventores encontraron que la entrega intramuscular de complejos ADN/Bupivacaina, o transfeccion mediada por electroporacion intramuscular de las celulas del musculo con un vector o constructo que expresa moleculas ARNbc, por ejemp/o, moleculas ARNhc (iARN), es sorprendentemente capaz de reducir la expresion de genes objetivo expresados en el higado. Algunos conjuntos de experimentos que se describen demostraron silenciamiento genico en el higado del raton, mediado por un vector de expresion de ARN interferente (eiARN) expresado, inyectado en el musculo. Los disenos experimentales difieren mas significativamente en la secuencia de administracion del material de prueba (terapeutico vs. profilactico), y el producto final que esta siendo ensayado para determinar el nivel de silenciamiento genico que tienen lugar. En el modelo terapeutico, la molecula objetivo (plasmido que expresa un ARN que se silencia) se administra antes que se administre la molecula farmaco (plasmido que expresa la molecula de silenciamiento ARNhc). Lo contrario es cierto para el modelo profilactico. En todos los experimentos, el ARN objetivo que se silencia se mide indirectamente cuantificando el nivel de proteina o actividad enzimatica que se traduce a partir del ARN objetivo. En algunos experimentos, el antigeno de superficie del HBV (sAg) es el producto final medido. En otros, la actividad luciferasa es el producto final medido.
En todos los experimentos descritos aqui, el protocolo hidrodinamico usado para la inyeccion del plasmido objetivo dirige el plasmido al higado, y se ensaya en los intervalos de tiempo cuando el plasmido se expresa exclusivamente en el higado. En ciertos conjuntos de experimentos, la expresion de ARN objetivo se restringe ademas al higado porque se usa un promotor especifico al higado, que no permite niveles significativos de la transcripcion en otros tejidos. Dado que el higado secreta los productos de proteina en el sistema circulatorio del animal, es posible y conveniente para la muestra del suero de la sangre del animal medir la expresion del plasmido objetivo basado en el higado en algunos de estos experimentos. Ya que la obtencion de una muestra de suero del animal no implica sacrificar al animal o de cualquier otra forma alterar la funcion hepatica, esto permite al investigador probar repetidamente los niveles de ARN objetivo en el higado en multiples intervalos de tiempo, midiendo de manera indirecta el producto de la proteina o actividad enzimatica de la proteina indicadora en la sangre.
En todos los experimentos "NUC050" se refiere al plasmido eiARN que es especifico al HBV y que media el silenciamiento genico de sAg. NUC049 es un plasmido eiARN control negativo (que contiene una version mutada de un ARNhc derivado de NUC050).
Ejemplo 1: Inhibicion terapeutica de la expresion in vivo del gen de sAg de HBV por inyeccion intramuscular
En el modelo terapeutico, los animales reciben el objetivo ARN exogeno en la forma de un plasmido que expresa la secuencia codificante del antigeno de superficie del HBV a traves de inyeccion hidrodinamica en la vena de cola. La inyeccion hidrodinamica es un metodo que usa un volumen grande con tiempo de inyeccion rapido para preferentemente dirigir el plasmido de ADN al higado donde se expresa.
Para obtener ratones que expresan un gen objetivo en el higado, el ADNc de HBsAg (antigeno de superficie) se coloco bajo el control de un promotor especifico de higado en un vector plasmidico disponible en el comercio (pLIVE). En el Dia -10, este vector se inyecto hidrodinamicamente en una cepa de ratones inmunodeficientes (NOD.CB17-Pkrdcscid/J). De este modo, el ADN se localiza en gran medida en los hepatocitos del higado y el promotor especifico a tejido restringe ademas la expresion del ARNm de sAg a estas celulas. Dado que los ratones son inmunodeficientes, son capaces de expresar el gen objetivo durante largos periodos de tiempo (mas de un mes) porque no se realizara respuesta inmune a la proteina foranea codificada por el gen objetivo.
Cinco dias despues de la administracion de plasmido objetivo (Dia -5), se sangraron los ratones para determinar los niveles de HBsAg circulante en el suero.
En el dia 0, los ratones se inyectaron por via intramuscular con el vector NUC050 a 1.0 mg/ml en una solucion 0.25 % bupivacaina en un volumen total de 50 ul. El vector NUC050 codifica cuatro moleculas diferentes de ARNhc que se dirigen a porciones diversas del genoma de la hepatitis B para la degradacion a traves del mecanismo del iARN celular. Tres de estas se dirigen a las regiones de HBsAg contenidas en el vector objetivo preadministrado a los ratones. Un grupo control de ratones se trato con el plasmido NUC049 control negativo. En algunos experimentos, los ratones recibieron otro plasmido control negativo, pGL2, que expresa el ARNm de luciferasa pero no moleculas de ARNhc)
Los animales se sangraron posteriormente de nuevo en los Dias 4, 11, 19, y 26 dias despues de la administracion del vector eiARN, respectivamente, y los niveles de HBsAg en el suero se determinaron usando un ELISA HBsAg disponible en el comercio (Bio-Rad, Hercules, CA. HBsAg 3.0 EIA # de catalogo 32591). De 5 a 8 ratones se usaron para cada grupo de tratamiento y los resultados se presentan como el porcentaje de HBsAg de los valores iniciales de HBsAg (pretratamiento). La capacidad del tratamiento con el vector NUC050 para disminuir la expresion de HBsAg se estimo calculando, para cada dia de sangrado, un valor normalizado de la diferencia de los niveles promedio de HBsAg para el control menos los grupos experimentales. La normalizacion se realizo calculando el porcentaje de HBsAg para cada dia posterior del sangrado, con respecto a los valores de HBsAg en el pretratamiento. Pruebas estadisticas Wilcoxon se usaron para evaluar la significacion de los resultados. Las diferencias experimental vs. control se tomaron que sean significativas en los valores de p de menos de 0.05.
El Dia 11 y el Dia 19 muestran promedios de diferencias estadisticamente significativas de -36% y -28 % respectivamente, entre NUC050 y NUC049 (p=0.0088, p=0.0339). (Estos valores reflejan valores promedios normalizados que estan debajo de los valores de presangrado (pretratamiento) de 56% y 93% para NUC050 y NUC049 respectivamente. Para el Dia 11 los valores promedios normalizados en comparacion con los valores de presangrado fueron 54 % (NUC050) vs 82 % (NUC049) para el Dia 19). Los valores promedios para todos los dias de sangrado para NUC050 fueron considerablemente inferiores que todos los valores de NUC049 correspondientes, pero alcanzaron significacion estadistica en los Dias 11 y 19. Ver la Figura 1.
Ejemplo 2: Inhibicion terapeutica de la expresion in vivo del gen de sAg por inyeccion intramuscular.
Los ratones (cepa inmunodeficiente NOD.CB17-Pkrdcscid/J) recibieron el plasmido de expresion objetivo (dirigido al higado por inyeccion hidrodinamica como se describio en el Ejemplo 1) de sAg de HBV (antigeno de superficie) algunos dias antes que se inyectan IM (por via intramuscular) con 1) vector eiARN que expresa ARNhc anti HBV, 2) vector control negativo, o 3) se deja sin tratamiento despues de la inyeccion inicial del plasmido objetivo. Los vectores eiARN para la inyeccion IM se formularon con 0.25% bupivacaina. Los niveles de expresion del sAg, producido en el higado, se supervisaron por ELISA de sAg de muestras de suero durante el curso de aproximadamente 4 semanas.
En este modelo, la expresion de sAg se expresa en un nivel determinado a continuacion de la inyeccion, y despues disminuye gradualmente durante varias semanas, si simplemente se deja a su propio curso, como se ve en los ratones que se dejan sin tratar despues de la inyeccion inicial del plasmido objetivo. Por la administracion del plasmido eiARN ARNhc anti-sAg, la velocidad de disminucion de sAg aumenta en el tiempo con respecto a los ratones no tratados despues de la inyeccion del plasmido de expresion objetivo de HBsAg, o con respecto a los ratones que reciben un plasmido control negativo en lugar de eiARN anti HBV. Un nivel de expresion de sAg inferior total se puede ademas observar en los grupos de ratones experimental vs. control. La velocidad de exito y la eficiencia de la transfeccion del musculo por la inyeccion se puede demostrar por la cotransfeccion de un gen reportero (por ejemp/o, codificando un gen reportero tal como EGFP en los plasmidos eiARN) y supervisando su expresion, ya sea en el musculo entero o secciones de tejidos despues de la inyeccion.
Ejemplo 3: Inhibicion profilactica de la expresion in vivodel gen sAg de HBV por inyeccion intramuscular.
Los ratones (cepa inmunocompetente C57B1/6) recibieron una sola dosis intramuscular del plasmido efector ARNhc de anti HBV, NUC050 o un plasmido control negativo, que se siguio tres dias despues por inyeccion hidrodinamica (a traves de la vena de la cola) del plasmido de HBsAg objetivo (el mismo plasmido objetivo como en el Exp 1 anteriormente). El plasmido de control usado en este experimento fue el vector comercial pGL2, que no codifica proteina y se usa como un control de plasmido irrelevante con respecto a la actividad de eiARN . Las inyecciones IM se formularon con bupivacaina (0.25 % p/v) con una concentracion de ADN de 1.0 mg/ml. 100 ul de la formulacion de bupivacaina se administro IM a cada raton (100ug de ADN).
Los ratones se sangraron para el ensayo ELISA de HBsAg en 3, 6, 9, y 13 dias despues de la administracion hidrodinamica del plasmido objetivo.
Dado que el plasmido objetivo que codifica ARNm de HBsAg y la proteina se reciben con posterioridad al plasmido efector en el modelo profilactico no es posible obtener un valor de sAg de los "valores iniciales" para estos ratones antes de la administracion del farmaco. La inyeccion hidrodinamica se conoce por producir generalmente niveles robustos pero muy variable de sAg en este tipo de modelo animal. Por lo tanto, el nivel de sAg determinado en cualquier intervalo de tiempo refleja una variacion desconocida en el nivel maximo potencialmente de expresion de sAg a partir del plasmido objetivo, asi como la variable experimental de interes, que es el efecto de silenciamiento genico del plasmido eiARN. Por esta razon, una comparacion de los niveles totales de sAg en los grupos de control y experimental no es concluyente, y se realiza el analisis de la velocidad (tambien llamado "analisis de pendiente").
La velocidad de disminucion de los niveles de sAg entre los dias 3 y 13 se aproxima primero ajustando una linea a la curva de los datos, y despues comparando las pendientes de esta linea de ajuste optimo entre los grupos de control y experimental. Los resultados revelaron un aumento en la velocidad de descomposicion de sAg mediado por el plasmido eiARN NUC050, con respecto al plasmido control negativo o ratones que recibieron solo el plasmido objetivo. Las velocidades de disminucion oscilan de 1.4 a 1.7 veces mayor para el tratamiento con eiARN en comparacion con los ratones control.
Ejemplo 4: Modelo profilactico usando la cepa inmunodeficiente NOD.CB17-Pkrdcscid/J, dosificacion multiple y lectura de luciferasa
En este experimento, usando solamente formulaciones de bupivacaina, de los vectores NUC050 (eiARN contra el sAg de HBV) y el NUC049 (control negativo), se uso un sistema de doble reportero para normalizar para la expresion dirigida al higado del plasmido objetivo.
El plasmido objetivo contiene dos genes separados que codifican luciferasas de dos organismos diferentes, luciernaga (FF) y medusas (Renilla o "JF"). Ver WO 04076629A3: Metodos y constructos para la evaluacion de los objetivos principales y moleculas efectoras. Debido a que cada uno produce una longitud de onda diferente de luminiscencia tras la hidrolisis del sustrato luciferina, las dos senales se pueden medir en la misma muestra. El ARNm de luciferasa de renilla se modifica como un ARNm de fusion con elementos de secuencia presentes en el genoma del HBV, tales como el ARNm de fusion se vuelve un objetivo para el plasmido eiARN NUC050, y la senal de renilla es una medida del efecto de silenciamiento genico de NUC050. Por lo tanto la actividad de NUC050 resultara en una reduccion de la senal de luciferasa de renilla aunque se dirige a secuencias del HBV porque las secuencias del HBV estan presentes en el extremo del ARNm de renilla. La senal de luciferasa de FF sirve como un estandar de normalizacion para corregir la variabilidad total en el plasmido objetivo de entrega/transfeccion, porque no esta sujeta a la modulacion negativa por el efector eiARN, sino depende del mismo plasmido para la expresion. Asi, tomando la relacion, luciferasa JF:FF se normaliza para la expresion del plasmido dirigido al higado. En los casos donde se observa una luciferasa de FF insuficiente, se puede concluir que el plasmido no se entrego, y por lo tanto la muestra no es valida para el analisis.
En este experimento, se usaron 25 animales para cada grupo de tratamiento. Los niveles de luciferasa de FF se aceptaron para 19/25 animales en el grupo eiARN (NUC050) y para 17/25 animales en el grupo control (NUC049). Un diagrama de caja y bigotes de todos los valores de relacion indica un cambio claro para relaciones inferiores renilla:FF en el tratamiento vs. el grupo control como se espera a partir del efecto de silenciamiento del plasmido NUC050.
Debido a que las senales promedio de luciferasa de FF fueron superiores en el grupo NUC050 vs NUC049, los datos se analizaron ademas comparando las relaciones renilla:FF en los subgrupos de animales con niveles similares de expresion de luciferasa de FF en ambos grupos de tratamiento. En el subgrupo superior o mas alto (mas de luciferasa de luciernaga) el cambio de relacion paso de 33.5 para los ratones control NUC049 a 24.8 para los ratones NUC050 (26 %) . Asi, existio una reduccion del 26 % en la relacion de renilla:FF en el subgrupo de animales que expresan la cantidad mas alta de la luciferasa de luciernaga. Existieron un total de 10 ratones en este grupo. El siguiente subgrupo mas alto mostro una diferencia de 8 % y paso de una relacion de 30.8 a 28.4. Existieron solamente 5 ratones en este grupo o cubo. El resto de los ratones estuvieron en los grupos que expresan inferior con diferencias menores entre los grupos como se esperaba, pero todavia existio algunas diferencias .. La diferencia total entre los 2 grupos comparando todos los animales fue de 10 %.
Para evaluar la importancia en la reduccion de 10-26 % en la relacion renilla: FF visto a traves de los grupos y subgrupos, comparamos la reduccion en la relacion con esa en los animales que reciben tanto los plasmidos objetivo como efectores juntos por entrega directa hidrodinamica. La entrega hidrodinamica directa de tanto los plasmidos objetivo como efectores tipicamente resulto en un efecto de silenciamiento maximo de 30% en este sistema. Por lo tanto, en comparacion con un efecto maximo de 30 %, el 10-26 % observado con este mecanismo de entrega nuevo parece muy significativo y sugiere que estos experimentos pueden servir como una base para metodos y composiciones nuevas para eiARN y ARNip/ARNhc mediado por el silenciamiento genico a traves de la entrega en el musculo.
Ejemplo 5: Entrega por electroporacion.in vivo del modelo eiARN:doble luciferasa
Para probar si la electroporacion in vivo seria una forma eficaz para entregar eiARN en las celulas del musculo esqueletico, los ratones se anestesiaron primero, entregaron la inyeccion IM y colocaron los electrodos en los musculos y se entregan los pulsos. Mas especificamente, hembras C57B1/6 recibieron una inyeccion intramuscular (IM) en el musculo de la tibia de una pata de cualquier formulacion NUC 050 (sustancia farmaco) o NUC 049 (control negativo) en un volumen de 25ul, concentracion de 2.0 mg/ml. Se uso una sonda de 3 puntas de Advisys, The Woodlands, Texas, y se coloco en el musculo de la tibia de la pata del raton. Se administraron dos pulsos de electricidad (ver detalles en la tabla mas abajo).
Tabla 1 Ajustes del electroporador
Pulso en la Secuencia :
1 2
Tiempo (s) de espera previo :
4 1
Ancho del pulso (ms):
52 52
Corriente del pulso (A):
0.1 0.1
Seis dias despues de la dosificacion, a todos los ratones se les administro una inyeccion hidrodinamica, o "desafio" de 1 ug del plasmido de expresion (NUC 060, plasmido de fusion doble luciferasa de HBV).
Cinco dias despues de la inyeccion hidrodinamica, todos los ratones se sacrificaron y sus higados se disecaron, congelaron, y almacenaron a -70C Los higados se homogeneizaron con un homogeneizador mecanico en un tampon de lisis celular, centrifugaron, y el sobrenadante se elimino para el analisis. Las muestras de sobrenadante de todos los higados se ensayaron para la presencia de proteinas de luciferasa tanto de Renilla como luciernaga. La relacion de luciferasa de Renilla:luciernaga (RLU) representa un perfil de expresion normalizado y sirve como medida de la salida del ensayo. El promedio de la relacion de luciferasa de Renilla:luciernaga del grupo NUC 050 se compara con la relacion promedio del grupo NUC 049. Esta diferencia se representa como un valor neto de la relacion y una diferencia de porcentaje.
La diferencia de los dos promedios se prueba para la significacion estadistica usando una prueba no parametrica de Wilcoxon de 2 muestras para un valor de p menos de 0.05.
Los resultados indican una reduccion del 35 % en el ARNm de fusion de Renilla con respecto al ARNm de luciernaga en el grupo de NUC050 (Ver las Figuras 2 y 3 y las Tablas 2 y 3). Con respecto a los resultados obtenidos con la inyeccion IM (sin electroporacion) de NUC050, estos resultados son consistentes con la mejor transfeccion del musculo cuando se usa la electroporacion como medio para transfectar el musculo con los vectores eiARN. Esto es consistente ademas con una velocidad de entrega al higado de los ARNip o ARNhc a hepatocitos aproximando y quizas excediendo lo que tipicamente se logra por inyeccion hidrodinamica cuando el eiARN se inyecta hidrodinamicamente primero y despues el desafio con el vector doble de luciferasa se recibe mas tarde por inyeccion hidrodinamica (HDI). Estimamos basado en estos datos que aproximadamente 40%-60% de los hepatocitos probablemente tomaron una o mas ARNhc codificados por NUC050. Esto se debe a que cada inyeccion hidraulica tipicamente transfecta aproximadamente 40-60% de los hepatocitos. La transfeccion de hepatocitos a continuacion de la HDI es aleatoria y la segunda HDI llegaria aproximadamente 40-60 % de las celulas que se transfectaron por la primera HDI
Tabla 2 Valores individuales de raton (relaciones)
Promedio
21.3 32.7
SD
2.97 8.49
Tabla 3
Analisis�ddiniondl
Nuc050 Nuc049
Promedio
21.28 32.69
Error Estandar
0.82 2.35
Promedio
21.43 32.90
Modo
#N/A #N/A
Desviacion Estandar
2.97 8.49
Varianza de la muestra
8.84 72.01
Curtosis
-0.09 -1.30
Asimetria
0.34 0.00
Intervalo
10.62 25.60
Minimo
16.78 19.30
Maximo
27.40 44.90
Suma
276.70 425.01
Conteo
13 13
Ejemplo 6. Entrega por electroporacion In vivo de eiARN contra el antigeno de superficie de HBV
En este experimento, los ratones inmunocompetentes C57B16 se electroporaron por via intramuscular con el eiARN anti-HBV (NUC050) o con un eiARN irrelevante (NUC049). A continuacion de la electroporacion, los ARNhc codificados por los vectores eiARN se transcriben a altos niveles de copia en el musculo electroporado (2,000,000,000 de copias de ARNhc individuales detectados por 0RT-PCR en el pedazo del musculo electroporado). Siete dias posterior a la electroporacion intramuscular (IM-EP), grupos de ratones se desafiaron por inyeccion hidrodinamica con tres dosis diferentes de NUC054, un vector de expresion de HBV que codifica HBsAg. Las dosis fueron de 10 ug, 5.0 ug y 2.0 ug de NUC054. Las inyecciones hidrodinamicas ademas todas contuvieron cantidades identicas de un vector de expresion hAAT como un marcador para la HDI exitosa, es decir, valores de hAAT en el suero son un marcador sustituto de la cantidad de transfeccion de NUC054 ya que ambos plasmidos se co-administraron. La cantidad total de ADN se mantuvo constante en cada inyeccion a traves de la inclusion de un plasmido rellenador inerte, pGL2-basico
Dos dias, siete dias y 16 dias a continuacion del desafio con NUC054, se recogio la sangre de los ratones para la medicion de HBsAg. Si IM-PE de NUC050 especificamente es capaz de regular negativamente el HBsAg en el suero (en comparacion con el control NUC049), despues el musculo transfectado debe ser capaz de pasar las moleculas de plasmido especificadas tales como ARNhc/ARNip producidos en el musculo a los hepatocitos donde se produce el iARN del ARNm objetivo de HBV. Esto es porque NUC054 que codifica el ARNm del HBV se expresa en los hepatocitos especificamente a continuacion de la HID de NUC054 y debe ocurrir en los hepatocitos si se produce la regulacion negativa. El HBsAg se elabora en los hepatocitos y se secreta en el suero donde se puede medir. Como se discute ademas mas abajo, los resultados indican que NUC050 especificamente, y con significacion estadistica regula negativamente la expresion de HBsAg en los ratones que recibieron NUC050 a traves de electroporacion intramuscular.
Ana/isis Estadfstico
Las concentraciones del antigeno de superficie en el suero (sAg) 2 dias posterior al desafio de los ratones que recibieron tratamiento con el plasmido NUC050 y 2, 5 o 10 ug del plasmido sAg (NUC054) inyectado hidrodinamicamente se compararon con el grupo sAg compuesto de concentraciones de sAg en el suero en el mismo dia que los ratones recibieron el plasmido NUC049 del tratamiento control y ya sea 2, 5 o 10 ug de NUC054 inyectado hidrodinamicamente usando una aplicacion de la prueba unilateral de Wilcoxon de dos muestras proporcionada por el Dr. Sam Litwin. El tratamiento con NUC050 resulto en valores inferiores de sAg en el suero estadisticamente significativo en comparacion con aquellos del grupo control (p=0.005).
El analisis anterior se realizo para los datos obtenidos 7 dias despues del desafio y el tratamiento con NUC050 resulto en valores de sAg en el suero inferiores, estadisticamente significativo cuando se comparo con el grupo control (p=0.002)
Los valores de hAAT en el suero a partir de ratones que recibieron tratamiento con NUC050 y 2, 5 o 10 ug de plasmido sAg inyectado hidrodinamicamente fueron coincidentes con los valores de hAAT de ratones que recibieron el tratamiento control con NUC049 y 2, 5 o 10 ug de plasmido NUC054 inyectado hidrodinamicamente . Los valores de hAAT en el suero son un marcador sustituto de la cantidad de transfeccion de NUC054 ya que ambos plasmidos se coadministraron. Los datos de las parejas de animales no coincidentes no se uso. El dia 2 las concentraciones de sAg de ratones que recibieron tratamiento con el plasmido NUC050 se compararon con el grupo coincidente compuesto de concentraciones de sAg en el mismo dia de los ratones que recibieron el plasmido NUC049 del tratamiento control usando una aplicacion de la prueba unilateral de Wilcoxon de muestras pareadas proporcionada por el Dr. Sam Litwin. Los resultados de la prueba mostraron que el tratamiento con NUC050 resulto en concentraciones de sAg inferiores estadisticamente significativo en comparacion con el grupo control (p= 0.011).
Los valores hAAT en el suero de ratones que recibieron el tratamiento con NUC050 y 10 ug del plasmido sAg inyectado hidrodinamicamente fueron coincidentes con los valores hAAT de los ratones que recibieron el tratamiento control con NUC049 y 10 ug de plasmido NUC054 inyectado hidrodinamicamente. Los valores de hAAT en el suero son un marcador sustituto de la cantidad de transfeccion de sAg ya que ambos plasmidos se co-administraron. Los datos de las parejas de animales no coincidentes no se uso. Las concentraciones de sAg en el dia 2 de ratones que recibieron tratamiento con el plasmido NUC050 se compararon con el grupo coincidente compuesto de concentraciones de sAg en el mismo dia que los ratones recibieron el plasmido NUC049 del tratamiento de control usando una aplicacion de la prueba unilateral de Wilcoxon de muestras pareadas proporcionada por el Dr. Sam Litwin. Los resultados de la prueba mostraron que el tratamiento con NUC050 resulto en concentraciones de sAg que fueron estadisticamente significativo (p=0.009) menos que aquellos del grupo de plasmido control NUC049. Ver la Tabla 4.
Tabla 4.
Muestrd
Pruebd vdlor-p
Datos combinados dia 2
Wilcoxon 2 muestra 0.005
Datos combinados dia 7
Wilcoxon 2 muestra 0.002
Datos coincidentes combinados dia 2
Wilcoxon pareado 0.011
Datos coincidentes 10-ug dia 2
Wilcoxon pareado 0.009
5 Ejemplo 7. Cuantificacion de ARNip expresado en el musculo
El proposito de este experimento fue medir la cantidad de ARNip expresado en el musculo a partir de plasmido eiARN a continuacion de la electroporacion intramuscular. Para nuestra hipotesis de celula del musculo transfectado para actuar como un deposito para entregar ARNip/ARNhc o ADN a los sitios distales, el musculo primero se debe transfectar. Si el
10 musculo esta secretando o exportando vesiculas que contienen ARNip/ARNhc, entonces mientras mas moleculas de estas se expresen, mas ARNip/ARNhc seran enviados hacia fuera de la celula, y se espera una entrega superior a los sitios distales.
En este experimento, los ratones se electroporaron por via intramuscular con NUC050. NUC050 expresa cuatro ARNhc
15 especificos a HBV que se procesan en los ARNip. Para este experimento, solo se midio uno de los ARNip codificados. A continuacion de la electroporacion, el area del musculo electroporado se recogio y congelo rapidamente. El ARN posteriormente se extrajo y uno de los ARNip expresados a partir de NUC050, si1737, se midio por 0RT-PCR.
El 0RT-PCR para la deteccion de los ARNip expresados dirigidos a HBV que incluyen si1737, si1907 y si2791 se realizo
20 utilizando el protocolo descrito por Caifu Chen, y otros en (Chen Caifu/ABI Method: Nucleic Acid Research, 2005, 33(20):e179). Si1737 sirvio como un ejemplo del protocolo. El procedimiento involucra una reaccion de transcripcion inversa para generar ADNc a partir del ARNip. Esto se realiza principalmente por el uso de un iniciador de lazo, que coincide con 8 nucleotidos de la secuencia de ARNip de 1737. (Fig. 4) Este protocolo utiliza un iniciador tallo-lazo para generar el ADNc para el PCR a partir del ARNip expresado. Este metodo se mostro para proporcionar mejor
25 especificidad de RT y eficiencia que los iniciadores lineales debido al apilamiento de bases del tallo del iniciador, lo que mejora la estabilidad termica del heteroduplex ARN-ADN resultante. La restriccion espacial del iniciador lazo mejora ademas la especificidad del ensayo en comparacion con los iniciadores lineales como se muestra por Chen.
El ARN para las reacciones se recogio por el protocolo de Invitrogen Trizol (catalogo #15596-026). El ARN se extrajo en
30 Trizol a partir de tejido del musculo usando homogeneizacion. La reaccion RT se realizo en un volumen de reaccion de 15ul con las concentraciones finales de 10 mM MgCl 2, 1x tampon PCR GeneAmp (Applied Biosystems catalogo # N808 -0010), 50 nM iniciador lazo, 0.26mM dNTP, 3.33 U/Il MultiScribe transcriptasa inversa (Applied Biosystems catalogo # 4319983), 0.26 U/Il inhibidor de ribonucleasa GeneAmp (Applied Biosystems catalogo # N808 -0119). Las reacciones se incubaron en un Reciclador Termico MJ Research PTC -200 Peltier durante 30 min a 16 °C , 30 min a 42 °C y 5 min
35 a 85 °C. El ADNc se anadio despues a la reaccion 0-PCR con una concentracion superior del iniciador directo. El exceso de iniciador directo preferentemente se une y genera mas ADNc antisentido. La sonda FAM para 0-PCR une despues el ADNc antisentido junto con el iniciador inverso, empezando asi, la deteccion de 0-PCR. La reaccion 0-PCR se realizo en 201l de volumen de reaccion con 21l de producto de RT de entrada, y concentraciones finales de la Mezcla maestra 1 x Taqman Universal Amperase UNG (Applied Biosystems catalogo # 4324018), 1500 nM iniciador
40 directo, 750 nM iniciador inverso, 200 nM sonda FAM . Las reacciones se ejecutaron en un sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems 7300 durante 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 60 °C durante 1 min usando un detector FAM. Las secuencias de iniciadores y sonda fueron como sigue:
Las secuencias de si1737 (hebras subrayadas) y su iniciador lazo se enumeran mas abajo:
5'-GGAUUCAGCGCCGACGGGACG-3'�ssen.�non�num.�deident.:�1�
3'-TGCCCTGCGAGTTG-ACTTAACGGCTGAGGTGCTGTGGTCAACTC-5' (sec. con num. de ident.: 2)
50 Despues de la reaccion RT, un ADNc se sintetizara como sigue :
3'-CCTAAGTCGCGGCTGCCCTGCGAGTTG-ACTTAACGGCTGAGGTGCTGTGGTCAACTC-5' (sec. con num. de ident.: 3)
55 En la reaccion 0-PCR, la concentracion superior del iniciador directo (hebra rosada) preferentemente elabora mas ADNc antisentido (la hebra azul):
El ADNc antisentido se podra usar para la union de la sonda y iniciador inverso:
5' CAGCTGGGA-GGATTCAGCGCCGAC-3' (sec. con num. de ident.: 7) 5 5'CAGCTGGGA-GGATTCAGCGCCGACGGGACGCTCAAC-TGAATTGCCGACTCCACGACACCAGTTGAG-3' (sec. con num. de ident.: 8)
Q-TGCCCTGCGAGTTG-ACTT-Fdm�ssen. non�num.�de�ident.: �9� 3'-CTGAGGTGCTGTGGTCAACT-5'�ssen.�non num. de�ident.: �10�
10 Si1737 quimicamente sintetizado por IDT, Ames Iowa se uso para generar una curva estandar y para usar en el recobrado pico.
Cuatro musculos electroporados a partir del estudio con ND311 que se inyectaron con NUC050 y APL050 mostraron niveles de expresion de si1737 entre 8.0 e+006 a 22 e+009 de los ARNip. Los musculos electroporados inyectados con 15 el vector de expresion sAg solo, APL050, no produjeron ninguna deteccion del ARNip segun predijimos. El musculo virgen fue negativo ademas para la expresion de ARNip segun predijimos. Para los resultados, ver Tabla 5 mas abajo.
Tdbld 5
Nombre de la muestra
Detector Tarea Ct Cantidad
6.00E+08
1737 Estandar 12.93
6.00E+08
6.00E+07
1737 Estandar 15.55
6.00E+07
6.00E+06
1737 Estandar 19.52
6.00E+06
6.00E+05
1737 Estandar 22.51
6.00E+05
6.00E+04
1737 Estandar 26.05
6.00E+04
musculo ND311 APL050 1A
1737 Desconocido sin determinar
musculo ND311 APL050 1B
1737 Desconocido sin determinar
musculo ND311 APL050 1C
1737 Desconocido sin determinar
musculo ND311 APL050 1D
1737 Desconocido sin determinar
musculo ND311 ALP050+Nuc050 2A
1737 Desconocido 19.04 7.24E+06
musculo ND311 ALP050+Nuc050 2B
1737 Desconocido 19.88 4.04E+06
musculo ND311 ALP050+Nuc050 2C
1737 Desconocido 14.95 1.24E+08
musculo ND311 ALP050+Nuc050 2D
1737 Desconocido 15.97 6.10E+07
musculo virgen
1737 Desconocido sin determinar
Control negativo H2O
1737 Desconocido sin determinar
Control negativo H2O
1737 Desconocido sin determinar
Nota 1. El ARN extraido del musculo se resuspendio en un volumen total de 12 ul. 5 ul de este
Nombre de la muestra
Detector Tarea Ct Cantidad
extracto se anadio a la reaccion inicial RT cuyo volumen total fue 15 ul. 2u/l/15ul de la reaccion RT se uso para una reaccion de PCR. Esto significa que los valores de PCR para el numero de copias de ARNip se multiplicaron por 18 para obtener el numero de copias de si1737 en los extractos de musculo. Por ejemplo, los resultados que se obtienen y muestran como datos en la tabla anterior se multiplicaron por 18 para obtener el numero total de copias de si1737 en la muestra extraida de musculo.
Ejemplo 8. Micrografias electronicas de protuberancias de musculo
Las fotos publicadas de protuberancias de musculo inmunologicamente tenidas por galectina-B (Fig. 5, paneles B, C y D) se compararon con una foto vencida en el tiempo por los presentes inventores de unas protuberancias secretoras de mioblastos (panel A). Antes de hacer la foto, las celulas L6 (que contienen mioblastos en cultivo que se diferenciaron en miotubos) se transfectaron con un plasmido de expresion EGFP para ver si podiamos ver las protuberancias y de ser asi, si contienen EGFP. De ser asi, esto indica que las protuberancias empacan el contenido citosolico en su interior. La imagen de la Figura 5, panel A muestra mioblastos transfectados con estructuras similares a protuberancias que son fluorescentes.
Ejemplo 9. Inhibicion profilactica de la expresion in vivo del gen de sAg de HBV por inyeccion intramuscular
Este ejemplo muestra esa inyeccion subcutanea de un plasmido eiARN que expresa los ARNip especificos de la Hepatitis B que causan la regulacion negativa distal de los ARNm que contienen secuencias objetivo de la Hepatitis B en los hepatocitos del higado. Los resultados de los datos podrian indicar que la inyeccion subcutanea de las moleculas de eiARN/moleculas de ARNip y probablemente la inyeccion intradermica asi puede mediar la regulacion negativa del gen(es) en los hepatocitos, sin limitarse al gen de sAg de HBV ejemplificados aqui. Las moleculas transferidas a los sitios distales podrian ser ARNip/ARNhc, el ADN plasmido eiARN o el Complejo de silenciamiento inducido por ARN cargado con ARN. Cualquier ARNip/ARNhc y/o ADN se podria predecir por lo tanto para transferir. Aunque este modelo es profilactico, ya que estos resultados muestran que el agente activo se transfiere a los hepatocitos, una inyeccion subcutanea terapeutica se predice ademas que funcione.
Fondo�experimentdl
En el modelo profilactico, la molecula farmaco (plasmido que expresa la molecula de silenciamiento ARNhc) se administra antes de que se administre la molecula objetivo (plasmido que expresa un ARN que se silencia).
En todos los experimentos "NUC050" se refiere a un vector de expresion de plasmido eiARN que expresa cuatro ARNbc de horquilla cortos diferentes (los ARNhc) especificos a HBV (ver por ejemp/o, WO 2006/033756, plasmido pHB4, Figura 9) que media el silenciamiento de un vector de fusion HBV-Luciferasa, "NUC060", por ejemp/o, como se describe en WO 04076629/US 2006/0263764. "NUC049" es un plasmido eiARN control negativo (que expresa una version mutada de un ARNhc unico derivado de NUC050).
El plasmido objetivo contiene dos genes separados que codifican luciferasas a partir de dos organismos diferentes, Luciernaga (FF) y medusa (Renilla o "JF"). Ver WO 04076629: Metodos y constructos para la evaluacion de los objetivos de iARN y moleculas efectoras. Debido a que cada uno produce una longitud de onda diferente de luminiscencia tras la hidrolisis del sustrato luciferina, las dos senales se pueden medir en la misma muestra. El ARNm de luciferasa de Renilla se modifica como un ARNm de fusion con elementos de secuencia presentes en el genoma del HBV, tal que el ARNm de fusion se vuelve un objetivo para el plasmido eiARN NUC050, y la senal de Renilla es una medida del efecto de silenciamiento genico de NUC050. La actividad de NUC050 por lo tanto resultara en una reduccion de la senal de luciferasa de Renilla aunque se dirige a secuencias del HBV porque las secuencias de HBV estan presentes en el extremo del ARNm de Renilla. La senal de luciferasa de FF sirve como un estandar de normalizacion para corregir la variabilidad total en el plasmido objetivo de entrega/transfeccion, porque no esta sujeta a la modulacion negativa por el efector eiARN, sino depende del mismo plasmido para la expresion. Asi, tomando la relacion, luciferasa JF:FF se normaliza para la expresion del plasmido dirigido al higado. En los casos donde se observa una luciferasa de FF insuficiente, se puede concluir que el plasmido no se entrego, y por lo tanto la muestra no es valida para el analisis.
Administracion subcutanea in vivo del modelo eiARN:doble luciferasa
Ratones hembras C57B1/6 recibieron una inyeccion subcutanea (SC) de ya sea formulacion de NUC 050 (sustancia farmaco eiARN ) o NUC 049 (sustancia control negativo eiARN) en un volumen de 200 Il, concentracion de 1.5 mg/ml. Las formulaciones consisten de ADN en una solucion salina isotonica. Seis dias despues de la dosificacion, todos los ratones se les administro la inyeccion hidrodinamica (HDI), o "desafio" de 1 ug del plasmido de expresion (NUC 060,
plasmido de fusion luciferasa doble de HBV). HDI es un mecanismo que permite la transfeccion selectiva de los hepatocitos del higado.
Cinco dias despues de la inyeccion hidrodinamica (dia 11), todos los ratones se sacrificaron y sus higados se disecaron,
5 congelaron, y almacenaron a -70C. Los higados se homogeneizaron con un homogeneizador mecanico en un tampon de lisis celular, centrifugaron, y el sobrenadante se elimino para el analisis. Las muestras de sobrenadante de todos los higados se ensayaron para la presencia tanto de proteinas de luciferasa de Renilla como luciernaga. La relacion de luciferasa de Renilla:Luciernaga (RLU) representa un perfil de expresion normalizado y sirve para medir la salida del ensayo. El promedio de la relacion de luciferasa de Renilla:Luciernaga del grupo NUC 050 se compara con la relacion
10 promedio del grupo NUC 049. Esta diferencia se representa como un valor neto de la relacion y una diferencia de porcentaje.
La diferencia de los dos promedios se prueba para la significacion estadistica usando una prueba no parametrica de 15 Wilcoxon de 2 muestras para un valor de p menos de 0.05.
En este experimento, se usaron 15 animales para cada grupo de tratamiento. Los niveles de luciferasa de FF fueron aceptables para 8/15 animales tanto en el grupo eiARN (NUC050) como el grupo de control (NUC049). Una grafica de caja y bigotes de las relaciones de actividad de Renilla:FF en las celulas del higado muestra una disminucion clara y
20 estadisticamente significativa del objetivo ARNm de fusion de HBV-luciferasa de Renilla en el tratamiento vs. el grupo de control. Los niveles promedios del ARNm objetivo se reducen por 16.7 % en el grupo de tratamiento (ver las Figuras 8 y 9 , Tablas 6 y 7) & 7).
El silenciamiento observado del ARNm objetivo indica ya sea que el ADN plasmidico, el eiARN expresado y/o sus
25 productos procesados (es decir, el ARNip ds o complejo de silenciamiento inducido por ARN cargado con ARN) se transportaron del sitio de la inyeccion subcutanea a los hepatocitos en el higado. Este transporte se puede mediar por las celulas en el sitio de la inyeccion. A pesar del mecanismo involucrado sin embargo, estos resultados muestran que la inyeccion subcutanea de un eiARN que expresa un plasmido puede reducir los niveles de ARNm objetivo en un sitio distal, en este caso hepatocitos del higado.
30 Tabla 6 Valores indoviduales de raton relaciones
Tabla 7
Analisis�ddiniondl
360-1 (Nuc050) 360-2 (Nuc049)
Promedio
14.81 17.79
Analisis�ddiniondl
Error Estandar
0.93 1.17
Promedio
14.68 17.94
Modo
#N/A #N/A
Estandar
Desviacion
2.62 3.30
Varianza de la muestra
6.88 10.88
Curtosis
-2.10 -0.18
Asimetria
0.17 -0.34
Intervalo
6.47 9.78
Minimo
12.03 12.28
Maximo
18.50 22.06
Suma
118.47 142.30
Promedio
14.81 17.79
Conteo
8 8
Ejemplo 10: Inhibicion terapeutica de la expresion in vivo del gen de sAg de HBV por transferencia adoptiva subcutanea de celulas transfectadas NUC050.
El vector NUC050 codifica cuatro moleculas diferentes de ARNhc que se dirigen a porciones diversas del genoma de la hepatitis B para la degradacion a traves del mecanismo del iARN celular. Tres de estas se dirigen a las regiones de HBsAg contenidas en el vector objetivo preadministrado a los ratones.
En el modelo terapeutico, los animales reciben el objetivo ARN exogeno en la forma de un plasmido que expresa la secuencia codificante del antigeno de superficie del HBV a traves de inyeccion hidrodinamica en la vena de cola. La inyeccion hidrodinamica es un metodo que usa un volumen grande con tiempo de inyeccion rapido para preferentemente dirigir el plasmido de ADN al higado donde se expresa.
Para obtener ratones que expresan un gen objetivo en el higado, el ADNc de HBsAg (antigeno de superficie) se coloco bajo el control de un promotor especifico de higado en un vector plasmidico disponible en el comercio (pLIVE). En el Dia -7, este vector se inyecto hidrodinamicamente en una cepa de ratones inmunodeficientes (NOD.CB17-Pkrdcscid/J). De este modo, el ADN se localiza en gran medida en los hepatocitos del higado y el promotor especifico a tejido restringe ademas la expresion del ARNm de sAg a estas celulas. Dado que los ratones son inmunodeficientes, son capaces de expresar el gen objetivo durante largos periodos de tiempo (mas de un mes) porque no se realizara respuesta inmune a la proteina foranea codificada por el gen objetivo.
Cuatro dias a continuacion de la administracion del plasmido objetivo (Dia -3), los ratones se sangraron para determinar los niveles de HBsAg circulante en el suero. En el Dia 0, los ratones se inyectaron por via subcutanea con una suspension de celulas RD (rabdomiosarcoma) (RD; ATCC CCL-135) que se habia transfectado con NUC050 dentro de un volumen total de 0.2-0.4 ml. Un grupo control de ratones se trato con una suspension de celulas RD que se habia transfectado con el plasmido NUC049 de control negativo.
Las suspensiones celulares NUC050 y NUC049 se prepararon identicamente como sigue: Brevemente, las celulas RD se sembraron en frascos T150 (150 cm2) a una densidad de 5x106 celulas por frasco e incubaron @ 37°C, 5% CO2. Un dia mas tarde se transfectaron ya sea con vectores NUC050 o vector NUC049 control negativo (28ug/frasco, respectivamente) se mezclaron con el reactivo de transfeccion Fugene Roche T 6 (catalogo # 11814443001). Las celulas fueron mas o menos 65% confluente en el momento de transfeccion. Despues de la transfeccion se anadio la mezcla, las celulas RD se incubaron durante la noche @ 37°C, 5% CO2. Al dia siguiente, las celulas se lavaron en Solucion Salina Tamponada con Fosfato 1x Dulbecco (DPBS) y el medio se cambio a Medio fresco de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) con 10 % SFB. Tres dias despues de la transfeccion, las celulas RD se lavaron en DPBS esteril y se tripsinizaron para liberarlas de la superficie del frasco. Las celulas se contaron y multiples alicuotas de 1x10 8 celulas se lavaron dos veces en DPBS esteril y sedimentaron por centrifugacion. Las celulas RD se resuspendieron despues en
4.5 ml DPBS esteril. Una suspension celular de 0.2-0.4 ml que contiene aproximadamente 8 x 10 6 celulas se inyectaron despues por via subcutanea en cada raton NOD.CB17-Prkdcscid/J (NOD/SCID) en el costado derecho, usando una aguja de calibre 23.
Los animales se sangraron de nuevo posteriormente en los Dias 6 y 11 despues de la administracion del vector eiARN, respectivamente y los niveles de HBsAg en suero se determinaron usando un ELISA HBsAg disponible en el comercio (Bio-Rad, Hercules, CA. HBsAg 3.0 EIA catalogo # 32591). Los animales estan programados para que se sangren de nuevo en los dias 18 y 25 dias despues de la administracion del vector eiARN, asi como con la posterior medicion del nivel de HBsAg. De 9 a 11 ratones se usaron para cada grupo de tratamiento y los resultados se presentan como porcentaje de HBsAg de los valores iniciales de HBsAg (pre- tratamiento). La capacidad de las celulas tratadas con el vector NUC050 transferidas adoptivamente para disminuir la expresion de HBsAg se estimo calculando, para cada dia de sangrado, un valor de la diferencia normalizada de los niveles promedios de HBsAg para el control menos los grupos experimentales. La normalizacion se realizo calculando el porcentaje de HBsAg para cada dia posterior del sangrado, con respecto a los valores de HBsAg en el pretratamiento.
Los Dia 6 y Dia 11 muestran los promedios de diferencia de -8 % y -18 % respectivamente, entre NUC050 y NUC049 (Figura 10 y Tabla 8) (Estos valores reflejan valores promedios normalizados que estan debajo de los valores de presangrado (pretratamiento) 124% y 132% para NUC050 y NUC049 respectivamente para el Dia 6. Los valores promedios normalizados en comparacion con los valores de Presangrado fueron 105% (NUC050) vs. 123% (NUC049) para el Dia 11. Basado en esta tendencia y las tendencias de los datos historicos dentro de este modelo animal, anticipamos diferencias crecientes entre los grupos de tratamiento y control en los puntos de tiempo posteriores (Dia 18 y Dia 25).
Las celulas transfectadas exogenamente por ejemp/o. las celulas del musculo como se describe en la presente se podrian ademas cultivar y su medio de cultivo usado como una fuente de "protuberancias" que contienen ARN o exovesiculas para usar como se describe en otras partes en la presente. Un experto en la tecnica reconocera ademas que los metodos descritos se pueden utilizar para el trasplante heterologo o autologo en un mamifero receptor de celulas transfectadas exogenamente, tales como celulas del musculo para usar como una fuente de moleculas efectoras de ARN biologicamente activas entregados a las celulas distales que incluyen las celulas del higado, tales como hepatocitos.
Tabla 8 Niveles normalizados de HBsAg (% del presangrado)
tiempo�pt
Nun049 Nun050 Diferennid
Did6
132.2 123.8 -8.4
Did�11
123.0 105.4 -17.6
Ejemplo 11. Entrega por electroporacion in vivo de eiARN contra interleucina- 12 (IL-12) endogena.
En este experimento, ratones BALB/cJ inmunocompetentes se administran un vector eiARN anti-IL-12 o un vector eiARN irrelevante, control negativo a traves de inyeccion intramuscular (IM) de forma concomitante con la electroporacion (EP) (IM-EP). El vector plasmidico eiARN anti-IL-12 codifica una molecula de ARNhc conducida por un promotor 7SK, que dirige la subunidad p40 de la secuencia de ARNm de IL-12 de raton para la degradacion a traves del mecanismo de iARN celular especifico de la secuencia. A continuacion de la administracion IM-EP, las moleculas de ARNhc codificados por los vectores eiARN se transcriben a altos niveles de copia en el musculo electroporado ( 2,000,000,000 copias de ARNhc individual detectable por 0RT-PCR en el pedazo de musculo electroporado).
Un dia, cuatro dias, siete dias, y 11 dias a continuacion de la dosificacion con los vectores eiARN anti-IL-12 y control, se recoge la sangre de los ratones para la medicion de IL-2 usando un ELISA disponible en el comercio (R&D Systems). Si la entrega IM-PE del vector eiARN anti-IL-12 es especificamente capaz de regular negativamente la IL-12 endogena en el suero (en comparacion con el vector control), el musculo transfectado despues debe ser capaz de pasar las moleculas expresadas de plasmido, tales como ARNhc/ARNip producido en el musculo para al menos algunas de las diversas celulas inmunes distales (macrofagos, monocitos, celulas dendriticas y celulas B) que expresan IL-12 y donde se produce iARN del ARNm objetivo de IL-12. Debido a que la IL-12 se expresa por multiples tipos de celulas en todo el cuerpo, la regulacion negativa significativa seria muy probable para la entrega sustancial de la senal a multiples sitios donde residen dichas celulas. En el presente estudio, esperamos que la inyeccion intramuscular del vector eiARN antiIL-12 con la electroporacion (IM-EP) en ratones resulte en la regulacion negativa sostenida de IL-12 endogena en suero durante todos los intervalos de tiempo. Esperamos que los metodos alternativos de entrega a las celulas del musculo (por ejemp/o, entrega vascular con presion aumentada al musculo de la extremidad de mamiferos como se describio en otras partes en la presente) podrian lograr ademas la regulacion negativa de un acido nucleico objetivo tal como la IL-12 en celulas no musculares distales, incluyendo las celulas inmunes.
Aunque en la especificacion anterior esta invencion se describio en relacion con ciertas modalidades preferidas de esta, y muchos detalles se expusieron para propositos de ilustracion, resultara evidente para aquellos con experiencia en la tecnica que la invencion es susceptible a modalidades adicionales y que ciertos de los detalles descritos en la presente se pueden variar considerablemente sin apartarse de los principios basicos de la invencion.

Claims (26)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un acido nucleico o vector de expresion para usar en el tratamiento o prevencion de una enfermedad que involucra el higado o para el tratamiento o prevencion de una afeccion que involucra el higado mediante la entrega de un acido nucleico o vector de expresion a una celula del higado en un animal en donde la entrega comprende:
    transfectar al menos una celula de la piel o del musculo en dicho animal con el acido nucleico o vector de expresion, en donde dicha transfeccion resulta en que dicho acido nucleico o vector de expresion se entrega a al menos una celula en el higado.
  2. 2.
    El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicha transfeccion de al menos una celula del musculo o al menos una celula de la piel resulta en dicho acido nucleico o vector de expresion que se encapsula mediante al menos una exovesicula de la celula del musculo
    o de la celula de la piel, y en donde al menos una de dicha exovesicula se entrega a al menos una celula en el higado.
  3. 3.
    El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde al menos una de dicha celula del musculo o de la piel se transfecta ex vivo con dicho acido nucleico o vector de expresion, y en donde dicha celula del musculo o de la piel transfectada se introduce en un animal en donde dicha introduccion resulta en dicho acido nucleico o vector de expresion que se entrega a al menos una celula de higado.
  4. 4.
    El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con la reivindicacion 2, en donde dicha transfeccion de al menos una celula del musculo o de al menos una celula de la piel resultando en dicho acido nucleico o vector de expresion que se encapsula mediante al menos una exovesicula se realiza in vitro o ex vivo, y en donde al menos una de dicha exovesicula se aisla y administra a un animal tal que dicho acido nucleico o vector de expresion se entrega a al menos una celula de higado.
  5. 5.
    El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde al menos una celula del musculo o al menos una celula de la piel se selecciona del grupo que consiste de las celulas en la capa dermica de la piel, las celulas en la capa subcutanea de la piel, miocitos, y mioblastos.
  6. 6.
    El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en donde el acido nucleico es acido ribonucleico (ARN) o un ARN modificado o el vector de expresion contiene un acido nucleico que codifica un ARN.
  7. 7.
    El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con la reivindicacion 6 en donde el ARN se selecciona del grupo que consiste de ARN antisentido, ARN micro (miARN), ARN mensajero (ARNm), ARNip, ARNhc, ARN modificado quimicamente, ARN de ribozima, ARNbc de horquilla, ARN micro que forma ARN triple, un ligando ARN de alta afinidad seleccionado artificialmente (aptomero) y ARNbc.
  8. 8.
    El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7, en donde una hebra de dicho ARNbc es sustancialmente complementaria a una region de un gen objetivo en el higado, y en donde la entrega de dicho ARNbc o dicho acido nucleico que codifica dicho ARNbc a la celula de higado inhibe
    o reduce la expresion de dicho gen objetivo.
  9. 9.
    El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con la reivindicacion 8, en donde dicha region se selecciona del grupo que consiste de una region transcrita del gen objetivo, una region promotora del gen, y una region del gen sin traducir corriente arriba o corriente abajo.
  10. 10.
    El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con las reivindicaciones 8 o 9, en donde dicho gen objetivo se selecciona del grupo que consiste de un gen patogeno, un gen viral, y un gen endogeno.
  11. 11.
    El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con la reivindicacion 10, en donde dicho gen viral es un gel viral de la Hepatitis seleccionado del grupo que consiste de Hepatitis A (HAV), Hepatitis B (HBV), Hepatitis C (HCV), Hepatitis D (HDV) y Hepatitis E (HEV).
  12. 12.
    El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con la reivindicacion 10, en donde dicho gen endogeno se selecciona del grupo que consiste de un gen de apolipoproteina (APOB), un gen pcsk 9, y un gen A1AT.
  13. 13.
    El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12 en donde el acido nucleico o vector de expresion se transfecta en las celulas del musculo o de la piel junto con un agente que facilita la transfeccion.
  14. 14.
    El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con la reivindicacion 13 en donde el agente que facilita la transfeccion es bupivacaina o la electroporacion.
  15. 15.
    El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde dichas celulas transfectadas expresan un ligando de superficie o transmembrana especifico para un receptor en la celula del higado.
  16. 16.
    El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con la reivindicacion 15, en donde un acido nucleico que expresa dicho ligando de superficie o transmembrana se co-transfecta con dicho acido nucleico o vector de expresion.
  17. 17.
    El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho acido nucleico es ARNbc que tiene de 15 a 50 pares de bases.
  18. 18.
    El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con la reivindicacion 17 en donde el ARNbc es un ARNhc, miARN o un ARNip.
  19. 19.
    El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en donde el animal es un mamifero.
  20. 20.
    El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con la reivindicacion 19 en donde el mamifero es un humano.
  21. 21.
    El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-20 en donde la enfermedad o afeccion de o que involucra el higado es:
    (a)
    una enfermedad viral del higado;
    (b)
    cancer del higado;
    (c)
    una enfermedad genetica del higado;
    (d)
    una afeccion que se puede modular dirigiendo un ARN o gen en el higado;o
    (e)
    terapia genica en el higado donde se sustituye un ARNm funcional.
  22. 22.
    El uso de un acido nucleico o vector de expresion en la fabricacion de un medicamento para entregar un acido nucleico o vector de expresion a una celula de higado en un animal en donde la entrega comprende:
    transfectar al menos una celula de la piel o del musculo en dicho animal con el acido nucleico o vector de expresion, en donde dicha transfeccion resulta en que dicho acido nucleico o vector de expresion se entrega a al menos una celula en el higado.
  23. 23.
    El uso del acido nucleico o vector de expresion de acuerdo con la reivindicacion 22, en donde el acido nucleico es el acido ribonucleico (ARN) o un ARN modificado o vector de expresion que contiene un acido nucleico que codifica un ARN.
  24. 24.
    El uso del acido nucleico o vector de expresion de acuerdo con la reivindicacion 23, en donde el ARN se selecciona del grupo que consiste de ARN antisentido, ARN micro (miARN), ARN mensajero (ARNm), ARNip, ARNhc, ARN modificado quimicamente, ARN de ribozima, ARNbc de horquilla, ARN micro que forma ARN triple, un ligando ARN de alta afinidad seleccionado artificialmente (aptomero) y ARNbc.
  25. 25.
    El uso del acido nucleico o vector de expresion de la reivindicacion 23 o 24, en donde una hebra de dicho ARNbc es sustancialmente complementaria a una region del gen objetivo en el higado, y en donde la entrega de dicho ARNbc o dicho acido nucleico que codifica dicho ARNbc a la celula del higado inhibe o reduce la expresion de dicho gen objetivo.
  26. 26.
    Uso de un acido nucleico o vector de expresion de la reivindicacion 25, en donde dicho gen objetivo se selecciona del grupo que consiste de un gen patogeno, un gen viral, y un gen endogeno.
    Figurd4 sChen�Cdifu� Metodo�ABI: �Nunlein �Anid�Resedrnh,�2005, 33s20�:e179�
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