KR20220070227A - 유전자 스플라이싱을 조절하는데 이용가능한 화합물 및 방법 - Google Patents

유전자 스플라이싱을 조절하는데 이용가능한 화합물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자 스플라이싱을 조절하는데 유용한 화합물, 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 유전자 스플라이싱 조절은 표적 단백질 또는 표적 기능성 RNA의 발현을 증가시킨다.

Description

유전자 스플라이싱을 조절하는데 이용가능한 화합물 및 방법
관련 출원
본 출원은 2019년 9월 19일자 미국 가출원번호 62/902,603 및 2019년 12월 4일자 미국 가출원번호 62/943,539에 대해 우선권을 주장한다. 이들 출원은 전체 교시 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용한 치료학적 접근법의 개발 가능성은 1978년에 발표된 논문에서 최초로 제시되었다. Zamecnik and Stephenson, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 280-284 및 285-288 (1978)에는, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 게놈의 부분에 대해 상보적인 13 mer 합성 올리고뉴클레오티드가 감염된 닭 섬유모세포에서 RSV 복제를 저해하고, 일차 병아리 섬유모세포의 악성 육종 세포로의 RSV-매개 형질전환을 저해함을, 기술하고 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드 접근법은 DNA 및/또는 RNA 기반의 올리고뉴클레오티드를 이용하여, 선택 mRNA, microRNA, preRNA 또는 미토콘드리아 RNA 표적에 서열-특이적으로 결합함으로써, 이로부터 생기는 번역을 저해하는 것이다. 이러한 올리고뉴클레오티드-기반의 번역, 궁극적으로 유전자 발현의 저해는, 비-제한적으로, (i) 번역의 직접 (입체) 차단, (ii) RNase H-매개 저해, 및 (iii) RNAi-매개 저해 (예를 들어, 짧은 간섭 RNA (siRNA), microRNA (miRNA), 스플라이싱의 조절, 비-암호화 RNA의 저해 및 단일 가닥 RNAi (ssRNAi))를 포함할 수 있는, 한가지 이상의 세포 기전의 결과이다.
안티센스 기술은 역사적으로, mRNA에 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 결정하는 것은 간단하지만, 유전자 발현을 저해할 수 있는 진정한 가능성을 가진, 즉 양호한 임상 후보물질일 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 최적화하는 것은 간단하지 않은 것으로, 드러났다. 안티센스 기술은 올리고뉴클레오티드를 기반으로 하므로, 생체내 불안정하고, 비-표적 효과, 예를 들어 의도되지 않은 면역 자극을 야기할 가능성이 있는, 근원적인 문제를 가지고 있다 (Agrawal & Kandimalla (2004) Nature Biotech. 22:1533-1537).
이러한 각각의 기술을 최적화하기 위한 접근법은 생체 안정성, RNA 표적에 대한 친화성, 세포 투과성 및 생체내 활성을 다루는데 집중되어 왔다. 종종, 이러한 고려 사항들이 상충되는 경우도 있다. 예를 들어, 전통적인 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드간 결합으로 포스포다이에스테르를 이용하지만, 이것은 생물학적으로 불안정하여 효과적이지 않은 것으로 입증되었다. 그래서, 이를 보다 생물학적으로 안정적으로 만들기 위해 안티센스 올리고뉴클레오티드를 변형하는데 초점이 맞춰졌다. 초기 접근법은 뉴클레오티드간 결합을 세포 뉴클레아제에 의한 분해로부터 더 잘 견딜 수 있도록 변형시키는데 집중하였다. 그러나, 이러한 변형이 분자의 표적 특이성을 떨어뜨릴 수 있으며, 원치않는 생물학적 활성을 초래할 수도 있다.
아울러, 올리고뉴클레오티드 연구를 통해, 이들 분자가 생체내에서 엑소뉴클레아제에 의한 분해에 취약하고, 일차적인 분해가 분자의 3' 말단에서 시작한다는 것이, 확인되었다 (Temsamani et al. (1993) Analytical Bioc. 215:54-58). 그래서, 이러한 엑소뉴클레아제 활성을 회피하기 위한 접근법이 활용되었다.
상당한 연구에도 불구하고, 안정성을 개선하고 RNA 표적 인지를 유지하고자 하는, 비-표적 효과가 없는, 시도에도 불구하고, 일반적으로 임상 성공 가능성이 높은 것으로 인지되는 올리고뉴클레오티드를 만들지 못하였다. 따라서, 유전자 발현을 하향 조절하고자 하는 올리고뉴클레오티드-기반의 접근법이 성공하려면, 이러한 결과를 가장 효과적으로 달성하는 최적화된 안티센스 올리고뉴클레오티드가 여전히 필요하다. 안티센스 활성에 대한 핵심 기전은 대략적으로 2가지이다. 첫번째 기전은 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적 RNA에 혼성하여 형성된 듀플렉스가 RNase H를 활성화하는 것이다. 2번째 기전은 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적에 혼성하여 스플라이싱 등의 표적 RNA의 프로세싱을 차단하고, 이로써 유전자 발현을 저해하거나 또는 증가시키는 것이다. 이러한 안티센스 결합 기전은 또한 넌센스 매개 소멸 (nonsense mediated decay)을 유발해, 유전자 발현을 저해하거나 또는 증가시킬 수 있다. 이러한 2가지 접근법을 이용한 경우, 비-표적 효과가 관찰되었으므로, 비-표적 활성을 완화하고 효능을 높이기 위한 새로운 안티센스 설계가 요구되고 있다.
스플라이싱을 조절하기 위해, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA에 높은 친화성으로 선택적으로 결합하도록 설계된다. 지금까지, 이러한 기전에서 채택된 안티센스 후보물질로는 변형된 RNA 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 세포에서 스플라이싱을 조절하기 위해 최초기 실험에서 사용되었던 2'-O-메틸 올리고리보뉴클레오시드가 있다 (Sierakowska et al., (1996) Proc Natl Acad Sci USA, v93(23): 12840-4; Wilton et al., Neuromuscul Discord (1999) v9(5): 330-8). 그 이후로, 수종의 다른 변형된 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 2'-메톡시에톡시, LNA, HNA, CeNa, ANA 또는 이들 변형의 혼합을 가진 올리고뉴클레오티드들이 조사되었다.
하지만, 다른 새로운 설계가 요구되고 있다.
본 발명은, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적 RNA의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 12개 이상의 인접한 핵염기를 가진 연결된 뉴클레오티드 14-30개를 포함하되, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 각각 독립적으로 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개를 독립적으로 가진 영역을 1-3개 포함하고, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된 뉴클레오티드, 비-이온성 뉴클레오티드 또는 구속된 당 뉴클레오티드 (constrained sugar nucleotide) 또는 이들의 조합인, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는 RNA 프로세싱을 조절하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적 pre-mRNA의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 12개 이상의 인접한 핵염기를 가진 연결된 뉴클레오티드 14-30개를 포함하되, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 pre-mRNA에서 제2 mRNA 전사체를 위한 스플라이스 부위를 표적화하여 제2 mRNA 전사체를 위한 스플라이스 부위를 차단함으로써 pre-mRNA가 1차 mRNA 전사체로 스플라이싱되도록 안내하고; 안티센스 올리고뉴클레오티드는 각각 독립적으로 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 영역을 1-3개 포함하고; 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된 뉴클레오티드, 비-이온성 뉴클레오티드 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합인, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, mRNA 전사체가 2가지 이상인 유전자에서 제1 mRNA 전사체를 선택하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적 RNA의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 12개 이상의 인접한 핵염기를 가진 연결된 뉴클레오티드 14-30개를 포함하되, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 각각 독립적으로 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 영역을 1-3개 포함하고, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된 뉴클레오티드, 비-이온성 뉴클레오티드 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합인, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, RNA 프로세싱의 조절이 개체 치료에 유익한, 질환 또는 장애를 개체에서 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적 RNA의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 12개 이상의 인접한 핵염기를 가진 연결된 뉴클레오티드 14-30개를 포함하되, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 각각 독립적으로 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 영역을 1-3개 포함하고, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된 뉴클레오티드, 비-이온성 뉴클레오티드 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합인, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는 표적 RNA의 넌센스 매개 소멸을 유도하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적 RNA의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 12개 이상의 인접한 핵염기를 가진 연결된 뉴클레오티드 14-30개를 포함하되, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 각각 독립적으로 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 영역을 1-3개 포함하고, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된 뉴클레오티드, 비-이온성 뉴클레오티드 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합인, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 단백질 또는 기능성 mRNA를 암호화하는 mRNA의 수준 증가와 단백질 또는 기능성 mRNA의 발현 증가를 달성하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 잔류 인트론 (retained intron)을 포함하는 표적 pre-mRNA의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 12개 이상의 인접한 핵염기를 가진 연결된 뉴클레오티드 14-30개를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 각각 독립적으로 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 영역을 1-3개 포함하고, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된 뉴클레오티드, 비-이온성 뉴클레오티드 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합이다.
도 1A 및 도 1B는 본 발명의 구현예들의 대략도이다.
본 발명은 유전자 스플라이싱을 조절하는데 이용가능한 화합물, 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 유전자 스플라이싱의 조절은 표적 단백질의 발현을 증가시키고, 바람직하지 않은 단백질 또는 표적 기능성 RNA의 발현을 억제한다.
관례상, 본원에 기술된 서열은 달리 명시되지 않은 한 5'에서 3' 방향으로 기재된다. 아울러, 서열번호로 기재된 서열을 가진 가닥은 달리 언급되지 않은 한 5'에서 3' 방향의 서열을 가진다.
용어 "3'"은, 방향에 대해 사용되는 경우, 일반적으로 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 내 한 영역 또는 위치가 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 내 다른 영역 또는 위치로부터 3' (뉴클레오티드의 3' 말단 방향)에 있는 것을 의미한다. 용어 "3' 말단"은 일반적으로 구성성분 올리고뉴클레오티드의 3' 마지막 뉴클레오티드를 지칭한다.
용어 "5'"은, 방향에 대해 사용되는 경우, 일반적으로 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 내 한 영역 또는 위치가 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 내 다른 영역 또는 위치로부터 5' (뉴클레오티드의 5' 말단 방향)에 있는 것을 의미한다. 본원에서, 용어 "5' 말단"은 일반적으로 구성성분 올리고뉴클레오티드의 5' 마지막 뉴클레오티드를 지칭한다.
용어 "약"은 일반적으로 정확한 숫자가 필연적인 것은 아님을 의미한다. 즉, 1개 또는 2개의 수개의 뉴클레오시드 잔기 또는 수개의 부가적인 뉴클레오시드 잔기를 가진 올리고뉴클레오티드들이 전술한 구현예들 각각에서 등가물로서 고려된다.
"안티센스 활성"은 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물이 이의 표적 핵산에의 혼성함으로써 발생되는 임의의 검출가능한 또는 측정가능한 활성을 의미한다. 특정 구현예에서, 안티센스 활성은 이러한 표적 핵산에 의해 암호화되는 표적 핵산 또는 단백질의 양 또는 발현의 감소이다. 특정 구현예에서, 안티센스 활성은 스플라이싱의 조절이며, 이로써 이러한 표적 핵산에 의해 암호화되는 단백질의 발현이 저해되거나 또는 증가된다.
"안티센스 저해"는 표적 핵산에 대해 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드의 존재시 표적 핵산 수준 또는 표적 단백질 수준이, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 부재시의 표적 핵산 수준 또는 표적 단백질 수준에 비해 감소하는 것을 의미한다.
"안티센스 올리고뉴클레오티드"는 표적 핵산의 대응되는 영역 또는 분절에의 혼성화를 허용하는 핵염기 서열을 가진 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
용어 "공동-투여" 또는 "공동-투여한다"는 일반적으로 2종 이상의 서로 다른 물질을 투여하는 것을 의미한다. 공동-투여는 동시 투여뿐 아니라 2종 이상의 서로 다른 물질을 단일 투여 또는 분리된 투여로서 임의 순서로 최대 수일 간격의 시간적으로 분리된 순서를 의미한다.
용어 "와 조합하여"는 일반적으로 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드-기반의 화합물과, 화합물의 활성을 해치지 않는 질환 또는 병태를 치료하는데 유용한 다른 물질을 환자를 치료하는 과정 중에 투여하는 것을 의미한다. 이러한 투여는 동시 투여뿐 아니라 수초 내지 최대 수일 간격의 시간적으로 분리된 순서를 비롯하여, 임의 순서로 수행할 수 있다. 이러한 조합 치료는 또한 본 발명에 따른 화합물 및/또는 독립적으로 다른 물질을 1회 투여보다 더 많은 횟수로 투여하는 것을 포함할 수도 있다. 본 발명에 따른 화합물과 다른 물질의 투여는 동일한 경로 또는 서로 다른 경로를 통해 수행할 수 있다.
용어 "개인" 또는 "개체" 또는 "환자"는 일반적으로 인간과 같은 포유류를 의미한다. 용어 "포유류"는, 비-제한적으로 인간, 인간을 제외한 영장류, 랫. 마우스, 고양이, 개, 말, 소, 젖소, 양 및 토끼 등의, 온혈, 척추 동물을 포괄하는 것으로 명확하게 의도된다. 본원에서, "필요로 하는 개체"는 이러한 치료 또는 요법이 필요한 치료 또는 요법의 대상으로 선정된 인간 또는 인간 이외의 동물을 의미한다.
본원에서, "발현 또는 활성의 저해"는 RNA 또는 단백질의 발현 또는 활성의 감소 또는 차단을 의미하지만, 반드시 발현 또는 활성의 전체 소거를 의미하는 것은 아니다.
용어 "뉴클레오시드"는 일반적으로 당, 통상적으로 리보스, 데옥시리보스, 펜토스, 아라비노스 또는 헥소스, 및 퓨린 또는 피리미딘 염기로 이루어진 화합물을 지칭한다. 본 발명의 목적에서, 염기가 구아닌, 시토신, 아데닌, 티민 또는 우라실이 아닌 경우, 염기는 비-천연성으로 간주되며, 당이 β-리보-푸라노사이드 또는 2'-데옥시리보-푸라노사이드가 아닌 겨우, 그 당은 비-천연성으로 간주된다.
용어 "뉴클레오티드"는 일반적으로 당에 부착된 인-함유 기를 포함하는 뉴클레오시드를 의미한다. 본원에서, "연결된 뉴클레오시드"는 포스페이트 연결을 통해 연결될 수 있거나 연결되지 않을 수 있으며, 따라서, 비-제한적으로, "연결된 뉴클레오티드"를 포괄한다. 본원에서, "연결된 뉴클레오시드"는 뉴클레오시드가 연속적인 서열로 연결된 것이다 (즉, 연결된 것 사이에 부가적인 뉴클레오시드가 존재하지 않음).
용어 "핵산"은 게놈 영역 또는 이로부터 전사되는 RNA 분자를 망라한다. 일부 구현예에서, 핵산은 mRNA이다. 일부 구현예에서, 핵산은 microRNA이다. 일부 구현예에서, 핵산은 ncRNA이다.
본원에서, "핵염기"는 당 모이어티에 연결되어, 올리고뉴클레오티드로 병합될 수 있는 뉴클레오시드를 형성할 수 있는 원자들의 군을 의미하며, 원자들의 군은 다른 올리고뉴클레오티드 또는 핵산의 상보적인 자연 생성 핵염기와 결합할 수 있는 것이다. 핵염기는 자연 생성될 수 있거나 또는 변형된 것일 수 있다. 본원에서, "핵염기 서열"은 임의의 당, 결합 또는 핵염기 변형과 무관한 인접한 핵염기들의 순서를 의미한다.
본원에서 용어 "비-변형된 핵염기" 또는 "자연 생성 핵염기"는 RNA 또는 DNA의 자연 생성 헤테로사이클릭 핵염기를 의미한다: 퓨린 염기, 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 피리미딘 염기, 티민 (T), 시토신 (C)(5-메틸 C 등) 및 우라실 (U).
본원에서, "변형된 핵염기"는 자연 생성 핵염기가 아닌 모든 핵염기를 의미한다.
본원에서, "변형된 뉴클레오시드"는 자연 생성 RNA 또는 DNA 뉴클레오시드와 비교해 하나 이상의 화학적 변형을 가진 뉴클레오시드를 의미한다. 변형된 뉴클레오시드는 변형된 당 모이어티 및/또는 변형된 핵염기를 포함한다.
본원에서, "올리고뉴클레오티드"는 연결된 뉴클레오시드를 복수개 포함하는 화합물을 의미한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 비-변형된 리보뉴클레오시드 (RNA) 및/또는 비-변형된 데옥시리보뉴클레오시드 (DNA) 하나 이상을 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 비-변형된 리보뉴클레오시드 (RNA) 및/또는 비-변형된 데옥시리보뉴클레오시드 (DNA)만 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드를 하나 이상 포함한다.　
본원에서, "변형된 올리고뉴클레오티드"는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 및/또는 하나 이상의 변형된 당을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본원에서 "뉴클레오시드간 결합 (internucleoside linkage)"은 올리고뉴클레오티드에서 인접한 뉴클레오시드들 간의 공유 결합을 의미한다. 본원에서, "자연 생성 뉴클레오시드간 결합"은 3' -> 5' 포스포다이에스테르 결합을 의미한다. 본원에서, "변형된 뉴클레오시드간 결합"은 자연 생성 뉴클레오시드들 간의 결합을 제외한 다른 모든 뉴클레오시드간 결합을 의미한다.
표현 "단일 가닥 RNA 서열에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드" 등은, 올리고뉴클레오티드의 핵염기가 단일 가닥 RNA 서열의 핵염기와 왓슨-클릭 상호작용을 통해 충분한 수의 수소 결합을 형성하여, 단일 가닥 RNA 서열과 생리학적 조건에서 이중 나선을 형성하는, 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이는, 이중 가닥 DNA 또는 RNA와 후그스틴 수소 결합을 통해 삼중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드와는 대비된다.
본원에서, "화학적 변형"은 자연 생성 카운터파트와 비교되는 화합물의 화학적 차이를 의미한다. 올리고뉴클레오티드에 대한 화학적 변형으로는 뉴클레오시드 변형 (당 모이어티 변형 및 핵염기 변형 등) 및 뉴클레오시드간 결합의 변형을 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 경우, 화학적 변형은 핵염기 서열 차이만 있는 것은 포함하지 않는다.
용어 "상보적인"은 올리고뉴클레오티드가 생리학적 조건에서 핵산 서열에, 예를 들어 왓슨-클릭 염기 쌍 형성 (올리고뉴클레오티드와 단일 가닥 핵산 간의 상호작용) 또는 후그스틴 염기 쌍 형성 (올리고뉴클레오티드와 이중 가닥 핵산 간의 상호작용) 또는 올리고뉴클레오티드의 경우, RNA에 결합해 유사매듭 (pseudoknot)의 형성 유발 등의 임의의 기타 수단에 의해 결합하는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 생리학적 조건에서 왓슨-클릭 또는 후그스틴 염기 쌍 형성에 의한 결합은 핵산 서열의 기능 간섭을 관찰함으로써 실질적인 값으로 측정된다.
"완전히 상보적인" 또는 "100% 상보적인"은 제1 핵산의 각 핵염기가 제2 핵산에서 상보적인 핵염기를 가지는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 제1 핵산은 안티센스 화합물이고, 표적 핵산은 제2 핵산이다.
"혼성화"는 상보적인 핵산 분자의 어닐링을 의미한다. 특정 구현예에서, 상보적인 핵산 분자는 안티센스 화합물 및 표적 핵산을 포함한다.
"넌센스 매개 소멸"은 mRNA 또는 pre-mRNA를 분해하는 RNase H 또는 RISC와는 독립적인 임의의 여러가지 세포 기전들을 의미한다. 특정 구현예에서, 넌센스 매개 소멸은 조기 정지 코돈을 가진 mRNA 전사체를 제거 및/또는 분해한다. 특정 구현예에서, 넌센스 매개 소멸은 임의 형태의 비정상적인 mRNA 및/또는 pre-mRNA 전사체를 제거 및/또는 분해한다.
용어 "약제학적으로 허용가능한"은 본 발명에 따른 화합물의 효능 또는 본 발명에 따른 화합물의 생물학적 활성을 간섭하지 않는 무독성 물질을 의미한다.
"부분 (portion)"은 핵산에서 지정된 개수로 이루어진 인접한 (즉, 연결된) 핵염기들을 의미한다. 특정 구현예에서, 부분은 표적 핵산에서 지정된 개수로 이루어진 인접한 핵염기이다. 특정 구현예에서, 부분은 안티센스 화합물에서 지정된 개수로 이루어진 인접한 핵염기이다.
용어 "예방학적인 유효량"은 일반적으로 바람직하지 않은 생물학적 효과를 방지하거나 또는 낮추는데 충분한 양을 의미한다.
본원에서, "당 모이어티"는 뉴클레오시드의 자연 생성 당 모이어티 또는 변형된 당 모이어티를 의미한다. 본원에서, "자연 생성 당 모이어티"는 자연 생성 RNA에서 발견되는 것과 같은 리보푸라노실 또는 자연생성 DNA에서 발견되는 것과 같은 데옥시리보푸라노실을 의미한다. 본원에서, "변형된 당 모이어티"는 치환된 당 모이어티 또는 당 대용물 (sugar surrogate), 비-제한적인 예로, 2' 변형된 당 또는 구속된 당을 의미한다.
용어 "치료학적 유효량" 또는 "약제학적 유효량"은 일반적으로 유익한 결과와 같이 요망되는 생물학적 효과에, 비-제한적으로, 질환 또는 장애의 징후 또는 증상의 예방, 약화, 개선 또는 소거를 비롯하여, 영향을 미치기에 충분한 양을 의미한다. 즉, 약학적 조성물 및 방법에서 각각의 활성 성분의 총량은 의미있는 환자 이점, 예를 들어, 비-제한적으로, 면역 자극을 특징으로 하는 만성 병태의 치유를 달성하기에 충분하다. 이에, "약제학적 유효량"은 이것이 투여되는 상황에 따라 달라질 것이다. 약제학적 유효량은 예방학적 투여 또는 치료학적 투여 중 한가지 이상으로 투여할 수 있다. 단독 투여되는 개별 활성 성분에 적용되는 경우, 이 용어는 단독 성분에 대한 것이다. 조합에 적용되는 경우, 이 용어는 연속적 또는 동시적인 조합 투여와 관계없이 치료학적 효과를 발생시키는 활성 성분들의 양을 합한 것을 의미한다.
용어 "치료"는 일반적으로 증상의 완화, 질환의 진행 지연 또는 개선을 포함할 수 있는, 유익한 또는 요망한 결과를 달성하기 위해 의도한 접근법을 의미한다.
용어 "유전자 발현"은 일반적으로 유전자로부터 수득한 정보를 단백질일 수 있는 기능성 유전자 산물을 합성하는데 이용하는 과정을 지칭한다. 이러한 과정은 전사, RNA 스플라이싱, 번역 및 단백질의 번역 후 수정을 수반할 수 있으며, mRNA, pre-mRNA, 비-암호화 RNA, snoRNA, 리보좀 RNA 및 그외 단백질 합성의 주형을 포함할 수 있다.
"표적화" 또는 "표적화된"은 표적 핵산에 특이적으로 혼성하여 요망하는 효과를 유도하게 될 안티센스 올리고뉴클레오티드를 설계 및 선별하는 과정을 의미한다. "표적 유전자", "표적 대립유전자", "표적 핵산", "표적 RNA", "표적 mRNA" 및 "표적 RNA 전사체"는 모두 안티센스 올리고뉴클레오티드가 특이적으로 혼성하게 될 핵산을 지칭한다. "표적 대립유전자"는 발현이 선택적으로 표적화된 대립유전자이다. "표적 분절", "표적 영역" 및 "표적 부위"는 모두 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
표적 영역은 표적 핵산의 구조적으로 정의되는 영역이다. 예를 들어, 표적 영역은 3' UTR, 5' UTR, 엑손, 인트론, 엑손/인트론 정션, 암호화 영역, 번역 개시 영역, 번역 종결 영역 또는 기타 정의된 핵산 영역을 망라할 수 있다.
일부 구현예들은 동물에 본원에 기술된 안티센스 화합물 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법 및 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 안티센스 화합물의 투여는 단백질의 활성 또는 유전자의 발현과 관련있는 질환 또는 병태를 방지하거나, 치료하거나, 개선하거나 또는 진행을 늦춘다. 특정 구현예에서, 동물은 인간이다.
본 발명은 스플라이싱을 조절하기 위한 새로운 안티센스 올리고뉴클레오티드 디자인을 제공한다. 이러한 디자인에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 도메인 2개를 가진다 (도 1 참조). 제1 도메인은 리보뉴클레오티드 (RNA), 변형된 RNA 또는 이들의 조합으로 구성되며, 이는 표적 RNA에 대한 친화성을 제공한다. 제2 도메인은 RNase H를 동원하지만 RNase H가 안티센스 올리고뉴클레오티드-표적 RNA 듀플렉스를 절단하지 못하는 포스포다이에스테르 또는 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드 (DNA)로 구성된다. RNase H의 동원 및 올리고뉴클레오티드-표적 RNA 듀플렉스에의 이의 결합이, 듀플렉스 부위에 입체 장애를 제공해, 스플라이싱을 촉진한다. 본원에서, 변형된 RNA로는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 뉴클레오티드 등이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
본원에 기술된 임의 방법은 본원에 개시된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 스플라이싱을 조절하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 RNA 스플라이싱을 조절하는 방법을 제공한다. 구현예들에서, RNA는 pre-mRNA, mRNA, 비-암호화 RNA를 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 구현예들에서, RNA는 pre-mRNA이다. 구현예들에서, RNA는 mRNA이다. 구현예들에서, RNA는 비-암호화 RNA이다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 잔류 인트론을 포함한다.
일부 구현예에서, 표적 pre-mRNA는 잔류 인트론을 포함한다. 일부 구현예에서, 잔류 인트론은 엑손 한쪽 측면 또는 양쪽에 위치한다. 일부 구현예에서, 엑손이 잔류 인트론의 5' 스플라이스 부위 측면에 위치한다. 일부 구현예에서, 엑손이 잔류 인트론의 3' 스플라이스 부위 측면에 위치한다. 일부 구현예에서, 엑손이 잔류 인트론의 5' 스플라이스 부위 측면에 위치하고, 엑손이 잔류 인트론의 3' 스플라이스 부위 측면에 위치한다.
일부 구현예에서, 잔류 인트론이 표적 RNA로부터 구성적으로 스플라이싱되며; 따라서 단백질 또는 기능성 mRNA를 암호화하는 mRNA의 수준을 증가시키고, 단백질 또는 기능성 mRNA의 발현을 높여준다. 일부 구현예에서, 본 발명은 단백질 또는 기능성 mRNA를 암호화하는 mRNA의 수준을 증가시키고 단백질 또는 기능성 mRNA의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 스플라이싱 조절 방법은 단백질의 양 또는 활성의 결핍, 또는 기능성 mRNA의 양 또는 활성의 결핍에 의해 유발되는 병태를 가진 개체를 치료하는데 유용하며; 상기한 단백질 또는 기능성 mRNA의 양 또는 활성의 결핍은 표적 단백질 또는 표적 기능성 RNA의 반수체 기능 부전 (haploinsufficiency)으로 인한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 스플라이싱 조절이 개체를 치료하는데 유익한 질환 또는 장애를 개체에서 치료하는 방법을 제공한다. 구현예들에서, 질환 또는 장애는 단백질의 양 또는 활성의 결핍 또는 기능성 mRNA의 양 또는 활성의 결핍에 의해 유발된다. 구현예들에서, 단백질 또는 기능성 mRNA의 양 또는 활성의 결핍은 표적 단백질 또는 표적 기능성 RNA의 반수체 기능 부전에 의해 유발된다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물은 표적 RNA의 영역에 대한 상보적인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물은 잔류 인트론을 포함하는 표적 RNA의 영역에 대해 상보적인 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 표적 pre-mRNA의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 12개 이상의 인접한 핵염기를 가진 연결된 뉴클레오티드 14-30개를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하며, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 pre-mRNA에서 제2 mRNA 전사체용 스플라이스 부위를 표적화하여 제2 mRNA 전사체용 스플라이스 부위를 차단함으로써 pre-mRNA가 제1 mRNA 전사체로 스플라이싱되게 안내하고, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 각각 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 뉴클레오티드 영역을 1-3개 포함하고, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합인, mRNA 전사체가 2가지 이상인 유전자에서 제1 mRNA를 선택하는 방법을 제공한다.
본원의 임의 구현예들에서, 잔류 인트론은 표적 RNA로부터 구성적으로 스플라이싱되며, 이로써 단백질 또는 기능성 mRNA를 암호화하는 mRNA의 수준이 증가하고 단백질 또는 기능성 mRNA의 발현이 증가한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 단백질 또는 기능성 mRNA를 암호화하는 mRNA의 수준을 증가시키고 단백질 또는 기능성 mRNA의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.
구현예들에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 뉴클레오티드 영역을 하나 포함하며, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합이다.
구현예들에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 뉴클레오티드 영역을 2개 포함하며, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 영역들 2개는 서로 인접하지 않는다.
구현예들에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 뉴클레오티드 영역을 3개 포함하며, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 데옥시리보뉴클레오티드 영역들은 서로 인접하지 않는다.
일 구현예에서, 본 발명은 표적 pre-mRNA의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 12개 이상의 인접한 핵염기를 가진 연결된 뉴클레오티드 14-30개를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하며, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 pre-mRNA에서 제2 mRNA 전사체용 스플라이스 부위를 표적화하여 제2 mRNA 전사체용 스플라이스 부위를 차단함으로써 pre-mRNA가 제1 mRNA 전사체로 스플라이싱되게 안내하고, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-4개로 구성되는 뉴클레오티드 영역을 1-3개 포함하고, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합인, mRNA 전사체가 2가지 이상인 유전자에서 제1 mRNA를 선택하는 방법을 제공한다.
구현예들에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-4개로 구성되는 뉴클레오티드 영역을 하나 포함하며, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합이다.
구현예들에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-4개로 구성되는 뉴클레오티드 영역을 2개 포함하며, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 영역 2개는 서로 인접하지 않는다.
구현예들에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-4개로 구성되는 뉴클레오티드 영역을 3개 포함하며, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 데옥시리보뉴클레오티드 영역들은 서로 인접하지 않는다.
일 구현예에서, 본 발명은 표적 pre-mRNA의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 12개 이상의 인접한 핵염기를 가진 연결된 뉴클레오티드 14-30개를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하며, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 pre-mRNA에서 제2 mRNA 전사체용 스플라이스 부위를 표적화하여 제2 mRNA 전사체용 스플라이스 부위를 차단함으로써 pre-mRNA가 1차 mRNA 전사체로 스플라이싱되게 안내하고, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 데옥시리보뉴클레오티드 영역을 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 위치에 포함하고, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합인, mRNA 전사체가 2가지 이상인 유전자에서 제1 mRNA를 선택하는 방법을 제공한다. 구현예들에서, 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 4개로 구성되는 데옥시리보뉴클레오티드 영역이 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치하고, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합이다.
일 구현예에서, 본 발명은 표적 pre-mRNA의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 12개 이상의 인접한 핵염기를 가진 연결된 뉴클레오티드 14-30개를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하며, 상기한 안티센스 올리고뉴클레오티드가 pre-mRNA에서 제2 mRNA 전사체용 스플라이스 부위를 표적화하여 제2 mRNA 전사체용 스플라이스 부위를 차단함으로써 pre-mRNA가 1차 mRNA 전사체로 스플라이싱되게 안내하고, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 데옥시리보뉴클레오티드 영역을 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 위치에 포함하고, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합인, mRNA 전사체가 2가지 이상인 유전자에서 제1 mRNA를 선택하는 방법을 제공한다. 구현예들에서, 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 4개로 구성되는 데옥시리보뉴클레오티드 영역이 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 위치에 포함하고, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 세포를 본원에 기술된 안티센스 올리고뉴클레오티드와 접촉시켜, 표적 전구체 전사체의 프로세싱을 조절하는 것을 포함하는 표적 RNA의 프로세싱을 조절하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA의 프로세싱은 암호화 RNA 및 비-암호화 RNA의 스플라이싱, 전달, 수송, 번역, 분해를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, RNA 프로세싱은 RNA 결합 단백질의 저해를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 프로세싱은 암호화 RNA 및 비-암호화 RNA의 스플라이싱을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 프로세싱은 암호화 RNA 및 비-암호화 RNA의 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 프로세싱은 암호화 RNA 및 비-암호화 RNA의 수송을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 프로세싱은 암호화 RNA 및 비-암호화 RNA의 번역을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 프로세싱은 암호화 RNA 및 비-암호화 RNA의 분해를 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여를 포함하는, 표적 전구체 전사체의 프로세싱을 조절함으로써 질환 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여를 포함하는, 표적 RNA의 넌센스 매개 소멸을 유도하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 표적 핵산의 스플라이싱을 조절하고, 이러한 조절이 넌센스 매개 소멸을 통해 표적 핵산의 분해 및/또는 감소를 유발한다.
특정 구현예에서, 표적 핵산에 상보적인 본원에 기술된 안티센스 올리고뉴클레오티드는, mRNA를 인지하여 분해하는 넌센스 매개 소멸 경로를 유발할 수 있는 엑손이, 포함되도록 증가시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 표적 핵산에 상보적인 본원에 기술된 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 넌센스 매개 소멸 경로가 엑손 없는 mRNA를 인지하여 분해하게 유발할 수 있는 엑손이, 제외되도록 증가시킬 수 있다.
넌센스 매개 소멸은 비정상적인 mRNA 전사체의 제거 및/또는 분해를 통해 비정상적인 유전자의 발현에서 오류를 줄이는 감시 경로의 일종이다. 특정 구현예에서, 넌센스 매개 소멸 기전은 pre-mRNA 프로세싱에서 오류로 생긴 mRNA를 선택적으로 분해한다. 예를 들어, 다수의 pre-mRNA 전사체들이 대안적으로 스플라이싱되어 다양한 엑손 조합들을 가진 여러 개의 mRNA 전사체를 만들 수 있는 여러 개의 엑손과 인트론을 포함한다. 이들 mRNA 전사체는 이후 여러 개의 단백질 이소형들로 번역된다. 특정 구현에서, pre-mRNA는 상기한 방식에서, 포함할 경우 비-기능성 단백질 또는 잘못 접힌 단백질을 암호화하거나 또는 암호화하게 될 mRNA를 유발하는 하나 이상의 엑손을 포함하도록, 프로세싱된다. 특정 구현예에서, pre-mRNA는 상기한 방식, 포함할 경우 조기 종결 코돈을 가진 mRNA를 만드는 하나 이상의 엑손을 포함하도록, 프로세싱된다. 이러한 특정 구현예에서, 넌센스 매개 소멸 기전이 여분의 엑손을 포함한 mRNA 전사체를 인지해, 번역하기 전 이 mRNA 전사체를 분해한다. 이러한 특정 구현예에서, 넌센스 매개 소멸 기전은 조기 종결 코돈을 가진 mRNA 전사체를 인지하여, 번역하기 전 이 mRNA 전사체를 분해한다.
특정 구현예에서, pre-mRNA는 상기한 방식에서, 엑손이 제외될 경우 비-기능적인 단백질을 암호화하는 mRNA가 만들어지는 하나 이상의 엑손이 제외되도록, 프로세싱된다. 특정 구현예에서, pre-mRNA는, 상기한 방식에서, 엑손이 제외될 경우 조기 종결 코돈을 가진 mRNA가 만들어지는 하나 이상의 엑손이 제외되도록, 프로세싱된다. 이러한 특정 구현예에서, 넌센스 매개 소멸 기전이 이 엑손이 누락된 mRNA 전사체를 인지하여, 번역하기 전 그 mRNA 전사체를 분해한다. 이러한 특정 구현예에서, 넌센스 매개 소멸 기전이 엑손 누락되고 조기 종결 코돈을 가진 mRNA 전사체를 인지해, 번역하기 전 mRNA 전사체를 분해한다.
임의의 특정한 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적 RNA에 결합해 RNase H와 복합체를 형성하는 것은 허용하지만; 안티센스 올리고뉴클레오티드는 RNase H 비활성으로 된다. 다시 말해, 안티센스 올리고뉴클레오티드/표적 RNA-RNase H 복합체가 RNase H에 의해 절단되지 않을 것이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 국소 투여한다.
특정 구현예에서, 안티센스 화합물은 표적 핵산에 대해 상보적인 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 또는 이로 구성된다. 특정 구현예에서, 표적 핵산은 내인성 RNA 분자이다. 특정 구현예에서, 표적 핵산은 pre-mRNA이다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 pre-mRNA의 스플라이싱을 조절한다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 pre-mRNA의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이되, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 pre-mRNA의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 12개 이상의 인접한 핵염기를 가진 연결된 뉴클레오티드 14-30개를 포함하고, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 뉴클레오티드 영역을 1-3개 포함하며, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 pre-mRNA의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이되, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 pre-mRNA의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 12개 이상의 인접한 핵염기를 가진 연결된 뉴클레오티드 14-30개를 포함하고, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-4개로 구성되는 뉴클레오티드 영역을 1-3개 포함하며, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 pre-mRNA의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이되, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 pre-mRNA의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 12개 이상의 인접한 핵염기를 가진 연결된 뉴클레오티드 14-30개를 포함하고, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 데옥시리보뉴클레오티드 영역을 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 포함하며, 나머지 뉴클레오티는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 pre-mRNA의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이되, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 pre-mRNA의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 12개 이상의 인접한 핵염기를 가진 연결된 뉴클레오티드 14-30개를 포함하고, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 데옥시리보뉴클레오티드 영역을 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 포함하고, 나머지 뉴클레오티는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합이다.
구현예들에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 영역을 하나 포함하고, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합이다. 구현예들에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 각각 독립적으로 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 데옥시리보뉴클레오티드 영역을 2개 포함하고, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합이다. 구현예들에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 각각 독립적으로 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 데옥시리보뉴클레오티드 영역을 3개 포함하고, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합이다.
구현예들에서, 데옥시리보뉴클레오티드 영역은 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개를 포함하며, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합이다. 구현예들에서, 데옥시리보뉴클레오티드 영역은 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-4개를 포함하며, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합이다. 구현예들에서, 데옥시리보뉴클레오티드 영역은 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 4개를 포함하며, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 2'-치환된 뉴클레오티드는, 비-제한적으로, 2'-O-메틸리보뉴클레오티드, 2'-O-메톡시-에틸 (2'-MOE) 리보뉴클레오티드, 2'-할로겐 (예를 들어, 플루오로) 뉴클레오티드 및 모르폴리노 변형된 핵산으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 구속된 당 뉴클레오티드는 이환식 뉴클레오시드 (bicyclic nucleoside)를 포함한다. 일부 구현예에서, 이환식 뉴클레오시드는 잠긴 (locked) 뉴클레오시드 및 브릿징된 뉴클레오시드 (bridged nucleoside)를 포함한다. 일부 구현예에서, 구속된 당 뉴클레오티드는, 비-제한적으로, 잠긴 핵산 (LNA), 펩타이드 핵산 (PNA), 안하이드로헥시톨 핵산 (HNA), 사이클로헥세닐 핵산 (CeNA), 알트리톨 핵산 (ANA), 구속된 MOE (cMOE), 구속된 에틸 (cEt), 에틸렌 브릿징된 핵산 (ENA), 세리놀 핵산 (SNA), 및 트위스트 인터컬레이팅 (twisted intercalating) 핵산 (TINA)으로부터 선택되나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 비-이온성은 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르 및 모르폴리노 (PMO)를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드는 2'-치환될 수 있으며, 구속된 당을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2, 3, 4 또는 5개를 포함하는 데옥시리보뉴클레오티드 영역을 하나 포함한다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2, 3 또는 4개를 포함하는 데옥시리보뉴클레오티드 영역을 하나 포함한다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2개를 포함하는 데옥시리보뉴클레오티드 영역을 하나 포함한다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 3개를 포함하는 데옥시리보뉴클레오티드 영역을 하나 포함한다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 4개를 포함하는 데옥시리보뉴클레오티드 영역을 하나 포함한다. 일부 구현예에서, 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 위치한다.
일부 구현예에서, 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치한다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 각각 독립적으로 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2, 3 또는 4개를 포함하는 데옥시리보뉴클레오티드 영역을 2개 포함한다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 각각 독립적으로 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2, 3 또는 4개를 포함하는 데옥시리보뉴클레오티드 영역을 3개 포함한다.
일부 구현예에서, 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 위치하거나, 또는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 올리고뉴클레오티드의 측면에 위치하거나 또는 이들의 조합 위치들에 존재한다. 일부 구현예에서, 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치한다. 일부 구현예에서, 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 위치한다. 일부 구현예에서, 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드는 2'-치환된 올리고리보뉴클레오티드의 측면에 위치한다.
일부 구현예에서, 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드는 자연 생성 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드는 비-변형된 것이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드는 변형된 것이다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 약제학적으로 허용가능한 것이다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 주사가능하다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 mRNA일 수 있다. 특정 구현예는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 타겟 서열의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 12개 이상의 인접한 핵염기를 포함하는 뉴클레오티드 17개 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 타겟 서열의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 12개 이상의 인접한 핵염기를 포함하는 뉴클레오티드 18-25개 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물을 제공한다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물은 뉴클레오티드 18개 길이이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물은 뉴클레오티드 19개 길이이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물은 뉴클레오티드 20개 길이이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물은 뉴클레오티드 21개 길이이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물은 뉴클레오티드 22개 길이이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물은 뉴클레오티드 23개 길이이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물은 뉴클레오티드 24개 길이이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물은 뉴클레오티드 25개 길이이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 표적 서열의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 12개 이상의 인접한 핵염기를 포함하는 뉴클레오티드 20개 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물을 제공한다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-4개로 구성되는 뉴클레오티드 영역을 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 포함하고, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된, 비-이온성 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 14개 이상 길이, 예를 들어 뉴클레오티드 14-30개 길이일 수 있다. 이에, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 14-25개 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 17-22개 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 19-28개 길이일 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 17개 길이일 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 18개 길이일 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 19개 길이일 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 20개 길이일 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 21개 길이일 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 22개 길이일 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 23개 길이일 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 24개 길이일 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 25개 길이일 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 26개 길이일 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 27개 길이일 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 28개 길이일 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 29개 길이일 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 30개 길이일 수 있다.
RNA에서 천연 또는 비-변형된 염기는 아데닌 (A) 및 구아닌 (G)이고, 피리미딘 염기 시토신 (C) 및 우라실 (U)(DNA는 티민 (T)임)이다. 대조적으로, 변형된 염기는, 또한 헤테로사이클릭 베이스 모이어티로도 지칭되며, 기타 핵염기, 예를 들어 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 피리미딘 염기의 5-프로피닐 우라실 및 시토신 및 기타 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 (5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실과 시토신 등), 7-메틸구아닌과 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌과 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌 등이 있다.
특정 구현예에서, 변형된 핵염기는 다음으로부터 선택된다: 유니버셜 염기, 소수성 염기, 혼성 염기 (promiscuous base), 크기-확장된 염기 (size-expanded base) 및 본원에 정의된 불소화 염기 (fluorinated base). 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, 예를 들어, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실; 5-프로피닐시토신; 5-하이드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌과 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌과 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실과 시토신, 및 피리미딘 염기의 기타 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 기타 8-치환된 아데닌과 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실과 시토신, 7-메틸구아닌과 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌과 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌과 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌과 3-데아자아데닌. 추가적인 변형된 핵염기로는 삼환계 피리미딘, 예를 들어 페녹사진 시티딘 ([5,4-b][1,4]벤즈옥사진-2(3H)-온), 페노티아진 (페노티아진) 시티딘 (1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프 (G-clamp), 예를 들어 치환된 페녹사진 시티딘 (예, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][1,4]벤즈옥사진-2(3H)-온), 카르바졸 시티딘 (2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘 (H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온) 등이 있다. 변형된 핵염기는 또한 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클로 치환된 것, 예를 들어 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 핵염기는 5-메틸시토신이다.
대표적인 변형된 당으로는 탄소고리 당 (carbocyclic sugar) 또는 비환식 당 (acyclic sugar), 2', 3' 또는 4' 위치들 중 하나 이상에서 치환기를 가진 당, 및 당의 수소 원자 하나 이상 대신 치환기를 가진 당 등이 있다. 특정 구현예에서, 당은 2' 위치에 치환기를 가짐으로써 변형된다. 추가적인 구현예에서, 당은 3' 위치에 치환기를 가짐으로써 변형된다. 다른 구현예들에서, 당은 4' 위치에 치환기를 가짐으로써 변형된다. 또한, 당이 이들 위치들 중 2곳 이상에서 변형을 가질 수 있거나, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 한 위치에 당 변형을 가진 뉴클레오티드 1개 이상과 다른 위치에 당 변형을 가진 뉴클레오티드 1개 이상을 가질 수 있는 것으로, 고려된다.
안티센스 올리고뉴클레오티드에서 고려되는 당 변형으로는, 비-제한적으로, OH; F; O-알킬, S-알킬 또는 N-알킬; O-알케닐, S-알케닐 또는 N-알케닐; O-알키닐, S-알키닐 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬로부터 선택되는 당 치환기를 포함하며, 여기서 알킬, 알케닐 및 알키닐은 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐로 치환되거나 또는 비-치환될 수 있다. 일부 구현예에서, 이들 기들은 O(CH2)xOCH3, O((CH2)xO)yCH3, O(CH2)xNH2, O(CH2)xCH3, O(CH2)xONH2, 및 O(CH2)xON((CH2)xCH3)2로부터 선택되며, 여기서 x와 y는 독립적으로 1 내지 10이다.
일부 구현예에서, 변형된 당은 다음으로부터 선택되는 치환기를 포함한다: C1 내지 C10의 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알케닐, 알키닐, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴 또는 O-아랄킬, SH, SCH3, Cl, Br, CN, OCN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단성 기, 리포터 유전자, 인터칼레이터, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 개선하는 기, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 약력학적 특성을 개선하는 기, 및 유사 특성을 가진 기타 치환기들. 일 구현예에서, 변형은 2'-메톡시에톡시 (2'-O-CH2CH2OCH3를 포함하며, 이는 또한 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로도 알려져 있음)(Martin et al., 1995), 즉, 알콕시알콕시 기를 포함한다. 다른 변형으로는 2'-다이메틸아미노옥시에톡시, 즉, O(CH2)2ON(CH3)2 기 (2'-DMAOE로도 알려져 있음) 및 2'-다이메틸아미노에톡시에톡시 (당해 기술 분야에서 2'-O-다이메틸-아미노-에톡시-에틸 또는 2'-DMAEOE로도 알려져 있음), 즉, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2를 포함한다.
추가적인 당 치환기로는 알릴 (-CH2-CH=CH2), -O-알릴 CH2-CH=CH2), 메톡시 (-O-CH3), 아미노프로폭시 (-OCH2CH2CH2NH2) 및 플루오로 (F)를 포함한다. 2' 위치 (2'-)의 당 치환기는 아라비노 (위) 위치 또는 리보 (아래) 위치에 존재할 수 있다. 하나의 2'-아라비노 변형은 2'-F이다. 다른 유사한 변형 역시 올리고머 화합물의 다른 위치에서, 특히 3' 말단 뉴클레오시드 상의 당의 3' 위치 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오티드 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 이루어질 수 있다. 올리고머 화합물은 또한 당 모방체를, 펜토푸라노실 당 대신, 예를 들어, 사이클로부틸 모이어티를 가질 수 있다. 변형된 당 구조의 제조를 개시하고 있는 미국 특허들의 예로는, 비-제한적으로, 미국 특허 번호 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; 및 5,700,920 등이 있으며, 이들 문헌은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
대표적인 당 치환기는 미국 특허 출원 공개공보 2005/0261218에 기술된 기를 포함하며, 이 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 특정 구현예에서, 당 변형은 6' 위치에서 탄소에 연결된 카르복시 기 상에서의 2'-O-Me 변형, 2' F 변형, 2' H 변형, 2' 아미노 변형, 4' 티오리보스 변형, 포스포로티오에이트 변형, 또는 이들의 조합을 포함한다.
특정 구현예에서, 2'-치환된 비-이환식의 변형된 뉴클레오시드 (2'-substituted non-bicyclic modified nucleoside)는 F, OCH3 및 OCH2CH2OCH3로부터 선택되는 비-브릿징된 (non-bridging) 2'-치환기를 포함하는 당 모이어티를 포함한다.
일부 변형된 당 모이어티는 푸라노실 고리의 2개의 원자들 간에 브릿지되어 제2 고리를 형성함으로써, 이환식 당 모이어티 (또한, 구속된 당으로도 지칭됨)가 만들어지는 치환을 포함한다. 이러한 특정 구현예에서, 이환식 당 모이어티는 4' 및 2' 푸라노스 고리 원자들 간의 브릿지를 포함한다. 이러한 4'에서 2'를 브릿지하는 당 치환기에 대한 예로는 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2' ("LNA"), 4'-CH2-S-2', 4'-(CH2)2-O-2' ("ENA"), 4'-CH(CH3)-O-2' ("구속된 에틸" 또는 "cEt"로도 지칭됨), 4'-CH2-O-CH2-2', 4'-CH2-N(R)-2', 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' ("구속된 MOE" 또는 "cMOE") 및 이들의 유사체 (예를 들어, Seth 등의 미국 특허 7,399,845, Bhat 등의 미국 특허 7,569,686, Swayze 등의 미국 특허 7,741,457, 및 Swayze 등의 미국 특허 8,022,193 참조), 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' 및 이의 유사체 (예를 들어, Seth 등의 미국 특허 8,278,283 참조), 4'-CH2-N(OCH3)-2' 및 이의 유사체 (예를 들어, Prakash 등의 미국 특허 8,278,425 참조), 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (예를 들어, Allerson 등의 미국 특허 7,696,345 및 Allerson 등의 미국 특허 8,124,745 참조), 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (예를 들어, Zhou, et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134 참조), 4'-CH2-C(=CH2)-2' 및 이의 유사체 (예를 들어, Seth 등의 미국 특허 8,278,426 참조), 4'-C(RaRb)-N(R)-O-2', 4,-C(RaRb)-O-N(R)-2', 4'-CH2-O-N(R)-2', 및 4'-CH2-N(R)-O-2' (각각의 R, Ra 및 Rb는 독립적으로 H, 보호기 또는 C1-C12 알킬임)(예를 들어 Imanishi 등의 미국 특허 7,427,672 참조) 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
특정 구현예에서, 이러한 4' -> 2' 브릿지는 독립적으로 -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x- 및 -N(Ra)-로부터 독립적으로 선택되는 연결 기 1-4개를 포함하며;
여기서,
x는 0, 1 또는 2이고;
n은 1, 2, 3 또는 4이고;
각각의 Ra 및 Rb는, 독립적으로, H, 보호기, 하이드록실, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C5-C7 지환식 라디칼, 치환된 C5-C7 지환식 라디칼, 할로겐, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, 아실 (C(=O)-H), 치환된 아실, CN, 설포닐 (S(=O)2-J1) 또는 설폭실 (S(=O)-J1)이고; J1 및 J2 각각은, 독립적으로, H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 아실 (C(=O)-H), 치환된 아실, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, C1-C12 아미노알킬, 치환된 C1-C12 아미노알킬, 또는 보호기이다.
추가적인 이환식 당 모이어티들이 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443, Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740, Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Kumar et al, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J Am. Chem. Soc, 20017, 129, 8362-8379; Wengel 등의 미국 특허 7,053,207; Imanishi 등의 미국 특허 6,268,490; Imanishi 등의 미국 특허 6,770,748; Imanishi 등의 미국 특허 RE44,779; Wengel 등의 미국 특허 6,794,499; Wengel 등의 미국 특허 6,670,461; Wengel 등의 미국 특허 7,034,133; Wengel 등의 미국 특허 8,080,644; Wengel 등의 미국 특허 8,034,909; Wengel 등의 미국 특허 8, 153,365; Wengel 등의 미국 특허 7,572,582; 및 Ramasamy 등의 미국 특허 6,525,191; Torsten 등의 WO 2004/106356; Wengel 등의 WO 1999/014226; Seth 등의 WO 2007/134181; Seth 등의 미국 특허 7,547,684; Seth 등의 미국 특허 7,666,854; Seth 등의 미국 특허 8,088,746; Seth 등의 미국 특허 7,750, 131; Seth 등의 미국 특허 8,030,467; Seth 등의 미국 특허 8,268,980; Seth 등의 미국 특허 8,546,556; Seth 등의 미국 특허 8,530,640; Migawa 등의 미국 특허 9,012,421; Seth 등의 미국 특허 8,501,805; 및 미국 특허 공개번호 Allerson 등의 US2008/0039618 및 Migawa 등의 US2015/0191727을 참조한다.
특정 구현예에서, 이환식 당 모이어티와 이러한 이환식 당 모이어티가 병합된 뉴클레오시드는 이성질체 배열에 의해 추가적으로 정의된다. 예를 들어, (본원에 기술된) LNA 뉴클레오시드는 α-L 배열 또는 β-D 배열로 존재할 수 있다.
Figure pct00001
α-L-메틸렌옥시 (4'-CH2-0-2') 또는 α-L-LNA 이환식 뉴클레오시드는 안티센스 활성을 가진 올리고뉴클레오티드로 변형된 바 있다 (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372). 여기에는 이환식 뉴클레오시드에 대한 일반적인 설명에 2가지 이성질체 배열 둘다 포함되어 있다. 특정 이환식 뉴클레오시드 (예를 들어, LNA 또는 cEt) 위치가 본원에 예시된 구현예에서 식별되는 경우, 이는 달리 언급되지 않은 한, β-D 배열을 취한다.
특정 구현예에서, 변형된 당 모이어티는 하나 이상의 비-브릿지된 당 치환기 및 하나 이상의 브릿지된 당 치환기 (예, 5'-치환된 및 4'-2' 브릿징된 당)를 포함한다.
특정 구현예에서, 변형된 당 모이어티는 당 대용물을 포함한다. 이러한 특정 구현예에서, 당 모이어티의 산소 원자는, 예를 들어, 황, 탄소 또는 질소 원자로 치환된다. 이러한 특정 구현예에서, 이러한 변형된 당 모이어티는 또한 본원에 기술된 바와 같이 브릿징 및/또는 비-브릿징 치환기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 당 대용물은 4'-황 원자 (예를 들어, Bhat 등의 미국 특허 7,875,733 및 Bhat 등의 미국 특허 7,939,677 참조)와 2' 위치 및/또는 5' 위치에 치환기를 포함한다.
특정 구현예에서, 당 대용물은 5개의 원자 이외의 다른 것을 가진 고리를 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예들에서, 당 대용물은 6원성 테트라하이드로피란 ("THP")을 포함한다. 이러한 테트라하이드로피란은 추가로 변형되거나 또는 치환될 수 있다. 이러한 변형된 테트라하이드로피란을 포함하는 뉴클레오시드로는 헥시톨 핵산 ("HNA"), 아니톨 핵산 ("ANA"), 만니톨 핵산 ("MNA") (예를 들어, Leumann, CJ. Bioorg. & Med. Chem. 2002, 10, 841-854 참조), 플루오로 HNA:
Figure pct00002
("F-HNA", 예를 들어 Swayze 등의 미국 특허 8,088,904; Swayze 등의 미국 특허 8,440,803; Swayze 등의 미국 특허 8,796,437; Swayze 등의 미국 특허 9,005,906 참조; F-HNA는 F-THP 또는 3'-플루오로 테트라하이드로피란으로도 지칭됨), 및 하기 식을 가진 추가적으로 변형된 THP를 포함하는 뉴클레오시드 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다:
Figure pct00003
상기 식에서, 상기한 변형된 THP 뉴클레오시드 각각에 대해, 독립적으로,
Bx는 핵염기 모이어티이고;
T3 및 T4는 각각, 독립적으로, 변형된 THP 뉴클레오시드를 올리고뉴클레오티드의 나머지 부분과 연결하는 뉴클레오시드 간의 연결 기이거나 또는 T3 및 T4 중 하나는 변형된 THP 뉴클레오시드를 올리고뉴클레오티드의 나머지 부분과 연결하는 뉴클레오시드 간의 연결 기이고, T3 및 T4 중 다른 하나는 H, 하이드록실 보호기, 연결된 공액 기 (conjugate group), 또는 5' 또는 3'-말단 기이고;
q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7은 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
각각의 R1 및 R2는 독립적으로 수소, 할로겐, 치환된 또는 비-치환된 알콕시, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 및 CN으로부터 선택되되, 여기서 X는 O, S 또는 NJ1이고, 각각의 J1, J2 및 J3는 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이다.
특정 구현예에서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7이 각각 H인, 변형된 THP 뉴클레오시드를 제공한다. 특정 구현예에서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7 중 하나 이상은 H가 아닌 다른 것이다. 특정 구현예에서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7 중 하나 이상은 메틸이다. 특정 구현예에서, R1 및 R2 중 하나가 F인 변형된 THP 뉴클레오시드를 제공한다. 특정 구현예에서, R1은 F이고, R2는 H이며, 특정 구현예들에서, R1은 메톡시이고, R2는 H이며, 특정 구현예들에서, R1은 메톡시에톡시이고, R2는 H이다.
특정 구현예에서, 당 대용물은 5개보다 많은 수의 원자와 2 이상의 이종원자를 가진 고리를 포함한다. 예를 들어, 모르폴리노 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드 및 올리고뉴클레오티드에서의 이의 사용이 발표된 바 있다 (예를 들어, Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510 및 Summerton 등의 미국 특허 5,698,685; Summerton 등의 미국 특허 5,166,315; Summerton 등의 미국 특허 5,185,444; 및 Summerton 등의 미국 특허 5,034,506 참조). 본원에서, 용어 "모르폴리노"는 하기 구조를 가진 당 대용물을 의미한다:
Figure pct00004
특정 구현예에서, 모르폴리노는, 예를 들어, 상기한 모르폴리노 구조로부터 다양한 치환기를 부가 또는 변형함으로써, 변형할 수 있다. 이러한 당 대용물은 본원에서 "변형된 모르폴리노"로 언급된다.
특정 구현예에서, 당 대용물은 비환식 모이어티를 포함한다. 비환식 당 대용물을 포함하는 뉴클레오시드 및 올리고뉴클레오티드에 대한 예로는 펩타이드 핵산 ("PNA"), 비환식 부틸 핵산 (예를 들어, Kumar et al., Org. Biomol. Chem., 2013, 11, 5853-5865 참조), 및 Manoharan 등의 WO2011/133876에 기술된 뉴클레오시드 및 올리고뉴클레오티드 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
변형된 뉴클레오시드에 이용가능한 다수의 다른 이환식 및 삼환식 당 대용물 고리 시스템들이 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드 잔기들은 다수의 공지된 임의의 뉴클레오시드간 결합을 통해 서로 연결될 수 있다. 뉴클레오시드간 결합 기에 대한 2가지 주요 계열은 인 원자의 존재 또는 부재에 의해 정의된다. 대표적인 인-함유 뉴클레오시드간 결합은, 포스포다이에스테르 결합 ("P=O")(또한, 비-변형된 또는 자연 생성 결합으로도 지칭됨), 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 및 포스포로티오에이트 ("P=S"), 및 포스포로다이티오에이트 ("HS-P=S")를 포함하여, 포스페이트를 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 대표적인 인 비-함유 뉴클레오시드간 결합 기로는 메틸렌메틸이미노 (-CH2-N(CH3)-O-CH2-), 티오다이에스테르, 티오노카바메이트 (-O-C(=O)(NH)-S-); 실록산 (-O-SiH2-O-); 및 N,N'-다이메틸하이드라진 (-CH2-N(CH3)-N(CH3)-) 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 인을 함유한 뉴클레오시드간 결합 및 인을 함유하지 않는 뉴클레오시드간 결합을 형성하는 방법은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 공지되어 있다.
이러한 뉴클레오시드간 결합으로는 포스포다이에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 메틸포스포네이트, 알킬포스포네이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 실록산, 카보네이트, 카르보알콕시, 아세트아미데이트, 카바메이트, 모르폴리노, 보라노, 티오에테르, 브릿징된 포스포르아미데이트, 브릿징된 메틸렌 포스포네이트, 브릿징된 포스포로티오에이트, 및 설폰 뉴클레오시드간 결합 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 본 발명의 합성 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드간 결합들의 조합을 포함할 수도 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 합성 안티센스 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트와 포스포다이에스테르의 뉴클레오티드간 결합들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 전체 뉴클레오티드간 결합들 중 절반 이상에서 100% 미만의 비율이 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합이다. 일부 구현예에서, 모든 뉴클레오티드간 결합이 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합이다.
키랄 센터를 가진 뉴클레오시드간 결합을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드는, 입체무작위 (stereorandom) 뉴클레오시드간 결합을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드 집단으로서, 또는 특정한 입체화학 배열의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드 집단으로서 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드의 집단은, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합들이 모두 입체무작위인, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 포함한다. 이러한 변형된 올리고뉴클레오티드는 각 포스포로티오에이트 결합의 입체화학적 배열을 무작위로 선택하게 되는 합성 방법으로 제작할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려진 바와 같이, 각각의 개별 올리고뉴클레오티드 분자의 각 개별 포스포로티오에이트는 정의된 입체배열을 가진다. 특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드의 집단은 하나 이상의 특정한 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 포함하는, 특히 독립적으로 선택된 입체화학적 배열을 포함하는, 변형된 올리고뉴클레오티드에 대해 농화된다.
특정 구현예에서, 포스포로티오에이트 결합은 Rp 거울상 이성질체와 Sp 거울상 이성질체의 혼합일 수 있거나, 또는 Rp 또는 Sp 형태로 입체규칙적으로 또는 실질적으로 입체규칙적으로 제조될 수 있다. 결합이 Rp 거울상 이성질체와 Sp 거울상 이성질체의 혼합인 구현예들에서, Rp 형태와 Sp 형태는 올리고뉴클레오티드 전체에 무작위로 배치되거나 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 지정된 위치에 존재할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 안티센스 올리고뉴클레오티드와, 선택적으로 하나 이상의 공액 기 및/또는 말단 기를 제공한다. 공액 기는 하나 이상의 공액 모이어티와, 공액 모이어티를 올리고뉴클레오티드에 연결하는 공액 링커로 구성된다. 공액 기는 올리고뉴클레오티드의 한쪽 또는 양쪽 말단에 부착되거나 및/또는 임의의 내부 위치에서 부착될 수 있다. 특정 구현예에서, 공액 기들은 변형된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드의 2'-위치에 부착된다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 한쪽 또는 양쪽 말단에 부착되는 공액 기는 말단 기이다. 이러한 특정 구현예에서, 공액 기 또는 말단 기는 올리고뉴클레오티드의 3' 및/또는 5' 말단에 부착된다. 이러한 특정 구현예에서, 공액 기 (또는 말단 기)는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 부착된다. 특정 구현예에서, 공액 기는 올리고뉴클레오티드의 3'-말단 근처에 부착된다. 특정 구현예에서, 공액 기 (또는 말단 기)는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 부착된다. 특정 구현예에서, 공액 기는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 근처에 부착된다.
말단 기에 대한 예로는 공액 기, 캡핑 기, 포스페이트 모이어티, 보호기, 염기-부재 (abasic) 뉴클레오시드, 변형된 또는 비-변형된 뉴클레오시드, 및 독립적으로 변형되거나 또는 비-변형된 2종 이상의 뉴클레오시드 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
일부 공액 기 및 공액 모이어티들이 기존에 개시된 바 있으며, 예를 들어: 콜레스테롤 모이어티 (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), 콜산 (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 1053-1060), 티오에테르, 예를 들어, 헥실-S-트리틸티올 (Manoharan et al., Ann. N Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett, 1993, 3, 2765-2770), 티오콜레스테롤 (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533- 538), 지방족 쇄, 예를 들어, 도-데칸-다이올 또는 운데실 잔기 (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBSLett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49- 54), 인지질, 예를 들어, 다이-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 l,2-다이-0-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트 (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄 (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), 또는 아다만탄 아세트산, 팔미틸 모이어티 (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티 (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937), 토코페롤 기 (Nishina et al., Molecular Therapy Nucleic Acids, 2015, 4, e220; 및 Nishina et al., Molecular Therapy, 2008, 16, 734-740), 또는 GalNAc 클러스터 (예를 들어, WO2014/179620)가 개시되어 있다.
본 발명의 합성 안티센스 화합물은 자동 합성기에 의해 또는 수동으로 수행할 수 있는 포스포르아미디트 또는 H-포스포네이트 화학과 같은 당해 기술 분야에서 인정되는 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명의 합성 안티센스 화합물은 또한 mRNA에 대한 혼성화 능력을 손상시키지 않으면서 다수의 방식으로 변형시킬 수도 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드-기반의 화합물은 선형적인 합성 방식으로 합성한다.
선형적인 합성에 의한 또는 병렬 합성 프로토콜에 의한 합성 종료시, 본 발명의 올리고뉴클레오티드-기반의 화합물은 편리하게는 진한 암모니아 용액으로 탈보호하거나, 또는 변형된 뉴클레오시드가 병합된 경우에는 포스포르아미디트 공급업체로부터 권고된 바와 같이 탈보호를 수행할 수 있다. 산물 올리고뉴클레오티드-기반의 화합물은 바람직하게는 역상 HPLC, 트리필 제거 (detritylation), 탈염 및 투석을 통해 정제한다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 비-제한적인 목록을 표 1에 나타낸다. 표 1에서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 마우스 디스트로핀 유전자 전사체에서 엑손 23 누락 (skipping)을 유발하도록 설계된 것이다. 달리 기재되지 않은 한, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 (PS) 백본 결합을 가진다. 그러나, 당해 기술 분야의 당업자라면, 포스포다이에스테르 또는 비-포스포다이에스테르 모이어티에 기반한 다른 결합도 존재할 수 있음을 이해할 것이다.
화합물 # 서열 서열번호
1 5'-GGCCAAACCUCGGCUUACCU-3' 1
2 5'-GGCCAAACCUCGGCUUACCU-3' 2
3 5'-GGCCAAACCTCGGCUUACCU-3' 3
4 5'-GGCCAAACCUCGGCTUACCU-3' 4
5 5'-GGCCAAACCUCGGCUUACCU-3' 5
6 5'-GGCCAAACCUCGGCUUACCT-3' 6
7 5'-GGCCAAACCUCGGCUUACCU-3' 7
8 5'-GGCCAAACCUCGGCUUACCU-3' 8
9 5'-GGCCAAACCTCGGCUUACCU-3' 9
10 5'-GGCCAAACCUCGGCTTACCU-3' 10
11 5'-GGCCAAACCUCGGCUUACCT-3' 11
12 5'-GGCCAAACCUCGGCTTACCT-3' 12
13 5'-GGCCAAACCUCGGCTTACCT-3' 13
14 5'-GGCCAAACCUCGGCUTACCT-3' 14
15 5'-GGCCAAACCUCGGCUUACCT-3' 15
16 5'-GGCCAAACCUCGGCUUACCT-3' 16
밑줄 = 데옥시리보뉴클레오티드; 밑줄 표시되지 않은 부분 = 2'-O-메틸뉴클레오티드
특정 구현예에서, 표적 핵산은 뮤라인 표적 서열이다. 특정 구현예에서, 표적 핵산은 인간 표적 서열이다.
본 발명은 본원에 기술된 안티센스 올리고뉴클레오티드와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 용어 "담체"는 일반적으로 임의의 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정제, 용해제, 오일, 지질, 지질 함유 소낭, 미소구, 리포좀 캡슐 (liposomal encapsulation), 또는 그외 약제학 제형에 사용하기 위한 기타 물질을 망라한다. 담체, 부형제 또는 희석제의 특징은 특수 적용을 위한 투여 경로에 따라 결정되는 것으로 이해될 것이다. 이들 물질이 포함된 약제학적으로 허용가능한 제형의 제조는 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990에 기술되어 있다.
조성물은 하나 이상의 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 물질로는 백신, 항원, 항체, 세포독성제, 화학치료제 (전통적인 화학요법 및 현대 표적 요법 둘다), 키나제 저해제, 알레르겐, 항생제, 작용제, 길항제, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, RNAi 분자, siRNA 분자, miRNA 분자, 앱타머, 단백질, 유전자 요법 벡터, DNA 백신, 보강제, 공동-자극성 분자 또는 이들의 조합 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 상보적인 핵산 서열은 저해할 물질에 따라 달리질 것이다. 예를 들어, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비정상적인 발현 또는 산물이 질환 상태를 야기하게 되는 세포 유전자 또는 유전자 전사체에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 이러한 세포 유전자 수종의 핵산 서열은 당해 기술 분야에 개시되어 있다. 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 표적 RNA 뉴클레오티드 서열에 대해 일부 또는 전체 상보적인 한, 모든 올리고뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA의 부분에 대해 전장에 걸쳐 90% 이상 상보적일 수 있다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA의 부분에 대해 전장에 걸쳐 93% 이상 상보적일 수 있다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA의 부분에 대해 전장에 걸쳐 95% 이상 상보적일 수 있다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA의 부분에 대해 전장에 걸쳐 98% 이상 상보적일 수 있다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA의 부분에 대해 전장에 걸쳐 99% 이상 상보적일 수 있다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA의 부분에 대해 전장에 걸쳐 100% 상보적일 수 있다.
특정 구현예는 유전자를 표적화하는 화합물을 제공하며, 이러한 화합물은 임의의 표적 RNA의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 인접한 핵염기 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21 또는 22개를 포함한다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 인접한 핵염기 12개 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단독으로 투여하거나, 또는 임의의 다른 물질 또는 요법과 조합하여 투여할 수 있다. 이러한 물질 또는 요법은 공동-투여하거나 또는 동시에 투여할 수 있다. 이러한 물질 또는 요법은 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위해 유용할 수 있으며, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 유전자 발현 조절 효과를 약화시키지 않는다. 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는데 유용한 물질(들)로는 백신, 항원, 항체, 바람직하게는 단일클론 항체, 세포독성제, 키나제 저해제, 알레르겐, 항생제, siRNA 분자, 안티센스 올리고뉴클레오티드, TLR 길항제 (예, TLR3의 길항제 및/또는 TLR7의 길항제 및/또는 TLR8의 길항제 및/또는 TLR9의 길항제), 화학치료제 (전통적인 화학요법 및 현대 표적 요법 둘다), 표적 치료제, 활성화된 세포, 펩타이드, 단백질, 유전자 요법 벡터, 펩타이드 백신, 단백질 백신, DNA 백신, 보강제, 및 공동-자극성 분자 (예, 사이토카인, 케모카인, 단백질 리간드, 트랜스-활성화 인자 (trans-activating factor), 펩타이드 또는 변형된 아미노산을 함유한 펩타이드), 또는 이들의 조합 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 대안적으로, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 유전자 발현 조절의 특이성 또는 정도를 강화하기 위해 다른 화합물 (예를 들어, 지질 또는 리포좀)과 조합하여 투여할 수도 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 임의의 적합한 경로를 통해 투여할 수 있으며, 그 예로는 비경구, 점막 전달, 경구, 설하, 경피, 국소, 흡입, 종양내, 정맥내, 피하, 척수강내, 비강내, 에어로졸, 안내, 기관내, 직장내, 질, 유전자 총에 의해, 진피 패치 또는 점안제 형태 또는 구강세척제 형태 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 방법들 중 임의 방법에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 단독 투여 또는 임의의 다른 물질과의 조합 투여는, 비-제한적으로, 방광, 간, 폐, 신장 또는 폐와 같은 조직 또는 장기로 직접 행해질 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 단독 투여 또는 임의의 다른 물질과의 조합 투여는 근육내 투여에 의해 이루어진다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 단독 투여 또는 임의의 다른 물질과의 조합 투여는 점막 투여에 의해 이루어진다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 단독 투여 또는 임의의 다른 물질과의 조합 투여는 경구 투여에 의해 이루어진다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 단독 투여 또는 임의의 다른 물질과의 조합 투여는 직장내 투여에 의해 이루어진다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 단독 투여 또는 임의의 다른 물질과의 조합 투여는 척수강내 투여에 의해 이루어진다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 단독 투여 또는 임의의 다른 물질과의 조합 투여는 종양내 투여에 의해 이루어진다.
비경구, 진피내 또는 피하 적용을 위해 사용되는 용액 또는 현탁제는 다음과 같은 성분들을 함유할 수 있다: 멸균 희석제, 예를 들어 주사용수, 식염수, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항세균제, 예를 들어 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트; 킬레이트제, 예를 들어 에틸렌다이아민테트라아세트산; 완충제, 예를 들어 아세테이트, 사이트레이트 또는 포스페이트, 및 긴장도 조정제, 예를 들어 소듐 클로라이드 또는 덱스트로스. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기를 이용해 조정할 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 일회용 주사기 또는 다중 용량 바이얼 (multiple dose vial)에 수용될 수 있다.
본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여는 질환의 증상 또는 대용 마커를 감소시키는데 유효한 기간 동안 유효량으로 사용해 공지된 절차로 수행할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 질환 및/또는 장애를 치료하기 위한 유효량은 증상을 완화 또는 낮추거나, 또는 종양, 암, 세균 감염, 바이러스 감염 또는 진균 감염을 지연시키거나 또는 개선하는데 필요한 양일 수 있다. 유전자 발현을 조절하는 조성물을 투여하는 맥락에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 유효량은, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 부재시 유전자 발현과 비교해, 요망하는 조절을 달성하기에 충분한 양이다. 임의의 특정한 적용을 위한 유효량은 치료 중인 질환 또는 병태, 투여 중인 구체적인 올리고뉴클레오티드, 개체의 신체 크기, 또는 질환 또는 병태의 중증도와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 당해 기술 분야에서 당업자라면 과도한 실험 없이 특정한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 유효량을 경험적으로 결정할 수 있다.
치료학적 조성물은, 전신 투여하는 경우, 바람직하게는 본 발명에 따른 화합물의 혈중 수준 약 0.0001 μmol 내지 약 10 μmol이 달성되기에 충분한 용량으로 투여한다. 국소 투여하는 경우에는, 이보다 훨씬 적은 농도가 유효할 수 있으며, 훨씬 더 높은 농도가 허용될 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 화합물의 총 용량 (total dosage)은 약 0.001 mg /환자 체중 kg /day 내지 약 200 mg /체중 kg/day 범위이다. 특정 구현예에서, 총 용량은 매일, 2주 간격 또는 매주 간격으로 투여되는 0.08, 0.16, 0.32, 0.48, 0.32, 0.64, 1, 10 또는 30 mg/체중 kg일 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 치료학적 조성물의 치료학적 유효량을 개체에 단일 치료 에피소드로서 동시에 또는 연속적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 이러한 측면에 따른 방법은 유전자 발현에 대한 모델 연구에 유용하다. 이 방법은 또한 인간 또는 동물 질환에 대한 예방학적 또는 치료학적 치료에 유용하다. 예를 들어, 이 방법은 유전자 발현 활용에서 소아과 및 수의학적 억제에 유용하다.
일부 구현예는 본원에 기술된 질환, 장애 또는 병태를 치료, 예방 또는 개선하기 위한 키트를 제공하며, 키트는 (i) 본원에 기술된 안티센스 올리고뉴클레오티드; 및 선택적으로 (ii) 본원에 기술된 제2 물질 또는 요법을 포함한다. 본 발명의 키트는 본원에 기술된 질환, 장애 또는 병태를 치료, 예방 또는 개선하기 위한 키트의 사용 설명서를 더 포함할 수 있다.
세포 배양 및 안티센스 화합물의 처리
표적 핵산의 수준, 활성 또는 발현에 대한 안티센스 화합물의 효과를 다양한 세포 유형들에서 시험관내에서 조사할 수 있다. 이러한 분석에 이용되는 세포 유형들은 상업적인 판매사 (예, American Type Culture Collection, Manassas, Va.; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, N.C.; Clonetics Corporation, Walkersville, Md.)로부터 입수가능하며, 상업적으로 이용가능한 시약을 이용하여 판매사의 지침에 따라 배양한다 (예, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Calif.). 세포 유형의 예로는 HepG2 세포, Hep3B 세포 및 일차 간세포 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 시험관내 검사
본원은 세포에 안티센스 올리고뉴클레오티드의 처리 방법을 기술하며, 이는 다른 안티센스 화합물을 이용해 처리하도록 적절하게 수정될 수 있다.
세포는, 배양 시 대략 60-80% 컨플루언스에 도달하였을 때, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리할 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드를 배양 세포에 도입하기 위해 통상적으로 사용되는 한가지 시약은 양이온성 지질 형질감염 시약 LIPOFECTIN (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 LIPOFECTIN과 OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) 중에 혼합하여, 100 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드 당 2 내지 12 ㎍/mL 범위일 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 LIPOFECTIN의 바람직한 최종 농도로 준비한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드를 배양 세포에 도입하기 위해 사용되는 다른 시약은 LIPOFECTAMINE (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 LIPOFECTAMINE과 OPTI-MEM 1 혈청-감소 배지 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) 중에 혼합하여, 100 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드 당 2 내지 12 ㎍/mL 범위일 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 LIPOFECTIN의 바람직한 최종 농도로 준비한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드를 배양 세포에 도입하기 위해 사용되는 다른 기법은 전기천공이다.
세포에 안티센스 올리고뉴클레오티드를 일반적인 방법으로 처리한다. 세포는, 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리 후 16-24시간 경과시 회수할 수 있으며, 이때 표적 핵산의 RNA 또는 단백질의 수준을 당해 기술 분야에 공지되고 본원에 기술된 방법으로 측정한다. 일반적으로, 처리를 복수의 레플리케이트 (replicate)를 사용해 수행하는 경우, 데이터는 레플리케이트들의 평균으로 나타낸다.
사용되는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도는 세포주에 따라 달라진다. 특정 세포주에 대해 최적인 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도를 결정하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는, LIPOFECTAMINE을 이용해 형질감염할 경우, 전형적으로 1 nM 내지 300 nM 범위의 농도로 사용한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 전기천공으로 형질감염할 경우, 625 내지 20,000 nM 범위의 더 높은 농도로 사용한다.
RNA 단리
RNA 분석은 전체 세포 RNA 또는 폴리(A)+ mRNA에 대해 수행할 수 있다. RNA 단리 방법은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. RNA는 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법을 이용해, 예를 들어 TRIZOL 시약 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)을 제조사에서 권고한 프로토콜에 따라 준비한다.
표적 수준 또는 발현의 저해 분석
표적 핵산의 수준 또는 발현 저해는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방식으로 분석할 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산 수준은, 예를 들어, 노던 블롯 분석, 경쟁적인 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 정량적인 실시간 PCR을 통해 정량할 수 있다. RNA 분석은 전체 세포 RNA 또는 폴리(A)+ mRNA에 대해 수행할 수 있다. RNA 단리 방법은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 노던 블롯 분석은 또한 당해 기술 분야에서 일반적이다. 정량적인 실시간 PCR은 PE-Applied Biosystems (Foster City, Calif.) 사의 상업적으로 이용가능한 ABI PRISM 7600, 7700 또는 7900 서열 검출 시스템을 이용해, 제조사의 지침에 따라 이용해, 편리하게 수행할 수 있다.
표적 RNA 수준에 대한 정량적인 실시간 PCR 분석
표적 RNA 수준의 정량화는 ABI PRISM 7600, 7700 또는 7900 서열 검출 시스템 (PE-Applied Biosystems, Foster City, Calif.)을 제조사의 지침에 따라 이용한 정량적인 실시간 PCR에 의해 달성할 수 있다. 정량적인 실시간 PCR 방법은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다.
단리한 RNA는 실시간 PCR을 수행하기 전에, 역전사효소 (RT) 반응에 투입하여, 이후에 실시간 PCR 증폭용 기질로서 사용되는 상보적인 DNA (cDNA)를 제작한다. RT 및 실시간 PCR 반응은 동일한 샘플 웰에서 연속적으로 이루어진다. RT 및 실시간 PCR 시약들은 Invitrogen (Carlsbad, Calif.)에서 입수할 수 있다. RT 실시간 PCR 반응은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 공지된 방법으로 수행한다.
실시간 PCR에 의해 수득되는 유전자 (또는 RNA) 표적의 양은, 발현이 일정한 유전자, 예를 들어 사이클로필린 A의 발현 수준을 이용하여 표준화하거나, 또는 RIBOGREEN RNA (Invitrogen, Inc. Carlsbad, Calif.)를 이용하여 전체 RNA를 정량함으로써 표준화한다. 사이클로필린 A 발현은 실시간 PCR에 의해, 표적과 동시에, 멀티플렉스로 또는 각각 분리하여 수행함으로써, 정량한다. 전체 RNA는 RIBOGREEN RNA 정량화 시약 (Invitrogen, Inc. Eugene, Oreg.)을 이용해 정량한다. RIBOGREEN에 의한 RNA 정량화 방법은 Jones, L. J., et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374)에 교시되어 있다. CYTOFLUOR 4000 장치 (PE Applied Biosystems)를 이용해 RIBOGREEN 형광성을 측정한다.
프로브 및 프라이머는 표적 핵산에 혼성하도록 설계한다. 실시간 PCR 프로브 및 프라이머를 설계하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, PRIMER EXPRESS 소프트웨어 (Applied Biosystems, Foster City, Calif.)와 같은 소프트웨어의 사용을 포함할 수 있다.
단백질 수준 분석
단백질 수준은 면역침강, 웨스턴 블롯 분석 (면역블롯팅), 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA), 정량적인 단백질 분석, 단백질 활성 분석 (예를 들어, 카스파제 활성 분석), 면역조직화학, 면역세포화학 또는 형광-활성화된 세포 분류 (FACS) 등의 당해 기술 분야에서 잘 알려진 다양한 방법으로 평가 또는 정량할 수 있다. 표적에 대한 항체를, 항체의 MSRS 카탈로그 (Aerie Corporation, Birmingham, Mich.)와 같은 다양한 공급원으로부터 식별 및 수득할 수 있거나, 또는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 통상적인 단일클론 또는 다클론 항체 제조 방법을 통해 제조할 수 있다.
안티센스 화합물의 생체내 검사
검사는 정상 동물에서, 또는 실험 질환 모델에서 수행할 수 있다. 동물에 투여하는 경우, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 포스페이트-완충화된 염수와 같은 약제학적으로 허용가능한 희석제 중에 제형화한다. 투여는 복막내, 정맥내 및 피하 등의 비경구 투여 경로를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 투여량 및 투여 빈도의 계산은 당해 기술 분야의 당업자의 능력에서 이루어지며, 투여 경로 및 동물 체중과 같은 인자에 따라 결정된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용한 치료 기간 경과 후, RNA를 단리하여, 핵산의 발현 변화를 측정한다.
특정 적응증
특정 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 하나 이상의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 개체 치료 방법을 기술한다. 특정 구현예는 본원에 기술된 안티센스 화합물을 치료학적 유효량으로 개체에 투여함으로써 필요한 개체를 치료하는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 핵산을 표적화하는 안티센스 화합물을 치료학적 유효량으로 투여하는 것은, 안티센스 화합물의 투여에 대한 개체의 반응을 확인하기 위해, 개체에서 대응되는 표적 수준을 모니터링함으로써 달성된다. 의사는 안티센스 화합물의 투여에 대한 개체의 반응을 이용해 치료학적 개입의 양 및 기간을 정할 수 있다.
실시예
안티센스 올리고뉴클레오티드의 합성
본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 포스포르아미데이트 또는 H-포스포네이트 화학 등의 당해 기술 분야에서 잘 알려진 공정에 의해 합성할 수 있으며, 이는 수동으로 또는 자동 합성기를 이용해 수행할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 선형적인 합성 방식으로 합성할 수도 있다.
본 실험에서 채택한 ARNA 화합물은 포스포르아미디트 화학 반응을 이용해 합성한 것이다. 이의 프로토콜은, 예를 들어, https://pubs.rsc.org/en/content/chapter/bk9781788012096-00453/978-1-78801-209-6에 상세히 기술되어 있으며, 그 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
세포 배양 및 형질감염
H-2Kb-tsA58 mdx 근모세포 42,43 (H2K mdx 세포)를 당해 기술 분야에서 기존에 개시된 바와 같이 배양 및 분화시킬 수 있다. 간략하게는, 근모세포 배양물이 60%-80% 컨플루언스에 도달하면, 여기에 트립신 (Thermo Fisher Scientific)을 처리하고, 이를 50 ㎍/mL 폴리-D-라이신 (Merck Millipore)과 이후 100 ㎍/ml 마트리겔 (Corning, 공급사 In Vitro Technologies)이 전처리된 24웰 플레이트에 2 x 104 세포/웰 밀도로 접종하였다. 세포는 5% 말 혈청이 첨가된 DMEM (Thermo Fisher Scientific)에서 37℃ 및 5% CO2 하에 24시간 동안 배양함으로써 근관세포로 분화시킬 수 있다. AO를 Lipofectin (Thermo Fisher Scientific)과 2:1 (w/w) (Lipofectin/AO)의 비율로 혼합하고, 24웰 플레이트에 500 ㎕/웰의 최종 형질감염 부피로 제조사의 지침에 따라 사용할 수 있다.
RNA 추출 및 RT- PCR
형질감염된 세포로부터 Direct-zol RNA 미니프렙 플러스 + TRI 시약 (Zymo Research, 공급업체: Integrated Sciences)을 제조사의 지침에 따라 사용해 RNA를 추출할 수 있다. 그 후, 엑손 20-26에 걸쳐 SuperScript III 역 전사효소 (Thermo Fisher Scientific)를 사용해 RT-PCR하여 디스트로핀 전사체를 분석할 수 있다. PCR 산물을 트리스-아세테이트-EDTA 완충제 중의 2% 아가로스 겔에서 전개시킬 수 있으며, Fusion Fx 기록 시스템 (Vilber Lourmat, Marne-la-Vallee, France)에서 이미지를 포착할 수 있다. ImageJ 소프트웨어로 밀도 측정을 수행할 수 있다. 엑손 23이 누락된 RT-PCR 산물의 양을 전체 디스트로핀 전사체 산물에 대한 양으로 표시하여, 실제 엑손-누락 효율을 결정할 수 있다. 결과를 아래 표에 나타낸다.
서열번호 서열 엑손 23이 누락된 경우의 %
7 5'-GGCCAAACCUCGGCUUACCU-3' 34
8 5'-GGCCAAACCUCGGCUUACCU-3' 30
9 5'-GGCCAAACCTCGGCUUACCU-3' 0
10 5'-GGCCAAACCUCGGCTTACCU-3' 32
11 5'-GGCCAAACCUCGGCUUACCT-3' 42
12 5'-GGCCAAACCUCGGCTTACCT-3' 25
13 5'-GGCCAAACCUCGGCTTACCT-3' 25
14 5'-GGCCAAACCUCGGCUTACCT-3' 29
15 5'-GGCCAAACCUCGGCUUACCT-3' 34
16 5'-GGCCAAACCUCGGCUUACCT-3' 34
본 발명이 바람직한 구현예를 들어 구체적으로 기술 및 설명되었지만, 당해 기술 분야의 당업자라면 첨부된 청구항에 의해 포괄되는 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 형태 및 상세 내용에 다양한 변화가 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
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Claims (50)

  1. 표적 RNA의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 12개 이상의 인접한 핵염기를 가진 연결된 뉴클레오티드 14-30개를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하고,
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 각각 독립적으로 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 영역을 1-3개 포함하고, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된 뉴클레오티드, 비-이온성 뉴클레오티드 또는 구속된 당 뉴클레오티드 (constrained sugar nucleotide) 또는 이들의 조합인,
    RNA 프로세싱을 조절하는 방법.
  2. 표적 pre-mRNA의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 12개 이상의 인접한 핵염기를 가진 연결된 뉴클레오티드 14-30개를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하고,
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 pre-mRNA에서 제2 mRNA 전사체를 위한 스플라이스 부위를 표적화하여 제2 mRNA 전사체를 위한 스플라이스 부위를 차단함으로써 pre-mRNA가 제1 mRNA 전사체로 스플라이싱되도록 안내하고;
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 각각 독립적으로 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 영역을 1-3개 포함하고, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된 뉴클레오티드, 비-이온성 뉴클레오티드 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합인,
    mRNA 전사체가 2가지 이상인 유전자에서 제1 mRNA 전사체를 선택하는 방법.
  3. 표적 RNA의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 12개 이상의 인접한 핵염기를 가진 연결된 뉴클레오티드 14-30개를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하고,
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 각각 독립적으로 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 영역을 1-3개 포함하고, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된 뉴클레오티드, 비-이온성 뉴클레오티드 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합인,
    RNA 프로세싱의 조절이 개체 치료에 유익한 질환 또는 장애를 개체에서 치료하는 방법.
  4. 표적 RNA의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 12개 이상의 인접한 핵염기를 가진 연결된 뉴클레오티드 14-30개를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하고,
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 각각 독립적으로 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 영역을 1-3개 포함하고, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된 뉴클레오티드, 비-이온성 뉴클레오티드 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합인,
    표적 RNA의 넌센스 매개 소멸 (nonsense mediated decay)을 유도하는 방법.
  5. 표적 RNA의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 12개 이상의 인접한 핵염기를 가진 연결된 뉴클레오티드 14-30개를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하며,
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 각각 독립적으로 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 영역을 1-3개 포함하고, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된 뉴클레오티드, 비-이온성 뉴클레오티드 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합인,
    단백질 또는 기능성 mRNA를 암호화하는 mRNA의 수준 증가와 단백질 또는 기능성 mRNA의 발현 증가를 달성하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적 RNA가 잔류 인트론 (retained intron)을 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 2'-치환된 뉴클레오티드가 2' O-메틸리보뉴클레오티드 또는 2'-MOE로부터 선택되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 영역을 하나 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에, 또는 2'-치환된 뉴클레오티드, 비-이온성 뉴클레오티드 또는 구속된 당 뉴클레오티드의 측면에 또는 이들의 조합 위치에 위치하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치하는, 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 위치하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드가 뉴클레오티드 2-4개 길이인, 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드가 뉴클레오티드 4개 길이인, 방법
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    엑손이 상기 잔류 인트론의 5' 스플라이스 부위 측면에 위치하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    엑손이 상기 잔류 인트론의 3' 스플라이스 부위 측면에 위치하는, 방법.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 잔류 인트론의 5' 스플라이스 부위 측면에 엑손이 위치하고, 상기 잔류 인트론의 3' 스플라이스 부위 측면에 엑손이 위치하는, 방법.
  17. 제2항 및 제6항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    엑손이 상기 제2 mRNA 전사체를 위한 스플라이스 부위의 5' 측면에 위치하는, 방법.
  18. 제2항 및 제6항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    엑손이 상기 제2 mRNA 전사체를 위한 스플라이스 부위의 3' 측면에 위치하는, 방법.
  19. 제2항 및 제6항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 mRNA 전사체를 위한 스플라이스 부위의 5' 측면에 엑손이 위치하고, 상기 제2 mRNA 전사체를 위한 스플라이스 부위의 3' 측면에 엑손이 위치하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 단백질의 양 또는 활성의 결핍 또는 pre-mRNA로부터 발현되는 기능성 mRNA의 양 또는 활성의 결핍으로 인해 유발되는 병태를 가진 개체를 치료하는데 이용가능한, 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    표적 단백질 또는 기능성 mRNA의 양 또는 활성의 결핍이 단백질 또는 기능성 RNA의 반수체 기능 부전 (haploinsufficiency)에 의해 유발되는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물의 일부인, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 국소 투여되는, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 (internucleotide linkage)을 하나 이상 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    뉴클레오티드간 결합들 중 절반 이상이 포스포로티오에이트인, 방법.
  26. 제24항에 있어서,
    모든 뉴클레오티드간 결합이 포스포로티오에이트인, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥인, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적 mRNA의 부분에 대해 전장에 걸쳐 90% 이상 상보적인, 방법.
  29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA가 pre-mRNA, mRNA 및 비-암호화 RNA로부터 선택되는, 방법.
  30. 잔류 인트론을 포함하는 표적 pre-mRNA의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 12개 이상의 인접한 핵염기를 가진 연결된 뉴클레오티드 14-30개를 포함하고,
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 각각 독립적으로 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 영역을 1-3개 포함하고, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된 뉴클레오티드, 비-이온성 뉴클레오티드 또는 구속된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합인,
    안티센스 올리고뉴클레오티드.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 2'-치환된 뉴클레오티드가 2' O-메틸리보뉴클레오티드 또는 2'-MOE로부터 선택되는, 올리고뉴클레오티드.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서,
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드 2-5개로 구성되는 영역을 하나 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에, 또는 2'-치환된 뉴클레오티드, 비-이온성 뉴클레오티드 또는 구속된 당 뉴클레오티드의 측면에, 또는 이들의 조합 위치에 위치하는, 올리고뉴클레오티드.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치하는, 올리고뉴클레오티드.
  35. 제33항에 있어서,
    상기 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 위치하는, 올리고뉴클레오티드.
  36. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드가 뉴클레오티드 2-4개 길이인, 올리고뉴클레오티드.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드가 뉴클레오티드 4개 길이인, 올리고뉴클레오티드.
  38. 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 잔류 인트론의 5' 스플라이스 부위 측면에 엑손이 위치하는, 올리고뉴클레오티드.
  39. 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 잔류 인트론의 3' 스플라이스 부위 측면에 엑손이 위치하는, 올리고뉴클레오티드.
  40. 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 잔류 인트론의 5' 스플라이스 부위 측면에 엑손이 위치하고, 상기 잔류 인트론의 3' 스플라이스 부위 측면에 엑손이 위치하는, 올리고뉴클레오티드.
  41. 제30항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 국소 투여되는, 올리고뉴클레오티드.
  42. 제30항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 하나 이상 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  43. 제42항에 있어서,
    뉴클레오티드간 결합들 중 절반 이상이 포스포로티오에이트인, 올리고뉴클레오티드.
  44. 제42항에 있어서,
    모든 뉴클레오티드간 결합이 포스포로티오에이트인, 올리고뉴클레오티드.
  45. 제30항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥인, 올리고뉴클레오티드.
  46. 제30항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적 mRNA의 부분에 대해 전장에 걸쳐 90% 이상 상보적인, 올리고뉴클레오티드.
  47. 제30항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA가 pre-mRNA, mRNA 및 비-암호화 RNA로부터 선택되는, 올리고뉴클레오티드.
  48. 제30항 내지 제47항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  49. 제1항에 있어서,
    RNA의 프로세싱이 스플라이싱을 포함하는, 방법.
  50. 제3항에 있어서,
    RNA의 프로세싱이 스플라이싱을 포함하는, 방법.
KR1020227011370A 2019-09-19 2020-03-19 유전자 스플라이싱을 조절하는데 이용가능한 화합물 및 방법 KR20220070227A (ko)

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