ES2709495T3 - Modulación de la expresión del transductor de señales y activador de la transcripción 3 (stat3) - Google Patents

Abstract

Un compuesto monocatenario que comprende un oligonucleótido monocatenario modificado que consiste en 16 nucleósidos unidos que tienen una secuencia de nucleobase que consiste en la SEQ ID NO: 245, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el oligonucleótido modificado comprende: una extensión 5' que consiste en 3 nucleósidos unidos; una extensión 3' que consiste en 3 nucleósidos unidos; un hueco entre la extensión 5' y la extensión 3' que consiste en 2'-desoxinucleósidos unidos; en donde cada nucleósido de cada una de la extensión 5' y la extensión 3' comprende un nucleósido de etilo restringido; en donde cada unión internucleósido es una unión fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.

Description

DESCRIPCION

Modulacion de la expresion del transductor de senales y activador de la transcripcion 3 (STAT)

LISTADO DE SECUENCIAS

La presente solicitud se presenta junto con un Listado de Secuencias en formato electronico. El Listado de Secuencias se provee como un archivo con el nombre BIOL0142WOSEQ.txt creado el 29 de marzo, 2012, cuyo tamano es de 672 Kb.

CAMPO DE LA INVENCION

En determinadas formas de realizacion se proveen metodos, compuestos y composiciones para inhibir la expresion de ARNm y de protemas STAT3 en un animal. Dichos metodos, compuestos y composiciones son de utilidad para tratar, prevenir o aliviar enfermedades hiperproliferativas.

ANTECEDENTES

La familia de protemas STAT (transductores de senal y activadores de la transcripcion) son protemas de union a ADN que cumple una doble funcion en la transduccion de senal y la activacion de la transcripcion. Actualmente se conocen seis miembros distintos de la familia STAT (STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5 y STAT6) y varias isoformas (STATIa, STAT1p, STAT3 a y STAT3p). Las actividades de protemas STAT son moduladas por diversas citoquinas y estfmulos mitogenicos. La union de una citoquina a su receptor da como resultado la activacion de las protemas tirosina quinasas Janus (JAKs) asociadas con estos receptores. Esto fosforila a la protema STAT, lo cual conduce a la traslocacion en el nucleo y la activacion transcripcional de los genes que responden a STAT. La fosforilacion de un residuo tirosina espedfico en las STAT da como resultado su activacion, lo cual conduce a la formacion de homodfmeros y/o heterodfmeros de STAT que se unen a secuencias promotoras de genes espedficos. Los eventos mediados por citoquinas a traves de la activacion de STAT incluyen la proliferacion y la diferenciacion celular y la prevencion de la apoptosis.

La especificidad de la activacion de STAT se debe a citoquinas espedficas, es decir, cada STAT responde a una pequena cantidad de citoquinas espedficas. Tambien se ha encontrado que otras moleculas de senalizacion que no son citoquinas, tales como los factores de crecimiento, activan a las STAT. La union de estos factores a un receptor de la superficie celular asociado con una protema tirosina quinasa tambien da como resultado la fosforilacion de STAT.

Se ha encontrado que, en particular, la STAT3 (tambien denominada factor de respuesta de fase aguda (APRF)), responde a la interleuquina-6 (IL-6), asf como al factor de crecimiento epidermico (EGF) (Darnell, Jr., J.E., et al., Science, 1994, 264, 1415-1421). Ademas, se ha encontrado que la STAT3 cumple un rol importante en la transduccion de senales por interferones (Yang, C.-H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 5568-5572). Existe evidencia que sugiere que la STAT3 puede ser regulada por la vfa MAPK. ERK2 induce fosforilacion de la serina y tambien esta asociada con la STAT3 (Jain, N., et al., Oncogene, 1998, 17, 3157-3167).

STAT3 se expresa en la mayona de los tipos celulares (Zhong, Z., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 4806-4810). Induce la expresion de los genes relacionados con la respuesta a lesiones e inflamacion de los tejidos. Tambien se ha demostrado que STAT3 previene la apoptosis por la expresion de bcl-2 (Fukada, T., et al., Immunity, 1996, 5, 449-460).

Recientemente, se detecto STAT3 en las mitocondrias de celulas transformadas, y se demostro que facilita las actividades de fosforilacion glucolttica y oxidativa similares a las de las celulas cancerosas (Gough, D.J., et al., Science, 2009, 324, 1713-1716). La inhibicion de STAT3 en las mitocondrias perjudico la transformacion maligna por el Ras activado. Los datos confirman la existencia de una funcion de transformacion mediada por Ras para la STAT3 en las mitocondrias ademas de sus funciones nucleares.

La expresion aberrante o la expresion constitutiva de STAT3 esta asociada con numerosos procesos de enfermedad.

La Publicacion de Solicitud de Patente U.S. No. 2005/0196781 ensena pequenas moleculas de acido nucleico, tales como moleculas de ARNip de doble cadena, que modulan la expresion del gen STAT3. El documento WO 2005/083124 ensena oligonucleotidos antisentido que modulan el gen STAT3.

RESUMEN

En la presente se proveen metodos, compuestos y composiciones para modular la expresion de ARNm y protemas STAT3. En determinadas formas de realizacion, los compuestos que son de utilidad para modular la expresion de ARNm y protemas STAT3 son compuestos antisentido. En determinadas formas de realizacion, los compuestos antisentido son oligonucleotidos antisentido.

En determinadas formas de realizacion, la modulacion puede tener lugar en una celula o en un tejido. En determinadas formas de realizacion, la celula o el tejido es de un animal. En determinadas realizaciones, el animal es un ser humano. En determinadas formas de realizacion, se reducen los niveles de ARNm de STAT3. En determinadas formas de realizacion, se reducen los niveles de protema STAT3. Dicha reduccion se puede producir de una manera dependiente del tiempo o de una manera dependiente de la dosis.

Tambien se proveen metodos, compuestos y composiciones de utilidad para prevenir, tratar y aliviar enfermedades, trastornos y condiciones. En determinadas formas de realizacion, dichas enfermedades, trastornos y condiciones son enfermedades, trastornos y condiciones hiperproliferativas. En determinadas formas de realizacion dichas enfermedades, trastornos y condiciones hiperproliferativas incluyen cancer, asf como formas malignas asociadas y metastasis. En determinadas formas de realizacion, dichos canceres incluyen cancer de pulmon, incluyendo cancer de pulmon de celulas no pequenas (NSCLC), cancer de pancreas, cancer colorrectal, mieloma multiple, carcinoma hepatocelular (HCC), glioblastoma, cancer de ovario, osteosarcoma, cancer de cabeza y cuello, cancer de mama, carcinomas epidermoides, adenomas intestinales, cancer de prostata y cancer gastrico.

Dichas enfermedades, trastornos y condiciones pueden tener uno o mas factores de riesgo, causas o resultados en comun. Algunos factores de riesgo y causas del desarrollo de una enfermedad hiperproliferativa incluyen el envejecimiento; el uso de tabaco; la exposicion a la luz solar y a la radiacion ionizante; el contacto con determinadas sustancias qmmicas; la infeccion con determinados virus y bacterias; determinadas terapias hormonales; antecedentes familiares de cancer; uso de alcohol; y determinadas elecciones de estilo de vida incluyendo una dieta pobre, falta de actividad ffsica y/o el sobrepeso. Algunos de los smtomas y los resultados asociados con el desarrollo de una enfermedad hiperproliferativa incluyen un engrosamiento o bulto en la mama o en cualquier otra parte del cuerpo; un lunar nuevo o un cambio en un lunar existente; una llaga que no se cura; ronquera o una tos que persiste; cambios en los habitos intestinales o de vejiga; malestar despues de comer; dificultad para tratar; aumento o perdida de peso sin explicacion; sangrado o descarga inusual; fatiga; metastasis de uno o mas tumores por todo el cuerpo; complicaciones cardiovasculares, incluyendo, paro cardfaco y accidente cerebrovascular; y muerte.

En determinadas formas de realizacion, los metodos de tratamiento incluyen administrar un compuesto antisentido STAT3 a un individuo que lo necesita. En determinadas formas de realizacion, los metodos de tratamiento incluyen administrar un Oligonucleotido antisentido STAT3 a un individuo que lo necesita.

DESCRIPCION DETALLADA

Se debe tener en cuenta que tanto la descripcion general anterior como la siguiente descripcion detallada solamente se ofrecen a modo de ejemplo y a efectos de una mayor explicacion y no restringe la invencion reivindicada. En la presente, el uso del singular incluye al plural a menos que espedficamente se determine de otra manera. Segun se usa en la presente, el uso de “o" significa “y/o” a menos que se defina de otra manera. Aun mas, el uso del termino “incluyendo", asf como otras formas, tales como “incluye" e “incluido", no es limitativo. Ademas, los terminos tales como “elemento" o “componente" abarcan los elementos y los componentes que constituyen una unidad, y los elementos y los componentes que comprenden mas de una subunidad, a menos que se indique espedficamente lo contrario.

Los encabezados de seccion utilizados en la presente solamente sirven a efectos de una mejor organizacion y no deben considerarse como limitativos del objeto descrito.

DEFINICIONES

A menos que se proporcionen definiciones espedficas, la nomenclatura relativa utilizada y los procedimientos y las tecnicas de laboratorio, qmmica analftica, qmmica organica de smtesis y qmmica medicinal y farmaceutica descritos en la presente son bien conocidos y de uso comun en el arte. Se pueden emplear tecnicas estandar para las smtesis qmmicas y los analisis qmmicos.

A menos que se indique de otra manera, los siguientes terminos tienen el significado que se indica a continuacion:

Un “2'-desoxinucleosido" se refiere a un nucleosido que comprende un grupo de azucar furanosilo 2'-H, como en los desoxirribonucleosidos (ADN) naturales. En determinadas formas de realizacion, un 2'-desoxinucleosido puede comprender una nucleobase modificada o puede comprender una nucleobase de ARN (por ejemplo, uracilo).

Un “2'-O-metoxietilo" (tambien denominado 2'-MOE y 2'-O(CH2)2-OCH3) se refiere a una modificacion O-metoxietilo de la posicion 2' de un anillo furosilo. Un azucar modificado 2'-O-metoxietilo es un azucar modificado.

Un “nucleosido 2'-MOE" (tambien denominado 2'-O-metoxinucleosido de etilo) se refiere a un nucleosido que comprende un grupo de azucar modificado 2'-MOE.

Un “nucleosido 2'-sustituido" se refiere a un nucleosido que comprende un sustituyente en la posicion 2' distinto de H u OH. A menos que se indique de otra manera, un nucleosido 2'-sustituido no es un nucleosido bidclico. Una “5-metilcitosina” se refiere a una citosina modificada con un grupo metilo unido en la posicion 5'. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.

“Aproximadamente” significa dentro de ±10% de un valor. Por ejemplo, si se establece que “los compuestos produjeron por lo menos un 70% aproximadamente de inhibicion de STAT3”, implica que los niveles de STAT3 son inhibidos en un rango de entre un 63% y un 77%.

Un “agente farmaceutico activo” se refiere a la sustancia o sustancias presentes en una composicion farmaceutica que proveen un beneficio terapeutico cuando se administran a un individuo. Por ejemplo, en determinadas formas de realizacion un oligonucleotido antisentido dirigido a STAT3 es un agente farmaceutico activo.

Una “region blanco activa” o una “region blanco” se refiere a la region a la cual seran dirigidos uno o mas compuestos antisentido activos. Los “compuestos antisentido activos” se refieren a los compuestos antisentido que reducen los niveles de acido nucleico blanco o los niveles de protema blanco.

“Administrado de manera concomitante” se refiere a la co-administracion de dos agentes de cualquier manera que permita que se manifiesten los efectos farmacologicos de ambos en el paciente al mismo tiempo. La administracion concomitante no requiere que ambos agentes sean administrados en una sola composicion farmaceutica, en la misma forma de dosificacion o por la misma ruta de administracion. No es necesario que ambos agentes manifiesten sus efectos al mismo tiempo. Los efectos solamente deben solaparse por un penodo de tiempo y no es necesario que sean co-extensivos.

La “administracion” se refiere a suministrar un agente farmaceutico a un individuo, e incluye, pero en un sentido no taxativo, una administracion realizada por un profesional medico y una auto-administracion.

Una “mejora” se refiere a la disminucion de por lo menos un indicador, signo o smtoma de una enfermedad, trastorno o condicion asociada. La severidad de los indicadores se puede determinar mediante medidas subjetivas u objetivas, que son conocidas por los especialistas en el arte.

Un “animal” se refiere a un animal humano o no humano, incluyendo, pero en un sentido no taxativo, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, incluyendo, pero en un sentido no taxativo, monos y chimpances.

Un “anticuerpo” se refiere a una molecula caracterizada porque reacciona de alguna manera espedfica con un antfgeno, donde el anticuerpo y el antfgeno se definen el uno en terminos del otro. Un anticuerpo puede hacer referencia a una molecula de anticuerpo completa o a cualquier fragmento o region de la misma, tal como la cadena pesada, la cadena liviana, una region Fab y una region Fc.

La “actividad antisentido” se refiere a cualquier actividad detectable o mensurable que puede ser atribuible a la hibridacion de un compuesto antisentido con su acido nucleico blanco. En determinadas formas de realizacion, la actividad antisentido es una disminucion en la cantidad o la expresion de un acido nucleico blanco o de una protema codificada por dicho acido nucleico blanco.

Un “compuesto antisentido” se refiere a un compuesto oligomerico capaz de hibridizarse con un acido nucleico blanco por puentes hidrogeno. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos de cadena simple y de cadena doble, tales como, oligonucleotidos antisentido, ARNsi, ARNsh, ARNsno, ARNmi y repeticiones de satelites.

Una “inhibicion antisentido” se refiere a la reduccion de los niveles de acido nucleico blanco o de los niveles de protema blanco en la presencia de un compuesto antisentido complementario del acido nucleico blanco en comparacion con los niveles del acido nucleico blanco o los niveles de la protema blanco en la ausencia del compuesto antisentido.

Un “oligonucleotido antisentido” se refiere a un oligonucleotido de cadena simple que tiene una secuencia de nucleobases que permite la hibridacion con una correspondiente region o segmento de un acido nucleico blanco. Un “azucar bidclico” se refiere a un anillo furosilo modificado por formacion de un puente de dos atomos. Un azucar bidclico es un azucar modificado.

Un “nucleosido bidclico” (tambien denominado BNA) se refiere a un nucleosido que tiene un grupo de azucar que comprende un puente que une a dos atomos de carbono del anillo de azucar, formando de esa manera un sistema de anillos bidclico. En determinadas formas de realizacion, el puente une el carbono 4' y el carbono 2' del anillo de azucar.

La “estructura protectora” o el “grupo protector terminal” se refiere a modificaciones qmmicas que se han incorporado a cualquiera de los extremos de un compuesto antisentido.

Un “cEt” o “etilo restringido” se refiere a un nucleosido bidclico que tiene un grupo de azucar que comprende un puente que une al carbono 4’ y el carbono 2', donde dicho puente presenta la formula: 4’-CH(cH³)-O-2’.

Un “nucleosido de etilo restringido” (tambien denominado nucleosido cEt) se refiere a un nucleosido que comprende un grupo de azucar bidclico que comprende un puente 4’-CH(CH³)-O-2’.

Una “region qmmicamente distinta” se refiere a una region de un compuesto antisentido que de alguna manera es qmmicamente diferente de otra region del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una region que contiene nucleotidos 2’-O-metoxietilo es qmmicamente distinta de una region que contiene nucleotidos sin las modificaciones 2’-O-metoxietilo.

Un “compuesto antisentido quimerico” se refiere a un compuesto antisentido que presenta por lo menos dos regiones qmmicamente distintas.

Una “co-administracion” se refiere a la administracion de dos o mas agentes farmaceuticos a un individuo. Dichos dos o mas agentes farmaceuticos se pueden encontrar en una sola composicion farmaceutica o en composiciones farmaceuticas separadas. Cada uno de dichos dos o mas agentes farmaceuticos se puede administrar por la misma ruta de administracion o por rutas o diferentes. La co-administracion abarca una administracion paralela o sucesiva.

La “complementariedad” se refiere a la capacidad de apareamiento entre nucleobases de un primer acido nucleico y un segundo acido nucleico.

Las “nucleobases contiguas” se refieren a las nucleobases que son inmediatamente adyacentes entre sf.

Un “diluyente” se refiere a un ingrediente en una composicion que carece de actividad farmacologica, pero que resulta farmaceuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, el diluyente en una composicion inyectable puede ser un lfquido, por ejemplo una solucion salina.

Una “dosis” se refiere a una cantidad especificada de un agente farmaceutico suministrada en una sola administracion o en penodo de tiempo espedfico. En determinadas formas de realizacion, la dosis se puede administrar en uno, dos, o mas bolos, tabletas o inyecciones. Por ejemplo, en determinadas formas de realizacion donde se desea una administracion subcutanea, la dosis deseada requiere un volumen que no se consigue facilmente con una sola inyeccion, por ello, se pueden emplear dos o mas inyecciones para alcanzar la dosis deseada. En determinadas formas de realizacion, el agente farmaceutico se administra por infusion sobre un penodo de tiempo extendido o de manera continua. Las dosis se pueden establecer como la cantidad de agente farmaceutico por hora, dfa, semana o mes.

Una “cantidad eficaz” se refiere a la cantidad de agente farmaceutico activo que es suficiente para lograr un resultado fisiologico deseado en un individuo que necesita del agente. La cantidad eficaz puede variar entre individuos dependiendo de la salud y condicion ffsica del individuo que sera tratado, del grupo taxonomico de los individuos que seran tratados, de la formulacion de la composicion, de la evaluacion de la condicion medica del individuo y otros factores relevantes.

“Completamente complementario” o “100% complementario” se refiere a que cada nucleobase de un primer acido nucleico tiene una nucleobase complementaria en un segundo acido nucleico. En determinadas formas de realizacion, el primer acido nucleico es un compuesto antisentido y el acido nucleico blanco es un segundo acido nucleico.

Un “gapmero” se refiere a un compuesto antisentido quimerico en el cual hay una region interna que tiene una pluralidad de nucleosidos que soportan el clivaje con la RNasa H ubicada entre regiones externas que tienen uno o mas nucleosidos, en donde los nucleosidos que comprenden a la region interna son qmmicamente distintos del nucleosido o de los nucleosidos que comprenden a las regiones externas. La region interna se denomina “hueco [gap]” y las regiones externas se denominan “extensiones [wings]’.

El termino “de hueco ampliado [gap-widened]’ se refiere a un compuesto antisentido quimerico que tiene un segmento hueco de 12 o mas 2’-desoxirribonucleosidos contiguos ubicados entre y de manea inmediatamente adyacente a segmentos de extension 5’ y 3’ que tienen entre uno y seis nucleosidos.

La “hibridacion” se refiere al apareamiento de moleculas de acido nucleico complementarias. En determinadas formas de realizacion, las moleculas de acido nucleico complementarias incluyen un compuesto antisentido y un acido nucleico blanco.

Una “enfermedad hiperproliferativa” se refiere a una enfermedad caracterizada por un crecimiento y una reproduccion rapida o excesiva de celulas. Los ejemplos de enfermedades hiperproliferativas incluyen cancer, por ejemplo, carcinomas, sarcomas, linfomas y leucemias, asf como metastasis y formas malignas asociadas.

La “identificacion de un animal con riesgo de sufrir una enfermedad hiperproliferativa” se refiere a la identificacion de un animal que ha sido diagnosticado con una enfermedad hiperproliferativa o a la identificacion de un animal que tiene predisposicion para desarrollar una enfermedad hiperproliferativa. Los individuos con predisposicion para desarrollar una enfermedad hiperproliferativa incluyen aquellos que tienen uno o mas factores de riesgo para dicha enfermedad hiperproliferativa incluyendo edad avanzada; antecedente de otras enfermedades hiperproliferativas; antecedente de tabaquismo; antecedente de exposicion a la luz solar y/o a la radiacion ionizante; contacto previo con determinados sustancias qmmicas, en especial un contacto continuo; infeccion previa o actual con determinados virus y bacterias; uso previo o actual de determinadas terapias hormonales; predisposicion genetica; uso de alcohol; y determinadas elecciones de estilo de vida incluyendo una dieta pobre, falta de actividad ffsica y/o sobrepeso. Dicha identificacion puede realizarse mediante cualquier metodo incluyendo la evaluacion de la historia medica de un individuo y pruebas o evaluaciones clmicas estandar.

“Inmediatamente adyacente” se refiere a que no hay elementos intervinientes entre elementos inmediatamente adyacentes.

La “inhibicion de STAT3” se refiere a una reduccion en la expresion de los niveles de ARNm y/o de protema STAT3 en la presencia de un compuesto antisentido de STAT3, incluyendo un oligonucleotido antisentido de STAT3, en comparacion con la expresion de niveles de ARNm y/o de protema STAT3 en la ausencia de un compuesto antisentido STAT3, tal como un oligonucleotido antisentido.

Un “individuo” se refiere a un animal humano o no humano seleccionado para un tratamiento o una terapia.

Un “enlace internucleosfdico” se refiere a la union qmmica entre nucleosidos.

Los “nucleosidos unidos” se refieren a nucleosidos adyacentes que estan unidos entre sf.

Una “coincidencia erronea” o una “nucleobase no complementaria” se refiere al caso cuando la nucleobase de un primer acido nucleico no se puede aparear con la correspondiente nucleobase de un segundo acido nucleico o acido nucleico blanco.

Un “enlace internucleosfdico modificado” se refiere a la sustitucion o a cualquier cambio con respecto a un enlace internucleosido natural (es decir un enlace internucleosido fosfodiester).

Una “nucleobase modificada” se refiere a cualquier nucleobase distinta de adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una “nucleobase no modificada” se refiere a las bases de purina, adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina, timina (T), citosina (C) y uracilo (U).

Un “nucleotido modificado” se refiere a un nucleotido que presenta, de manera independiente, un grupo de azucar modificado, un enlace internucleosfdico modificado o una nucleobase modificada. Un “nucleosido modificado” se refiere a un nucleosido que presenta, de manera independiente, un grupo de azucar modificado o una nucleobase modificada.

Un “oligonucleotido modificado” se refiere a un oligonucleotido que comprende un enlace internucleosfdico modificado, un azucar modificado y/o una nucleobase modificada.

Un “azucar modificado” se refiere a una sustitucion o un cambio con respecto al azucar natural.

Un “motivo” se refiere al patron de regiones qmmicamente distintas en un compuesto antisentido.

Un “enlace internucleosfdico natural” se refiere a un enlace fosfodiester 3' a 5'.

Un “grupo de azucar natural” se refiere a un azucar presente en el ADN (2'-H) o en el ARN (2'-OH).

Un “acido nucleico” se refiere a moleculas compuestas por nucleotidos monomericos. Un acido nucleico incluye acidos ribonucleicos (ARN), acidos desoxirribonucleicos (ADN), acidos nucleicos de cadena simple, acidos nucleicos de cadena doble, acidos ribonucleicos de interferencia pequenos (ARNsi) y microARN (ARNmi).

Una “nucleobase” se refiere a un grupo heterodclico capaz de aparearse con una base de otro acido nucleico. Una “secuencia de nucleobases” se refiere al orden de nucleobases contiguas independiente de cualquier modificacion del azucar, del enlace o de la nucleobase.

Un “nucleosido” se refiere a una nucleobase unida a un azucar.

Un "nucleosido mimetico" incluye aquellas estructuras usadas para reemplazar al azucar o bien al azucar y a la base y no necesariamente al enlace en una o mas posiciones de un compuesto oligomerico tal como, por ejemplo, nucleosido mimeticos que contienen mimeticos del azucar de morfolino, ciclohexenilo, ciclohexilo, tetrahidropiranilo, biciclo o triciclo, por ejemplo, unidades de azucares no furanosa. Un nucleotido mimetico incluye aquellas estructuras usadas para reemplazar el nucleosido y el enlace en una o mas posiciones de un compuesto oligomerico tal como por ejemplo acidos nucleicos peptfdicos o morfolinos (morfolinos unidos por -N(H)-C(=O)-O- u otro enlace no fosfodiester). Un sustito de azucar se superpone con el termino ligeramente mas amplio, nucleosido mimetico, pero pretende indicar el reemplazo de la unidad de azucar (anillo furanosa) solamente. Los anillos tetrahidropiranilo provistos en la presente son ilustrativos de ejemplos de sustitutos del azucar en donde el grupo de azucar furanosa ha sido reemplazado por un sistema de anillos de tetrahidropiranilo. Un “nucleotido” se refiere a un nucleosido que tiene un grupo fosfato unido de manera covalente a la porcion de azucar del nucleosido.

Un “efecto fuera del blanco” se refiere a un efecto biologico indeseado o perjudicial asociado con la modulacion de la expresion de ARN o de protema de un gen distinto del acido nucleico blanco pretendido.

Un “compuesto oligomerico” u “oligomero” se refiere a un polfmero de subunidades monomericas unidas que tiene la capacidad para hibridizarse con por lo menos una region de una molecula de acido nucleico.

Un “oligonucleotido” se refiere a un polfmero de nucleosidos unidos cada uno de los cuales puede estar modificado o no modificado, de manera independiente entre sf.

Una “administracion parenteral” se refiere a una administracion por inyeccion (por ejemplo, inyeccion de bolo) o por infusion. La administracion parenteral incluye una administracion subcutanea, una administracion intravenosa, una administracion intramuscular, una administracion intraarterial, una administracion intraperitoneal o una administracion intracraneal, por ejemplo, una administracion intratecal o intracerebroventricular.

Un “peptido” se refiere a una molecula formada por union de al menos dos aminoacidos por medio de enlaces amida. Un peptido se refiere a polipeptidos y protemas.

Una “composicion farmaceutica” se refiere a una mezcla de sustancias adecuadas para su administracion a un individuo. Por ejemplo, una composicion farmaceutica puede comprender uno o mas agentes farmaceuticos activos y una solucion acuosa esteril. En determinadas formas de realizacion, la composicion farmaceutica tiene actividad en un ensayo de captacion libre en determinadas lmeas celulares.

Un “derivado farmaceuticamente aceptable” abarca sales, conjugados, prodrogas o isomeros farmaceuticamente aceptables de los compuestos que se describen en la presente.

Las “sales farmaceuticamente aceptables” se refieren a sales fisiologicamente y farmaceuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biologica deseada del oligonucleotido parental y que no imparten efectos toxicologicos indeseados al mismo.

Un “enlace fosforotioato” se refiere a un enlace entre nucleosidos donde el enlace fosfodiester esta modificado por reemplazo de uno de los atomos de oxfgeno que no forman puente con un atomo de azufre. Un enlace fosforotioato (P=S) es un enlace internucleosfdico modificado.

Una “porcion” se refiere a un numero definido de nucleobases contiguos (es decir, unidos) de un acido nucleico. En determinadas formas de realizacion, una porcion es un numero definido de nucleobases contiguas de un acido nucleico blanco. En determinadas formas de realizacion, una porcion es un numero definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.

El termino “prevenir” se refiere a demorar o anticipar el comienzo o desarrollo de una enfermedad, trastorno o condicion por un penodo de tiempo desde minutos hasta indefinidamente. Prevenir tambien se refiere a reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o condicion.

Una “prodroga” se refiere a un terapeutico agente que se prepara en una forma inactiva que es convertida en una forma activa dentro del cuerpo o de celulas del mismo por la accion de enzimas endogenas u otras sustancias qmmicas o condiciones.

Los “efectos secundarios” se refieren a respuestas fisiologicas atribuibles a un tratamiento que son distintas de los efectos deseados. En determinadas formas de realizacion, los efectos secundarios incluyen reacciones en el sitio de inyeccion, anomalfas en pruebas de la funcion hepatica, anomalfas en la funcion renal, toxicidad hepatica, toxicidad renal, anomalfas del sistema nervioso central, miopatfas y malestar. Por ejemplo, los niveles incrementados de aminotransferasa en suero pueden indicar toxicidad hepatica o una anomalfa en la funcion hepatica. Por ejemplo, los niveles incrementados de bilirrubina en suero pueden indicar toxicidad hepatica o una anomalfa en la funcion hepatica.

Un “acido nucleico del transductor de senales y activador de la transcripcion 3” o “acido nucleico STAT3” se refiere a cualquier acido nucleico que codifica STAT3. Por ejemplo, en determinadas formas de realizacion, un acido nucleico STAT3 incluye una secuencia de ADN que codifica STAT3, una secuencia de ARN transcrita a partir de un ADN que codifica STAT3 (incluyendo ADN genomico que comprende intrones y exones) y una secuencia de ARNm que codifica STAT3. Un “ARNm STAT3” se refiere a un ARNm que codifica una protema STAT3.

Un “oligonucleotido de cadena simple” se refiere a un oligonucleotido que no se hibridiza con una cadena complementaria.

El termino “que se hibridiza espedficamente” se refiere a un compuesto antisentido que presenta un grado de complementariedad suficiente entre un oligonucleotido antisentido y un acido nucleico blanco como para inducir un efecto deseado, al mismo tiempo que exhibe un efecto mmimo o ningun efecto sobre los acidos nucleicos que no son blancos bajo las condiciones a las cuales se desea una union espedfica, es decir, bajo condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapeuticos.

Los terminos “buscar como blanco” o “buscado como blanco” se refiere al proceso de diseno y seleccion de un compuesto antisentido que se hibridizara espedficamente con un acido nucleico blanco e inducira un efecto deseado.

Un “acido nucleico blanco”, un “ARN blanco”, un “ARNm blanco” y un “transcripto de ARN blanco” se refieren todos a un acido nucleico capaz de ser buscado como blanco por compuestos antisentido.

Un “segmento blanco” se refiere a la secuencia de nucleotidos de un acido nucleico blanco que un compuesto antisentido buscara como blanco. Un “sitio blanco 5'” se refiere al nucleotido mas 5' de un segmento blanco. Un “sitio blanco 3'” se refiere al nucleotido mas 3' de un segmento blanco.

Una “cantidad terapeuticamente eficaz” se refiere a la cantidad de un agente farmaceutico que provee un beneficio terapeutico a un individuo.

“Tratar” se refiere a la administracion de una composicion farmaceutica para efectuar una alteracion o mejora de una enfermedad, trastorno o condicion.

Un “nucleotido no modificado” se refiere a un nucleotido compuesto por nucleobases, grupos de azucar y enlaces internucleosfdicos naturales. En determinadas formas de realizacion, un nucleotido no modificado es un nucleotido de ARN (es decir, p-D-ribonucleosidos) o un nucleotido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonucleosidos).

ALGUNAS FORMAS DE REALIZACION

En determinadas formas de realizacion se proveen metodos, compuestos, y composiciones para inhibir la expresion del ARNm o de la protema STAT3.

En determinadas formas de realizacion se proveen metodos para prevenir el crecimiento tumoral y el volumen del tumor. En determinadas formas de realizacion se proveen metodos para reducir el crecimiento tumoral y el volumen del tumor.

En determinadas formas de realizacion se proveen metodos, compuestos y composiciones para el tratamiento, la prevencion o el alivio de enfermedades, trastornos y condiciones asociadas con STAT3 en un individuo que lo necesita. Tambien se contemplan metodos y compuestos para la preparacion de un medicamento para el tratamiento, la prevencion o el alivio de una enfermedad, trastorno o condicion asociada con STAT3. Las enfermedades, los trastornos y las condiciones asociadas con STAT3 incluyen enfermedades hiperproliferativas, por ejemplo, cancer, carcinomas, sarcomas, linfomas y leucemias, asf como metastasis y formas malignas asociadas.

En determinadas formas de realizacion, se proveen compuestos antisentido STAT3 para su uso en el tratamiento, la prevencion o el alivio de una enfermedad asociada con STAT3. En determinadas formas de realizacion, los compuestos antisentido STAT3 son oligonucleotidos antisentido STAT3, capaces de inhibir la expresion de ARNm STAT3 y/o protema STAT3 en una celula, un tejido o un animal.

En determinadas formas de realizacion, se provee un compuesto antisentido STAT3 descrito en la presente para su uso en el tratamiento o la prevencion de cancer de pulmon, incluyendo cancer de pulmon de celulas no pequenas (NSCLC), cancer de pancreas, cancer colorrectal, mieloma multiple, carcinoma hepatocelular (HCC), glioblastoma, cancer de ovario, osteosarcoma, cancer de cabeza y cuello, cancer de mama, carcinomas epidermoides, adenomas intestinales, cancer de prostata y cancer gastrico.

En determinadas formas de realizacion se provee un compuesto antisentido STAT3 descrito en la presente para su uso en el tratamiento o la prevencion de metastasis de un cancer.

En determinadas formas de realizacion se provee un compuesto antisentido STAT3, descrito en la presente, para su uso en el tratamiento, la prevencion o el alivio de enfermedades hiperproliferativas, por ejemplo, cancer, carcinomas, sarcomas, linfomas y leucemias, asf como metastasis y formas malignas asociadas.

En la presente se revelan compuestos antisentido que buscan como blanco a un acido nucleico STAT3. Segun se revela en la presente, el acido nucleico STAT3 es cualquiera de las secuencias descritas en GENBANK, Acceso N° NM_139276.2 (incorporado en la presente como la SEQ ID N° 1) o el complemento de GENBANK, Acceso N° NT_010755.14 truncado entre los nucleotidos 4185000 y 4264000 (incorporado en la presente como la SEQ ID N°: 2).

En la presente se revelan compuestos que comprenden un oligonucleotido modificado que consiste en entre 12 y 30 nucleosidos unidos y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende una porcion de al menos l2 nucleobases contiguas complementarias de una porcion de SEQ ID N° 1 con una longitud identica que abarca las nucleobases 3016-3031, por lo que dicha secuencia de nucleobases efectivamente es complementaria de SEQ ID N° 1.

En determinadas formas de realizacion, se provee un compuesto monocatenario que comprende un oligonucleotido monocatenario modificado que consiste en 16 nucleosidos unidos que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la SEQ ID NO: 245, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en donde el oligonucleotido modificado comprende:

una extension 5' que consiste en 3 nucleosidos unidos;

una extension 3' que consiste en 3 nucleosidos unidos;

un hueco entre la una extension 5' y la extension 3' que consiste en 102'-desoxinucleosidos unidos; en donde cada nucleosido de cada una de la extension 5' y la extension 3' comprende un nucleosido de etilo restringido; en donde cada union internucleosido es una union fosforotioato; y

en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.

En determinadas formas de realizacion, la secuencia de nucleobases del oligonucleotido modificado consiste en la secuencia que se representa en SEQ ID N° 245.

Segun se revela en la presente, el oligonucleotido modificado es 100% complementario de SEQ ID N° 1 o 2. En determinadas formas de realizacion, el oligonucleotido modificado consiste en un oligonucleotido modificado de cadena simple.

En determinadas formas de realizacion, el oligonucleotido modificado comprende al menos un enlace modificado entre los nucleosidos.

En determinadas formas de realizacion, los enlaces entre todos los nucleosidos son enlaces de fosforotioato. En determinadas formas de realizacion, al menos un nucleosido comprende un azucar modificado.

En determinadas formas de realizacion, al menos uno de los azucares modificados es un azucar bidclico.

En determinadas formas de realizacion, el azucar bidclico comprende un enlace 4'-CH²-O-2'.

En determinadas formas de realizacion, el azucar bidclico comprende un enlace 4'-CH(CH³)-O-2'.

En determinadas formas de realizacion, el azucar modificado comprende un grupo 2'-O(CH²)²-OCH³.

En determinadas formas de realizacion, el azucar modificado comprende un grupo 2'-O-CH³.

En determinadas formas de realizacion, al menos uno de los nucleosidos del oligonucleotido modificado comprende una nucleobase modificada.

En determinadas formas de realizacion, la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.

En determinadas formas de realizacion, el oligonucleotido modificado comprende

una saliente en el extremo 5' que consiste en 3 nucleosidos unidos;

una saliente en el extremo 3' que consiste en 3 nucleosidos unidos;

una porcion entre la saliente en el extremo 5' y la saliente en el extremo 3' que consiste en 10 2'-deosxinucleosidos unidos;

donde todos los nucleosidos de la saliente en el extremo 5' y de la saliente en el extremo 3' comprenden etil nucleosidos restringidos;

donde los enlaces entre todos los nucleosidos son enlaces de fosforotioato; y

donde todas las citosinas son 5-metilcitosinas.

En la presente se revelan metodos para tratar una enfermedad hiperproliferativa en un animal que lo necesita, que comprenden administrarle al animal un compuesto que comprende un oligonucleotido modificado que consiste en entre 12 y 30 nucleosidos unidos y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 12 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases que se detallan en SEQ ID N° 9-426, 430-442, 445-464, 471-498, 500-1034, 1036-1512 o 1541-2757.

En determinadas formas de realizacion, se proveen metodos para tratar una enfermedad hiperproliferativa en un animal que lo necesita, que comprenden administrate al animal un compuesto que comprende un oligonucleotido modificado que consiste en entre 12 y 30 nucleosidos unidos y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 12 nucleobases contiguas de SEQ ID N° 245.

En determinadas formas de realizacion, la administracion es util para disminuir el tamano de los tumores en el animal.

En determinadas formas de realizacion, la administracion es util para disminuir el volumen de los tumores en el animal.

En determinadas formas de realizacion, la administracion es util para prevenir las metastasis en el animal. En determinadas formas de realizacion, la administracion es util para prolongar la supervivencia del animal. En determinadas formas de realizacion, la administracion es util para disminuir la caquexia en el animal. Determinadas formas de realizacion proveen un compuesto monocatenario que comprende un oligonucleotido monocatenario modificado que consiste en 16 nucleosidos unidos que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la SEQ ID NO: 245, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en donde el oligonucleotido modificado comprende:

una extension 5' que consiste en 3 nucleosidos unidos;

una extension 3' que consiste en 3 nucleosidos unidos;

un hueco entre la extension 5' y la extension 3' que consiste en 102'-desoxinucleosidos unidos;

en donde cada nucleosido de cada una de la extension 5' y la extension 3' comprende un nucleosido de etilo restringido; en donde cada union internucleosido es una union fosforotioato; y

en donde cada citosina es una 5-metilcitosina para uso en un metodo para tratar una enfermedad hiperproliferativa en un animal.

COMPUESTOS ANTISENTIDO

Los compuestos oligomericos incluyen, pero en un sentido no taxativo, oligonucleotidos, oligonucleosidos, analogos de oligonucleotidos, oligonucleotido mimeticos, compuestos antisentido, oligonucleotidos antisentido y ARNsi. Un compuesto oligomerico puede ser “antisentido” para un acido nucleico blanco, lo cual significa que tiene la capacidad para hibridizarse con un acido nucleico blanco por medio de puentes de hidrogeno.

En determinadas formas de realizacion, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la direccion 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento blanco del acido nucleico blanco que busca como blanco. En algunas de dichas formas de realizacion, un oligonucleotido antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la direccion 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento blanco del acido nucleico blanco que busca como blanco.

En la presente se revela un compuesto antisentido dirigido a un acido nucleico STAT3 que tiene una longitud de 12 a 30 subunidades. En la presente se revela un compuesto antisentido dirigido a un acido nucleico STAT3 que tiene una longitud de 14 a 30 subunidades. En la presente se revela un compuesto antisentido dirigido a un acido nucleico STAT3 que tiene una longitud de 12 a 22 subunidades. En otras palabras, tales compuestos antisentido son de 12 a 30 subunidades unidas, 14 a 30 subunidades unidas, o 12 a 22 subunidades unidas, respectivamente. En la presente se revela el compuesto antisentido de que es de 8 a 80, de 12 a 50, de 13 a 30, de 13 a 50, de 14 a 30, de 14 a 50, de 15 a 30, de 15 a 50, de 16 a 30, de 16 a 50, de 17 a 30 , 17 a 50, 18 a 22, 18 a 24, 18 a 30, 18 a 50, 19 a 22, 19 a 30, 19 a 50, o 20 a 30 subunidades unidas. En la presente se revelan los compuestos antisentido que son de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, o 80 subunidades unidas en longitud, o un rango definido por cualquiera de dos valores anteriores. En la presente se revela el compuesto antisentido que es un oligonucleotido antisentido, y las subunidades unidas son nucleotidos.

En determinadas formas de realizacion, los oligonucleotidos antisentido dirigidos a un acido nucleico STAT3 pueden ser mas cortos o pueden estar truncados. Por ejemplo, se puede eliminar una sola subunidad del extremo 5' (truncamiento 5') o, como alternativa, del extremo 3' (truncamiento 3'). A un compuesto antisentido mas corto o truncado dirigido a un acido nucleico STAT3 se le puede eliminar dos subunidades del extremo 5' o, como alternativa, se le puede eliminar dos subunidades del extremo 3', del compuesto antisentido. Como alternativa, los nucleosidos eliminados pueden estar dispersos por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido con un nucleosido eliminado del extremo 5' y un nucleosido eliminado del extremo 3'. Cuando hay una sola subunidad adicional en un compuesto antisentido alargado, la subunidad adicional se puede ubicar por el extremo 5' o el extremo 3' del compuesto antisentido. Cuando hay dos o mas subunidades adicionales, dichas subunidades agregadas pueden ser adyacentes entre sf, por ejemplo, en un compuesto antisentido al que se le agregaron dos subunidades por el extremo 5' (adicion 5') o, como alternativa, por el extremo 3' (adicion 3'), del compuesto antisentido. Como alternativa, las subunidades agregadas pueden estar dispersas por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido con una subunidad agregada al extremo 5' y una subunidad agregada al extremo 3'.

Se puede aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, tal como un oligonucleotido antisentido, y/o se pueden introducir bases de coincidencia erronea sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7305-7309, 1992), se evaluo una serie de oligonucleotidos antisentido de 13-25 nucleobases de longitud por su capacidad para inducir el clivaje de un ARN blanco en un modelo de inyeccion de oocitos. Los oligonucleotidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases de coincidencia erronea cerca de los extremos de los oligonucleotidos antisentido pudieron dirigir un clivaje espedfico del ARNm blanco, si bien en menor grado que los oligonucleotidos antisentido que no conteman coincidencias erroneas. De manera similar, se logro un clivaje espedfico del blanco usando oligonucleotidos antisentido de 13 nucleobases, incluyendo aquellos con 1 o 3 coincidencias erroneas.

Gautschi et al., (J. Natl. Cancer Inst., 93: 463-471, marzo de 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleotido con un 100% de complementariedad con el ARNm de bcl-2 y que presenta 3 coincidencias erroneas con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresion de ambos bcl-2 y bcl-xL in vitro e in vivo. Aun mas, este oligonucleotido mostro una potente actividad anti-tumoral in vivo.

Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16: 3341-3358, 1988) evaluaron una serie de oligonucleotidos antisentido de 14 nucleobases en tandem, y oligonucleotidos antisentido de 28 y 42 nucleobases compuestos por la secuencia de dos o tres de los oligonucleotidos antisentido en tandem, respectivamente, por su capacidad para detener la traduccion del DHFR humano en un ensayo con reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleotidos antisentido de 14 nucleobases pudo inhibir la traduccion, si bien en un nivel mas modesto que los oligonucleotidos antisentido de 28 o 42 nucleobases.

En determinadas formas de realizacion, los compuestos descritos en la presente son eficaces cuando presentan por lo menos una entre una IC50 in vitro menor que 20 uM, menor que 19 uM, menor que 18 uM, menor que 17 uM, menor que 16 uM, menor que 15 uM, menor que 14 uM, menor que 13 uM, menor que 12 uM, menor que 11 uM, menor que 10 uM, menor que 9 uM, menor que 8 uM, menor que 7 uM, menor que 6 uM, menor que 5 uM, menor que 4 uM, menor que 3 uM, menor que 2 uM, menor que 1 uM cuando son suministradas en celulas HuVEC como se describe en la presente.

En determinadas formas de realizacion, los compuestos descritos en la presente son eficaces cuando presentan por lo menos una entre una IC50 in vitro menor que 1.0 uM, menor que 0.9 uM, menor que 0.8 uM, menor que 0.7 uM, menor que 0.6 uM, menor que 0.5 uM, menor que 0.4 uM, menor que 0.3 uM, menor que 0.2 uM, menor que 0.1 uM cuando son suministradas en celulas HuVEC como se describe en la presente.

En determinadas formas de realizacion, los compuestos descritos en la presente son eficaces cuando presentan por lo menos una entre una IC50 in vitro menor que 0.95 uM, menor que 0.90 uM, menor que 0.85 uM, menor que 0.80 uM, menor que 0.75 uM, menor que 0.70 uM, menor que 0.65 uM, menor que 0.60 uM, menor que 0.55 uM, menor que 0.50 uM, menor que 0.45 uM, menor que 0.40 uM, menor que 0.35 uM, menor que 0.30 uM, menor que 0.25 uM, menor que 0.20 uM, menor que 0.15 uM, menor que 0.10 uM, menor que 0.05 uM, menor que 0.04 uM, menor que 0.03 uM, menor que 0.02 uM, menor que 0.01 uM cuando son suministradas en celulas HuVEC como se describe en la presente.

En determinadas formas de realizacion, el compuesto descrito en la presente es eficaz cuando presenta por lo menos una entre una IC50 in vitro menor que 20 uM, menor que 15 uM, menor que 10 uM, menor que 5 uM, menor que 2 uM, cuando se administra mediante metodos de captacion libre a lmeas celulares de cancer como se describe en la presente.

En determinadas formas de realizacion, los compuestos descritos en la presente son altamente tolerables como se demuestra con el incremento en por lo menos uno entre los valores ALT o AST de no mas de 4 veces, 3 veces o 2 veces en animales tratados con salina o un aumento en el peso de Idgado, bazo o rinon de no mas de un 30%, 20%, 15%, 12%, 10%, 5% o 2%. En determinadas formas de realizacion, los compuestos descritos en la presente son altamente tolerables como se demuestra al no haber un aumento de a Lt o AST en animales tratados con salina. En determinadas formas de realizacion, los compuestos descritos en la presente son altamente tolerables como se demuestra al no haber un aumento en el peso de Idgado, bazo o rinon en animales tratados con salina. En determinadas revelaciones, estos compuestos incluyen ISIS 455265, ISIS 455269, ISIS 455271, ISIS 455272, ISIS 455291, ISIS 455371, ISIS 455394, ISIS 455703, ISIS 455429, ISIS 455471, ISIS 455527, ISIS 455530, ISIS 455536, ISIS 455548, ISIS 455611, ISIS 465236, ISIS 465237, ISIS 465588, ISIS 465740, ISIS 465754, ISIS 465830, ISIS 466670, ISIS 466720; ISIS 481374, ISIS 481390, ISIS 481420, ISIS 481431, ISIS 481453, ISIS 481464, ISIS 481475, ISIS 481495, ISIS 481500, ISIS 481501, ISIS 481525, ISIS 481548, ISIS 481549, ISIS 481597, ISIS 481695, ISIS 481700, ISIS 481702, ISIS 481710, ISIS 481725, ISIS 481750 e ISIS 481763. En determinadas revelaciones, dichos compuestos incluyen compuestos que comprenden la secuencia de cualquiera de las SEQ ID N°: 57, 90, 90, 175, 223, 245, 267, 307, 317, 318, 366, 411, 413, 54, 258, 268, 272, 288, 464, 367, 393, 1564, 1568, 1571, 1572, 1590, 1670, 1693, 1728, 1770, 1826, 1829, 1835, 1847, 1910, 1997, 2168, 2198, 2325, 2339, 2720, 2731, 2732 y 2756.

MOTIVOS DE LOS COMPUESTOS ANTISENTIDO

En determinadas formas de realizacion, los compuestos antisentido dirigidos al acido nucleico STAT3 tienen subunidades qmmicamente modificadas dispuestas en patrones o motivos, para conferirles a los compuestos antisentido propiedades tales como una actividad inhibidora mejorada, una mayor afinidad de union por un acido nucleico blanco o resistencia a la degradacion por nucleasas in vivo.

Los compuestos antisentido quimericos tfpicamente contienen por lo menos una region modificada para asf conferir una mayor resistencia a la degradacion por nucleasas, una mayor captacion celular, una mayor afinidad de union por el acido nucleico blanco y/o una mayor actividad inhibidora. Una segunda region de un compuesto antisentido quimerico puede servir, opcionalmente, como sustrato para la endonucleasa celular RNasa H, que corta a la cadena de ARN de una dupla de ARN:ADN.

Los compuestos antisentido que tienen un motivo de gapmero se consideran compuestos antisentido quimericos. En un gapmero, una region interna que tiene una pluralidad de nucleotidos que sustenta el clivaje por RNasaH que se ubica entre las regiones externas que tienen una pluralidad de nucleotidos que son qmmicamente distintos de los nucleosidos de la region interna. En el caso de un oligonucleotido antisentido que tiene un motivo de gapmero, el segmento del hueco generalmente sirve como sustrato para el clivaje por endonucleasas, en tanto los segmentos de extension comprenden nucleosidos modificados. En determinadas formas de realizacion, las regiones de un gapmero se diferencian por los tipos de grupos de azucares comprendidos en cada region distinta. Los tipos de grupos de azucares que se usan para diferenciar las regiones de un gapmero pueden incluir, en algunas formas de realizacion, p-D-ribonucleosidos, p-D-desoxirribonucleosidos, nucleosidos modificados en 2' (dichos nucleosidos modificados en 2' pueden incluir 2'-MOE y 2'-O-CH³, entre otros), y nucleosidos con azucares bidclicos modificados (dichos nucleosidos con azucares bidclicos modificados pueden incluir aquellos que tienen un etilo restringido). En determinadas formas de realizacion, las extensiones pueden incluir barios grupos de azucares modificados, incluyendo, por ejemplo 2'-MOE y etilo restringido. En determinadas formas de realizacion, las extensiones pueden incluir varios grupos de azucares modificados y no modificados. En determinadas formas de realizacion, las extensiones pueden incluir diversas combinaciones de nucleosidos 2'-MOE, nucleosidos de etilo restringido y 2'-desoxinucleosidos.

Cada region distinta puede comprender grupos de azucares uniformes, variantes o grupos de azucares alternantes. El motivo de extension-hueco-extension con frecuencia se describe como “X-Y-Z”, donde “X” representa la longitud de la extension 5', “Y” representa la longitud del hueco y “Z” representa la longitud de la extension 3'. “X” y “Z” pueden comprender grupos de azucares uniformes, variantes o alternantes. En determinadas formas de realizacion, “X” e “Y” pueden incluir uno o mas 2'-desoxinucleosidos.

“Y” puede comprender 2'-desoxinucleosidos. Segun se usa en la presente, un gapmero descrito como “X-Y-Z” tiene una configuracion tal que el hueco se ubica inmediatamente adyacente a cada una de la extension 5' y la extension 3'. Por consiguiente, no existen nucleotidos intervinientes entre la extension 5' y el hueco o entre el hueco y la extension 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en la presente puede contener un motivo de gapmero. En determinadas formas de realizacion, “X” y “Z” son iguales, en otras formas de realizacion son diferentes. En determinadas revelaciones, “Y” tiene entre 8 y 15 nucleosidos. X, Y o Z pueden comprender cualquiera entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o mas nucleosidos.

En determinadas formas de realizacion, el compuesto antisentido dirigido a un acido nucleico STAT3 tiene un motivo de gapmero 3-10-3.

ACIDOS NUCLEICOS BLANCO, REGIONES BLANCO Y SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS

Las secuencias de nucleotidos que codifican STAT3 incluyen, sin limitaciones, los siguientes: GENBANK, Acceso N° NM_139276.2 (incorporada en la presente como la SEQ ID N°: 1) y el complemento de GENBANK, Acceso N° NT_010755.14 truncada entre los nucleotidos 4185000 y 4264000 (incorporada en la presente como la SEQ ID N°: 2).

Se comprendera que la secuencia que se muestra en cada SEQ ID N° en los Ejemplos contenidos en la presente es independiente de cualquier modificacion en un grupo de azucar, un enlace internucleosfdico o una nucleobase. Como tales, los compuestos antisentido definidos por un SEQ ID N° pueden comprender, de manera independiente, una o mas modificaciones en un grupo de azucar, un enlace intemucleosfdico o una nucleobase. Los compuestos antisentido descritos por el Numero Isis (N° Isis) indican la combinacion de la secuencia de nucleobases y el motivo.

En determinadas formas de realizacion, la region blanco es una region definida estructuralmente del acido nucleico blanco. Por ejemplo, una region blanco puede abarcar una UTR 3', una UTR 5', un exon, un intron, una union de exon/intron, una region de codificacion, una region de inicio de la traduccion, una region de terminacion de la traduccion o una otra region de acido nucleico definida. Las regiones estructuralmente definidas para STAT3 se pueden obtener con el numero de acceso en las bases de secuencias, tal como NCBI. En determinadas formas de realizacion, la region blanco puede abarcar la secuencia entre un sitio blanco 5' de un segmento blanco dentro de la region blanco y un sitio blanco 3' de otro segmento blanco dentro de la misma region blanco.

El direccionamiento incluye la determinacion de por lo menos un segmento blanco con el cual se hibridiza un compuesto antisentido, de manera tal que se produzca un efecto deseado. En determinadas formas de realizacion, el efecto deseado es una reduccion de los niveles de acido nucleico de ARNm blanco. En determinadas formas de realizacion, el efecto deseado es una reduccion de los niveles de protema codificada por el acido nucleico blanco o un cambio fenotfpico asociado con el acido nucleico blanco.

La region blanco puede contener uno o mas segmentos blanco. Los multiples segmentos blanco en una region blanco se pueden superponer. Como alternativa, no se superponen. En determinadas formas de realizacion, los segmentos blanco en una region blanco estan separados por no mas que aproximadamente 300 nucleotidos. En determinadas formas de realizacion, los segmentos blanco en una region blanco estan separados por un numero de nucleotidos que comprende, que comprende aproximadamente, que comprende no mas que, que comprende no mas que aproximadamente 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 nucleotidos en el acido nucleico blanco o un rango definido por cualesquiera dos de los valores precedentes. En determinadas formas de realizacion, los segmentos blanco en una region blanco estan separados por no mas que, o no mas que aproximadamente, 5 nucleotidos en el acido nucleico blanco. En determinadas formas de realizacion, los segmentos blanco son contiguos. Se contemplan regiones blanco definidas por un rango que tiene un acido nucleico de partida que comprende cualquiera de los sitios blanco 5' o los sitios blanco 3' enumerados en la presente.

Los segmentos blanco adecuados se pueden encontrar dentro de una UTR 5', una region de codificacion, una UTR 3', un intron, un exon o una union de exon/intron. Los segmentos blanco que contienen un codon de inicio o un codon de terminacion tambien constituyen segmentos blanco adecuados. Un segmento blanco adecuado puede excluir espedficamente una region determinada definida estructuralmente, tal como el codon de inicio o el codon de terminacion.

La determinacion de los segmentos blanco adecuados pueden incluir la comparacion de la secuencia de un acido nucleico blanco con otras secuencias de todo el genoma. Por ejemplo, se puede usar el algoritmo BLAST para identificar regiones de similitud entre diferentes acidos nucleicos. Esta comparacion puede prevenir la seleccion de secuencias de compuestos antisentido que se pueden hibridizar de una manera no espedfica con secuencias distintas de un acido nucleico blanco seleccionado (es decir, secuencias no blanco o fuera del blanco).

Puede haber variacion en la actividad (por ejemplo, como lo define una reduccion porcentual de los niveles de acido nucleico blanco) de los compuestos antisentido en una region blanco activa. En determinadas formas de realizacion, las reducciones en los niveles de ARNm STAT3 son indicativas de la inhibicion de la expresion de STAT3. Las reducciones en los niveles de una protema STAT3 tambien son indicativas de la inhibicion de la expresion del ARNm blanco. Ademas, los cambios fenotfpicos son indicativos de la inhibicion de la expresion de STAT3. En determinadas formas de realizacion, un crecimiento celular reducido, un crecimiento tumoral reducido y un volumen del tumor reducido pueden ser indicativos de la inhibicion de la expresion de STAT3. En determinadas formas de realizacion, el alivio de los smtomas asociados con el cancer puede ser indicativo de una inhibicion de la expresion de STAT3. En determinadas formas de realizacion, una reduccion de la caquexia es indicativa de una inhibicion de la expresion de STAT3. En determinadas formas de realizacion, una reduccion de los marcadores de cancer puede ser indicativa de una inhibicion de la expresion de STAT3.

HIBRIDACION

En algunas formas de realizacion, se produce hibridacion entre un compuesto antisentido divulgado en la presente y un acido nucleico STAT3. El mecanismo de hibridacion mas comun comprende la formacion de puentes de hidrogeno (por ejemplo, puentes de hidrogeno de Watson-Crick, Hoogsteen o inversos) entre nucleobases complementarias de las moleculas de acido nucleico.

La hibridacion puede tener lugar bajo condiciones variables. Las condiciones severas son dependientes de la secuencia y esta determinadas por la naturaleza y la composicion de las moleculas de acido nucleico que se hibridizaran.

Los metodos para determinar si una secuencia se hibridiza espedficamente con un acido nucleico blanco son bien conocidos en el arte. En determinadas formas de realizacion, los compuestos antisentido provistos en la presente se hibridizan espedficamente con un acido nucleico STAT3.

COMPLEMENTARIEDAD

Un compuesto antisentido y un acido nucleico blanco son complementary entre sf cuando un numero suficiente de nucleobases del compuesto antisentido puede formar puentes de hidrogeno con las correspondientes nucleobases del acido nucleico blanco, de manera tal que se producira el efecto deseado (por ejemplo, inhibicion antisentido de un acido nucleico blanco, tal como un acido nucleico STAT3).

Las nucleobases no complementarias entre un compuesto antisentido y un acido nucleico STAT3 se pueden tolerar siempre que el compuesto antisentido aun pueda hibridizarse espedficamente con un acido nucleico blanco. Aun mas, un compuesto antisentido se puede hibridiza sobre uno o mas segmentos de un acido nucleico STAT3 sin compromiso de segmentos intervinientes o adyacentes en el evento de hibridacion (por ejemplo, una estructura de bucle, una coincidencia erronea o una estructura en horquilla).

En determinadas formas de realizacion, los compuestos antisentido provistos en la presente, o una porcion espedfica de los mismos son, o son por lo menos, un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% complementarios de un acido nucleico STAT3, una region blanco, un segmento blanco o una porcion espedfica de los mismos. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un acido nucleico blanco se puede determinar usando metodos de rutina.

Por ejemplo, un compuesto antisentido en donde 18 de 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias de una region blanco, y por ello se hibridizanan espedficamente, representara un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias remanentes pueden estar agrupadas o dispersas entre las nucleobases complementarias y no es necesario que sean contiguas entre sf o de nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido de 18 nucleobases de longitud que tiene cuatro nucleobases no complementarias que estan flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el acido nucleico blanco tendna un 77.8% de complementariedad global con el acido nucleico blanco y por consiguiente se encontrana dentro del alcance de la presente invencion. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una region de un acido nucleico blanco se puede determinar de manera rutinaria usando los programas BLAST (herramientas de busqueda de alineacion local basica) y los programas PowerBLAST conocidos en el arte (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649656). El porcentaje de homology , de identidad de secuencia o de complementariedad se puede determinar, por ejemplo, con el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 para Unix, Genetics Computer Grupo, University Research Park, Madison Wis.), usando los ajustes predeterminados, que emplea el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482489).

En determinadas formas de realizacion, los compuestos antisentido provistos en la presente, o porciones espedficas de los mismos, son completamente complementarios (es decir, 100% complementarios) de un acido nucleico blanco o una porcion espedfica del mismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido puede ser completamente complementario de un acido nucleico STAT3 o de una region blanco o de un segmento blanco o de una secuencia blanco del mismo. Segun se usa en la presente, el termino “completamente complementary” se refiere a que cada nucleobase de un compuesto antisentido tiene la capacidad de aparear sus bases de manera precisa con las correspondientes nucleobases de un acido nucleico blanco. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es completamente complementario de una secuencia blanco de 400 nucleobases de longitud, siempre que exista una correspondiente porcion de 20 nucleobases en el acido nucleico blanco que sea completamente complementario del compuesto antisentido. El termino completamente complementario tambien se puede usar con referencia a una porcion espedfica del primer y/o del segundo acido nucleico. Por ejemplo, una porcion de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser “completamente complementaria” de una secuencia blanco de 400 nucleobases de longitud. La porcion de 20 nucleobases del oligonucleotido de 30 nucleobases es completamente complementaria de la secuencia blanco si la secuencia blanco tiene una correspondiente porcion de 20 nucleobases en donde cada nucleobase es complementario de la porcion de 20 nucleobases del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, el compuesto antisentido completo de 30 nucleobases puede, o no, ser completamente complementario de la secuencia blanco, dependiendo de si los 10 nucleobases remanentes del compuesto antisentido tambien son complementarios de la secuencia blanco.

La ubicacion de una nucleobase no complementaria se ser por el extremo 5' o por el extremo 3' del compuesto antisentido. Como alternativa, la nucleobase no complementaria o las nucleobases no complementarias pueden encontrarse en una posicion interna del compuesto antisentido. Cuando hay dos o mas nucleobases no complementarias, pueden ser contiguas (es decir, pueden estar unidas) o no contiguas. En una forma de realizacion, la nucleobase no complementaria se ubica en el segmento de extension de un oligonucleotido antisentido con gapmero.

En determinadas formas de realizacion, los compuestos antisentido que comprenden, o que comprenden hasta, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases de longitud comprenden no mas de 4, no mas de 3, no mas de 2 o no mas de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) con relacion a un acido nucleico blanco, tal como un acido nucleico STAT3 o una porcion espedfica del mismo.

En determinadas formas de realizacion, los compuestos antisentido que comprenden, o que comprenden hasta, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleobases de longitud comprenden no mas de 6, no mas de 5, no mas de 4, no mas de 3, no mas de 2 o no mas de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) con relacion a un acido nucleico blanco, tal como un acido nucleico STAT3 o una porcion espedfica del mismo.

Los compuestos antisentido provistos en la presente tambien incluyen aquellos que son complementarios de una porcion de un acido nucleico blanco. Segun se usa en la presente, una “porcion” se refiere a un numero definido de nucleobases contiguas (es decir, unidas) en una region o segmento de un acido nucleico blanco. Una “porcion” tambien puede hacer referencia a un numero definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En determinadas formas de realizacion, los compuestos antisentido son complementarios de por lo menos una porcion de 8 nucleobases de un segmento blanco. En determinadas formas de realizacion, los compuestos antisentido son complementarios de por lo menos una porcion de 9 nucleobases de un segmento blanco. En determinadas formas de realizacion, los compuestos antisentido son complementarios de por lo menos una porcion de 10 nucleobases de un segmento blanco. En determinadas formas de realizacion, los compuestos antisentido son complementarios de por lo menos una porcion de 11 nucleobases de un segmento blanco. En determinadas formas de realizacion, los compuestos antisentido son complementarios de por lo menos una porcion de 12 nucleobases de un segmento blanco. En determinadas formas de realizacion, los compuestos antisentido son complementarios de por lo menos una porcion de 13 nucleobases de un segmento blanco. En determinadas formas de realizacion, los compuestos antisentido son complementarios de por lo menos una porcion de 14 nucleobases de un segmento blanco. En determinadas formas de realizacion, los compuestos antisentido son complementarios de por lo menos una porcion de 15 nucleobases de un segmento blanco. Tambien se contemplan compuestos antisentido que son complementarios de por lo menos una porcion de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o mas nucleobases de un segmento blanco o un rango definido por cualesquiera dos de estos valores.

IDENTIDAD

Los compuestos antisentido provistos en la presente tambien pueden tener un porcentaje de identidad definido con una secuencia de nucleotidos, SEQ ID N° o compuesto particular representado por un numero Isis espedfico, o una porcion de la misma. Segun se usa en la presente, un compuesto antisentido es identico a la secuencia divulgada en la presente si tiene la misma capacidad de apareamiento de nucleobases. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en la secuencia de ADN divulgada se considerana identica a la secuencia de ADN dado que tanto el uracilo como la timidina se aparea con adenina. Tambien se contemplan versiones mas cortas o mas largas de los compuestos antisentido descritos en la presente, asf como compuestos que tienen bases no identicas con relacion a los compuestos antisentido provistos en la presente. Las bases no identicas pueden ser adyacentes entre sf o pueden estar dispersas por todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el numero de bases que tiene un apareamiento de bases identico con relacion a la secuencia con la cual se compara.

En determinadas formas de realizacion, los compuestos antisentido, o porciones de los mismos, son por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% identicos a uno o mas de los compuestos antisentido o SEQ ID N° o a porcion de los mismos, divulgados en la presente.

En determinadas formas de realizacion, se compara una porcion del compuesto antisentido con una porcion de igual longitud del acido nucleico blanco. En determinadas formas de realizacion, se compara una porcion de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleobases con una porcion de igual longitud del acido nucleico blanco.

En determinadas formas de realizacion, se compara una porcion del oligonucleotido antisentido con una porcion de igual longitud del acido nucleico blanco. En determinadas formas de realizacion, se compara una porcion de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleobases con una porcion de igual longitud del acido nucleico blanco.

MODIFICACIONES

Un nucleosido es una combinacion de una base y un azucar. La porcion de la nucleobase (tambien conocida simplemente como base) del nucleosido normalmente es una base heterodclica. Los nucleotidos son nucleosidos que ademas incluyen un grupo fosfato unido de manera covalente con la porcion de azucar del nucleosido. En el caso de los nucleosidos que incluyen un azucar de pentofuranosilo, el grupo fosfato se puede unir con el grupo hidroxilo 2', 3' o 5' del azucar. Los oligonucleotidos se forman mediante la union covalente de nucleosidos adyacentes entre sf, para formar un polimerico de linear oligonucleotidos lineal. En el contexto de la estructura del oligonucleotido, los grupos fosfatos se conocen comunmente por formar los enlaces internucleosfdicos del oligonucleotido.

Las modificaciones de los compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios en los enlaces intemucleosfdicos, en los grupos de azucares o en las nucleobases. A menudo se prefieren los compuestos antisentido modificados antes que las formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captacion celular mejorada, mayor afinidad por el acido nucleico blanco, mayor estabilidad en la presencia de nucleasas o mayor actividad inhibidora.

Tambien se pueden emplear nucleosidos qmmicamente modificados para aumentar la afinidad de union de un oligonucleotido antisentido mas corto o truncado por su acido nucleico blanco. En consecuencia, a menudo se pueden obtener resultados comparables con compuestos antisentido mas cortos que contienen a dichos nucleosidos qmmicamente modificados.

ENLACES INTERNUCLEOSIDICOS MODIFICADOS

Los enlaces internucleosfdicos de ARN y ADN naturales comprenden un enlace fosfodiester 3' a 5'. Los compuestos antisentido que tienen uno o mas enlaces internucleosfdicos modificados, es decir no naturales, a menudo se seleccionan ante los compuestos antisentido con enlaces internucleosfdicos naturales debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, una captacion celular mejorada, una mayor afinidad por los acidos nucleicos blanco y una mayor estabilidad en la presencia de nucleasas.

Los oligonucleotidos que tienen enlaces internucleosfdicos modificados incluyen enlaces internucleosfdicos que retienen un atomo de fosforo, asf como enlaces internucleosfdicos que no tienen un atomo de fosforo. Los enlaces internucleosfdicos que contienen fosforo representativos incluyen, pero en un sentido no taxativo, fosfodiesteres, fosfotriesteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los metodos de preparacion de enlaces que contienen fosforo y que no contienen fosforo son bien conocidos.

En determinadas formas de realizacion, los compuestos antisentido dirigidos a un acido nucleico STAT3 comprenden uno o mas enlaces internucleosfdicos modificados. En determinadas formas de realizacion, los enlaces internucleosfdicos modificados son enlaces fosforotioatos. En determinadas formas de realizacion, cada enlace internucleosfdico de un compuesto antisentido es un enlace internucleosfdico fosforotioato.

GRUPOS DE AZUCARES MODIFICADOS

Los compuestos antisentido provistos en la presente opcionalmente pueden contener uno o mas nucleosidos en los cuales se ha modificado el grupo de azucar. Dichos nucleosidos con azucar modificado pueden impartir una estabilidad mejorada a nucleasas, una mayor afinidad de union o alguna otra propiedad biologica beneficiosa, a los compuestos antisentido. En determinadas formas de realizacion, los nucleosidos comprenden un anillo ribofuranosa qmmicamente modificado. Los ejemplos de anillos ribofuranosa qmmicamente modificados incluyen, en un sentido no taxativo, adicion de grupos de sustituyentes (incluyendo grupos sustituyentes en 5' y 2'); formacion de puentes en atomos de anillo no geminales para formar acidos nucleicos bidclicos (BNA); reemplazo del atomo de oxfgeno del anillo ribosilo con S, N(R) o C(R1)(R)2 (R = H, C1-C12 alquilo o un grupo protector); y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de azucares qmmicamente modificados incluyen, nucleosido sustituidos con 2'-F-5'-metilo (vease, la Solicitud de Patente Internacional PCT WO 2008/101157, publicada el 21/8/08 por la divulgacion de otros nucleosidos 5', 2'-bi-sustituidos), reemplazo del atomo de oxfgeno en el anillo ribosilo por S con una sustitucion adicional en la posicion 2' (vease, la publicacion de la Solicitud de Patente de los EE.Uu . N°: US2005/0130923, publicada el 16 de junio, 2005) o, como alternativa, la sustitucion en 5' de un BNA (vease, Solicitud de Patente Internacional PCT WO 2007/134181, publicada el 22/11/07, en donde se sustituye LNA, por ejemplo, con un grupo 5'-metilo o un grupo 5'-vinilo).

Los ejemplos de nucleosidos que tienen grupos de azucares modificados incluyen, en un sentido no taxativo, nucleosidos que comprenden grupos de sustituyentes 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH³ y 2'-O(CH²)2OCH³. El sustituyente de la posicion 2' tambien se puede seleccionar entre alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-C1-C10 alquilo, OCF3, O(CH²)2SCH³, O(CH²)2-O-N(Rm)(Rn) y O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, de manera independiente, H o C1-C10 alquilo sustituido o no sustituido.

Segun se usa en la presente, los “nucleosidos bidclicos” se refieren a nucleosidos modificados que comprenden un azucar bidclico. Los ejemplos de nucleosidos bidclicos incluyen, en un sentido no taxativo, nucleosidos que comprenden un puente entre los atomos 4' y 2' del anillo ribosilo. En determinadas formas de realizacion, los compuestos antisentido provistos en la presente incluyen uno o mas nucleosidos bidclicos en donde el puente comprende un nucleosido bidclico 4' a 2'. Los ejemplos de dichos nucleosidos bidclicos 4' a 2', incluyen, pero en un sentido no taxativo, uno que presenta una de las siguientes formulas: 4'-(CH²)-O-2' (LNA); 4'-(CH²)-S-2'; 4'-(CH²)²-O-2' (ENA); 4'-CH(CH³)-O-2' y 4'-CH(CH²OCH³)-O-2' y analogos de los mismos (vease, la Patente de los EE.UU. N°: 7,399,845, presentada el 15 de julio, 2008); 4'-C(CH³)(CH³)-O-2' y analogos de los mismos (vease, la publicacion de la Solicitud de Patente Internacional PcT WO2009/006478, publicada el 8 de enero, 2009); 4'-CH²-N(OCH³)-2' y analogos de los mismos (vease, la publicacion de la Solicitud de Patente Internacional PCT WO2008/150729, publicada el 11 de diciembre, 2008); 4'-CH²-O-N(CH³)-2' (vease, la publicacion de la Solicitud de Patente de los EE.UU. N°: US2004/0171570, publicada el 2 de septiembre, 2004); 4'-CH²-N(R)-O-2', en donde R es H, un grupo C1-C12 alquilo o un grupo protector (vease, la Patente de los EE.UU. N°: 7,427,672, presentada el 23 de septiembre, 2008); 4'-CH²-C(H)(CH³)-2' (vease, Chattopadhyaya, et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118­ 134); y 4'-CH²-C(=CH²)-2' y analogos de los mismos (vease, la publicacion de la Solicitud de Patente Internacional PCT WO 2008/154401, publicada el 8 de diciembre, 2008). Tambien vease, por ejemplo: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 129(26) 8362-8379 (4 de julio, 2007); Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Patentes de los EE.UU. N°: 6,670,461, 7,053,207, 6,268,490, 6,770,748, 6,794,499, 7,034,133, 6,525,191, 7,399,845; las publicaciones de las Solicitudes de Patente Internacional PCT WO 2004/106356, WO 94/14226, WO 2005/021570 y WO 2007/134181; las publicaciones de las Patentes de los EE.UU. N°: US2004/0171570, US2007/0287831 y US2008/0039618; y las Patentes de los EE.UU. N° Acta: 12/129,154, 60/989,574, 61/026,995, 61/026,998, 61/056,564, 61/086,231, 61/097,787 y 61/099,844; y las Solicitudes de Patente Internacional PCT N° PCT/US2008/064591, PCT/US2008/066154 y PCT/US2008/068922. Cada uno de los nucleosidos bidclicos precedentes se puede preparar con una o mas configuraciones estereoqmmicas del azucar incluyendo, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (vease la Solicitud de Patente Internacional PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo, 1999 como WO 99/14226).

En determinadas formas de realizacion, las unidades de azucares bidclicos de los nucleosidos BNA pueden ser, sin limitaciones, compuestos que comprenden al menos un enlace entre las posiciones 4' y 2' de una unidad de azucar de pentofuranosilo, donde dichos enlaces comprenden, en cada caso independientemente, 1 o entre 2 y 4 grupos unidos que pueden seleccionarse de manera independiente entre los siguientes: -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)²-, -S(=O)x- y -N(Ra)-;

donde

x es 0, 1 o 2;

n es 1, 2, 3 o 4;

cada uno de Ra y Rb es independientemente H, un grupo protector, un hidroxilo, un alquilo C1-C12, un alquilo C1-C12 sustituido, un alquenilo C2-C12, un alquenilo C2-C12 sustituido, un alquinilo C2-C12, un alquinilo C2-C12 sustituido, un arilo C5-C20, un arilo C5-C20 sustituido, un radical heterodclico, un radical heterodclico sustituido, un heteroarilo, un heteroarilo sustituido, un radical alidclico C5-C7, un radical alidclico C5-C7 sustituido, un halogeno, un grupo OJ1 , un grupo NJ1J2, un grupo SJ1 , un grupo N3, un grupo COOJ1 , un grupo acil (C(=O)-H), un grupo acilo sustituido, un grupo CN, un grupo sulfonil (S(=O)2-J1) o un grupo sulfoxil (S(=O)-J1); y

cada uno de J1 y J2 es independientemente H, un alquilo C1-C12, un alquilo C1-C12 sustituido, un alquenilo C2-C12, un alquenilo C2-C12 sustituido, un alquinilo C2-C12, un alquinilo C2-C12 sustituido, un arilo C5-C20, un arilo C5-C20 sustituido, un grupo acil (C(=O)-H), un acilo sustituido, un radical heterodclico, un radical heterodclico sustituido, un aminoalquilo C1-C12, un aminoalquilo C1-C12 sustituido o un grupo protector.

En determinadas formas de realizacion, el enlace de la unidad de azucar bidclico es -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- o -C(RaRb)-O-N(R)-. En determinadas formas de realizacion, el enlace es ⁴ ' - C ^{h 2}- ² ', 4'-(CH²)²-2', 4'-(CH²)³-2', 4'-CH²-O-2', 4'-(CH²)²-O-2', 4'-CH²-O-N(R)-2' o 4'-CH²-N(R)-O-2'-, donde, en cada caso independientemente, R es H, un grupo protector o un alquilo C1-C12.

En determinadas formas de realizacion, los nucleosidos bidclicos tambien pueden definirse sobre la base de su configuracion isomerica. A modo de ejemplo, un nucleosido que comprende un enlace de 4'-2'-metileno-oxilo puede presentar una configuracion a-L o una configuracion p-D. Se ha descripto la incorporacion de nucleosidos BNA del tipo del a-L-metilenoxilo (4'-CH²-O-2') en oligonucleotidos antisentido activos (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).

En determinadas formas de realizacion, los nucleosidos bidclicos incluyen, sin limitaciones, (A) los nucleosidos BNA del tipo del a-L-metilenoxilo (4'-CH²-O-2'), (B) los nucleosidos B ⁿ A del tipo del p-D-metilenoxilo (4 -CH2-O-2'), (C) los nucleosidos BNA del tipo del etilenoxilo (4'-(CH²)²-O-2'), (D) los nucleosidos BNA del tipo del aminooxilo (4'-CH²-O-N(R)-2'), (E) los nucleosidos BNA del tipo del oxiamino (4'-CH²-N(R)-O-2'), (F) los nucleosidos BNA del tipo del metil(metilenoxilo) (4'-CH(CH³ )-O-2'), (G) los nucleosidos B ⁿ A del tipo del metilentiol (4'-CH²-S-2'), (H) los nucleosidos BNA del tipo del metilenamino (4'-CH2-N(R)-2'), (I) los nucleosidos BNA del tipo metil carbodclico (4'-CH²-CH(CH³)-2') y (J) los nucleosidos BNA del tipo propilen carbodclico (4'-(CH²)³-2'), que se representan a continuacion,

donde Bx es la unidad basica y R, en cada caso independientemente, es H, un grupo protector o un alquilo Ci -Cl ².

En determinadas formas de realizacion, el nucleosido bidclico tiene la formula I

donde

Bx es una unidad basica heterodclica;

-Qa-Qb-Qc- es -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- o -N(Rc)-O-CH2;

Rc es un alquilo C1-C12 o un grupo protector de amino; y

cada uno de Ta y Tb es independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo que reactivo que comprende fosforo, una unidad de fosforo o un enlace covalente con un medio de soporte.

En determinadas formas de realizacion, el nucleosido bidclico tiene la formula II

donde

Bx es una unidad basica heterodclica;

cada uno de Ta y Tb es independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo que reactivo que comprende fosforo, una unidad de fosforo o un enlace covalente con un medio de soporte; y Za es un alquilo C1-C6, un alquenilo C2-C6, un alquinilo C2-C6, un alquilo C1-C6 sustituido, un alquenilo C2-C6 sustituido, un alquinilo C2-C6 sustituido, un acilo, un acilo sustituido, una amida sustituida, un tiol o un tiol sustituido.

En una forma de realizacion, cada uno de los grupos sustituidos se encuentra monosustituido o polisustituido de manera independiente con grupos que pueden seleccionarse entre los halogenos y los grupos oxo, hidroxilo, OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc y NJeC(=X)NJcJd, donde cada uno de Jc, Jd y Je es independientemente H, un alquilo C1-C⁶ o un alquilo C1-C6 sustituido y X es O o NJc.

En determinadas formas de realizacion, el nucleosido bidclico tiene la formula III

donde

Bx es una unidad basica heterodclica;

cada uno de Ta y Tb es independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo que reactivo que comprende fosforo, una unidad de fosforo o un enlace covalente con un medio de soporte; y Zb es un alquilo C1-C6, un alquenilo C2-C6, un alquinilo C2-C6, un alquilo C1-C6 sustituido, un alquenilo C2-C6 sustituido, un alquinilo C2-C6 sustituido o un acilo sustituido (C(=O)-).

En determinadas formas de realizacion, el nucleosido bidclico tiene la formula IV

donde

Bx es una unidad basica heterodclica;

cada uno de Ta y Tb es independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo que reactivo que comprende fosforo, una unidad de fosforo o un enlace covalente con un medio de soporte;

Rd es un alquilo C1-C6, un alquenilo C2-C6, un alquinilo C2-C6, un alquilo C1-C6 sustituido, un alquenilo C2-C6 sustituido o un alquinilo C2-C6 sustituido; y

cada uno de qa, qb, qc y qd es independientemente H, un halogeno, un alquilo C1-C6, un alquenilo C2-C6, un alquinilo C2-C6, un alquilo C1-C6 sustituido, un alquenilo C2-C6 sustituido, un alquinilo C2-C6 sustituido, un alcoxilo C1-C6, un alcoxilo C1-C6 sustituido, un acilo, un acilo sustituido, un aminoalquilo C1-C6 o un aminoalquilo C1-C6 sustituido.

En determinadas formas de realizacion, el nucleosido bidclico tiene la formula V

donde

Bx es una unidad basica heterodclica;

cada uno de Ta y Tb es independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo que reactivo que comprende fosforo, una unidad de fosforo o un enlace covalente con un medio de soporte; cada uno de qa, qb, qe y qf es independientemente hidrogeno, un halogeno, un alquilo C1-C12, un alquilo C1-C12 sustituido, un alquenilo C2-C12, un alquenilo C2-C12 sustituido, un alquinilo C2-C12, un alquinilo C2-C12 sustituido, un alcoxilo C1-C12, un alcoxilo C1-C12 sustituido o un grupo OJj , SJj , SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj , O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk;

o qe y qf juntos forman un grupo =C(qg)(qh); y

cada uno de qg y qh es independientemente H, un halogeno, un alquilo C1-C12 o un alquilo C1-C12 sustituido. Se ha descripto la smtesis y la elaboracion de los monomeros de los nucleosidos BNA del tipo del metilenoxilo (4'-CH²-O-2'), la adenina, la citosina, la guanina, la 5-metil-citosina, la timina y el uracilo, asf como su oligomerizacion y sus propiedades relacionadas con el reconocimiento de los acidos nucleicos (vease, por ejemplo, Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Los nucleosidos BNA y su elaboracion tambien se describen en WO 98/39352 y en WO 99/14226.

Tambien se ha descripto la elaboracion de los analogos de los nucleosidos BNA del tipo del metilenoxilo (4'-CH²-O-2') y de los nucleosidos 2'-tio-BNA (vease, por ejemplo, Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219­ 2222), la elaboracion de los analogos de nucleosidos que comprenden duplas de oligodesoxirribonucleotidos, que pueden ser utiles como sustratos para las polimerasas que actuan sobre los acidos nucleicos (vease, por ejemplo, Wengel et al., WO 99/14226), la smtesis de los nucleosidos 2'-amino-BNA, que son analogos de oligonucleotidos novedosos que presentan una conformacion restringida y una afinidad elevada (vease, por ejemplo, Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039), y la elaboracion de los nucleosidos 2'-metilamino-BNA, que pueden formar duplas termicamente estables con cadenas de ARN o ADN complementario.

En determinadas formas de realizacion, el nucleosido bidclico tiene la formula VI

donde

Bx es una unidad basica heterodclica;

cada uno de Ta y Tb es independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo que reactivo que comprende fosforo, una unidad de fosforo o un enlace covalente con un medio de soporte; cada uno de qi, qj , qk y qi es independientemente H, un halogeno, un alquilo C1-C12, un alquilo C1-C12 sustituido, un alquenilo C2-C12, un alquenilo C2-C12 sustituido, un alquinilo C2-C12, un alquinilo C2-C12 sustituido, un alcoxilo C1-C12, un alcoxilo C1-C12 sustituido o un grupo OJj , SJj, SOJj , SO2Jj , NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk; y

qi y qj o ql y qk juntos forman un grupo =C(qg)(qh), donde cada uno de qg y qh es independientemente, H, un halogeno, un alquilo C1-C12 o un alquilo C1-C12 sustituido.

Se ha descripto un nucleosido carbodclico bidclico que comprende un enlace 4'-(CH²)³-2' y un analogo de alquenilo, que puede tomar la forma de un enlace 4'-Ch =CH-CH2-2' (vease, por ejemplo, Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443, y Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). Tambien se ha descripto la smtesis y la elaboracion de los nucleosidos carbodclicos, asf como su oligomerizacion, y se han publicado estudios bioqmmicos donde se los ha usado (vease, por ejemplo, Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc.

2007, 129(26), 8362-8379).

Tal como se lo emplea en la presente, el termino “nucleosido bidclico 4'-2'” hace referencia a un nucleosido bidclico que comprende un anillo de furanosa que presenta un enlace entre el atomo de carbono en la posicion 2' y el atomo de carbono en la posicion 4'.

Tal como se lo emplea en la presente, el termino “nucleosido monodclico” hace referencia a un nucleosido que comprende unidades de azucares modificados que no son azucares bidclicos. En determinadas formas de realizacion, la unidad de azucar de un nucleosido, que puede ser un analogo de un azucar, puede someterse a una modificacion o una sustitucion en cualquier posicion.

Tal como se lo emplea en la presente, el termino “azucar modificado en la posicion 2'” hace referencia a un azucar de furanosilo que presenta una modificacion en la posicion 2'. En determinadas formas de realizacion, las modificaciones en este contexto incluyen la introduccion de sustituyentes que pueden seleccionarse, sin limitaciones, entre los haluros, los alcoxilos sustituidos o no sustituidos, los tioalquilos sustituidos o no sustituidos, los amino alquilos sustituidos o no sustituidos, los alquilos sustituidos o no sustituidos, los alilos sustituidos o no sustituidos y los alquinilos sustituidos o no sustituidos. En determinadas formas de realizacion, las modificaciones en la posicion 2' abarcan la introduccion de sustituyentes que pueden seleccionarse, sin limitaciones, entre los grupos O[(CH²)nO]mCH³, O(CH2)nNH2, O(CH²)nCH³, O(CH2)nONH2, OCH²C(=O)N(H)CH³ y O(CH²)nON[(CH²)nCH³]², donde n y m pueden tomar un valor de entre 1 y 10. Otros grupos que pueden introducirse como sustituyentes en la posicion 2' incluyen los alquilos C1-C12, los alquilos sustituidos, los alquenilos, los alquinilos, los alcarilos, los aralquilos, los O-alcarilos, los O-aralquilos, los grupos SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, los grupos que pueden escindir el ARN, los grupos indicadores, los intercaladores, los grupos que son utiles para mejorar las propiedades farmacocineticas, los grupos que son utiles para mejorar las propiedades farmacodinamicas de los compuestos antisentido y los sustituyentes que presentan propiedades similares. En determinadas formas de realizacion, los nucleosidos modificados comprenden una cadena lateral de MOE en la posicion 2' (vease, por ejemplo, Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Se ha indicado que la introduccion de un sustituyente MOE en la posicion 2' es util para mejorar la afinidad de union, en comparacion con la afinidad que podnan presentar los nucleosidos no modificados u otros nucleosidos modificados, como es el caso de los nucleosidos que comprenden grupos O-metilo, O-propilo u O-aminopropilo en la posicion 2'. Tambien se ha comprobado que los oligonucleotidos antisentido que comprenden sustituyentes MOE en la posicion 2' pueden actuar como inhibidores de la expresion de los genes, por lo que podnan resultar de utilidad in vivo (vease, por ejemplo, Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504, Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176, Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637, y Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).

Tal como se lo emplea en la presente, el termino “nucleosido de tetrahidropirano modificado” o “nucleosido THP modificado” hace referencia a un nucleosido que comprende un “azucar” de seis miembros del tipo del tetrahidropirano como sustituyente en el residuo de pentofuranosilo, en comparacion con los nucleosidos normales, por lo que pueden ser usados en reemplazo de los azucares. Los nucleosidos THP modificados incluyen, sin limitaciones, los nucleosidos que en la tecnica se conocen como acidos nucleicos del tipo del hexitol (HNA), acidos nucleicos del tipo del anitol (ANA) o acidos nucleicos del tipo del manitol (MNA) (vease Leumann, CJ., Bioorg. & Med. Chem. (2002) 10:841-854), los acidos nucleicos HNA modificados con fluor (F-HNA) y los compuestos que se tienen la formula X

Formula X

donde de manera independiente en cada uno de los analogos de nucleosidos del tipo del tetrahidropirano que tienen la formula X,

Bx es una unidad basica heterodclica;

cada uno de T3 y T4 es independientemente un enlace entre dos nucleosidos, que en particular une el analogo de nucleosido del tipo del tetrahidropirano y el compuesto antisentido, o bien uno de T3 y T4 es un enlace entre dos nucleosidos que une el analogo de nucleosido del tipo del tetrahidropirano y el compuesto antisentido y el otro es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado o un grupo terminal 5' o 3';

cada uno de qi , q2, q³ , q⁴, q⁵, q⁶ y q⁷ es independientemente, H, un alquilo Ci -Ca, un alquilo Ci -Ca sustituido, un alquenilo C2-Ca, un alquenilo C2-Ca sustituido, un alquinilo C2-Ca o un alquinilo C2-Ca sustituido; y

uno de Ri y R2 es hidrogeno y el otro se selecciona entre un halogeno, un alcoxilo sustituido o no sustituido o un grupo NJ1J2, SJi , N3, OC(=X)Ji , OC(=X)NJi J2, NJ³C(=X)NJi J² o CN, donde X es O, S o NJi y cada uno de Ji , J2 y J3 es independientemente H o un alquilo Ci -Ca.

En determinadas formas de realizacion, en los nucleosidos THP modificados de formula X, qm, qn, qp, qr, qs, qt y qu son H. En determinadas formas de realizacion, al menos uno de qm, qn, qp, qr, qs, qt y qu no es H. En determinadas formas de realizacion, al menos uno de qm, qn, qp, qr, qs, qt y qu es metilo. En determinadas formas de realizacion, en los nucleosidos THP de formula X, uno de Ri y R2 es F. En determinadas formas de realizacion, Ri es fluoro y R2 es H, Ri es metoxilo y R2 es H o Ri es metoxietoxilo y R2 es H.

Tal como se los emplea en la presente, los terminos “modificado en la posicion 2'” y “sustituido en la posicion 2'” se aplican a aquellos nucleosidos que comprenden un azucar que presenta un sustituyente diferente del H y el OH en la posicion 2'. Los nucleosidos modificados en la posicion 2', incluyen, sin limitaciones, aquellos nucleosidos bidclicos que comprenden un enlace entre el atomo de carbono en la posicion 2' y otro atomo de carbono del anillo del azucar y aquellos nucleosidos que comprenden sustituyentes que no son enlaces en la posicion 2', lo que abarca los grupos alilo, amino, azido, tiol, O-alilo, alquilo O-Ci -Cio, -OCF3, O-(CH²)²-O-CH³, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) y O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada uno de Rm y Rn es independientemente H o un alquilo Ci -Cio sustituido o no sustituido. Los nucleosidos modificados en la posicion 2' tambien pueden presentar otras modificaciones, por ejemplo, en otras posiciones de los azucares y/o en las nucleobases.

Tal como se lo emplea en la presente, el termino “2'-F” hace referencia a la presencia de un atomo de fluor en la posicion 2' de un azucar en un nucleosido.

Tal como se los emplea en la presente, los terminos “2'-OMe”, “2'-OCH³” y “2'-O-metilo” hacen referencia a la presencia de un grupo -OCH3 en la posicion 2' de un azucar en un nucleosido.

Tal como se lo emplea en la presente, el termino “oligonucleotido” hace referencia a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleosidos unidos. En determinadas formas de realizacion, uno o mas de estos nucleosidos se encuentran modificados. En determinadas formas de realizacion, un oligonucleotido comprende uno o mas ribonucleosidos (ARN) y/o uno o mas desoxirribonucleosidos (ADN).

En la tecnica se conocen otros sistemas de anillos bidclicos o tridclicos que pueden usarse en reemplazo de los azucares para modificar los nucleosidos en los compuestos antisentido (vease, por ejemplo, el artfculo de Leumann, J. C., Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 84i-854).

Estos sistemas de anillos pueden someterse a diversas sustituciones adicionales para incrementar su actividad. Aquellos versados en la tecnica han de conocer diversos metodos para elaborar los azucares modificados.

En los nucleotidos que comprenden unidades de azucares modificados, suelen conservarse las nucleobases (que pueden ser nucleobases naturales, nucleobases modificadas o una combinacion de nucleobases naturales y nucleobases modificadas) para poder efectuar la hibridacion con los blancos apropiados.

En determinadas formas de realizacion, los compuestos antisentido comprenden uno o mas nucleotidos que presentan unidades de azucares modificados. En determinadas formas de realizacion, el azucar modificado toma la forma de una unidad MOE en el extremo 2'. En determinadas formas de realizacion, los nucleotidos modificados que comprenden unidades MOE en el extremo 2' se distribuyen con un patron intercalado. En determinadas formas de realizacion, el azucar modificado es una unidad de cEt. En determinadas formas de realizacion, los nucleotidos modificados que comprenden unidades cEt se localizan en los extremos, donde presentan un patron intercalado.

COMPOSICIONES Y METODOS PARA FORMULAR LAS COMPOSICIONES FARMACEUTICAS

Los oligonucleotidos antisentido pueden combinarse con sustancias activas o inertes farmaceuticamente aceptables para elaborar composiciones o formulaciones farmaceuticas. La naturaleza de las composiciones farmaceuticas y los metodos para formularlas pueden variar en funcion de numerosos factores, tales como la ruta a traves de la cual se desea efectuar la administracion, la extension de la enfermedad o la dosis que se desea administrar.

Un compuesto antisentido dirigido a un acido nucleico STAT3 puede formularse en composiciones farmaceuticas combinandolo con un diluyente o un vehnculo farmaceuticamente aceptable. Un diluyente farmaceuticamente aceptable puede ser la solucion salina amortiguada con fosfato (PBS). La PBS es un diluyente apropiado para usar en aquellas composiciones que han de administrarse por vfa parenteral. Por lo tanto, en una forma de realizacion, en los metodos que se describen en la presente puede emplearse una composicion farmaceutica que comprende un compuesto antisentido dirigido a un acido nucleico STAT3 y un diluyente farmaceuticamente aceptable. En determinadas formas de realizacion, el diluyente farmaceuticamente aceptable es la PBS. En determinadas formas de realizacion, el compuesto antisentido es un oligonucleotido antisentido.

Las composiciones farmaceuticas que comprendan los compuestos antisentido tambien podran comprender sales, esteres o sales de esteres de dichos compuestos, o bien cualquier otro oligonucleotido que, al administrarlo en un animal, tal como un ser humano, de como resultado (de manera directa o indirecta) un metabolito con actividad biologica o un residuo de este. En este contexto, dentro del alcance de la presente invencion tambien se incluyen las sales de los compuestos antisentido que se describen en la presente, las prodrogas de dichos compuestos, las sales farmaceuticamente aceptables de dichas prodrogas y otros equivalentes biologicos. Las sales farmaceuticamente aceptables apropiadas incluyen, sin limitaciones, las sales de sodio y las sales de potasio.

Una prodroga puede comprender un compuesto antisentido inactivo con nucleosidos adicionales en uno de sus extremos o en ambos, donde dichos nucleosidos adicionales pueden ser escindidos por las nucleasas endogenas en el cuerpo para formar un compuesto antisentido activo.

COMPUESTOS ANTISENTIDO CONJUGADOS

Los compuestos antisentido pueden unirse a traves de enlaces covalentes a una o mas unidades o pueden combinarse con grupos conjugados espedficos para incrementar su actividad o para mejorar su distribucion en las celulas o su captacion por parte de las celulas. Los grupos conjugados tfpicos incluyen las unidades a base de colesterol y las unidades lipfdicas. Otros grupos conjugados incluyen los hidratos de carbono, los fosfolfpidos, la biotina, la fenazina, el folato, la fenantridina, la antraquinona, la acridina, las fluorescemas, las rodaminas, las cumarinas y los colorantes.

En uno de los extremos de los compuestos antisentido, o en ambos, tambien pueden introducirse grupos estabilizadores espedficos para mejorar propiedades como la estabilidad ante las nucleasas. Entre los grupos que pueden introducirse, pueden mencionarse las estructuras de recubrimiento. Estas modificaciones que se realizan en los extremos de los compuestos antisentido pueden ser utiles para proteger los nucleotidos que se encuentran en dichos extremos de la degradacion por parte de las exonucleasas y para mejorar la distribucion y/o la localizacion de los compuestos en las celulas. Las estructuras de recubrimiento pueden estar presentes en el extremo 5' (en cuyo caso puede conocerselas como recubrimientos 5') y/o en el extremo 3' (en cuyo caso puede conocerselas como recubrimientos 3'). Las estructuras de recubrimiento son conocidas en la tecnica e incluyen, por ejemplo, las estructuras de recubrimiento abasicas invertidas que comprenden unidades de desoxilo. Otros grupos estabilizadores que pueden introducirse como estructuras de recubrimiento en los extremos 3' y 5' de los compuestos antisentido para incrementar su estabilidad ante las nucleasas incluyen los que se describen en WO 03/004602, que fue publicada el 16 de enero de 2003.

CULTIVO DE LAS CELULAS Y TRATAMIENTOS CON LOS COMPUESTOS ANTISENTIDO

Los efectos que presentan los compuestos antisentido sobre el nivel, la actividad o la expresion de los acidos nucleicos STAT3 pueden analizarse en diversos tipos de celulas in vitro. En este contexto, los tipos de celulas que pueden usarse en los analisis que se han descripto pueden obtenerse en proveedores comerciales como la Coleccion Americana de Tipos de Cultivo, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC, o Clonetics Corporation, Walkersville, MD. Las celulas pueden cultivarse de acuerdo con las instrucciones de los proveedores, mediante el uso de reactivos disponibles comercialmente (que por ejemplo, pueden adquirirse en Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Entre los tipos de celulas que pueden usarse, pueden mencionarse, sin limitaciones, las celulas HuVEC, las celulas b.END, las celulas HepG2, las celulas Hep3B y los hepatocitos primarios.

ANALISIS DE LOS OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENTIDO IN VITRO

En la presente se describen metodos con los que pueden tratarse las celulas con los oligonucleotidos antisentido, los cuales tambien pueden someterse a modificaciones apropiadas para efectuar un tratamiento con otros compuestos antisentido.

En este contexto, las celulas pueden tratarse con los oligonucleotidos antisentido cuando presentan una confluencia de aproximadamente 60-80% en el cultivo.

Un reactivo que suele emplearse para introducir los oligonucleotidos antisentido en las celulas en los cultivos es el reactivo para transfectar lfpidos cationicos que se conoce como Lipofectin (de Invitrogen, Carlsbad, CA). De esta manera, los oligonucleotidos antisentido pueden combinarse con la Lipofectin en un medio Opti-Mem 1 (de Invitrogen, Carlsbad, CA) de manera tal de alcanzar la concentracion final deseada, donde la concentracion de la Lipofectin puede variar entre 2 y 12 pg/ml por cada 100 nmol/litro del oligonucleotido antisentido.

Otro reactivo que puede usarse para introducir los oligonucleotidos antisentido en las celulas en los cultivos es la Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA). De esta manera, los oligonucleotidos antisentido pueden combinarse con la Lipofectamine en un medio con un contenido reducido de suero, tal como el medio Opti-Mem 1 (de Invitrogen, Carlsbad, CA), de manera tal de alcanzar la concentracion final deseada, donde la concentracion de la Lipofectamine puede variar entre 2 y 12 pg/ml por cada 100 nmol/litro del oligonucleotido antisentido.

Otro procedimiento que puede usarse para introducir los oligonucleotidos antisentido en las celulas cultivadas es la electroporacion.

Las celulas pueden tratarse con los oligonucleotidos antisentido de acuerdo con metodos de rutina. En este contexto, las celulas pueden cosecharse 16-24 horas despues de tratarlas con los oligonucleotidos antisentido para determinar el nivel de las protemas o el ARN deseado con metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, segun se describe en la presente. En general, cuando los tratamientos se llevan a cabo en multiples replicas, los resultados pueden presentarse como el promedio de las diversas replicas.

La concentracion que se emplea de los oligonucleotidos antisentido puede variar en funcion de la lmea de celulas usada. En la tecnica se conocen metodos apropiados para determinar la concentracion optima de los oligonucleotidos antisentido para diversas lmeas de celulas. En este contexto, los oligonucleotidos antisentido suelen usarse en una concentracion que vana entre 1 nM y 300 nM cuando se realiza una transfeccion con Lipofectamine. Por otro lado, cuando se realiza una transfeccion basada en una electroporacion, los oligonucleotidos antisentido suelen usarse en una concentracion mas elevada, por ejemplo, de entre 625 y 20000 nM.

ANALISIS BASADOS EN LA CAPTACION LIBRE

En determinadas formas de realizacion, puede usarse la actividad independiente de la transfeccion (es decir, en el contexto de una captacion libre) de los oligonucleotidos antisentido en lmeas de celulas cancerosas como una indicacion de su potencia. La captacion libre de los compuestos puede determinarse en lmeas de celulas cancerosas como las celulas SK-BR-3, las celulas U251-MG, las celulas MDA-MB-231, las celulas H460, las celulas A431, las celulas colo205, las celulas SNB-19, las celulas SK-OV3, las celulas de cancer de pulmon H1993, las celulas de cancer de pulmon H358, las celulas de cancer de pulmon PC-9, las celulas de cancer de pulmon KHM-35, las celulas de cancer de pancreas Capan-1, las celulas de cancer de pancreas HPAF-11 o las celulas de cancer colorrectal Colo 201.

En los analisis basados en la captacion libre, los oligonucleotidos antisentido se introducen en las celulas sin la ayuda de un agente de transfeccion o de un procedimiento de electroporacion. En este contexto, se aplican los oligonucleotidos antisentido sobre las celulas en una o mas dosis y se determina el porcentaje de inhibicion de la expresion del ARNm o la protema blanco. Cuando se administran multiples dosis, puede determinarse la IC50. En determinadas formas de realizacion, se prefieren los oligonucleotidos antisentido que presentan una potencia alta, lo cual puede determinarse sobre la base del porcentaje de inhibicion del blanco, despues de administrar una o varias dosis, sobre los oligonucleotidos antisentido que presentan una potencia baja, ya que es mas probable que los oligonucleotidos antisentido que se caractericen por una potencia elevada in vitro presenten una potencia apropiada in vivo.

AISLAMIENTO DEL ARN

El estudio del ARN puede basarse en un analisis del ARN total de las celulas o del ARNm poli(A)+. Los metodos para aislar el ARN han de resultar conocidos para aquellos versados en la tecnica, asf como los metodos para preparar el ARN. A modo de ejemplo, puede recurrirse al uso del reactivo Trizol (de Invitrogen, Carlsbad, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

ANALISIS DE LA INHIBICION DEL NIVEL O LA EXPRESION DEL BLANCO

La inhibicion del nivel o la expresion de un acido nucleico STAT3 puede analizarse con diversos procedimientos conocidos en la tecnica. A modo de ejemplo, el nivel del acido nucleico blanco puede cuantificarse, por ejemplo, por medio de un analisis de transferencia Northern, sobre la base de una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) competitiva o con una PCR cuantitativa en tiempo real. Segun se ha indicado, el estudio del ARN puede basarse en un analisis del ARN total de las celulas o del ARNm poli(A)+, y los metodos para aislar el ARN han de resultar conocidos para aquellos versados en la tecnica. El analisis de transferencia Northern tambien ha de resultar conocido para aquellos versados en la tecnica. La PCR cuantitativa en tiempo real puede ponerse en practica de manera conveniente con los sistemas comerciales para analizar secuencias ABI PRISM 7600, 7700 o 7900, de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, que pueden emplearse de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

ANALISIS DEL NIVEL DEL ARN BLANCO POR MEDIO DE UNA PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL

El nivel del ARN blanco puede cuantificarse sobre la base de una PCR cuantitativa en tiempo real, por ejemplo, mediante el uso de un sistema para analizar secuencias ABI PRISM 7600, 7700 o 7900 (de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En la tecnica se conocen metodos para poner en practica la PCR cuantitativa en tiempo real.

Antes de llevar a cabo una PCR en tiempo real, el ARN aislado es sometido a una reaccion con una transcriptasa inversa (RT), con lo que puede producirse un ADN complementario (ADNc), que posteriormente puede usarse como sustrato en la amplificacion basada en la PCR en tiempo real. La reaccion con la RT y la PCR en tiempo real pueden llevarse a cabo de manera consecutiva, en una misma cavidad, y los reactivos correspondientes pueden adquirirse en Invitrogen (Carlsbad, CA). En general, la reaccion con la RT y la PCR en tiempo real pueden ponerse en practica con metodos bien conocidos por aquellos versados en la tecnica.

La cantidad del gen (o el ARN) blanco que se determina en la PCR en tiempo real suele normalizarse en funcion del nivel de expresion de un gen que presenta una expresion constante, tal como el gen que codifica la ciclofilina A. Como alternativa, es posible realizar una cuantificacion del ARN total con el reactivo Ribogreen (de Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA), segun se describe en Jones, L. J., et al., Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374, donde la fluorescencia obtenida puede determinarse con un instrumento Cytofluor 4000 (de PE Applied Biosystems). La expresion del gen que codifica la ciclofilina A puede cuantificarse sobre la base de una PCR en tiempo real, de manera simultanea con el analisis del blanco o por separado, en una unidad o en varias replicas.

En todos los procedimientos que se han descripto, suelen emplearse cebadores y sondas que pueden hibridar con los acidos nucleicos STAT3. En la tecnica se conocen diversos metodos para disenar cebadores y sondas apropiados para poner en practica una PCR en tiempo real, que pueden incluir el uso de un software como Primer Express (de Applied Biosystems, Foster City, CA).

ANALISIS DEL NIVEL DE LAS PROTEINAS

La inhibicion antisentido de los acidos nucleicos STAT3 puede evaluarse determinando el nivel de las protemas STAT3, para lo cual puede recurrirse a diversos procedimientos bien conocidos en la tecnica, tales como la inmunoprecipitacion, los analisis de transferencia Western (la inmunotransferencia), los analisis inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA), los analisis cuantitativos de las protemas, los analisis de la actividad de las protemas (por ejemplo, el analisis de la actividad de la caspasa), los procedimientos inmunohistoqmmicos, los procedimientos inmunocitoqmmicos o la clasificacion de las celulas activadas por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos al blanco pueden identificarse y obtenerse a partir de diversas fuentes, tales como el catalogo de anticuerpos MSRS (de Aerie Corporation, Birmingham, MI), o bien pueden elaborarse con metodos convencionales para generar anticuerpos monoclonales o policlonales, que han de resultar conocidos para aquellos versados en la tecnica. Los anticuerpos utiles para detectar las protemas STAT3 de raton, de rata, de mono y humanas se encuentran disponibles comercialmente.

ANALISIS DE LOS COMPUESTOS ANTISENTIDO IN VIVO

Los compuestos antisentido, por ejemplo, los oligonucleotidos antisentido, pueden analizarse en animales para determinar su capacidad de inhibir la expresion de STAT3 y de producir cambios en el fenotipo, por ejemplo, una disminucion en la velocidad de crecimiento de las celulas, una mejora de los smtomas asociados al cancer, una reduccion de la caquexia o una disminucion en el nivel de los indicadores del cancer. El analisis podra llevarse a cabo en animales normales o en animales que sirvan como modelos experimentales de diversas enfermedades. Para administrarselos a los animales, los oligonucleotidos antisentido pueden formularse en un diluyente farmaceuticamente aceptable, tal como la solucion salina amortiguada con fosfato. La administracion puede efectuarse por vfa parenteral, por ejemplo, por vfa intraperitoneal, intravenosa, subcutanea, intratecal o intracerebroventricular. Aquellos versados en la tecnica han de poder determinar facilmente la dosis de los oligonucleotidos antisentido y la frecuencia de su administracion, en funcion de factores como la ruta seleccionada para la administracion o el peso corporal del animal. Despues de un penodo de tratamiento con los oligonucleotidos antisentido, puede aislarse ARN a partir del tejido hepatico para analizar los cambios en la expresion de los acidos nucleicos STAT3. Tambien pueden analizarse los cambios en el nivel de las protemas STAT3.

En determinadas formas de realizacion, puede recurrirse al uso de modelos basados en el xenoinjerto de tumores para analizar el efecto de los oligonucleotidos antisentido sobre el crecimiento de los tumores o sobre sus metastasis. En los modelos basados en xenoinjertos que se describen en la presente, se inoculan celulas pertenecientes a una lmea cancerosa en un animal. Las lmeas que pueden usarse incluyen, por ejemplo, las celulas de cancer de mama humano MDA-MB-231, las celulas de cancer epidermoide humano A431, las celulas de tumores provenientes de gliomas humanos U251 y las celulas de carcinoma de celulas pulmonares no pequenas humano NCI-H460. Los compuestos que se describen en la presente, que pueden usarse en los modelos basados en xenoinjertos que se describen en la presente, pueden estar dirigidos a acidos nucleicos STAT3 humanos, de raton, de rata y/o de mono. Algunos de los compuestos que se describen en la presente, que pueden usarse en los modelos basados en xenoinjertos que se describen en la presente, pueden presentar una reaccion transversal con acidos nucleicos STAT3 de una o mas especies. En determinadas formas de realizacion, los compuestos que se describen en la presente, que pueden usarse en los modelos basados en xenoinjertos que se describen en la presente, pueden ser inhibidores mas potentes del crecimiento de los tumores y pueden provocar una disminucion mas importante en el volumen de los tumores que lo que podna esperarse en funcion de los datos disponibles que se han obtenido en ausencia de una inhibicion de STAT3, debido a la falta de reactividad transversal.

INDICACIONES

En determinadas formas de realizacion, en la presente se proveen metodos, compuestos y composiciones farmaceuticas que son utiles en determinados metodos de tratamiento, particularmente en el tratamiento de aquellos individuos que padecen enfermedades hiperproliferativas. En determinadas formas de realizacion, la enfermedad hiperproliferativa es un cancer, por ejemplo, un carcinoma, un sarcoma, un linfoma, una leucemia o un tumor maligno asociado o una metastasis de cualquiera de ellos. En determinadas formas de realizacion, el cancer es un cancer de pulmon, tal como el cancer de las celulas pulmonares no pequenas (NSCLC), un cancer de pancreas, un cancer colorrectal, un mieloma multiple, un carcinoma hepatocelular (HCC), un glioblastoma, un cancer de ovario, un osteosarcoma, un cancer de cabeza y cuello, un cancer de mama, un carcinoma epidermoide, un adenoma intestinal, un cancer de prostata o un cancer gastrico. En determinadas formas de realizacion, los individuos se encuentran en riesgo de desarrollar una enfermedad hiperproliferativa, que puede ser un cancer, por ejemplo, un carcinoma, un sarcoma, un linfoma, una leucemia o un tumor maligno asociado o una metastasis de cualquiera de ellos. Estos individuos pueden presentar uno o mas factores de riesgo asociados al desarrollo de una enfermedad hiperproliferativa, tales como una edad avanzada, un historial de uso de tabaco, una exposicion excesiva a la luz solar o a la radiacion ionizante, un contacto con determinadas sustancias qmmicas, una infeccion con determinados virus o con determinadas bacterias, un historial de determinadas terapias hormonales, una predisposicion genetica, un historial de uso de alcohol o determinados factores de riesgo asociados al estilo de vida, como puede ser el caso de una dieta pobre, un historial de poca actividad ffsica y/o un historial de sobrepeso. En determinadas formas de realizacion, los individuos son individuos de los que se ha determinado que necesitan un tratamiento para una enfermedad hiperproliferativa. En determinadas formas de realizacion, se proveen metodos con los que puede disminuirse de manera profilactica la expresion de STAT3 en un individuo. En determinadas formas de realizacion, el tratamiento de los individuos que lo necesitan esta basado en la administracion de una cantidad eficaz para el uso terapeutico de un compuesto antisentido dirigido a un acido nucleico STAT3.

En determinadas formas de realizacion, el tratamiento con los metodos, los compuestos y las composiciones que se describen en la presente es util para prevenir las metastasis de un cancer asociado a la regulacion positiva de determinados genes, tales como STAT3, en la interfase entre los huesos. En determinadas formas de realizacion, el tratamiento con los metodos, los compuestos y las composiciones que se describen en la presente es util para prevenir el desarrollo de metastasis de un cancer hasta los huesos. En determinadas formas de realizacion, el tratamiento con los metodos, los compuestos y las composiciones que se describen en la presente es util para prevenir el desarrollo de metastasis desde un carcinoma de las celulas renales, un cancer de mama, un carcinoma de las celulas pulmonares no pequenas o un cancer de prostata hasta los huesos.

En una forma de realizacion, la administracion de una cantidad eficaz para el uso terapeutico de un compuesto antisentido dirigido a un acido nucleico STAT3 esta acompanada por el monitoreo del nivel de STAT3 en el suero de un individuo, con lo que puede determinarse la respuesta del individuo a la administracion del compuesto antisentido. A su vez, la respuesta del individuo a la administracion del compuesto antisentido puede ser usada por un medico para determinar la magnitud y la duracion de la intervencion terapeutica.

En determinadas formas de realizacion, la administracion de un compuesto antisentido dirigido a un acido nucleico STAT3 da como resultado una disminucion en la expresion de STAT3 de al menos 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99%, o de cualquier rango intermedio definido por dos de estos valores. En determinadas formas de realizacion, la administracion de un compuesto antisentido dirigido a un acido nucleico STAT3 da como resultado una disminucion en el crecimiento de las celulas, una disminucion en el crecimiento de los tumores, una disminucion en el tamano de los tumores, una mejora en los smtomas asociados a un cancer o una disminucion en el nivel de los indicadores de un cancer. En determinadas formas de realizacion, la administracion de un compuesto antisentido dirigido a STAT3 da como resultado una disminucion en el crecimiento de las celulas, en el crecimiento de los tumores o en el tamano de los tumores de al menos 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99%, o de cualquier rango intermedio definido por dos de estos valores.

En determinadas formas de realizacion, las composiciones farmaceuticas que comprenden un compuesto antisentido dirigido a STAT3 se usan para elaborar medicamentos utiles para tratar aquellos pacientes que padecen enfermedades hiperproliferativas o que se encuentran en riesgo de contraerlas.

TERAPIAS COMBINADAS

En determinadas formas de realizacion, se administran una o mas composiciones farmaceuticas como las que se describen en la presente de manera concurrente con uno o mas agentes farmaceuticos adicionales. En determinadas formas de realizacion, estos uno o mas agentes farmaceuticos adicionales son utiles para tratar las mismas enfermedades, los mismos trastornos o las mismas afecciones que las una o mas composiciones farmaceuticas que se describen en la presente. En determinadas formas de realizacion, estos uno o mas agentes farmaceuticos adicionales son utiles para tratar enfermedades, trastornos o afecciones diferentes de las enfermedades, los trastornos o las afecciones que pueden tratarse con las una o mas composiciones farmaceuticas que se describen en la presente. En determinadas formas de realizacion, estos uno o mas agentes farmaceuticos adicionales son utiles para tratar los efectos colaterales indeseables de las una o mas composiciones farmaceuticas que se describen en la presente. En determinadas formas de realizacion, se administran una o mas composiciones farmaceuticas como las que se describen en la presente de manera concurrente con otros agentes farmaceuticos que son utiles para tratar los efectos indeseables de otros agentes farmaceuticos diferentes. En determinadas formas de realizacion, se administran una o mas composiciones farmaceuticas como las que se describen en la presente de manera concurrente con otros agentes farmaceuticos que son utiles para obtener efectos combinados. En determinadas formas de realizacion, se administran una o mas composiciones farmaceuticas como las que se describen en la presente de manera concurrente con otros agentes farmaceuticos que son utiles para obtener efectos sinergicos.

En determinadas formas de realizacion, las una o mas composiciones farmaceuticas como las que se describen en la presente se administran de manera simultanea con los uno o mas agentes farmaceuticos adicionales. En determinadas formas de realizacion, las una o mas composiciones farmaceuticas como las que se describen en la presente y los uno o mas agentes farmaceuticos adicionales se administran en momentos diferentes. En determinadas formas de realizacion, las una o mas composiciones farmaceuticas como las que se describen en la presente y los uno o mas agentes farmaceuticos adicionales se preparan en una unica formulacion. En determinadas formas de realizacion, las una o mas composiciones farmaceuticas como las que se describen en la presente y los uno o mas agentes farmaceuticos adicionales se preparan por separado. En determinadas formas de realizacion, los ejemplos de estos uno o mas agentes farmaceuticos adicionales incluyen el acido retinoico completamente trans, la azacitidina, la azatioprina, la bleomicina, el carboplatino, la capecitabina, el cisplatino, el clorambucil, la ciclofosfamida, la citarabina, la daunorrubicina, el docetaxel, la doxifluridina, la doxorrubicina, la epirrubicina, la epotilona, el etoposido, el fluorouracilo, la gemcitabina, la hidroxiurea, la idarrubicina, el imatinib, la mecloretamina, la mercaptopurina, el metotrexato, la mitoxantrona, el oxaliplatino, el paclitaxel, el pemetrexed, el teniposido, la tioguanina, la valrrubicina, la vinblastina, la vincristina, la vindesina y la vinorelbina. En determinadas formas de realizacion, los uno o mas agentes farmaceuticos adicionales pueden ser otros oligonucleotidos antisentido. En determinadas formas de realizacion, los otros oligonucleotidos antisentido tambien pueden ser oligonucleotidos antisentido dirigidos a STAT3.

En determinadas formas de realizacion, los uno o mas agentes farmaceuticos adicionales pueden tomar la forma de terapias moleculares guiadas. En determinadas formas de realizacion, la terapia molecular guiada se basa en el uso de un inhibidor del EGFR, de un inhibidor de mTOR, de un inhibidor de HER2 o de un inhibidor del VEGF/VEGFR. En determinadas formas de realizacion, los inhibidores del EGFR incluyen el gefitinib, el erlotinib, el lapatinib, el cetuximab y el panitumumab. En determinadas formas de realizacion, los inhibidores de mTOR incluyen el everolimus y el temsirolimus. En determinadas formas de realizacion, los inhibidores de HER2 incluyen el trastuzumab y el lapatinib. En determinadas formas de realizacion, los inhibidores del VEGF/VEGFR incluyen el pazopanib, el bevacizumab, el sunitinib y el sorafenib.

En determinadas formas de realizacion, se administran una o mas composiciones farmaceuticas como las que se describen en la presente con una terapia con radiacion. En determinadas formas de realizacion, se administran una o mas composiciones farmaceuticas de manera simultanea con una terapia con radiacion. En determinadas formas de realizacion, se administran una o mas composiciones farmaceuticas antes de aplicar una terapia con radiacion. En determinadas formas de realizacion, se administran una o mas composiciones farmaceuticas despues de aplicar una terapia con radiacion. En determinadas formas de realizacion, se administran una o mas composiciones farmaceuticas en diversos puntos de tiempo durante el transcurso de un regimen terapeutico con radiacion.

En determinadas formas de realizacion, la terapia con radiacion es util para inhibir el crecimiento de los tumores.

En determinadas formas de realizacion, la terapia con radiacion es util para incrementar la supervivencia en general. En determinadas formas de realizacion, la aplicacion de una terapia con radiacion en combinacion con la administracion de uno o mas farmacos como los que se describen en la presente resulta mas ventajosa que cualquiera de estos dos tratamientos por separado, debido a que cuando se los combina es posible limitar tanto la terapia con radiacion como la administracion de los uno o mas farmacos para disminuir su toxicidad, sin que se vea afectada la respuesta antiproliferativa final.

En determinadas formas de realizacion, el regimen terapeutico, que puede estar basado en la aplicacion de una terapia con radiacion y la administracion de una o mas composiciones farmaceuticas como las que se describen en la presente, es determinado por un medico. En determinadas formas de realizacion, el regimen terapeutico, que puede estar basado en la aplicacion de una terapia con radiacion, la administracion de una o mas composiciones farmaceuticas como las que se describen en la presente y la administracion de uno o mas agentes quimioterapeuticos adicionales, es determinado por un medico.

TOLERABILIDAD

En determinadas formas de realizacion, los compuestos que se describen en la presente presentan efectos colaterales mmimos. Los efectos colaterales son aquellas respuestas que tfpicamente no estan relacionadas con el efecto sobre la expresion de STAT3 que se producen cuando se administran los compuestos antisentido de acuerdo con la invencion, como es el caso de las respuestas inflamatorias en los animales. En determinadas formas de realizacion, los compuestos pueden ser bien tolerados por los animales. Una tolerabilidad superior puede atribuirse a numerosos factores, tales como la secuencia de nucleotidos de los compuestos antisentido, las modificaciones qmmicas en los nucleotidos, los motivos particulares que forman los nucleosidos no modificados y los nucleosidos modificados en los compuestos antisentido o cualquier combinacion de los anteriores. La tolerabilidad propiamente dicha tambien puede depender de factores como el peso corporal, el peso de los organos, la funcion del hngado, la funcion de los rinones, el conteo de plaquetas o el conteo de leucocitos.

En determinadas formas de realizacion, los compuestos que se describen en la presente presentan un efecto mmimo sobre el peso de los organos. En determinadas formas de realizacion, los compuestos dan como resultado un incremento de menos de 7 veces, menos de 6 veces, menos de 5 veces, menos de 4 veces, menos de 3 veces o menos de 2 veces en el peso del bazo y/o del hngado, o directamente no provocan un incremento significativo.

En determinadas formas de realizacion, los compuestos que se describen en la presente presentan un efecto mmimo sobre la funcion del hngado. Los factores en los que puede basarse el analisis de la funcion del hngado incluyen el nivel de ALT, el nivel de AST, el nivel de la bilirrubina en el plasma y el nivel de la albumina en el plasma. En determinadas formas de realizacion los compuestos que se describen en la presente dan como resultado un incremento de menos de 7 veces, menos de 6 veces, menos de 5 veces, menos de 4 veces, menos de 3 veces o menos de 2 veces en el nivel de ALT o de AST, o directamente no provocan un incremento significativo. En determinadas formas de realizacion los compuestos que se describen en la presente dan como resultado un incremento de menos de 3 veces o menos de 2 veces en el nivel de la bilirrubina en el plasma, o directamente no provocan un incremento significativo.

En determinadas formas de realizacion, los compuestos que se describen en la presente presentan un efecto mmimo sobre la funcion de los rinones. En determinadas formas de realizacion, los compuestos que se describen en la presente dan como resultado un incremento de menos de 3 veces o menos de 2 veces en la concentracion del nitrogeno proveniente de la urea en la sangre (BUN), o directamente no provocan un incremento significativo. En determinadas formas de realizacion, los compuestos que se describen en la presente dan como resultado un incremento de menos de 6 veces, menos de 5 veces, menos de 4 veces, menos de 3 veces o menos de 2 veces en la proporcion entre las protemas y la creatinina en la orina, o directamente no provocan un incremento significativo.

En determinadas formas de realizacion, los compuestos que se describen en la presente presentan un efecto mmimo sobre los factores hematologicos. En determinadas formas de realizacion, los compuestos que se describen en la presente dan como resultado una disminucion inferior a 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% o 5% en el conteo de plaquetas. En determinadas formas de realizacion, los compuestos que se describen en la presente dan como resultado una disminucion de menos de 4 veces, menos de 3 veces, menos de 2 veces en el conteo de monocitos, o directamente no provocan una disminucion significativa.

En determinadas formas de realizacion, los compuestos tambien presentan una farmacocinetica favorable. En determinadas formas de realizacion, los compuestos antisentido presentan vidas medias relativamente prolongadas en los fluidos o los tejidos biologicos relevantes.

En determinadas formas de realizacion, los compuestos o las composiciones que los comprenden tambien presentan una viscosidad favorable. En determinadas formas de realizacion, la viscosidad de los compuestos o de las composiciones que los comprenden en una concentracion de 165-185 mg/ml no supera los 40cP.

En otras formas de realizacion, los compuestos presentan una combinacion de las caractensticas que se enumeraron con anterioridad y tambien dan como resultado una disminucion altamente eficiente en la expresion del ARNm de STAT3 en un modelo basado en animales.

Ejemplos

DIVULGACION NO LIMITANTE E INCORPORACION POR REFERENCIA

Mientras que ciertos compuestos, composiciones y metodos que se describen en la presente se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas formas de realizacion, los siguientes ejemplos sirven solo para ilustrar los compuestos que se describen en la presente y no pretenden limitar a los mismos.

EJEMPLO 1: INHIBICION POR ANTISENTIDO DE STAT3 HUMANA EN CELULAS HUVEC

Se disenaron oligonucleotidos antisentido contra un acido nucleico de STAT3 humana y se probaron para su efecto sobre la expresion del ARNm de STAT3 humana in vitro. Los oligonucleotidos antisentido quimericos que se presentan en las Tablas 1 y 2 se disenaron ya sea como gapmeros cEt 2-10-2 o bien como gapmeros cEt 3­ 10-3. Los gapmeros cEt 2-10-2 son de 14 nucleotidos de longitud, en donde el segmento espaciador central comprende diez 2'-desoxinucleosidos y esta flanqueado a ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por extensiones que comprenden dos nucleosidos cada una. Los gapmeros cEt 3-10-3 tienen 16 nucleosidos de longitud, en donde el segmento espaciador central comprende diez 2'-desoxinucleosidos y esta flanqueado a ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por extensiones que comprenden tres nucleosidos cada una. Cada nucleosido en el segmento extension 5' y cada nucleosido en el segmento extension 3' tiene una modificacion de azucar de cEt. Las uniones internucleosfdicas a lo largo de cada gapmero son uniones fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmero son 5-metilcitosinas.

Se comparo la potencia de los gapmeros cEt con ISIS 337332, ISIS 337333, e ISIS 345785, que son gapmeros MOE 5-10-5 contra STAT3 humana y que se describen adicionalmente en USPN 7,307,069.

Las celulas HuVEC cultivadas a una densidad de 20,000 celulas por pocillo se transfectaron usando electroporacion con 1,000 nM de oligonucleotido antisentido. Despues de un periodo de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de cebadores y sonda para humano RTS199 (secuencia directa ACATGCCACTTTGGTGTTTCATAA, designada en la presente como SEQ ID N° 6; secuencia reversa TCTTCGTAGATTGTGCTGATAGAGAAC, designada en la presente como SEQ ID N° 7; secuencia de sonda CAGTATAGCCGCTTCCTGCAAGAGTCGAA, designada en la presente como SEQ ID N° 8) se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar. Todos los gapmeros cEt y gapmeros MOE se probaron bajo las mismas condiciones. “Sitio de inicio de blanco en humano” indica el nucleosido ubicado mas hacia 5' contra el que esta dirigido el gapmero en la secuencia genica humana. “Sitio de finalizacion de blanco en humano” indica el nucleosido ubicado mas hacia 3' contra el que esta dirigido el gapmero en la secuencia genica humana. Cada gapmero que se lista en la Tabla 1 se dirige contra el ARNm de STAT3 humana, designada en la presente como s Eq ID N° 1 (No. de Acceso a GENBANK NM_139276.2). Cada gapmero que se lista en la Tabla 2 se dirige contra la secuencia genomica de STAT3 humana, designada en la presente como SEQ ID N° 2 (el complemento del No. de Acceso a GENBANK NT_010755.14 truncado entre los nucleotidos 4185000 y 4264000).

EJEMPLO 2: INHIBICION POR ANTISENTIDO DE STAT3 MURINA EN CELULAS B.END

Los oligonucleotidos antisentido que se probaron en el estudio que se describe en el Ejemplo 1 tambien se probaron para sus efectos sobre el ARNm de STAT3 en celulas b.END. Las celulas b.END cultivadas a una densidad de 20,000 celulas por pocillo se transfectaron usando electroporacion con 7,000 nM de oligonucleotido antisentido. Despues de un periodo de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de cebadores y sonda para murino RTS2381 (secuencia directa GCCACGTTGGTGTTTCATAATCT, designada en la presente como SEQ ID N° 465; secuencia reversa GATAGAGGACATTGGACTCTTGCA, designada en la presente como SEQ ID N° 466; secuencia de sonda TTGGGTGAAATTGACCAGCAATATAGCCG, designada en la presente como SEQ ID N° 467) se uso para medir el ARN. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®.

Ciertas secuencias complementarias a la secuencia genica murina de STAT3 mostraron buena inhibicion en las celulas b.END. Los resultados se presentan en la Tabla 3 como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar. Los oligonucleotidos humanos en la Tabla 3 se compararon con la secuencia genomica de la STAT-3 de raton, designada en la presente como SEQ ID N° 3 (el complemento del No. de Acceso a GENBANK NT_165773.2 truncado entre los nucleotidos 12286001 y 12344000). “Sitio de inicio de blanco de raton” indica el nucleotido ubicado mas hacia 5' contra el que esta dirigido el gapmero en la secuencia murina. “Sitio de finalizacion de blanco de raton” indica el nucleotido ubicado mas hacia 3' contra el que esta dirigido el gapmero en la secuencia murina.

TABLA 3

Niveles de inhibicion del ARNm de STAT3 humana por ciertos oligonucleotidos antisentido quimericos cEt complementarios a SEQ ID N° 1 y SEQ ID N° 3

EJEMPLO 3: TOLERABILIDAD DE OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENTIDO CONTRA STAT3 EN

RATONES BALB/C

Cuarenta oligonucleotidos antisentido que exhiben un alto nivel de potencia, seleccionados de entre los 452 compuestos que se evaluaron en el Ejemplo 1, se probaron adicionalmente para tolerabilidad in vivo.

Se inyectaron grupos de entre 2 y 4 ratones BALB/c machos por via subcutanea dos veces por semana durante 3 semanas con 25 mg/kg de oligonucleotidos antisentido ISIS. Un grupo de 4 ratones BALB/c machos se inyecto por via subcutanea dos veces por semana durante 3 semanas con PBS. Este grupo de ratones se utilizo como grupo control contra el que se compararon los grupos de tratamiento. Un dia despues de la ultima dosis, se tomaron los pesos corporales, se sacrificaron los ratones, y se colectaron los organos y el plasma para analisis adicionales.

Los pesos corporales de los ratones se midieron antes de las dosis y al final del periodo de tratamiento. Se calculo el porcentaje de incremento por sobre el peso corporal inicial. Se midieron los pesos de higado, bazo, y rinon al final del estudio y se compararon con los ratones tratados con PBS.

Para evaluar el efecto de los oligonucleotidos ISIS sobre la funcion metabolica, se midieron las concentraciones plasmaticas de transaminasas y BUN usando un analizador para quimica clmica automatico (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron las concentraciones plasmaticas de ALT (alanina transaminasa), AST (aspartato transaminasa), y BUN.

Entre los cuarenta oligonucleotidos antisentido probados, ciertos oligonucleotidos antisentido, incluyendo a ISIS 481374, ISIS 481390, ISIS 481420, ISIS 481431, ISIS 481453, ISIS 481464, ISIS 481475, ISIS 481495, ISIS 481500, ISIS 481501, ISIS 481525, ISIS 481548, ISIS 481549, ISIS 481597, ISIS 481695, ISIS 481700, ISIS 481702, ISIS 481710, ISIS 481725, ISIS 481750, y ISIS 481763 cumplieron con los umbrales de tolerabilidad para peso corporal, peso de organos, ALT, AST, y parametros BUN.

EJEMPLO 4: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE STAT3 HUMANA EN CELULAS HUVEC

Los gapmeros de los Ejemplos 1 y 2 que exhiben inhibicion in vitro significativa de STAT3 se probaron a diferentes dosis en celulas HuVEC. Se plaquearon las celulas a una densidad de 20,000 celulas por pocillo y se transfectaron usando electroporacion con concentraciones de 31.25 nM, 62.5 nM, 125 nM, 250 nM, 500 nM, y 1,0000 nM de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 4. Despues de un periodo de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS199 (secuencia directa ACATGCCACTTTGGTGTTTCATAA, designada en la presente como SEQ ID N° 6; secuencia reversa TCTTCGTAGATTGTGCTGATAGAGAAC, designada en la presente como SEQ ID N° 7; secuencia de sonda CAGTATAGCCGCTTCCTGCAAGAGTCGAA, designada en la presente como SEQ ID N° 8) se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

La concentracion inhibitoria semimaxima (IC50) de cada oligonucleotido tambien se presenta en la Tabla 4 y se calculo mediante el grafico de las concentraciones de los oligonucleotidos usados versus el porcentaje de inhibicion de la expresion del ARNm de STAT3 conseguida para cada concentracion y registrando la concentracion de oligonucleotido a la que se consiguio el 50% de inhibicion de la expresion del ARNm de STAT3 en comparacion con el control. Como se ilustra en la Tabla 4, los niveles de ARNm de STAT3 se redujeron de forma significativa en una forma dependiente de la dosis en las celulas tratadas con oligonucleotidos antisentido.

TABLA 4

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de STAT3 humana en celulas HuVEC usando electroporacion

EJEMPLO 5: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE STAT3 DESPUES DE LA CAPTACION LIBRE DE OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO EN CELULAS SK-BR-3

Los gapmeros del Ejemplo 4 se probaron a diferentes dosis en celulas SK-BR-3. Se plaquearon las celulas a una densidad de 4,000 celulas por pocillo. Se incubaron las celulas con concentraciones de 0.02 |jM, 0.1 |jM, 0.5 |j M, 1 jiM, 2.5 jiM, y 10 |j M de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 5. Despues de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS199, que se describio previamente en la presente, se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

La concentracion inhibitoria semimaxima (IC50) de cada oligonucleotido tambien se presenta en la Tabla 5. Como se ilustra en la Tabla 5, la mayoria de los oligonucleotidos ISIS fueron capaces de penetrar la membrana celular y los niveles de ARNm de STAT3 se redujeron de forma significativa en una forma dependiente de la dosis en las celulas tratadas con oligonucleotidos antisentido.

TABLA 5

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de STAT3 humana mediante captacion libre de oligonucleotido ISIS por las celulas SK-BR-3

EJEMPLO 6: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE _ STAT3 DESPUES DE LA CAPTACION LIBRE DE OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO EN CELULAS

U251-MG

Los gapmeros del Ejemplo 5 se probaron adicionalmente a diferentes dosis en celulas U251-MG. Se plaquearon las celulas a una densidad de 4,000 celulas por pocillo. Se incubaron las celulas con concentraciones de 0.02 ^|jM, 0.1 ^|jM, 0.5 ^|jM, 1 ^|jM, 2.5 ^|jM, y 10 ^|jM de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 6. Despues de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS199, que se describio previamente en la presente, se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

La concentracion inhibitoria semimaxima (IC50) de cada oligonucleotido tambien se presenta en la Tabla 6. Como se ilustra en la Tabla 6, la mayoria de los oligonucleotidos ISIS fueron capaces de penetrar la membrana celular y los niveles de ARNm de STAT3 se redujeron de forma significativa en una forma dependiente de la dosis en las celulas tratadas con oligonucleotidos antisentido.

TABLA 6

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de STAT3 mediante captacion libre de oligonucleotido ISIS por las celulas U251-MG

EJEMPLO 7: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE STAT3 DESPUES DE LA CAPTACION LIBRE DE OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO EN CELULAS

U251-MG

Los ISIS 481464 e ISIS 481549, de los estudios que se describieron previamente, se probaron adicionalmente a diferentes dosis en celulas U251-MG. Se plaquearon las celulas a una densidad de 4,000 celulas por pocillo. Se incubaron las celulas con concentraciones de 0.1 ^|jM, 1 ^|jM, 5 ^|jM, 10 ^|jM, y 20 j M de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 7. Despues de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS199, que se describio previamente en la presente, se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

La concentracion inhibitoria semimaxima (IC50) de cada oligonucleotido tambien se presenta en la Tabla 7. Como se ilustra en la Tabla 7, ambos oligonucleotidos ISIS fueron capaces de penetrar la membrana celular.

TABLA 7

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de STAT3 mediante captacion libre de oligonucleotido ISIS por las celulas U251-MG

EJEMPLO 8: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE _ STAT3 DESPUES DE LA CAPTACION LIBRE DE OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO EN CELULAS MDA-MB-231

Se probaron los ISIS 481464 e ISIS 481549 adicionalmente a diferentes dosis en celulas MDA-MB-231. Se plaquearon las celulas a una densidad de 4,000 celulas por pocillo. Se incubaron las celulas con concentraciones de 0.02 ^|jM, 0.2 ^|jM, 1.0 ^|jM, 5.0 ^|jM, y 10.0 jⁱM de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 8. Despues de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS199, que se describio previamente en la presente, se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

La concentracion inhibitoria semimaxima (IC50) de cada oligonucleotido tambien se presenta en la Tabla 8. Como se ilustra en la Tabla 8, ambos oligonucleotidos ISIS fueron capaces de penetrar la membrana celular y reducir significativamente los niveles de ARNm de STAT3 en una forma dependiente de la dosis.

TABLA 8

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de STAT3 mediante captacion libre de oligonucleotido ISIS por celulas MDA-MB-231

EJEMPLO 9: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE _ STAT3 DESPUES DE LA CAPTACION LIBRE DE OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO EN CELULAS

A431

Se probaron adicionalmente los ISIS 481464 e ISIS 481549 a diferentes dosis en celulas A431. Se plaquearon las celulas a una densidad de 4,000 celulas por pocillo. Se incubaron las celulas con concentraciones de 0.02 jiM, 0.2 jiM, 1.0 jiM, 5.0 jiM, y 10.0 jiM de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 9. Despues de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS199, que se describio previamente en la presente, se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

La concentracion inhibitoria semimaxima (IC50) de cada oligonucleotido tambien se presenta en la Tabla 9. Como se ilustra en la Tabla 9, ambos oligonucleotidos ISIS fueron capaces de penetrar la membrana celular y reducir significativamente los niveles de ARNm de STAT3 en una forma dependiente de la dosis.

TABLA 9

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de STAT3 mediante captacion libre de oligonucleotido ISIS por las celulas A431

EJEMPLO 10: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE _ STAT3 DESPUES DE LA CAPTACION LIBRE DE OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO EN CELULAS

H460

Se probaron adicionalmente los ISIS 481464 e ISIS 481549 a diferentes dosis en celulas H460. Se plaquearon las celulas a una densidad de 4,000 celulas por pocillo. Se incubaron las celulas con concentraciones de 0.02 ^|jM, 0.2 ^|jM, 1.0 ^|jM, 5.0 ^|jM, y 10.0 jⁱM de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 10. Despues de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS199, que se describio previamente en la presente, se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

La concentracion inhibitoria semimaxima (IC50) de cada oligonucleotido tambien se presenta en la Tabla 10. Como se ilustra en la Tabla 10, ambos oligonucleotidos ISIS fueron capaces de penetrar la membrana celular y reducir significativamente los niveles de ARNm de STAT3 en una forma dependiente de la dosis.

TABLA 10

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de STAT3 mediante captacion libre de oligonucleotido ISIS por las celulas H460

EJEMPLO 11: INHIBICION POR ANTISENTIDO DE STAT3 HUMANA EN CELULAS HUVEC Se disenaron oligonucleotidos antisentido contra un acido nucleico de STAT3 humana y se probaron para su efecto sobre la expresion del ARNm de STAT3 humana in vitro. Las celulas HuVEC cultivadas a una densidad de 20,000 celulas por pocillo se transfectaron usando electroporacion con 1,000 nM de oligonucleotido antisentido. Despues de un periodo de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de cebadores y sonda para humano RTS199 (secuencia directa ACATGCCACTTTGGTGTTTCATAA, designada en la presente como SEQ ID N° 6; secuencia reversa TCTTCGTAGATTGTGCTGATAGAGAAC, designada en la presente como SEQ iD N° 7; secuencia de sonda CAGTATAGCCGCTTCCTGCAAGAGTCGAA, designada en la presente como SEQ ID N° 8) se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

Los oligonucleotidos antisentido quimericos en la Tabla 11 se disenaron como gapmeros 3-10-3 MOE, desoxi, y cEt. Los gapmeros tienen 16 nucleotidos de longitud, en donde el segmento espaciador central comprende diez 2'-desoxinucleosidos y esta flanqueado a ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por extensiones que comprenden tres nucleosidos cada una. Cada nucleosido en el segmento de extension 5' tiene una modificacion con azucar 2'-MOE. Cada nucleosido en el segmento de extension 3' tiene una modificacion con azucar cEt. Las uniones internucleosidicas a lo largo de cada gapmero son uniones fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmero son 5-metilcitosinas. La columna de la quimica de Tabla 11 presenta el motivo de azucar de cada gapmero, en donde 'e' indica un nucleosido 2'-MOE, 'k' indica un nucleosido de etilo (cEt) constrenido, y 'd' indica un 2'-desoxinude6sido.

“Sitio de inicio de blanco en humano” indica el nucle6sido ubicado mas hacia 5' contra el que esta dirigido el gapmero en la secuencia genica humana. “Sitio de finalizaci6n de blanco en humano” indica el nucle6sido ubicado mas hacia 3' contra el que esta dirigido el gapmero en la secuencia genica humana. Cada gapmero que se lista en la Tabla 11 se dirige contra el ARNm de STAT3 humana, designada en la presente como SEQ ID N° 1 (No. de Acceso a GENBANK NM_139276.2).

EJEMPLO 12: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE STAT3 HUMANA EN CELULAS HUVEC

Los gapmeros del estudio que se describe en el Ejemplo 11, previamente, que exhiben inhibicion in vitro significativa de STAT3 se probaron a diferentes dosis en celulas HuVEC. Se plaquearon las celulas a una densidad de 20,000 celulas por pocillo y se transfectaron usando electroporacion con concentraciones de 23.4375 nM, 93.75 nM, 375.0 nM, y 1,500.0 nM de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 12. Despues de un periodo de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS199, que se describio previamente en la presente, se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

La concentracion inhibitoria semimaxima (IC50) de cada oligonucleotido tambien se presenta en la Tabla 12 y se calculo mediante el grafico de las concentraciones de los oligonucleotidos usados versus el porcentaje de inhibicion de la expresion del ARNm de STAT3 conseguida para cada concentracion, y registrando la concentracion de oligonucleotido a la cual se consigue el 50% de inhibicion de la expresion del ARNm de STAT3 en comparacion con el control. Como se ilustra en la Tabla 12, los niveles de ARNm de STAT3 se redujeron de forma significativa en una forma dependiente de la dosis en las celulas tratadas con oligonucleotidos antisentido.

TABLA 12

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de STAT3 humana en celulas HuVEC

EJEMPLO 13: INHIBICION POR ANTISENTIDO DE STAT3 HUMANA EN CELULAS HUVEC Se disenaron oligonucleotidos antisentido contra un acido nucleico de STAT3 humana y se probaron para su efecto sobre la expresion del ARNm de STAT3 humana in vitro. Los oligonucleotidos antisentido quimericos de las Tablas 13 y 14 son gapmeros de 16 o 17 nucleotidos de longitud que tienen diversas modificaciones quimicas. Cada gapmero comprende un segmento espaciador central que consiste en nueve o diez 2'-desoxinucleosidos y esta flanqueado a ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por extensiones que comprenden 1, 2, 3, 4, o 5 nucleotidos cada uno. Cada uno de los nucleotidos en las extensiones comprenden una modificacion con azucar 2'-MOE o una modificacion con azucar cEt. Los motivos de gapmero incluyen 3-10-3, 4-9-3, 2-10-4, 1­ 10-5, y 3-10-4. La columna de la quimica de Tablas 13 y 14 provee el motivo de azucar de cada gapmero, en donde 'e' indica un nucleosido 2'-MOE, 'k' indica un nucleosido de etilo (cEt) constrenido, y 'd' indica un 2'- desoxinucleosido. Las uniones internucleosidicas a lo largo de cada gapmero son uniones fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmero son 5-metilcitosinas.

La potencia de los oligonucleotidos antisentido quimericos se comparo con los ISIS 481464, ISIS 518344, e ISIS 518349 (que se describieron previamente en la presente).

Las celulas HuVEC cultivadas a una densidad de 20,000 celulas por pocillo se transfectaron usando electroporacion con 1,000 nM de oligonucleotido antisentido. Despues de un periodo de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de cebadores y sonda para humano RTS199, que se describio previamente en la presente, se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

“Sitio de inicio de blanco en humano” indica el nucleosido ubicado mas hacia 5' contra el que esta dirigido el gapmero en la secuencia genica humana. “Sitio de finalizacion de blanco en humano” indica el nucleosido ubicado mas hacia 3' contra el que esta dirigido el gapmero en la secuencia genica humana. Cada gapmero que se lista en la Tabla 13 se dirige contra el ARNm de STAT3 humana, designada en la presente como SEQ ID N° 1 (No. de Acceso a GENBANK NM_139276.2). Cada gapmero que se lista en la Tabla 14 se dirige contra la secuencia genomica de STAT3 humana, designada en la presente como SEQ ID N° 2 (el complemento del No. de Acceso a GENBANK NT_010755.14 truncado entre los nucleotidos 4185000 y 4264000).

EJEMPLO 14: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE STAT3 HUMANA EN CELULAS HUVEC

Los gapmeros del estudio que se describe en el Ejemplo 13 que exhiben inhibicion in vitro significativa de STAT3 se probaron a diferentes dosis en celulas HuVEC. Se plaquearon las celulas a una densidad de 20,000 celulas por pocillo y se transfectaron usando electroporacion con concentraciones de 39.1 nM, 156.3 nM, 625.0 nM, y 2,500.0 nM de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 15. Despues de un periodo de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS199, que se describio previamente en la presente, se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

La concentracion inhibitoria semimaxima (IC50) de cada oligonucleotido tambien se presenta en la Tabla 15. Como se ilustra en la Tabla 15, los niveles de ARNm de STAT3 se redujeron de forma significativa en una forma dependiente de la dosis en las celulas tratadas con oligonucleotidos antisentido.

TABLA 15

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de STAT3 humana en celulas HuVEC

EJEMPLO 15: INHIBICION POR ANTISENTIDO DE STAT3 HUMANA EN CELULAS HUVEC

Se disenaron otros oligonucleotidos antisentido contra un acido nucleico de STAT3 y se probaron para su efectos sobre el ARNm de STAT3 in vitro. Las celulas HuVEC cultivadas a una densidad de 20,000 celulas por pocillo se transfectaron usando electroporacion con 1,000 nM de oligonucleotido antisentido. Despues de un periodo de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de cebadores y sonda para humano RTS199, que se describio previamente en la presente, se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

Los oligonucleotidos antisentido quimericos en la Tabla 16 son gapmeros 3-10-3 desoxi, MOE y gapmeros cEt o 3-10-4 desoxi, mOe y cEt. Los gapmeros 3-10-3 tienen 16 nucleosidos de longitud, en donde el segmento espaciador central comprende diez 2'-desoxinucleosidos y esta flanqueado a ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por extensiones que comprenden 3 nucleotidos cada una. Los gapmeros 3-10-4 tienen 17 nucleosidos de longitud, en donde el segmento espaciador central comprende diez 2'-desoxinucleosidos y esta flanqueado en la direccion 5' por una extension que comprende 3 nucleosidos y en la direccion 3' por una extension que comprende 4 nucleosidos. Las uniones internucleosidicas a lo largo de cada gapmero son uniones fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmero son 5-metilcitosinas. La columna de la quimica de Tabla 16 presenta el motivo de azucar de cada gapmero, en donde 'e' indica un nucleosido 2'-MOE, 'k' indica un nucleosido de etilo (cEt) constrenido, y 'd' indica un 2'-desoxinucleosido.

“Sitio de inicio de blanco en humano” indica el nucleosido ubicado mas hacia 5' contra el que esta dirigido el gapmero en la secuencia genica humana. “Sitio de finalizacion de blanco en humano” indica el nucleosido ubicado mas hacia 3' contra el que esta dirigido el gapmero en la secuencia genica humana. Cada gapmero que se lista en la Tabla 16 se dirige contra el ARNm de STAT3 humana, designada en la presente como SEQ ID N° 1 (No. de Acceso a GENBANK NM_139276.2). Cada gapmero que se lista en la Tabla 17 se dirige contra secuencia genomica de STAT3 humana, designada en la presente como SEQ ID N° 2 (el complemento del No. de Acceso a GENBANK NT_010755.14 truncado entre los nucleotidos 4185000 to 4264000).

EJEMPLO 16: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE STAT3 HUMANA EN CELULAS HUVEC

Los gapmeros del estudio que se describe en el Ejemplo 15 que exhiben inhibicion in vitro significativa de STAT3 se probaron a diferentes dosis en celulas HuVEC. Se plaquearon las celulas a una densidad de 20,000 celulas por pocillo y se transfectaron usando electroporacion con concentraciones de 39.1 nM, 156.3 nM, 625.0 nM, y 2,500.0 nM de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 18. Despues de un periodo de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS199, que se describio previamente en la presente, se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

La concentracion inhibitoria semimaxima (IC50) de cada oligonucleotido tambien se presenta en la Tabla 18. Como se ilustra en la Tabla 18, los niveles de ARNm de STAT3 se redujeron de forma significativa en una forma dependiente de la dosis en las celulas tratadas con oligonucleotidos antisentido.

TABLA 18

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de STAT3 humana en celulas HuVEC

EJEMPLO 17: EFECTO DE ISIS OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENTIDO CONTRA STAT3 EN EL TRATAMIENTO DE UN MODELO DE XENOINJERTO DE CANCER DE MAMA HUMANO POR MDA-MB-231

Los ratones BALB/c inoculados con celulas de cancer de mama humano MDA-MB-231 se trataron con ISIS 481464 e ISIS 481549. El ISIS 481549 reacciona en forma cruzada con la secuencia de raton (o sea, hidridiza con la secuencia de raton). Se evaluo el crecimiento tumoral y la tolerabilidad de los oligonucleotidos en los ratones.

TRATAMIENTO

El estudio se llevo a cabo en Pharmaron Inc (Beijing, Republica Popular China). Los ratones BALB/c se obtuvieron de Beijing HFK Bio-Technology Co., Ltd. Las celulas de cancer de mama humano MDA-MB-231 se mantuvieron in vitro como cultivo en monocapa en Medio L-15 de Leibovitz suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor, 100 U/mL de penicilina, 100 |jg/mL de estreptomicina, y 2 mM de L-glutamina. Las celulas se mantuvieron a 37°C en una atmosfera de 5% de CO2 en aire. Las celulas tumorales se subcultivaron de rutina dos veces por semana con tratamiento de tripsina-EDTA. Las celulas creciendo en fase exponencial se cosecharon y contaron para la inoculacion de los tumores.

Tres grupos de ocho ratones hembra BALB/c de entre 6 y 8 semanas de edad asignados al azar se inocularon cada uno en el flanco derecho con fragmentos de tumor de MDA-MB-231 (3 mm x 2 mm x 2 mm, que se generaron a partir de pasajes de inoculacion tumoral) para desarrollo tumoral. El tratamiento con oligonucleotidos antisentido comenzo en el dia 11 despues de la inoculacion tumoral cuando el tamano tumoral medio alcanzo aproximadamente 100 mm3. Dos de los grupos se inyectaron por via intraperitoneal dos veces por semana durante 3 semanas con 25 mg/kg de ISIS 481464 o ISIS 481549. Un grupo control de ratones se inyecto por via intraperitoneal dos veces por semana durante 3 semanas con PBS.

Todos los procedimientos relacionados con la manipulacion, cuidado y tratamiento de animales, se llevaron a cabo de acuerdo a las guias aprobadas por el Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Se revisaron de rutina los animales para ver cualquier efecto del crecimiento tumoral sobre el comportamiento normal, tales como la movilidad, consumo de alimento, cambios de peso corporal y cualquier otro efecto anormal.

ANALISIS DEL ARN

Se extrajo el ARN del tejido tumoral para analisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de STAT3 humana usando el juego de sonda y cebadores RTS199, que se describio previamente en la presente. Los niveles de ARNm de STAT3 murina tambien se midieron usando el juego de sonda y cebadores mSTAT3_LTS00664 (secuencia directa CGACAGCTTCCCCATGGA, designada en la presente como SEQ ID N° 1513; secuencia reversa ATGCCCAGTCTTGACTCTCAATC, designada en la presente como SEQ ID N° 1514; secuencia de sonda CTGCGGCAGTTCCTGGCACCTT, designada en la presente como SEQ ID N° 1515). Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion al control con PBS, normalizados a ciclofilina. Como se muestra en la Tabla 19, el tratamiento con oligonucleotidos antisentido ISIS resulto en la reduccion del ARNm de STAT3 tanto humana como murina en comparacion con el control con PBS.

TABLA 19

Porcentaje de inhibicion de ARNm de STAT3 en los grupos de tratamiento en relacion al control con PBS en el modelo de xenoinjerto con MDA-MB-231

EFECTO SOBRE EL CRECIMIENTO TUMORAL

Se midio el tamano tumoral dos veces por semana en dos dimensiones usando un calibre. Los volumenes tumorales se calcularon usando la formula: V = 0.536 x a x b2, en donde a y b son los diametros largo y corto del tumor, respectivamente. El tamano tumoral se utilizo para los calculos de los valores de T-C y T^v/C^v . T-C se calculo con T como la mediana de tiempo (en dias) que se requiere para que los tumores en los grupos de tratamiento alcancen un tamano predeterminado (900 mm3), y C como la mediana de tiempo (en dias) para que los tumores del grupo control alcancen el mismo tamano. El valor de T^v/C^v (expresado como porcentaje) es una indicacion de la eficacia antitumoral de los oligonucleotidos ISIS, en donde T^v y C^v fueron el volumen medio de los grupos tratados y control, respectivamente, en un dia dado (dia 32).

Los resultados se presentan en las Tablas 20 y 21. Los datos indican que el tratamiento con ISIS 481464 e ISIS 481549 previnieron de forma significativa el crecimiento tumoral.

TABLA 20

Efecto de inhibicion antisentido de STAT3 sobre el crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto con MDA-MB-231

TABLA 21

Efecto de inhibicion antisentido de STAT3 sobre la inhibicion del el crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto con MDA-MB-231

MEDIDAS DE PESO CORPORAL

Para evaluar el efecto de oligonucleotidos ISIS sobre la salud general de los animales, se midieron los pesos corporales en forma regular durante el periodo de tratamiento. Los datos se presentan en la Tabla 22 e indican que el tratamiento con alguno de ISIS 481464 o ISIS 481549 no causa ganancia o perdida de peso significativa.

TABLA 22

Medidas de peso corporal de ratones en el modelo de xenoinjerto con MDA-MB-231

EJEMPLO 18: EFECTO DE OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENTIDO ISIS CONTRA STAT3 EN EL TRATAMIENTO DE UN MODELO DE XENOINJERTO DE CARCINOMA EPIDERMOIDE HUMANO POR A431

Los ratones BALB/c inoculados con celulas de cancer epidermoide humano A431 se trataron con ISIS 481464 e ISIS 481549. El ISIS 481549 reacciona en forma cruzada con la secuencia de raton (o sea, hidridiza con la secuencia de raton). Se evaluo el efecto del tratamiento sobre el crecimiento tumoral y la tolerabilidad en los ratones.

TRATAMIENTO

El estudio se llevo a cabo en Pharmaron Inc (Beijing, Republica Popular China). Los ratones BALB/c se obtuvieron de Beijing HFK Bio-Technology Co., Ltd. Las celulas de carcinoma epidermoide humano A431 se mantuvieron in vitro como cultivo en monocapa en medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor, 100 U/mL de penicilina, 100 |jg/mL de estreptomicina, y 2 mM de L-glutamina. Las celulas se mantuvieron a 37°C en una atmosfera de 5% de CO2 en aire. Las celulas tumorales se subcultivaron de rutina dos veces por semana con tratamiento de tripsina-EDTA. Se cosecharon las celulas creciendo en fase de crecimiento exponencial y se contaron para la inoculacion tumoral.

Tres grupos de ocho ratones hembra BALB/c de entre 6 y 8 semanas de edad asignados al azar se inocularon cada uno por via subcutanea con 5 x 106 celulas tumorales A431 para desarrollo tumoral. El tratamiento con oligonucleotidos antisentido comenzo en el dia 8 despues de la inoculacion tumoral cuando el tamano tumoral medio alcanzo aproximadamente 95 mm3. Dos de los grupos se inyectaron por via intraperitoneal dos veces por semana durante 4 semanas con 25 mg/kg de ISIS 481464 o ISIS 481549. Un grupo control de ratones se inyecto por via intraperitoneal dos veces por semana durante 4 semanas con PBS.

Todos los procedimientos relacionados con la manipulacion, cuidado y tratamiento de animales, se llevaron a cabo de acuerdo a las guias aprobadas por el Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Al momento del monitoreo de rutina, los animales se revisaron para cualquier efecto del crecimiento tumoral sobre el comportamiento normal, tales como la movilidad, consumo de alimento, cambios de peso corporal y cualquier otro efecto anormal.

ANALISIS DEL ARN

Se extrajo el ARN del tejido tumoral para analisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de STAT3 humana usando el juego de sonda y cebadores RTS199, que se describio previamente en la presente. Los niveles de ARNm de STAT3 murina tambien se midieron usando el juego de sonda y cebadores mSTAT3_LTS00664, que se describio previamente en la presente. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion al control con PBS, normalizados a ciclofilina. Como se muestra en la Tabla 23, el tratamiento con oligonucleotidos antisentido ISIS resulto en la reduccion del ARNm de STAT3 tanto humana como murina en comparacion con el control con PBS.

TABLA 23

Inhibicion de ARNm de STAT3 en los grupos de tratamiento en relacion al control con PBS en el modelo de xenoinjerto con A431

ANALISIS DE PROTEINAS

Se extrajeron proteinas a partir de los lisados tumorales para analisis por transferencia Western los niveles de la proteina STAT3 humana con anticuerpo monoclonal contra STAT3 (Cell Signaling Technology, Cat #9135). Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion al control con PBS, normalizados a la proteina de control interno, COX-II. Como se muestra en la Tabla 24, el tratamiento con oligonucleotidos antisentido ISIS resulto en la reduccion de los niveles de la proteina STAT3 en comparacion con el control con PBS.

TABLA 24

Inhibicion de los niveles de proteina STAT3 en los grupos de tratamiento en relacion al control con PBS en el modelo de xenoinjerto con A431

EFECTO SOBRE EL CRECIMIENTO TUMORAL

Se midio el tamano tumoral dos veces por semana en dos dimensiones usando un calibre, y los volumenes tumorales se calcularon usando la formula: V = 0.5 x a x b2, en donde a y b son los diametros largo y corto del tumor, respectivamente. El tamano tumoral se utilizo para los calculos de los valores de T-C y T^v/C^v . T-C se calculo con T como la mediana de tiempo (en d^as) que se requiere para que los tumores en los grupos de tratamiento alcancen un tamano predeterminado (800 mm3), y C como la mediana de tiempo (en dias) para que los tumores del grupo control alcancen el mismo tamano. El valor de T^v/C^v (expresado como porcentaje) es una indicacion de la eficacia antitumoral de los oligonucleotidos ISIS, en donde T^v y C^v fueron el volumen medio de los grupos tratados y control, respectivamente, en un dia dado (dia 33).

Los resultados se presentan en las Tablas 25 y 26. Los datos indican que el tratamiento con alguno de ISIS 481464 o ISIS 481549 previnieron de forma significativa el crecimiento tumoral.

TABLA 25

Efecto de inhibicion antisentido de STAT3 sobre el crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto con A431

TABLA 26

Efecto de inhibicion antisentido de STAT3 sobre la inhibicion del el crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto con A431

MEDIDAS DE PESO CORPORAL

Para evaluar el efecto de oligonucleotidos ISIS sobre la salud general de los animales, se midieron los pesos corporales en forma regular durante el periodo de tratamiento. Los datos se presentan en la Tabla 27 e indican que el tratamiento con alguno de ISIS 481464 o ISIS 481549 no afecta la salud general de los ratones.

TABLA 27

Medidas de peso corporal de ratones en el modelo de xenoinjerto con A431

EJEMPLO 19: EFECTO DE OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENTIDO ISIS CONTRA STAT3 EN EL TRATAMIENTO DE UN MODELO DE XENOINJERTO DE CANCER DE PULMON A CELULAS NO PEQUENAS HUMANO (NSCLC) POR NCI-H460

Los ratones BALB/c inoculados con NCI-H460 humanas de NSCLC humano se trataron con ISIS 491464, que se dirige contra STAT3 humana, e ISIS 481549, que se dirige contra STAT3 tanto humana como murina. Se evaluo el efecto del tratamiento sobre el crecimiento tumoral y la tolerabilidad en los ratones.

TRATAMIENTO

El estudio se llevo a cabo en Pharmaron Inc (Beijing, Republica Popular China). Los ratones BALB/c se obtuvieron de Beijing HFK Bio-Technology Co., Ltd. Las celulas de NSCLC humano NCI-H460 se mantuvieron in vitro como cultivo en monocapa en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor, 100 U/mL de penicilina, 100 |jg/mL de estreptomicina, y 2 mM de L-glutamina. Las celulas se mantuvieron a 37°C en una atmosfera de 5% de CO2 en aire. Las celulas tumorales se subcultivaron de rutina dos veces por semana con tratamiento de tripsina-EDTA. Se cosecharon las celulas creciendo en fase de crecimiento exponencial y se contaron para la inoculacion tumoral.

Tres grupos de ocho ratones hembra BALB/c de entre 6 y 8 semanas de edad asignados al azar se inocularon cada uno por via subcutanea con 2 x 106 celulas tumorales NCI-H460 para desarrollo tumoral. El tratamiento con oligonucleotidos antisentido comenzo en el dia 6 despues de la inoculacion tumoral cuando el tamano tumoral medio alcanzo aproximadamente 100 mm3. Dos de los grupos se inyectaron por via intraperitoneal dos veces por semana durante 3 semanas con 25 mg/kg de ISIS 481464 o ISIS 481549. El tercer grupo de ratones se inyecto por via intraperitoneal dos veces por semana durante 3 semanas con PBS, y sirvio como grupo control.

Todos los procedimientos relacionados con la manipulacion, cuidado y tratamiento de animales, se llevaron a cabo de acuerdo a las guias aprobadas por el Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Al momento del monitoreo de rutina, los animales se revisaron para cualquier efecto del crecimiento tumoral sobre el comportamiento normal, tales como la movilidad, consumo de alimento, cambios de peso corporal y cualquier otro efecto anormal.

a n Al is is d e l a r n

Se extrajo el ARN del tejido tumoral para analisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de STAT3 humana usando el juego de sonda y cebadores RTS199, que se describio previamente en la presente. Los niveles de ARNm de STAT3 murina tambien se midieron usando el juego de sonda y cebadores mSTAT3_LTS00664, que se describio previamente en la presente. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion al control con PBS, normalizados a ciclofilina. Como se muestra en la Tabla 28, el tratamiento con oligonucleotidos antisentido ISIS resulto en la reduccion del ARNm de STAT3 tanto humana como murina en comparacion con el control con PBS.

TABLA 28

Inhibicion de ARNm de STAT3 en los grupos de tratamiento en relacion al control con PBS en el modelo de xenoinjerto por NCI-H460

EFECTO SOBRE EL CRECIMIENTO TUMORAL

Se midio el tamano tumoral dos veces por semana en dos dimensiones usando un calibre, y los volumenes tumorales se calcularon usando la formula: V = 0.5 x a x b2, en donde a y b son los diametros largo y corto del tumor, respectivamente. El tamano tumoral se utilizo para los calculos de los valores de T-C y T^v/C^v . T-C se calculo con T como la mediana de tiempo (en dias) que se requiere para que los tumores en los grupos de tratamiento alcancen un tamano predeterminado (1,500 mm3), y C como la mediana de tiempo (en dias) para que los tumores del grupo control alcancen el mismo tamano. El valor de T^v/C^v (expresado como porcentaje) es una indicacion de la eficacia antitumoral de los oligonucleotidos ISIS, en donde T^v y C^v fueron el volumen medio de los grupos tratados y control, respectivamente, en un dia dado (dia 20).

Los resultados se presentan en las Tablas 29 y 30. Los datos indican que el tratamiento con alguno de ISIS 481464 o ISIS 481549 previnieron de forma significativa el crecimiento tumoral.

TABLA 29

Efecto de inhibicion antisentido de STAT3 sobre el crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto por NCI-H460

TABLA 30

Efecto de inhibicion antisentido de STAT3 sobre la inhibicion del el crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto por NCI-H460

MEDIDAS DE PESO CORPORAL

Para evaluar el efecto de oligonucleotidos ISIS sobre la salud general de los animales, se midieron los pesos corporales en forma regular durante el periodo de tratamiento. Los datos se presentan en la Tabla 31 e indican que el tratamiento con alguno de ISIS 481464 o ISIS 481549 no afecta la salud general de los ratones.

TABLA 31

Medidas de peso corporal de ratones en el modelo de xenoinjerto por NCI-H460

EJEMPLO 20: EFECTO DE INHIBICION ANTISENTIDO DE STAT3 HUMANA EN UN MODELO DE RATON CON GLIOBASTOMA ORTOTOPICO HUMANO

Se trataron ratones NU/J implantados ortotopicamente con celulas de glioblastoma humano con ISIS 455291, un gapmero 5-10-5 MOE que tiene una secuencia de CAGCAGATCAAGTCCAGGGA (SEQ ID N° 1590). Se evaluo el efecto del tratamiento sobre el crecimiento tumoral y la tolerabilidad en los ratones.

TRATAMIENTO

Treinta ratones NU/J se implantaron estereotacticamente en el lobulo frontal derecho con 5 x 105 celulas U-87 MG-luc2. En el d^a 15 despues de la implantacion de las celulas tumorales, 15 de estos ratones se dosificaron intracanealmente con una inyeccion en bolo en el sitio de la implantacion tumoral con 100 |jg de ISIS 455291, que se disolvio en 2 |jL de PBS. Los restantes 15 ratones se dosificaron intracanealmente con una inyeccion en bolo en el sitio de la implantacion tumoral con 2 jL de PBS. El segundo grupo de ratones sirvio como grupo control.

ANALISIS

En el dia 18 despues de la implantacion del tumor, cinco ratones de cada grupo se sacrificaron por inhalacion de CO2 y se recolectaron los cerebros para analisis del ARN. Se extrajo el ARN del tejido tumoral para analisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de STAT3 humana usando el juego de sonda y cebadores RTS199, que se describio previamente en la presente. El tratamiento con ISIS 455291 resulto en 27% de reduccion de ARNm de STAT3 humana en el tejido tumoral en comparacion con el control con PBS.

Los restantes ratones de cada grupo se monitorearon regularmente hasta las 2 semanas para analisis de supervivencia. La mediana de supervivencia para el grupo control con PBS fue 30.5 dias. La mediana de supervivencia para los ratones tratados con oligonucleotidos ISIS fue de 35 dias. El valor P fue de 0.2088.

EJEMPLO 21: EFECTO DEL TRATAMIENTO CON ISIS 481549 EN RATONES APC/MIN+

Se evaluo el efecto del tratamiento con ISIS 481549 sobre los niveles de ARNm de STAT3 y los numeros de adenomas intestinales en el modelo de raton APC/Min+. La cepa de ratones APC/Min+ tiene predisposicion para formacion de adenoma intestinal espontaneo a lo largo del tracto intestinal completo en una etapa temprana (Moser A.R. et al., Science 1990. 247: 322-324).

TRATAMIENTO

Dos grupos de 4 ratones APC/Min+ macho de nueve semanas de edad se inyectaron por via subcutanea con 5 mg/kg o 25 mg/kg de ISIS 481549 administrados cinco veces por semana (dosis semanales totales de 25 mg/kg y 125 mg/kg, respectivamente) durante 4 semanas. Un grupo de 4 ratones APC/Min+ ratones macho de nueve semanas de edad se inyecto por via subcutanea con 50 mg/kg de oligonucleotido control, ISIS 141923, administrados cinco veces por semana (dosis semanal total de 250 mg/kg) durante 4 semanas. Un grupo control de 4 ratones APC/Min+ ratones macho de nueve semanas de edad se inyecto por via subcutanea con PBS administrados cinco veces por semana durante 4 semanas. Los ratones se sacrificaron con isofluorano seguido por dislocacion cervical 48 horas despues de la inyeccion final.

Se quitaron colon e intestino, se separaron uno de otro y se limpiaron. Se cortaron aproximadamente 5 cm del tracto intestinal superior y se homogeneizaron en 2.5 mL de solucion amortiguadora RLT (Qiagen) con 1% de 2-mercaptoetanol (RLT-BMe) y se colocaron en hielo seco. Se corto el colon a la mitad y se homogeneizo la mitad proximal del tejido en 2.5 mL de RLT-BMe y se coloco en hielo seco. Se corto una pieza pequena del higado (0.2 g) y se homogeneizo en RLT-BMe y se coloco en hielo seco.

ANALISIS DEL ARN

Se aislo ARN de los tejidos usando el conjunto de componentes PureLink™ Total RNA Purification (Invitrogen; #12173-011 A), de acuerdo al protocolo del fabricante. La RT-PCR se llevo a cabo usando el sistema StepOnePlus (Applied Biosystems), de acuerdo al protocolo del fabricante. El juego de cebadores y sonda para murino mSTAT3_LTS000664 (cebador directo CGACAGCTTCCCCATGGA, designado en la presente como SEQ ID N° 1513; cebador reverso ATGCCCAGTCTTGACTCTCAATC, designado en la presente como SEQ ID N° 1514; sonda CTGCGGCAGTTCCTGGCACCTT, designada en la presente como SEQ ID N° 1515) se uso para medir los niveles de ARNm de STAT3. El nivel de ARNm del gen estandar interno, ciclofilina, se midio con el juego de cebadores y sonda mcyclo_24 (cebador directo TCGCCGCTTGCTGCA, designado en la presente como SEQ ID N° 1516; cebador reverso ATCGGCCGTGATGTCGA, designado en la presente como SEQ ID N° 1517; sonda CCATGGTCAACCCCACCGTGTTC, designada en la presente como SEQ ID N° 1518) y se uso para normalizar los niveles de ARNm de STAT3.

El tratamiento con ISIS 481549 resulto en una reduccion estadisticamente significativa de la expresion del ARNm de STAT3 en el higado a 25 mg/kg/semana y 125 mg/kg/semana de dosificacion en higado, intestino delgado y colon (Tabla 32) en comparacion con el control con PBS. Se determinaron diferencias significativas entre los grupos de tratamiento y control usando la prueba t de Student de dos colas (p<0.05).

TABLA 32

Porcentaje de inhibicion de la expresion de los niveles de ARNm de STAT3 en ratones APC/Min+

ANALISIS DEL NUMERO DE ADENOMAS

Se llevo a cabo el analisis histologico del intestino delgado para evaluar microscopicamente el numero de adenomas. El tratamiento con ISIS 481549 a 125 mg/kg/semana resulto en una disminucion estadisticamente significativa del numero de tumores en comparacion con el control con PBS (Tabla 33). Las diferencias significativas entre los grupos de tratamiento y control se determinaron usando la prueba t de Student de dos colas (p<0.05).

TABLA 33

Conteos de adenomas en ratones APC/Min+

EJEMPLO 22: EFECTO DE OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENTIDO CONTRA STAT3 EN EL TRATAMIENTO DE UN MODELO DE XENOINJERTO DE NSCLC POR PC-9

Los ratones BALB/c (Charles River) inoculados con la linea celular de cancer de pulmon humano a celulas no pequenas, PC-9, se trataron con ISIS 481549 e ISIS 481464. Se evaluo el crecimiento tumoral y la reduccion del blanco STAT3 en los ratones.

TRATAMIENTO

Se inocularon ratones BALB/c hembra de entre seis y ocho semanas de edad por via subcutanea con 7 x 106 celulas de NSCLC humano PC-9. Los ratones que mostraron un volumen de tumor medio de entre 150 y 200 mm3 se seleccionaron y randomizaron en diferentes grupos de tratamiento. Dos grupos de 7 ratones se inyectaron por via subcutanea con 25 mg/kg de ISIS 481549 o ISIS 481464 administrados cinco veces por semana (dosis semanales totales de 125 mg/kg) durante 6 semanas. Un grupo de 7 ratones se inyectaron por via subcutanea con 25 mg/kg de ISIS 347526 (TCTTATGTTTCCGAACCGTT, ningun blanco humano o murino conocido, designada en la presente como SEQ ID N° 1519) administrados cinco veces por semana (dosis semanales totales de 125 mg/kg) durante 6 semanas. 24 horas antes del sacrificio de los ratones se dio una dosis final de oligonucleotido antisentido.

ANALISIS DEL ARN

Se recolectaron los tumores y se aislo el ARN usando el conjunto de componentes Qiagen RNAeasy Mini Kit (#74106), de acuerdo al protocolo del fabricante. Se midieron los niveles de ARNm de STAT3 usando un instrumento ABI StepOnePlus RT-PCR con el juego de cebadores y sonda para STAT3 humana RTS2033 (cebador directo GAGGCCCGCCCAACA, designado en la presente como SEQ ID N° 1520; cebador reverso TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT, designado en la presente como SEQ ID N° 1521; sonda CTGCCTAGATCGGC, designada en la presente como SEQ ID N° 1522). Los niveles de ARNm del gen estandar interno, GAPDH, se midieron con el juego de cebadores y sonda (cebador directo GAAGGTGAAGGTCGGAGTC, designado en la presente como SEQ ID N° 1523; cebador reverso GAAGATGGTGATGGGATTTC, designado en la presente como SEQ ID N° 1524; sonda CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC, designada en la presente como SEQ ID N° 1525) y se uso para normalizar los niveles de ARN. Los resultados se presentan en la Tabla 34 e indican que los oligonucleotidos antisentido redujeron los niveles de ARNm de STAT3.

TABLA 34

Porcentaje de inhibicion de la expresion de los niveles de ARNm de STAT3 en el modelo de xenoinjerto de NSCLC en comparacion con el control ASO

ANALISIS DE CRECIMIENTO TUMORAL

Se midieron los tumores regularmente a lo largo del periodo de estudio. La inhibicion del crecimiento tumoral (TGI) se calculo usando la formula

TGI = [1-(X de grupo STAT3 ASO (final))-X de grupo STAT3 ASO (dia 1))/(X de control grupo ASO (final)-X de control de grupo ASO (dia 1))] x 100%, en donde X = volumen medio del tumor.

La diferencia entre el grupo de tratamiento y el grupo control se evaluo usando la prueba estadistica de ANOVA. Los resultados se presentan en la Tabla 35. Los datos indican que el crecimiento tumoral se inhibio significativamente por ISIS 481464 con TGI de 97% al dia 52. El tratamiento con ISIS 481549 inhibio el crecimiento tumoral por PC-9 en 78%.

TABLA 35

Medidas de crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto de NSCLC

ANALISIS DE PESO CORPORAL

Se midieron los pesos corporales regularmente a lo largo del periodo de estudio. Los resultados se presentan en la Tabla 36 e indican que no hubo cambios significativos en el peso corporal de los grupos de tratamiento en comparacion con los grupos control.

TABLA 36

Medidas de peso corporal en el modelo de xenoinjerto de NSCLC

EJEMPLO 23: EFECTO DE ISIS 481464 EN EL TRATAMIENTO DE UN MODELO DE XENOINJERTO DE NSCLC MEDIANTE LG-476

Se inocularon ratones NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG; JAX #5557), que son inmunodeficientes, con la linea celular de cancer de pulmon humano a celulas no pequenas, LG-476 (Jackson Laboratory) y se trataron con ISIS 481464. Se evaluo el crecimiento tumoral y la reduccion del blanco STAT3 en los ratones.

TRATAMIENTO

Se inocularon ratones NSG hembra de entre cuatro y seis semanas de edad por via subcutanea con celulas de NSCLC humano LG-476 y se monitorearon tres veces por semana para observaciones clinicas, pesos corporales y volumen de tumor. Una vez que los tumores alcanzaron 1,000 mm3, se recolectaron los tumores y se fragmentaron. Se implantaron fragmentos de tumor con medida de entre 3 y 5 mm3 por via subcutanea en el flanco trasero derecho de 30 ratones NSG. Se monitorearon los ratones tres times a semana. Cuando los tumores individuales alcanzaron un volumen de entre 200 y 250 mm3, se asignaron los ratones al azar a 2 grupos y se inyectaron con 25 mg/kg de ISIS 481464 o PBS, administrados 5 veces por semana (dosis semanales de 125 mg/kg) durante 3 semanas. Se recolectaron los tumores 24 horas despues de la ultima dosis.

ANALISIS DEL ARN

Se prepararon lisados de los tumores usando un instrumento ABI StepOnePlus RT-PCR con un juego de cebadores y sonda especificos para humanos RTS2033. Se midieron los niveles de ARNm del gen estandar interno, ciclofilina, con un juego de cebadores y sonda especificos para humano (cebador directo GACGGCGAGc CcTTGG, designado en la presente como SEQ ID N° 1526; cebador reverso TGCTGTCTTTGGGACCTTGTC, designado en la presente como SEQ ID N° 1527; sonda CCGCGTCTCCTTTGAGCTGTTTGC, designada en la presente como SEQ ID N° 1528). Las diferencias significativas entre los grupos de tratamiento y control se determinaron usando la prueba t de Student de dos colas (p<0.05).

El tratamiento con ISIS 481464 resulto en 43% de reduccion de los niveles de ARNm de STAT3 en la masa tumoral en comparacion con el control con PBS (Figura 8), lo que fue estadisticamente significativo.

ANALISIS DE PROTEINAS

Se prepararon lisados celulares totales homogeneizando el tumor en solucion amortiguadora de ensayo de radio inmunoprecipitacion (RIPA) enfriada en hielo con coctel de inhibidores de proteasas. Se analizaron los lisados mediante transferencia western usando anticuerpo anti-STAT3 (Abcam Antibodies, #ab32500). Tambien se marcaron las protemas estandar interno citocromo oxidasa II (COXII; #ab79393) y survivina (#ab76424). Los niveles de STAT3 se normalizaron a proteina COXII o bien a proteina survivina y se cuantificaron usando ImageJ software.

El tratamiento con ISIS 481464 resulto en 50% de reduccion en los niveles de proteina STAT3 en la masa tumoral en comparacion con el control con PBS, lo cual fue estadisticamente significativo.

ANALISIS DE CRECIMIENTO TUMORAL

Se midieron los tumores regularmente a lo largo del periodo de estudio. El tratamiento con ISIS 481464 resulto en una disminucion del volumen tumoral de aproximadamente 39% en comparacion con el control con PBS.

EJEMPLO 24: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE _ STAT3 DESPUES DE LA CAPTACION LIBRE DE OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO EN CELULAS PC9

El ISIS 481464, de los estudios que se describieron previamente, se probo ademas a diferentes dosis en celulas PC9, una linea de celulas de carcinoma de pulmon a celulas no pequenas. Se plaquearon las celulas a una densidad de 3,000 celulas por pocillo. Se incubaron las celulas con concentraciones de 0.02 ^|jM, 0.1 ^|jM, 0.5 ^|jM, 2.5 ^|jM, y 10.0 ^|jM de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 37. Despues de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS2033 (secuencia directa GAGGCCCGCCCAACA, designada en la presente como SEQ ID N° 1520; secuencia reversa TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT, designada en la presente como SEQ ID N° 1521; secuencia de sonda CTGCCTAGATCGGC, designada en la presente como SEQ ID N° 1522) se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de beta-actina, un gen estandar interno, segun la medida mediante el juego de cebadores y sonda para humano HTS5002 (secuencia directa CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA, designada en la presente como SEQ ID N° 1529; secuencia reversa GCCATGCCAATCTCATCTTGT, designada en la presente como SEQ ID N° 1530; secuencia de sonda CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA, designada en la presente como SEQ ID N° 1531). Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

La concentracion inhibitoria semimaxima (IC50) de cada oligonucleotido tambien se presenta en la Tabla 37. Como se ilustra en la Tabla 37, el ISIS 481464 fue capaz de penetrar la membrana celular.

TABLA 37

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de STAT3 mediante captacion libre de oligonucleotido ISIS en celulas PC9

ISIS N° 0.02 ^jiM 0.1 ^jiM 0.5 ^jiM 2.5 ^jiM 10.0 ^jiM IC50 (j M)

481464 20 51 84 94 96 0.19

EJEMPLO 25: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE _ STAT3 DESPUES DE LA CAPTACION LIBRE DE OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO EN CELULAS

C42B

El ISIS 481464, de los estudios que se describieron previamente, se probo ademas a diferentes dosis en celulas C42B, una linea celular de cancer de prostata. Se plaquearon las celulas a una densidad de 3,000 celulas por pocillo. Se incubaron las celulas con concentraciones de 0.02 jiM, 0.1 jⁱM, 0.5 jⁱM, 2.5 jⁱM, y 10.0 jⁱM de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 38. Despues de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS2033 (secuencia directa GAGGCCCGCCCAACA, designada en la presente como SEQ ID N° 1520; secuencia reversa TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT, designada en la presente como s Eq ID N° 1521; secuencia de sonda CTGCCTAGATCGGC, designada en la presente como SEQ ID N° 1522) se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de beta-actina, un gen estandar interno, segun la medida mediante el juego de cebadores y sonda para humano HTS5002 (secuencia directa CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA, designada en la presente como SEQ ID N° 1529; secuencia reversa GCCATGCCAATCTCATCTTGT, designada en la presente como SEQ ID N° 1530; secuencia de sonda CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA, designada en la presente como SEQ ID N° 1531). Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

La concentracion inhibitoria semimaxima (IC50) de cada oligonucleotido tambien se presenta en la Tabla 38. Como se ilustra en la Tabla 38, el ISIS 481464 fue capaz de penetrar la membrana celular.

TABLA 38

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de STAT3 mediante captacion libre de oligonucleotido ISIS en celulas C42B

EJEMPLO 26: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE STAT3 DESPUES DE LA CAPTACION LIBRE DE OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO EN CELULAS COLO201

El ISIS 481464, de los estudios que se describieron previamente, se probo ademas a diferentes dosis en celulas Colo201, una linea celular de cancer colorrectal. Se plaquearon las celulas a una densidad de 3,000 celulas por pocillo. Se incubaron las celulas con concentraciones de 0.02 ^|jM, 0.1 ^|jM, 0.5 j M, 2.5 j M, y 10.0 j M de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 39. Despues de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS2033 (secuencia directa GAGGCCCGCCCAACA, designada en la presente como SEQ ID N° 1520; secuencia reversa TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT, designada en la presente como s Eq ID N° 1521; secuencia de sonda CTGCCTAGATCGGC, designada en la presente como SEQ ID N° 1522) se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron al contenido de beta-actina, un gen estandar interno, segun la medida mediante el juego de cebadores y sonda para humano HTS5002 (secuencia directa CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA, designada en la presente como SEQ ID N° 1529; secuencia reversa GCCATGCCAATCTCATCTTGT, designada en la presente como SEQ ID N° 1530; secuencia de sonda CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA, designada en la presente como SEQ ID N° 1531). Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

La concentracion inhibitoria semimaxima (IC50) de cada oligonucleotido tambien se presenta en la Tabla 39. Como se ilustra en la Tabla 39, ISIS 481464 fue capaz de penetrar la membrana celular.

TABLA 39

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de STAT3 mediante captacion libre de oligonucleotido ISIS en celulas Colo201

EJEMPLO 27: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE _ STAT3 DESPUES DE LA CAPTACION LIBRE DE OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO EN CELULAS BT474M1

El ISIS 481464, de los estudios que se describieron previamente, se probo ademas a diferentes dosis en celulas BT474M1, una linea celular de cancer de mama. Se plaquearon las celulas a una densidad de 3,000 celulas por pocillo. Se incubaron las celulas con concentraciones de 0.02 j M, 0.1 j M, 0.5 j M, 2.5 j M, y 10.0 j M de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 40. Despues de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS2033 (secuencia directa GAGGCCCGCCCAACA, designada en la presente como SEQ ID N° 1520; secuencia reversa TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT, designada en la presente como s Eq ID N° 1521; secuencia de sonda CTGCCTAGATCGGC, designada en la presente como SEQ ID N° 1522) se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron al contenido de beta-actina, un gen estandar interno, segun la medida mediante el juego de cebadores y sonda para humano HTS5002 (secuencia directa CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA, designada en la presente como SEQ ID N° 1529; secuencia reversa GCCATGCCAATCTCATCTTGT, designada en la presente como SEQ ID N° 1530; secuencia de sonda CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA, designada en la presente como SEQ ID N° 1531). Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

La concentracion inhibitoria semimaxima (IC50) de cada oligonucleotido tambien se presenta en la Tabla 40. Como se ilustra en la Tabla 40, ISIS 481464 fue capaz de penetrar la membrana celular.

TABLA 40

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de STAT3 mediante captacion libre de oligonucleotido ISIS en celulas BT474M1

EJEMPLO 28: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE _ STAT3 DESPUES DE LA CAPTACION LIBRE DE OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO EN CELULAS

H929

El ISIS 481464, de los estudios que se describieron previamente, se probo ademas a diferentes dosis en celulas H929, una linea celular de mieloma multiple. Se plaquearon las celulas a una densidad de entre 10,000 y 12,000 celulas por pocillo. Se incubaron las celulas con concentraciones de 0.01 ^|jM, 0.5 ^|jM, 2.5 ^|jM, y 10.0 ^|jM de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 41. Despues de aproximadamente 72 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS2033 (secuencia directa GAGGCCCGCCCAACA, designada en la presente como SEQ ID N° 1520; secuencia reversa TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT, designada en la presente como s Eq ID N° 1521; secuencia de sonda CTGCCTAGATCGGC, designada en la presente como SEQ ID N° 1522) se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron al contenido de beta-actina, un gen estandar interno, segun la medida mediante el juego de cebadores y sonda para humano HTS5002 (secuencia directa CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA, designada en la presente como SEQ ID N° 1529; secuencia reversa GCCATGCCAATCTCATCTTGT, designada en la presente como SEQ ID N° 1530; secuencia de sonda CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA, designada en la presente como SEQ ID N° 1531). Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

La concentracion inhibitoria semimaxima (IC50) de cada oligonucleotido tambien se presenta en la Tabla 41. Como se ilustra en la Tabla 41, ISIS 481464 fue capaz de penetrar la membrana celular.

TABLA 41

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de STAT3 mediante captacion libre de oligonucleotido ISIS por celulas H929

EJEMPLO 29: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE STAT3 d e s p u Es DE LA CAPTACION LIBRE DE OLIGONUCLEOTIDO a n t is e n t id o en c El u l a s MM1R

Se ensayo adicionalmente el ISIS 481464, de los estudios que se describieron previamente, a diferentes dosis en celulas MM1R, una linea celular de mieloma multiple. Se plaquearon las celulas a una densidad de entre 10,000 y 12,000 celulas por pocillo. Se incubaron las celulas con concentraciones de 0.01 |jM, 0.5 |jM, 2.5 |jM y 10.0 |jM de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 42. Despues de aproximadamente 72 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS2033 (secuencia directa GAGGCCCGCCCAACA, designada en la presente como SEQ ID N° 1520; secuencia reversa TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT, designada en la presente como s Eq ID N° 1521; secuencia de sonda CTGCCTAGATCGGC, designada en la presente como SEQ ID N° 1522) se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de beta-actina, un gen estandar interno, segun la medida por el juego de cebadores y sonda humanos HTS5002 (secuencia directa CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA, designada en la presente como SEQ ID N° 1529; secuencia reversa GCCATGCCAATCTCATCTTGT, designada en la presente como SEQ ID N° 1530; secuencia de sonda CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA, designada en la presente como SEQ ID N° 1531). Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

La concentracion inhibitoria semimaxima (IC50) de cada oligonucleotido tambien se presenta en la Tabla 42. Como se ilustra en la Tabla 42, el ISIS 481464 fue capaz de penetrar la membrana celular.

TABLA 42

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de STAT3 mediante captacion libre de oligonucleotido ISIS por celulas MM1R

EJEMPLO 30: EFECTO DE LOS OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENTIDO CONTRA STAT3 EN EL TRATAMIENTO DE UN MODELO DE XENOINJERTO DE CANCER DE OVARIO SK-OV3

Se inocularon ratones atimicos BALB/c con la linea celular de cancer ovarico humano, SK-OV3 y se trataron con ISIS 481464 o ISIS 481549. El ISIS 481549 tiene reaccion cruzada con la secuencia de raton (es decir, hibridiza con la secuencia de raton).

ESTUDIO 1

Se inyectaron celulas SK-OV3 de cancer ovarico humano (aproximadamente 100 mm3) intraperitonealmente en ratones atimicos. Diez dias despues, los ratones se inocularon por via subcutanea con 25 mg/kg de ISIS 481464 o ISIS 481549, se administraron dos veces por semana durante 11 semanas. Los ratones se sacrificaron 24 horas despues de la ultima dosis.

ANALISIS DE ARN

Los lisados se prepararon con el uso del conjunto de elementos para extraccion de ARN (Invitrogen) para el analisis por RT-PCR de los niveles de ARNm de STAT3, usando el juego de cebadores y sonda humanos (RTS2033) y juego de cebadores y sonda de raton (mSTAT3-LTS0664). Los resultados se presentan en la Tabla 43. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion al control de PBS. Los datos indican que el tratamiento con oligonucleotidos antisentido ISIS dio como resultado la reduccion del ARNm de humano y de raton de STAT3 en comparacion al control de PBS.

TABLA 43

Inhibicion porcentual de ARNm de STAT3 en los grupos de tratamiento en relacion al control de PBS en el modelo de xenoinjerto de SK-OV3

ANALISIS DE PROTEINA

Los lisados se prepararon con solucion amortiguada RIPA para analisis por transferencia western de los niveles de proteina STAT3, usando un anticuerpo dirigido contra STAT3 fosforilada (Cell Signaling). Los resultados se presentan en Figura 1. Los datos indican que el tratamiento con ISIS 481549 dio como resultado la reduccion de la proteina STAT3 fosforilada en comparacion al control de PBS.

ANALISIS DEL NIVEL DE IL-6

Los lisados se prepararon con el uso del conjunto de elementos para extraccion de ARN (Invitrogen) para analisis por RT-PCR de los niveles de ARNm de IL-6, usando el juego de cebadores y sonda de raton mIL6-LTS00629. Los resultados se presentan en la Tabla 44. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de IL-6, en relacion al control de PBS. Los datos indican que el tratamiento con ISIS 481549 dio como resultado la reduccion significativa de ambos ARNm de IL-6 en comparacion al control de PBS.

TABLA 44

Inhibicion porcentual de ARNm de IL-6 en los grupos de tratamiento en relacion al control de PBS en el modelo de xenoinjerto de SK-OV3

ANALISIS DEL PESO DEL TUMOR

Se recolectaron los tumores. Se midio el peso de los tumores y los resultados se presentan en la Tabla 45. Los resultados se presentan como porcentaje del peso del tumor del control con PBS. Los datos indican que el tratamiento con ISIS 481549 dio como resultado la reduccion significativa del peso del tumor en comparacion al control de PBS.

TABLA 45

Disminucion porcentual del peso del tumor en los grupos de tratamiento en relacion al control de PBS en el modelo de xenoinjerto de SK-OV3

ESTUDIO 2

Se inocularon celulas SK-OV3 de cancer ovarico humano (aproximadamente 100 mm3) por via subcutanea en ratones atimicos. Diez dias despues, los ratones se inocularon intraperitonealmente con 50 mg/kg de ISIS 481464 o 50 mg/kg de ISIS 481464 e ISIS 481549 en combinacion, administrado cinco veces por semana durante 6 semanas. Se sacrificaron los ratones 24 horas despues de la ultima dosis.

ANALISIS DEL VOLUMEN DEL TUMOR

Los tumores se midieron regularmente usando calibres Vernier y los volumenes de los tumores se calcularon usando la formula, volumen del tumor = ^ (longitud x ancho2). Los resultados se presentan en la Figura 2. Los datos indican que el tratamiento de los ratones con una combinacion de ISIS 481464 e ISIS 481549 dio como resultado la inhibicion significativa del crecimiento del tumor.

Ejemplo 31: Estudio de tolerabilidad de ISIS 481464 en monos cinomologos

Se evaluo la eficacia y tolerabilidad de ISIS 481464 en monos cinomologos.

TRATAMIENTO

Se asignaron monos cinomologos naive machos y hembra a cinco grupos de tratamiento. Tres grupos de 5 monos recibieron cada uno dosis de carga de 3 mg/kg, 10 mg/kg o 30 mg/kg cada dos dias durante la primera semana del estudio (a los dias 1, 3, 5 y 7) seguido luego por administracion una vez por semana (comenzando en el dia 14). Un grupo control de 5 monos recibieron PBS cada dos dias durante la primera semana del estudio (en los dias 1, 3, 5 y 7) como la dosis de carga, seguido luego por administracion una vez por semana (comenzando en el dia 14). Estas dosis se administraron por infusion intravenosa durante una hora (i.v.). Un quinto grupo de 5 monos recibieron dosis de carga de 30 mg/kg administrados por via subcutanea cada dos dias durante la primera semana del estudio (en los dias 1, 3, 5 y 7) seguido luego por la administracion subcutanea (s.c.) una vez por semana (comenzando en el dia 14).

Para las infusiones i.v., los animales se sujetaron, sin sedacion, en una silla de sujecion. Se coloco un cateter en una de las venas cefalicas y se infundio una solucion de ISIS 481464 en la dosis apropiada a una velocidad constante durante aproximadamente 1 hora usando una bomba de jeringa calibrada (Stoelting Co, EE.UU.). El sitio de dosificacion se roto entre los brazos derecho e izquierdo y el tiempo de dosificacion fue registrado. La velocidad de infusion se selecciono para administrar el volumen de dosis calculado y se monitoreo la precision de las bombas y se registro para cada dosis. Al final del periodo de infusion, la solucion de dosificacion se cambio a PBS. En el caso de la administracion s.c., las inyecciones se realizaron con rotacion en el sentido de las agujas del reloj en 4 sitios en la espalda. Los sitios de inyeccion se mantuvieron afeitando periodicamente y por numeracion permanente por tatuaje.

Se sacrificaron tres monos de cada grupo en el dia 44, que fue aproximadamente 48 horas luego de la ultima dosis en el dia 42. Los otros 2 monos de cada grupo estan siendo observados para ver los efectos toxicologicos. Se realizo una eutanasia de los animales por exsanguinacion luego de anestesia inducida por quetamina/xilazina y administracion de pentobarbital sodico. Los protocolos descritos en el Ejemplo fueron aprobados por el Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

ANALISIS DE ARN

Se homogeneizo tejido hepatico en 3 mL de solucion amortiguada de lisis RLT (Qiagen) suplementada con 1% de 2-mercaptoethanol (Sigma). Se purifico ARN a partir del homogenato resultante usando placas de 96 pocillos de Qiagen RNeasy para purificacion de ARN, de acuerdo al protocolo del fabricante. Luego de la purificacion, las muestras de ARN se sometieron a analisis por RT-PCR usando un Perkin-Elmer ABI Prism 7700 Sequence Detection System y un juego de sondas cebadores para STAT3 RTS3235 (cebador directo AAGTTTATCTGTGTGACACCAACGA, designada en la presente como SEQ ID N° 1532; cebador reverso CTTCACCATTATTTCCAAACTGCAT, designada en la presente como SEQ ID N° 1533; sonda TGCCGATGTCCCCCCGCA, designada en la presente como SEQ ID N° 1534). Los niveles de ARNm de STAT3 se normalizaron a CiclofilinaA de mono, que se cuantifico usando el juego de cebadores y sonda mk_cycloA_2nd (cebador directo TGCTGGACCCAACACAAATG, designada en la presente como SEQ ID N° 1535; cebador reverso TGCCATCCAACCACTCAGTC, designada en la presente como SEQ ID N° 1536; sonda TTCCCAGTTTTTCATCTGCACTGCCAX, designada en la presente como SEQ ID N° 1537).

El tratamiento con ISIS 481464 a concentraciones de dosis de 30 mg/kg por infusion i.v. o inyeccion s.c. dio como resultado una reduccion estadisticamente significativa en el ARNm de la expresion de STAT3 en higado (Tabla 46) en comparacion al control de PBS. Las diferencias estadisticas entre el tratamiento y los grupos control se determinaron usando la prueba t de Student (p<0.05).

TABLA 46

Inhibicion porcentual de los niveles de ARNm de STAT3 en monos cinomologos

ANALISIS DE PROTEINAS

El tejido hepatico se homogeneizo en 1 mL de solucion amortiguada RIPA (Sigma) enfriada en hielo que contenia una mezcla de inhibidores de proteasas y fosfatasas (Roche). Los lisados totales se separaron por Bis-Tris PAGE (Invitrogen), se transfirieron a una membrana de PVDF y se realizo un Western blot usando anticuerpos primarios para STAT3 (Cell Signaling, #9132) y GAPDH (Advanced Immunochemicals, #06-1-G4-C5). Las bandas inmunoespecificas se detectaron con el conjunto de elementos para deteccion Enhanced Chemiluminescence Plus (Amersham Biosciences) luego de la exposicion a una placa radiografica. La intensidad de las bandas luego se escaneo y se cuantifico usando el programa de computacion ImageJ. Las diferencias estad^sticas entre el tratamiento y los grupos control se determinaron usando la prueba t de Student (p<0.05).

Se produjo una disminucion dependiente de la dosis en los niveles de proteina STAT3, como se muestra en la Tabla 47, con 33% y 82% de reduccion a 3 mg/kg/semana y 10 mg/kg/semana respectivamente. La proteina STAT3 no se pudo detectar para 30 mg/kg/semana sin importar la ruta de dosificacion.

TABLA 47

Inhibicion porcentual de los niveles de proteina STAT3 en monos cinomologos

FUNCION HEPATICA

Para evaluar el efecto de los oligonucleotidos ISIS sobre la funcion hepatica, se recolectaron muestras de sangre de todos los grupos de estudio. Las muestras de sangre se recolectaron por medio de venopuntura en el dia 44, 48 horas luego de la dosificacion. Las muestras de sangre (1 mL) se recolectaron en tubos sin anticoagulante para la separacion de suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante aproximadamente 60 minutos y luego se centrifugaron a 3,000 rpm durante 10 minutos para obtener suero. Los niveles de diferentes marcadores de la funcion hepatica se midieron usando un analizador para quimica clinica Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japon). Los niveles plasmaticos de ALT y AST se midieron y los resultados se presentan en la Tabla 48, expresados en IU/L. Los datos de monos macho y hembra se presentan separadamente. Los resultados indican que el tratamiento con ISIS 481464 no tuvo efecto sobre la funcion hepatica fuera del rango esperado para los oligonucleotidos antisentido.

TABLA 48

Efecto del tratamiento con oligonucleotido antisentido sobre los marcadores de la funcion hepatica en plasma de monos cinomologos

FUNCION RENAL

Para evaluar el efecto de los oligonucleotidos ISIS sobre la funcion renal, se recolectaron muestras de sangre de todos los grupos de estudio. Las muestras de sangre se recolectaron por venopuntura femoral en el dia 44, 48 horas luego de la dosificacion. Las muestras de sangre (1 mL) se recolectaron en tubos sin anticoagulante para la separacion de suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante aproximadamente 60 minutos y luego se centrifugaron a 3,000 rpm durante 10 minutos para obtener suero. Los niveles de diferentes marcadores de la funcion renal se midieron usando un analizador para quimica clinica Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japon). Los resultados se presentan en la Tabla 49, expresados en mg/dL. Los datos de quimica en plasma indican que el tratam iento con ISIS 481464 no tuvo ningun efecto sobre la funcion renal fuera del rango esperado para los oligonucleotidos antisentido.

TABLA 49

Efecto del tratam iento con oligonucleotido antisentido sobre el BUN plasmatico y los niveles de creatinina (mg/dL) en monos cinomologos

MEDIDAS DEL PESO CORPORAL

Para evaluar el efecto de los oligonucleotidos ISIS sobre la salud general de los animales, se midieron los pesos corporales y se presentan en las Tablas 50 y 51. Los resultados indican que el efecto del tratam iento con ISIS 481464 sobre los pesos corporales estuvo dentro del rango esperado para los oligonucleotidos antisentido.

TABLA 50

Efecto del tratam iento con oligonucleotido antisentido sobre los pesos corporales (g) en monos cinomologos macho

TABLA 51

Efecto del tratamiento con oligonucleotido antisentido sobre los pesos corporales (g) en monos cinomologos hembra

EJEMPLO 32: INHIBICION POR ANTISENTIDO DE STAT3 HUMANA EN CELULAS HUVEC

Se disenaron oligonucleotidos antisentido contra un acido nucleico de STAT3 y se probaron sus efectos sobre el ARNm de STAT3 in vitro. Las celulas HuVEC cultivadas a una densidad de 5,000 celulas por pocillo se transfectaron usando el reactivo LipofectAMINE 2000® con 30 nM de oligonucleotido antisentido. Despues de un periodo de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de cebadores y sonda para humano RTS2033 (secuencia directa GAGGCCCGCCCAACA, designada en la presente como SEQ ID N° 5; secuencia reversa TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT, designada en la presente como SEQ ID N° 6; secuencia de sonda CTGCCTAGATCGGC, designada en la presente como SEQ ID N° 7) se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

Los oligonucleotidos antisentido quimericos de las Tablas 52 y 53 se disenaron como gapmeros 5­ 10-5 MOE. Los gapmeros tienen 20 nucleosidos de longitud, en donde el segmento espaciador central comprende diez 2'-desoxinucleosidos y esta flanqueado a ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por extensiones que comprenden cinco nucleosidos cada uno. Cada nucleosido en el segmento extension 5' y cada nucleosido en el segmento extension 3' tiene una modificacion 2'-MOE. Las uniones internucleosidicas a lo largo de cada gapmero son uniones fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmero son 5-metilcitosinas. “Sitio de inicio de blanco en humano” indica el nucleosido ubicado mas hacia 5' contra el que esta dirigido el gapmero en la secuencia genica humana. “Sitio de finalizacion de blanco en humano” indica el nucleosido ubicado mas hacia 3' contra el que esta dirigido el gapmero en la secuencia genica humana. Cada gapmero que se lista en la Tabla 52 se dirige contra el ARNm de STAT3 humana, designada en la presente como SEQ ID N° 1 (No. de Acceso a GENBANK NM_139276.2). Cada gapmero que se lista en la Tabla 53 se dirige contra secuencia genomica de STAT3 humana, designada en la presente como SEQ ID N° 2 (el complemento del No. de Acceso a GENBANK Nt_010755.14 truncado entre los nucleotidos 4185000 a 4264000).

La potencia de los gapmeros fue comparable a ISIS 337332, ISIS 337333, e ISIS 345785, que tambien son gapmeros 5-10-5 MOE dirigidos contra STAT3 humana y que se describen adicionalmente en USPN 7,307,069.

EJEMPLO 33: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE STAT3 HUMANA EN CELULAS HUVEC

Los gapmeros del estudio que se describen en el Ejemplo 32 que exhiben inhibicion in vitro significativa de STAT3 se probaron a diferentes dosis en celulas HuVEC. Se plaquearon las celulas con una densidad de 5,000 celulas por pocillo y se transfectaron usando el reactivo LipofectAMINE2000® con concentraciones 1.1 nM, 3.3 nM, 10.0 nM y 30.0 nM de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 54. Despues de un periodo de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. Se uso el juego de sonda y cebadores para STAT3 humana rTs 199 (secuencia directa ACATGCCACTTTGGTGTTTCATAA, designada en la presente como SEQ ID N° 6; secuencia reversa TCTTCGTAGATTGTGCTGATAGAGAAC, designada en la presente como SeQ ID N° 7; secuencia de sonda CAGTATAGCCGCTTCCTGCAAGAGTCGAA, designada en la presente como SEQ ID N° 8) para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

La concentracion inhibitoria semimaxima (IC50) de cada oligonucleotido tambien se presenta en la Tabla 54 y se calculo mediante el grafico de las concentraciones de los oligonucleotidos usados versus el porcentaje de inhibicion de la expresion del ARNm de STAT3 conseguida para cada concentracion y registrando la concentracion de oligonucleotido a la cual se consigue el 50% de inhibicion de la expresion del ARNm de STAT3 en comparacion con el control. Como se ilustra en la Tabla 54, los niveles de ARNm de STAT3 se redujeron de forma significativa en una forma dependiente de la dosis en las celulas tratadas con oligonucleotidos antisentido.

TABLA 54

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de STAT3 humana en celulas HuVEC

EJEMPLO 34: INHIBICION POR ANTISENTIDO DE STAT3 HUMANA EN CELULAS HUVEC POR OLIGONUCLEOTIDOS DISENADOS POR MICROCAMINATA

Se disenaron gapmeros adicionales basado en los gapmeros presentados en el Ejemplo 1 que demostraron una inhibicion de al menos 50%. Estos gapmeros se disenaron por creacion de gapmeros desplazados levemente corriente arriba y corriente abajo (es decir, “microcaminata”) de los gapmeros originales. Estos gapmeros se probaron in vitro. Tambien se incluyo el ISIS 337332 en el ensayo para comparacion. Las celulas HuVEC cultivadas a una densidad de 5,000 celulas por pocillo se transfectaron usando el reactivo LipofectAMINE 2000® con 30 nM de oligonucleotido antisentido. Despues de un periodo de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de cebadores y sonda humanos RTS199, que se describio previamente en la presente, se uso para medir los niveles de ARNm de STAT3. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar. Los resultados se presentan en la Tabla 55.

Los oligonucleotidos antisentido quimericos en la Tabla 55 se disenaron como gapmeros 5-10-5 MOE. Los gapmeros disenados con un asterisco (*) en la Tabla 55 son los gapmeros originales a partir de los cuales se disenaron gapmeros, ISIS 465226-466744, por medio de microcaminata. Los gapmeros 5-10-5 tienen 20 nucleosidos de longitud, en donde el segmento espaciador central esta comprendido por diez 2'-desoxinucleosidos y esta flanqueado a ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por extensiones que comprenden cinco nucleosidos cada uno. Cada nucleosido en el segmento extension 5' y cada nucleosido en el segmento extension 3' tiene una modificacion 2'-MOE. Las uniones internucleosidicas a lo largo de cada gapmero son uniones fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmero son 5-metilcitosinas. “Sitio de inicio de blanco” indica el nucleosido ubicado mas hacia 5' contra el que esta dirigido el gapmero. “Sitio de finalizacion de blanco” indica el nucleosido ubicado mas hacia 3' contra el que esta dirigido el gapmero. Cada gapmero que se lista en la Tabla 55 se dirige contra la region blanco que se expande en las nucleobases 2313-76017 de SEQ ID N° 2 (el complemento del No. de Acceso a g En BANK NT_010755.14 truncado entre los nucleotidos 4185000 a 4264000).

EJEMPLO 35: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE STAT3 HUMANA EN CELULAS HUVEC

Los gapmeros del estudio que se describen en el Ejemplo 3 que exhiben inhibicion in vitro significativa de STAT3 se probaron a diferentes dosis en celulas HuVEC. Se plaquearon las celulas a una densidad de 5,000 celulas por pocillo y se transfectaron usando el reactivo LipofectAMINE2000® con concentraciones de 8.8 nM, 17.5 nM, 35.0 nM y 70.0 nM de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 56. Despues de un periodo de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS199, que se describio previamente en la presente, se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

Como se ilustra en la Tabla 56, los niveles de ARNm de STAT3 se redujeron en una forma dependiente de la dosis en las celulas tratadas con oligonucleotidos antisentido.

TABLA 56

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de STAT3 humana en celulas HuVEC usando reactivo LipofectAMINE 2000®

EJEMPLO 36: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE STAT3 HUMANA EN CELULAS HUVEC

Los gapmeros del estudio que se describen en el Ejemplo 3 se probaron adicionalmente a diferentes dosis en celulas HuVEC. Se plaquearon las celulas a una densidad de 20,000 celulas por pocillo y se transfectaron usando electroporacion con concentraciones de 187.5 nM, 375.0 nM, 750.0 nM, 1,500.0 nM, 3,000.0 nM y 6,000.0 nM de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 57. Despues de un periodo de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS199, que se describio previamente en la presente, se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

Como se ilustra en la Tabla 57, los niveles de ARNm de STAT3 se redujeron de forma significativa en una forma dependiente de la dosis en las celulas tratadas con oligonucleotidos antisentido.

TABLA 57

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de STAT3 humana en celulas HuVEC usando electroporacion

EJEMPLO 37: TOLERABILIDAD DE OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENTIDO CONTRA STAT3 HUMANA EN RATONES CD1

Treinta y nueve oligonucleotidos antisentido que exhiben un nivel alto de potencia se probaron adicionalmente para tolerabilidad in vivo.

Se inyectaron grupos de ocho ratones CD1 macho por via subcutanea dos veces por semana durante 6 semanas con 50 mg/kg de oligonucleotidos antisentido ISIS. Un grupo de ocho ratones CD1 macho se inyecto por via subcutanea dos veces por semana durante 6 semanas con PBS. Este grupo sirvio como grupo control. Tres dias despues de la ultima dosis se sacrificaron los ratones y se colectaron los organos y el plasma para analisis adicionales. El peso del higado, bazo y rinones se midieron al final del estudio y se compararon con los ratones tratados con PBS.

Para evaluar el efecto de los oligonucleotidos ISIS sobre la funcion hepatica, se midieron las concentraciones plasmaticas de transaminasas usando un analizador para quimica clinica automatico (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron las concentraciones plasmaticas de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa).

Para evaluar el efecto de los oligonucleotidos ISIS sobre la funcion renal, se midieron las concentraciones plasmaticas de nitrogeno ureico sanguineo (BUN) usando un analizador para quimica clinica automatico (Hitachi Olympus AU400e, Melville, ⁿ Y).

La sangre obtenida de todos los grupos de ratones se enviaron a Antech Diagnostics para medidas de hematocrito (HCT), volumen corpuscular medio (MCV), hemoglobina corpuscular media (MCH) y concentracion de hemoglobina corpuscular media (MCHC) y analisis, asi como medidas de los recuentos diferenciales de celulas sanguineas, tales como WBC, RBC y contenido total de hemoglobina.

Entre los 39 oligonucleotidos antisentido ensayados, ciertos oligonucleotidos antisentido, incluyendo a ISIS 455265, ISIS 455269, ISIS 455271, ISIS 455272, ISIS 455291, ISIS 455371, ISIS 455394, ISIS 455703, ISIS 455429, ISIS 455471, ISIS 455527, ISIS 455530, ISIS 455536, ISIS 455548, ISIS 455611, ISIS 465236, ISIS 465237, ISIS 465588, ISIS 465740, ISIS 465754, ISIS 465830, ISIS 466670, e ISIS 466720 cumplieron con los umbrales de tolerabilidad para el peso de organos, ALT, AST, BUN y parametros hematologicos.

EJEMPLO 38: MEDIDA DE LA VIDA MEDIA DE OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO EN HIGADO DE RATONES CD1

Los ratones CD1 se trataron con oligonucleotidos antisentido ISIS descritos y se evaluo la vida media del oligonucleotido en el higado.

TRATAMIENTO

Se inyectaron grupos de doce ratones CD1 por via subcutanea dos veces por semana durante 2 semanas con 50 mg/kg de ISIS 455265, ISIS 455269, ISIS 455271, ISIS 455272, ISIS 455291, ISIS 455371, ISIS 455393, ISIS 455553, ISIS 455582, ISIS 455703, ISIS 455394, ISIS 455429, ISIS 455438, ISIS 455471, ISIS 455527, ISIS 455530, ISIS 455536, ISIS 455540, ISIS 455548, ISIS 455611, ISIS 455429, ISIS 455463, ISIS 455464, ISIS 455471, ISIS 455527, ISIS 455611, ISIS 465236, ISIS 465237, ISIS 465239, ISIS 465588, ISIS 465740, ISIS 465742, ISIS 465751, ISIS 465752, ISIS 465754, ISIS 465830, ISIS 466670, ISIS 466718, e ISIS 466720. Cuatro ratones de cada grupo se sacrificaron 3 dias, 28 dias y 56 dias luego de la ultima dosis. Los higados se colectaron para el analisis.

MEDIDAS DE CONCENTRACION DE OLIGONUCLEOTIDO

Se midio la concentracion de oligonucleotido de longitud completa as ^ como la concentracion total de oligonucleotido (incluyendo la forma degradada). El metodo usado es una modificacion de metodos previamente publicados (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999), que incluye una extraccion en fenolcloroformo (liquido-liquido) seguida por una extraccion en fase solida. Se agrego un estandar interno (ISIS 355868, un oligonucleotido 27-mero de fosforotioato con modificacion 2'-O-metoxietilo, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, designada en la presente como SEQ ID N° 2758) antes de la extraccion. Se calcularon las concentraciones de muestra de tejido usando curvas de calibracion, con un limite inferior de cuantificacion (LLOQ) de aproximadamente 1.14 |jg/g. Luego se calcularon las vidas medias usando el programa de computacion WinNonlin (PHARSIGHT).

La vida media de cada oligonucleotido se presenta en la Tabla 58. Los oligonucleotidos antisentido con vidas medias dentro de entre 11 y 34 dias se eligieron para estudios adicionales.

TABLA 58

Vida media de oligonucleotidos ISIS en el higado de ratones CD1

EJEMPLO 39: TOLERABILIDAD DE OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENTIDO CONTRA STAT3 HUMANA EN RATAS SPRAGUE-DAWLEY

Veintitres oligonucleotidos antisentido que exhiben un nivel alto de potencia se probaron adicionalmente para tolerabilidad in vivo.

Se inyectaron grupos de cuatro ratas Sprague-Dawley por via subcutanea dos veces por semana durante 6 semanas con 50 mg/kg de oligonucleotidos antisentido ISIS. Un grupo de ratas se inyecto por via subcutanea dos veces por semana durante 6 semanas con PBS. Este grupo sirvio como el grupo control. Tres dias luego de la ultima dosis se sacrificaron las ratas y se colectaron los organos y el plasma para analisis adicionales. El peso del higado, bazo y rinones se midieron al final del estudio y se compararon con ratas tratadas con PBS.

Para evaluar el efecto de los oligonucleotidos ISIS sobre la funcion hepatica, se midieron las concentraciones plasmaticas de transaminasas usando un analizador para quimica clinica automatico (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron las concentraciones plasmaticas de AST (aspartato transaminasa) y bilirrubina total.

Para evaluar el efecto de los oligonucleotidos ISIS sobre la funcion renal, se midieron el BUN, proteinas totales en orina y creatinina usando un analizador para quimica clinica automatico (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY).

Entre los 23 oligonucleotidos antisentido ensayados, ciertos oligonucleotidos antisentido, que incluye a ISIS 455269, ISIS 455291, ISIS 455371, ISIS 455703, ISIS 455429, ISIS 465236, ISIS 465237, ISIS 465754, iSiS 465830, e ISIS 466670 cumplieron con los umbrales de tolerabilidad para el peso de organos, AST, bilirrubina, BUN, proteinas totales en orina y creatinina.

EJEMPLO 40: MEDIDA DE LA VIDA MEDIA DE OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO EN HIGADO Y RINON DE RATAS SPRAGUE-DAWLEY

Se trataron ratas Sprague Dawley con oligonucleotidos antisentido ISIS y se evaluaron la vida media del oligonucleotido asi como el tiempo transcurrido para la degradacion y eliminacion del oligonucleotido del higado y rinones.

TRATAMIENTO

Se inyectaron grupos de cuatro ratas Sprague Dawley por via subcutanea dos veces por semana durante 2 semanas con 20 mg/kg de ISIS 455265, ISIS 455269, ISIS 455271, ISIS 455272, ISIS 455291, ISIS 455371, ISIS 455394, ISIS 455703, ISIS 455429, ISIS 455471, ISIS 455527, ISIS 455530, ISIS 455536, ISIS 455548, ISIS 455611, ISIS 465236, ISIS 465237, ISIS 465588, ISIS 465740, ISIS 465754, ISIS 465830, ISIS 466670, e ISIS 466720. Tres dias despues de la ultima dosis, se sacrificaron las ratas y se recolectaron los higados y rinones para analisis.

MEDIDA DE LA CONCENTRACION DE OLIGONUCLEOTIDO

Se midio la concentracion del oligonucleotido de longitud completa asi como la concentracion total de oligonucleotido (que incluye la forma degradada). El metodo usado es una modificacion de metodos previamente publicados (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999), que incluye una extraccion en fenol-cloroformo (liquido-liquido) seguido por una extraccion en fase solida. Se agrego un estandar interno (ISIS 355868, un oligonucleotido 27-mero de fosforotioato con modificacion 2'-O-metoxietilo, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, designada en la presente como SEQ ID N° 2758) antes de la extraccion. Se calcularon las concentraciones de muestra de tejido usando curvas de calibracion, con un limite inferior de cuantificacion (LLOQ) de aproximadamente 1.14 |jg/g. Se calculo la relacion de rinon a higado de la concentracion del oligonucleotido de longitud completa, asi como la de la concentracion de oligonucleotido total. Los resultados se presentan en la Tabla 59. TABLA 59

Relacion rinon a higado de las concentraciones de oligonucleotido de longitud completa y total en ratas Sprague-Dawley

EJEMPLO 41: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE STAT3 DESPUES DE LA CAPTACION LIBRE DE OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO EN CELULAS SK-BR-3

Se probaron gapmeros de los estudios de tolerabilidad en roedores descritos en los Ejemplos 6-9 a diferentes dosis en celulas SK-BR-3. Se plaquearon las celulas con una densidad de 4,000 celulas por pocillo. Se incubaron las celulas sin ningun reactivo de transfeccion con concentraciones de 0.02 |jM, 0.10 ^|jM, 0.50 jiM, 1.00 ^|jM, 2.50 jiM y 10.00 ^|jM de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 60. Despues de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS199, como el que se describio previamente en la presente, se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

La concentracion inhibitoria semimaxima (IC50) de cada oligonucleotido tambien se presenta en la Tabla 60.

TABLA 60

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de STAT3 humana mediante captacion libre de oligonucleotido ISIS por las celulas SK-BR-3

EJEMPLO 42: MEDIDA DE LA VISCOSIDAD DE OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENTIDO ISIS CONTRA STAT3 HUMANA

La viscosidad de oligonucleotidos antisentido seleccionados de los estudios descritos en los Ejemplos 6-10 se midio con la ayuda de oligonucleotidos antisentido para separacion por tamizaje que tienen una viscosidad mayor a 40 cP. Los oligonucleotidos que tienen una viscosidad mayor de 40 cP podrian ser muy viscosos para ser administrados a cualquier sujeto.

Los oligonucleotidos ISIS (32-35 mg) se pesaron en un vial de vidrio, se agregaron 120 |jL de agua y se disolvio el oligonucleotido antisentido en la solucion por calentamiento del vial a 50°C. Parte (75 j L) de la muestra precalentada se transfirio con pipeta a un microviscosimetro (Cambridge). La temperatura del microviscosimetro se ajusto a 25°C y se midio la viscosidad de la muestra. Otra parte (20 |jL) de la muestra precalentada se transfirio con pipeta a 10 mL de agua para lectura en UV a 260 nM a 85°C (instrumento para UV Cary). Los resultados se presentan en la Tabla 61 e indican que todas las soluciones de oligonucleotidos antisentido tienen viscosidades optimas bajo el criterio establecido anteriormente.

TABLA 61

Viscosidad de oligonucleotidos antisentido ISIS contra STAT3 humana

EJEMPLO 43: EFECTO DE LOS OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENTIDO ISIS CONTRA STAT3 HUMANA EN MONOS CINOMOLOGOS

Nueve oligonucleotidos antisentido que exhiben un nivel alto de potencia se probaron adicionalmente en monos cinomologos. Se evaluo la tolerabilidad y perfil farmacocinetico de oligonucleotidos antisentido en el higado y rinon.

El estudio se realizo en el Instituto de toxicologia de Corea, Republica de Corea. Antes del estudio, los monos se mantuvieron en cuarentena durante un periodo de tiempo de 30 dias, durante el cual se realizaron paneles estandares de quimica serica y hematologia, examen de huevos y parasitos en muestras fecales y una prueba de tuberculosis, para separar por tamizaje los monos anormales o enfermos. Nueve grupos de cuatro monos cinomologos macho asignados al azar se inyectaron por via subcutanea tres veces por semana durante la primera semana y posteriormente dos veces por semana durante las siguientes 7 semanas, con 25 mg/kg de oligonucleotidos antisentido ISIS. Un grupo control de 4 monos cinomologos se inyecto con PBS por via subcutanea tres veces por semana durante la primera semana y posteriormente dos veces por semana durante las siguientes 7 semanas. Los sacrificios terminales de todos los grupos se realizaron en el dia 55, el cual fue 48 horas luego de la ultima dosis.

Durante el periodo del estudio, los monos se observaron diariamente para signos de enfermedad o sufrimiento. Cualquier animal que mostro efectos adversos al tratamiento se elimino y se llevo al veterinario y al director del estudio.

Para evaluar el efecto de los oligonucleotidos ISIS sobre la salud general de los animales, se midieron los pesos del bazo, corazon, rinon, higado y vesicula biliar en el dia 55. Se midieron los pesos de los organos y los pesos del grupo de tratamiento se compararon con los correspondientes pesos de control de PBS.

Para evaluar el efecto de los oligonucleotidos ISIS sobre la funcion hepatica y renal, se recolectaron muestras de sangre de todos los grupos de estudio. Los monos se ayunaron durante la noche antes de la recoleccion de sangre. Aproximadamente, 1 mL de cada una de las muestras de sangre re recolecto en tubos sin ningun anticoagulante para la separacion de suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante 90 minutos y luego se centrifugaron (3000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente) para obtener suero. Se midieron las concentraciones de las transaminasas usando un analizador para quimica clinica Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japon). Se midieron las concentraciones plasmaticas de ALT (alanina transaminasa), AST (aspartato transaminasa) y BUN en el dia 55. En el dia 55 tambien se midio de manera similar la protema C reactiva (CRP), la cual es sintetizada en el higado y que es util como marcador de inflamacion.

Para evaluar el efecto de los oligonucleotidos ISIS sobre factores involucrados en inflamacion, se recolecto sangre en el dia 55 de todos los animales para analisis de los niveles de C3 del complemento, niveles de citoquina MIP-1 p y numero de plaquetas.

Para el analisis del C3 del complemento, se recolectaron aproximadamente 0.5 mL de cada muestra de sangre en tubos sin anticoagulante para la separacion de suero. Para los analisis de los niveles de citoquinas, se recolectaron aproximadamente 2 mL de cada muestra de sangre en tubos sin anticoagulante para la separacion de suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante 90 minutos y luego se centrifugaron (3000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente) para obtener suero. El C3 del complemento se midio usando un analizador automatico (analizador para quimica clinica Toshiba 200 f R NEO, Toshiba co., Japon). El suero se utilizo para el analisis de citoquinas usando un arreglo de nueve paneles Searchlight Multiplex.

Para el recuento de plaquetas, se recolectaron aproximadamente 0.5 mL de cada una de las muestras de sangre en tubos que contenian sal de potasio de EDTA. Las muestras se analizaron para el recuento de plaquetas usando un analizador hematologico ADVIA120 (Bayer, EE.UU.).

La concentracion de oligonucleotido se midio en el higado y rinon en el dia 55. El metodo usado es una modificacion de metodos previamente publicados (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999), el cual incluye una extraccion en fenol-cloroformo (liquido-liquido) seguida por una extraccion en fase solida. Se agrego un estandar interno (ISIS 355868, un oligonucleotido 27-mero de fosforotioato con modificacion 2'-O-metoxietilo, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, designada en la presente como SEQ ID N° 2758) antes de la extraccion. Se calcularon las concentraciones de muestra de tejido usando curvas de calibracion, con un limite inferior de cuantificacion (LLOQ) de aproximadamente 1.14 |jg/g.

Entre los 9 oligonucleotidos antisentido ensayados, ciertos oligonucleotidos antisentido, que incluye a ISIS 455269, ISIS 455371, ISIS 455429, e ISIS 455670 cumplieron con los umbrales de tolerabilidad para el peso de organos, ALT, AST, BUN y parametros hematologicos.

EJEMPLO 44: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE _ STAT3 DESPUES DE LA CAPTACION LIBRE DE OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO EN CELULAS MDA-MB-231

Los oligonucleotidos ISIS del estudio descrito en el Ejemplo 12 se probaron adicionalmente a diferentes dosis en celulas MDA-MB-231. Se plaquearon las celulas a una densidad de 4,000 celulas por pocillo. Se incubaron las celulas sin ningun reactivo de transfeccion con concentraciones de 0.02 jM , 0.20 jM , 1.00 jM , 5.00 jM y 10.00 jM de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 62. Despues de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS199, como el descrito previamente en la presente, se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar. La concentracion inhibitoria semimaxima (IC50) de cada oligonucleotido tambien se presenta en la Tabla 62.

TABLA 62

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de STAT3 mediante captacion libre de oligonucleotido ISIS por celulas MDA-MB-231

EJEMPLO 45: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE _ STAT3 DESPUES DE LA CAPTACION LIBRE DE OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO EN CELULAS

U251-MG

Los oligonucleotidos ISIS del estudio descrito en el Ejemplo 12 se probaron adicionalmente a diferentes dosis en celulas U251-MG. Se plaquearon las celulas a una densidad de 4,000 celulas por pocillo. Se incubaron las celulas sin ningun reactivo de transfeccion con concentraciones de 0.1 |jM, 1.0 j M, 5.0 j M, 10.0 j M y 20.0 j M de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 63. Despues de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS199, como el descrito previamente en la presente, se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar. La concentracion inhibitoria semimaxima (IC50) de cada oligonucleotido tambien se presenta en la Tabla 63.

TABLA 63

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de STAT3 mediante captacion libre de oligonucleotido ISIS por las celulas U251-MG

EJEMPLO 46: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE _ STAT3 DESPUES DE LA CAPTACION LIBRE DE OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO EN CELULAS

A431

Los oligonucleotidos ISIS del estudio descrito en el Ejemplo 12 se probaron adicionalmente a diferentes dosis en celulas A431. Se plaquearon las celulas a una densidad de 4,000 celulas por pocillo. Se incubaron las celulas sin ningun reactivo de transfeccion con concentraciones de 0.02 j M, 0.2 j M, 1.0 j M, 5.0 j M y 10.0 j M de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 64. Despues de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS199, como el descrito previamente en la presente, se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

La concentracion inhibitoria semimaxima (IC50) de cada oligonucleotido tambien se presenta en la Tabla 64. Como se ilustra en la Tabla 64, los oligonucleotidos ISIS fueron capaces de penetrar la membrana celular y reducir significativamente los niveles de ARNm de STAT3 en una forma dependiente de la dosis.

TABLA 64

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de STAT3 mediante captacion libre de oligonucleotido ISIS por las celulas A431

EJEMPLO 47: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE _ STAT3 DESPUES DE LA CAPTACION LIBRE DE OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO EN CELULAS

H460

Los oligonucleotidos ISIS del estudio descrito en el Ejemplo 12 se probaron adicionalmente a diferentes dosis en celulas H460. Se plaquearon las celulas a una densidad de 4,000 celulas por pocillo. Se incubaron las celulas sin ningun reactivo de transfeccion con concentraciones de 0.02 |jM, 0.20 ^|jM, 1.00 ^|jM, 5.00 ^|jM y 10.00 ^|jM de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 65. Despues de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS199, como el descrito previamente en la presente, se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de ARN total, segun la medida por Ribogreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

La concentracion inhibitoria semimaxima (IC50) de cada oligonucleotido tambien se presenta en la Tabla 65. Como se ilustra en la Tabla 65, los oligonucleotidos ISIS fueron capaces de penetrar la membrana celular y reducir significativamente los niveles de ARNm de STAT3 en una forma dependiente de la dosis.

TABLA 65

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de STAT3 mediante captacion libre de oligonucleotido ISIS por las celulas H460

EJEMPLO 48: EFECTO DE LOS OLIGONUCLEOTIDOS ISIS DIRIGIDOS CONTRA STAT3 EN EL TRATAMIENTO DEL MODELO DE XENOINJERTO DE CANCER DE GLIOMA HUMANO U251 Se trataron ratones atimicos BALB/c inoculados con celulas de tumor de glioma U251 humanas con oligonucleotidos ISIS del estudio descrito en el Ejemplo 12. Se evaluo el efecto del tratamiento sobre el crecimiento del tumor en los ratones.

TRATAMIENTO

Los ratones atimicos BALB/c fueron implantados por via subcutanea con 1 x 106 celulas tumorales. En el dia 4 de la implantacion, grupos de 4 ratones cada uno se administraron con 50 mg/kg inyectados intraperitonealmente cinco veces por semana durante 3 semanas y media de ISIS 455269, ISIS 455291, ISIS 455371, ISIS 455703, ISIS 455429, ISIS 465237, ISIS 465754, ISIS 465830, o ISIS 466670. Un grupo de ratones se administro con 50 mg/kg inyectados intraperitonealmente cinco veces por semana durante 3 semanas y media del oligonucleotido control, ISIS 141923. Un grupo de ratones se administro con PBS inyectado intraperitonealmente cinco veces por semana durante 3 semanas y media.

EFECTO SOBRE EL CRECIMIENTO DEL TUMOR

El tamano del tumor se midio dos veces semanalmente en dos dimensiones usando un calibre y los volumenes de los tumores se calcularon usando la formula: V = 0.5 x a x b2, en donde a y b son los diametros mayor y menor del tumor, respectivamente. Los resultados se presentan en la Tabla 66. Los datos indican que el tratamiento con oligonucleotidos ISIS previene significativamente el crecimiento del tumor. 'n/a' indica que los puntos de datos para ese punto en el tiempo no estan disponibles.

TABLA 66

Efecto de la inhibicion por antisentido de STAT3 sobre el crecimiento del tumor en el modelo de xenoinjerto U251

EJEMPLO 49: EFECTO DE ISIS 455291 DIRIGIDO CONTRA STAT3 EN EL TRATAMIENTO DE UN MODELO DE XENOINJERTO DE CANCER DE MAMA HUMANO MDA-MB-231

Se trataron ratones atimicos BALB/c inoculados con celulas cancerigenas de mama humanas MDA-MB-231 con ISIS 455291. Se evaluo el efecto del tratamiento sobre el crecimiento del tumor y la tolerabilidad en los ratones.

TRATAMIENTO

El estudio se realizo en Pharmaron Inc (Beijing, Republica Popular China). Los ratones atimicos BALB/c se obtuvieron de Beijing HFK Bio-Technology Co., Ltd. Las celulas de cancer de mama humanas MDA-MB-231 se mantuvieron in vitro como un cultivo monocapa en medio L-15 de Leibovitz suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor, penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 |jg/mL y L-glutamina 2 mM. Las celulas se mantuvieron a 37°C en una atmosfera de CO25% en aire. Las celulas tumorales se subcultivaron rutinariamente dos veces semanalmente con tratamiento con tripsina-EDTA. Las celulas crecidas en fase de crecimiento exponencial se recolectaron y se contaron para la inoculacion de tumor.

Dos grupos de ocho ratones atimicos BALB/c hembra asignados al azar entre 6 y 8 semanas de edad se inocularon cada uno en el flanco derecho con los fragmentos de tumor MDA-MB-231 (3 mm x 2 mm x 2 mm, que fueron generados a partir del pasaje de inoculacion del tumor) para el desarrollo del tumor. El tratamiento con oligonucleotido antisentido comenzo el dia 11 luego de la inoculacion del tumor cuando el tamano medio del tumor alcanzo aproximadamente 100 mm3. Uno de los grupos se inyecto intraperitonealmente dos veces por semana durante 3 semanas con 50 mg/kg de ISIS 455291. El otro grupo de ratones se inyecto intraperitonealmente dos veces por semana durante 3 semanas con PBS y sirvio como grupo control.

Todos los procedimientos relacionados con el manejo, cuidado y tratamiento de animales, fueron realizados de acuerdo a las normativas aprobadas por el Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Al momento del monitoreo de rutina, se revisaron los animales para cualquier efecto del crecimiento del tumor sobre el comportamiento normal, tal como movilidad, consumo de alimento, cambios en el peso corporal y cualquier otro efecto anormal.

a n Alis is de a r n

Se extrajo ARN del tejido tumoral para el analisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de STAT3 humana usando el juego de sonda y cebadores RTS199, que se describio previamente en la presente. Los niveles murinos de ARNm de STAT3 tambien se midieron usando el juego de sonda y cebadores mSTAT3_LTS00664 (secuencia directa CGACAGCTTCCCCATGGA, designada en la presente como SEQ ID N° 1513; secuencia reversa ATGCCCAGTCTTGACTCTCAATC, designada en la presente como SEQ ID N° 1514; secuencia de sonda CTGCGGCAGTTCCTGGCACCTT, designada en la presente como SEQ ID N° 1515). Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion al control de PBS, normalizados a ciclofilina. Como se muestra en la Tabla 67, el tratamiento con ISIS 455291 dio como resultado la reduccion del ARNm humano y murino de STAT3 en comparacion al control de PBS.

TABLA 67

Inhibicion de ARNm de STAT3 en los grupos de tratamiento en relacion al control de PBS en el modelo de xenoinjerto MDA-MB-231

EFECTO SOBRE EL CRECIMIENTO DEL TUMOR

El tamano del tumor se midio dos veces semanalmente en dos dimensiones usando un calibre y los volumenes de los tumores se calcularon usando la formula: V = 0.536 x a x b2, en donde a y b son los diametros mayor y menor del tumor, respectivamente. El tamano del tumor se utilizo para los calculos de los valores T-C y T^v/C^v . T-C se calculo con T como la mediana del tiempo (en dias) requerido para que los tumores en los grupos de tratamiento alcanzaran un tamano predeterminado (900 mm3) y C como la mediana del tiempo (en dias) para que los tumores en el grupo control alcanzaran el mismo tamano. El valor T^v/C^v (expresado como porcentaje) es una indicacion de la eficacia antitumoral de los oligonucleotidos ISIS, en donde T^v y C^v eran los volumenes promedio de los grupos tratado y control, respectivamente, en un dia dado (dia 32).

Los resultados se presentan en las Tablas 68 y 69. Los datos indican que la inhibicion del ARNm de STAT3 previene significativamente el crecimiento del tumor.

TABLA 68

Efecto de la inhibicion por antisentido de STAT3 sobre el crecimiento del tumor en el modelo de xenoinjerto MDA-MB-231

TABLA 69

Efecto de la inhibicion por antisentido de STAT3 sobre el crecimiento del tumor inhibicion en el modelo de xenoinjerto MDA-MB-231

MEDIDAS DEL PESO CORPORAL

Para evaluar el efecto de los oligonucleotidos ISIS sobre la salud general de los animales, se midieron los pesos corporales regularmente durante el periodo de tratamiento. Los datos se presentan en la Tabla 70 e indican que el tratamiento con ISIS 455291 no afecta el peso corporal general de los ratones.

TABLA 70

Medidas de peso corporal de ratones en el modelo de xenoinjerto MDA-MB-231

EJEMPLO 50: EFECTO DE ISIS 455291 DIRIGIDO CONTRA STAT3 EN EL TRATAMIENTO DE UN MODELO DE XENOINJERTO DE CARCINOMA EPIDERMOIDE HUMANO A431

Se trataron ratones atimicos BALB/c inoculados con celulas de cancer epidermoide humano A431 con ISIS 455291. Se evaluo el efecto del tratamiento sobre el crecimiento del tumor y la tolerabilidad en los ratones.

TRATAMIENTO

El estudio se realizo en Pharmaron Inc (Beijing, Republica Popular China). Los ratones atimicos BALB/c se obtuvieron de Beijing HFK Bio-Technology Co., Ltd. Las celulas de carcinoma epidermoide humano A431 se mantuvieron en in vitro como un cultivo en monocapa en medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor, penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 |jg/mL y L-glutamina 2 mM. Las celulas se mantuvieron a 37°C en una atmosfera de CO25% en aire. Las celulas tumorales se subcultivaron rutinariamente dos veces semanalmente con tratamiento con tripsina-EDTA. Las celulas crecidas en fase de crecimiento exponencial se recolectaron y se contaron para la inoculacion de tumor.

Dos grupos de ocho ratones atimicos BALB/c hembra asignados al azar de entre 6 y 8 semanas de edad se inocularon cada uno por via subcutanea con 5 x 106 celulas tumorales A431 para el desarrollo del tumor. El tratamiento con oligonucleotido antisentido se inicio en el dia 8 luego de la inoculacion cuando el tamano promedio del tumor alcanzo aproximadamente 95 mm3. Uno de los grupos se inyecto intraperitonealmente dos veces por semana durante 4 semanas con 50 mg/kg de ISIS 455291. El otro grupo de ratones se inyecto intraperitonealmente dos veces por semana durante 3 semanas con PBS y sirvio como grupo control.

Todos los procedimientos relacionados con el manejo, cuidado y tratamiento de animales, fueron realizados de acuerdo a las normativas aprobadas por el Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Al momento del monitoreo de rutina, se revisaron los animales para cualquier efecto del crecimiento del tumor sobre el comportamiento normal, tal como movilidad, consumo de alimento, cambios en el peso corporal y cualquier otro efecto anormal.

ANALISIS DE ARN

Se extrajo ARN del tejido tumoral para el analisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de STAT3 humana usando el juego de sonda y cebadores RTS199, que se describio previamente en la presente. Los niveles murinos de ARNm de STAT3 tambien se midieron usando el juego de sonda y cebadores mSTAT3_LTS00664. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion al control de PBS, normalizados a ciclofilina. Como se muestra en la Tabla 71, el tratamiento con ISIS 455291 dio como resultado la reduccion en el ARNm de STAT3 humana y murina en comparacion al control de PBS.

TABLA 71

Inhibicion de ARNm de STAT3 en los grupos de tratamiento en relacion al control de PBS en el modelo de xenoinjerto A431

EFECTO SOBRE EL CRECIMIENTO DEL TUMOR

El tamano del tumor se midio dos veces semanalmente en dos dimensiones usando un calibre y los volumenes de los tumores se calcularon usando la formula: V = 0.5 x a x b2, en donde a y b son los diametros mayor y menor del tumor, respectivamente. El tamano del tumor se utilizo para los calculos de los valores T-C y T^v/C^v . T-C se calculo con T como la mediana del tiempo (en dias) requerido para que los tumores en los grupos de tratamiento alcanzaran un tamano predeterminado (800 mm3) y C como la mediana del tiempo (en dias) para que los tumores en el grupo control alcanzaran el mismo tamano. El valor T^v/C^v (expresado como porcentaje) es una indicacion de la eficacia antitumoral de los oligonucleotidos ISIS, en donde T^v y C^v eran los volumenes promedio de los grupos tratado y control, respectivamente, en un dia dado (dia 33).

Los resultados se presentan en las Tablas 72 y 73. Los datos indican que la inhibicion de ARNm de STAT3 previno el crecimiento del tumor.

TABLA 72

Efecto de la inhibicion por antisentido de STAT3 sobre el crecimiento del tumor en el modelo de xenoinjerto A431

TABLA 73

Efecto de la inhibicion por antisentido de STAT3 sobre el crecimiento del tumor inhibicion en el modelo de xenoinjerto A431

MEDIDAS DE PESO CORPORAL

Para evaluar el efecto de los oligonucleotidos ISIS sobre la salud general de los animales, se midieron los pesos corporales regularmente durante el periodo de tratamiento. Los datos se presentan en la Tabla 74 e indican que el tratamiento con ISIS 455291 no afecta el peso corporal general de los ratones.

TABLA 74

Medidas de peso corporal de ratones en el modelo de xenoinjerto A431

EJEMPLO 51: EFECTO DE ISIS 455291 DIRIGIDO CONTRA STAT3 EN EL TRATAMIENTO_ DE UN MODELO DE XENOINJERTO DE CANCER DE PULMON A CELULAS NO PEQUENAS

(NSCLC) NCI-H460

Se trataron ratones aMmicos BALB/c inoculados con NSCLC humanas de NCI-H460 con ISIS 455291. Se evaluo el efecto del tratamiento sobre el crecimiento del tumor y la tolerabilidad en los ratones.

TRATAMIENTO

El estudio se realizo en Pharmaron Inc (Beijing, Republica Popular China). Los ratones atimicos BALB/c se obtuvieron de Beijing HFK Bio-Technology Co., Ltd. Las celulas NSCLC humanas NCI-H460 se mantuvieron in vitro como un cultivo monocapa en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor, penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 |jg/mL y L-glutamina 2 mM. Las celulas se mantuvieron a 37°C en una atmosfera de CO25% en aire. Las celulas tumorales se subcultivaron rutinariamente dos veces semanalmente con tratamiento con tripsina-EDTA. Las celulas crecidas en fase de crecimiento exponencial se recolectaron y se contaron para la inoculacion de tumor.

Se inocularon grupos de ocho ratones atimicos BALB/c hembra asignados al azar de entre 6 y 8 semanas de edad cada uno por via subcutanea con 2 x 106 de celulas tumorales NCI-H460 para el desarrollo del tumor. El tratamiento con oligonucleotido antisentido comenzo en el dia 6 luego de la inoculacion del tumor cuando el tamano promedio del tumor alcanzo aproximadamente 100 mm3. Uno de los grupos se inyecto intraperitonealmente dos veces por semana durante 3 semanas con 50 mg/kg de ISIS 455291. El otro grupo de ratones se inyecto intraperitonealmente dos veces por semana durante 3 semanas con PBS y sirvio como grupo control.

Todos los procedimientos relacionados con el manejo, cuidado y tratamiento de animales, fueron realizados de acuerdo a las normativas aprobadas por el Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Al momento del monitoreo de rutina, se revisaron los animales para cualquier efecto del crecimiento del tumor sobre el comportamiento normal, tal como movilidad, consumo de alimento, cambios en el peso corporal y cualquier otro efecto anormal.

EFECTO SOBRE EL CRECIMIENTO DEL TUMOR

El tamano del tumor se midio dos veces semanalmente en dos dimensiones usando un calibre y los volumenes de los tumores se calcularon usando la formula: V = 0.5 x a x b2, en donde a y b son los diametros mayor y menor del tumor, respectivamente. El tamano del tumor se utilizo para los calculos de los valores T-C y T^v/C^v . T-C se calculo con T como la mediana del tiempo (en dias) requerido para que los tumores en los grupos de tratamiento alcanzaran un tamano predeterminado (1,500 mm3) y C como la mediana del tiempo (en dias) para que los tumores en el grupo control alcanzaran el mismo tamano. El valor T^v/C^v (expresado como porcentaje) es una indicacion de la eficacia antitumoral de los oligonucleotidos ISIS, en donde T^v y C^v eran los volumenes promedio de los grupos tratado y control, respectivamente, en un dia dado (dia 20).

Los resultados se presentan en las Tablas 75 y 76. Los datos indican que la inhibicion de STAT3 previno significativamente el crecimiento del tumor.

TABLA 75

Efecto de la inhibicion por antisentido de STAT3 sobre el crecimiento del tumor en el modelo de xenoinjerto NCI-H460

TABLA 76

Efecto de la inhibicion por antisentido de STAT3 sobre la inhibicion del crecimiento del tumor en el modelo de xenoinjerto NCI-H460

MEDIDAS DE PESO CORPORAL

Para evaluar el efecto de los oligonucleotidos ISIS sobre la salud general de los animales, se midieron los pesos corporales regularmente durante el periodo de tratamiento. Los datos se presentan en la Tabla 77 e indican que el tratamiento con ISIS 455291 no afecta el peso corporal general de los ratones.

TABLA 77

Medidas de peso corporal de ratones en el modelo de xenoinjerto NCI-H460

EJEMPLO 52: EFECTO DE LA INHIBICION POR ANTISENTIDO DE STAT3 HUMANA EN UN MODELO DE RATON ORTOTOPICO DE GLIOBLASTOMA HUMANO

Se trataron ratones NU/J implantados ortotopicamente con celulas de glioblastoma humano con ISIS 455291, un gapmero 5-10-5 MOE que tiene una secuencia CAGCAGATCAAGTCCAGGGA (SEQ ID N° 1590). Se evaluo el efecto del tratamiento sobre el crecimiento del tumor y la tolerabilidad en los ratones.

TRATAMIENTO

Treinta ratones NU/J se implantaron estereotacticamente en el lobulo frontal derecho con 5 x 105 celulas MG-luc2 U-87. En el dia 15 luego de la implantacion de las celulas de tumor, 15 de estos ratones se dosificaron intracranealmente con una inyeccion en bolo en el sitio de implantacion del tumor con 100 |jg de ISIS 455291, que se disolvieron en 2 |jL de PBS. Los 15 ratones remanentes se dosificaron intracranealmente con una inyeccion en bolo en el sitio de implantacion del tumor con 2 jL de PBS. El segundo grupo de ratones sirvio como grupo control.

ANALISIS

En el dia 18 luego del trasplante del tumor, se sacrificaron cinco ratones de cada grupo por inhalacion de CO2 y se recolectaron muestras de cerebro para el analisis de ARN. El ARN se extrajo a partir del tejido tumoral para el analisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de STAT3 humana usando el juego de sonda y cebadores RTS199, que se describio previamente en la presente. El tratamiento con ISIS 455291 dio como resultado un 27% de reduccion de ARNm de STAT3 humana en el tejido tumoral en comparacion al control de PBS.

Los ratones remanentes en cada grupo se monitorearon regularmente hasta 2 semanas para el analisis de supervivencia. La mediana de la supervivencia para el grupo control de PBS fue 30.5 dias. La mediana de la supervivencia para los ratones tratados con oligonucleotidos ISIS fue 35 dias. El valor P fue 0.2088.

EJEMPLO 53: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE _ STAT3 DESPUES DE LA CAPTACION LIBRE DE OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO EN CELULAS PC9

El ISIS 455703 e ISIS 455291, de los estudios que se describieron previamente, se probaron adicionalmente a diferentes dosis en celulas PC9, una linea de celulas de carcinoma a celulas no pequenas. Se plaquearon las celulas a una densidad de 3,000 celulas por pocillo. Se incubaron las celulas con concentraciones de 0.02 ^|jM, 0.1 ^|jM, 0.5 ^|jM, 2.5 ^|jM y 10.0 ^|jM de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 78. Despues de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS2033 (secuencia directa GAGGCCCGCCCAACA, designada en la presente como SEQ ID N° 1520; secuencia reversa TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT, designada en la presente como SEQ ID N° 1521; secuencia de sonda CTGCCTAGATCGGC, designada en la presente como SEQ ID N° 1522) se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de beta-actina, un gen estandar interno, segun la medida con el juego de cebadores y sonda humanos HTS5002 (secuencia directa CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA, designada en la presente como SEQ ID N° 1529; secuencia reversa GCCATGCCAATCTCATCTTGT, designada en la presente como SEQ ID N° 1530; secuencia de sonda CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA, designada en la presente como SEQ ID N° 1531). Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

La concentracion inhibitoria semimaxima (IC50) de cada oligonucleotido tambien se presenta en la Tabla 78. Como se ilustra en la Tabla 78, ISIS 455703 e ISIS 455291 fueron capaces de penetrar la membrana celular.

TABLA 78

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de STAT3 mediante captacion libre de oligonucleotido ISIS por celulas PC9

EJEMPLO 54: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE STAT3 DESPUES DE LA CAPTACION LIBRE DE OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO EN CELULAS

C42B

El ISIS 455291, de los estudios que se describieron previamente, se ensayo adicionalmente a diferentes dosis en celulas C42B, una linea de celulas de cancer de prostata. Se plaquearon las celulas a una densidad de 3,000 celulas por pocillo. Se incubaron las celulas con concentraciones de 0.02 jiM, 0.1 jiM, 0.5 jiM, 2.5 jiM y 10.0 jiM de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 79. Despues de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS2033 (secuencia directa GAGGCCCGCCCAACA, designada en la presente como SEQ ID N° 1520; secuencia reversa TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT, designada en la presente como Se Q ID N° 1521; secuencia de sonda CTGCCTAGATCGGC, designada en la presente como SEQ ID N° 1522) se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de beta-actina, un gen estandar interno, segun la medida con el juego de cebadores y sonda humanos HTS5002 (secuencia directa CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA, designada en la presente como SEQ ID N° 1529; secuencia reversa GCCATGCCAATCTCATCTTGT, designada en la presente como SEQ ID N° 1530; secuencia de sonda CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA, designada en la presente como SEQ ID N° 1531). Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

Como se ilustra en la Tabla 79, ISIS 455291 tuvo la capacidad de penetrar la membrana celular.

TABLA 79

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de STAT3 mediante captacion libre de oligonucleotido ISIS por celulas C42B

EJEMPLO 55: INHIBICION POR ANTISENTIDO DEPENDIENTE DE LA DOSIS DE _ STAT3 DESPUES DE LA CAPTACION LIBRE DE OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO EN CELULAS COLO201

El ISIS 455291, de los estudios que se describieron previamente, se ensayo adicionalmente a diferentes dosis en celulas Colo201, una linea de celulas de cancer colorrectal. Se plaquearon las celulas a una densidad de 3,000 celulas por pocillo. Se incubaron las celulas con concentraciones de 0.02 ^|jM, 0.1 ^|jM, 0.5 ^|jM, 2.5 ^|jM y 10.0 ^|jM de oligonucleotido antisentido, como se especifica en la Tabla 80. Despues de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN a partir de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de STAT3 por PCR cuantitativa en tiempo real. El juego de sonda y cebadores para STAT3 humana RTS2033 (secuencia directa GAGGCCCGCCCAACA, designada en la presente como SEQ ID N° 1520; secuencia reversa TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT, designada en la presente como Se Q ID N° 1521; secuencia de sonda CTGCCTAGATCGGC, designada en la presente como SEQ ID N° 1522) se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de STAT3 se ajustaron de acuerdo al contenido de beta-actina, un gen estandar interno, segun la medida con el juego de cebadores y sonda humanos HTS5002 (secuencia directa CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA, designada en la presente como SEQ ID N° 1529; secuencia reversa GCCATGCCAATCTCATCTTGT, designada en la presente como SEQ ID N° 1530; secuencia de sonda CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA, designada en la presente como SEQ ID N° 1531). Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de STAT3, en relacion a las celulas control sin tratar.

La concentracion inhibitoria semimaxima (IC50) de cada oligonucleotido tambien se presenta en la Tabla 80. Como se ilustra en la Tabla 29, el ISIS 455291 tuvo la capacidad de penetrar la membrana celular.

TABLA 80

Inhibicion por antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de STAT3 mediante captacion libre de oligonucleotido ISIS por celulas Colo201

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto monocatenario que comprende un oligonucleotido monocatenario modificado que consiste en 16 nucleosidos unidos que tienen una secuencia de nucleobase que consiste en la SEQ ID NO: 245, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en donde el oligonucleotido modificado comprende:

una extension 5' que consiste en 3 nucleosidos unidos;

una extension 3' que consiste en 3 nucleosidos unidos;

un hueco entre la extension 5' y la extension 3' que consiste en 102-desoxinucleosidos unidos;

en donde cada nucleosido de cada una de la extension 5' y la extension 3' comprende un nucleosido de etilo restringido;

en donde cada union internucleosido es una union fosforotioato; y

en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.

2. El compuesto de la reivindicacion 1, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que el oligonucleotido esta unido covalentemente a uno o mas grupos conjugados.

3. El compuesto de la reivindicacion 2, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que el uno o mas grupos conjugados incluyen carbohidratos.

4. Una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo y un diluyente o vehiculo farmaceuticamente aceptable.

5. Un compuesto monocatenario que comprende un oligonucleotido monocatenario modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, o la composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 4 para uso en el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa en un animal.

6. El compuesto o composicion de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que el animal es un humano.

7. El compuesto o composicion de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6, en el que la enfermedad hiperproliferativa es cancer.