KR20230016201A - 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 조성물 및 이와 관련된 방법 - Google Patents

이중 가닥 올리고뉴클레오티드 조성물 및 이와 관련된 방법 Download PDF

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나오키 이와모토
루치아노 에이치. 아포니
데이빗 찰스 도넬 버틀러
파차무투 칸다사미
수브라마니안 마라판
스넬라타 트리파시
웨이 류
무그다 베데카
비노드 바티파디칼
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Abstract

본 발명은 이중 가닥 올리고뉴클레오티드, 조성물, 및 이와 관련된 방법을 제공한다. 본 발명은, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 구조적 요소, 예를 들어 염기 서열, 화학적 변형(예를 들어, 당, 염기, 및/또는 뉴클레오티드간 연결의 변형) 또는 이의 패턴, 및/또는 입체화학(예를 들어, 백본 키랄 중심(키랄 뉴클레오티드간 연결)의 입체화학), 및/또는 이의 패턴이 올리고뉴클레오티드 특성 및 활성, 예를 들어 RNA 간섭(RNAi) 활성, 안정성, 전달 등에 상당한 영향을 미칠 수 있다는 인식을 포함한다. 본 발명은 또한, 예를 들어 RNA 간섭에서, 제공된 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 조성물을 사용하여 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

이중 가닥 올리고뉴클레오티드 조성물 및 이와 관련된 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 5월 22일에 출원된 미국 가출원 제63/029,060호에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
유전자 표적화 올리고뉴클레오티드는 다양한 응용분야, 예를 들어 치료, 진단, 연구, 및 나노물질 응용분야에서 유용하다. 이러한 응용 분야에서 천연 발생 핵산(예를 들어, 비변형 DNA 또는 RNA)의 사용은 예를 들어, 엔도- 및 엑소-뉴클레아제에 대한 민감성으로 인해 제한된다. 따라서, 다양한 합성 대응물이 이러한 결점을 면하기 위해 개발되었다. 이러한 대응물에는 염기 변형, 당 변형, 백본 변형과 같은 화학적 변형을 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 그러나, 당업계에, 전술한 응용분야와 관련하여 사용하기 위한 개선된 특성을 갖는 이중 가닥(ds) 올리고뉴클레오티드는 여전히 필요하다.
본 발명은, 부분적으로, 이중 가닥(ds) 올리고뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드의 구조적 요소를 제어하는 것이 ds 올리고뉴클레오티드의 특성 및/또는 활성에 상당한 영향을 미칠 수 있다는 인식에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 이러한 구조적 요소는 다음 중 하나 이상을 포함한다: (1) 화학적 변형(예를 들어, 당, 염기, 및/또는 뉴클레오티드간 연결의 변형) 및 이의 패턴; 및 (2) 입체화학의 변경(예를 들어, 백본 키랄 뉴클레오티드간 연결의 입체화학) 및 이의 패턴. 이러한 구조적 요소 중 하나 이상은, 특정 구현예에서, 독립적으로 ds 올리고뉴클레오티드의 하나 또는 둘 모두의 올리고뉴클레오티드에 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 구조적 요소의 영향을 받는 특성 및/또는 활동은 예를 들어, RNA 간섭(RNAi 간섭), RNase H-매개 넉다운, 번역의 입체장애 등에 의해 매개되는 유전자 또는 이의 유전자 생성물의 발현, 활성, 또는 수준에 있어서의 관여, 감소 유도를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 본 발명은 제어된 구조적 요소를 갖는 ds 올리고뉴클레오티드(예를 들어, dsRNAi 올리고뉴클레오티드, dsRNAi 제제로도 지칭됨)를 포함하는 조성물이 예상치 못한 특성 및/또는 활성을 제공한다는 것을 입증한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 입체화학, 예를 들어 백본 키랄 중심의 입체화학이 뜻밖에 ds 올리고뉴클레오티드의 특성을 유지하거나 개선할 수 있다는 인식을 포함한다. 예를 들어, 제한 없이, 본 발명은 부분적으로 다음 중 하나 이상을 포함하는 ds 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다: (1) 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(즉, 5' 방향)(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는 가이드 가닥; (2) 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(즉, 3' 방향)(+2) 뉴클레오티드 사이 및 +2 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이의 Rp, Sp, 또는 교호 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는 가이드 가닥; (3) 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심에 대해 상류(즉, 5' 방향)에 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는 가이드 가닥(상류 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심은 Rp 또는 Sp 배열임); (4) 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 (+2) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이, 또한 (a) +3 뉴클레오티드와 +4 뉴클레오티드 사이 및 (b) +5 뉴클레오티드와 +6 뉴클레오티드 사이 중 하나 또는 둘 모두의 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는 가이드 가닥; 및 (5) Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함하는, 전술한 가이드 가닥 중 하나 이상과 조합된 패신저 가닥.
특정 구현예에서, 본 발명은 입체화학, 예를 들어 가이드 가닥(ds 올리고뉴클레오티드의 가이드 가닥은 또한 Rp 또는 Sp 배열의 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함)의 5' 말단 변형에서 키랄 중심의 입체화학이 뜻밖에 ds 올리고뉴클레오티드의 특성을 유지하거나 개선할 수 있다는 인식을 포함한다. 예를 들어, 제한 없이, 본 발명은 부분적으로 Rp 또는 Sp 배열의 포스포로티오에이트 키랄 중심 및 다음으로부터 선택되는 5' 말단 변형을 포함하는 가이드 가닥을 포함하는 ds 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다:
특정 구현예에서, 본 발명은 입체화학, 예를 들어 가이드 가닥(ds 올리고뉴클레오티드의 가이드 가닥은 또한 Rp 또는 Sp 배열의 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함)의 5' 말단 변형에서 키랄 중심의 입체화학이 뜻밖에 ds 올리고뉴클레오티드의 특성을 유지하거나 개선할 수 있다는 인식을 포함한다. 예를 들어, 제한 없이, 본 발명은 부분적으로 Rp 또는 Sp 배열의 포스포로티오에이트 키랄 중심 및 다음으로부터 선택되는 5' 말단 변형을 포함하는 가이드 가닥을 포함하는 ds 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다:
(a) 5' PO 변형, 예컨대(그러나 다음으로 한정되지 않음):
Figure pct00001
;
(b) 5' VP 변형, 예컨대(그러나 다음으로 한정되지 않음):
Figure pct00002
;
(c) 5' MeP 변형, 예컨대(그러나 다음으로 한정되지 않음):
Figure pct00003
;
(d) 5' PN 및 5' 트리졸-P 변형, 예컨대(그러나 다음으로 한정되지 않음):
Figure pct00004
및
Figure pct00005
;
여기서, 염기는 A, C, G, T, U, 비염기성, 및 변형 핵염기에서 선택되고;
R2'는 H, OH, O-알킬, F, MOE, 4' C로의 잠금 핵산(LNA) 가교체 및 가교 핵산(BNA) 가교체로부터 선택됨, 예컨대(그러나 다음으로 한정되지 않음):
Figure pct00006
및
Figure pct00007
.
다른 특정 구현예에서, 본 발명은 입체화학, 예를 들어 가이드 가닥(ds 올리고뉴클레오티드의 가이드 가닥은 또한 Rp 또는 Sp 배열의 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함)의 5' 말단 뉴클레오티드에서 키랄 중심의 입체화학이 뜻밖에 ds 올리고뉴클레오티드의 특성을 유지하거나 개선할 수 있다는 인식을 포함한다. 예를 들어, 제한 없이, 본 발명은 부분적으로 Rp 또는 Sp 배열의 포스포로티오에이트 키랄 중심 및 다음으로부터 선택되는 5' 말단 뉴클레오티드를 포함하는 가이드 가닥을 포함하는 ds 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다:
(a) 5' PO 뉴클레오티드, 예컨대(그러나 다음으로 한정되지 않음):
Figure pct00008
;
(b) 5' VP 뉴클레오티드, 예컨대(그러나 다음으로 한정되지 않음):
Figure pct00009
;
(c) 5' MeP 뉴클레오티드, 예컨대(그러나 다음으로 한정되지 않음):
Figure pct00010
;
(d) 5' PN 및 5' 트리졸-P 뉴클레오티드, 예컨대(그러나 다음으로 한정되지 않음):
Figure pct00011
,
Figure pct00012
및
Figure pct00013
;
(e) 5' 비염기성 VP 및 5' 비염기성 MeP 뉴클레오티드, 예컨대(그러나 다음으로 한정되지 않음):
Figure pct00014
및
Figure pct00015
.
특정 구현예에서, 본 발명은, 천연 비-발생 뉴클레오티드간 연결, 예를 들어 중성 뉴클레오티드간 연결은, 특정 구현예에서, 뜻밖에 ds 올리고뉴클레오티드의 특성을 유지하거나 개선할 수 있다는 인식을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은, 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결이 ds 올리고뉴클레오티드의 활성을 크게 감소시키지 않으면서 ds 올리고뉴클레오티드에 도입될 수 있음을 입증한다. 예를 들어, 제한 없이, 본 발명은 부분적으로 다음 중 하나 이상을 포함하는 ds 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다: (1) 5' 및 3' 말단 디뉴클레오티드 중 하나 또는 둘 모두가 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결에 의해 연결되지 않은 가이드 가닥(즉 가이드 가닥은, 5' 말단 디뉴클레오티드 사이의 연결에 대해, 하류(즉, 3' 방향) 및/또는 3' 말단 디뉴클레오티드 사이의 연결에 대해, 상류(즉, 5' 방향)의 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결을 포함함); (2) 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이, 가이드 가닥의, 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 두 번째(+2)와 세 번째(+3) 뉴클레오티드 사이에 나타나고, 끝에서 두 번째 3' (N-1) 뉴클레오티드(여기서, N은 3' 말단 뉴클레오티드임)에 대해 나타나는 가이드 가닥; (3) 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이, 가이드 가닥의, 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 세 번째(+3)와 네 번째(+4) 뉴클레오티드 사이 및/또는 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 10번째(+10)와 11번째(+11) 뉴클레오티드 사이에 나타나는 가이드 가닥; (4) 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이 패신저 가닥의 중앙 뉴클레오티드에 대해, 상류(즉, 5' 방향)에 나타나는 패신저 가닥; 및 (5) 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이 패신저 가닥의 중앙 뉴클레오티드에 대해, 하류(즉, 3' 방향)에 나타나는 패신저 가닥.
특정 구현예에서, 본 발명은, 천연 비-발생 뉴클레오티드간 연결, 예를 들어 중성 뉴클레오티드간 연결은, 특정 구현예에서, 하나 이상의 분자를 본원에 기재된 이중 가닥 올리고뉴클레오티드에 연결하는 데 사용될 수 있다는 인식을 포함한다. 특정 구현예에서, 이러한 연결된 분자는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 표적화 및/또는 전달을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 제한 없이, 이러한 연결된 분자에는 친유성 분자가 포함된다. 특정 구현예에서, 연결된 분자는 하나 이상의 GalNAc 모이어티를 포함하는 분자이다. 특정 구현예에서, 연결된 분자는 수용체이다. 특정 구현예에서, 연결된 분자는 수용체 리간드이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 다양한 추가 화학적 모이어티를 ds 올리고뉴클레오티드에 혼입시키기 위한 기술을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 예를 들어, 핵염기를 통해(예를 들어, 임의로 링커를 통해 핵염기의 부위에 대한 공유 연결에 의해) 추가 화학적 모이어티를 도입하기 위한 시약 및 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 대립유전자-특이적 억제를 달성하는 기술, 예를 들어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물 및 이의 방법을 제공하며, 특정 표적 유전자의 하나의 대립유전자로부터의 전사체는 동일한 유전자의 적어도 하나의 다른 대립유전자에 비해 선택적으로 넉다운된다.
특히, 본 발명은, ds 올리고뉴클레오티드에 혼입될 수 있고 이의 하나 이상의 특성을 부여하거나 조정할 수 있는 구조적 요소, 기술, 및/또는 특징을 제공한다(예를 들어, 관련 기술 또는 특징이 결여된 다른 동일한 ds 올리고뉴클레오티드에 비해). 특정 구현예에서, 본 발명은, 하나 이상의 제공된 기술 및/또는 특징이 다양한 서열의 ds 올리고뉴클레오티드에 유용하게 혼입될 수 있음을 문서로 뒷받침한다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 제공된 특정 구조적 요소, 기술, 및/또는 특징이 RNAi 메커니즘(예를 들어, RNAi 제제)에 있어 관여 및/또는 유도하는 ds 올리고뉴클레오티드에 특히 유용함을 입증한다. 그러나 그럼에도 본 발명의 교시는 임의의 특정 메커니즘에 관여하거나 이를 통해 작동하는 ds 올리고뉴클레오티드로 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 본 발명은 임의의 메카니즘을 통해 작동하고 본원에 기재된 임의의 서열, 구조, 또는 포맷(또는 이의 일부)을 포함하는, 임의의 목적에 유용한 임의의 ds 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 임의의 메카니즘을 통해 작동하고, 본원에 기재된 임의의 서열, 구조, 또는 포맷(또는 이의 일부)을 포함하는 임의의 목적에 유용한 ds 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것으로, ds 올리고뉴클레오티드는 (1) 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는 가이드 가닥; (2) 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 +2 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이의 Rp, Sp, 또는 교호 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는 가이드 가닥; (3) 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심에 대해 상류, 즉, 5' 방향으로, 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는 가이드 가닥(상류 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심은 Rp 또는 Sp 배열임); (4) 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 (+2) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이, 또한 (a) +3 뉴클레오티드와 +4 뉴클레오티드 사이 및 (b) +5 뉴클레오티드와 +6 뉴클레오티드 사이 중 하나 또는 둘 모두의 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는 가이드 가닥; 및 (5) Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함하는, 전술한 가이드 가닥 중 하나 이상과 조합된 패신저 가닥을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 본 발명은 임의의 메카니즘을 통해 작동하고, 본원에 기재된 임의의 서열, 구조, 또는 포맷(또는 이의 일부)을 포함하는 임의의 목적에 유용한 ds 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것으로, ds 올리고뉴클레오티드는 (1) 5' 및 3' 말단 디뉴클레오티드 중 하나 또는 둘 모두가 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결에 의해 연결되지 않은 가이드 가닥(즉 가이드 가닥은, 5' 말단 디뉴클레오티드 사이의 연결에 대해, 하류(즉, 3' 방향) 및/또는 3' 말단 디뉴클레오티드 사이의 연결에 대해, 상류(즉, 5' 방향)의 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결을 포함함); (2) 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이, 가이드 가닥의, 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 두 번째(+2)와 세 번째(+3) 뉴클레오티드 사이에 나타나고, 끝에서 두 번째 3' (N-1) 뉴클레오티드(여기서, N은 3' 말단 뉴클레오티드임)에 대해 나타나는 가이드 가닥; (3) 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이, 가이드 가닥의, 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 세 번째(+3)와 네 번째(+4) 뉴클레오티드 사이 및/또는 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 10번째(+10)와 11번째(+11) 뉴클레오티드 사이에 나타나는 가이드 가닥; (4) 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이 패신저 가닥의 중앙 뉴클레오티드에 대해, 상류(즉, 5' 방향)에 나타나는 패신저 가닥; 및 (5) 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이 패신저 가닥의 중앙 뉴클레오티드에 대해, 하류(즉, 3' 방향)에 나타나는 패신저 가닥을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 본 발명은 임의의 메카니즘을 통해 작동하고 본원에 기재된 임의의 서열, 구조, 또는 포맷(또는 이의 일부)을 포함하는, 임의의 목적에 유용한 ds 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것으로, ds 올리고뉴클레오티드는 (1) 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는 가이드 가닥; (2) 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 +2 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이의 Rp, Sp, 또는 교호 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는 가이드 가닥; (3) 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심에 대해 상류(즉, 5' 방향)에 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는 가이드 가닥(상류 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심은 Rp 또는 Sp 배열임); (4) 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 (+2) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이, 또한 (a) +3 뉴클레오티드와 +4 뉴클레오티드 사이 및 (b) +5 뉴클레오티드와 +6 뉴클레오티드 사이 중 하나 또는 둘 모두의 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는 가이드 가닥; 및 (5) Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함하는, 전술한 가이드 가닥 중 하나 이상과 조합된 패신저 가닥을 포함하지만 이에 한정되지 않고, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 서열, 구조, 또는 포맷(또는 이의 일부)을 포함하는, 임의의 목적에 유용한 ds 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것으로, ds 올리고뉴클레오티드는 (1) 5' 및 3' 말단 디뉴클레오티드 중 하나 또는 둘 모두가 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결에 의해 연결되지 않은 가이드 가닥(즉 가이드 가닥은, 5' 말단 디뉴클레오티드 사이의 연결에 대해, 하류(즉, 3' 방향) 및/또는 3' 말단 디뉴클레오티드 사이의 연결에 대해, 상류(즉, 5' 방향)의 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결을 포함함); (2) 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이, 가이드 가닥의, 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 두 번째(+2)와 세 번째(+3) 뉴클레오티드 사이에 나타나고, 끝에서 두 번째 3' (N-1) 뉴클레오티드(여기서, N은 3' 말단 뉴클레오티드임)에 대해 나타나는 가이드 가닥; (3) 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이, 가이드 가닥의, 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 세 번째(+3)와 네 번째(+4) 뉴클레오티드 사이 및/또는 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 10번째(+10)와 11번째(+11) 뉴클레오티드 사이에 나타나는 가이드 가닥; (4) 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이 패신저 가닥의 중앙 뉴클레오티드에 대해, 상류(즉, 5' 방향)에 나타나는 패신저 가닥; 및 (5) 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이 패신저 가닥의 중앙 뉴클레오티드에 대해, 하류(즉, 3' 방향)에 나타나는 패신저 가닥을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 RNAi 메커니즘에 관여(예를 들어, 유도)할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 RNase H(리보뉴클레아제 H) 메커니즘에 관여할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 번역 억제제로서 작용할 수 있다(예를 들어, 번역의 입체 블록을 제공할 수 있음).
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49)을 포함한다.
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 +2 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이의 Rp, Sp, 또는 교호 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49)을 포함한다.
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심 상류의 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49)을 포함한다.
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 가이드 가닥의, 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 두 번째(+2)와 세 번째(+3) 뉴클레오티드 사이에 나타나고 끝에서 두 번째 3' (N-1) 뉴클레오티드에 대해 나타나는 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결을 포함하고, 패신저 가닥은 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49)을 포함한다.
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함한다.
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 +2 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이의 Rp, Sp, 또는 교호 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함한다.
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 키랄 중심 상류의 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함한다.
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 (+2) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이, 또한 (a) (+3) 뉴클레오티드와 (+4) 뉴클레오티드 사이 및 (b) (+5) 뉴클레오티드와 (+6) 뉴클레오티드 사이 중 하나 또는 둘 모두의 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함한다.
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 가이드 가닥의, 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 두 번째(+2)와 세 번째(+3) 뉴클레오티드 사이에 나타나고 끝에서 두 번째 3' (N-1) 뉴클레오티드에 대해 나타나는 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결을 포함하고, 패신저 가닥은 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함한다.
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49) 및 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함한다.
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 +2 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이의 Rp, Sp, 또는 교호 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49) 및 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함한다.
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심 상류의 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49) 및 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함한다.
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 가이드 가닥의, 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 두 번째(+2)와 세 번째(+3) 뉴클레오티드 사이에 나타나고 끝에서 두 번째 3' (N-1) 뉴클레오티드에 대해 나타나는 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결을 포함하고, 패신저 가닥은 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49) 및 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함한다.
특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 엑손 스키핑 메커니즘에 관여할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 앱타머일 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 단백질, 소분자, 핵산, 또는 세포에 결합하여 기능을 억제할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 세포에서 이중 가닥 핵산과 삼중 나선을 형성하는 데 관여할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 게놈(예를 들어, 염색체) 핵산에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 게놈(예를 들어, 염색체) 핵산에 결합하여 핵산의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있다(예를 들어, 전사, 전사 향상, 변형 등을 방지하거나 감소시킴으로써). 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 DNA 쿼드루플렉스에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 면역조절성일 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 면역자극성일 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오티드는 면역자극성일 수 있고, CpG 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 면역자극성일 수 있고, CpG 서열을 포함할 수 있고, 보조제로서 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 면역자극성일 수 있고, CpG 서열을 포함할 수 있고, 질환(예를 들어, 감염성 질환 또는 암) 치료에 보조제로서 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 치료적일 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 비치료적일 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 치료적 또는 비치료적일 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 치료, 진단, 연구, 및/또는 나노물질 응용에 유용하다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 실험 목적으로 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 실험 목적, 예를 들어 프로브로서, 마이크로어레이 등에서 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 하나 초과의 생물학적 메커니즘에 관여할 수 있다; 이러한 특정 구현예에서, 예를 들어 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 RNAi 및 RNase H 메커니즘 모두에 관여할 수 있다.
특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 표적(예를 들어, 표적 서열, 표적 RNA, 표적 mRNA, 표적 pre-mRNA, 표적 유전자 등)으로 유도된다. 표적 유전자는 하나 이상의 유전자 생성물(예를 들어, RNA 및/또는 단백질 생성물)의 발현 및/또는 활성이 변경되도록 의도된 유전자이다. 특정 구현예에서, 표적 유전자는 억제되도록 의도된다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 ds 올리고뉴클레오티드가 특정 표적 유전자에 작용하는 경우, ds 올리고뉴클레오티드가 없을 때와 비교하여 올리고뉴클레오티드가 존재할 때 해당 유전자의 하나 이상의 유전자 생성물의 존재 및/또는 활성이 변경된다.
특정 구현예에서, 표적은 하나 이상의 산물(예를 들어, RNA 및/또는 단백질 산물)의 발현 및/또는 활성이 변경되도록 의도된 특정 대립유전자이다. 특정 구현예에서, 표적 대립유전자는 이의 존재 및/또는 발현이 하나 이상의 질환 및/또는 병태의 존재, 발병률, 및/또는 중증도와 관련이 있는 것이다(예를 들어, 상관관계가 있다). 대안적으로 또는 추가적으로, 특정 구현예에서, 표적 대립유전자는 하나 이상의 유전자 생성물의 수준 및/또는 활성의 변경이 질환 및/또는 병태의 하나 이상의 측면의 개선(예를 들어, 발병 지연, 중증도 감소, 다른 치료법에 대한 반응성 등)과 상관되는 것이다.
특정 구현예에서, 특정 대립유전자(질환 관련 대립유전자)의 존재 및/또는 활성이 하나 이상의 장애, 질환, 및/또는 병태의 존재, 발생률, 및/또는 중증도와 연관(예를 들어, 상관)되는 경우, 동일한 대립유전자의 다른 대립유전자 유전자가 존재하고, 그 정도로 연관되지 않았거나 더 적은 정도로 연관되고(예를 들어, 덜 유의하거나 통계적으로 유의하지 않은 상관관계를 보임), 본원에 기재된 바와 같은 ds 올리고뉴클레오티드 및 이의 방법은 하나 이상의 덜 연관된/비연관된 대립유전자(들)에 비해 연관된 대립유전자를 우선적으로 또는 특이적으로 표적화하여 대립유전자-특이적 억제를 매개할 수 있다.
특정 구현예에서, 표적 서열은 본원에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드가 결합하는 서열이다. 특정 구현예에서, 표적 서열은 제공된 올리고뉴클레오티드의 서열, 또는 그 안의 연속적인 잔기와 동일하거나 또는 그에 대한 정확한 상보체이다(예를 들어, 제공된 올리고뉴클레오티드는 표적 서열과 동일하거나 표적 서열의 정확한 상보체인 표적-결합 서열을 포함한다). 특정 구현예에서, 표적-결합 서열은 전사체(예를 들어, pre-mRNA, mRNA 등)의 표적 서열의 정확한 상보체이다. 표적-결합 서열/표적 서열은 목적하는 활성 및/또는 특성을 갖는 제공된 올리고뉴클레오티드에 대해 다양한 길이일 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 결합 서열/표적 서열은 5~50개(예를 들어, 10~40, 15~30, 15~25, 16~25, 17~25, 18~25, 19~25, 20~25, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상)의 염기를 포함한다. 특정 구현예에서, 표적 및/또는 올리고뉴클레오티드 서열의 5' 및/또는 3'-말단 영역을 포함하지만 이에 한정되지 않는 (관련 부분의) 올리고뉴클레오티드와 이의 표적 서열 사이에 소수의 차이/불일치가 허용된다. 특정 구현예에서, 표적 서열은 표적 유전자 내에 존재한다. 특정 구현예에서, 표적 서열은 표적 유전자로부터 생성된 전사체(예를 들어, mRNA 및/또는 프리-mRNA) 내에 존재한다.
특정 구현예에서, 표적 서열은 하나 이상의 대립유전자 부위(즉, 대립유전자 변이가 발생하는 표적 유전자 내의 위치)를 포함한다. 특정 구현예에서, 대립유전자 부위는 돌연변이이다. 특정 구현예에서, 대립유전자 부위는 SNP이다. 이러한 일부 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 다른 대립유전자에 비해 우선적으로 또는 특이적으로 하나의 대립유전자에 결합한다. 특정 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오티드는 질환-관련 대립유전자에 우선적으로 결합한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드(또는 이의 표적-결합 서열 부분)는 표적 서열의 특정 대립유전자 버전과 완전히 또는 적어도 부분적으로 동일하거나 이의 정확한 상보체인 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드(또는 이의 표적-결합 서열 부분)는 질환-관련 대립유전자의 대립유전자 부위 또는 대립유전자 부위를 포함하는 표적 서열과 동일하거나 이의 정확한 상보체인 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 올리고뉴클레오티드는 대립유전자(특정 구현예에서, 질환 관련 대립유전자)의 전사체의 대립유전자 부위를 포함하는 표적 서열의 정확한 상보체인 표적 결합 서열을 갖고, 대립유전자 부위는 돌연변이이다. 특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 올리고뉴클레오티드는 대립유전자(특정 구현예에서, 질환 관련 대립유전자)의 전사체의 대립유전자 부위를 포함하는 표적 서열의 정확한 상보체인 표적 결합 서열을 갖고, 대립유전자 부위는 SNP이다. 특정 구현예에서, 서열은 본원에 개시된 임의의 서열이다.
달리 언급되지 않는 한, 모든 서열(화학, 변형, 및/또는 입체화학의 염기 서열 및 패턴을 포함하지만 이에 한정되지 않음)는 5'에서 3' 순으로, 5' 말단 뉴클레오티드는 "+1" 위치로 식별되고, 3' 말단 뉴클레오티드는 전체 서열의 뉴클레오티드 수 또는 "N"에 의해 식별되고, 끝에서 두 번째 뉴클레오티드는 예를 들어, "N-1" 등으로 식별되어 제시된다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 표적에 특이적이고 본원에 개시된 임의의 올리고뉴클레오티드의 임의의 포맷, 구조적 요소, 또는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드와 관련된 조성물 및 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 표적에 특이적이고 본원에 개시된 임의의 올리고뉴클레오티드의 염기 서열 또는 본원에 개시된 임의의 올리고뉴클레오티드의 염기 서열의 적어도 15개 인접 뉴클레오티드의 영역을 갖거나 포함하는 올리고뉴클레오티드와 관련된 조성물 및 방법을 제공하고, 염기 서열의 첫 번째 뉴클레오티드 또는 적어도 15개 인접 뉴클레오티드의 첫 번째 뉴클레오티드는 T 또는 DNA T로 임의로 대체될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 RNAi 제제(또한 RNAi 올리고뉴클레오티드로 지칭됨)에 의해 유도되는 RNA 간섭을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 이러한 조성물의 올리고뉴클레오티드는 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드의 포맷, 구조적 요소, 또는 염기 서열을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)에 의해 유도되는 표적 유전자 RNA의 RNase H-매개 넉다운을 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
제공된 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 조성물은 본원에 개시된 임의의 올리고뉴클레오티드의 임의의 포맷, 구조적 요소, 또는 염기 서열을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 구조적 요소는 5'-말단 구조, 5'-말단 영역, 5'-뉴클레오티드, 시드 영역, 시드-후 영역, 3'-말단 영역, 3'-말단 디뉴클레오티드, 3'-말단 캡, 또는 이러한 구조 중 임의의 부분, GC 함량, 긴 GC 스트레치, 및/또는 임의의 변형, 화학, 입체화학, 변형 패턴, 화학 또는 입체화학, 또는 화학적 모이어티(예를 들어, 표적화 모이어티, 지질 모이어티, GalNAc 모이어티, 탄수화물 모이어티 등), 임의의 성분, 또는 상기 중 임의의 조합이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 올리고뉴클레오티드의 조성물 및 사용 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 표적 유전자 RNA의 RNA 간섭 및 RNase H-매개 넉다운 모두를 유도할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 조성물 및 사용 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 이러한 조성물의 올리고뉴클레오티드는 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드의 포맷, 구조적 요소, 또는 염기 서열을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 특정 이벤트 또는 활성을 유도하는 올리고뉴클레오티드는 특정 이벤트 또는 활성, 예를 들어 표적 유전자 또는 이의 유전자 생성물의 발현, 수준, 또는 활성의 감소에 관여한다. 특정 구현예에서, 이벤트 또는 활성이 발생할 수 있는 시스템에서 올리고뉴클레오티드의 존재가 이벤트 또는 활성의 검출가능한 발생률, 빈도, 강도, 및/또는 수준과 상관관계가 있을 때, 올리고뉴클레오티드는 특정 이벤트 또는 활동을 "유도"하는 것으로 간주된다.
특정 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드의 임의의 하나 이상의 구조적 요소, 예를 들어 염기 서열(또는 이의 적어도 15개 인접 염기의 일부); 뉴클레오티드간 연결(또는 이의 적어도 5개 인접 뉴클레오티드간 연결의 일부) 패턴; 뉴클레오티드간 연결(또는 이의 적어도 5개 인접 뉴클레오티드간 연결의 일부) 입체화학 패턴; 5' 말단 구조; 5' 말단 영역; 제1 영역; 제2 영역; 및 3'-말단 영역(3'-말단 디뉴클레오티드 및/또는 3'-말단 캡일 수 있음); 및 임의의 추가 화학적 모이어티를 포함하고; 특정 구체예에서, 적어도 하나의 구조적 요소는 키랄 제어 키랄 중심을 포함한다. 특정 구현예에서, 3'-말단 디뉴클레오티드는 총 2개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티는 비제한적 예로서, 표적화 모이어티, 탄수화물 모이어티, GalNAc 모이어티, 지질 모이어티, 및 본원에 기재되거나 당업계에 알려진 임의의 다른 화학적 모이어티로부터 선택되는 화학적 모이어티를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, APGR에 결합하는 모이어티는 본원에 기재되거나 당업계에 알려진 GalNAc의 모이어티, 또는 이의 변이체, 유도체, 또는 변형된 버전이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 RNAi 제제이다. 특정 구현예에서, 제1 영역은 시드 영역이다. 특정 구현예에서, 제2 영역은 시드-후 영역이다.
특정 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 제제의 임의의 하나 이상의 구조적 요소, 예를 들어, 5'-말단 구조; 5' 말단 영역; 시드 영역; 시드-후 영역(시드 영역과 3'-말단 영역 사이의 영역); 및 3'-말단 영역(3'-말단 디뉴클레오티드 및/또는 3'-말단 캡일 수 있음); 및 임의의 추가 화학적 모이어티를 포함하고; 특정 구현예에서, 적어도 하나의 구조적 요소는 키랄 제어 키랄 중심을 포함한다. 특정 구현예에서, 3'-말단 디뉴클레오티드는 총 2개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티는 비제한적 예로서, 표적화 모이어티, 탄수화물 모이어티, GalNAc 모이어티, 및 지질 모이어티로부터 선택되는 화학적 모이어티를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, APGR에 결합하는 모이어티는 본원에 기재되거나 당업계에 알려진 임의의 GalNAc, 또는 이의 변이체, 유도체, 또는 변형이다.
특정 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드의 임의의 하나 이상의 구조적 요소, 예를 들어, 5'-말단 구조, 5'-말단 영역, 제1 영역, 제2 영역, 3'-말단 영역, 및 임의의 추가 화학적 모이어티를 포함하고, 적어도 하나의 구조적 요소는 키랄 제어 키랄 중심을 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 2'-변형 없이 적어도 총 5개의 뉴클레오티드의 스팬을 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티는 비제한적 예로서, 표적화 모이어티, 탄수화물 모이어티, GalNAc 모이어티, 및 지질 모이어티로부터 선택되는 추가 화학적 모이어티를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오티드는 RNA 간섭을 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오티드는 RNase H-매개 넉다운을 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오티드는 RNA 간섭 및 RNase H-매개 넉다운 모두를 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 영역은 시드 영역이다. 특정 구현예에서, 제2 영역은 시드-후 영역이다.
특정 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 제제의 임의의 하나 이상의 구조적 요소, 예를 들어, 5'-말단 구조, 5'-말단 영역, 시드 영역, 시드-후 영역, 및 3'-말단 영역, 및 임의의 추가 화학적 모이어티를 포함하고, 적어도 하나의 구조적 요소는 키랄 제어 키랄 중심을 포함하고; 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 또한 표적 유전자 RNA의 RNase H-매개 넉다운을 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 총 5개의 2'-데옥시 뉴클레오티드의 스팬을 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티는 비제한적 예로서, 표적화 모이어티, 탄수화물 모이어티, GalNAc 모이어티, 및 지질 모이어티로부터 선택되는 화학적 모이어티 및 본원에 기재된 임의의 다른 추가적인 화학적 모이어티를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 올리고뉴클레오티드 특성이 화학적 변형을 통해 조절될 수 있음을 입증한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 공통 염기 서열을 갖고 하나 이상의 뉴클레오티드간 연결, 당, 및/또는 염기 변형을 포함하는 복수의 제1 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 공통 염기 서열을 갖고 하나 이상의 뉴클레오티드간 연결, 및/또는 하나 이상의 당, 및/또는 하나 이상의 염기 변형을 포함하는 복수의 제1 올리고뉴클레오티드를 포함하고 RNA 간섭을 유도할 수 있는 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 조성물은 또한 표적 유전자 RNA의 RNase H-매개 넉다운을 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 올리고뉴클레오티드 특성, 예를 들어, 활성, 독성 등이 당, 핵염기, 및/또는 뉴클레오티드간 연결의 화학적 변형을 통해.조절될 수 있음을 입증한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 공통 염기 서열을 갖고, 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드간 연결(또는 "비-천연 뉴클레오티드간 연결, 천연 DNA 및 RNA에서 발견되는 (생리적 pH에서 염 형태(-OP(O)(O-)O-)로 존재할 수 있는) 천연 포스페이트 뉴클레오티드간 연결(-OP(O)(OH)O-) 대신 이용될 수 있는 연결), 하나 이상의 변형된 당 모이어티, 및/또는 하나 이상의 천연 포스페이트 연결을 포함하는, 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오티드는 둘 이상의 유형의 변형 뉴클레오티드간 연결을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오티드는 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 중성 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 중성 뉴클레오티드간 연결은 환형 구아니딘 모이어티를 포함한다. 이러한 모이어티는 임의로 치환된다. 특정 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오티드는 중성 뉴클레오티드간 연결 및 중성 백본이 아닌, 또 다른 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오티드는 중성 뉴클레오티드간 연결 및 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 제공된 올리고뉴클레오티드 조성물은 키랄 제어되고, 조성물의 복수의 올리고뉴클레오티드의 수준은 제어되거나 사전 결정되고, 복수의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 키랄 뉴클레오티드간 연결에서 공통 입체화학 배열을 공유한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 각각이 독립적으로 Rp 또는 Sp인, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 키랄 뉴클레오티드간 연결에서 공통 입체화학 배열을 공유한다. 특정 구현예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 각각의 키랄 뉴클레오티드간 연결에서 공통 입체화학 배열을 공유한다. 특정 구현예에서, 조성물의 미리 결정된 수준의 올리고뉴클레오티드가 공통 입체화학 배열(독립적으로 Rp 또는 Sp)을 공유하는 키랄 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이라 지칭된다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은, pH(예를 들어, 인간의 생리적 pH(약 7.4), 전달 부위(예를 들어, 소기관, 세포, 조직, 기관, 유기체 등)의 pH 등)에서 주로 (예를 들어, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 등; 특정 구현예에서, 적어도 30%; 특정 구현예에서, 적어도 40%; 특정 구현예에서, 적어도 50%; 특정 구현예에서, 적어도 60%; 특정 구현예에서, 적어도 70%; 특정 구현예에서, 적어도 80%; 특정 구현예에서, 적어도 90%; 특정 구현예에서, 적어도 99%; 등) 각각 중성 또는 양이온 형태(음이온 형태(예를 들어, -O-P(O)(O-)-O-(천연 포스페이트 연결의 음이온 형태), -O-P(O)(S-)-O-(포스포로티오에이트 연결의 음이온 형태)와 비교하여)로서 존재한다는 점에서 음으로 하전되지 않은 (중성 또는 양이온성) 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은, pH에서 주로 중성 형태로서 존재한다는 점에서 중성 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은, pH에서 주로 양이온성 형태로서 존재한다는 점에서 양이온성 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, pH는 인간의 생리적 pH(약 7.4)이다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은, 수용액 중 pH 7.4에서, 뉴클레오티드간 연결의 적어도 90%가 중성 형태로서 존재한다는 점에서 중성 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은, 올리고뉴클레오티드의 수용액에서, 뉴클레오티드간 연결의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%가 중성 형태로서 존재한다는 점에서 중성 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 90%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 95%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 99%이다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결, 예를 들어, 중성 뉴클레오티드간 연결은, 이의 중성 형태로 있을 때, pKa가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14 미만인 모이어티를 갖지 않는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오티드간 연결의 pKa는 CH3-뉴클레오티드간 연결-CH3(즉, 뉴클레오티드간 연결에 의해 연결된 두 개의 뉴클레오시드 단위를 두 개의 -CH3 기로 대체)의 pKa로 표시될 수 있다. 임의의 특정 이론에 구애되고자 함이 없이, 적어도 일부 경우에, 올리고뉴클레오티드의 중성 뉴클레오티드간 연결은, 중성 뉴클레오티드간 연결을 포함하지 않는 비슷한 핵산과 비교하여, 개선된 특성 및/또는 활성, 예를 들어, 개선된 전달, 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제에 대한 개선된 저항성, 개선된 세포 흡수, 개선된 엔도솜 탈출 및/또는 개선된 핵 흡수 등을 제공할 수 있다.
특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은, 예를 들어 화학식 I-n-1, I-n-2, I-n-3, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2의 구조를 가지며, 이는 US 9394333, US 9744183, US 9605019, US 9598458, US 9982257, US 10160969, US 10479995, US 2020/0056173, US 2018/0216107, US 2019/0127733, US 10450568, US 2019/0077817, US 2019/0249173, US 2019/0375774, WO 2018/223056, WO 2018/223073, WO 2018/223081, WO 2018/237194, WO 2019/032607, WO 2019/055951, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, 및/또는 WO 2019/032612에 기술된 바와 같다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 환형 구아니딘 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 환형 구아니딘 모이어티를 포함하는 변형 뉴클레오티드간 연결은 다음의 구조를 갖는다:
Figure pct00016
. 특정 구현예에서, 환형 구아니딘 모이어티를 포함하는 중성 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 적어도 하나의 중성 뉴클레오티드간 연결 및 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 적어도 하나의 중성 뉴클레오티드간 연결 및 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결은 Sp 배열의 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 적어도 하나의 중성 뉴클레오티드간 연결 및 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 포스포로티오에이트는 Rp 배열의 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 Tmg 기(
Figure pct00017
)를 포함하는 중성 뉴클레오티드간 연결의 적어도 하나의 중성 뉴클레오티드간 연결 및 적어도 하나의 포스포로티오에이트를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로, 천연 포스페이트 연결, 포스포로티오에이트 연결, 및 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, n001, n003, n004, n006, n008, n009, n013, n020, n021, n025, n026, n029, n031, n037, n046, n047, n048, n054, 또는 n055)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로, 천연 포스페이트 연결, 포스포로티오에이트 연결, 및 중성 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, n001, n003, n004, n006, n008, n009, n013 n020, n021, n025, n026, n029, n031, n037, n046, n047, n048, n054, 또는 n055)로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 Tmg 기를 포함하는 중성 뉴클레오티드간 연결의 적어도 하나의 중성 뉴클레오티드간 연결 및 적어도 하나의 포스포로티오에이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 포스포로티오에이트는 Sp 배열의 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 Tmg 기를 포함하는 중성 뉴클레오티드간 연결로부터 선택된 적어도 하나의 중성 뉴클레오티드간 연결 및 적어도 하나의 포스포로티오에이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 포스포로티오에이트는 Rp 배열의 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다.
다양한 유형의 뉴클레오티드간 연결은 특성이 상이하다. 임의의 이론에 구애되고자 함이 없이, 본 발명은 천연 포스페이트 연결(포스포디에스테르 뉴클레오티드간 연결)은 음이온성이고, 생체 내에서 다른 화학적 변형 없이 그것만으로 사용될 때 불안정할 수 있고; 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결은 음이온성이고, 일반적으로 천연 포스페이트 연결보다 생체 내에서 안정적이고, 일반적으로 더 소수성이며; 환형 구아니딘 모이어티를 포함하는 본 발명에 예시된 것과 같은 중성 뉴클레오티드간 연결은 생리적 pH에서 중성이고, 천연 포스페이트 연결보다 생체 내에서 안정적일 수 있고, 더 소수성일 수 있음에 주목한다.
특정 구현예에서, 키랄 제어 중성 뉴클레오티드간 연결은 생리학적 pH에서 중성이고, 키랄 제어되고, 생체내에서 안정하고, 소수성이고, 엔도솜 탈출을 증가시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 영역, 예를 들어 블록, 윙, 코어, 5'-말단, 3'-말단, 중간, 시드, 시드-후 영역 등을 포함한다. 특정 구현예에서, 영역(예를 들어, 블록, 윙, 코어, 5'-말단, 3'-말단, 중간 영역 등)은, US 9394333, US 9744183, US 9605019, US 9598458, US 9982257, US 10160969, US 10479995, US 2020/0056173, US 2018/0216107, US 2019/0127733, US 10450568, US 2019/0077817, US 2019/0249173, US 2019/0375774, WO 2018/223056, WO 2018/223073, WO 2018/223081, WO 2018/237194, WO 2019/032607, WO 2019/055951, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, 및/또는 WO 2019/032612에 기재된 바와 같이, 예를 들어 화학식 I-n-1, I-n-2, I-n-3, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2의, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 영역은 중성 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 영역은 환형 구아니딘인 구아니딘을 포함하는 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 영역은 환형 구아니딘 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 영역은
Figure pct00018
의 구조를 갖는 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 이러한 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어된다.
특정 구현예에서, 뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체이다. 특정 구현예에서, 염기는 변형 염기이다. 특정 구현예에서, 염기는 올리고뉴클레오티드 합성에 사용되는 보호된 핵염기와 같은 보호된 핵염기이다. 특정 구현예에서, 염기는 변형 유사체이다. 특정 구현예에서, 당은 변형 당이다. 특정 구현예에서, 당은 당 유사체이다. 특정 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 변형 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 뉴클레오티드는 염기, 당, 및 뉴클레오티드간 연결을 포함하고, 각각의 염기, 당, 및 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 그리고 임의로 천연 발생 또는 천연 비-발생이다. 특정 구현예에서, 뉴클레오시드는 염기 및 당을 포함하고, 염기 및 당 각각은 독립적으로 그리고 임의로 천연 발생 또는 천연 비-발생이다. 뉴클레오티드의 비제한적인 예는 DNA(2'-데옥시) 및 RNA(2'-OH) 뉴클레오티드를 포함하고; 염기, 당, 및/또는 뉴클레오티드간 연결에서 하나 이상의 변형을 포함하는 것을 포함한다. 당의 비제한적 예는 리보스 및 데옥시리보스를 포함하고; 2'-F, LNA, 2'-OMe, 및 2'-MOE 변형을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 2'-변형을 갖는 리보스 및 데옥시리보스를 포함한다. 특정 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 인을 포함하지 않지만 2개의 천연 또는 비-천연 당을 연결하는 역할을 하는 모이어티이다.
특정 구현예에서, 조성물은 복수의 제1 올리고뉴클레오티드 및/또는 복수의 제2 올리고뉴클레오티드 중 임의의 둘 이상의 다량체를 포함하고, 복수의 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드는 RNA 간섭 및/또는 RNase H-매개 넉다운을 통해 독립적으로 동일하거나 상이한 표적의 넉다운을 독립적으로 유도할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 다음을 공유하는 복수의 제1 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공한다:
1) 공통 염기 서열;
2) 공통 백본 연결 패턴;
3) 독립적으로 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 또는 50개의 키랄 뉴클레오티드간 연결("키랄 제어 뉴클레오티드간 연결")에서 공통 입체화학(조성물 내 복수의 제1 올리고뉴클레오티드의 수준에서 키랄 제어되는 조성물은 미리 결정됨).
특정 구현예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 복수의 제1 올리고뉴클레오티드)를 포함하는 올리고뉴클레오티드 조성물은 복수의 올리고뉴클레오티드가 하나 이상의 키랄 뉴클레오티드간 연결에서 독립적으로 공통 입체화학을 공유한다는 점에서 키랄 제어된다. 특정 구현예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 각각이 독립적으로 Rp 또는 Sp인, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 키랄 뉴클레오티드간 연결에서 공통 입체화학 배열을 공유한다. 특정 구현예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 각각의 키랄 뉴클레오티드간 연결에서 공통 입체화학 배열을 공유한다. 특정 구현예에서, 조성물의 미리 결정된 수준의 올리고뉴클레오티드가 공통 입체화학 배열(독립적으로 Rp 또는 Sp)을 공유하는 키랄 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이라 지칭된다.
특정 구현예에서, 제공된 조성물의 미리 결정된 수준의 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 특정 예시 조성물의 제1 복수의 올리고뉴클레오티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결을 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 5개의 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어된다; 특정 구현예에서, 적어도 10개의 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어된다; 특정 구현예에서, 적어도 15개의 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어된다; 특정 구현예에서, 각각의 키랄 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어된다.
특정 구현예에서, 키랄 뉴클레오티드간 연결의 1~100%는 키랄 제어된다. 특정 구현예에서, 키랄 뉴클레오티드간 연결의 적어도 15%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%는 키랄 제어된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 다음을 공유하는 복수의 제1 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공한다:
1) 공통 염기 서열;
2) 공통 백본 연결 패턴; 및
3) 공통 백본 키랄 중심 패턴(상기 조성물은, 조성물 중 올리고뉴클레오티드의 미리 결정된 수준이 공통 염기 서열 및 길이, 공통 백본 연결 패턴, 및 공통 백본 키랄 중심 패턴을 갖는다는 점에서 올리고뉴클레오티드의 실질적으로 순수한 제제임). 특정 구현예에서, 공통 백본 키랄 중심 패턴은 키랄 제어 키랄 중심을 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준의 올리고뉴클레오티드는 제공된 조성물 내 모든 올리고뉴클레오티드의 적어도 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준의 올리고뉴클레오티드는, 공통 염기 서열이거나 이를 포함하는 제공된 조성물 내 모든 올리고뉴클레오티드의 적어도 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다. 특정 구현예에서, 공통 염기 서열이거나 이를 포함하는 제공된 조성물 내 모든 올리고뉴클레오티드는 조성물 내 모든 올리고뉴클레오티드의 적어도 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준의 올리고뉴클레오티드는 공통 염기 서열, 염기 변형, 당 변형, 및/또는 변형 뉴클레오티드간 연결이거나 이를 포함하는 제공된 조성물 내 모든 올리고뉴클레오티드의 적어도 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다. 특정 구현예에서, 공통 염기 서열, 염기 변형, 당 변형, 및/또는 변형 뉴클레오티드간 연결이거나 이를 포함하는 제공된 조성물 내 모든 올리고뉴클레오티드는 조성물 내 모든 올리고뉴클레오티드의 적어도 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준의 올리고뉴클레오티드는, 공통 염기 서열, 염기 변형 패턴, 당 변형 패턴, 및/또는 변형 뉴클레오티드간 연결 패턴이거나 이를 포함하는 제공된 조성물 내 모든 올리고뉴클레오티드의 적어도 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다. 특정 구현예에서, 공통 염기 서열, 염기 변형 패턴, 당 변형 패턴, 및/또는 변형 뉴클레오티드간 연결 패턴이거나 이를 포함하는 제공된 조성물 내 모든 올리고뉴클레오티드는 조성물 내 모든 올리고뉴클레오티드의 적어도 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준의 올리고뉴클레오티드는 공통 염기 서열, 공통 염기 변형 패턴, 공통 당 변형 패턴, 및/또는 공통 변형 뉴클레오티드간 연결 패턴을 공유하는 제공된 조성물 내 모든 올리고뉴클레오티드의 적어도 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다. 특정 구현예에서, 공통 염기 서열, 공통 염기 변형 패턴, 공통 당 변형 패턴, 및/또는 공통 변형 뉴클레오티드간 연결 패턴을 공유하는 제공된 조성물 내 모든 올리고뉴클레오티드는 조성물 내 모든 올리고뉴클레오티드의 적어도 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 1~100%이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 1%이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 5%이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 10%이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 20%이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 30%이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 40%이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 50%이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 60%이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 10%이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 70%이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 80%이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 90%이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 5*(1/2 g)이고, g는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 수이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 10*(1/2 g)이고, g는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 수이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 100*(1/2 g)이고, g는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 수이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 (0.80)g이고, g는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 수이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 (0.80)g이고, g는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 수이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 (0.80)g이고, g는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 수이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 (0.85)g이고, g는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 수이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 (0.90)g이고, g는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 수이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 (0.95)g이고, g는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 수이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 (0.96)g이고, g는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 수이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 (0.97)g이고, g는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 수이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 (0.98)g이고, g는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 수이다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 수준은 적어도 (0.99)g이고, g는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 수이다. 특정 구현예에서, 조성물 내 g개의 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드의 수준을 결정하기 위해, g개의 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결 각각의 부분입체순도의 곱((키랄 제어 뉴클레오티드간 연결 1의 부분입체순도) * (키랄 제어 뉴클레오티드간 연결 2의 부분입체순도) * … * (키랄 제어 뉴클레오티드간 연결 g의 부분입체순도))이 수준으로서 사용되고, 각각의 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결 부분입체순도는 독립적으로, 동일한 뉴클레오티드간 연결 및 뉴클레오티드간 연결을 플랭킹하는 뉴클레오시드를 포함하고 올리고뉴클레오티드와 유사한 방법(예를 들어, 유사하거나 바람직하게 동일한 시약 및 반응 조건을 포함하는 유사하거나 바람직하게 동일한 올리고뉴클레오티드 제조 사이클)으로 제조된 이량체의 부분입체순도로 표시된다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 수준 및/또는 부분입체순도는 분석 방법, 예를 들어 크로마토그래피, 분광분석, 분광법, 또는 이의 임의의 조합에 의해 측정될 수 있다. 특히, 본 발명은 입체무작위 올리고뉴클레오티드 제제가 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 사슬 내의 개별 백본 키랄 중심의 입체화학 구조(또는 입체화학)에서, 서로 상이한, 복수의 구별되는 화학적 엔티티를 함유한다는 인식을 포함한다. 백본 키랄 중심의 입체화학의 제어가 없으면, 입체무작위 올리고뉴클레오티드 제제는 미결정된 수준의 올리고뉴클레오티드 입체이성체를 포함하는 비제어된 조성물을 제공한다. 이러한 입체이성체는 동일한 염기 서열 및/또는 화학적 변형을 가질 수 있지만, 적어도 이들의 상이한 백본 입체화학으로 인해 이들은 상이한 화학적 엔티티를 갖고, 본원에서 증명된 바와 같이, 상이한 특성, 예를 들어, 뉴클레아제에 대한 민감성, 활성, 분포 등을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 특정 입체이성체는 예를 들어, 이의 염기 서열, 이의 길이, 이의 백본 연결의 패턴, 및 이의 백본 키랄 중심의 패턴에 의해 정의될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 올리고뉴클레오티드 내 입체화학의 제어를 통해 달성되는 특성 및 활성의 개선이 화학적 변형의 사용을 통해 달성되는 것과 필적하거나 보다 더 우수할 수 있음을 입증한다.
특히, 본 발명은 입체무작위 올리고뉴클레오티드 제제가 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 사슬 내의 개별 백본 키랄 중심의 입체화학 구조(또는 입체화학)에서, 서로 상이한, 복수의 구별되는 화학적 엔티티를 함유한다는 인식을 포함한다. 백본 키랄 중심의 입체화학의 제어가 없으면, 입체무작위 올리고뉴클레오티드 제제는 미결정된 수준의 올리고뉴클레오티드 입체이성체를 포함하는 비제어된 조성물을 제공한다. 이러한 입체이성체는 동일한 염기 서열 및/또는 화학적 변형을 가질 수 있지만, 적어도 이들의 상이한 백본 입체화학으로 인해 이들은 상이한 화학적 엔티티를 갖고, 본원에서 증명된 바와 같이, 상이한 특성, 예를 들어, 뉴클레아제에 대한 민감성, 활성, 분포 등을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 특정 입체이성체는 예를 들어, 이의 염기 서열, 이의 길이, 이의 백본 연결의 패턴, 및 이의 백본 키랄 중심의 패턴에 의해 정의될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 올리고뉴클레오티드 내 입체화학의 제어를 통해 달성되는 특성 및 활성의 개선이 화학적 변형의 사용을 통해 달성되는 것과 필적하거나 보다 더 우수할 수 있음을 입증한다.
본 발명의 기술은 특정 구현예에 대한 다음의 상세한 설명을 참조하여 보다 쉽게 이해될 수 있다.
정의
본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 지시되지 않는 한 다음의 정의가 적용될 것이다. 본 발명의 목적상, 원소는 문헌[Periodic Table of the Elements, CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed.]에 따라 확인된다. 또한, 유기 화학의 일반적인 원리가 문헌["Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999], 및 문헌["March's Advanced Organic Chemistry", 5th Ed., Ed.: Smith, M.B. and March, J., John Wiley & Sons, New York: 2001]에 기재되어 있다.
본 발명에서 본원에서 사용되는 바와 같이, 문맥상 달리 명백하지 않는 한, (i) 단수형 용어("a" 또는 "an")는 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해될 수 있고; (ii) "또는"이라는 용어는 "및/또는"을 의미하는 것으로 이해될 수 있고; (iii) "포함하는", "포함하다", "함유하는"("~에 한정되지 않는"과 함께 사용되든지 그렇지 않든지 간에) 및 "함유하다"("~에 한정되지 않는"과 함께 사용되든지 그렇지 않든지 간에)라는 용어는 단독으로 제공되든지 하나 이상의 추가의 구성 요소 또는 단계와 함께 제공되든지 간에 항목별 구성 요소 또는 단계를 포함하는 것으로 이해될 수 있고; (iv) "또 다른"이라는 용어는 적어도 추가의/두 번째의 하나 이상을 의미하는 것으로 이해될 수 있고; (v) "약" 및 "대략"이라는 용어는 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 표준 변동을 허용하는 것으로 이해될 수 있고; (vi) 범위가 제공되는 경우 종점이 포함된다.
달리 언급되지 않는 한, 올리고뉴클레오티드 및 이의 요소(예를 들어, 염기 서열, 당 변형, 뉴클레오티드간 연결, 연결 인 입체화학, 이의 패턴 등)에 대한 설명은 5'에서 3' 순으로, 5' 말단 뉴클레오티드는 "+1" 위치로 식별되고, 3' 말단 뉴클레오티드는 전체 서열의 뉴클레오티드 수 또는 "N"에 의해 식별되고, 끝에서 두 번째 뉴클레오티드는 예를 들어, "N-1" 등으로 식별된다. 당업자가 이해하는 바와 같이,특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 염 형태, 특히 제약상 허용가능한 염 형태, 예를 들어 나트륨 염으로서 제공 및/또는 이용될 수 있다. 당업자가 또한 인식할 수 있는 바와 같이, 특정 구현예에서, 조성물 내의 개별 올리고뉴클레오티드는, 비록 그러한 조성물(예를 들어, 액체 조성물) 내에서 특정한 이러한 올리고뉴클레오티드가 특정 순간에 상이한 염 형태(들)로 존재할 수 있다 해도(그리고 용해될 수 있고 올리고뉴클레오티드 사슬이 음이온 형태로 존재할 수 있다 해도(예를 들어 액체 조성물일 때)) 동일 구성 및/또는 구조인 것으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 당업자는 주어진 pH에서 올리고뉴클레오티드 사슬을 따른 개별 뉴클레오티드간 연결이 산(H) 형태, 또는 복수의 가능한 염 형태(예를 들어, 나트륨 염, 또는 상이한 양이온의 염(어떤 이온이 제제 또는 조성물에 존재할 수 있는지에 따라 다름)))로 존재할 수 있음을 인식할 것이며, 이의 산 형태(예를 들어, 모든 양이온(만약에 있다면)이 H+로 대체됨)가 동일한 구성 및/또는 구조의 것이기만 하다면, 이러한 개별 올리고뉴클레오티드는 적절하게는 동일한 구성 및/또는 구조의 것으로 간주될 수 있다.
지방족: 본원에서 사용되는 바와 같이, "지방족"은 완전히 포화되거나 하나 이상의 불포화 단위를 함유하는 직쇄(즉, 비분지형) 또는 분지형, 치환 또는 비치환 탄화수소 사슬, 또는 완전히 포화되거나 하나 이상의 불포화(그러나 방향족은 아님) 단위를 함유하는 치환 또는 비치환 단환, 이환, 또는 다환 탄화수소 고리(그러나 방향족은 아님), 또는 이들의 조합을 의미한다. 특정 구현예에서, 지방족 기는 1~50개의 지방족 탄소 원자를 포함한다. 특정 구현예에서, 지방족 기는 1~20개의 지방족 탄소 원자를 포함한다. 다른 구현예에서, 지방족 기는 1~10개의 지방족 탄소 원자를 포함한다. 다른 구현예에서, 지방족 기는 1~9개의 지방족 탄소 원자를 포함한다. 다른 구현예에서, 지방족 기는 1~8개의 지방족 탄소 원자를 포함한다. 다른 구현예에서, 지방족 기는 1~7개의 지방족 탄소 원자를 포함한다. 다른 구현예에서, 지방족 기는 1~6개의 지방족 탄소 원자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 지방족 기는 1~5개의 지방족 탄소 원자를 포함하고, 또 다른 구현예에서, 지방족 기는 1, 2, 3, 또는 4개의 지방족 탄소 원자를 포함한다. 적합한 지방족 기는 선형 또는 분지형, 치환 또는 비치환 알킬, 알케닐, 알키닐 기 및 이의 하이브리드, 예컨대 (시클로알킬)알킬, (시클로알케닐)알킬 또는 (시클로알킬)알케닐을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
알케닐: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "알케닐"은 하나 이상의 이중 결합을 갖는 본원에 정의된 바와 같은 지방족 기를 지칭한다.
알킬: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "알킬"은 당업계에서의 통상적인 의미가 주어지며, 직쇄 알킬 기, 분지쇄 알킬 기, 시클로알킬(지환족) 기, 알킬 치환 시클로알킬 기 및 시클로알킬 치환 알킬 기를 포함하는 포화 지방족 기를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 알킬은 1~100개의 탄소 원자를 갖는다. 특정 구현예에서, 직쇄 또는 분지쇄 알킬은 이의 백본 내에 약 1~20개의 탄소 원자(예를 들어, 직쇄의 경우 C1-C20, 분지쇄의 경우 C2-C20), 대안적으로 약 1~10개의 탄소 원자를 갖는다. 특정 구현예에서, 시클로알킬 고리는 이의 고리 구조(여기서 이러한 고리는 단환, 이환, 또는 다환임) 내에 약 3~10개의 탄소 원자, 대안적으로 약 5, 6 또는 7개의 탄소를 갖는다. 특정 구현예에서, 알킬 기는 저급 알킬 기일 수 있으며, 여기서, 저급 알킬 기는 1~4개의 탄소 원자를 포함한다(예를 들어, 직쇄 저급 알킬의 경우 C1-C4).
알키닐: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "알키닐"은 하나 이상의 삼중 결합을 갖는 본원에 정의된 바와 같은 지방족 기를 지칭한다.
유사체: 용어 "유사체"는 기준 화학적 모이어티 또는 모이어티 클래스와 구조적으로 상이하지만 이러한 기준 화학적 모이어티 또는 모이어티 클래스의 적어도 하나의 기능을 수행할 수 있는 임의의 화학적 모이어티를 포함한다. 비제한적인 예로서, 뉴클레오티드 유사체는 뉴클레오티드와 구조적으로 상이하지만 뉴클레오티드의 하나 이상의 기능을 수행하고; 핵염기 유사체는 핵염기와 구조적으로 상이하지만 핵염기의 하나 이상의 기능을 수행하고; 기타 등등이다.
동물: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "동물"은 동물계의 임의의 구성원을 지칭한다. 특정 구현예에서, "동물"은 임의의 발달 단계의 인간을 지칭한다. 특정 구현예에서, "동물"은 임의의 발달 단계의 비인간 동물을 지칭한다. 특정 구현예에서, 비인간 동물은 포유동물(예를 들어, 설치류, 마우스, 래트, 토끼, 마우스, 개, 고양이, 양, 소, 영장류, 및/또는 돼지)이다. 특정 구현예에서, 동물은 포유동물, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 및/또는 벌레를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 동물은 트랜스제닉 동물, 유전자 조작 동물, 및/또는 클론일 수 있다.
아릴: 본원에서 사용되는 바와 같이, 단독으로, 또는 "아르알킬", "아르알콕시", 또는 "아릴옥시알킬"에서와 같이 더 큰 모이어티의 일부로서 사용되는 "아릴"이라는 용어는 총 5~30개의 고리 구성원을 갖는 단환, 이환, 또는 다환 고리 시스템을 지칭하며, 여기서, 상기 시스템에서의 적어도 하나의 고리는 방향족이다. 특정 구현예에서, 아릴 기는 총 5~14개의 고리 구성원을 갖는 단환, 이환, 또는 다환 고리 시스템이며, 여기서, 상기 시스템에서의 적어도 하나의 고리는 방향족이고, 상기 시스템에서의 각각의 고리는 3~7개의 고리 구성원을 포함한다. 특정 구현예에서, 각각의 단환 고리 단위는 방향족이다. 특정 구현예에서, 아릴 기는 바이아릴 기이다. 용어 "아릴"은 용어 "아릴 고리"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, "아릴"은 하나 이상의 치환기를 가질 수 있는 페닐, 바이페닐, 나프틸, 바이나프틸, 안트라실 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 방향족 고리 시스템을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아릴"의 범주 내에는 방향족 고리가 하나 이상의 비방향족 고리에 융합된 기, 예컨대 인다닐, 프탈이미딜, 나프트이미딜, 페난트리디닐, 또는 테트라하이드로나프틸 등도 포함된다.
키랄 제어: 본원에서 사용되는 바와 같이, "키랄 제어"는 올리고뉴클레오티드 내의 키랄 뉴클레오티드간 연결에서의 키랄 연결 인의 입체화학적 지정의 제어를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 키랄 뉴클레오티드간 연결은 연결 인이 키랄인 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 제어는 올리고뉴클레오티드의 당 및 염기 모이어티가 부재하는 키랄 요소를 통해 달성되며, 예를 들어, 특정 구현예에서, 제어는 올리고뉴클레오티드 제조 동안의 하나 이상의 키랄 보조체의 사용을 통해 달성되는데, 상기 키랄 보조체는 종종 올리고뉴클레오티드 제조 동안 사용되는 키랄 포스포아미다이트의 일부이다. 키랄 제어와 대조적으로, 당업자는 키랄 보조체를 사용하지 않는 종래의 올리고뉴클레오티드 합성이 키랄 뉴클레오티드간 연결을 형성하는 데 사용되는 경우 이러한 종래의 올리고뉴클레오티드 합성은 키랄 뉴클레오티드간 연결에서 입체화학을 제어할 수 없음을 이해할 것이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 내의 각각의 키랄 뉴클레오티드간 연결에서의 각각의 키랄 연결 인의 입체화학적 지정이 제어된다.
키랄 제어 올리고뉴클레오티드 조성물: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "키랄 제어 올리고뉴클레오티드 조성물", "키랄 제어 핵산 조성물" 등은 공통 염기 서열을 공유하는 복수의 올리고뉴클레오티드(또는 핵산)를 포함하는 조성물을 지칭하며, 여기서, 복수의 올리고뉴클레오티드(또는 핵산)는 하나 이상의 키랄 뉴클레오티드간 연결에서 동일한 연결 인 입체화학(키랄 제어 또는 입체정의 뉴클레오티드간 연결(이의 키랄 연결 인은 조성물에서, 비-키랄 제어 뉴클레오티드간 연결로서의 무작위 Rp 및 Sp 조합이 아닌, Rp 또는 Sp임("입체정의됨")))을 공유한다. 특정 구현예에서, 키랄 제어 올리고뉴클레오티드 조성물은 1) 공통 염기 서열, 2) 공통 백본 연결 패턴, 및 3) 공통 백본 인 변형 패턴을 공유하는 복수의 올리고뉴클레오티드(또는 핵산)을 포함하고, 복수의 올리고뉴클레오티드(또는 핵산)는 하나 이상의 키랄 뉴클레오티드간 연결에서 동일한 연결 인 입체화학(키랄 제어 또는 입체정의 뉴클레오티드간 연결(이의 키랄 연결 인은 조성물에서, 비-키랄 제어 뉴클레오티드간 연결로서의 무작위 Rp 및 Sp 조합이 아닌, Rp 또는 Sp임("입체정의됨")))을 공유한다. 키랄 제어 올리고뉴클레오티드 조성물 중 복수의 올리고뉴클레오티드(또는 핵산)의 수준은 비-키랄 제어 올리고뉴클레오티드 조성물의 무작위 수준과 비교하여, (예를 들어, 하나 이상의 키랄 뉴클레오티드간 연결을 입체선택적으로 형성하기 위해 키랄 제어 올리고뉴클레오티드 제조를 통해) 미리 결정/제어되거나 풍부하다. 특정 구현예에서, 키랄 제어 올리고뉴클레오티드 조성물 내의 모든 올리고뉴클레오티드의 약 1%~100%(예를 들어, 약 5%~100%, 10%~100%, 20%~100%, 30%~100%, 40%~100%, 50%~100%, 60%~100%, 70%~100%, 80~100%, 90~100%, 95~100%, 50%~90%, 또는 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%, 또는 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)는 복수의 올리고뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 공통 염기 서열, 공통 백본 연결 패턴, 및 공통 백본 인 변형 패턴을 공유하는 키랄 제어 올리고뉴클레오티드 조성물 내의 모든 올리고뉴클레오티드의 약 1%~100%(예를 들어, 약 5%~100%, 10%~100%, 20%~100%, 30%~100%, 40%~100%, 50%~100%, 60%~100%, 70%~100%, 80~100%, 90~100%, 95~100%, 50%~90%, 또는 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%, 또는 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)는 복수의 올리고뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 수준은 조성물 내의 모든 올리고뉴클레오티드의, 또는 (예를 들어, 복수의 올리고뉴클레오티드의 또는 올리고뉴클레오티드 유형의) 공통 염기 서열을 공유하는 조성물 내의 모든 올리고뉴클레오티드의, 또는 공통 염기 서열, 공통 백본 연결 패턴, 및 공통 백본 인 변형 패턴을 공유하는 조성물 내의 모든 올리고뉴클레오티드의, 또는 공통 염기 서열, 공통 염기 변형 패턴, 공통 당 변형 패턴, 공통 뉴클레오티드간 연결 유형 패턴, 및/또는 공통 뉴클레오티드간 연결 변형 패턴을 공유하는 조성물 내의 모든 올리고뉴클레오티드의 약 1%~100%(예를 들어, 약 5%~100%, 10%~100%, 20%~100%, 30%~100%, 40%~100%, 50%~100%, 60%~100%, 70%~100%, 80~100%, 90~100%, 95~100%, 50%~90%, 또는 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%, 또는 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)이다. 특정 구현예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 약 1~50개(예를 들어, 약 1~10, 1~20, 5~10, 5~20, 10~15, 10~20, 10~25, 10~30개, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개)의 키랄 뉴클레오티드간 연결에서 동일한 입체화학을 공유한다. 특정 구현예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 약 1%~100%(예를 들어, 약 5%~100%, 10%~100%, 20%~100%, 30%~100%, 40%~100%, 50%~100%, 60%~100%, 70%~100%, 80~100%, 90~100%, 95~100%, 50%~90%, 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%, 또는 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%)의 키랄 뉴클레오티드간 연결에서 동일한 입체화학을 공유한다. 특정 구현예에서, 임의의 경우 복수의 올리고뉴클레오티드(또는 핵산)는 동일한 패턴의 당 및/또는 핵염기 변형을 공유한다. 특정 구현예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드(또는 핵산)는 동일한 올리고뉴클레오티드의 다양한 형태(예를 들어, 동일한 올리고뉴클레오티드의 산 및/또는 다양한 염)이다. 특정 구현예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드(또는 핵산)는 동일한 구성을 갖는다. 특정 구현예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드(또는 핵산)의 수준은 복수의 올리고뉴클레오티드(또는 핵산)와 동일한 구성을 공유하는 조성물 내의 모든 올리고뉴클레오티드(또는 핵산)의 약 1%~100%(예를 들어, 약 5%~100%, 10%~100%, 20%~100%, 30%~100%, 40%~100%, 50%~100%, 60%~100%, 70%~100%, 80~100%, 90~100%, 95~100%, 50%~90%, 또는 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%, 또는 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)이다. 특정 구현예에서, 각각의 키랄 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이고, 조성물은 완전히 키랄 제어 올리고뉴클레오티드 조성물이다. 특정 구현예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드(또는 핵산)는 구조적으로 동일하다. 특정 구현예에서, 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결은 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%, 일반적으로는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%의 부분입체순도를 갖는다. 특정 구현예에서, 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결은 적어도 95%의 부분입체순도를 갖는다. 특정 구현예에서, 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결은 적어도 96%의 부분입체순도를 갖는다. 특정 구현예에서, 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결은 적어도 97%의 부분입체순도를 갖는다. 특정 구현예에서, 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결은 적어도 98%의 부분입체순도를 갖는다. 특정 구현예에서, 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결은 적어도 99%의 부분입체순도를 갖는다. 특정 구현예에서, 수준의 백분율은 (DS)nc 이상이고, DS는 본 발명에 기재된 바와 같은 부분입체순도(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 이상)이고, nc는 본 발명에 기재된 바와 같은 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 수(예를 들어, 1~50, 1~40, 1~30, 1~25, 1~20, 5~50, 5~40, 5~30, 5~25, 5~20, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 이상)이다. 특정 구현예에서, 수준의 백분율은 (DS)nc 이상이고, DS는 95%~100%이다. 예를 들어, DS가 99%이고 nc가 10인 경우, 백분율은 90% 이상이다((99%)10
Figure pct00019
0.90 = 90%). 특정 구현예에서, 조성물 내 복수의 올리고뉴클레오티드의 수준은 올리고뉴클레오티드에 있는 각각의 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 부분입체순도의 곱으로 표시된다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드(또는 핵산)에 있는 2개의 뉴클레오시드를 연결하는 뉴클레오티드간 연결의 부분입체순도는 상기 2개의 뉴클레오시드를 연결하는 이량체의 뉴클레오티드간 연결의 부분입체순도로 표시되고, 이러한 이량체는 비견되는 조건들, 일부 경우에 동일한 합성 사이클 조건들을 사용하여 제조된다(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 …NxNy…에서 Nx와 Ny 사이의 연결의 경우, 이량체는 NxNy임). 특정 구현예에서, 모든 키랄 뉴클레오티드간 연결이 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결은 아니며, 조성물은 부분적으로 키랄 제어 올리고뉴클레오티드 조성물이다. 특정 구현예에서, 비-키랄 제어 뉴클레오티드간 연결은 입체무작위 올리고뉴클레오티드 조성물에서 일반적으로 관찰되는 바와 같이(예를 들어, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 기존의 올리고뉴클레오티드 합성, 예를 들어 포스포아미다이트 방법으로부터), 약 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 미만의, 또는 약 50%의 부분입체순도를 갖는다. 특정 구현예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드(또는 핵산)는 동일 유형의 것이다. 특정 구현예에서, 키랄 제어 올리고뉴클레오티드 조성물은 비무작위 또는 제어된 수준의 개별 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 유형을 포함한다. 예를 들어 특정 구현예에서, 키랄 제어 올리고뉴클레오티드 조성물은 하나 이하의 올리고뉴클레오티드 유형을 포함한다. 특정 구현예에서, 키랄 제어 올리고뉴클레오티드 조성물은 하나 초과의 올리고뉴클레오티드 유형을 포함한다. 특정 구현예에서, 키랄 제어 올리고뉴클레오티드 조성물은 다수의 올리고뉴클레오티드 유형을 포함한다. 특정 구현예에서, 키랄 제어 올리고뉴클레오티드 조성물은 소정 올리고뉴클레오티드 유형의 올리고뉴클레오티드의 조성물이고, 이 조성물은 상기 올리고뉴클레오티드 유형의 비무작위 또는 제어된 수준의 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
비견되는: 본원에서 용어 "비견되는"은 수득된 결과 또는 관찰된 현상의 비교를 가능하게 하기 위하여 서로 충분히 유사한 두 세트(또는 그 이상의 세트)의 조건 또는 상황을 설명하는 데 사용된다. 특정 구현예에서, 비견되는 조건 또는 상황 세트는 복수의 실질적으로 동일한 특징 및 하나 이하의 다양한 특징을 특징으로 한다. 당업자는, 상이한 조건 또는 상황 세트 하에서 수득된 결과 또는 관찰된 현상의 차이가 다양한 특징의 변동에 의해 야기되거나 상기 변동을 나타낸다는 합리적인 결론을 보증하기에 충분한 수 및 유형의 실질적으로 동일한 특징을 특징으로 하는 경우 조건들의 세트들이 서로에 비슷한 것임을 이해할 것이다.
지환족: 용어 "지환족", "탄소환", "카보시클릴", "탄소환 라디칼", 및 "탄소환 고리"는 상호교환가능하게 사용되며, 본원에서 사용되는 바와 같이 포화 또는 부분 불포화, 비방향족, 환형 지방족 단환, 이환, 또는 다환 고리 시스템(본원에 기재된 바와 같으며, 달리 특정되지 않는 한, 3~30개의 고리 구성원을 가짐)을 지칭한다. 지환족 기는 제한 없이, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로펜테닐, 시클로헥실, 시클로헥세닐, 시클로헵틸, 시클로헵테닐, 시클로옥틸, 시클로옥테닐, 노르보르닐, 아다만틸, 및 시클로옥타디에닐을 포함한다. 특정 구현예에서, 지환족 기는 3~6개의 탄소를 갖는다. 특정 구현예에서, 지환족 기는 포화되며 시클로알킬이다. 또한 용어 "지환족"은 데카하이드로나프틸 또는 테트라하이드로나프틸과 같은 하나 이상의 방향족 또는 비방향족 고리에 융합된 지방족 고리를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 지환족 기는 이환이다. 특정 구현예에서, 지환족 기는 삼환이다. 특정 구현예에서, 지환족 기는 다환이다. 특정 구현예에서, "지환족"은 C3-C6 단환 탄화수소, 또는 완전 포화되거나 하나 이상의 불포화 단위를 포함하지만 방향족이 아니고, 분자의 나머지에 대한 단일 부착점을 갖는 C8-C10 이환 또는 다환 탄화수소, 또는 완전 포화되거나 하나 이상의 불포화 단위를 포함하지만 방향족이 아니고, 분자의 나머지에 대한 단일 부착점을 갖는 C9-C16 다환 탄화수소를 지칭한다.
헤테로지방족: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "헤테로지방족"은 당업계에서의 이의 통상적인 의미가 주어지며, 하나 이상의 탄소 원자가 독립적으로 하나 이상의 헤테로원자(예를 들어, 산소, 질소, 황, 규소, 인 등)로 대체된 본원에 기재된 바와 같은 지방족 기를 지칭한다. 특정 구현예에서, C, CH, CH2, 및 CH3으로부터 선택되는 하나 이상의 단위는 독립적으로 하나 이상의 헤테로원자(이의 산화된 형태 및/또는 치환된 형태를 포함함)로 대체된다. 특정 구현예에서, 헤테로지방족 기는 헤테로알킬이다. 특정 구현예에서, 헤테로지방족 기는 헤테로알케닐이다.
헤테로알킬: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "헤테로알킬"은 당업계에서의 이의 통상적인 의미가 주어지며, 하나 이상의 탄소 원자가 독립적으로 하나 이상의 헤테로원자(예를 들어, 산소, 질소, 황, 규소, 인 등)로 대체된 본원에 기재된 바와 같은 알킬 기를 지칭한다. 헤테로알킬 기의 예는 알콕시, 폴리(에틸렌 글리콜)-, 알킬-치환 아미노, 테트라하이드로푸라닐, 피페리디닐, 모르폴리닐 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
헤테로아릴: 본원에서 사용되는 바와 같이, 단독으로 또는 더 큰 모이어티의 일부로서(예를 들어, "헤테로아르알킬" 또는 "헤테로아르알콕시") 사용되는 "헤테로아릴" 및 "헤테로아르-"라는 용어는 총 5~30개의 고리 구성원을 갖는 단환, 이환, 또는 다환 고리 시스템을 지칭하며, 여기서, 상기 시스템에서의 적어도 하나의 고리는 방향족이고, 적어도 하나의 방향족 고리 원자는 헤테로원자이다. 특정 구현예에서, 헤테로아릴 기는 5~10개의 고리 원자(즉, 단환, 이환, 또는 다환), 특정 구현예에서 5, 6, 9, 또는 10개의 고리 원자를 갖는 기이다. 특정 구현예에서, 각각의 단환 고리 단위는 방향족이다. 특정 구현예에서, 헤테로아릴 기는 환형 어레이에서 공유되는 6, 10 또는 14개의 π 전자를 가지며; 탄소 원자 외에 1~5개의 헤테로원자를 갖는다. 헤테로아릴 기는 제한 없이 티에닐, 푸라닐, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 옥사디아졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 티아디아졸릴, 피리딜, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 인돌리지닐, 퓨리닐, 나프티리디닐, 및 프테리디닐을 포함한다. 특정 구현예에서, 헤테로아릴은 헤테로바이아릴 기, 예컨대 바이피리딜 등이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "헤테로아릴" 및 "헤테로아르-"는 또한 헤테로방향족 고리가 하나 이상의 아릴, 지환족, 또는 헤테로시클릴 고리에 융합된 기를 포함하며, 여기서, 라디칼 또는 부착점은 헤테로방향족 고리 상에 있다. 비제한적 예는 인돌릴, 이소인돌릴, 벤조티에닐, 벤조푸라닐, 디벤조푸라닐, 인다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤즈티아졸릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 신놀리닐, 프탈라지닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 4H-퀴놀리지닐, 카바졸릴, 아크리디닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 페녹사지닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 및 피리도[2,3-b]-1,4-옥사진-3(4H)-온을 포함한다. 헤테로아릴 기는 단환, 이환, 또는 다환일 수 있다. 용어 "헤테로아릴"은 용어 "헤테로아릴 고리", "헤테로아릴 기", 또는 "헤테로방향족"과 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 상기 용어 중 임의의 것은 임의로 치환된 고리를 포함한다. 용어 "헤테로아르알킬"은 헤테로아릴 기로 치환된 알킬 기를 지칭하며, 여기서, 알킬 및 헤테로아릴 부분은 독립적으로 임의로 치환된다.
헤테로원자: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "헤테로원자"는 탄소 또는 수소가 아닌 원자를 의미한다. 특정 구현예에서, 헤테로원자는 붕소, 산소, 황, 질소, 인 또는 규소(산화된 형태의 질소, 황, 인 또는 규소; 하전된 형태의 질소(예를 들어, 4차화된 형태, 이미늄 기에서와 같은 형태 등), 인, 황, 산소 등을 포함함)이다. 특정 구현예에서, 헤테로원자는 규소, 인, 산소, 황 또는 질소이다. 특정 구현예에서, 헤테로원자는 규소, 산소, 황 또는 질소이다. 특정 구현예에서, 헤테로원자는 산소, 황 또는 질소이다.
복소환: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "복소환", "헤테로시클릴", "복소환 라디칼" 및 "복소환 고리"(본원에서 사용되는 바와 같음)는 상호교환가능하게 사용되며, 포화 또는 부분 불포화되고 하나 이상의 헤테로원자 고리 원자를 갖는 단환, 이환, 또는 다환 고리 모이어티(예를 들어, 3~30원)를 지칭한다. 특정 구현예에서, 헤테로시클릴 기는, 상기에 정의된 바와 같이, 포화 또는 부분 불포화되고, 탄소 원자에 더하여 하나 이상의, 바람직하게는 1 내지 4개의 헤테로원자를 갖는 안정한 5 내지 7원 단환 또는 7 내지 10원 이환 복소환 모이어티이다. 복소환의 고리 원자와 관련하여 사용되는 경우, 용어 "질소"는 치환된 질소를 포함한다. 일례로서, 산소, 황 및 질소로부터 선택되는 0~-3개의 헤테로원자를 갖는 포화 또는 부분 불포화 고리에서, 질소는 N(3,4-디하이드로-2H-피롤릴에서와 같이), NH(피롤리디닐에서와 같이), 또는 +NR(N-치환 피롤리디닐에서와 같이)일 수 있다. 복소환 고리는 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자에서 이의 펜던트 기에 부착될 수 있으며(이는 안정한 구조를 초래함) 임의의 고리 원자는 임의로 치환될 수 있다. 이러한 포화 또는 부분 불포화 복소환 라디칼의 예는 제한 없이 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로티에닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피롤리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 데카하이드로퀴놀리닐, 옥사졸리디닐, 피페라지닐, 디옥사닐, 디옥솔라닐, 디아제피닐, 옥사제피닐, 티아제피닐, 모르폴리닐, 및 퀴누클리디닐을 포함한다. 용어 "복소환", "헤테로시클릴", "헤테로시클릴 고리", "복소환 기", "복소환 모이어티" 및 "복소환 라디칼"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 또한 헤테로시클릴 고리가 하나 이상의 아릴, 헤테로아릴, 또는 지환족 고리에 융합된 기, 예컨대 인돌리닐, 3H-인돌릴, 크로마닐, 페난트리디닐, 또는 테트라하이드로퀴놀리닐을 포함한다. 헤테로시클릴 기는 단환, 이환, 또는 다환일 수 있다. 용어 "헤테로시클릴알킬"은 헤테로시클릴로 치환된 알킬 기를 지칭하며, 여기서, 알킬 및 헤테로시클릴 부분은 독립적으로 임의로 치환된다.
동일성: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "동일성"은 중합체 분자 사이, 예를 들어 핵산 분자(예를 들어, 올리고뉴클레오티드, DNA, RNA 등) 사이 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 특정 구현예에서, 중합체 분자는 이들의 서열이 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 경우 서로 "실질적으로 동일"한 것으로 간주된다. 예를 들어, 2개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 동일성 퍼센트의 계산은 최적의 비교의 목적을 위해 상기 2개의 서열을 정렬함으로써 수행될 수 있다(예를 들어, 갭이 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 서열 중 하나 또는 이들 둘 다에 도입될 수 있으며, 동일하지 않은 서열들은 비교 목적에 대해 무시될 수 있다). 특정 구현예에서, 비교 목적으로 정렬되는 서열의 길이는 기준 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 실질적으로 100%이다. 그 후, 상응하는 위치들의 뉴클레오티드들이 비교된다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 잔기(예를 들어, 뉴클레오티드 또는 아미노산)에 의해 점유된다면, 분자들은 그 위치에서 동일하다. 두 서열 사이의 퍼센트 동일성은 상기 서열들이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수로서, 이는 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 각각의 갭의 길이 및 갭의 수를 고려한다. 서열 비교 및 두 서열 사이의 동일성 퍼센트의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 성취될 수 있다. 예를 들어, 두 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 퍼센트는 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 Meyers와 Miller의 알고리즘(문헌[CABIOS, 1989, 4: 11-17])을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 예시적인 구현예에서, ALIGN 프로그램으로 이루어진 핵산 서열 비교는 PAM120 가중 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용한다. 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 퍼센트는 대안적으로 NWSgapdna.CMP 매트릭스를 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다.
뉴클레오티드간 연결: 본원에서 사용되는 바와 같이, 어구 "뉴클레오티드간 연결"은 일반적으로, 올리고뉴클레오티드 또는 핵산의 뉴클레오시드 단위들을 연결시키는 연결을 지칭한다. 특정 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 포스포디에스테르 연결이며, 이는 천연 발생 DNA 및 RNA 분자에서 광범위하게 발견되는 바와 같다(당업자에 의해 이해되는 바와 같이 염 형태로 존재할 수 있는 천연 포스페이트 연결 (-OP(=O)(OH)O-)). 특정 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 변형 뉴클레오티드간 연결(천연 포스페이트 연결이 아님)이다. 특정 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 포스포디에스테르 연결의 적어도 하나의 산소 원자 또는 -OH가 상이한 유기 또는 무기 모이어티로 대체된 "변형 뉴클레오티드간 연결"이다. 특정 구현예에서, 이러한 유기 또는 무기 모이어티는 =S, =Se, =NR', -SR', -SeR', -N(R')2, B(R')3, -S-, -Se-, 및 -N(R')-로부터 선택되며, 여기서, 각각의 R'은 독립적으로 본 발명에 정의되고 기술된 바와 같다. 특정 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 포스포트리에스테르 연결, 포스포로티오에이트 연결(또는 포스포로티오에이트 디에스테르 연결, -OP(=O)(SH)O-(이는 당업자에 의해 인식되는 바와 같이 염 형태로 존재할 수 있음), 또는 포스포로티오에이트 트리에스테르 결합이다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 특정 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 예를 들어 PNA(펩티드 핵산) 또는 PMO(포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머) 연결 중 하나이다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 중성 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, 제공된 특정 올리고뉴클레오티드들에서의 n001)이다. 당업자는 뉴클레오티드간 연결이 연결에서의 산 또는 염기 모이어티의 존재로 인해 주어진 pH에서 음이온 또는 양이온으로 존재할 수 있음을 이해한다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 WO 2017/210647에 기재된 바와 같이 s, s1, s2, s3, s4, s5, s6, s7, s8, s9, s10, s11, s12, s13, s14, s15, s16, s17 및 s18로 표기되는 변형 뉴클레오티드간 연결이다.
시험관 내에서: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "시험관 내에서"는 유기체(예를 들어, 동물, 식물 및/또는 미생물) 내에서라기보다는 인공 환경에서, 예를 들어, 시험관 또는 반응 용기, 세포 배양 등에서 일어나는 사건을,
생체 내에서: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생체 내에서"는 유기체(예를 들어, 동물, 식물 및/또는 미생물) 내에서 일어나는 사건을 지칭한다.
연결 인: 본원에 정의된 바와 같이, 어구 "연결 인"은 언급된 특정 인 원자가 뉴클레오티드간 연결에 존재하는 인 원자임을 나타내는 데 사용되며, 상기 인 원자는 천연 발생 DNA 및 RNA에서 나타나는 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 연결의 인 원자에 상응한다. 특정 구현예에서, 연결 인 원자는 변형 뉴클레오티드간 연결에 존재하며, 여기서, 포스포디에스테르 연결의 각각의 산소 원자는 임의로, 그리고 독립적으로 유기 또는 무기 모이어티로 대체된다. 특정 구현예에서, 연결 인 원자는 키랄이다(예를 들어, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결에서와 같이). 특정 구현예에서, 연결 인 원자는 아키랄 원자이다(예를 들어, 천연 포스페이트 연결에서와 같이).
변형 핵염기: 용어 "변형 핵염기", "변형 염기" 등은 핵염기와 화학적으로 구별되지만 핵염기의 하나 이상의 기능을 수행할 수 있는 화학적 모이어티를 지칭한다. 특정 구현예에서, 변형 핵염기는 변형을 포함하는 핵염기이다. 특정 구현예에서, 변형 핵염기는 핵염기의 하나 이상의 기능이 가능하며, 예를 들어, 적어도 상보성 염기 서열을 포함하는 핵산에 대하여 염기쌍을 형성할 수 있는 중합체에서의 모이어티를 형성할 수 있다. 특정 구현예에서, 변형 핵염기는 치환된 A, T, C, G, 또는 U, 또는 A, T, C, G, 또는 U의 치환된 호변이성체이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 맥락에서 변형 핵염기는 A, T, C, G 또는 U가 아닌 핵염기를 지칭한다.
변형 뉴클레오시드: 용어 "변형 뉴클레오시드"는 천연 뉴클레오시드로부터 유도되거나 천연 뉴클레오시드와 화학적으로 유사하지만, 천연 뉴클레오시드와 구별되는 화학적 변형을 포함하는 모이어티를 지칭한다. 변형 뉴클레오시드의 비제한적인 예는 염기 및/또는 당에서의 변형을 포함하는 것을 포함한다. 변형 뉴클레오시드의 비제한적인 예는 당에서의 2' 변형을 갖는 것을 포함한다. 변형 뉴클레오시드의 비제한적인 예는 또한 (핵염기가 결여된) 무염기 뉴클레오시드를 포함한다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오시드는 뉴클레오시드의 적어도 하나의 기능을 할 수 있으며, 예를 들어 적어도 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산에 대해 염기쌍을 형성할 수 있는 중합체에서 모이어티를 형성할 수 있다.
변형 뉴클레오티드: 용어 "변형 뉴클레오티드"는 천연 뉴클레오티드와 구조적으로 다르지만 천연 뉴클레오티드의 적어도 하나의 기능을 수행할 수 있는 임의의 화학적 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드는 당, 염기, 및/또는 뉴클레오티드간 연결에서의 변형을 포함한다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드는 변형 당, 변형 핵염기, 및/또는 변형 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 적어도 하나의 기능을 할 수 있으며, 예를 들어 적어도 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산에 대해 염기쌍을 형성할 수 있는 중합체에서 서브유닛을 형성할 수 있다.
변형 당: 용어 "변형 당"은 당을 대체할 수 있는 모이어티를 지칭한다. 변형 당은 당의 공간적 배열, 전자적 특성 또는 몇몇의 다른 물리화학적 특성을 모방한다. 특정 구현예에서, 본 발명에 기재된 바와 같이, 변형 당은 치환된 리보스 또는 데옥시리보스이다. 특정 구현예에서, 변형 당은 2'-변형을 포함한다. 유용한 2'-변형의 예는 당업계에서 널리 활용되고 본원에 설명되어 있다. 특정 구현예에서, 2'-변형은 2'-F이다. 특정 구현예에서, 2'-변형은 2'-OR이고, R은 임의로 치환된 C1-10 지방족이다. 특정 구현예에서, 2'-변형은 2'-OMe이다. 특정 구현예에서, 2'-변형은 2'-MOE이다. 특정 구현예에서, 변형 당은 이환 당(예를 들어, LNA, BNA 등에 사용되는 당)이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드와 관련하여, 변형 당은 천연 RNA 또는 DNA에서 일반적으로 발견되는 리보스 또는 데옥시리보스가 아닌 당이다.
핵산: 본원에서 사용되는 용어 "핵산"은 임의의 뉴클레오티드 및 이의 중합체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 임의의 길이의 리보뉴클레오티드(RNA) 또는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 이들의 조합의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 이러한 용어들은 분자의 일차 구조를 지칭하고, 따라서 이중 및 단일 가닥의 DNA, 및 이중 및 단일 가닥의 RNA를 포함한다. 이들 용어는 등가물로서 메틸화, 보호 및/또는 캡핑된 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 변형 뉴클레오티드 및/또는 변형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 RNA 또는 DNA의 유사체를 포함한다. 상기 용어는 폴리- 또는 올리고-리보뉴클레오티드(RNA) 및 폴리- 또는 올리고-데옥시리보뉴클레오티드(DNA); 핵염기 및/또는 변형 핵염기의 N-글리코시드 또는 C-글리코시드로부터 유도된 RNA 또는 DNA; 당 및/또는 변형 당으로부터 유도된 핵산; 및 포스페이트 가교 및/또는 변형 뉴클레오티드간 연결로부터 유도된 핵산을 포함한다. 상기 용어는 핵염기, 변형 핵염기, 당, 변형 당, 포스페이트 가교 또는 변형 뉴클레오티드간 연결의 임의의 조합을 함유하는 핵산을 포함한다. 예는 리보스 모이어티를 함유하는 핵산, 데옥시-리보스 모이어티를 함유하는 핵산, 리보스 및 데옥시리보스 모이어티 둘 다를 함유하는 핵산, 리보스 및 변형 리보스 모이어티를 함유하는 핵산을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 달리 명시되지 않는 한, 접두어 폴리-는 2 내지 약 10,000개의 뉴클레오티드 단량체 단위를 함유하는 핵산을 지칭하고, 접두어 올리고-는 2 내지 약 200개의 뉴클레오티드 단량체 단위를 함유하는 핵산을 지칭한다.
핵염기: 용어 "핵염기"는 서열 특이적 방식으로 하나의 핵산 가닥을 또 다른 상보성 가닥에 결합시키는 수소 결합에 관여하는 핵산 부분을 지칭한다. 가장 일반적인 천연 발생 핵염기는 아데닌(A), 구아닌(G), 우라실(U), 시토신(C), 및 티민(T)이다. 특정 구현예에서, 천연 발생 핵염기는 변형 아데닌, 구아닌, 우라실, 시토신, 또는 티민이다. 특정 구현예에서, 천연 발생 핵염기는 메틸화 아데닌, 구아닌, 우라실, 시토신, 또는 티민이다. 특정 구현예에서, 핵염기는 고리 원자가 질소인 헤테로아릴 고리를 포함하고, 뉴클레오시드에 있을 때 질소는 당 모이어티에 결합된다. 특정 구현예에서, 핵염기는 고리 원자가 질소인 복소환 고리를 포함하고, 뉴클레오시드에 있을 때 질소는 당 모이어티에 결합된다. 특정 구현예에서, 핵염기는 아데닌(A), 구아닌(G), 우라실(U), 시토신(C), 및 티민 (T) 이외의 핵염기인 "변형 핵염기"이다. 특정 구현예에서, 변형 핵염기는 치환된 A, T, C, G 또는 U이다. 특정 구현예에서, 변형 핵염기는 A, T, C, G, 또는 U의 치환된 호변이성체이다. 특정 구현예에서, 변형 핵염기는 메틸화 아데닌, 구아닌, 우라실, 시토신 또는 티민이다. 특정 구현예에서, 변형 핵염기는 핵염기의 공간적 배열, 전자적 특성 또는 몇몇의 다른 물리화학적 특성을 모방하며, 서열 특이적 방식으로 하나의 핵산 가닥을 또 다른 것에 결합시키는 수소 결합의 특성을 보유한다. 특정 구현예에서, 변형 핵염기는 용융 거동, 세포내 효소에 의한 인식 또는 올리고뉴클레오티드 듀플렉스의 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 모든 5가지 천연 발생 염기(우라실, 티민, 아데닌, 시토신 또는 구아닌)와 쌍을 형성할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵염기"는 또한 변형 핵염기 및 핵염기 유사체와 같은, 천연 또는 천연 발생 뉴클레오티드 대신에 사용되는 구조적 유사체를 포함한다. 특정 구현예에서, 핵염기는 임의로 치환된 A, T, C, G, 또는 U, 또는 A, T, C, G 또는 U의 임의로 치환된 호변이성체이다. 특정 구현예에서, "핵염기"는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산에서의 핵염기 단위를 지칭한다(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 핵산에서와 같이 A, T, C, G 또는 U).
뉴클레오시드: 용어 "뉴클레오시드"는 핵염기 또는 변형 핵염기가 당 또는 변형 당에 공유 결합된 모이어티를 지칭한다. 특정 구현예에서, 뉴클레오시드는 천연 뉴클레오시드, 예를 들어, 아데노신, 데옥시아데노신, 구아노신, 데옥시구아노신, 티미딘, 우리딘, 시티딘, 또는 데옥시시티딘이다. 특정 구현예에서, 뉴클레오시드는 변형 뉴클레오시드, 예를 들어, 치환된 천연 뉴클레오시드(아데노신, 데옥시아데노신, 구아노신, 데옥시구아노신, 티미딘, 우리딘, 시티딘 및 데옥시시티딘으로부터 선택됨)이다. 특정 구현예에서, 뉴클레오시드는 변형 뉴클레오시드, 예를 들어, 아데노신, 데옥시아데노신, 구아노신, 데옥시구아노신, 티미딘, 우리딘, 시티딘, 및 데옥시시티딘으로부터 선택되는 천연 뉴클레오시드의 치환된 호변이성체이다. 특정 구현예에서, "뉴클레오시드"는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산에서의 뉴클레오시드 단위를 지칭한다.
뉴클레오티드: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "뉴클레오티드"는 핵염기, 당 및 하나 이상의 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, 천연 DNA 및 RNA에서의 포스페이트 연결)로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 단량체 단위를 지칭한다. 천연 발생 염기[구아닌(G), 아데닌(A), 시토신(C), 티민(T), 및 우라실(U)]는 퓨린 또는 피리미딘의 유도체이지만, 천연 발생 및 천연 비-발생 염기 유사체도 포함됨이 이해되어야 한다. 천연 발생 당은 펜토스(오탄당) 데옥시리보스(이는 DNA를 형성함) 또는 리보스(이는 RNA를 형성함)이지만, 천연 발생 및 천연 비-발생 당 유사체도 포함됨이 이해되어야 한다. 뉴클레오티드는 뉴클레오티드간 연결을 통해 연결되어 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 형성한다. (포스페이트, 포스포로티오에이트, 보라노포스페이트 등과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는) 많은 뉴클레오티드간 연결이 당업계에 공지되어 있다. 인공 핵산은 PNA(펩티드 핵산), 포스포트리에스테르, 포스포로티오네이트, H-포스포네이트, 포스포아미데이트, 보라노포스페이트, 메틸포스포네이트, 포스포노아세테이트, 티오포스포노아세테이트 및 천연 핵산의 포스페이트 백본의 다른 변이체, 예컨대 본원에 기재된 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 천연 뉴클레오티드는 천연 발생 염기, 당 및 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "뉴클레오티드"는 또한 변형 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은, 천연 또는 천연 발생 뉴클레오티드 대신에 사용되는 구조적 유사체를 포함한다. 특정 구현예에서, "뉴클레오티드"는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산에서의 뉴클레오티드 단위를 지칭한다.
올리고뉴클레오티드: 용어 "올리고뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체 또는 올리고머를 지칭하며, 천연 및 비-천연 핵염기, 당, 및 뉴클레오티드간 연결의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 영역(단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 두 부분에 의해 형성됨)을 가질 수 있고, 2개의 올리고뉴클레오티드 사슬을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 상기 두 올리고뉴클레오티드 사슬이 서로 상보성이 아닌 영역에서 단일 가닥 영역을 가질 수 있다. 예시적인 올리고뉴클레오티드는 구조적 유전자, 제어 및 종결 영역을 포함하는 유전자, 바이러스 또는 플라스미드 DNA와 같은 자가 복제 시스템, 단일 가닥 및 이중 가닥 RNAi 에이전트 및 기타 RNA 간섭 시약(RNAi 에이전트 또는 iRNA 에이전트), shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 마이크로RNA, 마이크로RNA 모방체, 수퍼미르(supermir), 압타머(aptamer), 안티미르(antimir), 안타고미르(antagomir), Ul 어댑터(adaptor), 트리플렉스-형성 올리고뉴클레오티드, G-쿼드루플렉스 올리고뉴클레오티드, RNA 활성자, 면역자극 올리고뉴클레오티드 및 데코이(decoy) 올리고뉴클레오티드를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 다양한 길이를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 약 2 내지 약 200개 뉴클레오시드 범위의 길이일 수 있다. 다양한 관련 구현예에서, 단일 가닥, 이중 가닥, 또는 삼중 가닥 올리고뉴클레오티드는 약 4 내지 약 10개 뉴클레오시드, 약 10 내지 약 50개 뉴클레오시드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오시드, 약 15 내지 약 30개 뉴클레오시드, 또는 약 20 내지 약 30개 뉴클레오시드 범위의 길이일 수 있다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 약 9 내지 약 39개 뉴클레오시드의 길이이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 뉴클레오시드의 길이이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 4개 뉴클레오시드의 길이이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 5개 뉴클레오시드의 길이이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 6개 뉴클레오시드의 길이이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 7개 뉴클레오시드의 길이이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 8개 뉴클레오시드의 길이이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 9개 뉴클레오시드의 길이이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 10개 뉴클레오시드의 길이이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 11개 뉴클레오시드의 길이이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 12개 뉴클레오시드의 길이이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 15개 뉴클레오시드의 길이이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 15개 뉴클레오시드의 길이이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 16개 뉴클레오시드의 길이이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 17개 뉴클레오시드의 길이이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 18개 뉴클레오시드의 길이이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 19개 뉴클레오시드의 길이이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 20개 뉴클레오시드의 길이이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 25개 뉴클레오시드의 길이이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 30개 뉴클레오시드의 길이이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 길이로 계수된 각각의 뉴클레오시드는 독립적으로 적어도 하나의 질소 고리 원자를 갖는 고리를 포함하는 핵염기를 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 길이에서 카운팅되는 각각의 뉴클레오시드는 독립적으로 A, T, C, G, 또는 U, 또는 임의로 치환된 A, T, C, G 또는 U, 또는 A, T, C, G 또는 U의 임의로 치환된 호변이성체를 포함한다.
올리고뉴클레오티드 유형: 본원에서 사용되는 바와 같이, 어구 "올리고뉴클레오티드 유형"은 특정 염기 서열, 백본 연결 패턴(즉, 뉴클레오티드간 연결 유형, 예를 들어 포스페이트, 포스포로티오에이트, 포스포로티오에이트 트리에스테르 등의 패턴), 백본 키랄 중심의 패턴(즉, 연결 인 입체화학의 패턴(Rp/Sp)), 및 백본 인 변형의 패턴을 갖는 올리고뉴클레오티드를 정의하는 데 사용된다. 특정 구현예에서, 공통 표기 "유형"의 올리고뉴클레오티드는 서로 구조적으로 동일하다.
당업자는 본 발명의 합성 방법이 올리고뉴클레오티드 가닥의 합성 동안 어느 정도의 제어를 제공하여 올리고뉴클레오티드 가닥의 각각의 뉴클레오티드 단위가 연결 인에서의 특정 입체화학 및/또는 연결 인에서의 특정 변형 및/또는 특정 염기 및/또는 특정 당을 갖도록 미리 설계되고/되거나 선택될 수 있음을 이해할 것이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 가닥은 연결 인에서 입체중심들의 특정 조합을 갖도록 미리 설계되고/되거나 선택된다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 가닥은 연결 인에서 변형들의 특정 조합을 갖도록 설계되고/되거나 결정된다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 가닥은 염기들의 특정 조합을 갖도록 설계되고/되거나 선택된다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 가닥은 상기 구조적 특징들 중 하나 이상의 특정 조합을 갖도록 설계되고/되거나 선택된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 복수의 올리고뉴클레오티드 분자를 포함하거나 이로 이루어진 조성물(예를 들어, 키랄 제어 올리고뉴클레오티드 조성물)을 제공한다. 특정 구현예에서, 이러한 모든 분자는 동일한 유형의 것이다(즉, 서로 구조적으로 동일하다). 그러나 특정 구현예에서, 제공된 조성물은 상이한 유형의 복수의 올리고뉴클레오티드를 전형적으로 소정의 상대적인 양으로 포함한다.
임의로 치환된: 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 화합물, 예를 들어 올리고뉴클레오티드는 임의로 치환된 모이어티 및/또는 치환된 모이어티를 포함할 수 있다. 일반적으로, "임의로"라는 용어가 선행하든지 아니든지 간에, "치환된"이라는 용어는 표기된 모이어티의 하나 이상의 수소가 적합한 치환기로 대체됨을 의미한다. 달리 지시되지 않는 한, "임의로 치환된" 기는 기의 각각의 치환가능한 위치에 적합한 치환기를 가질 수 있고, 임의의 주어진 구조에서 하나 초과의 위치가 특정 기로부터 선택된 하나 초과의 치환기로 치환될 수 있는 경우, 치환기는 모든 위치에서 동일하거나 상이할 수 있다. 특정 구현예에서, 임의로 치환된 기는 비치환이다. 본 발명에 의해 구상되는 치환기들의 조합은 바람직하게는 안정하거나 화학적으로 실현가능한(chemically feasible) 화합물을 생성하는 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "안정한"은 화합물의 생성, 검출, 및 특정 구현예에서, 화합물의 회수, 정제, 및 본원에 개시된 목적 중 하나 이상을 위한 용도를 가능하게 하기 위한 조건을 가할 경우 실질적으로 변경되지 않는 화합물을 지칭한다. 특정 치환기는 아래에 기재되어 있다.
치환가능한 원자, 예를 들어 적합한 탄소 원자 상의 적합한 1가 치환기는 독립적으로 할로겐; -(CH2)0- 4R°; -(CH2)0- 4OR°; -O(CH2)0- 4R°, -O-(CH2)0- 4C(O)OR°; -(CH2)0-4CH(OR°)2; R°로 치환될 수 있는 -(CH2)0- 4Ph; R°로 치환될 수 있는 -(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph; R°로 치환될 수 있는 -CH=CHPh; R°로 치환될 수 있는 -(CH2)0-4O(CH2)0-1-피리딜; -NO2; -CN; -N3; -(CH2)0- 4N(R°)2; -(CH2)0- 4N(R°)C(O)R°; -N(R°)C(S)R°; -(CH2)0- 4N(R°)C(O)NR°2; -N(R°)C(S)NR°2; -(CH2)0- 4N(R°)C(O)OR°; -N(R°)N(R°)C(O)R°; -N(R°)N(R°)C(O)NR°2; -N(R°)N(R°)C(O)OR°; -(CH2)0-4C(O)R°; -C(S)R°; -(CH2)0- 4C(O)OR°; -(CH2)0- 4C(O)SR°; -(CH2)0- 4C(O)OSiR°3; -(CH2)0-4OC(O)R°; -OC(O)(CH2)0- 4SR°, -SC(S)SR°; -(CH2)0- 4SC(O)R°; -(CH2)0-4C(O)NR°2; -C(S)NR°2; -C(S)SR°; -(CH2)0- 4OC(O)NR°2; -C(O)N(OR°)R°; -C(O)C(O)R°; -C(O)CH2C(O)R°; -C(NOR°)R°; -(CH2)0- 4SSR°; -(CH2)0- 4S(O)2R°; -(CH2)0-4S(O)2OR°; -(CH2)0- 4OS(O)2R°; -S(O)2NR°2; -(CH2)0- 4S(O)R°; -N(R°)S(O)2NR°2; -N(R°)S(O)2R°; -N(OR°)R°; -C(NH)NR°2; -Si(R°)3; -OSi(R°)3; -B(R°)2; -OB(R°)2; -OB(OR°)2; -P(R°)2; -P(OR°)2; -P(R°)(OR°); -OP(R°)2; -OP(OR°)2; -OP(R°)(OR°); -P(O)(R°)2; -P(O)(OR°)2; -OP(O)(R°)2; -OP(O)(OR°)2; -OP(O)(OR°)(SR°); -SP(O)(R°)2; -SP(O)(OR°)2; -N(R°)P(O)(R°)2; -N(R°)P(O)(OR°)2; -P(R°)2[B(R°)3]; -P(OR°)2[B(R°)3]; -OP(R°)2[B(R°)3]; -OP(OR°)2[B(R°)3]; -(C1-4 직쇄 또는 분지형 알킬렌)O-N(R°)2; 또는 -(C1-4 직쇄 또는 분지형 알킬렌)C(O)O-N(R°)2이고, 각각의 R°ㅇ는 본원에 정의된 바와 같이 치환될 수 있고, 독립적으로 수소, C1-20 지방족, 질소, 산소, 황, 규소, 및 인으로부터 독립적으로 선택되는 1~5개의 헤테로원자를 갖는 C1-20 헤테로지방족, -CH2-(C6-14 아릴), -O(CH2)0-1(C6-14 아릴), -CH2-(5~14원 헤테로아릴 고리), 5~20원, 단환, 이환, 또는 다환, 포화, 부분 불포화 또는 아릴 고리(질소, 산소, 황, 규소, 및 인으로부터 독립적으로 선택되는 0~5개의 헤테로원자를 가짐)이거나, 또는 상기 정의에도 불구하고, 2개의 독립적으로 존재하는 R°은 이들의 사이에 개재된 원자(들)와 함께 5~20원, 단환, 이환, 또는 다환, 포화, 부분 불포화 또는 아릴 고리(질소, 산소, 황, 규소, 및 인으로부터 독립적으로 선택되는 0~5개의 헤테로원자를 가짐)를 형성하고, 이는 하기에 정의된 바와 같이 치환될 수 있다.
R°(또는 2개의 독립적으로 존재하는 R°이 이들의 사이에 개재된 원자와 함께 형성하는 고리) 상의 적합한 1가 치환기는 독립적으로 할로겐, -(CH2)0-2Rㆍ, -(할로Rㆍ), -(CH2)0- 2OH, -(CH2)0- 2ORㆍ, -(CH2)0- 2CH(ORㆍ)2; -O(할로Rㆍ), -CN, -N3, -(CH2)0-2C(O)Rㆍ, -(CH2)0- 2C(O)OH, -(CH2)0- 2C(O)ORㆍ, -(CH2)0- 2SRㆍ, -(CH2)0- 2SH, -(CH2)0- 2NH2, -(CH2)0-2NHRㆍ, -(CH2)0- 2NRㆍ 2, -NO2, -SiRㆍ 3, -OSiRㆍ 3, -C(O)SRㆍ , -(C1-4 직쇄 또는 분지형 알킬렌)C(O)ORㆍ, 또는 -SSRㆍ이고, 각각의 Rㆍ은 비치환이거나, 또는 앞에 "할로"가 있는 경우, 하나 이상의 할로겐으로만 치환되고, 독립적으로 C1-4 지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0- 1Ph, 및 5~6원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리(질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0~4개의 헤테로원자를 가짐)로부터 선택된다. R°의 포화 탄소 원자 상의 적합한 2가 치환기는 =O 및 =S를 포함한다.
예를 들어 적합한 탄소 원자 상의 적합한 2가 치환기는 독립적으로 =O, =S, =NNR* 2, =NNHC(O)R*, =NNHC(O)OR*, =NNHS(O)2R*, =NR*, =NOR*, -O(C(R* 2))2-3O-, 또는 -S(C(R* 2))2-3S-이고, 각각 독립적으로 존재하는 R*는 수소, 하기에 정의된 바와 같이 치환될 수 있는 C1-6 지방족, 및 비치환 5~6원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리(질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0~4개의 헤테로원자를 가짐)로부터 선택된다. "임의로 치환된" 기의 인접한 치환가능 탄소에 결합되는 적합한 2가 치환기는 -O(CR* 2)2 -3O-이고, 각각 독립적으로 존재하는 R*는 수소, 하기에 정의된 바와 같이 치환될 수 있는 C1-6 지방족, 및 비치환 5~6원 포화, 부분 불포화, 및 아릴 고리(질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0~4개의 헤테로원자를 가짐)로부터 선택된다.
R*의 지방족 기 상의 적합한 치환기는 독립적으로 할로겐, -Rㆍ, -(할로Rㆍ), -OH, -ORㆍ, -O(할로Rㆍ), -CN, -C(O)OH, -C(O)ORㆍ, -NH2, -NHRㆍ, -NRㆍ 2, 또는 -NO2이고, 각각의 Rㆍ은 비치환이거나, 또는 앞에 "할로"가 있는 경우, 하나 이상의 할로겐으로만 치환되고, 독립적으로 C1-4 지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0- 1Ph, 또는 5~6원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리(질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0~4개의 헤테로원자를 가짐)이다.
특정 구현예에서, 치환가능 질소 상의 적합한 치환기는 독립적으로 -R†, -NR† 2, -C(O)R†, -C(O)OR†, -C(O)C(O)R†, -C(O)CH2C(O)R†, -S(O)2R†, -S(O)2NR† 2, -C(S)NR† 2, -C(NH)NR† 2, 또는 -N(R†)S(O)2R†이고, 각각의 R†는 독립적으로 수소, 하기에 정의된 바와 같이 치환될 수 있는 C1-6 지방족, 비치환 -OPh, 또는 비치환 5~6원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리(질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0~4개의 헤테로원자를 가짐)이거나, 또는 상기 정의에도 불구하고, 2개의 독립적으로 존재하는 R†는 이들의 사이에 개재된 원자(들)와 함께, 비치환 3~12원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 단환 또는 이환 고리(질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0~4개의 헤테로원자를 가짐)를 형성한다.
R†의 지방족 기 상의 적합한 치환기는 독립적으로 할로겐, -Rㆍ, -(할로Rㆍ), -OH, -ORㆍ, -O(할로Rㆍ), -CN, -C(O)OH, -C(O)ORㆍ, -NH2, -NHRㆍ, -NRㆍ 2, 또는 -NO2이고, 각각의 Rㆍ은 비치환이거나, 또는 앞에 "할로"가 있는 경우, 하나 이상의 할로겐으로만 치환되고, 독립적으로 C1-4 지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0- 1Ph, 또는 5~6원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리(질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0~4개의 헤테로원자를 가짐)이다.
P-변형: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "P-변형"은 입체화학적 변형 이외의 연결 인에서의 임의의 변형을 지칭한다. 특정 구현예에서, P-변형은 연결 인에 공유적으로 부착된 펜던트 모이어티의 부가, 치환 또는 제거를 포함한다.
부분 불포화된: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "부분 불포화된"은 적어도 하나의 이중 또는 삼중 결합을 포함하는 고리 모이어티를 지칭한다. 용어 "부분 불포화된"은 다수의 불포화 부위를 갖는 고리를 포함하고자 하지만, 본원에 정의된 바와 같은 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티를 포함하고자 하는 것은 아니다.
제약 조성물: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "제약 조성물"은 하나 이상의 제약상 허용가능한 담체와 함께 제형화된 활성제를 지칭한다. 특정 구현예에서, 활성제는 관련 집단에 투여되는 경우 통계적으로 유의한, 소정 치료 효과의 달성 확률을 나타내는 치료 요법에서의 투여에 적절한 양의 단위 용량으로 존재한다. 특정 구현예에서, 제약 조성물은 다음을 위한 것으로 수정된 것을 비롯하여 고체 또는 액체 형태로 투여하기 위한 것으로 특별히 제형화 될 수 있다: 예를 들어, 드렌치(수성 또는 비수성 용액 또는 현탁액), 정제, 예를 들어 협측, 설하, 및 전신 흡수용으로 표적화된 것, 볼루스, 산제, 과립, 혀에의 적용을 위한 페이스트와 같은 경구 투여용; 예를 들어, 살균 용액 또는 현탁액, 또는 서방형 제형으로서, 예를 들어 피하, 근육내, 정맥내 또는 경막외 주사에 의한 비경구 투여용; 예를 들어, 피부, 폐 또는 구강에 적용되는 크림, 연고 또는 제어 방출 패치 또는 스프레이로서의 국소 적용용; 예를 들어 페서리, 크림 또는 폼으로서의 질내 또는 직장내 투여용; 설하 투여용; 눈 투여용; 경피 투여용; 또는 비강, 폐 및 다른 점막 표면 투여용.
제약상 허용가능한: 본원에서 사용되는 바와 같이, "제약상 허용가능한"이라는 어구는 건전한 의학적 판단의 범주 내에서, 합리적인 이익/위험 비에 상응하여, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
제약상 허용가능한 담체: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "제약상 허용가능한 담체"는 하나의 기관, 또는 신체 일부로부터 또 다른 기관 또는 신체 일부로 대상 화합물을 운반 또는 수송하는 데 관여하는 제약상 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분과 상용성이고 환자에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용가능"해야 한다. 제약상 허용가능한 담체로서의 역할을 할 수 있는 물질의 일부 예는 다음을 포함한다: 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로오스 및 이의 유도체, 예컨대 소듐 카복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트; 분말형 트래거캔스; 맥아; 젤라틴; 활석; 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 한천; 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 알긴산; 무발열원 물; 등장 염수; 링거액(Ringer's solution); 에틸 알코올; pH 완충 용액; 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및/또는 폴리언하이드라이드; 및 제약 제형에 이용되는 다른 비독성 상용성 물질.
제약상 허용가능한 염: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "제약상 허용가능한 염"은 의약품 맥락에서 사용하기에 적절한 화합물의 염, 즉, 건전한 의학적 판단의 범주 내에서 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 등이 없이 인간 및 더 하등한 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합리적인 이익/위험 비에 상응하는 염을 지칭한다. 제약상 허용가능한 염은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, S. M. Berge 등은 제약상 허용가능한 염을 문헌[J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977)]에서 상세히 기술한다. 특정 구현예에서, 제약상 허용가능한 염은 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기 산 또는 아세트산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 숙신산 또는 말론산과 같은 유기 산에 의해 형성되거나 또는 이온 교환과 같은 본 기술 분야에서 사용되는 다른 방법을 사용하여 형성된 아미노기의 염인 비독성 산 부가염을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 제약상 허용가능한 염은 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 시트레이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 제공된 화합물은 하나 이상의 산성 기, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 제약상 허용가능한 염은 알칼리, 알칼리 토금속, 또는 암모늄(예를 들어, N(R)3의 암모늄 염(여기서, 각각의 R은 독립적으로 정의되며, 본 발명에 기재되어 있음)) 염이다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 소듐, 리튬, 포타슘, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 특정 구현예에서, 제약상 허용가능한 염은 소듐 염이다. 특정 구현예에서, 제약상 허용가능한 염은 포타슘 염이다. 특정 구현예에서, 제약상 허용가능한 염은 칼슘 염이다. 특정 구현예에서, 제약상 허용가능한 염은, 적절한 경우, 할라이드, 하이드록시드, 카복실레이트, 설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 설포네이트 및 아릴 설포네이트와 같은 반대 이온을 사용하여 형성되는 비독성 암모늄, 4차 암모늄 및 아민 양이온을 포함한다. 특정 구현예에서, 제공된 화합물은 하나 초과의 산 기를 포함하고, 예를 들어 올리고뉴클레오티드는 2개 이상의 산성 기를 포함할 수 있다(예를 들어, 천연 포스페이트 연결 및/또는 변형 뉴클레오티드간 연결에서). 특정 구현예에서, 이러한 화합물의 제약상 허용가능한 염, 또는 일반적으로 염은 동일하거나 상이할 수 있는 2개 이상의 양이온을 포함한다. 특정 구현예에서, 제약상 허용가능한 염(또는 일반적으로 염)에서, 산성 기에서의 모든 이온화가능 수소(예를 들어, 약 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2 이하; 특정 구현예에서 약 7 이하; 특정 구현예에서 약 6 이하; 특정 구현예에서 약 5 이하; 특정 구현예에서 약 4 이하; 특정 구현예에서 약 3 이하의 pKa를 갖는 수용액에서)는 양이온으로 대체된다. 특정 구현예에서, 각각의 포스포로티오에이트 및 포스페이트 기는 독립적으로 이의 염 형태로 존재한다(예를 들어, 나트륨 염인 경우 각각 -O-P(O)(SNa)-O- 및 -O-P(O)(ONa)-O-). 특정 구현예에서, 각각의 포스포로티오에이트 및 포스페이트 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 이의 염 형태로 존재한다(예를 들어, 나트륨 염인 경우 각각 -O-P(O)(SNa)-O- 및 -O-P(O)(ONa)-O-). 특정 구현예에서, 제약상 허용가능한 염은 올리고뉴클레오티드의 소듐 염이다. 특정 구현예에서, 제약상 허용가능한 염은 각각의 산성 포스페이트 및 변형 포스페이트 기(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스페이트 등)가, 만약에 있다면, 염 형태(모두 나트륨 염)로 존재하는 올리고뉴클레오티드의 나트륨 염이다.
미리 결정된: 미리 결정된(또는 미리-결정된)이라는 것은, 예를 들어 무작위로 일어나는, 무작위의, 또는 제어 없이 달성되는 것과는 대조적으로, 고의로 선택되거나 비-무작위이거나 제어됨을 의미한다. 당업자라면, 본 명세서를 읽고서 본 발명 내용이 특정 화학 및/또는 입체화학 특징을 선택하여 올리고뉴클레오티드 조성물 내에 포함시키는 것을 가능하게 하는 기술을 제공하며, 추가로 이러한 화학 및/또는 입체화학 특징을 갖는 올리고뉴클레오티드 조성물의 제어된 제조를 가능하게 함을 이해할 것이다. 이러한 제공된 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 "미리 결정된" 것이다. 특정 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있는 조성물은 특정 화학 및/또는 입체화학 특징을 의도적으로 생성하도록 제어되는 것이 아닌 공정을 통해 우연히 생성되었기 때문에 "미리 결정된" 조성물이 아니다. 특정 구현예에서, 미리 결정된 조성물은 의도적으로 재현될 수 있는 조성물이다(예를 들어, 제어된 공정의 반복을 통해). 특정 구현예에서, 조성물 중 미리 결정된 수준의 복수의 올리고뉴클레오티드는 조성물 중 복수의 올리고뉴클레오티드의 절대적인 양 및/또는 상대적인 양(비, 백분율 등)이 제어됨을 의미한다. 특정 구현예에서, 조성물 중 미리 결정된 수준의 복수의 올리고뉴클레오티드는 키랄 제어 올리고뉴클레오티드 제조를 통하여 달성된다.
보호기: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "보호기"는 본 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 문헌[Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd edition, John Wiley & Sons, 1999]에 상세하게 기술된 것을 포함하는데, 상기 문헌 전체는 본원에 참고로 포함된다. 문헌[Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, edited by Serge L. Beaucage et al. 06/2012](제2장 전체가 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 것들과 같은 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 화학을 위하여 특별히 수정된 보호기가 또한 포함된다. 적합한 아미노 보호기는 메틸 카바메이트, 에틸 카바메이트, 9-플루오레닐메틸 카바메이트(Fmoc), 9-(2-설포)플루오레닐메틸 카바메이트, 9-(2,7-디브로모)플루오로에닐메틸 카바메이트, 2,7-디-t-부틸-[9-(10,10-디옥소-10,10,10,10-테트라하이드로티옥산틸)]메틸 카바메이트(DBD-Tmoc), 4-메톡시페나실 카바메이트(Phenoc), 2,2,2-트리클로로에틸 카바메이트(Troc), 2-트리메틸실릴에틸 카바메이트(Teoc), 2-페닐에틸 카바메이트(hZ), 1-(1-아다만틸)-1-메틸에틸 카바메이트(Adpoc), 1,1-디메틸-2-할로에틸 카바메이트, 1,1-디메틸-2,2-디브로모에틸 카바메이트(DB-t-BOC), 1,1-디메틸-2,2,2-트리클로로에틸 카바메이트(TCBOC), 1-메틸-1-(4-바이페닐릴)에틸 카바메이트(Bpoc), 1-(3,5-디-t-부틸페닐)-1-메틸에틸 카바메이트(t-Bumeoc), 2-(2'- 및 4'-피리딜)에틸 카바메이트(Pyoc), 2-(N,N-디시클로헥실카복사미도)에틸 카바메이트, t-부틸 카바메이트(BOC), 1-아다만틸 카바메이트(Adoc), 비닐 카바메이트(Voc), 알릴 카바메이트(Alloc), 1-이소프로필알릴 카바메이트(Ipaoc), 신나밀 카바메이트(Coc), 4-니트로신나밀 카바메이트(Noc), 8-퀴놀릴 카바메이트, N-하이드록시피페리디닐 카바메이트, 알킬디티오 카바메이트, 벤질 카바메이트(Cbz), p-메톡시벤질 카바메이트(Moz), p-니트로벤질 카바메이트, p-브로모벤질 카바메이트, p-클로로벤질 카바메이트, 2,4-디클로로벤질 카바메이트, 4-메틸설피닐벤질 카바메이트(Msz), 9-안트릴메틸 카바메이트, 디페닐메틸 카바메이트, 2-메틸티오에틸 카바메이트, 2-메틸설포닐에틸 카바메이트, 2-(p-톨루엔설포닐)에틸 카바메이트, [2-(1,3-디티아닐)]메틸 카바메이트(Dmoc), 4-메틸티오페닐 카바메이트(Mtpc), 2,4-디메틸티오페닐 카바메이트(Bmpc), 2-포스포니오에틸 카바메이트(Peoc), 2-트리페닐포스포니오이소프로필 카바메이트(Ppoc), 1,1-디메틸-2-시아노에틸 카바메이트, m-클로로-p-아실옥시벤질 카바메이트, p-(디하이드록시보릴)벤질 카바메이트, 5-벤즈이속사졸릴메틸 카바메이트, 2-(트리플루오로메틸)-6-크로모닐메틸 카바메이트(Tcroc), m-니트로페닐 카바메이트, 3,5-디메톡시벤질 카바메이트, o-니트로벤질 카바메이트, 3,4-디메톡시-6-니트로벤질 카바메이트, 페닐(o-니트로페닐)메틸 카바메이트, 페노티아지닐-(10)-카보닐 유도체, N'-p-톨루엔설포닐아미노카보닐 유도체, N'-페닐아미노티오카보닐 유도체, t-아밀 카바메이트, S-벤질 티오카바메이트, p-시아노벤질 카바메이트, 시클로부틸 카바메이트, 시클로헥실 카바메이트, 시클로펜틸 카바메이트, 시클로프로필메틸 카바메이트, p-데실옥시벤질 카바메이트, 2,2-디메톡시카보닐비닐 카바메이트, o-(N,N-디메틸카복사미도)벤질 카바메이트, 1,1-디메틸-3-(N,N-디메틸카복사미도)프로필 카바메이트, 1,1-디메틸프로피닐 카바메이트, 디(2-피리딜)메틸 카바메이트, 2-푸라닐메틸 카바메이트, 2-요오도에틸 카바메이트, 이소보르닐 카바메이트, 이소부틸 카바메이트, 이소니코티닐 카바메이트, p-(p'-메톡시페닐아조)벤질 카바메이트, 1-메틸시클로부틸 카바메이트, 1-메틸시클로헥실 카바메이트, 1-메틸-1-시클로프로필메틸 카바메이트, 1-메틸-1-(3,5-디메톡시페닐)에틸 카바메이트, 1-메틸-1-(p-페닐아조페닐)에틸 카바메이트, 1-메틸-1-페닐에틸 카바메이트, 1-메틸-1-(4-피리딜)에틸 카바메이트, 페닐 카바메이트, p-(페닐아조)벤질 카바메이트, 2,4,6-트리-t-부틸페닐 카바메이트, 4-(트리메틸암모늄)벤질 카바메이트, 2,4,6-트리메틸벤질 카바메이트, 포름아미드, 아세트아미드, 클로로아세트아미드, 트리클로로아세트아미드, 트리플루오로아세트아미드, 페닐아세트아미드, 3-페닐프로판아미드, 피콜린아미드, 3-피리딜카복사미드, N-벤조일페닐알라닐 유도체, 벤즈아미드, p-페닐벤즈아미드, o-니트로페닐아세트아미드, o-니트로페녹시아세트아미드, 아세토아세트아미드, (N'-디티오벤질옥시카보닐아미노)아세트아미드, 3-(p-하이드록시페닐)프로판아미드, 3-(o-니트로페닐)프로판아미드, 2-메틸-2-(o-니트로페녹시)프로판아미드, 2-메틸-2-(o-페닐아조페녹시)프로판아미드, 4-클로로부탄아미드, 3-메틸-3-니트로부탄아미드, o-니트로신나미드, N-아세틸메티오닌 유도체, o-니트로벤즈아미드, o-(벤조일옥시메틸)벤즈아미드, 4,5-디페닐-3-옥사졸린-2-온, N-프탈이미드, N-디티아숙신이미드(Dts), N-2,3-디페닐말레이미드, N-2,5-디메틸피롤, N-1,1,4,4-테트라메틸디실릴아자시클로펜탄 부가물(STABASE), 5-치환 1,3-디메틸-1,3,5-트리아자시클로헥산-2-온, 5-치환 1,3-디벤질-1,3,5-트리아자시클로헥산-2-온, 1-치환 3,5-디니트로-4-피리돈, N-메틸아민, N-알릴아민, N-[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸아민(SEM), N-3-아세톡시프로필아민, N-(1-이소프로필-4-니트로-2-옥소-3-피롤린-3-일)아민, 4차 암모늄염, N-벤질아민, N-디(4-메톡시페닐)메틸아민, N-5-디벤조수베릴아민, N-트리페닐메틸아민(Tr), N-[(4-메톡시페닐)디페닐메틸]아민(MMTr), N-9-페닐플루오레닐아민(PhF), N-2,7-디클로로-9-플루오레닐메틸렌아민, N-페로세닐메틸아미노(Fcm), N-2-피콜릴아미노 N'-옥사이드, N-1,1-디메틸티오메틸렌아민, N-벤질리덴아민, N-p-메톡시벤질리덴아민, N-디페닐메틸렌아민, N-[(2-피리딜)메시틸]메틸렌아민, N-(N',N'-디메틸아미노메틸렌)아민, N,N'-이소프로필리덴디아민, N-p-니트로벤질리덴아민, N-살리실리덴아민, N-5-클로로살리실리덴아민, N-(5-클로로-2-하이드록시페닐)페닐메틸렌아민, N-시클로헥실리덴아민, N-(5,5-디메틸-3-옥소-1-시클로헥세닐)아민, N-보란 유도체, N-디페닐보린산 유도체, N-[페닐(펜타카보닐크로뮴- 또는 텅스텐)카보닐]아민, N-구리 킬레이트, N-아연 킬레이트, N-니트로아민, N-니트로소아민, 아민 N-옥사이드, 디페닐포스핀아미드(Dpp), 디메틸티오포스핀아미드(Mpt), 디페닐티오포스핀아미드(Ppt), 디알킬 포스포아미데이트, 디벤질 포스포아미데이트, 디페닐 포스포아미데이트, 벤젠설펜아미드, o-니트로벤젠설펜아미드(Nps), 2,4-디니트로벤젠설펜아미드, 펜타클로로벤젠설펜아미드, 2-니트로-4-메톡시벤젠설펜아미드, 트리페닐메틸설펜아미드, 3-니트로피리딘설펜아미드(Npys), p-톨루엔설폰아미드(Ts), 벤젠설폰아미드, 2,3,6,-트리메틸-4-메톡시벤젠설폰아미드(Mtr), 2,4,6-트리메톡시벤젠설폰아미드(Mtb), 2,6-디메틸-4-메톡시벤젠설폰아미드(Pme), 2,3,5,6-테트라메틸-4-메톡시벤젠설폰아미드(Mte), 4-메톡시벤젠설폰아미드(Mbs), 2,4,6-트리메틸벤젠설폰아미드(Mts), 2,6-디메톡시-4-메틸벤젠설폰아미드(iMds), 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설폰아미드(Pmc), 메탄설폰아미드(Ms), β-트리메틸실릴에탄설폰아미드(SES), 9-안트라센설폰아미드, 4-(4',8'-디메톡시나프틸메틸)벤젠설폰아미드(DNMBS), 벤질설폰아미드, 트리플루오로메틸설폰아미드, 및 페나실설폰아미드를 포함한다.
적절하게 보호된 카복실산은 추가로 실릴-, 알킬-, 알케닐-, 아릴-, 및 아릴알킬-보호된 카복실산을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 적합한 실릴 기의 예는 트리메틸실릴, 트리에틸실릴, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴, 트리이소프로필실릴 등을 포함한다. 적합한 알킬 기의 예는 메틸, 벤질, p-메톡시벤질, 3,4-디메톡시벤질, 트리틸, t-부틸, 테트라하이드로피란-2-일을 포함한다. 적합한 알케닐 기의 예는 알릴을 포함한다. 적합한 아릴 기의 예는 임의로 치환된 페닐, 바이페닐, 또는 나프틸을 포함한다. 적합한 아릴알킬 기의 예는 임의로 치환된 벤질(예를 들어, p-메톡시벤질(MPM), 3,4-디메톡시벤질, O-니트로벤질, p-니트로벤질, p-할로벤질, 2,6-디클로로벤질, p-시아노벤질), 및 2- 및 4-피콜릴을 포함한다.
적합한 하이드록실 보호기는 메틸, 메톡실메틸(MOM), 메틸티오메틸(MTM), t-부틸티오메틸, (페닐디메틸실릴)메톡시메틸(SMOM), 벤질옥시메틸(BOM), p-메톡시벤질옥시메틸(PMBM), (4-메톡시페녹시)메틸(p-AOM), 과이어콜메틸(GUM), t-부톡시메틸, 4-펜테닐옥시메틸(POM), 실록시메틸, 2-메톡시에톡시메틸(MEM), 2,2,2-트리클로로에톡시메틸, 비스(2-클로로에톡시)메틸, 2-(트리메틸실릴)에톡시메틸(SEMOR), 테트라하이드로피라닐(THP), 3-브로모테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로티오피라닐, 1-메톡시시클로헥실, 4-메톡시테트라하이드로피라닐(MTHP), 4-메톡시테트라하이드로티오피라닐, 4-메톡시테트라하이드로티오피라닐 S,S-디옥사이드, 1-[(2-클로로-4-메틸)페닐]-4-메톡시피페리딘-4-일(CTMP), 1,4-디옥산-2-일, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로티오푸라닐, 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타하이드로-7,8,8-트리메틸-4,7-메타노벤조푸란-2-일, 1-에톡시에틸, 1-(2-클로로에톡시)에틸, 1-메틸-1-메톡시에틸, 1-메틸-1-벤질옥시에틸, 1-메틸-1-벤질옥시-2-플루오로에틸, 2,2,2-트리클로로에틸, 2-트리메틸실릴에틸, 2-(페닐셀레닐)에틸, t-부틸, 알릴, p-클로로페닐, p-메톡시페닐, 2,4-디니트로페닐, 벤질, p-메톡시벤질, 3,4-디메톡시벤질, o-니트로벤질, p-니트로벤질, p-할로벤질, 2,6-디클로로벤질, p-시아노벤질, p-페닐벤질, 2-피콜릴, 4-피콜릴, 3-메틸-2-피콜릴 N-옥시도, 디페닐메틸, p,p'-디니트로벤즈하이드릴, 5-디벤조수베릴, 트리페닐메틸, α-나프틸디페닐메틸, p-메톡시페닐디페닐메틸, 디(p-메톡시페닐)페닐메틸, 트리(p-메톡시페닐)메틸, 4-(4'-브로모페나실옥시페닐)디페닐메틸, 4,4',4''-트리스(4,5-디클로로프탈이미도페닐)메틸, 4,4',4''-트리스(레불리노일옥시페닐)메틸, 4,4',4''-트리스(벤조일옥시페닐)메틸, 3-(이미다졸-1-일)비스(4',4''-디메톡시페닐)메틸, 1,1-비스(4-메톡시페닐)-1'-피레닐메틸, 9-안트릴, 9-(9-페닐)잔테닐, 9-(9-페닐-10-옥소)안트릴, 1,3-벤조디티올란-2-일, 벤즈이소티아졸릴 S,S-디옥시도, 트리메틸실릴(TMS), 트리에틸실릴(TES), 트리이소프로필실릴(TIPS), 디메틸이소프로필실릴(IPDMS), 디에틸이소프로필실릴(DEIPS), 디메틸텍실실릴, t-부틸디메틸실릴(TBDMS), t-부틸디페닐실릴(TBDPS), 트리벤질실릴, 트리-p-자일릴실릴, 트리페닐실릴, 디페닐메틸실릴(DPMS), t-부틸메톡시페닐실릴(TBMPS), 포르메이트, 벤조일포르메이트, 아세테이트, 클로로아세테이트, 디클로로아세테이트, 트리클로로아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 메톡시아세테이트, 트리페닐메톡시아세테이트, 페녹시아세테이트, p-클로로페녹시아세테이트, 3-페닐프로피오네이트, 4-옥소펜타노에이트(레불리네이트), 4,4-(에틸렌디티오)펜타노에이트(레불리노일디티오아세탈), 피발로에이트, 아다만토에이트, 크로토네이트, 4-메톡시크로토네이트, 벤조에이트, p-페닐벤조에이트, 2,4,6-트리메틸벤조에이트(메시토에이트), 알킬 메틸 카보네이트, 9-플루오레닐메틸 카보네이트(Fmoc), 알킬 에틸 카보네이트, 알킬 2,2,2-트리클로로에틸 카보네이트(Troc), 2-(트리메틸실릴)에틸 카보네이트(TMSEC), 2-(페닐설포닐) 에틸 카보네이트(Psec), 2-(트리페닐포스포니오) 에틸 카보네이트(Peoc), 알킬 이소부틸 카보네이트, 알킬 비닐 카보네이트 알킬 알릴 카보네이트, 알킬 p-니트로페닐 카보네이트, 알킬 벤질 카보네이트, 알킬 p-메톡시벤질 카보네이트, 알킬 3,4-디메톡시벤질 카보네이트, 알킬 o-니트로벤질 카보네이트, 알킬 p-니트로벤질 카보네이트, 알킬 S-벤질 티오카보네이트, 4-에톡시-1-나프트틸 카보네이트, 메틸 디티오카보네이트, 2-요오도벤조에이트, 4-아지도부티레이트, 4-니트로-4-메틸펜타노에이트, o-(디브로모메틸)벤조에이트, 2-포르밀벤젠설포네이트, 2-(메틸티오메톡시)에틸, 4-(메틸티오메톡시)부티레이트, 2-(메틸티오메톡시메틸)벤조에이트, 2,6-디클로로-4-메틸페녹시아세테이트, 2,6-디클로로-4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페녹시아세테이트, 2,4-비스(1,1-디메틸프로필)페녹시아세테이트, 클로로디페닐아세테이트, 이소부티레이트, 모노숙시노에이트, (E)-2-메틸-2-부테노에이트, o-(메톡시카보닐)벤조에이트, α-나프토에이트, 니트레이트, 알킬 N,N,N',N'-테트라메틸포스포로디아미데이트, 알킬 N-페닐카바메이트, 보레이트, 디메틸포스피노티오일, 알킬 2,4-디니트로페닐설페네이트, 설페이트, 메탄설포네이트(메실레이트), 벤질설포네이트, 및 토실레이트(Ts)를 포함한다. 1,2- 또는 1,3-디올 보호의 경우, 보호기는 메틸렌 아세탈, 에틸리덴 아세탈, 1-t-부틸에틸리덴 케탈, 1-페닐에틸리덴 케탈, (4-메톡시페닐)에틸리덴 아세탈, 2,2,2-트리클로로에틸리덴 아세탈, 아세토니드, 시클로펜틸리덴 케탈, 시클로헥실리덴 케탈, 시클로헵틸리덴 케탈, 벤질리덴 아세탈, p-메톡시벤질리덴 아세탈, 2,4-디메톡시벤질리덴 케탈, 3,4-디메톡시벤질리덴 아세탈, 2-니트로벤질리덴 아세탈, 메톡시메틸렌 아세탈, 에톡시메틸렌 아세탈, 디메톡시메틸렌 오르토 에스테르, 1-메톡시에틸리덴 오르토 에스테르, 1-에톡시에틸리딘 오르토 에스테르, 1,2-디메톡시에틸리덴 오르토 에스테르, α-메톡시벤질리덴 오르토 에스테르, 1-(N,N-디메틸아미노)에틸리덴 유도체, α-(N,N'-디메틸아미노)벤질리덴 유도체, 2-옥사시클로펜틸리덴 오르토 에스테르, 디-t-부틸실릴렌 기(DTBS), 1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴) 유도체(TIPDS), 테트라-t-부톡시디실록산-1,3-디일리덴 유도체(TBDS), 환형 카보네이트, 환형 보로네이트, 에틸 보로네이트, 및 페닐 보로네이트를 포함한다.
특정 구현예에서, 하이드록실 보호기는 아세틸, t-부틸, t부톡시메틸, 메톡시메틸, 테트라하이드로피라닐, 1-에톡시에틸, 1-(2-클로로에톡시)에틸, 2-트리메틸실릴에틸, p-클로로페닐, 2,4-디니트로페닐, 벤질, 벤조일, p-페닐벤조일, 2,6-디클로로벤질, 디페닐메틸, p-니트로벤질, 트리페닐메틸(트리틸), 4,4'-디메톡시트리틸, 트리메틸실릴, 트리에틸실릴, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴, 트리페닐실릴, 트리이소프로필실릴, 벤조일포르메이트, 클로로아세틸, 트리클로로아세틸, 트리플루오로아세틸, 피발로일, 9-플루오레닐메틸 카보네이트, 메실레이트, 토실레이트, 트리플레이트, 트리틸, 모노메톡시트리틸(MMTr), 4,4'-디메톡시트리틸(DMTr) 및 4,4',4''-트리메톡시트리틸(TMTr), 2-시아노에틸(CE 또는 Cne), 2-(트리메틸실릴)에틸(TSE), 2-(2-니트로페닐)에틸, 2-(4-시아노페닐)에틸 2-(4-니트로페닐)에틸(NPE), 2-(4-니트로페닐설포닐)에틸, 3,5-디클로로페닐, 2,4-디메틸페닐, 2-니트로페닐, 4-니트로페닐, 2,4,6-트리메틸페닐, 2-(2-니트로페닐)에틸, 부틸티오카보닐, 4,4',4''-트리스(벤조일옥시)트리틸, 디페닐카바모일, 레불리닐, 2-(디브로모메틸)벤조일(Dbmb), 2-(이소프로필티오메톡시메틸)벤조일(Ptmt), 9-페닐잔텐-9-일(픽실) 또는 9-(p-메톡시페닐)잔틴-9-일(MOX)이다. 특정 구현예에서, 각각의 하이드록실 보호기는 독립적으로 아세틸, 벤질, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴, 및 4,4'-디메톡시트리틸로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 하이드록실 보호기는 트리틸, 모노메톡시트리틸, 및 4,4'-디메톡시트리틸 기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 인 연결 보호기는 올리고뉴클레오티드 합성 전체에 걸쳐 인 연결(예를 들어, 뉴클레오티드간 연결)에 부착되어 있는 기이다. 특정 구현예에서, 보호기는 포스포로티오에이트 기의 황 원자에 부착된다. 특정 구현예에서, 보호기는 뉴클레오티드간 포스포로티오에이트 연결의 산소 원자에 부착된다. 특정 구현예에서, 보호기는 뉴클레오티드간 포스페이트 연결의 산소 원자에 부착된다. 특정 구현예에서, 보호기는 2-시아노에틸(CE 또는 Cne), 2-트리메틸실릴에틸, 2-니트로에틸, 2-설포닐에틸, 메틸, 벤질, o-니트로벤질, 2-(p-니트로페닐)에틸(NPE 또는 Npe), 2-페닐에틸, 3-(N-tert-부틸카복사미도)-1-프로필, 4-옥소펜틸, 4-메틸티오-1-부틸, 2-시아노-1,1-디메틸에틸, 4-N-메틸아미노부틸, 3-(2-피리딜)-1-프로필, 2-[N-메틸-N-(2-피리딜)]아미노에틸, 2-(N-포르밀,N-메틸)아미노에틸, 또는 4-[N-메틸-N-(2,2,2-트리플루오로아세틸)아미노]부틸이다.
대상체: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체" 또는 "테스트 대상체"는, 화합물(예를 들어, 올리고뉴클레오티드) 또는 조성물이 예를 들어, 실험, 진단, 예방 및/또는 치료 목적을 위하여 본 발명에 따라 투여되는 임의의 유기체를 지칭한다. 전형적인 대상체는 동물(예를 들어, 포유동물, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 비인간 영장류, 및 인간; 곤충류; 충류 등) 및 식물을 포함한다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다. 특정 구현예에서, 대상체는 질환, 장애 및/또는 병태를 앓고 있고/있거나 이에 걸리기 쉬울 수 있다.
실질적으로: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로"는 관심있는 특징 또는 특성의 전체 또는 거의 전체의 범위 또는 정도를 나타내는 정성적 상태를 지칭한다. 제2 서열에 실질적으로 동일하거나 상보성인 염기 서열은 제2 서열과 완전히 동일하거나 상보적이지 않지만, 제2 서열과 대부분 동일하거나 또는 거의 동일하거나 상보적이다. 특정 구현예에서, 다른 올리고뉴클레오티드 또는 핵산에 대해 실질적으로 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드는 완전히 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드와 유사한 방식으로 올리고뉴클레오티드 또는 핵산과 듀플렉스를 형성한다. 게다가, 생물학 및/또는 화학 분야의 통상의 기술자는 생물학적 및 화학적 현상이 완료되는 경우가 거의 없고/없거나 완전성을 달성하거나 절대 결과를 달성 또는 회피하는 경우가 거의 없다는 것을 이해할 것이다. 따라서 용어 "실질적으로"는 많은 생물학적 및/또는 화학적 현상에 내재된 완전성의 잠재적 결핍을 포착하기 위해 본원에서 사용된다.
당: 용어 "당"은 폐쇄 및/또는 개방 형태의 단당류 또는 다당류를 지칭한다. 특정 구현예에서, 당은 단당류이다. 특정 구현예에서, 당은 다당류이다. 당은 리보스, 데옥시리보스, 펜토푸라노스, 펜토피라노스 및 헥소피라노스 모이어티를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "당"은 또한 통상적인 당 분자 대신 사용되는 구조적 유사체, 예컨대 글리콜(이의 중합체는 핵산 유사체의 백본을 형성함), 글리콜 핵산("GNA") 등을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "당"은 또한 천연 또는 천연 발생 뉴클레오티드 대신 사용되는 구조적 유사체, 예컨대 변형 당 및 뉴클레오티드 당을 포함한다. 특정 구현예에서, 당은 RNA 또는 DNA 당(리보스 또는 데옥시리보스)이다. 특정 구현예에서, 당은 변형 리보스 또는 데옥시리보스 당, 예를 들어 2'-변형된 것, 5'-변형된 것 등이다. 본원에 기재된 바와 같이, 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 및/또는 핵산에서 사용되는 경우, 변형 당은 하나 이상의 원하는 특성, 활성 등을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 당은 임의로 치환된 리보스 또는 데옥시리보스이다. 특정 구현예에서, "당"은 올리고뉴클레오티드 또는 핵산에서의 당 단위를 지칭한다.
걸리기 쉬운: 질환, 장애 및/또는 병태에 "걸리기 쉬운" 개체는 그 질환, 장애 및/또는 병태의 발병 위험이 일반 대중 구성원보다 더 높은 개체이다. 특정 구현예에서, 질환, 장애 및/또는 병태에 걸리기 쉬운 개체는 그 질환, 장애 및/또는 병태를 갖는 성향이 있다. 특정 구현예에서, 질환, 장애 및/또는 병태에 걸리기 쉬운 개체는 그 질환, 장애 및/또는 병태가 진단된 적이 없을 수 있다. 특정 구현예에서, 질환, 장애 및/또는 병태에 걸리기 쉬운 개체는 그 질환, 장애 및/또는 병태의 증상을 나타낼 수 있다. 특정 구현예에서, 질환, 장애 및/또는 병태에 걸리기 쉬운 개체는 그 질환, 장애 및/또는 병태의 증상을 나타내지 않을 수 있다. 특정 구현예에서, 질환, 장애 및/또는 병태에 걸리기 쉬운 개체는 그 질환, 장애 및/또는 병태가 발병할 것이다. 특정 구현예에서, 질환, 장애 및/또는 병태에 걸리기 쉬운 개체는 그 질환, 장애 및/또는 병태가 발병하지 않을 것이다.
치료제: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료제"는 일반적으로, 대상체에게 투여되는 경우 원하는 효과(예를 들어, 원하는 생물학적, 임상적 또는 약리학적 효과)를 유발하는 임의의 약제를 지칭한다. 특정 구현예에서, 제제, 예를 들어 dsRNAi 제제는 적절한 집단 전체에 걸쳐 통계적으로 유의한 효과를 나타내는 경우 치료제로 간주된다. 특정 구현예에서, 적절한 집단은 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있고/있거나 이에 걸리기 쉬운 대상체의 집단이다. 특정 구현예에서, 적절한 집단은 모델 유기체의 집단이다. 특정 구현예에서, 적절한 집단은 연령 군, 성별, 유전적 배경, 기존 임상 상태, 요법에 대한 사전 노출과 같은 하나 이상의 기준에 의해 정의될 수 있다. 특정 구현예에서, 치료제는 유효량으로 대상체에게 투여되는 경우 대상체에서 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 간 증상 또는 특징을 경감시키고/시키거나, 개선시키고/시키거나, 완화시키고/시키거나, 억제하고/하거나, 예방하고/하거나, 이의 발병을 지연시키고/시키거나, 이의 중증도를 감소시키고/시키거나 이의 발생을 감소시키는 물질이다. 특정 구현예에서, "치료제"는 인간 투여용으로 판매될 수 있기 전에 정부 기관에 의해 승인되었거나 승인을 받는 것이 요구되는 약제이다. 특정 구현예에서, "치료제"는 인간에게 투여하기 위해 의학적 처방이 요구되는 약제이다. 특정 구현예에서, 치료제는 제공된 화합물, 예를 들어 제공된 올리고뉴클레오티드이다.
치료적 유효량: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료적 유효량"은 치료 요법의 일부로서 투여되는 경우 원하는 생물학적 반응을 유발하는 물질(예를 들어, 치료제, 조성물 및/또는 제형)의 양을 의미한다. 특정 구현예에서, 물질의 치료적 유효량은 질환, 장애 및/또는 병태를 앓고 있거나 이것에 걸리기 쉬운 대상체에게 투여되는 경우 그 질환, 장애 및/또는 병태의 치료, 진단, 예방 및/또는 발병 지연에 충분한 양이다. 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 물질의 유효량은 목적하는 생물학적 종점으로서 이러한 인자, 전달되는 물질, 표적 세포 또는 조직 등에 따라 다를 수 있다. 예를 들어 질환, 장애 및/또는 병태를 치료하기 위한 제형 중 화합물의 유효량은, 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 경감, 개선, 완화, 억제, 예방, 발병 지연, 중증도 감소 및/또는 발생 감소시키는 양이다. 특정 구현예에서, 치료적 유효량은 단회 용량으로 투여되며; 특정 구현예에서, 다회 단위 용량이 치료적 유효량 전달에 필요하다.
치료하다: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료", 또는 "치료하는"은 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징의 부분적이거나 완전한 경감, 개선, 완화, 억제, 예방, 발병 지연, 중증도 감소 및/또는 발생 감소에 사용되는 임의의 방법을 지칭한다. 치료제는 질환, 장애, 및/또는 병태의 징후를 나타내지 않는 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 치료제는 예를 들어 질환, 장애, 및/또는 병태와 관련된 병상의 발생 위험을 감소시키기 위해 질환, 장애, 및/또는 병태의 초기 징후만을 나타내는 대상체에게 투여될 수 있다.
불포화된: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "불포화된"은 모이어티가 하나 이상의 불포화 단위를 가짐을 의미한다.
야생형: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "야생형"은 (돌연변이, 병에 걸린, 변경된 등과 대조되는) "정상" 상태 또는 맥락에서 자연에서 발견되는 구조 및/또는 활성을 갖는 엔티티(entity)를 지칭하는 당업계에서 이해되는 의미를 갖는다. 당업자는 야생형 유전자 및 폴리펩티드가 종종 다수의 상이한 형태(예를 들어, 대립유전자)로 존재한다는 것을 이해할 것이다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 제공된 화합물(예를 들어, 올리고뉴클레오티드)과 관련하여 본원에 기재된 방법 및 조성물은 또한 이러한 화합물의 제약상 허용가능한 염에 일반적으로 적용된다.
1. 특정 구현예의 설명
올리고뉴클레오티드는 다양한 응용 분야에서 유용한 도구이다. 예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드는 다양한 병태, 장애, 및 질환의 치료를 비롯하여 치료, 진단, 및 연구 응용 분야에서 유용하다. 자연 발생적 핵산(예를 들어, 비변형 DNA 또는 RNA)의 사용은 예를 들어, 엔도- 및 엑소-뉴클레아제에 대한 민감성으로 인해 제한된다. 따라서, 이러한 단점을 피하고/하거나 다양한 특성 및 활성을 더욱 개선시키기 위해 다양한 합성 대응물이 개발되었다. 이러한 대응물에는 화학적 변형, 예를 들어 염기 변형, 당 변형, 백본 변형 등을 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드(특히, 이러한 분자를 분해에 덜 민감하게 만들고 다른 특성 및/또는 활성을 개선시키는 것)가 포함된다. 구조적 관점에서, 뉴클레오티드간 연결에 대한 변형은 키랄성 및/또는 변경 전하를 도입할 수 있으며, 특정 특성 및 활성은 올리고뉴클레오티드의 연결 인 원자의 배열에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성, 상보적 RNA에 대한 서열 특이적 결합, 뉴클레아제에 대한 안정성, 표적 핵산의 절단, 전달, 약동학적 특성 등은 특히 백본 연결 원자의 키랄성 및/또는 전하에 의해 영향을 받을 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 제어된 구조적 요소를 갖는 ds 올리고뉴클레오티드(예를 들어, dsRNAi 올리고뉴클레오티드, dsRNAi 제제로도 지칭됨)를 포함하는 조성물이 예상치 못한 특성 및/또는 활성을 제공한다는 것을 입증한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 입체화학, 예를 들어 백본 키랄 중심의 입체화학이 뜻밖에 ds 올리고뉴클레오티드의 특성을 유지하거나 개선할 수 있다는 인식을 포함한다. 안정성을 증가시키는 일부 구조적 요소가 활성, 예를 들어 RNA 간섭을 낮출 수도 있다는 이전의 많은 관찰과 대조적으로, 본 발명은 입체화학의 제어가 놀랍게도 활성을 유의하게 감소시키지 않으면서 증가된 안정성을 유지할 수 있음을 입증한다. 예를 들어, 제한 없이, 본 발명은 부분적으로 다음 중 하나 이상을 포함하는 ds 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다: (1) 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는 가이드 가닥; (2) 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 +2 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이의 Rp, Sp, 또는 교호 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는 가이드 가닥; (3) 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심에 대해 상류(즉, 5' 방향)에 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는 가이드 가닥(상류 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심은 Rp 또는 Sp 배열임); (4) 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 (+2) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이, 또한 (a) +3 뉴클레오티드와 +4 뉴클레오티드 사이 및 (b) +5 뉴클레오티드와 +6 뉴클레오티드 사이 중 하나 또는 둘 모두의 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는 가이드 가닥; 및 (5) Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함하는, 전술한 가이드 가닥 중 하나 이상과 조합된 패신저 가닥.
특정 구현예에서, 본 발명은 입체화학, 예를 들어 가이드 가닥(ds 올리고뉴클레오티드의 가이드 가닥은 또한 Rp 또는 Sp 배열의 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함)의 5' 말단 변형에서 키랄 중심의 입체화학이 뜻밖에 ds 올리고뉴클레오티드의 특성을 유지하거나 개선할 수 있다는 인식을 포함한다. 예를 들어, 제한 없이, 본 발명은 부분적으로 Rp 또는 Sp 배열의 포스포로티오에이트 키랄 중심 및 다음으로부터 선택되는 5' 말단 변형을 포함하는 가이드 가닥을 포함하는 ds 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다:
(a) 5' PO 변형, 예컨대(그러나 다음으로 한정되지 않음):
Figure pct00020
;
(b) 5' VP 변형, 예컨대(그러나 다음으로 한정되지 않음):
Figure pct00021
;
(c) 5' MeP 변형, 예컨대(그러나 다음으로 한정되지 않음):
Figure pct00022
;
(d) 5' PN 및 5' 트리졸-P 변형, 예컨대(그러나 다음으로 한정되지 않음):
Figure pct00023
및
Figure pct00024
;
여기서, 염기는 A, C, G, T, U, 비염기성, 및 변형 핵염기에서 선택되고;
R2'는 H, OH, O-알킬, F, MOE, 4' C로의 잠금 핵산(LNA) 가교체 및 가교 핵산(BNA) 가교체로부터 선택됨, 예컨대(그러나 다음으로 한정되지 않음):
Figure pct00025
및
Figure pct00026
.
다른 특정 구현예에서, 본 발명은 입체화학, 예를 들어 가이드 가닥(ds 올리고뉴클레오티드의 가이드 가닥은 또한 Rp 또는 Sp 배열의 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함)의 5' 말단 뉴클레오티드에서 키랄 중심의 입체화학이 뜻밖에 ds 올리고뉴클레오티드의 특성을 유지하거나 개선할 수 있다는 인식을 포함한다. 예를 들어, 제한 없이, 본 발명은 부분적으로 Rp 또는 Sp 배열의 포스포로티오에이트 키랄 중심 및 다음으로부터 선택되는 5' 말단 뉴클레오티드를 포함하는 가이드 가닥을 포함하는 ds 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다:
(a) 5' PO 뉴클레오티드, 예컨대(그러나 다음으로 한정되지 않음):
Figure pct00027
;
(b) 5' VP 뉴클레오티드, 예컨대(그러나 다음으로 한정되지 않음):
Figure pct00028
Figure pct00029
;
(c) 5' MeP 뉴클레오티드, 예컨대(그러나 다음으로 한정되지 않음):
Figure pct00030
;
(d) 5' PN 및 5' 트리졸-P 뉴클레오티드, 예컨대(그러나 다음으로 한정되지 않음):
Figure pct00031
,
Figure pct00032
, 및
Figure pct00033
;
(e) 5' 비염기성 VP 및 5' 비염기성 MeP 뉴클레오티드, 예컨대(그러나 다음으로 한정되지 않음):
Figure pct00034
및
Figure pct00035
.
특정 구현예에서, 본 발명은, 천연 비-발생 뉴클레오티드간 연결, 예를 들어 중성 뉴클레오티드간 연결은 뜻밖에 ds 올리고뉴클레오티드의 특성을 유지하거나 개선할 수 있다는 인식을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은, 변형 뉴클레오티드간 연결이 ds 올리고뉴클레오티드의 활성을 크게 감소시키지 않으면서 ds 올리고뉴클레오티드에 도입될 수 있음을 입증한다. 예를 들어, 제한 없이, 본 발명은 부분적으로 다음 중 하나 이상을 포함하는 ds 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다: (1) 5' 및 3' 말단 디뉴클레오티드 중 하나 또는 둘 모두가 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결에 의해 연결되지 않은 가이드 가닥(즉 가이드 가닥은, 5' 말단 디뉴클레오티드 사이의 연결에 대해, 하류(즉, 3' 방향) 및/또는 3' 말단 디뉴클레오티드 사이의 연결에 대해, 상류(즉, 5' 방향)의 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결을 포함함); (2) 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이, 가이드 가닥의, 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 두 번째(+2)와 세 번째(+3) 뉴클레오티드 사이에 나타나고, 끝에서 두 번째 3' (N-1) 뉴클레오티드(여기서, N은 3' 말단 뉴클레오티드임)에 대해 나타나는 가이드 가닥; (3) 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이, 가이드 가닥의, 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 세 번째(+3)와 네 번째(+4) 뉴클레오티드 사이 및/또는 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 10번째(+10)와 11번째(+11) 뉴클레오티드 사이에 나타나는 가이드 가닥; (4) 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이 패신저 가닥의 중앙 뉴클레오티드에 대해, 상류(즉, 5' 방향)에 나타나는 패신저 가닥; 및 (5) 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이 패신저 가닥의 중앙 뉴클레오티드에 대해, 하류(즉, 3' 방향)에 나타나는 패신저 가닥.
특정 구현예에서, 본 발명은, 천연 비-발생 뉴클레오티드간 연결, 예를 들어 중성 뉴클레오티드간 연결은, 특정 구현예에서, 하나 이상의 분자를 본원에 기재된 이중 가닥 올리고뉴클레오티드에 연결하는 데 사용될 수 있다는 인식을 포함한다. 특정 구현예에서, 이러한 연결된 분자는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 표적화 및/또는 전달을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 제한 없이, 이러한 연결된 분자에는 친유성 분자가 포함된다. 특정 구현예에서, 연결된 분자는 하나 이상의 GalNac 모이어티를 포함하는 분자이다. 특정 구현예에서, 연결된 분자는 수용체이다. 특정 구현예에서, 연결된 분자는 수용체 리간드이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 개선된 안정성 올리고뉴클레오티드의 조성물을 포함하는, 올리고뉴클레오티드 활성을 유지 또는 증가시키면서 올리고뉴클레오티드의 안정성을 개선하기 위한 기술(예를 들어, 화합물, 방법 등)을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 다양한 추가 화학적 모이어티를 ds 올리고뉴클레오티드에 혼입시키기 위한 기술을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 예를 들어, 핵염기를 통해(예를 들어, 임의로 링커를 통해 핵염기의 부위에 대한 공유 연결에 의해) 추가 화학적 모이어티를 도입하기 위한 시약 및 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 대립유전자-특이적 억제를 달성하는 기술, 예를 들어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물 및 이의 방법을 제공하며, 특정 표적 유전자의 하나의 대립유전자로부터의 전사체는 동일한 유전자의 적어도 하나의 다른 대립유전자에 비해 선택적으로 넉다운된다.
특히, 본 발명은, ds 올리고뉴클레오티드에 혼입될 수 있고 이의 하나 이상의 특성을 부여하거나 조정할 수 있는 구조적 요소, 기술, 및/또는 특징을 제공한다(예를 들어, 관련 기술 또는 특징이 결여된 다른 동일한 ds 올리고뉴클레오티드에 비해). 특정 구현예에서, 본 발명은, 하나 이상의 제공된 기술 및/또는 특징이 다양한 서열의 ds 올리고뉴클레오티드에 유용하게 혼입될 수 있음을 문서로 뒷받침한다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 제공된 특정 구조적 요소, 기술, 및/또는 특징이 RNAi 메커니즘(예를 들어, RNAi 제제)에 있어 관여 및/또는 유도하는 ds 올리고뉴클레오티드에 특히 유용함을 입증한다. 그러나 그럼에도 본 발명의 교시는 임의의 특정 메커니즘에 참여하거나 이를 통해 작동하는 ds 올리고뉴클레오티드로 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 본 발명은 임의의 메카니즘을 통해 작동하고 본원에 기재된 임의의 서열, 구조, 또는 포맷(또는 이의 일부)을 포함하는, 임의의 목적에 유용한 임의의 ds 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 임의의 메카니즘을 통해 작동하고, 본원에 기재된 임의의 서열, 구조, 또는 포맷(또는 이의 일부)을 포함하는 임의의 목적에 유용한 ds 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것으로, ds 올리고뉴클레오티드는 (1) 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는 가이드 가닥; (2) 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 +2 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이의 Rp, Sp, 또는 교호 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는 가이드 가닥; (3) 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심에 대해 상류, 즉, 5' 방향으로, 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는 가이드 가닥(상류 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심은 Rp 또는 Sp 배열임); (4) 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 (+2) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이, 또한 (a) +3 뉴클레오티드와 +4 뉴클레오티드 사이 및 (b) +5 뉴클레오티드와 +6 뉴클레오티드 사이 중 하나 또는 둘 모두의 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는 가이드 가닥; 및 (5) Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함하는, 전술한 가이드 가닥 중 하나 이상과 조합된 패신저 가닥을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 본 발명은 임의의 메카니즘을 통해 작동하고, 본원에 기재된 임의의 서열, 구조, 또는 포맷(또는 이의 일부)을 포함하는 임의의 목적에 유용한 ds 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것으로, ds 올리고뉴클레오티드는 (1) 5' 및 3' 말단 디뉴클레오티드 중 하나 또는 둘 모두가 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결에 의해 연결되지 않은 가이드 가닥(즉 가이드 가닥은, 5' 말단 디뉴클레오티드 사이의 연결에 대해, 하류(즉, 3' 방향) 및/또는 3' 말단 디뉴클레오티드 사이의 연결에 대해, 상류(즉, 5' 방향)의 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결을 포함함); (2) 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이, 가이드 가닥의, 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 두 번째(+2)와 세 번째(+3) 뉴클레오티드 사이에 나타나고, 끝에서 두 번째 3' (N-1) 뉴클레오티드(여기서, N은 3' 말단 뉴클레오티드임)에 대해 나타나는 가이드 가닥; (3) 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이, 가이드 가닥의, 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 세 번째(+3)와 네 번째(+4) 뉴클레오티드 사이 및/또는 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 10번째(+10)와 11번째(+11) 뉴클레오티드 사이에 나타나는 가이드 가닥; (4) 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이 패신저 가닥의 중앙 뉴클레오티드에 대해, 상류(즉, 5' 방향)에 나타나는 패신저 가닥; 및 (5) 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이 패신저 가닥의 중앙 뉴클레오티드에 대해, 하류(즉, 3' 방향)에 나타나는 패신저 가닥을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 본 발명은 임의의 메카니즘을 통해 작동하고 본원에 기재된 임의의 서열, 구조, 또는 포맷(또는 이의 일부)을 포함하는, 임의의 목적에 유용한 ds 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것으로, ds 올리고뉴클레오티드는 (1) 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는 가이드 가닥; (2) 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 +2 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이의 Rp, Sp, 또는 교호 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는 가이드 가닥; (3) 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심에 대해 상류(즉, 5' 방향)에 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는 가이드 가닥(상류 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심은 Rp 또는 Sp 배열임); (4) 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 (+2) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이, 또한 (a) (+3) 뉴클레오티드와 (+4) 뉴클레오티드 사이 및 (b) (+5) 뉴클레오티드와 (+6) 뉴클레오티드 사이 중 하나 또는 둘 모두의 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는 가이드 가닥; 및 (5) Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함하는, 전술한 가이드 가닥 중 하나 이상과 조합된 패신저 가닥을 포함하지만 이에 한정되지 않고, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 서열, 구조, 또는 포맷(또는 이의 일부)을 포함하는, 임의의 목적에 유용한 ds 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것으로, ds 올리고뉴클레오티드는 (1) 5' 및 3' 말단 디뉴클레오티드 중 하나 또는 둘 모두가 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결에 의해 연결되지 않은 가이드 가닥(즉 가이드 가닥은, 5' 말단 디뉴클레오티드 사이의 연결에 대해, 하류(즉, 3' 방향) 및/또는 3' 말단 디뉴클레오티드 사이의 연결에 대해, 상류(즉, 5' 방향)의 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결을 포함함); (2) 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이, 가이드 가닥의, 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 두 번째(+2)와 세 번째(+3) 뉴클레오티드 사이에 나타나고, 끝에서 두 번째 3' (N-1) 뉴클레오티드(여기서, N은 3' 말단 뉴클레오티드임)에 대해 나타나는 가이드 가닥; (3) 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이, 가이드 가닥의, 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 세 번째(+3)와 네 번째(+4) 뉴클레오티드 사이 및/또는 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 10번째(+10)와 11번째(+11) 뉴클레오티드 사이에 나타나는 가이드 가닥; (4) 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이 패신저 가닥의 중앙 뉴클레오티드에 대해, 상류(즉, 5' 방향)에 나타나는 패신저 가닥; 및 (5) 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이 패신저 가닥의 중앙 뉴클레오티드에 대해, 하류(즉, 3' 방향)에 나타나는 패신저 가닥을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 RNAi 메커니즘에 관여(예를 들어, 유도)할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 RNase H(리보뉴클레아제 H) 메커니즘에 관여할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 번역 억제제로서 작용할 수 있다(예를 들어, 번역의 입체 블록을 제공할 수 있음).
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49)을 포함한다.
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 +2 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이의 Rp, Sp, 또는 교호 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49)을 포함한다.
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심 상류의 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49)을 포함한다.
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 가이드 가닥의, 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 두 번째(+2)와 세 번째(+3) 뉴클레오티드 사이에 나타나고 끝에서 두 번째 3' (N-1) 뉴클레오티드에 대해 나타나는 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결을 포함하고, 패신저 가닥은 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49)을 포함한다.
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함한다.
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 +2 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이의 Rp, Sp, 또는 교호 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함한다.
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심 상류의 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함한다.
특정 구현예에서, 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 (+2) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이, 또한 (a) (+3) 뉴클레오티드와 (+4) 뉴클레오티드 사이 및 (b) (+5) 뉴클레오티드와 (+6) 뉴클레오티드 사이 중 하나 또는 둘 모두의 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함한다.
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 가이드 가닥의, 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 두 번째(+2)와 세 번째(+3) 뉴클레오티드 사이에 나타나고 끝에서 두 번째 3' (N-1) 뉴클레오티드에 대해 나타나는 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결을 포함하고, 패신저 가닥은 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함한다.
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49) 및 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함한다.
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 +2 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이의 Rp, Sp, 또는 교호 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49) 및 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함한다.
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심 상류의 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49) 및 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함한다.
특정 구현예에서, 가이드 가닥은 가이드 가닥의, 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 두 번째(+2)와 세 번째(+3) 뉴클레오티드 사이에 나타나고 끝에서 두 번째 3' (N-1) 뉴클레오티드에 대해 나타나는 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결을 포함하고, 패신저 가닥은 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49) 및 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함한다.
특정 구현예에서, RNAi 올리고뉴클레오티드는 표적 게놈 서열 또는 이로부터의 전사체(예를 들어, mRNA(예를 들어, pre-mRNA, 스플라이싱 후 mRNA 등))의, 10개 이상(예를 들어, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상)의 인접 염기와 완전히 또는 실질적으로 동일하거나 완전히 또는 실질적으로 상보적인 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, RNAi 올리고뉴클레오티드는 표적 전사체의 10개 이상(예를 들어, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상)의 인접 염기와 완전히 상보적인 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 인접 염기는 약 15~20개이다. 특정 구현예에서, 인접 염기는 약 20개이다. 특정 구현예에서, RNAi 올리고뉴클레오티드는 표적 전사체(예를 들어, pre-mRNA, RNA 등)와 혼성화할 수 있고, 표적 전사체 및/또는 표적 전사체에 의해 암호화되는 단백질의 수준을 감소시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본원(예를 들어 표 1A, 표 1B, 표 1C, 또는 표 1D)에 개시된 바와 같은 dsRNAi 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본원(예를 들어 표 1B)에 개시된 염기 서열 또는 적어도 10개(예를 들어, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상)의 인접 염기를 포함하는 이의 일부를 갖는 dsRNAi 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것으로, RNAi 올리고뉴클레오티드는 입체무작위적이거나 키랄 제어되지 않고, 각각의 T는 독립적으로 U로 치환될 수 있으며 그 반대도 가능하다.
특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결은 1~5, 1~10, 1~15, 1~20, 1~25, 1~30, 1~40, 1~50개, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결을 포함하거나 이로 구성된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 dsRNAi 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결을 포함하는, dsRNAi 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 dsRNAi 올리고뉴클레오티드가 입체무작위이거나 키랄 제어되지 않는, dsRNAi 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드에서, 적어도 하나의 뉴클레오티드간 연결은 입체무작위이고 적어도 하나의 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어된다.
특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결은 하나 이상의 중성으로 하전된 뉴클레오티드간 연결을 포함하거나 이로 구성된다.
1.1 이중 가닥 올리고뉴클레오티드
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 기재된 바와 같은 다양한 핵염기 및 이의 패턴, 당 및 이의 패턴, 뉴클레오티드간 연결 및 이의 패턴, 및/또는 추가 화학적 모이어티 및 이의 패턴을 포함할 수 있는 다양한 설계의 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 특정 구현예에서, 제공된 dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 유전자 및/또는 하나 이상의 이의 생성물(예를 들어, 전사체, mRNA, 단백질 등)의 발현, 수준, 및/또는 활성의 감소를 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 대상체 또는 환자의 세포에서 유전자 및/또는 하나 이상의 이의 생성물의 발현, 수준, 및/또는 활성의 감소를 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 정상적으로 단백질을 발현하거나 생성한다. 특정 구현예에서, 제공된 dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 표적 유전자 또는 유전자 생성물의 발현, 수준, 및/또는 활성의 감소를 유도할 수 있으며, 본원에 개시된 dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 염기 서열로 이루어지거나, 이를 포함하거나, 이의 일부분(예를 들어, 1~5, 1~10, 1~15, 1~20, 1~25, 1~30, 1~40, 1~50, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 연접 염기들의 스팬)을 포함하는 염기 서열(여기서 각각의 T는 독립적으로 U로 치환될 수 있으며, 그 반대도 가능함)을 가지며, ds 올리고뉴클레오티드는 염기, 당 및/또는 뉴클레오티드간 연결의 적어도 하나의 천연 비-발생 변형을 포함한다.
특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 표적 유전자, 예를 들어, 표적 유전자, 또는 이의 산물의 발현, 수준, 및/또는 활성의 감소를 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 표적 유전자 또는 이의 유전자 생성물의 발현 및/또는 수준의 감소를 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 표적 산물 수준의 감소를 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 표적 유전자의 전사체 수준을 감소시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 표적 유전자의 mRNA 수준을 감소시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 표적 유전자에 의해 암호화되는 단백질 수준을 감소시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 RNA 간섭을 통해 표적 유전자 또는 이의 유전자 생성물의 발현 및/또는 수준의 감소를 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 RNA 간섭 또는 RISC(RNaseH-매개 넉다운 또는 유전자 발현의 입체장애를 포함하지만 이에 한정되지 않음)를 수반하지 않는 생화학적 메카니즘을 통해 표적 유전자 또는 이의 유전자 생성물 발현 및/또는 수준의 감소를 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오티드는 RNA 간섭 및/또는 RNase H 매개 넉다운을 통해 표적 유전자 또는 이의 유전자 생성물의 발현 및/또는 수준의 감소를 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds RNAi 올리고뉴클레오티드는 표적 유전자 mRNA에 결합한 후 번역을 입체적으로 차단하고/하거나 mRNA 스플라이싱 및/또는 엑손 포함 또는 배제를 변경하거나 간섭함으로써 표적 유전자 또는 이의 생성물의 발현 및/또는 수준의 감소를 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 본 발명에 따라 본원에 기재되거나 당업계에 알려진 하나 이상의 구조적 요소, 예를 들어 염기 서열; 변형; 입체화학; 뉴클레오티드간 연결 패턴; GC 함량; 긴 GC 스트레치; 백본 연결 패턴; 백본 키랄 중심 패턴; 백본 인 변형 패턴; 추가 화학적 모이어티(하나 이상의 표적 모이어티, 지질 모이어티, 및/또는 탄수화물 모이어티 등을 포함하나 이에 한정되지 않음); 시드 영역; 시드-후 영역; 5' 말단 구조; 5' 말단 영역; 5' 뉴클레오티드 모이어티; 3' 말단 영역; 3'-말단 디뉴클레오티드; 3' 말단 캡 등을 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 시드 영역은 5' 말단에서부터 세어 2~8번째, 2~7번째, 2~6번째, 3~8번째, 3~7번째, 3~7번째, 또는 4~8번째, 또는 4~7번째 뉴클레오티드이거나 이를 포함하고; 올리고뉴클레오티드의 시드-후 영역은 시드 영역에 대해 바로 다음의 3'에 있는 영역이고, 시드 영역과 3' 말단 영역 사이에 개재되어 있다. 특정 구현예에서, 제공된 조성물은 ds 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 제공된 조성물은 하나 이상의 지질 모이어티, 하나 이상의 탄수화물 모이어티(달리 명시되지 않는 한, 뉴클레오티드간 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드 사슬을 형성하는 뉴클레오시드 단위의 당 모이어티 이외), 및/또는 하나 이상의 표적화 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, ds RNAi 올리고뉴클레오티드는, 표적 유전자 mRNA에 결합한 후 번역을 입체적으로 차단하고/하거나 mRNA 스플라이싱을 변경하거나 간섭함으로써 표적 유전자 또는 이의 생성물의 발현, 수준, 및/또는 활성의 감소를 유도할 수 있다. 그러나, 그럼에도 불구하고, 본 발명은 임의의 특정 메커니즘에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 본 발명은 이중 가닥 RNA 간섭, 단일 가닥 RNA 간섭, RNase H 매개 넉다운, 번역의 입체장애, 또는 2가지 이상의 이러한 메커니즘의 조합을 통해 작동할 수 있는 ds 올리고뉴클레오티드, 조성물, 방법 등을 제공한다.
특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 본원에, 예를 들어 표 1A 또는 표 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D에 기술된 구조적 요소 또는 이의 일부를 포함한다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 본원에 기술된 염기 서열(또는 이의 일부)(여기서 각각의 T는 독립적으로 U로 치환될 수 있으며, 그 반대도 가능함), 화학적 변형 또는 화학적 변형 패턴(또는 이의 일부), 및/또는 포맷 또는 이의 일부(본원에 기술됨)를 포함한다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 염기 서열을 가지며, 이는 본원에, 예를 들어 표 1A 또는 표 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D에 개시된, 또는 달리 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드의 염기 서열(또는 이의 일부)(여기서 각각의 T는 독립적으로 U로 치환될 수 있으며, 그 반대도 가능함), 화학적 변형 패턴(또는 이의 일부), 및/또는 포맷을 포함한다. 특정 구현예에서, 이러한 ds 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 유전자, 예를 들어 유전자 또는 이의 유전자 생성물의 발현, 수준, 및/또는 활성을 감소시킨다.
특히, 제공된 dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 이의 표적 핵산(예를 들어, pre-mRNA, 성숙 mRNA 등)에 혼성화될 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 DNA 가닥(유전자의 어느 한 가닥)으로부터 유래된 핵산에 혼성화될 수 있다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 전사체에 혼성화될 수 있다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 프리-mRNA 또는 성숙 mRNA를 포함하지만 이에 한정되지 않는 RNA 프로세싱의 임의의 단계의 표적 핵산에 혼성화될 수 있다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 또는 이의 보체의 임의의 요소(프로모터 영역, 인핸서 영역, 전사 종결 영역, 번역 시작 신호, 번역 종결 신호, 암호화 영역, 비암호화 영역, 엑손, 인트론, 인트론/엑손 또는 엑손/인트론 접합부, 5' UTR, 또는 3' UTR을 포함하지만, 이에 한정되지 않음)에 혼성화될 수 있다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 최대 2개의 불일치로 이의 표적에 혼성화될 수 있다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 최대 1개의 불일치로 이의 표적에 혼성화될 수 있다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 불일치 없이 이의 표적에 혼성화될 수 있다(예를 들어, 모든 C-G 및/또는 A-T/U 염기쌍 형성 시).
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 전사체의 2가지 이상의 변이체에 혼성화될 수 있다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 전사체의 2가지 이상의 또는 모든 변이체에 혼성화될 수 있다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥으로부터 유래된 전사체의 2가지 이상의 또는 모든 변이체에 혼성화될 수 있다.
특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 표적은 mRNA가 아닌 RNA이다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 증가된 수준의 하나 이상의 동위원소를 함유한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 하나 이상의 원소, 예를 들어 수소, 탄소, 질소 등의 하나 이상의 동위원소로 표지된다. 특정 구현예에서, 제공된 조성물 내의 ds 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 dsRNAi 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 복수의 조성물의 ds 올리고뉴클레오티드는 염기 변형, 당 변형, 및/또는 뉴클레오티드간 연결 변형을 포함하고, ds 올리고뉴클레오티드는 강화된 수준의 중수소를 함유한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 RNAi 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 위치에서 중수소로 표지된다(-1H를 -2H로 대체). 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 사슬 또는 ds 올리고뉴클레오티드 사슬에 접합된 임의의 모이어티(예를 들어, 표적화 모이어티 등)의 하나 이상의 1H는 2H로 치환된다. 이러한 ds 올리고뉴클레오티드는 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 복수의 ds 올리고뉴클레오티드를 포함하는 ds 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공하며, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는
1) 전사체에서 표적 서열(예를 들어, 표적 서열)에 상보성인 공통 염기 서열을 갖고;
2) 하나 이상의 변형 당 모이어티 및/또는 변형 뉴클레오티드간 연결을 포함한다.
특정 구현예에서, 공통 염기 서열을 갖는 dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오시드 변형, 예를 들어, 당 변형, 염기 변형 등의 동일한 패턴을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 뉴클레오시드 변형의 패턴은 위치 및 변형의 조합에 의해 표시될 수 있다. 특정 구현예에서, 백본 연결 패턴은 각각의 뉴클레오티드간 연결의 위치 및 유형(예를 들어, 포스페이트, 포스포로티오에이트, 치환 포스포로티오에이트 등)을 포함한다.
특정 구현예에서, 예를 들어 제공된 조성물 내, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는 동일한 ds 올리고뉴클레오티드 유형의 것이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 유형의 ds 올리고뉴클레오티드는 공통 당 변형 패턴을 갖는다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 유형의 ds 올리고뉴클레오티드는 공통 염기 변형 패턴을 갖는다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 유형의 ds 올리고뉴클레오티드는 공통 뉴클레오시드 변형 패턴을 갖는다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 유형의 ds 올리고뉴클레오티드는 동일한 구성을 갖는다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 유형의 ds 올리고뉴클레오티드는 동일하다. 특정 구현예에서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는 동일하다. 특정 구현예에서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는 동일한 구성을 공유한다.
특정 구현예에서, 본원에 예시된 바와 같이, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결을 포함하며 키랄 제어된다. 특정 구현예에서, ds RNAi 올리고뉴클레오티드는 입체화학적으로 순수하다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 다른 입체이성체로부터 분리된다.
특정 구현예에서, RNAi 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형 핵염기, 하나 이상의 변형 당, 및/또는 하나 이상의 변형 뉴클레오티드간 연결을 포함한다.
특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형 당을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 ds 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형 핵염기를 포함한다. 본 발명에 따라 당 및/또는 핵염기에 다양한 변형이 도입될 수 있다. 예를 들어 특정 구현예에서, 변형은 US 9006198에 기재된 변형이다. 특정 구현예에서, 변형은 US 9394333, US 9744183, US 9605019, US 9598458, US 9982257, US 10160969, US 10479995, US 2020/0056173, US 2018/0216107, US 2019/0127733, US 10450568, US 2019/0077817, US 2019/0249173, US 2019/0375774, WO 2018/223056, WO 2018/223073, WO 2018/223081, WO 2018/237194, WO 2019/032607, WO 2019/055951, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, 및/또는 WO 2019/032612에 기재된 변형이고, 각각의 당, 염기, 및 뉴클레오티드간 연결 변형은 독립적으로 본원에 참조로 포함된다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 특정 구현예에서, "하나 이상"은 1~200, 1~150, 1~100, 1~90, 1~80, 1~70, 1~25, 1~50, 1~40, 1~30, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개이다. 특정 구현예에서, "하나 이상"은 1개이다. 특정 구현예에서, "하나 이상"은 2개이다. 특정 구현예에서, "하나 이상"은 3개이다. 특정 구현예에서, "하나 이상"은 4개이다. 특정 구현예에서, "하나 이상"은 5개이다. 특정 구현예에서, "하나 이상"은 6개이다. 특정 구현예에서, "하나 이상"은 7개이다. 특정 구현예에서, "하나 이상"은 8개이다. 특정 구현예에서, "하나 이상"은 9개이다. 특정 구현예에서, "하나 이상"은 10개이다. 특정 구현예에서, "하나 이상"은 적어도 1개이다. 특정 구현예에서, "하나 이상"은 적어도 2개이다. 특정 구현예에서, "하나 이상"은 적어도 3개이다. 특정 구현예에서, "하나 이상"은 적어도 4개이다. 특정 구현예에서, "하나 이상"은 적어도 5개이다. 특정 구현예에서, "하나 이상"은 적어도 6개이다. 특정 구현예에서, "하나 이상"은 적어도 7개이다. 특정 구현예에서, "하나 이상"은 적어도 8개이다. 특정 구현예에서, "하나 이상"은 적어도 9개이다. 특정 구현예에서, "하나 이상"은 적어도 10개이다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 특정 구현예에서, "적어도 하나"는 1~200, 1~150, 1~100, 1~90, 1~80, 1~70, 1~60, 1~50, 1~40, 1~30, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 21,22, 23, 24, 또는 25개이다. 특정 구현예에서, "적어도 하나"는 1개이다. 특정 구현예에서, "적어도 하나"는 2개이다. 특정 구현예에서, "적어도 하나"는 3개이다. 특정 구현예에서, "적어도 하나"는 4개이다. 특정 구현예에서, "적어도 하나"는 5개이다. 특정 구현예에서, "적어도 하나"는 6개이다. 특정 구현예에서, "적어도 하나"는 7개이다. 특정 구현예에서, "적어도 하나"는 8개이다. 특정 구현예에서, "적어도 하나"는 9개이다. 특정 구현예에서, "적어도 하나"는 10개이다.
특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 표 1A 또는 표 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D에 기재된 dsRNAi 올리고뉴클레오티드이거나 이를 포함한다.
본 발명에서 입증된 바와 같이, 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드(예를 들어, dsRNAi 올리고뉴클레오티드)는 넉다운 시스템에서 전사체와 접촉될 때 이의 표적(예를 들어, 표적 올리고뉴클레오티드에 대한 전사체)의 넉다운을 특징으로 한다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 염 형태로 제공된다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 이의 염 형태로 존재하는 음으로 하전된 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결, 천연 포스페이트 연결 등)을 포함하는 염으로 제공된다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 제약상 허용되는 염으로 제공된다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 금속염으로 제공된다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 나트륨염으로 제공된다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 금속염, 예를 들어 나트륨염으로 제공되며, 음으로 하전된 각각의 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 염 형태(예를 들어, 나트륨염에 있어서, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결의 경우 -O-P(O)(SNa)-O-, 천연 포스페이트 연결의 경우 -O-P(O)(ONa)-O- 등)이다.
1.2 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 영역
1.2.1 염기서열
특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 본원에 기재된 염기 서열 또는 이의 일부(예를 들어, 5~50, 5~40, 5~30, 5~20개, 또는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 20개, 또는 적어도 10개, 적어도 15개의 연접 핵염기의 스팬)를 포함하며(0~5개(예를 들어, 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개)의 불일치가 있음), 각각의 T는 독립적으로 U로 치환될 수 있고 그 반대도 가능하다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 본원에 기재된 염기 서열 또는 이의 일부를 포함하며, 일부는 적어도 10개의 연접 핵염기의 스팬, 또는 1~5개의 불일치가 있는 적어도 15개의 연접 핵염기의 스팬이다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 본원에 기재된 염기 서열, 또는 이의 일부를 포함하며, 일부는 적어도 10개의 연접 핵염기의 스팬, 또는 1~5개의 불일치가 있는 적어도 10개의 연접 핵염기의 스팬이고, 각각의 T는 독립적으로 U로 치환될 수 있고 그 반대도 가능하다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 염기 서열은 유전자 또는 이의 전사체(예를 들어, mRAN)의 염기 서열과 동일하거나 이에 대하여 상보적인 염기 서열의 10~50개(예를 들어, 약 또는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45개; 특정 구현예에서, 적어도 15개; 특정 구현예에서, 적어도 16개; 특정 구현예에서, 적어도 17개; 특정 구현예에서, 적어도 18개; 특정 구현예에서, 적어도 19개; 특정 구현예에서, 적어도 20개; 특정 구현예에서, 적어도 21개; 특정 구현예에서, 적어도 22개; 특정 구현예에서, 적어도 23개; 특정 구현예에서, 적어도 24개; 특정 구현예에서, 적어도 25개)의 연접 염기를 포함하거나 이로 구성된다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 가이드 가닥의 염기 서열은 일반적으로, 표적-특이적 넉다운을 매개하기에 충분한 길이 및 이의 표적, 예를 들어 RNA 전사체(예를 들어, 프리-mRNA, 성숙 mRNA 등)에 대한 상보성을 갖는다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드 가이드 가닥의 염기 서열은 표적-특이적 넉다운을 매개하기에 충분한 길이 및 전사체 표적에 대한 동일성을 갖는다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드 가이드 가닥은 전사체(전사체 표적 서열)의 일부에 상보적이다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 염기 서열은 표 1A 또는 표 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D에 개시된 ds 올리고뉴클레오티드의 염기 서열과 90% 이상의 동일성을 가지며, 각각의 T는 독립적으로 U로 치환될 수 있고 그 반대도 가능하다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 염기 서열은 표 1A 또는 표 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D에 개시된 올리고뉴클레오티드의 염기 서열과 95% 이상의 동일성을 가지며, 각각의 T는 독립적으로 U로 치환될 수 있고 그 반대도 가능하다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 염기 서열은 표 1A 또는 표 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D에 개시된 올리고뉴클레오티드의 15개 이상의 염기의 연속 스팬을 포함하고, 각각의 T는 독립적으로 U로 치환될 수 있으며 그 반대도 가능하나, 스팬 내의 하나 이상의 염기가 비염기성인(예를 들어, 핵염기가 뉴클레오티드에 부재하는) 경우는 제외된다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 염기 서열은 본원에 개시된 dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 19개 이상의 염기의 연속 스팬을 포함하나, 스팬 내의 하나 이상의 염기가 비염기성인(예를 들어, 핵염기가 뉴클레오티드에 부재하는) 경우는 제외된다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 염기 서열은 본원에 개시된 ds 올리고뉴클레오티드의 19개 이상의 염기의 연속 스팬을 포함하고, 염기 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에서의 1개 또는 2개의 염기의 차이를 제외하고, 각각의 T는 독립적으로 U로 치환될 수 있고 그 반대도 가능하다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 ds 올리고뉴클레오티드의 염기 서열을 포함하는 염기 서열을 갖는 ds 올리고뉴클레오티드에 관한 것으로, 각각의 T는 독립적으로 U로 대체될 수 있고 그 반대도 가능하다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 ds 올리고뉴클레오티드의 염기 서열의 적어도 15개의 연접 염기를 포함하는 염기 서열을 갖는 ds 올리고뉴클레오티드에 관한 것으로, 각각의 T는 독립적으로 U로 대체될 수 있고 그 반대도 가능하다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 ds 올리고뉴클레오티드의 염기 서열과 적어도 90% 동일한 염기 서열을 갖는 ds 올리고뉴클레오티드에 관한 것으로, 각각의 T는 독립적으로 U로 대체될 수 있고 그 반대도 가능하다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 ds 올리고뉴클레오티드의 염기 서열과 적어도 95% 동일한 염기 서열을 갖는 ds 올리고뉴클레오티드에 관한 것으로, 각각의 T는 독립적으로 U로 대체될 수 있고 그 반대도 가능하다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 염기 서열은 본원에 기재된 임의의 ds 올리고뉴클레오티드의 염기 서열이거나, 이를 포함하거나, 이의 10~20개, 예를 들어10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 연접 염기를 포함하고, 각각의 T는 독립적으로 U로 대체될 수 있고 그 반대도 가능하다.
특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 표 1A 또는 표 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D로부터 선택된다.
특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 2개 이상 또는 모든 대립유전자(관련 시스템에 다중 대립유전자가 존재하는 경우)를 표적화한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 야생형 대립유전자 및 돌연변이 대립유전자, 및/또는 이의 전사체 및/또는 생성물의 발현, 수준, 및/또는 활성을 감소시킨다.
특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드의 염기 서열은 인간 및 비인간 영장류(NHP) 표적 서열 모두에 완전히 상보적이다. 특정 구현예에서, 이러한 서열은 인간 및 비인간 영장류 모두에서 쉽게 평가될 수 있으므로 특히 유용할 수 있다.
특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 표 1A 또는 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D에 기재된 염기 서열 또는 이의 일부(각각의 T는 독립적으로 U로 대체될 수 있고 그 반대도 가능함), 및/또는 표 1A 또는 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D에 기재된 당, 핵염기, 및/또는 뉴클레오티드간 연결 변형 및/또는 입체화학, 및/또는 이의 패턴, 및/또는 표 1A 또는 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D에 기재된 추가 화학적 모이어티(올리고뉴클레오티드 사슬 외에도, 예를 들어 표적 모이어티, 지질 모이어티, 탄수화물 모이어티 등)를 포함한다.
특정 구현예에서, "상보적", "완전히 상보적" 및 "실질적으로 상보적"이라는 용어는 이들이 사용된 문맥에서 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, ds 올리고뉴클레오티드(예를 들어, dsRNAi 올리고뉴클레오티드) 염기 서열과 표적 서열 사이의 염기 일치와 관련하여 사용될 수 있다. U를 T로 치환하거나 그 반대의 경우도 일반적으로 상보성의 양을 변경시키지 않는다는 점에 유의한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 표적 서열에 대하여 "실질적으로 상보적"인 ds 올리고뉴클레오티드는 대체로 또는 대부분 상보적이지만 100% 상보적인 것은 아니다. 특정 구현예에서, 실질적으로 상보적인 서열(예를 들어, dsRNAi 올리고뉴클레오티드)은 표적 서열에 정렬될 때 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 불일치를 갖는다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 표적 서열에 실질적으로 상보적인 염기 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 본원에 개시된 dsRNAi 올리고뉴클레오티드 서열의 보체에 실질적으로 상보적인 염기 서열을 갖는다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 서열은 ds 올리고뉴클레오티드가 기능(예를 들어, 표적 핵산의 넉다운)을 수행하기 위해 표적에 대해 100% 상보적일 필요는 없다. 전형적으로 상보성을 결정할 때, A와 T(또는 U)가 상보적 핵염기이고, C와 G가 상보적 핵염기이다.
특정 구현예에서, "일부"(예를 들어, 염기 서열 또는 변형 패턴의 일부)는 길이가 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 단량체 단위(예를 들어, 염기 서열의 경우, 길이가 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 염기)이다. 특정 구현예에서, 염기 서열의 "일부"는 적어도 5개 염기의 길이이다. 특정 구현예에서, 염기 서열의 "일부"는 적어도 10개 염기의 길이이다. 특정 구현예에서, 염기 서열의 "일부"는 적어도 15개 염기의 길이이다. 특정 구현예에서, 염기 서열의 "일부"는 적어도 16, 17, 18, 19, 또는 20개 염기의 길이이다. 특정 구현예에서, 염기 서열의 "일부"는 적어도 20개 염기의 길이이다. 특정 구현예에서, 염기 서열의 일부는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19개 이상의 연접(연속) 염기이다. 특정 구현예에서, 염기 서열의 일부는 15개 이상의 연접(연속) 염기이다. 특정 구현예에서, 염기 서열의 일부는 16, 17, 18, 19, 또는 20개 이상의 연접(연속) 염기이다. 특정 구현예에서, 염기 서열의 일부는 20개 이상의 연접(연속) 염기이다.
특정 구현예에서, 일부는 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 총 뉴클레오티드의 스팬이다. 특정 구현예에서, 일부는 0~3개의 불일치를 갖는 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 총 뉴클레오티드의 스팬이다. 특정 구현예에서, 일부는 0~3개의 불일치를 갖는 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 총 뉴클레오티드의 스팬이며, 0개의 불일치를 갖는 스팬은 상보적이고, 1개 이상의 불일치를 갖는 스팬은 실질적 상보성의 비제한적 예이다. 특정 구현예에서, 염기는 핵산(예를 들어, 유전자)의 특징적인 일부를 포함하며, 이는 상기 일부가 상기 핵산 또는 이의 전사체의 일부와 동일하거나 상보적이고, 동일 게놈에서의 임의의 다른 핵산(예를 들어, 유전자) 또는 이의 전사체의 일부와는 동일하지 않거나 상보적이지 않다는 점에서 그러하다. 특정 구현예에서, 일부는 인간 dsRNAi의 특징이다.
특정 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 본원에 기술된 바와 같이 최대 약 49, 45, 40, 30, 35, 25, 또는 23개 총 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 본원에 인용된 서열이 5'-말단에서 U 또는 T로로 시작하는 특정 구현예에서, U는 결실되고/되거나 또 다른 염기로 대체될 수 있다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 입체무작위이다. 특정 구현예에서, RNAi 올리고뉴클레오티드는 키랄 제어된다. 특정 구현예에서, ds RNAi 올리고뉴클레오티드는 키랄적으로 순수하고(또는 "입체순수", "입체화학적으로 순수"), ds 올리고뉴클레오티드는 단일 입체이성체 형태(많은 경우, ds 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 연결 인, 당 탄소 등에 다중 키랄 중심이 존재할 수 있기 때문에 단일 부분입체이성체(diastereoisomeric 또는 diastereomeric) 형태)로 존재한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 키랄 순수 ds 올리고뉴클레오티드는 (화학적 및 생물학적 과정, 선택성 및/또는 정제 등이 절대적으로 완결되는 것이 드물기 때문에 일부 불순물이 존재할 수 있는 정도까지) 다른 입체이성체 형태로부터 분리된다. 키랄 순수 ds 올리고뉴클레오티드에서, 각각의 키랄 중심은 독립적으로 배열에 대해 정의된다(키랄 순수 ds 올리고뉴클레오티드에 대해, 각각의 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 입체정의되거나 키랄 조절됨). 입체정의된 연결 인을 포함하는 키랄 제어 및 키랄 순수 ds 올리고뉴클레오티드와 대조적으로, 키랄 연결 인을 포함하는 라세미(또는 "입체무작위", "비-키랄 제어") ds 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 기존의 황화와 조합된 커플링 단계 동안 입체화학적 제어가 없는 기존의 포스포아미다이트 올리고뉴클레오티드 합성(입체무작위 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 생성)에서 유래된 것)는 다양한 입체이성체(ds 올리고뉴클레오티드에는 다중 키랄 중심이 있기 때문에 일반적으로 부분입체이성체(diastereoisomer 또는 diastereomer); 예를 들어 뉴클레오시드 및 연결 인에 있는 것 외에 키랄 요소를 포함하지 않는 시약을 사용하는 기존의 ds 올리고뉴클레오티드 제조에서 유래된 것)의 무작위 혼합물을 지칭한다. 예를 들어, A*A*A(여기서, *는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결(이는 키랄 연결 인을 포함함)임)의 경우, 라세미 올리고뉴클레오티드 제제는 다음의 4가지 부분입체이성체를 포함한다[22 = 4, 상기 2개의 키랄 연결 인을 고려하면, 이들 각각은 두 배열(Sp 또는 Rp) 중 하나로 존재할 수 있음]: A *S A *S A, A *S A *R A, A *R A *S A, 및 A *R A *R A(여기서, *S는 Sp 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 나타내며, *R은 Rp 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 나타냄). 키랄 순수 올리고뉴클레오티드(예를 들어, A *S A *S A)의 경우, 이는 단일 입체이성체 형태로 존재하고 다른 입체이성체(예를 들어, 부분입체이성체 A *S A *R A, A *R A *S A, 및 A *R A *R A)로부터 분리된다.
특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 입체무작위 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, 기존의 비-키랄 제어 올리고뉴클레오티드 합성에서 유래된, 뉴클레오티드간 연결에서 Rp 및 Sp 연결 인의 혼합물)을 포함한다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 하나 이상(예를 들어, 1~50, 1~40, 1~30, 1~25, 1~20, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상)의 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, 키랄 제어 올리고뉴클레오티드 합성에서 유래된, 뉴클레오티드간 연결에서 Rp 또는 Sp 연결 인)을 포함한다.
특정 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 입체무작위 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이다.
특히, 본 발명은 키랄 제어(특정 구현예에서, 입체화학적 순수) ds 올리고뉴클레오티드의 제조 기술을 제공한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 입체화학적으로 순수하다. 특정 구현예에서, 본 발명의 ds 올리고뉴클레오티드는 약 5%~100%, 10%~100%, 20%~100%, 30%~100%, 40%~100%, 50%~100%, 60%~100%, 70%~100%, 80~100%, 90~100%, 95~100%, 50%~90%, 또는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%, 또는 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 순수하다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결은 하나 이상(예를 들어, 1~50, 1~40, 1~30, 1~25, 1~20, 5~50, 5~40, 5~30, 5~25, 5~20, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상)의 키랄 뉴클레오티드간 연결을 포함하거나 이로 구성되며, 이들 각각은 독립적으로 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5%, 전형적으로 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%의 부분입체순도를 갖는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 ds 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 (DS)CIL의 부분입체순도를 가지며, DS는 본 발명에 기재된 바와 같은 부분입체순도(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 이상)이고, CIL은 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 수(예를 들어, 1~50, 1~40, 1~30, 1~25, 1~20, 5~50, 5~40, 5~30, 5~25, 5~20, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 이상)이다. 특정 구현예에서, DS는 95%~100%이다. 특정 구현예에서, 각각의 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 키랄 제어되며, CIL은 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 수이다.
예로서, 특정 예시적인 염기 서열, 핵염기 변형 및 이의 패턴, 당 변형 및 이의 패턴, 뉴클레오티드간 연결 및 이의 패턴, 연결 인 입체화학 및 이의 패턴, 링커, 및/또는 추가 화학적 모이어티 등을 포함하는 특정 dsRNAi 올리고뉴클레오티드가 하기 표 1A 또는 표 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D에 제시되어 있다. 특히, ds 올리고뉴클레오티드(예를 들어 표 1A의 ds 올리고뉴클레오티드)는 전사체를 표적화하기 위해, 예를 들어 전사체 및/또는 이의 생성물의 수준을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
표 1A. 인자 VII를 표적화하는 예시적인 올리고뉴클레오티드/조성물
ID 설명 네이키드 서열 입체화학/연결
WV-34349 mU*fU*mAfAmGfAmCfUmUfGmAmGmAfUmGfAmUfCmCfUmG*mG*mC UUAAGACUUGAGAUGAUCCUGGC XXOOOOOOOOOOOOOOOOOOXX
WV-34350 fC*mA*fGmGfAmUfCmAfUfCfUmCfAmAfGmUfCmUfUmAfAL001Mod001 CAGGAUCAUCUCAAGUCUUAA XXOOOOOOOOOOOOOOOOOOO
WV-34351 mU*SfU*SmAfAmGfAmCfUmUfGmAmGmAfUmGfAmUfCmCfUmG*SmG*SmC UUAAGACUUGAGAUGAUCCUGGC SSOOOOOOOOOOOOOOOOOOSS
WV-34352 mU*RfU*SmAfAmGfAmCfUmUfGmAmGmAfUmGfAmUfCmCfUmG*SmG*SmC UUAAGACUUGAGAUGAUCCUGGC RSOOOOOOOOOOOOOOOOOOSS
WV-34353 mU*SfU*RmAfAmGfAmCfUmUfGmAmGmAfUmGfAmUfCmCfUmG*SmG*SmC UUAAGACUUGAGAUGAUCCUGGC SROOOOOOOOOOOOOOOOOOSS
WV-34354 mU*RfU*RmAfAmGfAmCfUmUfGmAmGmAfUmGfAmUfCmCfUmG*SmG*SmC UUAAGACUUGAGAUGAUCCUGGC RROOOOOOOOOOOOOOOOOOSS
WV-34355 mU*SfU*SmAfAmGfAmCfUmUfGmAmGmAfUmGfAmUfCmCfUmG*RmG*SmC UUAAGACUUGAGAUGAUCCUGGC SSOOOOOOOOOOOOOOOOOORS
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WV-34357 mU*SfU*RmAfAmGfAmCfUmUfGmAmGmAfUmGfAmUfCmCfUmG*RmG*SmC UUAAGACUUGAGAUGAUCCUGGC SROOOOOOOOOOOOOOOOOORS
WV-34358 mU*RfU*RmAfAmGfAmCfUmUfGmAmGmAfUmGfAmUfCmCfUmG*RmG*SmC UUAAGACUUGAGAUGAUCCUGGC RROOOOOOOOOOOOOOOOOORS
WV-34359 mU*SfU*SmAfAmGfAmCfUmUfGmAmGmAfUmGfAmUfCmCfUmG*SmG*RmC UUAAGACUUGAGAUGAUCCUGGC SSOOOOOOOOOOOOOOOOOOSR
WV-34360 mU*RfU*SmAfAmGfAmCfUmUfGmAmGmAfUmGfAmUfCmCfUmG*SmG*RmC UUAAGACUUGAGAUGAUCCUGGC RSOOOOOOOOOOOOOOOOOOSR
WV-34361 mU*SfU*RmAfAmGfAmCfUmUfGmAmGmAfUmGfAmUfCmCfUmG*SmG*RmC UUAAGACUUGAGAUGAUCCUGGC SROOOOOOOOOOOOOOOOOOSR
WV-34362 mU*RfU*RmAfAmGfAmCfUmUfGmAmGmAfUmGfAmUfCmCfUmG*SmG*RmC UUAAGACUUGAGAUGAUCCUGGC RROOOOOOOOOOOOOOOOOOSR
WV-34363 mU*SfU*SmAfAmGfAmCfUmUfGmAmGmAfUmGfAmUfCmCfUmG*RmG*RmC UUAAGACUUGAGAUGAUCCUGGC SSOOOOOOOOOOOOOOOOOORR
WV-34364 mU*RfU*SmAfAmGfAmCfUmUfGmAmGmAfUmGfAmUfCmCfUmG*RmG*RmC UUAAGACUUGAGAUGAUCCUGGC RSOOOOOOOOOOOOOOOOOORR
WV-34365 mU*SfU*RmAfAmGfAmCfUmUfGmAmGmAfUmGfAmUfCmCfUmG*RmG*RmC UUAAGACUUGAGAUGAUCCUGGC SROOOOOOOOOOOOOOOOOORR
WV-34366 mU*RfU*RmAfAmGfAmCfUmUfGmAmGmAfUmGfAmUfCmCfUmG*RmG*RmC UUAAGACUUGAGAUGAUCCUGGC RROOOOOOOOOOOOOOOOOORR
WV-34367 fC*SmA*SfGmGfAmUfCmAfUfCfUmCfAmAfGmUfCmUfUmAfAL001Mod001 CAGGAUCAUCUCAAGUCUUAA SSOOOOOOOOOOOOOOOOOOO
WV-34368 fC*RmA*SfGmGfAmUfCmAfUfCfUmCfAmAfGmUfCmUfUmAfAL001Mod001 CAGGAUCAUCUCAAGUCUUAA RSOOOOOOOOOOOOOOOOOOO
WV-34369 fC*SmA*RfGmGfAmUfCmAfUfCfUmCfAmAfGmUfCmUfUmAfAL001Mod001 CAGGAUCAUCUCAAGUCUUAA SROOOOOOOOOOOOOOOOOOO
WV-34370 fC*RmA*RfGmGfAmUfCmAfUfCfUmCfAmAfGmUfCmUfUmAfAL001Mod001 CAGGAUCAUCUCAAGUCUUAA RROOOOOOOOOOOOOOOOOOO
표 1B. mTTR을 표적화하는 예시적인 올리고뉴클레오티드 및/또는 조성물
ID 설명 네이키드 서열 입체화학/연결
WV-20167 mU*fU*mAfUmAfGmAfGmCfAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmU*mU*mU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU XXOOOOOOOOOOOOOOOOOOXX
WV-20169 mU*SfU*SmAfUmAfGmAfGmCfAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmU*SmU*SmU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU SSOOOOOOOOOOOOOOOOOOSS
WV-20170 mU*RfU*SmAfUmAfGmAfGmCfAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmU*SmU*SmU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU RSOOOOOOOOOOOOOOOOOOSS
WV-20171 mU*SfU*RmAfUmAfGmAfGmCfAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmU*SmU*SmU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU SROOOOOOOOOOOOOOOOOOSS
WV-20172 mU*RfU*RmAfUmAfGmAfGmCfAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmU*SmU*SmU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU RROOOOOOOOOOOOOOOOOOSS
WV-20173 mU*SfU*SmAfUmAfGmAfGmCfAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmU*RmU*SmU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU SSOOOOOOOOOOOOOOOOOORS
WV-20174 mU*RfU*SmAfUmAfGmAfGmCfAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmU*RmU*SmU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU RSOOOOOOOOOOOOOOOOOORS
WV-20175 mU*SfU*RmAfUmAfGmAfGmCfAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmU*RmU*SmU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU SROOOOOOOOOOOOOOOOOORS
WV-20176 mU*RfU*RmAfUmAfGmAfGmCfAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmU*RmU*SmU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU RROOOOOOOOOOOOOOOOOORS
WV-20177 mU*SfU*SmAfUmAfGmAfGmCfAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmU*SmU*RmU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU SSOOOOOOOOOOOOOOOOOOSR
WV-20178 mU*RfU*SmAfUmAfGmAfGmCfAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmU*SmU*RmU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU RSOOOOOOOOOOOOOOOOOOSR
WV-20179 mU*SfU*RmAfUmAfGmAfGmCfAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmU*SmU*RmU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU SROOOOOOOOOOOOOOOOOOSR
WV-20180 mU*RfU*RmAfUmAfGmAfGmCfAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmU*SmU*RmU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU RROOOOOOOOOOOOOOOOOOSR
WV-20181 mU*SfU*SmAfUmAfGmAfGmCfAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmU*RmU*RmU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU SSOOOOOOOOOOOOOOOOOORR
WV-20182 mU*RfU*SmAfUmAfGmAfGmCfAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmU*RmU*RmU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU RSOOOOOOOOOOOOOOOOOORR
WV-20183 mU*SfU*RmAfUmAfGmAfGmCfAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmU*RmU*RmU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU SROOOOOOOOOOOOOOOOOORR
WV-20184 mU*RfU*RmAfUmAfGmAfGmCfAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmU*RmU*RmU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU RROOOOOOOOOOOOOOOOOORR
WV-28310 fA*mA*fCmAfGmUfGmUfUfCfUmUfGmCfUmCfUmAfUmAfAL001Mod001 AACAGUGUUCUUGCUCUAUAA XXOOOOOOOOOOOOOOOOOOO
WV-28311 fA*SmA*SfCmAfGmUfGmUfUfCfUmUfGmCfUmCfUmAfUmAfAL001Mod001 AACAGUGUUCUUGCUCUAUAA SSOOOOOOOOOOOOOOOOOOO
WV-28312 fA*RmA*SfCmAfGmUfGmUfUfCfUmUfGmCfUmCfUmAfUmAfAL001Mod001 AACAGUGUUCUUGCUCUAUAA RSOOOOOOOOOOOOOOOOOOO
WV-28313 fA*SmA*RfCmAfGmUfGmUfUfCfUmUfGmCfUmCfUmAfUmAfAL001Mod001 AACAGUGUUCUUGCUCUAUAA SROOOOOOOOOOOOOOOOOOO
WV-28314 fA*RmA*RfCmAfGmUfGmUfUfCfUmUfGmCfUmCfUmAfUmAfAL001Mod001 AACAGUGUUCUUGCUCUAUAA RROOOOOOOOOOOOOOOOOOO
WV-36831 mUn001fUn001mAfUmAfGmAfGmCfAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmU*mU*mU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU nXnXOOOOOOOOOOOOOOOOOOXX
WV-36832 mU*fU*mAfUmAfGmAfGmCfAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmUn001mUn001mU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU XXOOOOOOOOOOOOOOOOOOnXnX
WV-36833 mUn001fU*mAfUmAfGmAfGmCfAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmU*mUn001mU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU nXXOOOOOOOOOOOOOOOOOOXnX
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WV-36836 mUn001fU*mAfUmAfGmAfGmCfAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmU*mU*mU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU nXXOOOOOOOOOOOOOOOOOOXX
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WV-36838 mU*fU*mAn001fUmAfGmAfGmCfAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmU*mU*mU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU XXnXOOOOOOOOOOOOOOOOOXX
WV-36839 mU*fU*mAfUn001mAfGmAfGmCfAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmU*mU*mU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU XXOnXOOOOOOOOOOOOOOOOXX
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WV-36843 mU*fU*mAfUmAfGmAfGn001mCfAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmU*mU*mU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU XXOOOOOnXOOOOOOOOOOOOXX
WV-36844 mU*fU*mAfUmAfGmAfGmCn001fAmAmGmAfAmCfAmCfUmGfUmU*mU*mU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU XXOOOOOOnXOOOOOOOOOOOXX
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표 1C. mTTR을 표적화하는 예시적인 올리고뉴클레오티드 및/또는 조성물
ID 설명 네이키드 서열 입체화학/연결
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WV-44461 mU*SfU*RmAmUmAfGmAmGmCmAmAmGmAfAmCfAmCmUmGmUmUmUn001SmU UUAUAGAGCAAGAACACUGUUUU SROOOOOOOOOOOOOOOOOOOnS
표 1D. PTEN을 표적화하는 예시적인 올리고뉴클레오티드 및/또는 조성물
ID 설명 네이키드 서열 입체화학/연결
WV-40398 fU*fA*mUfAmGfUmUfUmCfAmAmAmCfAmUfCmAfUmC*mU*mU UAUAGUUUCAAACAUCAUCUU XXOOOOOOOOOOOOOOOOXX
WV-40399 mGmAfUmGfAmUfGfUfUmUfGmAfAmAfCmUfAmUfA GAUGAUGUUUGAAACUAUA OOOOOOOOOOOOOOOOOO
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WV-43231 fU*SfA*RmUn001SfAmG*SfUmUn001SfU*SmC*SfA*SmA*SmA*SmC*SfA*SmU*SfC*SmA*SfUn001SmC*SmU*SmU UAUAGUUUCAAACAUCAUCUU SRnSOSOnSSSSSSSSSSSnSSS
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WV-43234 mG*SmA*SfU*SmG*SfAn001RmUfGfUfUmUfGmAfAn001RmA*SfC*SmU*SfA*SmU*SfA GAUGAUGUUUGAAACUAUA SSSSnROOOOOOOnRSSSSS
WV-43235 mG*SmA*SfU*SmG*SfAn001RmU*SfG*SfU*SfUmUfGmAfAn001RmAfCmUfAmU*SfA GAUGAUGUUUGAAACUAUA SSSSnRSSSOOOOnROOOOS
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WV-42309 fU*RfA*SmUn001SfAmGfUmUn001SfUmCfAmAmAmC*SfA*SmU*SfC*SmA*SfUn001SmC*SmU*SmU UAUAGUUUCAAACAUCAUCUU RSnSOOOnSOOOOOSSSSSnSSS
주:
설명, 염기 서열, 및 입체화학/연결은 이들의 길이로 인해 표 1A~1D에서 여러 줄로 나뉠 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 표 1A~1D의 모든 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 뉴클레오시드 단위는 비변형이며, 달리(예를 들어, r, m 등으로) 표시되지 않는 한, 비변형 핵염기 및 2'-데옥시 당을 함유하고; 연결은 달리 표시되지 않는 한, 천연 포스페이트 연결이며; 산성/염기성 기는 독립적으로 이들의 염 형태로 존재할 수 있다. 당이 명시되지 않은 경우, 당은 천연 DNA 당이고; 뉴클레오티드간 연결이 명시되지 않은 경우, 뉴클레오티드간 연결은 천연 포스페이트 연결이다. 모이어티 및 변형:
m: 2'-OMe;
f: 2'-F;
O, PO: 포스포디에스테르(포스페이트). 이는 링커 또는 말단기(또는 이의 구성요소), 예를 들어 링커와 올리고뉴클레오티드 사슬 사이의 연결, 뉴클레오티드간 연결(천연 포스페이트 연결) 등일 수 있다. 포스포디에스테르는 일반적으로 입체화학/연결 열에 "O"로 표시되고 일반적으로 설명 열에는 표시되지 않으며(말단기, 예를 들어 5'-말단기인 경우, 설명에 표시되며 일반적으로 입체화학/연결에는 표시되지 않음); 설명 열에 연결이 표시되지 않은 경우, 달리 표시되지 않는 한, 일반적으로 포스포디에스테르이다. 링커(예를 들어, L001)와 올리고뉴클레오티드 사슬 사이의 포스페이트 연결은 설명 열에 표시되지 않을 수 있지만, 입체화학/연결 열에 "O"로 표시될 수 있음에 유의;
*, PS: 포스포로티오에이트. 이는 말단기(말단기, 예를 들어 5'-말단기인 경우, 설명에 표시되며 일반적으로 입체화학/연결에는 표시되지 않음), 또는 연결, 예를 들어 링커(예를 들어, L001)와 올리고뉴클레오티드 사슬 사이의 연결, 뉴클레오티드간 연결(포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결) 등일 수 있음;
R, Rp: Rp 배열의 포스포로티오에이트. 설명의 * R은 Rp 배열의 단일 포스포로티오에이트 연결을 나타냄에 유의;
S, Sp: Sp 배열의 포스포로티오에이트. 설명의 * S는 Sp 배열의 단일 포스포로티오에이트 연결을 나타냄에 유의;
X: 입체무작위 포스포로티오에이트;
n001:
Figure pct00036
;
nX: 입체무작위 n001;
nR 또는 n001R: Rp 배열의 n001;
nS 또는 n001S: Sp 배열의 n001;
n009:
Figure pct00037
;
nX: 입체무작위 n009;
nR 또는 n009R: Rp 배열의 n009;
nS 또는 n009S: Sp 배열의 n009;
n031:
Figure pct00038
;
nX: 입체무작위 n031;
nR 또는 n031R: Rp 배열의 n031;
nS 또는 n031S: Sp 배열의 n031;
n033:
Figure pct00039
;
nX: 입체무작위 n033;
nR 또는 n033R: Rp 배열의 n033;
nS 또는 n033S: Sp 배열의 n033;
n037:
Figure pct00040
;
nX: 입체무작위 n037;
nR 또는 n037R: Rp 배열의 n037;
nS 또는 n037S: Sp 배열의 n037;
n046:
Figure pct00041
;
nX: 입체무작위 n046;
nR 또는 n046R: Rp 배열의 n046;
nS 또는 n046S: Sp 배열의 n046;
n047:
Figure pct00042
;
nX: 입체무작위 n047;
nR 또는 n047R: Rp 배열의 n047;
nS 또는 n047S: Sp 배열의 n047;
n025:
Figure pct00043
;
nX: 입체무작위 n025;
nR 또는 n025R: Rp 배열의 n025;
nS 또는 n025S: Sp 배열의 n025;
n054:
Figure pct00044
;
nX: 입체무작위 n054;
nR 또는 n054R: Rp 배열의 n054;
nS 또는 n054S: Sp 배열의 n054;
n055:
Figure pct00045
;
nX: 입체무작위 n055;
nR 또는 n055R: Rp 배열의 n055;
nS 또는 n055S: Sp 배열의 n055;
n026:
Figure pct00046
;
nX: 입체무작위 n001;
nR 또는 n026R: Rp 배열의 n026;
nS 또는 n026S: Sp 배열의 n026;
n004:
Figure pct00047
;
nX: 입체무작위 n004;
nR 또는 n004R: Rp 배열의 n004;
nS 또는 n004S: Sp 배열의 n004;
n003:
Figure pct00048
;
nX: 입체무작위 n003;
nR 또는 n003R: Rp 배열의 n003;
nS 또는 n003S: Sp 배열의 n003;
n008:
Figure pct00049
;
nX: 입체무작위 n008;
nR 또는 n008R: Rp 배열의 n008;
nS 또는 n008S: Sp 배열의 n008;
n029:
Figure pct00050
;
nX: 입체무작위 n029;
nR 또는 n029R: Rp 배열의 n029;
nS 또는 n029S: Sp 배열의 n029;
n021:
Figure pct00051
;
nX: 입체무작위 n021;
nR 또는 n021R: Rp 배열의 n021;
nS 또는 n021S: Sp 배열의 n021;
n006:
Figure pct00052
;
nX: 입체무작위 n006;
nR 또는 n006R: Rp 배열의 n006;
nS 또는 n006S: Sp 배열의 n006;
n020:
Figure pct00053
;
nX: 입체무작위 n020;
nR 또는 n020R: Rp 배열의 n020;
nS 또는 n020S: Sp 배열의 n020;
X: 입체무작위 포스포로티오에이트;
sm01n001:
Figure pct00054
(예를 들어, Asm01n001:
Figure pct00055
; Gsm01n001:
Figure pct00056
; Tsm01n001:
Figure pct00057
; Csm01n001:
Figure pct00058
; Usm01n001:
Figure pct00059
);
sm01*n001:
Figure pct00060
(예를 들어, Asm01*n001:
Figure pct00061
; Gsm01*n001:
Figure pct00062
; Tsm01*n001:
Figure pct00063
; Csm01*n001:
Figure pct00064
; Usm01*n001:
Figure pct00065
);
L026
Figure pct00066
; L027
Figure pct00067
; mU
Figure pct00068
;
fU
Figure pct00069
; dT
Figure pct00070
; POdT 또는 PO4-dT
Figure pct00071
;
PO5MRdT
Figure pct00072
; PO5MSdT
Figure pct00073
;
VPdT
Figure pct00074
; 5mvpdT
Figure pct00075
;
5mrpdT
Figure pct00076
; 5mspdT
Figure pct00077
;
PNdT
Figure pct00078
; SPNdT
Figure pct00079
;
5ptzdT
Figure pct00080
; Teo
Figure pct00081
;
n013:
Figure pct00082
(-C(O)-는 질소에 결합);
sm01n013:
Figure pct00083
;
즉, 모르폴린 카바메이트 뉴클레오티드간 연결(sm01n013)
Figure pct00084
; Asm01n013
Figure pct00085
; Gsm01n013:
Figure pct00086
; Csm01n013:
Figure pct00087
; Usm01n013:
Figure pct00088
; Tsm01n013:
Figure pct00089
; m5Csm01n013:
Figure pct00090
;
Mod001:
Figure pct00091
;
Mod015:
Figure pct00092
;
Mod020:
Figure pct00093
;
Mod029:
Figure pct00094
;
L001 : -NH-를 통해 Mod(예를 들어, Mod001)에 연결되고, 예를 들어 WV-38061의 경우, 포스페이트 연결(O 또는 PO)을 통해 올리고뉴클레오티드 사슬의 5'-말단에 연결되는 -NH-(CH2)6- 링커(C6 링커, C6 아민 링커 또는 C6 아미노 링커). 예를 들어 WV-38061에서, L001은 -NH-를 통해 Mod001에 연결되고(아미드기 -C(O)-NH-를 형성), 포스페이트 연결(O)을 통해 올리고뉴클레오티드 사슬에 연결됨.
L010:
Figure pct00095
. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 중간에 L010이 존재하는 경우, 예를 들어 연결(예를 들어, 포스페이트 연결(O 또는 PO) 또는 포스포로티오에이트 연결(키랄 제어되지 않거나 키랄 제어될 수 있음(Sp 또는 Rp)))을 통해, 독립적으로 다른 당(예를 들어, DNA 당)으로서 뉴클레오티드간 연결에 결합됨(예를 들어, 5'-탄소는 다른 단위(예를 들어, 당의 3')에 연결되고 3'-탄소는 다른 단위(예를 들어, 탄소의 5'-탄소)에 연결됨);
L012:-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-. 올리고뉴클레오티드의 중간에 L012가 존재하는 경우, 두 말단 각각은 독립적으로 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, 포스페이트 연결(O 또는 PO) 또는 포스포로티오에이트 연결(키랄 제어되지 않거나 키랄 제어될 수 있음(Sp 또는 Rp)))에 결합됨;
L022:
Figure pct00096
, 달리 나타내지 않는 한 L022는 포스페이트를 통해 분자의 나머지 부분에 연결됨;
L023: HO-(CH2)6-, 달리 나타내지 않는 한 CH2는 포스페이트를 통해 분자의 나머지 부분에 연결됨 (예를 들어, WV-42644(OnRnRnRnRSSSSSSSSSSSSSSSSSSSnRSSSSSnRSSnR의 O 는 L023을 나머지 분자에 연결하는 포스페이트 연결을 나타냄);
L025:
Figure pct00097
, -CH2- 연결 부위는 당(예를 들어, DNA 당)의 C5 연결 부위로서 사용되고 다른 단위(예를 들어, 당의 3')에 연결되고, 고리 상의 연결 부위는 C3 연결 부위로서 사용되고 다른 단위(예를 들어, 탄소의 5'-탄소)에 연결되고, 이들 각각은 독립적으로, 예를 들어 연결(예를 들어, 포스페이트 연결(O 또는 PO) 또는 포스포로티오에이트 연결(키랄 제어되지 않거나 키랄 제어될 수 있음(Sp 또는 Rp)))을 통해 연결된다. L025가 어떠한 변형도 없이 5'-말단에 있는 경우, -CH2- 연결 부위는 -OH에 결합된다. 예를 들어, 다양한 올리고뉴클레오티드에서 L025L025L025-는
Figure pct00098
의 구조를 가지며(다양한 염 형태로 존재할 수 있음), 표시된 바와 같은 연결(예를 들어, 포스페이트 연결(O 또는 PO) 또는 포스포로티오에이트 연결(키랄 제어되지 않거나 키랄 제어될 수 있음(Sp 또는 Rp)))을 통해 올리고뉴클레오티드 사슬의 5'-탄소에 연결됨;
L016:
Figure pct00099
. 달리 나타내지 않는 한 L016은 포스페이트를 통해 분자의 나머지 부분에 연결된다; L016은 n001과 함께 사용되어
Figure pct00100
의 구조를 가진 L016n001을 형성함.
1.2.2 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 길이
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, ds 올리고뉴클레오티드는 다양한 용도를 위한 목적하는 특성 및/또는 활성을 제공하기 위해 다양한 길이를 가질 수 있다. 올리고뉴클레오티드 길이를 평가, 선택, 및/또는 최적화하기 위한 많은 기술이 당업계에서 이용가능하고, 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 본원에서 입증된 바와 같이, 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 이의 표적과 혼성화하고 이의 표적 및/또는 이의 암호화된 생성물의 수준을 감소시키기에 적합한 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산(예를 들어, 표적 mRNA)을 인식하기에 충분히 길다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산과 다른 핵산(예를 들어, 표적 서열이 아닌 염기 서열을 갖는 핵산)을 구별하여 오프-타겟(off-target) 효과를 감소시키기에 충분히 길다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 제조 또는 생산의 복잡성을 감소시키고 제품 비용을 낮추기에 충분히 짧다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 염기 서열은 약 10~500개 핵염기의 길이이다. 특정 구현예에서, 염기 서열은 약 10~500개 핵염기의 길이이다. 특정 구현예에서, 염기 서열은 약 10~50개 핵염기의 길이이다. 특정 구현예에서, 염기 서열은 약 15~50개 핵염기의 길이이다. 특정 구현예에서, 염기 서열은 약 15 내지 약 30개 핵염기의 길이이다. 특정 구현예에서, 염기 서열은 약 10 내지 약 25개 핵염기의 길이이다. 특정 구현예에서, 염기 서열은 약 15 내지 약 22개 핵염기의 길이이다. 특정 구현예에서, 염기 서열은 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 핵염기의 길이이다. 특정 구현예에서, 염기 서열은 약 18개 핵염기의 길이이다. 특정 구현예에서, 염기 서열은 약 19개 핵염기의 길이이다. 특정 구현예에서, 염기 서열은 약 20개 핵염기의 길이이다. 특정 구현예에서, 염기 서열은 약 21개 핵염기의 길이이다. 특정 구현예에서, 염기 서열은 약 22개 핵염기의 길이이다. 특정 구현예에서, 염기 서열은 약 23개 핵염기의 길이이다. 특정 구현예에서, 염기 서열은 약 24개 핵염기의 길이이다. 특정 구현예에서, 염기 서열은 약 25개 핵염기의 길이이다. 특정 구현예에서, 각각의 핵염기는 임의로 치환된 A, T, C, G, U, 또는 A, T, C, G, 또는 U의 임의로 치환된 호변이성체이다.
2.2.3. 뉴클레오티드간 연결
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 염기 변형, 당 변형, 및/또는 뉴클레오티드간 연결 변형을 포함한다. 다양한 뉴클레오티드간 연결을 본 발명에 따라 사용하여 핵염기, 예를 들어 뉴클레오시드를 포함하는 단위들을 연결할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형 뉴클레오티드간 연결 및 하나 이상의 천연 포스페이트 연결 둘 다를 포함한다. 당업자에게 널리 알려진 바와 같이, 천연 포스페이트 연결은 천연 DNA 및 RNA 분자에서 널리 발견되며; 이들은 -OP(O)(OH)O-의 구조를 가지며, DNA 및 RNA의 뉴클레오시드에 있는 당들을 연결하고, 다양한 염 형태로 존재할 수 있다(예를 들어, 생리학적 pH(약 7.4)에서, 천연 포스페이트 연결은 음이온이 -OP(O)(O-)O-인 염 형태로 주로 존재한다). 변형 뉴클레오티드간 연결 또는 비천연 포스페이트 연결은 천연 포스페이트 연결 또는 이의 염 형태가 아닌 뉴클레오티드간 연결이다. 변형 뉴클레오티드간 연결은 구조에 따라 염 형태로도 존재할 수 있다. 예를 들어, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, -OP(O)(SH)O-의 구조를 갖는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결은 다양한 염 형태로 존재할 수 있다(예를 들어 생리학적 pH(약 7.4)에서, 음이온은 -OP(O)(S-)O-임).
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드간 연결인 뉴클레오티드간 연결, 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로아미데이트, 티오포스페이트, 3'-티오포스페이트, 또는 5'-티오포스페이트를 포함한다.
특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 키랄 연결 인을 포함하는 키랄 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 키랄 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 특정 구현예에서, 키랄 뉴클레오티드간 연결은 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 키랄 뉴클레오티드간 연결은 중성 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 키랄 뉴클레오티드간 연결은 키랄 연결 인과 관련하여 키랄 제어된다. 특정 구현예에서, 키랄 뉴클레오티드간 연결은 키랄 연결 인과 관련하여 입체화학적으로 순수하다. 특정 구현예에서, 키랄 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어되지 않는다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결(Rp 또는 Sp)의 위치와 연결 인 배열 및 아키랄 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, 천연 포스페이트 연결)의 위치를 포함하거나 이로 구성된다.
특정 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 P-변형을 포함하고, P-변형은 연결 인에서의 변형이다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 인을 포함하지 않지만 예를 들어 펩티드 핵산(PNA)에서와 같이 각각 독립적으로 핵염기를 포함하는 2개의 당 또는 2개의 모이어티를 연결하는 역할을 하는 모이어티이다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드간 연결, 예를 들어 화학식 I, I-a, I-b, 또는 I-c의 구조를 갖는 것과 본원 및/또는 WO 2018/022473, WO 2018/098264, WO 2018/223056, WO 2018/223073, WO 2018/223081, WO 2018/237194, WO 2019/032607, WO 2019/055951, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, 및/또는 WO 2019/032612에 기재된 것들을 포함하고, 각각의 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, 화학식 I, I-a, I-b, I-c 등의 것)은 독립적으로 본원에 참조로 포함된다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 키랄 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이다.
특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 음으로 하전되지 않은 하나 이상의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 양으로 하전된 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 중성 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 중성 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 본원 및/또는 US 9394333, US 9744183, US 9605019, US 9982257, US 20170037399, US 20180216108, US 20180216107, US 9598458, WO 2017/062862, WO 2018/067973, WO 2017/160741, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/098264, WO 2018/022473, WO 2018/223056, WO 2018/223073, WO 2018/223081, WO 2018/237194, WO 2019/032607, WO2019/032612, WO 2019/055951, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, 및/또는 WO 2019/032612에 기재된 바와 같은 화학식 I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2 등, 또는 이의 염 형태의 구조를 가지며, 음으로 하전되지 않은 각각의 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, 화학식 I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2 등, 또는 이의 적합한 염 형태의 것)은 독립적으로 본원에 참조로 포함된다.
특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 전달 및/또는 활성(예를 들어, 아데노신 편집 활성)을 개선시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결)은 임의로 치환된 트리아졸릴을 포함한다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결)은 임의로 치환된 알키닐을 포함한다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 트리아졸 또는 알킨 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 트리아졸 모이어티(예를 들어, 트리아졸릴기)는 임의로 치환된다. 특정 구현예에서, 트리아졸 모이어티(예를 들어, 트리아졸릴기)는 치환된다. 특정 구현예에서, 트리아졸 모이어티는 치환되지 않는다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 임의로 치환된 환형 구아니딘 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00101
의 구조를 가지며 임의로 키랄 제어되고, R1은 -L-R'이고, L은 본원에 기재된 바와 같은 LB이고, R'은 본원에 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, 각각의 R1은 독립적으로 R'이다. 특정 구현예에서, 각각의 R'은 독립적으로 R이다. 특정 구현예에서, 2개의 R1은 R이고 함께 본원에 기재된 바와 같은 고리를 형성한다. 특정 구현예에서, 2개의 다른 질소 원자 상의 2개의 R1은 R이고 함께 본원에 기재된 바와 같은 고리를 형성한다. 특정 구현예에서, R1은 독립적으로 본원에 기재된 바와 같은 임의로 치환된 C1-6 지방족이다. 특정 구현예에서, R1은 메틸이다. 특정 구현예에서, 동일한 질소 원자 상의 2개의 R'은 R이고 함께 본원에 기재된 바와 같은 고리를 형성한다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00102
의 구조를 가지며 임의로 키랄 제어된다. 특정 구현예에서,
Figure pct00103
는
Figure pct00104
이다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 임의로 치환된 환형 구아니딘 모이어티를 포함하고,
Figure pct00105
,
Figure pct00106
, 또는
Figure pct00107
의 구조를 가지며, W는 O 또는 S이다. 특정 구현예에서, W는 O이다. 특정 구현예에서, W는 S이다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 입체화학적으로 제어된다.
특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결 또는 중성 뉴클레오티드간 연결은 트리아졸 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드간 연결이다. 일부 구현예에서, 트리아졸 모이어티(예를 들어, 임의로 치환된 트리아졸릴기)를 포함하는 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00108
의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 트리아졸 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00109
의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 트리아졸 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00110
의 화학식을 가지며, W는 O 또는 S이다. 일부 구현예에서, 알킨 모이어티(예를 들어, 임의로 치환된 알키닐기)를 포함하는 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00111
의 화학식을 가지며, W는 O 또는 S이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결, 예를 들어 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결, 중성 뉴클레오티드간 연결은 환형 구아니딘 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 환형 구아니딘 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00112
의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결, 또는 중성 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00113
또는
Figure pct00114
로부터 선택되는 구조이거나 이를 포함하며, W는 O 또는 S이다. 특정 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결, 예를 들어 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결, 중성 뉴클레오티드간 연결은 환형 구아니딘 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 환형 구아니딘 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00115
의 구조를 갖는다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결 또는 중성 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00116
의 구조이거나 이를 포함하고, W는 O 또는 S이다.
특정 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 Tmg 기(
Figure pct00117
)를 포함한다. 특정 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 Tmg 기를 포함하고
Figure pct00118
의 구조를 갖는다("Tmg 뉴클레오티드간 연결"). 특정 구현예에서, 중성 뉴클레오티드간 연결은 PNA 및 PMO의 뉴클레오티드간 연결, 및 Tmg 뉴클레오티드간 연결을 포함한다.
특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 화학식 I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2 등, 또는 이의 염 형태의 구조를 갖는다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 1~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 3~20원 헤테로시클릴 또는 헤테로아릴 기를 포함한다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 1~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 3~20원 헤테로시클릴 또는 헤테로아릴 기를 포함하고, 적어도 하나의 헤테로원자는 질소이다. 특정 구현예에서, 이러한 헤테로시클릴 또는 헤테로아릴 기는 5원 고리의 기이다. 특정 구현예에서, 이러한 헤테로시클릴 또는 헤테로아릴 기는 6원 고리의 기이다.
특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 1~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5~20원 헤테로아릴 기를 포함한다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 1~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5~20원 헤테로아릴 기를 포함하고, 적어도 하나의 헤테로원자는 질소이다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 1~4개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5~6원 헤테로아릴 기를 포함하고, 적어도 하나의 헤테로원자는 질소이다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 1~4개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5원 헤테로아릴 기를 포함하고, 적어도 하나의 헤테로원자는 질소이다. 특정 구현예에서, 헤테로아릴 기는 연결 인에 직접 결합된다.
특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 1~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5~20원 헤테로시클릴 기를 포함한다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 1~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5~20원 헤테로시클릴 기를 포함하고, 적어도 하나의 헤테로원자는 질소이다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 1~4개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5~6원 헤테로시클릴 기를 포함하고, 적어도 하나의 헤테로원자는 질소이다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 1~4개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5원 헤테로시클릴 기를 포함하고, 적어도 하나의 헤테로원자는 질소이다. 특정 구현예에서, 적어도 2개의 헤테로원자는 질소이다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 임의로 치환된 트리아졸릴 기를 포함한다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 비치환 트리아졸릴 기, 예를 들어
Figure pct00119
를 포함한다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 치환 트리아졸릴 기, 예를 들어
Figure pct00120
를 포함한다.
특정 구현예에서, 헤테로시클릴 기는 연결 인에 직접 결합된다. 특정 구현예에서, 헤테로시클릴 기는 링커, 예를 들어 헤테로시클릴 기가 =N-을 통해 연결 인에 유도되어 결합된 구아니딘 모이어티의 일부인 경우, =N-을 통해 연결 인에 결합된다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 임의로 치환된
Figure pct00121
기를 포함한다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 치환된
Figure pct00122
기를 포함한다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00123
기를 포함하고, 각각의 R1은 독립적으로 -L-R이다. 특정 구현예에서, 각각의 R1은 독립적으로 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 특정 구현예에서, 각각의 R1은 독립적으로 메틸이다.
특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결, 예를 들어 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 트리아졸 또는 알킨 모이어티를 포함하고, 이들 각각은 임의로 치환된다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 트리아졸 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 비치환 트리아졸 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 치환 트리아졸 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 알킬 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 임의로 치환된 알키닐 기를 포함한다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 비치환 알키닐 기를 포함한다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 치환 알키닐 기를 포함한다. 특정 구현예에서, 알키닐 기는 연결 인에 직접 결합된다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 상이한 유형의 뉴클레오티드간 인 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 키랄 제어 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 천연 포스페이트 연결 및 적어도 하나의 변형(비천연) 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 천연 포스페이트 연결 및 적어도 하나의 포스포로티오에이트를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 음으로 하전되지 않은 적어도 하나의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 천연 포스페이트 연결 및 음으로 하전되지 않은 적어도 하나의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 및 음으로 하전되지 않은 적어도 하나의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결, 적어도 하나의 천연 포스페이트 연결, 및 음으로 하전되지 않은 적어도 하나의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 음으로 하전되지 않은 하나 이상, 예를 들어 1~50, 1~40, 1~30, 1~20, 1~15, 1~10, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은, 수용액 중의 소정 pH에서 50%, 40%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 또는 1% 미만의 뉴클레오티드간 연결이 음으로 하전된 염 형태로 존재한다는 점에서, 음으로 하전되지 않은 것이다. 특정 구현예에서, pH는 약 pH 7.4이다. 특정 구현예에서, pH는 약 4~9이다. 특정 구현예에서, 백분율은 10% 미만이다. 특정 구현예에서, 백분율은 5% 미만이다. 특정 구현예에서, 백분율은 1% 미만이다. 특정 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은, 중성 형태의 뉴클레오티드간 연결이 물에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 이하인 pKa를 갖지 않는다는 점에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, pKa는 7 이하가 아니다. 특정 구현예에서, pKa는 6 이하가 아니다. 특정 구현예에서, pKa는 5 이하가 아니다. 특정 구현예에서, pKa는 4 이하가 아니다. 특정 구현예에서, pKa는 3 이하가 아니다. 특정 구현예에서, pKa는 2 이하가 아니다. 특정 구현예에서, pKa는 1 이하가 아니다. 특정 구현예에서, 중성 형태의 뉴클레오티드간 연결의 pKa는 CH3-뉴클레오티드간 연결-CH3의 구조를 갖는 중성 형태의 화합물의 pKa로 표시될 수 있다. 예를 들어, 화학식 I의 구조를 갖는 중성 형태의 뉴클레오티드간 연결의 pKa는
Figure pct00124
(X, Y, Z 각각은 독립적으로 -O-, -S-, -N(R')-이고; L은 LB이고, R1은 -L-R'임)의 구조를 갖는 중성 형태의 화합물의 pKa로 표시될 수 있고,
Figure pct00125
의 pKa는
Figure pct00126
의 pKa로 표시될 수 있다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 중성 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 양으로 하전된 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 구아니딘 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 헤테로아릴 염기 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 트리아졸 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 알키닐 모이어티를 포함한다.
특정 구현예에서, 중성의 또는 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 US 9394333, US 9744183, US 9605019, US 9982257, US 20170037399, US 20180216108, US 20180216107, US 9598458, WO 2017/062862, WO 2018/067973, WO 2017/160741, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/098264, WO 2018/022473, WO 2018/223056, WO 2018/223073, WO 2018/223081, WO 2018/237194, WO 2019/032607, WO2019/032612, WO 2019/055951, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, 및/또는 WO 2019/032612,2607, WO2019032612, WO 2019/055951, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, 및/또는 WO 2019/032612 중 어느 하나에 기재된 임의의 중성의 또는 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결의 구조를 가지며, 각각의 중성의 또는 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 본원에 참조로 포함된다.
특정 구현예에서, 각각의 R'은 독립적으로 임의로 치환된 C1-6 지방족이다. 특정 구현예에서, 각각의 R'은 독립적으로 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 특정 구현예에서, 각각의 R'은 독립적으로 -CH3이다. 특정 구현예에서, 각각의 Rs는 -H이다.
특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00127
의 구조를 갖는다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00128
의 구조를 갖는다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00129
의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00130
의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00131
의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00132
의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00133
의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00134
의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00135
의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00136
의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00137
의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00138
의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, W는 O이다. 일부 구현예에서, W는 S이다. 일부 구현예에서, 중성 뉴클레오티드간 연결은 전술한 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이다.
특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 US 9394333, US 9744183, US 9605019, US 9982257, US 20170037399, US 20180216108, US 20180216107, US 9598458, WO 2017/062862, WO 2018/067973, WO 2017/160741, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/098264, WO 2018/022473, WO 2018/223056, WO 2018/223073, WO 2018/223081, WO 2018/237194, WO 2019/032607, WO2019/032612, WO 2019/055951, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, 및/또는 WO 2019/032612,2607, WO2019032612, WO 2019/055951, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, 및/또는 WO 2019/032612에 기재된 화학식 I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, 또는 II-d-2의 하나 이상의 뉴클레오티드간 연결을 포함하고, 각각의 화학식 I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, 또는 II-d-2, 또는 이의 염 형태는 독립적으로 본원에 참조로 포함된다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 중성 뉴클레오티드간 연결 및 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 중성 뉴클레오티드간 연결, 및 중성 뉴클레오티드간 연결이 아닌 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 중성 뉴클레오티드간 연결 및 키랄 제어 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 음으로 하전되지 않은 하나 이상의 뉴클레오티드간 연결 및 하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 ds 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 올리고뉴클레오티드에 있는 각각의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 중성 뉴클레오티드간 연결 및 하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 ds 올리고뉴클레오티드를 제공하며, ds 올리고뉴클레오티드에 있는 각각의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 키랄 제어 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어된다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어되지 않는다. 특정 구현예에서, 중성 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어된다. 특정 구현예에서, 중성 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어되지 않는다.
임의의 특정 이론에 구애되고자 함이 없이, 본 발명은 천연 포스페이트 연결(PO)보다 소수성일 수 있는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결(PS)보다 중성 뉴클레오티드간 연결이 더 소수성일 수 있음에 주목한다. 일반적으로, PS 또는 PO와는 달리, 중성 뉴클레오티드간 연결은 더 적은 전하를 띤다. 임의의 특정 이론에 구애되고자 함이 없이, 본 발명은 하나 이상의 중성 뉴클레오티드간 연결을 ds 올리고뉴클레오티드에 혼입시키면 ds 올리고뉴클레오티드가 세포에 흡수되는 능력 및/또는 엔도솜에서 탈출하는 능력이 증가할 수 있음에 주목한다. 임의의 특정 이론에 구애되고자 함이 없이, 본 발명은 하나 이상의 중성 뉴클레오티드간 연결의 혼입을 사용하여 ds 올리고뉴클레오티드와 이의 표적 핵산 사이에 형성된 듀플렉스의 용융 온도를 조절할 수 있음에 주목한다.
임의의 특정 이론에 구애되고자 함이 없이, 본 발명은 음으로 하전되지 않은 하나 이상의 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, 중성 뉴클레오티드간 연결)을 ds 올리고뉴클레오티드에 혼입시키면 표적 아데노신 편집과 같은 기능을 매개하는 ds 올리고뉴클레오티드의 능력이 증가할 수 있음에 주목한다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 천연 포스페이트 연결 및 화학식 I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, 또는 이의 염 형태의 것과 같은 뉴클레오티드간 연결은 일반적으로, US 9394333, US 9744183, US 9605019, US 9982257, US 20170037399, US 20180216108, US 20180216107, US 9598458, WO 2017/062862, WO 2018/067973, WO 2017/160741, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/098264, WO 2018/022473, WO 2018/223056, WO 2018/223073, WO 2018/223081, WO 2018/237194, WO 2019/032607, WO2019032612, WO 2019/055951, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, 및/또는 WO 2019/032612에 기재된 바와 같은 2개의 뉴클레오시드(천연이거나 변형될 수 있음)를 연결하며, 각각의 화학식 I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, 또는 이의 염 형태는 독립적으로 본원에 참조로 포함된다. 천연 DNA 및 RNA에서와 같은 일반적인 연결은 뉴클레오티드간 연결이 2개의 당(이는 본원에 기재된 바와 같이 변형되거나 변형되지 않을 수 있음)과 결합을 형성한다는 것이다. 많은 구현예에서, 본원에 예시된 바와 같이, 뉴클레오티드간 연결은 산소 원자 또는 헤테로원자(예를 들어, 다양한 화학식에서 Y 및 Z)를 통해 5' 탄소에서 하나의 임의로 변형된 리보스 또는 데옥시리보스와 결합을 형성하고 3' 탄소에서 다른 임의로 변형된 리보스 또는 데옥시리보스와 결합을 형성한다. 특정 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결에 의해 연결된 각각의 뉴클레오시드 단위는, 독립적으로 임의로 치환된 A, T, C, G 또는 U, 또는 A, T, C, G 또는 U의 치환된 호변이성체인 핵염기, 또는 적어도 하나의 질소 원자를 갖는 임의로 치환된 헤테로시클릴 및/또는 헤테로아릴 고리를 포함하는 핵염기를 독립적으로 포함한다.
일부 구현예에서, 연결은 -Y-PL(-X-RL)-Z- 또는 이의 염 형태의 구조를 갖거나 이를 포함하고, 이 경우
PL은 P, P(=W), P->B(-LL-RL)3, 또는 PN이고;
W는 O, N(-LL-RL), S, 또는 Se이고;
PN은 P=N-C(-LL-R')(=LN-R') 또는 P=N-LL-RL이고;
LN은 =N-LL1-, =CH-LL1-이고(CH는 임의로 치환되거나, =N+(R')(Q-)-LL1-임);
Q-는 음이온이고,
X, Y, 및 Z는 각각 독립적으로 -O-, -S-, -LL-N(-LL-RL)-LL-, -LL-N=C(-LL-RL)-LL-, 또는 LL이고;
각각의 RL은 독립적으로 -LL-N(R')2, -LL-R', -N=C(-LL-R')2, -LL-N(R')C(NR')N(R')2, -LL-N(R')C(O)N(R')2, 탄수화물, 또는 링커를 통해 임의로 연결된 하나 이상의 추가 화학 모이어티이고;
LL1 및 LL은 각각 독립적으로 L이고;
-CyIL-은 -Cy-이고;
각각의 L은 독립적으로 공유 결합, 또는 C1-30 지방족 기 및 1~10개의 헤테로원자를 갖는 C1-30 헤테로지방족 기로부터 선택되는 2가의 임의로 치환된 선형 또는 분지형 기(여기서, 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 그리고 독립적으로 C1-6 알킬렌, C1-6 알케닐렌, -C≡C-, 1~5개의 헤테로원자를 갖는 2가 C1-C6 헤테로지방족 기, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(NR')N(R')-, -N(R')C(NR')N(R')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -C(O)S-, -C(O)O-, -P(O)(OR')-, -P(O)(SR')-, -P(O)(R')-, -P(O)(NR')-, -P(S)(OR')-, -P(S)(SR')-, -P(S)(R')-, -P(S)(NR')-, -P(R')-, -P(OR')-, -P(SR')-, -P(NR')-, -P(OR')[B(R')3]-, -OP(O)(OR')O-, -OP(O)(SR')O-, -OP(O)(R')O-, -OP(O)(NR')O-, -OP(OR')O-, -OP(SR')O-, -OP(NR')O-, -OP(R')O-, -OP(OR')[B(R')3]O-, 또는 -[C(R')2C(R')2O]n-로부터 선택되는 임의로 치환된 기로 대체되고, 하나 이상의 질소 또는 탄소 원자는 임의로 그리고 독립적으로 CyL로 대체됨)이고;
각각의 -Cy-는 독립적으로 0~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 2가 3~30원 단환, 이환, 또는 다환 고리이고;
각각의 -Cy-는 독립적으로 0~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 3가 또는 4가 3~30원 단환, 이환, 또는 다환 고리이고;
각각의 R'은 독립적으로 -R, -C(O)R, -C(O)N(R)2, -C(O)OR, 또는 -S(O)2R이고;
각각의 R은 독립적으로 -H, 또는 C1-30 지방족, 1~10개의 헤테로원자를 갖는 C1-30 헤테로지방족, C6-30 아릴, C6-30 아릴지방족, 1~10개의 헤테로원자를 갖는 C6-30 아릴헤테로지방족, 1~10개의 헤테로원자를 갖는 5~30원 헤테로아릴, 및 1~10개의 헤테로원자를 갖는 3~30원 헤테로시클릴로부터 선택되는 임의로 치환된 기이거나;
2개의 R 기는 임의로 그리고 독립적으로 함께 공유 결합을 형성하거나;
동일한 원자 상의 2개 이상의 R기는 임의로 그리고 독립적으로 해당 원자와 함께, 해당 원자 외에도 0~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 3~30원 단환, 이환, 또는 다환 고리를 형성하거나;
2개 이상의 원자 상의 2개 이상의 R기는 임의로 그리고 독립적으로 이들의 사이에 개재된 원자와 함께, 해당 개재된 원자 외에도 0~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 3~30원 단환, 이환, 또는 다환 고리를 형성한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -O-PL(-X-RL)-O-의 구조를 갖고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -O-P(=W)(-X-RL)-O-의 구조를 갖고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -O-P(=W)[-N(-LL-RL)-RL]-O-의 구조를 갖고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -O-P(=W)(-NH-LL-RL)-O-의 구조를 갖고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -O-P(=W)[-N(R')2]-O-의 구조를 갖고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -O-P(=W)(-NHR')-O-의 구조를 갖고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -O-P(=W)(-NHSO2R)-O-의 구조를 갖고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -O-P(=W)[-N=C(-LL-R')2]-O-의 구조를 갖고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -O-P(=W)[-N=C[N(R')2]2]-O-의 구조를 갖고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=W)(-N=C(R'')2)-O-의 구조를 갖고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=W)(-N(R'')2)-O-의 구조를 갖고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, W는 O이다. 일부 구현예에서, W는 S이다. 일부 구현예에서, 이러한 뉴클레오티드간 연결은 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이다. 일부 구현예에서, 이러한 뉴클레오티드간 연결은 중성 뉴클레오티드간 연결이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -PL(-X-RL)-Z-의 구조를 갖고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -PL(-X-RL)-O-의 구조를 갖고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=W)(-X-RL)-O-의 구조를 갖고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=W)[-N(-LL-RL)-RL]-O-의 구조를 갖고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=W)(-NH-LL-RL)-O-의 구조를 갖고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=W)[-N(R')2]-O-의 구조를 갖고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=W)(-NHR')-O-의 구조를 갖고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=W)(-NHSO2R)-O-의 구조를 갖고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=W)[-N=C(-LL-R')2]-O-의 구조를 갖고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=W)[-N=C[N(R')2]2]-O-의 구조를 갖고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=W)(-N=C(R'')2)-O-의 구조를 갖고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=W)(-N(R'')2)-O-의 구조를 갖고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, W는 O이다. 일부 구현예에서, W는 S이다. 일부 구현예에서, 이러한 뉴클레오티드간 연결은 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이다. 일부 구현예에서, 이러한 뉴클레오티드간 연결은 중성 뉴클레오티드간 연결이다. 일부 구현예에서, 이러한 뉴클레오티드간 연결의 P는 당의 N에 결합된다.
일부 구현예에서, 연결은 포스포릴 구아니딘 뉴클레오티드간 연결이다. 일부 구현예에서, 연결은 티오포스포릴 구아니딘 뉴클레오티드간 연결이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 그리고 독립적으로 본원에 기재된 모이어티로 대체된다. 일부 구현예에서, L 또는 LL은 -SO2-를 포함한다. 일부 구현예에서, L 또는 LL은 -SO2N(R')-를 포함한다. 일부 구현예에서, L 또는 LL은 -C(O)-를 포함한다. 일부 구현예에서, L 또는 LL은 -C(O)O-를 포함한다. 일부 구현예에서, L 또는 LL은 -C(O)N(R')-를 포함한다. 일부 구현예에서, L 또는 LL은 -P(=W)(R')-를 포함한다. 일부 구현예에서, L 또는 LL은 -P(=O)(R')-를 포함한다. 일부 구현예에서, L 또는 LL은 -P(=S)(R')-를 포함한다. 일부 구현예에서, L 또는 LL은 -P(R')-를 포함한다. 일부 구현예에서, L 또는 LL은 -P(=W)(OR')-를 포함한다. 일부 구현예에서, L 또는 LL은 -P(=O)(OR')-를 포함한다. 일부 구현예에서, L 또는 LL은 -P(=S)(OR')-를 포함한다. 일부 구현예에서, L 또는 LL은 -P(OR')-를 포함한다.
일부 구현예에서, -X-RL은 -N(R')SO2RL이다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N(R')C(O)RL이다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N(R')P(=O)(R')RL이다.
일부 구현예에서, 연결, 예를 들어 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결 또는 중성 뉴클레오티드간 연결은 -P(=W)(-N=C(R'')2)-, -P(=W)(-N(R')SO2R'')-, -P(=W)(-N(R')C(O)R'')-, -P(=W)(-N(R'')2)-, -P(=W)(-N(R')P(O)(R'')2)-, -OP(=W)(-N=C(R'')2)O-, -OP(=W)(-N(R')SO2R'')O-, -OP(=W)(-N(R')C(O)R'')O-, -OP(=W)(-N(R'')2)O-, -OP(=W)(-N(R')P(O)(R'')2)O-, -P(=W)(-N=C(R'')2)O-, -P(=W)(-N(R')SO2R'')O-, -P(=W)(-N(R')C(O)R'')O-, -P(=W)(-N(R'')2)O-, 또는 -P(=W)(-N(R')P(O)(R'')2)O-, 또는 이의 염 형태의 구조를 갖거나 이를 포함하고, 이 경우
W는 O 또는 S이고;
각각의 R''은 독립적으로 R', -OR', -P(=W)(R')2 또는 -N(R')2이고;
각각의 R'은 독립적으로 -R, -C(O)R, -C(O)N(R)2, -C(O)OR, 또는 -S(O)2R이고;
각각의 R은 독립적으로 -H, 또는 C1-30 지방족, 1~10개의 헤테로원자를 갖는 C1-30 헤테로지방족, C6-30 아릴, C6-30 아릴지방족, 1~10개의 헤테로원자를 갖는 C6-30 아릴헤테로지방족, 1~10개의 헤테로원자를 갖는 5~30원 헤테로아릴, 및 1~10개의 헤테로원자를 갖는 3~30원 헤테로시클릴로부터 선택되는 임의로 치환된 기이거나;
2개의 R 기는 임의로 그리고 독립적으로 함께 공유 결합을 형성하거나;
동일한 원자 상의 2개 이상의 R기는 임의로 그리고 독립적으로 해당 원자와 함께, 해당 원자 외에도 0~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 3~30원 단환, 이환, 또는 다환 고리를 형성하거나;
2개 이상의 원자 상의 2개 이상의 R기는 임의로 그리고 독립적으로 이들의 사이에 개재된 원자와 함께, 해당 개재된 원자 외에도 0~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 3~30원 단환, 이환, 또는 다환 고리를 형성한다.
일부 구현예에서, W는 O이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=O)(-N=C(R'')2)-, -P(=O)(-N(R')SO2R'')-, -P(=O)(-N(R')C(O)R'')-, -P(=O)(-N(R'')2)-, -P(=O)(-N(R')P(O)(R'')2)-, -OP(=O)(-N=C(R'')2)O-, -OP(=O)(-N(R')SO2R'')O-, -OP(=O)(-N(R')C(O)R'')O-, -OP(=O)(-N(R'')2)O-, -OP(=O)(-N(R')P(O)(R'')2)O-, -P(=O)(-N=C(R'')2)O-, -P(=O)(-N(R')SO2R'')O-, -P(=O)(-N(R')C(O)R'')O-, -P(=O)(-N(R'')2)O-, 또는 -P(=O)(-N(R')P(O)(R'')2)O-, 또는 이의 염 형태의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=O)(-N=C(R'')2)- -P(=O)(-N(R'')2)-, -OP(=O)(-N=C(R'')2)-O-, -OP(=O)(-N(R'')2)-O-, -P(=O)(-N=C(R'')2)-O-, 또는 -P(=O)(-N(R'')2)-O-, 또는 이의 염 형태의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=O)(-N=C(R'')2)-O- 또는 -OP(=O)(-N(R'')2)-O-, 또는 이의 염 형태의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=O)(-N=C(R'')2)-O- 또는 이의 염 형태의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=O)(-N(R'')2)-O- 또는 이의 염 형태의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=O)(-N(R')SO2R'')O- 또는 이의 염 형태의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=O)(-N(R')C(O)R'')O- 또는 이의 염 형태의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=O)(-N(R')P(O)(R'')2)O- 또는 이의 염 형태의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 n001이다.
일부 구현예에서, W는 S이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=S)(-N=C(R'')2)-, -P(=S)(-N(R')SO2R'')-, -P(=S)(-N(R')C(O)R'')-, -P(=S)(-N(R'')2)-, -P(=S)(-N(R')P(O)(R'')2)-, -OP(=S)(-N=C(R'')2)O-, -OP(=S)(-N(R')SO2R'')O-, -OP(=S)(-N(R')C(O)R'')O-, -OP(=S)(-N(R'')2)O-, -OP(=S)(-N(R')P(O)(R'')2)O-, -P(=S)(-N=C(R'')2)O-, -P(=S)(-N(R')SO2R'')O-, -P(=S)(-N(R')C(O)R'')O-, -P(=S)(-N(R'')2)O-, 또는 -P(=S)(-N(R')P(O)(R'')2)O-, 또는 이의 염 형태의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=S)(-N=C(R'')2)- -P(=S)(-N(R'')2)-, -OP(=S)(-N=C(R'')2)-O-, -OP(=S)(-N(R'')2)-O-, -P(=S)(-N=C(R'')2)-O-, 또는 -P(=S)(-N(R'')2)-O-, 또는 이의 염 형태의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=S)(-N=C(R'')2)-O- 또는 OP(=S)(-N(R'')2)-O-, 또는 이의 염 형태의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=S)(-N=C(R'')2)-O- 또는 이의 염 형태의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=S)(-N(R'')2)-O- 또는 이의 염 형태의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=S)(-N(R')SO2R'')O- 또는 이의 염 형태의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=S)(-N(R')C(O)R'')O- 또는 이의 염 형태의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=S)(-N(R')P(O)(R'')2)O- 또는 이의 염 형태의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 *n001이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=O)(-N(R')SO2R'')-의 구조를 갖고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=S)(-N(R')SO2R'')-의 구조를 갖고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=O)(-N(R')SO2R'')O-의 구조를 갖고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=S)(-N(R')SO2R'')O-의 구조를 갖고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=O)(-N(R')SO2R'')O-의 구조를 갖고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=S)(-N(R')SO2R'')O-의 구조를 갖고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 예를 들어, -N(R')-의 R'은 수소 또는 임의로 치환된 C1-6 지방족이다. 일부 구현예에서, R'은 C1-6 알킬이다. 일부 구현예에서, R'은 수소이다. 일부 구현예에서, 예를 들어, -SO2R''에서 R"는 본원에 기재된 바와 같은 R'이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=O)(-NHSO2R'')-의 구조를 갖고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=S)(-NHSO2R'')-의 구조를 갖고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=O)(-NHSO2R'')O-의 구조를 갖고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=S)(-NHSO2R'')O-의 구조를 갖고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=O)(-NHSO2R'')O-의 구조를 갖고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=S)(-NHSO2R'')O-의 구조를 갖고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N(R')SO2RL이고, R' 및 RL은 각각 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, RL은 R''이다. 일부 구현예에서, RL은 R'이다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N(R')SO2R''이고, R'은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, X-RL은 -N(R')SO2R'이고, R'은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, X-RL은 -NHSO2R'이고, R'은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, R'은 본원에 기재된 바와 같은 R이다. 일부 구현예에서, R'은 임의로 치환된 C1-6 지방족이다. 일부 구현예에서, R'은 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 구현예에서, R'은 임의로 치환된 페닐이다. 일부 구현예에서, R'은 임의로 치환된 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, 예를 들어 -SO2R''에서 R''은 R이다. 일부 구현예에서, R은 C1-6 지방족, 아릴, 헤테로시클릴, 및 헤테로아릴로부터 선택되는 임의로 치환된 기이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-6 지방족이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 구현예에서, R'은 임의로 치환된 C1-6 알케닐이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-6 알키닐이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 메틸이다. 일부 구현예에서 -X-RL은 -NHSO2CH3이다. 일부 구현예에서, R은 -CF3이다. 일부 구현예에서, R은 메틸이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 에틸이다. 일부 구현예에서, R은 에틸이다. 일부 구현예에서, R은 -CH2CHF2이다. 일부 구현예에서, R은 -CH2CH2OCH3이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 프로필이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 부틸이다. 일부 구현예에서, R은 n-부틸이다. 일부 구현예에서, R은 -(CH2)6NH2이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 선형 C2-20 지방족이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 선형 C2-20 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 선형 C2-20 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, 또는 C20 지방족이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, 또는 C20 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 선형 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, 또는 C20 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 선형 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, 또는 C20 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 페닐이다. 일부 구현예에서, R은 페닐이다. 일부 구현예에서, R은 p-메틸페닐이다. 일부 구현예에서, R은 4-디메틸아미노페닐이다. 일부 구현예에서, R은 3-피리디닐이다. 일부 구현예에서, R은
Figure pct00139
이다. 일부 구현예에서, R은
Figure pct00140
이다. 일부 구현예에서, R은 벤질이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 1,3-디아졸릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 2-(1,3)-디아졸릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 1-메틸-2-(1,3)-디아졸릴이다. 일부 구현예에서, R은 이소프로필이다. 일부 구현예에서, R''은 -N(R')2이다. 일부 구현예에서, R''은 -N(CH3)2이다. 일부 구현예에서, 예를 들어, -SO2R''에서 R"는 -OR'이고, R'은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, R'은 본원에 기재된 바와 같은 R이다. 일부 구현예에서, R''은 -OCH3이다. 일부 구현예에서, 연결은 -OP(=O)(-NHSO2R)O-이고, R은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, R은 본원에 기재된 바와 같은 임의로 치환된 선형 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 본원에 기재된 바와 같은 선형 알킬이다. 일부 구현예에서, 연결은 -OP(=O)(-NHSO2CH3)O-이다. 일부 구현예에서, 연결은 -OP(=O)(-NHSO2CH2CH3)O-이다. 일부 구현예에서, 연결은 -OP(=O)(-NHSO2CH2CH2OCH3)O-이다. 일부 구현예에서, 연결은 OP(=O)(-NHSO2CH2Ph)O-이다. 일부 구현예에서, 연결은 -OP(=O)(-NHSO2CH2CHF2)O-이다. 일부 구현예에서, 연결은 -OP(=O)(-NHSO2(4-메틸페닐))O-이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00141
이다. 일부 구현예에서, 연결은 -OP(=O)(-X-RL)O-이고, -X-RL은
Figure pct00142
이다. 일부 구현예에서, 연결은 -OP(=O)(-NHSO2CH(CH3)2)O-이다. 일부 구현예에서, 연결은 -OP(=O)(-NHSO2N(CH3)2)O-이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=O)(-N(R')C(O)R'')-의 구조를 갖고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=S)(-N(R')C(O)R'')-의 구조를 갖고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=O)(-N(R')C(O)R'')O의 구조를 갖고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=S)(-N(R')C(O)R'')O-의 구조를 갖고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=O)(-N(R')C(O)R'')O-의 구조를 갖고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=S)(-N(R')C(O)R'')O-의 구조를 갖고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 예를 들어, -N(R')-의 R'은 수소 또는 임의로 치환된 C1-6 지방족이다. 일부 구현예에서, R'은 C1-6 알킬이다. 일부 구현예에서, R'은 수소이다. 일부 구현예에서, 예를 들어, -C(O)R''의 R''은 본원에 기재된 바와 같은 R'이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=O)(-NHC(O)R'')-의 구조를 갖고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=S)(-NHC(O)R'')-의 구조를 갖고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=O)(-NHC(O)R'')O-의 구조를 갖고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=S)(-NHC(O)R'')O-의 구조를 갖고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=O)(-NHC(O)R'')O-의 구조를 갖고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=S)(-NHC(O)R'')O-의 구조를 갖고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, -X-RL은 --N(R')CORL이고, RL은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N(R')COR''이고, R''은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N(R')COR'이고, R'은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -NHCOR'이고, R'은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, R'은 본원에 기재된 바와 같은 R이다. 일부 구현예에서, R'은 임의로 치환된 C1-6 지방족이다. 일부 구현예에서, R'은 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 구현예에서, R'은 임의로 치환된 페닐이다. 일부 구현예에서, R'은 임의로 치환된 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, 예를 들어, -C(O)R''에서 R''은 R이다. 일부 구현예에서, R은 C1-6 지방족, 아릴, 헤테로시클릴, 및 헤테로아릴로부터 선택되는 임의로 치환된 기이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-6 지방족이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 구현예에서, R'은 임의로 치환된 C1-6 알케닐이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-6 알키닐이다. 일부 구현예에서, R은 메틸이다. 일부 구현예에서 -X-RL은 -NHC(O)CH3이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 메틸이다. 일부 구현예에서, R은 -CF3이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 에틸이다. 일부 구현예에서, R은 에틸이다. 일부 구현예에서, R은 -CH2CHF2이다. 일부 구현예에서, R은 -CH2CH2OCH3이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-20(예를 들어, C1-6, C2-6, C3-6, C1-10, C2-10, C3-10, C2-20, C3-20, C10-20, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 등) 지방족이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-20(예를 들어, C1-6, C2-6, C3-6, C1-10, C2-10, C3-10, C2-20, C3-20, C10-20, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 등) 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 선형 C2-20 지방족이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 선형 C2-20 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 선형 C2-20 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, 또는 C20 지방족이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, 또는 C20 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 선형 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, 또는 C20 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 선형 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, 또는 C20 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 아릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 페닐이다. 일부 구현예에서, R은 p-메틸페닐이다. 일부 구현예에서, R은 벤질이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 1,3-디아졸릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 2-(1,3)-디아졸릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 1-메틸-2-(1,3)-디아졸릴이다. 일부 구현예에서, RL은 -(CH2)5NH2이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00143
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00144
이다. 일부 구현예에서, R''은 -N(R')2이다. 일부 구현예에서, R''은 -N(CH3)2이다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N(R')CON(RL)2이고, R' 및 RL은 각각 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -NHCON(RL)2이고, RL은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 2개의 R' 또는 2개의 RL은 이들이 부착된 질소 원자와 함께, 본원에 기재된 바와 같이 고리를 형성한다(예를 들어 임의로 치환된
Figure pct00145
,
Figure pct00146
,
Figure pct00147
,
Figure pct00148
,
Figure pct00149
,
Figure pct00150
,
Figure pct00151
,
Figure pct00152
,
Figure pct00153
,
Figure pct00154
,
Figure pct00155
,
Figure pct00156
,
Figure pct00157
또는
Figure pct00158
). 일부 구현예에서, 예를 들어, -C(O)R''에서 R"은 -OR'이고, R'은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, R'은 본원에 기재된 바와 같은 R이다. 일부 구현예에서, R'은 임의로 치환된 C1-6 지방족이다. 일부 구현예에서, R'은 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 구현예에서, R''은 -OCH3이다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N(R')C(O)ORL이고, R' 및 RL은 각각 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, R은
Figure pct00159
이다. 일부 구현예에서 -X-RL은 -NHC(O)OCH3이다. 일부 구현예에서 -X-RL은 -NHC(O)N(CH3)2이다. 일부 구현예에서, 연결은 -OP(O)(NHC(O)CH3)O-이다. 일부 구현예에서, 연결은 -OP(O)(NHC(O)OCH3)O-이다. 일부 구현예에서, 연결은 -OP(O)(NHC(O)(p-메틸페닐))O-이다. 일부 구현예에서, 연결은 -OP(O)(NHC(O)N(CH3)2)O-이다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N(R')RL이고, R' 및 RL은 각각 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N(R')RL이고, R' 및 RL은 각각 독립적으로 수소가 아니다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -NHRL이고, RL은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, RL은 수소가 아니다. 일부 구현예에서, RL은 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, RL은 임의로 치환된 아릴이다. 일부 구현예에서, RL은 임의로 치환된 페닐이다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N(R')2이고, 각각의 R'은 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -NHR'이고, R'은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -NHR이고, R은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, -X-RL은 RL이고, RL은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, RL은 -N(R')2이고, 각각의 R'은 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, RL은 -NHR'이고, R'은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, RL은 -NHR이고, R은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, RL은 -N(R')2이고, 각각의 R'은 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, -N(R')2에서 R' 중 어느 것도 수소가 아니다. 일부 구현예에서, RL은 -N(R')2이고, 각각의 R'은 독립적으로 C1-6 지방족이다. 일부 구현예에서, RL은 -L-R'이고, L 및 R'은 각각 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, RL은 -L-R이고, L 및 R은 각각 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, RL은 -N(R')-Cy-N(R')-R'이다. 일부 구현예에서, RL은 -N(R')-Cy-C(O)-R'이다. 일부 구현예에서, RL은 -N(R')-Cy-O-R'이다. 일부 구현예에서, RL은 -N(R')-Cy-SO2-R'이다. 일부 구현예에서, RL은 -N(R')-Cy-SO2-N(R')2이다. 일부 구현예에서, RL은 -N(R')-Cy-C(O)-N(R')2이다. 일부 구현예에서, RL은 -N(R')-Cy-OP(O)(R'')2이다. 일부 구현예에서, -Cy-는 임의로 치환된 2가 아릴 기이다. 일부 구현예에서, -Cy-는 임의로 치환된 페닐렌이다. 일부 구현예에서, -Cy-는 임의로 치환된 1,4-페닐렌이다. 일부 구현예에서, -Cy-는 1,4-페닐렌이다. 일부 구현예에서, RL은 -N(CH3)2이다. 일부 구현예에서, RL은 -N(i-Pr)2이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00160
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00161
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00162
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00163
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00164
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00165
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00166
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00167
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00168
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00169
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00170
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00171
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00172
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00173
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00174
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00175
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00176
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00177
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00178
,
Figure pct00179
,
Figure pct00180
,
Figure pct00181
,
Figure pct00182
,
Figure pct00183
,
Figure pct00184
,
Figure pct00185
,
Figure pct00186
,
Figure pct00187
,
Figure pct00188
,
Figure pct00189
,
Figure pct00190
,
Figure pct00191
,
Figure pct00192
,
Figure pct00193
,
Figure pct00194
,
Figure pct00195
,
Figure pct00196
,
Figure pct00197
,
Figure pct00198
,
Figure pct00199
,
Figure pct00200
,
Figure pct00201
,
Figure pct00202
,
Figure pct00203
,
Figure pct00204
또는
Figure pct00205
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N(R')-C(O)-Cy-RL이다. 일부 구현예에서, -X-RL은 RL이다. 일부 구현예에서, RL은 -N(R')-C(O)-Cy-O-R'이다. 일부 구현예에서, RL은 -N(R')-C(O)-Cy-R'이다. 일부 구현예에서, RL은 -N(R')-C(O)-Cy-C(O)-R'이다. 일부 구현예에서, RL은 -N(R')-C(O)-Cy-N(R')2이다. 일부 구현예에서, RL은 -N(R')-C(O)-Cy-SO2-N(R')2이다. 일부 구현예에서, RL은 -N(R')-C(O)-Cy-C(O)-N(R')2이다. 일부 구현예에서, RL은 -N(R')-C(O)-Cy-C(O)-N(R')-SO2-R'이다. 일부 구현예에서, R'은 본원에 기재된 바와 같은 R이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00206
,
Figure pct00207
,
Figure pct00208
,
Figure pct00209
,
Figure pct00210
,
Figure pct00211
,
Figure pct00212
,
Figure pct00213
,
Figure pct00214
,
Figure pct00215
,
Figure pct00216
,
Figure pct00217
,
Figure pct00218
,
Figure pct00219
,
Figure pct00220
,
Figure pct00221
,
Figure pct00222
,
Figure pct00223
,
Figure pct00224
,
Figure pct00225
,
Figure pct00226
,
Figure pct00227
,
Figure pct00228
,
Figure pct00229
,
Figure pct00230
,
Figure pct00231
또는
Figure pct00232
이다.
본원에 기재된 바와 같이, 일부 구현예에서, L, 또는 L을 포함하거나 L인 변수의 하나 이상의 메틸렌 단위는 독립적으로-O-, -N(R')-, -C(O)-, -C(O)N(R')-, -SO2-, -SO2N(R')-, 또는 -Cy-로 대체된다. 일부 구현예에서, 메틸렌 단위는 -Cy-로 대체된다. 일부 구현예에서, -Cy-는 임의로 치환된 2가 아릴 기이다. 일부 구현예에서, -Cy-는 임의로 치환된 페닐렌이다. 일부 구현예에서, -Cy-는 임의로 치환된 1,4-페닐렌이다. 일부 구현예에서, -Cy-는 1~10개(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 헤테로원자를 갖는, 임의로 치환된 2가 5~20(예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20)원 헤테로아릴 기이다. 일부 구현예에서, -Cy-는 단환이다. 일부 구현예에서, -Cy-는 이환이다. 일부 구현예에서, -Cy-는 다환이다. 일부 구현예에서, -Cy-의 각 단환 단위는 독립적으로 3~10(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)원이고, 독립적으로 포화, 부분 포화, 또는 방향족이다. 일부 구현예에서, -Cy-는 임의로 치환된 3~20(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20)원 단환, 이환, 또는 다환 지방족 기이다. 일부 구현예에서, -Cy-는 1~10개(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 헤테로원자를 갖는, 임의로 치환된 3~20(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20)원 단환, 이환, 또는 다환 헤테로지방족 기이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=O)(-N(R')P(O)(R'')2)-의 구조를 갖고, 각각의 R''은 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=S)(-N(R')P(O)(R'')2)-의 구조를 갖고, 각각의 R''은 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=O)(-N(R')P(O)(R'')2)O-의 구조를 갖고, 각각의 R''은 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=S)(-N(R')P(O)(R'')2)O-의 구조를 갖고, 각각의 R''은 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=O)(-N(R')P(O)(R'')2)O-의 구조를 갖고, 각각의 R''은 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=S)(-N(R')P(O)(R'')2)O-의 구조를 갖고, 각각의 R''은 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 예를 들어, -N(R')-의 R'은 수소 또는 임의로 치환된 C1-6 지방족이다. 일부 구현예에서, R'은 C1-6 알킬이다. 일부 구현예에서, R'은 수소이다. 일부 구현예에서, 예를 들어, -P(O)(R'')2에서 R''은 본원에 기재된 바와 같은 R'이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=O)(-NHP(O)(R'')2)-의 구조를 갖고, 각각의 R''은 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=S)(-NHP(O)(R'')2)-의 구조를 갖고, 각각의 R''은 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=O)(-NHP(O)(R'')2)O-의 구조를 갖고, 각각의 R''은 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -P(=S)(-NHP(O)(R'')2)O-의 구조를 갖고, 각각의 R''은 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=O)(-NHP(O)(R'')2)O-의 구조를 갖고, 각각의 R''은 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=S)(-NHP(O)(R'')2)O-의 구조를 갖고, 각각의 R''은 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 예를 들어, -P(O)(R'')2에서 R''의 존재는 R이다. 일부 구현예에서, R은 C1-6 지방족, 아릴, 헤테로시클릴, 및 헤테로아릴로부터 선택되는 임의로 치환된 기이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-6 지방족이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 구현예에서, R'은 임의로 치환된 C1-6 알케닐이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-6 알키닐이다. 일부 구현예에서, R은 메틸이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 메틸이다. 일부 구현예에서, R은 -CF3이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 에틸이다. 일부 구현예에서, R은 에틸이다. 일부 구현예에서, R은 -CH2CHF2이다. 일부 구현예에서, R은 -CH2CH2OCH3이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-20(예를 들어, C1-6, C2-6, C3-6, C1-10, C2-10, C3-10, C2-20, C3-20, C10-20, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 등) 지방족이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-20(예를 들어, C1-6, C2-6, C3-6, C1-10, C2-10, C3-10, C2-20, C3-20, C10-20, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 등) 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 선형 C2-20 지방족이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 선형 C2-20 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 선형 C2-20 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 이소프로필이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, 또는 C20 지방족이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, 또는 C20 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 선형 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, 또는 C20 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 선형 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, 또는 C20 알킬이다. 일부 구현예에서, 각각의 R"은 독립적으로 본원에 기재된 바와 같은 R이고, 예를 들어 일부 구현예에서, 각각의 R"은 메틸이다. 일부 구현예에서, R''은 임의로 치환된 아릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 페닐이다. 일부 구현예에서, R은 p-메틸페닐이다. 일부 구현예에서, R은 벤질이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 1,3-디아졸릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 2-(1,3)-디아졸릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 1-메틸-2-(1,3)-디아졸릴이다. 일부 구현예에서, R''의 존재는 -N(R')2이다. 일부 구현예에서, R''은 -N(CH3)2이다. 일부 구현예에서, 예를 들어, -P(O)(R'')2에서 R"의 존재는 -OR'이고, R'은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, R'은 본원에 기재된 바와 같은 R이다. 일부 구현예에서, R'은 임의로 치환된 C1-6 지방족이다. 일부 구현예에서, R'은 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 구현예에서, R''은 -OCH3이다. 일부 구현예에서, 각각의 R''은 본원에 기재된 바와 같은 -OR'이다. 일부 구현예에서, 각각의 R''은 -OCH3이다. 일부 구현예에서, 각각의 R''은 -OH이다. 일부 구현예에서, 연결은 -OP(O)(NHP(O)(OH)2)O-이다. 일부 구현예에서, 연결은 -OP(O)(NHP(O)(OCH3)2)O-이다. 일부 구현예에서, 연결은 -OP(O)(NHP(O)(CH3)2)O-이다.
일부 구현예에서, -N(R'')2는 -N(R')2이다. 일부 구현예에서, -N(R'')2는 -NHR이다. 일부 구현예에서, -N(R'')2는 -NHC(O)R이다. 일부 구현예에서, -N(R'')2는 -NHC(O)OR이다. 일부 구현예에서, -N(R'')2는 -NHS(O)2R이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 포스포릴 구아니딘 뉴클레오티드간 연결이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 본원에 기재된 바와 같이 -X-RL을 포함한다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N=C(-LL-RL)2이다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N=C[N(RL)2]2이다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N=C[NR'RL]2이다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N=C[N(R')2]2이다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N=C[N(RL)2](CHRL1RL2)이고, RL1 및 RL2는 각각 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N=C(NR'RL)(CHRL1RL2)이고, RL1 및 RL2는 각각 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N=C(NR'RL)(CR'RL1RL2)이고, RL1 및 RL2는 각각 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N=C[N(R')2](CHR'RL2)이다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N=C[N(RL)2](RL)이다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N=C(NR'RL)(RL)이다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N=C(NR'RL)(R')이다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N=C[N(R')2](R')이다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N=C(NR'RL1)(NR'RL2)이고, RL1 및 RL2는 각각 독립적으로 RL이고, R' 및 RL은 각각 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N=C(NR'RL1)(NR'RL2)이고, 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N=C(NR'RL1)(CHR'RL2)이고, 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N=C(NR'RL1)(R')고, 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 각각의 R'은 독립적으로 R이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-6 지방족이다. 일부 구현예에서, R은 메틸이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00233
이다. 일부 구현예에서, R', RL, RL1, RL2 등으로부터 선택된 2개의 기(일부 구현예에서, 동일한 원자 상의, 예를 들어, -N(R')2, 또는 -NR'RL, 또는 -N(RL)2(R' 및 RL은 독립적으로 본원에 기재된 바와 같은 R일 수 있음)), 또는 다른 원자 상의, 예를 들어, -N=C(NR'RL)(CR'RL1RL2) 또는 -N=C(NR'RL1)(NR'RL2)의 두 개의 R')는 독립적으로 R이고, 이들의 개재 원자와 함께, 본원에 기재된 바와 같은 고리를 형성한다. 일부 구현예에서, 동일한 원자 상의 R, R', RL, RL1, 또는RL2(예를 들어, -N(R')2, -N(RL)2, -NR'RL, -NR'RL1, -NR'RL2, -CR'RL1RL2 등) 중 2개는 함께, 본원에 기재된 바와 같은 고리를 형성한다. 일부 구현예에서, 두 개의 다른 원자 상의 R', RL, RL1, 또는 RL2 중 2개(예를 들어, -N=C(NR'RL)(CR'RL1RL2), -N=C(NR'RL1)(NR'RL2) 등의 두 개의 R')는 함께, 본원에 기재된 바와 같은 고리를 형성한다. 일부 구현예에서, 형성된 고리는 0~5개의 추가 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 3~20개(예를 들어, 3~15, 3~12, 3~10, 3~9, 3~8, 3~7, 3~6, 4~15, 4~12, 4~10, 4~9, 4~8 , 4~7, 4~6, 5~15, 5~12, 5~10, 5~9, 5~8, 5~7, 5~6, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 등)의 단환, 이환, 또는 삼환 고리이다. 일부 구현예에서, 형성된 고리는 본원에 기술된 바와 같이 단환이다. 일부 구현예에서, 형성된 고리는 본원에 임의로 치환된 5~10원 단환 고리이다. 일부 구현예에서, 형성된 고리는 이환이다. 일부 구현예에서, 형성된 고리는 다환이다. 일부 구현예에서, R이거나 R일 수 있는 두 개의 기(예를 들어, -N=C(NR'RL)(CR'RL1RL2) 또는 -N=C(NR'RL1)(NR'RL2)의 두 개의 R', -N=C(NR'RL)(CR'RL1RL2), -N=C(NR'RL1)(NR'RL2) 등의 두 개의 R')는 함께, 임의로 치환된 2가 탄화수소 사슬, 예를 들어 임의로 치환된 C1-20 지방족 사슬, 임의로 치환된 -(CH2)n(n은 1~20(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20)을 형성한다. 일부 구현예에서, 탄화수소 사슬은 포화되어 있다. 일부 구현예에서, 탄화수소 사슬은 부분적으로 불포화되어 있다. 일부 구현예에서, 탄화수소 사슬은 불포화되어 있다. 일부 구현예에서, R이거나 R일 수 있는 두 개의 기(예를 들어, -N=C(NR'RL)(CR'RL1RL2) 또는 -N=C(NR'RL1)(NR'RL2)의 두 개의 R', -N=C(NR'RL)(CR'RL1RL2), -N=C(NR'RL1)(NR'RL2) 등의 두 개의 R')는 함께, 임의로 치환된 2가 헤테로지방족 사슬, 예를 들어 1~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 C1-20 헤테로지방족 사슬을 형성한다. 일부 구현예에서, 헤테로지방족 사슬은 포화되어 있다. 일부 구현예에서, 헤테로지방족 사슬은 부분적으로 불포화되어 있다. 일부 구현예에서, 헤테로지방족 사슬은 불포화되어 있다. 일부 구현예에서, 사슬은 임의로 치환된 -(CH2)-이다. 일부 구현예에서, 사슬은 임의로 치환된 -(CH2)2-이다. 일부 구현예에서, 사슬은 임의로 치환된 -(CH2)-이다. 일부 구현예에서, 사슬은 임의로 치환된 -(CH2)2-이다. 일부 구현예에서, 사슬은 임의로 치환된 -(CH2)3-이다. 일부 구현예에서, 사슬은 임의로 치환된 -(CH2)4-이다. 일부 구현예에서, 사슬은 임의로 치환된 -(CH2)5-이다. 일부 구현예에서, 사슬은 임의로 치환된 -(CH2)6-이다. 일부 구현예에서, 사슬은 임의로 치환된 -CH=CH-이다. 일부 구현예에서, 사슬은 임의로 치환된
Figure pct00234
이다. 일부 구현예에서, 사슬은 임의로 치환된
Figure pct00235
이다. 일부 구현예에서, 사슬은 임의로 치환된
Figure pct00236
이다. 일부 구현예에서, 사슬은 임의로 치환된
Figure pct00237
이다. 일부 구현예에서, 사슬은 임의로 치환된
Figure pct00238
이다. 일부 구현예에서, 사슬은 임의로 치환된
Figure pct00239
이다. 일부 구현예에서, 사슬은 임의로 치환된
Figure pct00240
이다. 일부 구현예에서, 사슬은 임의로 치환된
Figure pct00241
이다. 일부 구현예에서, 사슬은 임의로 치환된
Figure pct00242
이다. 일부 구현예에서, 상이한 원자 상의 R, R', RL, RL1, RL2 등 중 2개는 함께, 본원에 기재된 바와 같이 고리를 형성한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00243
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00244
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00245
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00246
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00247
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00248
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00249
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00250
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00251
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00252
이다. 일부 구현예에서, -N(R')2, -N(R)2, -N(RL)2, -NR'RL, -NR'RL1, -NR'RL2, -NRL1RL2 등은 형성된 고리이다. 일부 구현예에서, 고리는 임의로 치환된
Figure pct00253
이다. 일부 구현예에서, 고리는 임의로 치환된
Figure pct00254
이다. 일부 구현예에서, 고리는 임의로 치환된
Figure pct00255
이다. 일부 구현예에서, 고리는 임의로 치환된
Figure pct00256
이다. 일부 구현예에서, 고리는 임의로 치환된
Figure pct00257
이다. 일부 구현예에서, 고리는 임의로 치환된
Figure pct00258
이다. 일부 구현예에서, 고리는 임의로 치환된
Figure pct00259
이다. 일부 구현예에서, 고리는 임의로 치환된
Figure pct00260
이다. 일부 구현예에서, 고리는 임의로 치환된
Figure pct00261
이다. 일부 구현예에서, 고리는 임의로 치환된
Figure pct00262
이다. 일부 구현예에서, 고리는 임의로 치환된
Figure pct00263
이다. 일부 구현예에서, 고리는 임의로 치환된
Figure pct00264
이다. 일부 구현예에서, 고리는 임의로 치환된
Figure pct00265
이다. 일부 구현예에서, 고리는 임의로 치환된
Figure pct00266
이다. 일부 구현예에서, 고리는 임의로 치환된
Figure pct00267
이다.
일부 구현예에서, RL1과 RL2는 동일하다. 일부 구현예에서, RL1과 RL2는 상이하다. 일부 구현예에서, RL1 및 RL2은 각각 독립적으로 예를 들어 하기의 본원에 기재된 바와 같은 RL이다.
일부 구현예에서, RL은 임의로 치환된 C1-30 지방족이다. 일부 구현예에서, RL은 임의로 치환된 C1-30 알킬이다. 일부 구현예에서, RL은 선형이다. 일부 구현예에서, RL은 임의로 치환된 선형 C1-30 알킬이다. 일부 구현예에서, RL은 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 구현예에서, RL은 메틸이다. 일부 구현예에서, RL은 에틸이다. 일부 구현예에서, RL은 n-프로필이다. 일부 구현예에서, RL은 이소프로필이다. 일부 구현예에서, RL은 n-부틸이다. 일부 구현예에서, RL은 tert-부틸이다. 일부 구현예에서, RL은 (E)-CH2-CH=CH-CH2-CH3이다. 일부 구현예에서, RL은 (Z)-CH2-CH=CH-CH2-CH3이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00268
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00269
이다. 일부 구현예에서, RL은 CH3(CH2)2C≡CC≡C(CH2)3-이다. 일부 구현예에서, RL은 CH3(CH2)5C≡C-이다. 일부 구현예에서, RL은 임의로 치환된 아릴이다. 일부 구현예에서, RL은 임의로 치환된 페닐이다. 일부 구현예에서, RL은 하나 이상의 할로겐으로 치환된 페닐이다. 일부 구현예에서, RL은 할로겐, -N(R'), 또는 -N(R')C(O)R'로 임의로 치환된 페닐이다. 일부 구현예에서, RL은 -Cl, -Br, -F, -N(Me)2, 또는 -NHCOCH3로 임의로 치환된 페닐이다. 일부 구현예에서, RL은 -LL-R'이고, LL은 임의로 치환된 C1-20 포화, 부분 불포화, 또는 불포화 탄화수소 사슬이다. 일부 구현예에서, 이러한 탄화수소 사슬은 선형이다. 일부 구현예에서, 이러한 탄화수소 사슬은 치환되지 않는다. 일부 구현예에서, LL은 (E)-CH2-CH=CH-이다. 일부 구현예에서, LL은 -CH2-C≡C-CH2-이다. 일부 구현예에서, LL은 -(CH2)3-이다. 일부 구현예에서, LL은 -(CH2)4-이다. 일부 구현예에서, LL은 -(CH2)n-이고, n은 1~30(예를 들어, 1~20, 5~30, 6~30, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 등). 일부 구현예에서, R'은 본원에 기재된 바와 같은 임의로 치환된 아릴이다. 일부 구현예에서, R'은 임의로 치환된 페닐이다. 일부 구현예에서, R'은 페닐이다. 일부 구현예에서, R'은 본원에 기재된 바와 같은 임의로 치환된 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, R'은 2'-피리디닐이다. 일부 구현예에서, R'은 3'-피리디닐이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00270
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00271
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00272
이다. 일부 구현예에서, RL은 -LL-N(R')2이고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 각각의 R'은 독립적으로 본원에 기재된 바와 같은 C1-6 지방족이다. 일부 구현예에서, -N(R')2는 -N(CH3)2이다. 일부 구현예에서, -N(R')2는 -NH2이다. 일부 구현예에서, RL은 -(CH2)n-N(R')2이고, n은 1~30(예를 들어, 1~20, 5~30, 6~30, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 등). 일부 구현예에서, RL은 -(CH2CH2O)n-CH2CH2-N(R')2이고, n은 1~30(예를 들어, 1~20, 5~30, 6~30, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 등). 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00273
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00274
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00275
이다. 일부 구현예에서, RL은 -(CH2)n-NH2이다. 일부 구현예에서, RL은 -(CH2CH2O)n-CH2CH2-NH2이다. 일부 구현예에서, RL은 -(CH2CH2O)n-CH2CH2-R'이고, n은 1~30(예를 들어, 1~20, 5~30, 6~30, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 등). 일부 구현예에서, RL은 -(CH2CH2O)n-CH2CH2CH3이고, n은 1~30(예를 들어, 1~20, 5~30, 6~30, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 등). 일부 구현예에서, RL은 -(CH2CH2O)n-CH2CH2OH이고, n은 1~30(예를 들어, 1~20, 5~30, 6~30, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 등). 일부 구현예에서, RL은 탄수화물 모이어티, 예를 들어 GalNAc이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, RL은 -LL-GalNAc이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00276
이다. 일부 구현예에서, LL의 하나 이상의 메틸렌 단위는 독립적으로 -Cy-(예를 들어, 임의로 치환된 1,4-페닐렌, 임의로 치환된 3~30원 2가 단환, 이환, 또는 다환 지환족 고리 등), -O-, -N(R')-(예를 들어, -NH), -C(O)-, -C(O)N(R')-(예를 들어, -C(O)NH-), -C(NR')-(예를 들어, -C(NH)-), -N(R')C(O)(N(R')-(예를 들어, -NHC(O)NH-), -N(R')C(NR')(N(R')-(예를 들어, -NHC(NH)NH-), -(CH2CH2O)n- 등으로 대체된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00277
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00278
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00279
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00280
이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00281
이고, n은 0~20이다. 일부 구현예에서, RL은 링커(2가 또는 다가일 수 있음)를 통해 연결된 임의로 치환된 하나 이상의 추가 화학적 모이어티(예를 들어, 탄수화물 모이어티, GalNAc 모이어티 등)이거나 이를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00282
이고, n은 0~20이다. 일부 구현예에서, RL은
Figure pct00283
이고, n은 0~20이다. 일부 구현예에서, RL은 본원에 기재된 바와 같은 R'이다. 본원에 기재된 바와 같이, 많은 변수는 독립적으로 R'일 수 있다. 일부 구현예에서, R'은 본원에 기재된 바와 같은 R이다. 본원에 기재된 바와 같이, 많은 변수는 독립적으로 R일 수 있다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1--6 지방족이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 메틸이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 시클로지방족이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 시클로알킬이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 아릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 페닐이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 헤테로시클릴이다. 일부 구현예에서, R은 1~5개의 헤테로원자(예를 들어 이들 중 하나는 질소)를 갖는 임의로 치환된 C1-20 헤테로시클릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된
Figure pct00284
이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된
Figure pct00285
이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된
Figure pct00286
이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된
Figure pct00287
이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된
Figure pct00288
이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된
Figure pct00289
이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된
Figure pct00290
이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된
Figure pct00291
이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된
Figure pct00292
이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된
Figure pct00293
이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된
Figure pct00294
이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된
Figure pct00295
이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된
Figure pct00296
이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된
Figure pct00297
이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된
Figure pct00298
이다.
일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00299
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00300
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00301
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00302
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00303
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00304
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00305
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00306
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00307
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00308
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00309
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00310
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00311
이고, n은 1~20이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00312
이고, n은 1~20이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00313
,
Figure pct00314
,
Figure pct00315
,
Figure pct00316
,
Figure pct00317
,
Figure pct00318
,
Figure pct00319
,
Figure pct00320
및
Figure pct00321
로부터 선택된다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00322
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00323
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00324
이다.
일부 구현예에서, RL은 본원에 기재된 바와 같은 R''이다. 일부 구현예에서, RL은 본원에 기재된 바와 같은 R이다.
일부 구현예에서, R'' 또는 RL은 추가 화학적 모이어티이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, R'' 또는 RL은 추가 화학적 모이어티이거나 이를 포함하고, 추가 화학적 모이어티는 탄수화물 모이어티이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, R'' 또는 RL은 GalNAc이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, RL 또는 R''은 추가 화학적 모이어티로 대체되거나, 이에 연결하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, X는 -O-이다. 일부 구현예에서, X는 -S-이다. 일부 구현예에서, X는 -LL-N(-LL-RL)-LL-이다. 일부 구현예에서, X는 -N(-LL-RL)-LL-이다. 일부 구현예에서, X는 -LL-N(-LL-RL)-이다. 일부 구현예에서, X는 -N(-LL-RL)-이다. 일부 구현예에서, X는 -LL-N=C(-LL-RL)-LL-이다. 일부 구현예에서, X는 -N=C(-LL-RL)-LL-이다. 일부 구현예에서, X는 -LL-N=C(-LL-RL)-이다. 일부 구현예에서, X는 -N=C(-LL-RL)-이다. 일부 구현예에서, X는 LL이다. 일부 구현예에서, X는 공유 결합이다.
일부 구현예에서, Y는 공유 결합이다. 일부 구현예에서, Y는 -O-이다. 일부 구현예에서, Y는 -N(R')-이다. 일부 구현예에서, Z는 공유 결합이다. 일부 구현예에서, Z는 -O-이다. 일부 구현예에서, Z는 -N(R')-이다. 일부 구현예에서, R'은 R이다. 일부 구현예에서, R은 -H이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1--6 지방족이다. 일부 구현예에서, R은 메틸이다. 일부 구현예에서, R은 에틸이다. 일부 구현예에서, R은 프로필이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 페닐이다. 일부 구현예에서, R은 페닐이다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 구조에서 다양한 변수는 R일 수 있거나 R을 포함할 수 있다. R에 대한 적합한 구현예는 본 발명에 광범위하게 기술되어 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, R일 수 있는 변수에 대해 기술된 R 구현예는 또한 R일 수 있는 또 다른 변수에 적용될 수 있다. 마찬가지로, 변수에 대한 구성요소/모이어티(예를 들어, L)에 대해 기술된 구현예는 또한 구성요소/모이어티일 수 있거나 이를 포함할 수 있는 다른 변수에 적용될 수 있다.
일부 구현예에서, R''은 R'이다. 일부 구현예에서, R''은 -N(R')2이다.
일부 구현예에서, -X-RL은 -SH이다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -OH이다.
일부 구현예에서, -X-RL은 -N(R')2이다. 일부 구현예에서, 각각의 R'은 독립적으로 임의로 치환된 C1-6 지방족이다. 일부 구현예에서, 각각의 R'은 독립적으로 메틸이다.
일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=O)(-N=C((N(R')2)2-O-의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 하나의 N(R')2의 R' 기는 R이고, 나머지 N(R')2의 R' 기는 R이고, 2개의 R 기는 이들의 개재 원자와 함께, 임의의 치환된 고리, 예를 들어, n001에서와 같은 5원의 고리를 형성한다. 일부 구현예에서, 각각의 R'은 독립적으로 R이고, 각각의 R은 독립적으로 임의의 치환된 치환 C1-6 지방족이다.
일부 구현예에서, -X-RL은 -N=C(-LL-R')2이다. 일부 구현예에서, -X-RL는 -N=C(-LL1-LL2-LL3-R')2이고, LL1, LL2, 및 LL3각각은 독립적으로 L''이고, 각각의 L''은 독립적으로 공유 결합, 또는 C1-10 지방족 기 및 1~10개의 헤테로원자를 갖는 C1-10 헤테로지방족 기로부터 선택되는 2가의 임의로 치환된 선형 또는 분지형 기(여기서, 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 그리고 독립적으로 C1-6 알킬렌, C1-6 알케닐렌, -C≡C-, 1~5개의 헤테로원자를 갖는 2가 C1-6 헤테로지방족 기, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -C(O)S-, -C(O)O-, -P(O)(OR')-, -P(O)(SR')-, -P(O)(R')-, -P(O)(NR')-, -P(S)(OR')-, -P(S)(SR')-, -P(S)(R')-, -P(S)(NR')-, -P(R')-, -P(OR')-, -P(SR')-, -P(NR')-, -P(OR')[B(R')3]-, -OP(O)(OR')O-, -OP(O)(SR')O-, -OP(O)(R')O-, -OP(O)(NR')O-, -OP(OR')O-, -OP(SR')O-, -OP(NR')O-, -OP(R')O-, 또는 -OP(OR')[B(R')3]O-로부터 선택되는 임의로 치환된 기로 대체되고, 하나 이상의 질소 또는 탄소 원자는 임의로 그리고 독립적으로 CyL로 대체됨)이다. 일부 구현예에서, LL2는 -Cy-이다. 일부 구현예에서, LL1은 공유 결합이다. 일부 구현예에서, LL3은 공유 결합이다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N=C(-LL1-Cy-LL3-R')2이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00325
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00326
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00327
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00328
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00329
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00330
이다.
일부 구현예에서, 본 발명에서 사용된 바와 같이, L은 공유 결합이다. 일부 구현예에서, L은 C1-30 지방족 기 및 1~10개의 헤테로원자를 갖는 C1-30 헤테로지방족 기로부터 선택되는 2가의 임의로 치환된 선형 또는 분지형 기(여기서, 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 그리고 독립적으로 C1-6 알킬렌, C1-6 알케닐렌, -C≡C-, 1~5개의 헤테로원자를 갖는 2가 C1-C6 헤테로지방족 기, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -C(O)S-, -C(O)O-, -P(O)(OR')-, -P(O)(SR')-, -P(O)(R')-, -P(O)(NR')-, -P(S)(OR')-, -P(S)(SR')-, -P(S)(R')-, -P(S)(NR')-, -P(R')-, -P(OR')-, -P(SR')-, -P(NR')-, -P(OR')[B(R')3]-, -OP(O)(OR')O-, -OP(O)(SR')O-, -OP(O)(R')O-, -OP(O)(NR')O-, -OP(OR')O-, -OP(SR')O-, -OP(NR')O-, -OP(R')O-, 또는 -OP(OR')[B(R')3]O-로부터 선택되는 임의로 치환된 기로 대체되고, 하나 이상의 질소 또는 탄소 원자는 임의로 그리고 독립적으로 CyL로 대체됨)이다. 일부 구현예에서, L은 C1-30 지방족 기 및 1~10개의 헤테로원자를 갖는 C1-30 헤테로지방족 기로부터 선택되는 2가의 임의로 치환된 선형 또는 분지형 기(여기서, 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 그리고 독립적으로 -C≡C-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -C(O)S-, -C(O)O-, -P(O)(OR')-, -P(O)(SR')-, -P(O)(R')-, -P(O)(NR')-, -P(S)(OR')-, -P(S)(SR')-, -P(S)(R')-, -P(S)(NR')-, -P(R')-, -P(OR')-, -P(SR')-, -P(NR')-, -P(OR')[B(R')3]-, -OP(O)(OR')O-, -OP(O)(SR')O-, -OP(O)(R')O-, -OP(O)(NR')O-, -OP(OR')O-, -OP(SR')O-, -OP(NR')O-, -OP(R')O-, 또는 -OP(OR')[B(R')3]O-로부터 선택되는 임의로 치환된 기로 대체되고, 하나 이상의 질소 또는 탄소 원자는 임의로 그리고 독립적으로 CyL로 대체됨)이다. 일부 구현예에서, L은 C1-10 지방족 기 및 1~10개의 헤테로원자를 갖는 C1-10 헤테로지방족 기로부터 선택되는 2가의 임의로 치환된 선형 또는 분지형 기(여기서, 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 그리고 독립적으로 -C≡C-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -C(O)S-, -C(O)O-, -P(O)(OR')-, -P(O)(SR')-, -P(O)(R')-, -P(O)(NR')-, -P(S)(OR')-, -P(S)(SR')-, -P(S)(R')-, -P(S)(NR')-, -P(R')-, -P(OR')-, -P(SR')-, -P(NR')-, -P(OR')[B(R')3]-, -OP(O)(OR')O-, -OP(O)(SR')O-, -OP(O)(R')O-, -OP(O)(NR')O-, -OP(OR')O-, -OP(SR')O-, -OP(NR')O-, -OP(R')O-, 또는 -OP(OR')[B(R')3]O-로부터 선택되는 임의로 치환된 기로 대체되고, 하나 이상의 질소 또는 탄소 원자는 임의로 그리고 독립적으로 CyL로 대체됨)이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 그리고 독립적으로 -C≡C-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -C(O)S-, 또는 -C(O)O-부터 선택되는 임의로 치환된 기로 대체된다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 포스포릴 구아니딘 뉴클레오티드간 연결이다. 일부 구현예에서, -X-RL은 -N=C[N(R')2]2이다. 일부 구현예에서, 각각의 R'은 독립적으로 R이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-6 지방족이다. 일부 구현예에서, R은 메틸이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00331
이다. 일부 구현예에서, 질소 원자 상의 하나의 R'은 다른 질소 상의 R'과 함께 본원에 기재된 바와 같은 고리를 형성한다.
일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00332
이고, R1 및 R2는 독립적으로 R'이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00333
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00334
이다. 일부 구현예에서, 동일한 질소 상의 2개의 R'은 함께 본원에 기재된 바와 같은 고리를 형성한다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00335
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00336
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00337
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00338
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00339
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00340
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00341
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00342
이다. 일부 구현예에서, -X-RL은
Figure pct00343
이다.
일부 구현예에서, -X-RL은 본원에 기재된 바와 같은 R이다. 일부 구현예에서, R은 수소가 아니다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-6 지방족이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 메틸이다.
일부 구현예에서, -X-RL은 하기의 표로부터 선택된다. 일부 구현예에서, X는 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, RL은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 연결은 -Y-PL(-X-RL)-Z-의 구조를 갖고, -X-RL은 하기의 표로부터 선택되고, 각각의 다른 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 연결은 -P(O)(-X-RL)-의 구조를 갖거나 이를 포함하고, -X-RL은 하기의 표로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 연결은 -P(S)(-X-RL)-의 구조를 갖거나 이를 포함하고, -X-RL은 하기의 표로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 연결은 -P(-X-RL)-의 구조를 갖거나 이를 포함하고, -X-RL은 하기의 표로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 연결은 -O-P(O)(-X-RL)-O-의 구조를 갖거나 이를 포함하고, -X-RL은 하기의 표로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 연결은 -O-P(S)(-X-RL)-O-의 구조를 갖거나 이를 포함하고, -X-RL은 하기의 표로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 연결은 -O-P(-X-RL)-O-의 구조를 갖거나 이를 포함하고, -X-RL은 하기의 표로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 연결은 -O-P(O)(-X-RL)-O-의 구조를 갖고, -X-RL은 하기의 표로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 연결은 -O-P(S)(-X-RL)-O-의 구조를 갖고, -X-RL은 하기의 표로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 연결은 -O-P(-X-RL)-O-의 구조를 갖고, -X-RL은 하기의 표로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 하기 표에서, n은 0~20이거나 본원에 기재된 바와 같다.
표 L-1. 연결 인에 결합된 유용한 특정 모이어티(예를 들어, -X-RL).
Figure pct00344
Figure pct00345
Figure pct00346
(각각의 RLS는 독립적으로 Rs임). 일부 구현예에서, 각각의 RLS는 독립적으로 -Cl, -Br, -F, -N(Me)2, 또는 -NHCOCH3이다.
표 L-2. 연결 인에 결합된 유용한 특정 모이어티(예를 들어, -X-RL).
Figure pct00347
표 L-3. 연결 인에 결합된 유용한 특정 모이어티(예를 들어, -X-RL).
Figure pct00348
표 L-4. 연결 인에 결합된 유용한 특정 모이어티(예를 들어, -X-RL).
Figure pct00349
Figure pct00350
표 L-5. 연결 인에 결합된 유용한 특정 모이어티(예를 들어, -X-RL).
Figure pct00351
Figure pct00352
표 L-6. 연결 인에 결합된 유용한 특정 모이어티(예를 들어, -X-RL).
Figure pct00353
일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결, 예를 들어, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결 또는 중성 뉴클레오티드간 연결은 -LL1-CyIL-LL2-의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, LL1는 당의 3'-탄소에 결합된다. 일부 구현예에서, LL2는 당의 5'-탄소에 결합된다. 일부 구현예에서, LL1은 -O-CH2-이다. 일부 구현예에서, LL2는 공유 결합이다. 일부 구현예에서, LL2는 -N(R')-이다. 일부 구현예에서, LL2는 -NH-이다. 일부 구현예에서, LL2는 당의 5'-탄소에 결합되고, 5'-탄소는 =O로 치환된다. 일부 구현예에서, CyIL은 임의로 치환된 3~10원 포화, 부분 불포화, 또는 0~5 헤테로원자를 갖는 방향족 고리이다. 일부 구현예에서, CyIL은 임의로 치환된 트리아졸 고리이다. 일부 구현예에서, CyIL은
Figure pct00354
이다. 일부 구현예에서, 연결은
Figure pct00355
이다.
일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 -OP(=W)(-N(R')2)-O-의 구조를 갖는다.
일부 구현예에서, R'은 R이다. 일부 구현예에서, R'은 H이다. 일부 구현예에서, R'은 -C(O)R이다. 일부 구현예에서, R'은 -C(O)OR이다. 일부 구현예에서, R'은 -S(O)2R이다.
일부 구현예에서, R''은 -NHR'이다. 일부 구현예에서, -N(R')2는 -NHR'이다.
본원에 기술된 바와 같이, 일부 구현예에서, R은 H이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1--6 지방족이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 메틸이다. 일부 구현예에서, R은 치환된 메틸이다. 일부 구현예에서, R은 에틸이다. 일부 구현예에서, R은 치환된 에틸이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 중성 뉴클레오티드간 연결이다.
일부 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결)은 임의로 치환된 트리아졸릴을 포함한다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 트리아졸릴이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결)은 임의로 치환된 알키닐을 포함한다. 일부 구현예에서, R'은 임의로 치환된 알키닐이다. 일부 구현예에서, R'은 임의로 치환된 삼중 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 트리아졸 또는 알킨 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, R'은 임의로 치환된 트리아졸 또는 알킨 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 트리아졸 모이어티(예를 들어, 트리아졸릴기)는 임의로 치환된다. 일부 구현예에서, 트리아졸 모이어티(예를 들어, 트리아졸릴기)는 치환된다. 일부 구현예에서, 트리아졸 모이어티는 치환되지 않는다. 일부 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 임의로 치환된 구아니딘 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 임의로 치환된 환형 구아니딘 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, R', RL, 또는 -X-RL은 임의로 치환된 구아니딘 모이어티이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, R', RL, 또는 -X-RL은 임의로 치환된 환형 구아니딘 모이어티이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, R', RL, 또는 -X-RL은 임의로 치환된 환형 구아니딘 모이어티를 포함하고, 변형 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00356
,
Figure pct00357
, 또는
Figure pct00358
의 구조를 가지며, W는 O 또는 S이다. 일부 구현예에서, W는 O이다. 일부 구현예에서, W는 S이다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 입체화학적으로 제어된다.
일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결 또는 중성 뉴클레오티드간 연결은 트리아졸 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드간 연결이다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결 또는 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 임의로 치환된 트리아졸릴기를 포함한다. 일부 구현예에서, 트리아졸 모이어티(예를 들어, 임의로 치환된 트리아졸릴기)를 포함하는 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00359
의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 트리아졸 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00360
의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결, 예를 들어, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결, 중성 뉴클레오티드간 연결은 환형 구아니딘 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 환형 구아니딘 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00361
의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결 또는 중성 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00362
,
Figure pct00363
,
Figure pct00364
, 또는
Figure pct00365
로부터 선택되는 구조이거나 이를 포함하고, W는 O 또는 S이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 Tmg 기(
Figure pct00366
)를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 Tmg 기를 포함하고
Figure pct00367
의 구조를 갖는다("Tmg 뉴클레오티드간 연결"). 일부 구현예에서, 중성 뉴클레오티드간 연결은 PNA 및 PMO의 뉴클레오티드간 연결, 및 Tmg 뉴클레오티드간 연결을 포함한다.
일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 1~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 3~20원 헤테로시클릴 또는 헤테로아릴 기를 포함한다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 1~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 3~20원 헤테로시클릴 또는 헤테로아릴 기를 포함하고, 적어도 하나의 헤테로원자는 질소이다. 일부 구현예에서, 이러한 헤테로시클릴 또는 헤테로아릴 기는 5원 고리의 기이다. 일부 구현예에서, 이러한 헤테로시클릴 또는 헤테로아릴 기는 6원 고리의 기이다.
일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 1~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5~20원 헤테로아릴 기를 포함한다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 1~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5~20원 헤테로아릴 기를 포함하고, 적어도 하나의 헤테로원자는 질소이다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 1~4개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5~6원 헤테로아릴 기를 포함하고, 적어도 하나의 헤테로원자는 질소이다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 1~4개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5원 헤테로아릴 기를 포함하고, 적어도 하나의 헤테로원자는 질소이다. 일부 구현예에서, 헤테로아릴 기는 연결 인에 직접 결합된다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 1~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5~20원 헤테로시클릴 기를 포함한다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 1~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5~20원 헤테로시클릴 기를 포함하고, 적어도 하나의 헤테로원자는 질소이다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 1~4개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5~6원 헤테로시클릴 기를 포함하고, 적어도 하나의 헤테로원자는 질소이다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 1~4개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5원 헤테로시클릴 기를 포함하고, 적어도 하나의 헤테로원자는 질소이다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 헤테로원자는 질소이다. 일부 구현예에서, 헤테로시클릴 기는 연결 인에 직접 결합된다. 일부 구현예에서, 헤테로시클릴 기는 링커, 예를 들어 헤테로시클릴 기가 =N-을 통해 연결 인에 유도되어 결합된 구아니딘 모이어티의 일부인 경우, =N-을 통해 연결 인에 결합된다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 임의로 치환된
Figure pct00368
기를 포함한다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 치환된
Figure pct00369
기를 포함한다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00370
기를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 R1은 독립적으로 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 구현예에서, 각각의 R1은 독립적으로 메틸이다.
일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결, 예를 들어, 중성 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어되지 않는다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어된다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어되고, 이의 연결 인은 Rp이다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어되고, 이의 연결 인은 Sp이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 연결 인을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -C(O)-(O)- 또는 -C(O)-N(R')-의 구조를 갖고, R'은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 -C(O)-(O)-의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 --C(O)-N(R')-의 구조를 갖고, R'은 본원에 기재된 바와 같다. 다양한 구현예에서, -C(O)-는 질소에 결합된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 카바메이트 모이어티의 일부인 -C(O)-O-이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 우레아 모이어티의 일부인 -C(O)-O-이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는1~20, 1~15, 1~10, 1~5, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 ~20, 1~15, 1~10, 1~5, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 중성 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결 및/또는 중성 뉴클레오티드간 연결 각각은 임의로 그리고 독립적으로 키랄 제어된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드에서의 각각의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드에서의 각각의 중성 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결/중성 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00371
의 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 연결 인이 Rp 배열인 적어도 하나의, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결, 및 연결 인이 Sp 배열인 적어도 하나의, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결을 포함한다.
많은 구현예, 광범위하게 입증된 바와 같이, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 2개 이상의 상이한 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 및 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결, 및 천연 포스페이트 연결을 포함한다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 중성 뉴클레오티드간 연결이다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 n001, n003, n004, n006, n008 또는 n009, n013, n020, n021, n025, n026, n029, n031, n037, n046, n047, n048, n054, 또는 n055이다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 n001이다. 일부 구현예에서, 각각의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 키랄 제어된다. 일부 구현예에서, 각각의 키랄 변형 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 키랄 제어된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어되지 않는다.
천연 DNA 및 RNA에서와 같은 일반적인 연결은 뉴클레오티드간 연결이 2개의 당(이는 본원에 기재된 바와 같이 변형되거나 변형되지 않을 수 있음)과 결합을 형성한다는 것이다. 많은 구현예에서, 본원에 예시된 바와 같이, 뉴클레오티드간 연결은 산소 원자 또는 헤테로원자를 통해 5' 탄소에서 하나의 임의로 변형된 리보스 또는 데옥시리보스와 결합을 형성하고 3' 탄소에서 다른 임의로 변형된 리보스 또는 데옥시리보스와 결합을 형성한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결은 리보스 당이 아닌 당, 예를 들어 N 고리 원자를 포함하는 당 및 본원에 기재된 비환식 당을 연결한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결에 의해 연결된 각각의 뉴클레오시드 단위는, 독립적으로 임의로 치환된 A, T, C, G, 또는 U, 또는 A, T, C, G, 또는 U의 임의로 치환된 호변이성체인 핵염기를 독립적으로 포함한다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 US 9394333, US 9744183, US 9605019, US 9598458, US 9982257, US 10160969, US 10479995, US 2020/0056173, US 2018/0216107, US 2019/0127733, US 10450568, US 2019/0077817, US 2019/0249173, US 2019/0375774, WO 2018/223056, WO 2018/223073, WO 2018/223081, WO 2018/237194, WO 2019/032607, WO 2019/055951, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, 및/또는 WO 2019/032612에 기재된 바와 같은 변형 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, 화학식 I, I-a, I-b, 또는 I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2 등, 또는 이의 염 형태의 구조를 갖는 변형 뉴클레오티드간 연결)을 포함하고, 상기 문헌 각각의 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, 화학식 I, I-a, I-b, 또는 I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2 등의 것)은 독립적으로 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이다. 일부 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오티드는 음으로 하전되지 않은 하나 이상의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 양으로 하전된 뉴클레오티드간 연결이다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결은 중성 뉴클레오티드간 연결이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 중성 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결 또는 중성 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, 화학식 I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2 등 중 하나)은 US 9394333, US 9744183, US 9605019, US 9598458, US 9982257, US 10160969, US 10479995, US 2020/0056173, US 2018/0216107, US 2019/0127733, US 10450568, US 2019/0077817, US 2019/0249173, US 2019/0375774, WO 2018/223056, WO 2018/223073, WO 2018/223081, WO 2018/237194, WO 2019/032607, WO 2019/055951, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, 및/또는 WO 2019/032612에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결 또는 중성 뉴클레오티드간 연결은 WO 2018/223056, WO 2019/032607, WO 2019/075357, WO 2019/032607, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, 및/또는 WO 2019/032612에 기재된 바와 같은 화학식 I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2 등 중 하나이고, 상기 문헌 각각의 이러한 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 본원에 참조로 포함된다.
본원에 기재된 바와 같이, 다양한 변수는 R, 예를 들어, R', RL 등일 수 있다. R에 대한 다양한 구현예가 본 발명에 기재된다(예를 들어, R일 수 있는 변수를 설명하는 경우). 이러한 구현예는 일반적으로, R일 수 있는 모든 변수에 유용하다. 일부 구현예에서, R은 수소이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-30(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29. 또는 30) 지방족이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-20 지방족이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-10 지방족이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-6 지방족이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 메틸이다. 일부 구현예에서, R은 메틸이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 에틸이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 프로필이다. 일부 구현예에서, R은 이소프로필이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 부틸이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 펜틸이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 헥실이다.
일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 3~30원(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30) 지환족이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 시클로알킬이다. 일부 구현예에서, 지환족은 단환, 이환, 또는 다환이고, 각각의 단환 단위는 독립적으로 포화되거나 부분적으로 포화된다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 시클로프로필이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 시클로부틸이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 시클로펜틸이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 시클로헥실이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 아다만틸이다.
일부 구현예에서, R은 1~10개의 헤테로원자를 갖는, 임의로 치환된 C1-30(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30) 헤테로지방족이다. 일부 구현예에서, R은 1~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 C1-20 지방족이다. 일부 구현예에서, R은 1~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 C1-10 지방족이다. 일부 구현예에서, R은 1~3개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 C1-6 지방족이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 헤테로알킬이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-6 헤테로알킬이다. 일부 구현예에서, R은 1~10개의 헤테로원자를 갖는, 임의로 치환된 3~30원(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30) 헤테로고리지방족이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 헤테로시클로알킬이다. 일부 구현예에서, 헤테로고리지방족은 단환, 이환, 또는 다환이고, 각각의 단환 단위는 독립적으로 포화되거나 부분적으로 포화된다.
일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C6-30 아릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 페닐이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 페닐이다. 일부 구현예에서, R은 C6-14 아릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 이환 아릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 다환 아릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 C6-30 아릴지방족이다. 일부 구현예에서, R은 1~10개의 헤테로원자를 갖는 C6-30 아릴헤테로지방족이다.
일부 구현예에서, R은 1~10개의 헤테로원자를 갖는, 임의로 치환된 5~30(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30)원 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, R은 1~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5~20원 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, R은 1~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5~10원 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, R은 1~5개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5원 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, R은 1~4개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5원 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, R은 1~3개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5원 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, R은 1~2개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5원 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, R은 1개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5원 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, R은 1~5개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 6원 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, R은 1~4개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 6원 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, R은 1~3개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 6원 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, R은 1~2개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 6원 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, R은 1개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 6원 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 단환 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 이환 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 다환 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, 헤테로원자는 질소이다.
일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 2-피리디닐이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 3-피리디닐이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 4-피리디닐이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된
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Figure pct00383
,
Figure pct00384
,
Figure pct00385
,
Figure pct00386
,
Figure pct00387
,
Figure pct00388
,
Figure pct00389
,
Figure pct00390
또는
Figure pct00391
이다.
일부 구현예에서, R은 1~10개의 헤테로원자를 갖는, 임의로 치환된 3~30(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30)원 헤테로시클릴이다. 일부 구현예에서, R은 1~2개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 3원 헤테로시클릴이다. 일부 구현예에서, R은 1~2개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 4원 헤테로시클릴이다. 일부 구현예에서, R은 1~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5~20원 헤테로시클릴이다. 일부 구현예에서, R은 1~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5~10원 헤테로시클릴이다. 일부 구현예에서, R은 1~5개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5원 헤테로시클릴이다. 일부 구현예에서, R은 1~4개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5원 헤테로시클릴이다. 일부 구현예에서, R은 1~3개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5원 헤테로시클릴이다. 일부 구현예에서, R은 1~2개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5원 헤테로시클릴이다. 일부 구현예에서, R은 1개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5원 헤테로시클릴이다. 일부 구현예에서, R은 1~5개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 6원 헤테로시클릴이다. 일부 구현예에서, R은 1~4개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 6원 헤테로시클릴이다. 일부 구현예에서, R은 1~3개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 6원 헤테로시클릴이다. 일부 구현예에서, R은 1~2개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 6원 헤테로시클릴이다. 일부 구현예에서, R은 1개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 6원 헤테로시클릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 단환 헤테로시클릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 이환 헤테로시클릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 다환 헤테로시클릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 포화 헤테로시클릴이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된 부분 불포화 헤테로시클릴이다. 일부 구현예에서, 헤테로원자는 질소이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된
Figure pct00392
이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된
Figure pct00393
이다. 일부 구현예에서, R은 임의로 치환된
Figure pct00394
이다.
일부 구현예에서, 2개의 R기는 임의로 그리고 독립적으로 함께 공유 결합을 형성한다. 일부 구현예에서, 동일한 원자 상의 2개 이상의 R기는 임의로 그리고 독립적으로 해당 원자와 함께, 해당 원자 외에도 0~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 3~30원 단환, 이환, 또는 다환 고리를 형성한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 원자 상의 2개 이상의 R기는 임의로 그리고 독립적으로 이들의 사이에 개재된 원자와 함께, 해당 개재된 원자 외에도 0~10개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 3~30원 단환, 이환, 또는 다환 고리를 형성한다.
다양한 변수는 임의로 치환된 고리를 포함할 수 있거나, 개재된 원자(들)와 함께 고리를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 고리는 3~30(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29. 또는 30)원이다. 일부 구현예에서, 고리는 3~20원이다. 일부 구현예에서, 고리는 3~15원이다. 일부 구현예에서, 고리는 3~10원이다. 일부 구현예에서, 고리는 3~8원이다. 일부 구현예에서, 고리는 3~7원이다. 일부 구현예에서, 고리는 3~6원이다. 일부 구현예에서, 고리는 4~20원이다. 일부 구현예에서, 고리는 5~20원이다. 일부 구현예에서, 고리는 단환이다. 일부 구현예에서, 고리는 이환이다. 일부 구현예에서, 고리는 다환이다. 일부 구현예에서, 각각의 단환 고리, 또는 다환 또는 다환 고리의 각각의 단환 고리 단위는 독립적으로 포화, 부분 포화, 또는 방향족이다. 일부 구현예에서, 각각의 단환 고리, 또는 다환 또는 다환 고리의 각각의 단환 고리 단위는 독립적으로 3~10원이고, 0~5개의 헤테로원자를 갖는다.
일부 구현예에서, 각각의 헤테로원자는 독립적으로 선택된 산소, 질소, 황, 규소, 및 인이다. 일부 구현예에서, 각각의 헤테로원자는 독립적으로 선택된 산소, 질소, 황, 및 인이다. 일부 구현예에서, 각각의 헤테로원자는 독립적으로 선택된 산소, 질소, 및 황이다. 일부 구현예에서, 헤테로원자는 산화된 형태이다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 많은 다른 유형의 뉴클레오티드간 연결이 본 발명에 따라 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,177,195; 5,023,243; 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,188,897; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,423; 5,264,564; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,938; 5,405,939; 5,434,257; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,466,677; 5,470,967; 5,476,925; 5,489,677; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,307; 5,541,316; 5,550,111; 5,561,225; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,596,086; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,625,050; 5,633,360; 5,64,562; 5,663,312; 5,677,437; 5,677,439; 6,160,109; 6,239,265; 6,028,188; 6,124,445; 6,169,170; 6,172,209; 6,277,603; 6,326,199; 6,346,614; 6,444,423; 6,531,590; 6,534,639; 6,608,035; 6,683,167; 6,858,715; 6,867,294; 6,878,805; 7,015,315; 7,041,816; 7,273,933; 7,321,029; 또는 RE39464에 기재된 것들). 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 US 9982257, US 20170037399, US 20180216108, WO 2017192664, WO 2017015575, WO2017062862, WO 2018067973, WO 2017160741, WO 2017192679, WO 2017210647, WO 2018098264, PCT/US18/35687, PCT/US18/38835, 또는 PCT/US18/51398에 기재된 것이고, 각각의 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 핵염기, 당, 뉴클레오티드간 연결, 키랄 보조체/시약, 및 기술(시약, 조건, 사이클 등)은 독립적으로 본원에 참조로 포함된다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드에 있는 각각의 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 천연 포스페이트 연결, 포스포로티오에이트 연결, 및 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, n001)로부터 선택된다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드에 있는 각각의 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 천연 포스페이트 연결, 포스포로티오에이트 연결, 및 중성 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, n001)로부터 선택된다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 특정 조건에서 "자동방출"되기 쉬운 인 변형을 독립적으로 포함하는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 즉, 특정 조건에서, 특정 인 변형은 예를 들어 천연 포스페이트 연결을 제공하기 위해 ds 올리고뉴클레오티드로부터 자가 절단되도록 설계된다. 특정 구현예에서, 이러한 인 변형은 -O-L-R1의 구조를 가지며, L은 본원에 기재된 바와 같은 LB이고, R1은 본원에 기재된 바와 같은 R'이다. 특정 구현예에서, 인 변형은 -S-L-R1의 구조를 가지며, 각각의 L 및 R1은 독립적으로 본 발명에 기재된 바와 같다. 이러한 인 변형 기의 특정 예는 US 9982257에서 찾을 수 있다. 특정 구현예에서, 자동방출 기는 모르폴리노 기를 포함한다. 특정 구현예에서, 자동방출 기는 뉴클레오티드간 인 링커에 제제를 전달하는 능력을 특징으로 하며, 이러한 제제는 예를 들어 탈황과 같은 인 원자의 추가 변형을 촉진한다. 특정 구현예에서, 이러한 제제는 물이고 추가 변형은 천연 포스페이트 연결을 형성하기 위한 가수분해이다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 약학적 특성 및/또는 활성을 개선시키는 하나 이상의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의해 빠르게 분해되고 세포질 세포막을 통한 약한 세포 흡수를 나타낸다는 것이 당업계에 잘 문서화되어 있다(Poijarvi-Virta et al., Curr. Med. Chem. (2006), 13(28);3441-65; Wagner et al., Med. Res. Rev. (2000), 20(6):417-51; Peyrottes et al., Mini Rev. Med. Chem. (2004), 4(4):395-408; Gosselin et al., (1996), 43(1):196-208; Bologna et al., (2002), Antisense & Nucleic Acid Drug Development 12:33-41). Vives 등(Nucleic Acids Research (1999), 27(20):4071-76)은 tert-부틸 SATE 프로-올리고뉴클레오티드가 특정 조건에서 모체 올리고뉴클레오티드에 비해 현저하게 증가된 세포 침투를 나타냄을 보고하였다.
ds 올리고뉴클레오티드는 다양한 수의 천연 포스페이트 연결을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결의 5% 이상은 천연 포스페이트 연결이다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결의 10% 이상은 천연 포스페이트 연결이다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결의 15% 이상은 천연 포스페이트 연결이다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결의 20% 이상은 천연 포스페이트 연결이다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결의 25% 이상은 천연 포스페이트 연결이다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결의 30% 이상은 천연 포스페이트 연결이다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결의 35% 이상은 천연 포스페이트 연결이다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결의 40% 이상은 천연 포스페이트 연결이다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 천연 포스페이트 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 천연 포스페이트 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 천연 포스페이트 연결의 개수는 2개이다. 특정 구현예에서, 천연 포스페이트 연결의 개수는 3개이다. 특정 구현예에서, 천연 포스페이트 연결의 개수는 4개이다. 특정 구현예에서, 천연 포스페이트 연결의 개수는 5개이다. 특정 구현예에서, 천연 포스페이트 연결의 개수는 6개이다. 특정 구현예에서, 천연 포스페이트 연결의 개수는 7개이다. 특정 구현예에서, 천연 포스페이트 연결의 개수는 8개이다. 특정 구현예에서, 천연 포스페이트 연결의 일부 또는 전부는 연속적이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 적어도 일부 경우에, 특히 5'-말단 및/또는 3'-말단의 Sp 뉴클레오티드간 연결이 ds 올리고뉴클레오티드 안정성을 개선시킬 수 있음을 나타낸다. 특정 구현예에서, 본 발명은 특히, 천연 포스페이트 연결 및/또는 Rp 뉴클레오티드간 연결이 시스템으로부터의 ds 올리고뉴클레오티드 제거를 개선시킬 수 있음을 나타낸다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 당업계에 알려진 다양한 분석법을 사용하여 본 발명에 따라 이러한 특성을 평가할 수 있다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 일부(예를 들어, 도메인, 서브도메인 등)에 있는 각각의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 키랄 제어된다. 특정 구현예에서, 각각은 독립적으로 Sp 또는 Rp이다. 특정 구현예에서, 높은 수준은 본원에 기재된 바와 같은 Sp이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 일부에 있는 각각의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어되고 Sp이다. 특정 구현예에서, 하나 이상, 예를 들어 약 1~5개(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개)는 Rp이다.
특정 구현예에서, 특정 예에서 예시된 바와 같이, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 일부는 음으로 하전되지 않은 하나 이상의 뉴클레오티드간 연결을 포함하고, 각각은 임의로 그리고 독립적으로 키랄 제어된다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 각각의 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 n001이다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 키랄 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어되지 않는다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 각각의 키랄 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어되지 않는다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 키랄 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어된다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 키랄 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어되고 Rp이다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 키랄 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어되고 Sp이다. 특정 구현예에서, 각각의 음으로 하전되지 않은 키랄 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어된다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 일부에 있는 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결의 개수는 약 1~10개, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개이다. 특정 구현예에서, 개수는 약 1개이다. 특정 구현예에서, 개수는 약 2개이다. 특정 구현예에서, 개수는 약 3개이다. 특정 구현예에서, 개수는 약 4개이다. 특정 구현예에서, 개수는 약 5개이다. 특정 구현예에서, 개수는 약 6개이다. 특정 구현예에서, 개수는 약 7개이다. 특정 구현예에서, 개수는 약 8개이다. 특정 구현예에서, 개수는 약 9개이다. 특정 구현예에서, 개수는 약 10개이다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 2개 이상의 뉴클레오티드간 연결은 연속적이다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 2개의 뉴클레오티드간 연결은 연속적이지 않다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 일부에 있는 음으로 하전되지 않은 모든 뉴클레오티드간 연결은 연속적이다(예를 들어, 음으로 하전되지 않은 3개의 연속적인 뉴클레오티드간 연결). 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결, 또는 음으로 하전되지 않은 2개 이상(예를 들어, 약 2개, 약 3개, 약 4개 등)의 연속적인 뉴클레오티드간 연결은 ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 일부의 3'-말단에 있다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 일부의 마지막 2개 또는 3개 또는 4개의 뉴클레오티드간 연결은 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이 아닌 적어도 하나의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 일부의 마지막 2개 또는 3개 또는 4개의 뉴클레오티드간 연결은 n001이 아닌 적어도 하나의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 일부의 처음 2개의 뉴클레오시드를 연결하는 뉴클레오티드간 연결은 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 일부의 마지막 2개의 뉴클레오시드를 연결하는 뉴클레오티드간 연결은 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 일부의 처음 2개의 뉴클레오시드를 연결하는 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 이는 Sp이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 일부의 마지막 2개의 뉴클레오시드를 연결하는 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 이는 Sp이다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 키랄 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어되고, 하나 이상의 키랄 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어되지 않는다. 특정 구현예에서, 각각의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 키랄 제어되고, 음으로 하전되지 않은 하나 이상의 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어되지 않는다. 특정 구현예에서, 각각의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 키랄 제어되고, 음으로 하전되지 않은 각각의 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어되지 않는다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 처음 2개의 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오티드간 연결은 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 마지막 2개의 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오티드간 연결은 각각 독립적으로 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 둘 다 독립적으로 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 각각의 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 중성 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 각각의 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 n001이다.
특정 구현예에서, 조성물 내의 제어된 수준의 ds 올리고뉴클레오티드는 목적하는 ds 올리고뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 공통 염기 서열(예를 들어, 목적상 원하는 서열)을 공유하는 조성물 내의 모든 ds 올리고뉴클레오티드 중, 또는 조성물 내의 모든 ds 올리고뉴클레오티드 중, 목적하는 ds 올리고뉴클레오티드(다양한 형태(예를 들어, 염 형태)로 존재할 수 있고 일반적으로 비-키랄 제어 뉴클레오티드간 연결에서만 상이함(동일한 입체이성체의 다양한 형태는 이러한 목적상 동일한 것으로 간주될 수 있음))의 수준은 약 5%~100%, 10%~100%, 20%~100%, 30%~100%, 40%~100%, 50%~100%, 60%~100%, 70%~100%, 80~100%, 90~100%, 95~100%, 50%~90%, 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%, 또는 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%이다. 특정 구현예에서, 수준은 적어도 약 50%이다. 특정 구현예에서, 수준은 적어도 약 60%이다. 특정 구현예에서, 수준은 적어도 약 70%이다. 특정 구현예에서, 수준은 적어도 약 75%이다. 특정 구현예에서, 수준은 적어도 약 80%이다. 특정 구현예에서, 수준은 적어도 약 85%이다. 특정 구현예에서, 수준은 적어도 약 90%이다. 특정 구현예에서, 수준은 (DS)nc 이상이고, DS는 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%이고 nc는 본 발명에 기재된 바와 같은 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 수(예를 들어, 1~50, 1~40, 1~30, 1~25, 1~20, 5~50, 5~40, 5~30, 5~25, 5~20, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 이상)이다. 특정 구현예에서, 수준은 (DS)nc 이상이고, DS는 95%~100%이다.
목적하는 ds 올리고뉴클레오티드 특성 및/또는 활성을 달성하기 위해 다양한 유형의 뉴클레오티드간 연결이 다른 구조적 요소, 예를 들어 당과 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 ds 올리고뉴클레오티드를 설계함에 있어서 임의로 천연 포스페이트 연결 및 천연 당과 함께 변형 뉴클레오티드간 연결 및 변형 당을 통상적으로 사용한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 변형 당을 포함하는 ds 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 변형 당 및 하나 이상의 변형 뉴클레오티드간 연결(이 중 하나 이상은 천연 포스페이트 연결임)을 포함하는 ds 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
2.3. 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 조성물
특히, 본 발명은 다양한 ds 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 ds 올리고뉴클레오티드의 ds 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 조성물, 예를 들어 dsRNAi 올리고뉴클레오티드 조성물은 본 발명에 기술된 복수의 ds 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 조성물, 예를 들어 dsRNAi 올리고뉴클레오티드 조성물은 키랄 제어된다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 조성물, 예를 들어 dsRNAi 올리고뉴클레오티드 조성물은 키랄 제어되지 않는다(입체무작위).
천연 포스페이트 연결의 연결 인은 아키랄이다. 많은 변형 뉴클레오티드간 연결, 예를 들어 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결의 연결 인은 키랄이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 조성물의 제조 중에(예를 들어, 기존의 포스포아미다이트 ds 올리고뉴클레오티드 합성에서), 키랄 연결 인의 배열은 의도적으로 설계 또는 제어되지 않아, 다양한 입체이성체의 복잡한 무작위 혼합물(부분입체이성체)인 비-키랄 제어(입체무작위) ds 올리고뉴클레오티드 조성물(실질적 라세미 제제)을 생성한다(n개의 키랄 뉴클레오티드간 연결(연결 인은 키랄임)을 갖는 ds 올리고뉴클레오티드의 경우, 일반적으로 2n개의 입체이성체(예를 들어, n이 10인 경우, 210 = 1,032; n이 20인 경우, 220 = 1,048,576)). 이러한 입체이성체는 동일한 구성을 갖지만 연결 인의 입체 화학 패턴과 관련하여 상이하다.
특정 구현예에서, 입체무작위 ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 특정 목적 및/또는 응용에 충분한 특성 및/또는 활성을 갖는다. 특정 구현예에서, 입체무작위 ds 올리고뉴클레오티드 조성물의 제조는 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물보다 더 저렴하고/하거나, 더 쉽고/쉽거나, 더 간단할 수 있다. 그러나, 입체무작위 조성물 내의 입체이성체는 상이한 특성, 활성, 및/또는 독성을 가질 수 있어서, 특히 동일 구성의 ds 올리고뉴클레오티드의 특정 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물과 비교하여 입체무작위 조성물에 의한 일관성 없는 치료 효과 및/또는 의도하지 않은 부작용을 초래할 수 있다.
2.3.1. 키랄 제어 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 조성물
특정 구현예에서, 본 발명은 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물의 설계 및 제조 기술을 포함한다. 특정 구현예에서, 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 제어된/미리 결정된(입체무작위 조성물에서와 같이 무작위가 아님) 수준의 복수의 ds 올리고뉴클레오티드를 포함하고, ds 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 키랄 뉴클레오티드간 연결(키랄 제어 뉴클레오티드간 연결)에서 동일한 연결 인 입체화학을 공유한다. 특정 구현예에서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는 동일한 백본 키랄 중심 패턴(연결 인의 입체화학)을 공유한다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 본 발명에 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는 동일한 구성을 공유한다. 특정 구현예에서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는 구조적으로 동일하다.
예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명은 복수의 ds 올리고뉴클레오티드를 포함하는 ds 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공하며, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는
1) 공통 염기 서열 및
2) 하나 이상(예를 들어, 약 1~50, 1~40, 1~30, 1~25, 1~20, 1~15, 1~10, 5~50, 5~40, 5~30, 5~25, 5~20, 5~15, 5~10, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 이상)의 키랄 뉴클레오티드간 연결("키랄 제어 뉴클레오티드간 연결")에서 독립적으로 동일한 연결 인 입체화학을 공유하고, 조성물 내 복수의 ds 올리고뉴클레오티드의 수준은 비무작위이다(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 제어/미리 결정됨).
특정 구현예에서, 본 발명은 복수의 ds 올리고뉴클레오티드를 포함하는 ds 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공하며, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는
1) 공통 염기 서열, 및
2) 하나 이상(예를 들어, 약 1~50, 1~40, 1~30, 1~25, 1~20, 1~15, 1~10, 5~50, 5~40, 5~30, 5~25, 5~20, 5~15, 5~10, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 이상)의 키랄 뉴클레오티드간 연결("키랄 제어 뉴클레오티드간 연결")에서 독립적으로 동일한 연결 인 입체화학을 공유하고, 조성물은 공통 염기 서열을 공유하는 ds 올리고뉴클레오티드의 실질적 라세미 제제에 비해 복수의 올리고뉴클레오티드가 풍부하다.
특정 구현예에서, 본 발명은 복수의 ds 올리고뉴클레오티드를 포함하는 ds 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공하며, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는
1) 공통 염기 서열, 및
2) 하나 이상(예를 들어, 약 1~50, 1~40, 1~30, 1~25, 1~20, 1~15, 1~10, 5~50, 5~40, 5~30, 5~25, 5~20, 5~15, 5~10, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 이상)의 키랄 뉴클레오티드간 연결("키랄 제어 뉴클레오티드간 연결")에서 독립적으로 동일한 연결 인 입체화학을 공유하고, 공통 염기 서열을 공유하는 조성물 내의 모든 ds 올리고뉴클레오티드의 약 1%~100%(예를 들어, 약 5%~100%, 10%~100%, 20%~100%, 30%~100%, 40%~100%, 50%~100%, 60%~100%, 70%~100%, 80~100%, 90~100%, 95~100%, 50%~90%, 또는 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%, 또는 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)는 복수의 ds 올리고뉴클레오티드이다.
특정 구현예에서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드의 백분율/수준은 적어도 (DS)nc이고, DS는 90%~100%이고, nc는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 수이다. 특정 구현예에서, nc는 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상이다. 특정 구현예에서, 백분율/수준은 적어도 10%이다.
특정 구현예에서, 백분율/수준은 적어도 20%이다. 특정 구현예에서, 백분율/수준은 적어도 30%이다. 특정 구현예에서, 백분율/수준은 적어도 40%이다. 특정 구현예에서, 백분율/수준은 적어도 50%이다. 특정 구현예에서, 백분율/수준은 적어도 60%이다. 특정 구현예에서, 백분율/수준은 적어도 65%이다. 특정 구현예에서, 백분율/수준은 적어도 70%이다. 특정 구현예에서, 백분율/수준은 적어도 75%이다. 특정 구현예에서, 백분율/수준은 적어도 80%이다. 특정 구현예에서, 백분율/수준은 적어도 85%이다. 특정 구현예에서, 백분율/수준은 적어도 90%이다. 특정 구현예에서, 백분율/수준은 적어도 95%이다.
특정 구현예에서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는 공통 백본 연결 패턴을 공유한다. 특정 구현예에서, 복수의 각각의 ds 올리고뉴클레오티드는 독립적으로 각각의 뉴클레오티드간 연결 부위에서 독립적으로 특정 구성의 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, -O-P(O)(SH)-O-) 또는 이의 염 형태(예를 들어, -O-P(O )(SNa)-O-)를 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 뉴클레오티드간 연결 부위에서의 뉴클레오티드간 연결은 동일한 형태이다. 특정 구현예에서, 각각의 뉴클레오티드간 연결 부위에서의 뉴클레오티드간 연결은 상이한 형태이다.
특정 구현예에서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는 동일한 구성을 공유한다. 특정 구현예에서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는 공통 구성의 동일한 형태이다. 특정 구현예에서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는 2개 이상의 공통 구성 형태이다. 특정 구현예에서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는 각각 독립적으로 특히 올리고뉴클레오티드 또는 이의 제약상 허용가능한 염, 또는 특히 ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 제약상 허용가능한 염과 동일한 구성을 갖는 ds 올리고뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 공통 구성을 공유하는 조성물 내의 모든 ds 올리고뉴클레오티드의 약 1%~100%(예를 들어, 약 5%~100%, 10%~100%, 20%~100%, 30%~100%, 40%~100%, 50%~100%, 60%~100%, 70%~100%, 80~100%, 90~100%, 95~100%, 50%~90%, 또는 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%, 또는 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)는 복수의 ds 올리고뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 수준의 백분율은 적어도 (DS)nc이고, DS는 90%~100%이고, nc는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 수이다. 특정 구현예에서, nc는 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상이다. 특정 구현예에서, 수준은 적어도 10%이다. 특정 구현예에서, 수준은 적어도 20%이다. 특정 구현예에서, 수준은 적어도 30%이다. 특정 구현예에서, 수준은 적어도 40%이다. 특정 구현예에서, 수준은 적어도 50%이다. 특정 구현예에서, 수준은 적어도 60%이다. 특정 구현예에서, 수준은 적어도 65%이다. 특정 구현예에서, 수준은 적어도 70%이다. 특정 구현예에서, 수준은 적어도 75%이다. 특정 구현예에서, 수준은 적어도 80%이다. 특정 구현예에서, 수준은 적어도 85%이다. 특정 구현예에서, 수준은 적어도 90%이다. 특정 구현예에서, 수준은 적어도 95%이다.
특정 구현예에서, 각각의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 특정 ds 올리고뉴클레오티드 유형의 복수의 ds 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공하며, 이의 특징은 다음과 같다:
a) 공통 염기 서열,
b) 공통 백본 연결 패턴,
c) 공통 백본 키랄 중심 패턴(조성물은, 동일한 공통 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 실질적 라세미 제제에 비해 특정 올리고뉴클레오티드 유형의 올리고뉴클레오티드가 풍부함).
특정 구현예에서, 본 발명은 특정 ds 올리고뉴클레오티드 유형의 복수의 ds 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공하며, 이의 특징은 다음과 같다:
a) 공통 염기 서열,
b) 공통 백본 연결 패턴,
c) 공통 백본 키랄 중심 패턴(복수의 ds 올리고뉴클레오티드는 Sp 배열의 공통 연결 인을 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오티드간 연결을 포함하고; 조성물은, 동일한 공통 염기 서열을 갖는 d 올리고뉴클레오티드의 실질적 라세미 제제에 비해 특정 ds 올리고뉴클레오티드 유형의 올리고뉴클레오티드가 풍부함).
공통 백본 키랄 중심 패턴은 당업자가 이해하는 바와 같이 적어도 하나의 Rp 또는 적어도 하나의 Sp를 포함한다. 특정 백본 키랄 중심 패턴은 예를 들어 표 1A 및 1B 또는 표 1C 또는 표 1D에 예시되어 있다.
특정 구현예에서, 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 동일한 공통 염기 서열 및 공통 백본 연결 패턴을 공유하는 ds 올리고뉴클레오티드의 실질적 라세미 제제에 비해 특정 ds 올리고뉴클레오티드 유형의 ds 올리고뉴클레오티드가 풍부하다.
특정 구현예에서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 특정 ds 올리고뉴클레오티드 유형은 공통 백본 인 변형 패턴 및 공통 뉴클레오시드 변형 패턴을 갖는다. 특정 구현예에서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는 공통 당 변형 패턴을 공유한다. 특정 구현예에서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는 공통 염기 변형 패턴을 갖는다. 특정 구현예에서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는 공통 뉴클레오시드 변형 패턴을 갖는다. 특정 구현예에서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는 동일한 구성을 갖는다. 특정 구현예에서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는 동일하다. 특정 구현예에서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는 동일한 ds 올리고뉴클레오티드이다(당업자가 이해하는 바와 같이, 이러한 ds 올리고뉴클레오티드는 각각 독립적으로 ds 올리고뉴클레오티드의 다양한 형태 중 하나로 존재할 수 있고, ds 올리고뉴클레오티드와 동일하거나 상이한 형태일 수 있음). 특정 구현예에서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는 각각 독립적으로 동일한 ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 제약상 허용가능한 염이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 예를 들어, "입체화학/연결"이 S 및/또는 R을 포함하는, 표 1A 또는 1B 또는 표 1C 또는 표 1D의 많은 올리고뉴클레오티드의 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는 각각 독립적으로 "입체화학/연결"이 임의로 다양한 형태의 S 및/또는 R을 포함하는, 표 1의 특정 ds 올리고뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는 각각 독립적으로 "입체화학/연결"이 S 및/또는 R을 포함하는, 표 1A 또는 1B 또는 표 1C 또는 표 1D의 특정 ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 제약상 허용가능한 염이다.
특정 구현예에서, 조성물 내 복수의 ds 올리고뉴클레오티드의 수준은 ds 올리고뉴클레오티드에 있는 각각의 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 부분입체순도의 곱으로서 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드(또는 핵산)에 있는 2개의 뉴클레오시드를 연결하는 뉴클레오티드간 연결의 부분입체순도는 상기 2개의 뉴클레오시드를 연결하는 이량체의 뉴클레오티드간 연결의 부분입체순도로 표시되고, 이러한 이량체는 비견되는 조건들, 일부 경우에 동일한 합성 사이클 조건들을 사용하여 제조된다.
특정 구현예에서, 모든 키랄 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 키랄 제어되고, 조성물은 완전히 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물이다. 특정 구현예에서, 모든 키랄 뉴클레오티드간 연결이 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결은 아니며, 조성물은 부분적으로 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물이다.
ds 올리고뉴클레오티드는 다양한 백본 키랄 중심 패턴(키랄 연결 인의 입체화학 패턴)을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 특정의 유용한 백본 키랄 중심 패턴은 본 발명에 기재되어 있다. 특정 구현예에서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는 공통 백본 키랄 중심 패턴을 공유하며, 이는 본 발명에 기재된(예를 들어, "입체화학 및 백본 키랄 중심 패턴", 표 1A 또는 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D의 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드의 백본 키랄 중심 패턴 등에서와 같은) 패턴이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 키랄 순수(또는 입체순수, 입체화학적 순수) ds 올리고뉴클레오티드 조성물이고, ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, ds 올리고뉴클레오티드들은 동일한 입체이성체이다(각각의 키랄 연결 인을 포함하는 ds 올리고뉴클레오티드의 각각의 키랄 요소가 독립적으로 정의(입체정의)됨을 포함). ds 올리고뉴클레오티드 입체이성체의 키랄 순수(또는 입체순수, 입체화학적 순수) ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 다른 입체이성체를 함유하지 않는다(당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 하나 이상의 의도하지 않은 입체이성체가 예를 들어 제조, 저장 등으로부터 불순물로서 존재할 수 있음).
2.3.2 입체화학 및 백본 키랄 중심 패턴
천연 포스페이트 연결과 대조적으로, 키랄 변형 뉴클레오티드간 연결, 예를 들어 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결의 연결 인은 키랄이다. 특히, 본 발명은 키랄 뉴클레오티드간 연결에서의 키랄 연결 인의 입체화학의 제어를 포함하는 기술(예를 들어, 올리고뉴클레오티드, 조성물, 방법 등)을 제공한다. 특정 구현예에서, 본원에 입증된 바와 같이, 입체화학의 제어는 원하는 안정성, 감소된 독성, 표적 핵산의 개선된 감소 등을 비롯한 개선된 특성 및/또는 활성을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 올리고뉴클레오티드 및/또는 이의 영역에 유용한 백본 키랄 중심 패턴을 제공하며, 상기 패턴은 키랄 연결 인의 각각의 키랄 연결 인(Rp 또는 Sp)의 입체화학의 조합, 각각의 비키랄 연결 인(만약에 있다면, Op)의 표시 등(5'에서 3'으로)이다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 절단 시스템(예를 들어, 시험관 내 분석, 세포, 조직, 기관, 유기체, 대상체 등)에서 표적 핵산이 제공된 ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 조성물과 접촉될 때 표적 핵산의 절단 패턴을 제어할 수 있다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 절단 시스템에서 표적 핵산이 제공된 ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 조성물과 접촉될 때 표적 핵산의 절단 효율 및/또는 선택성을 개선한다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 영역의 백본 키랄 중심 패턴은 임의의 (Np)n(Op)m이거나 이를 포함하고, Np는 Rp 또는 Sp이고, Op는 비키랄인 연결 인(예를 들어, 천연 포스페이트 연결 인)이고, n 및 m 각각은 독립적으로 본 발명에서 정의되고 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 영역의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)n(Op)m이거나 이를 포함하고, 각 변수는 독립적으로 본 발명에서 정의되고 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 영역의 백본 키랄 중심 패턴은 (Rp)n(Op)m이거나 이를 포함하고, 각 변수는 독립적으로 본 발명에서 정의되고 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, n은 1이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 영역의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)(Op)m이거나 이를 포함하고, m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 영역의 백본 키랄 중심 패턴은 (Rp)(Op)m이거나 이를 포함하고, m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. 특정 구현예에서, 5'-윙의 백본 키랄 중심 패턴은 (Np)n(Op)m이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 5'-윙의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)n(Op)m이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 5'-윙의 백본 키랄 중심 패턴은 (Rp)n(Op)m이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 5'-윙의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)(Op)m이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 5'-윙의 백본 키랄 중심 패턴은 (Rp)(Op)m이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 5'-윙의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)(Op)m이다. 특정 구현예에서, 5'-윙의 백본 키랄 중심 패턴은 (Rp)(Op)m이다. 특정 구현예에서, 5'-윙의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)(Op)m이고, Sp는 5'-말단으로부터 올리고뉴클레오티드의 첫 번째 뉴클레오티드간 연결의 인 연결 배열이다. 특정 구현예에서, 5'-윙의 백본 키랄 중심 패턴은 (Rp)(Op)m이고, Rp는 5'-말단으로부터의 올리고뉴클레오티드의 첫 번째 뉴클레오티드간 연결의 연결 인 배열이다. 특정 구현예에서, 본 발명에 기재된 바와 같이, m은 2이고; 특정 구현예에서, m은 3이고; 특정 구현예에서, m은 4이고; 특정 구현예에서, m은 5이고; 특정 구현예에서, m은 6이다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 영역의 백본 키랄 중심 패턴은 임의의 (Op)m(Np)n이거나 이를 포함하고, Np는 Rp 또는 Sp이고, Op는 비키랄인 연결 인(예를 들어, 천연 포스페이트 연결 인)이고, n 및 m 각각은 독립적으로 본 발명에서 정의되고 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 영역의 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)m(Sp)n이거나 이를 포함하고, 각 변수는 독립적으로 본 발명에서 정의되고 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 영역의 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)m(Rp)n이거나 이를 포함하고, 각 변수는 독립적으로 본 발명에서 정의되고 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, n은 1이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 영역의 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)m(Sp)이거나 이를 포함하고, m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 영역의 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)m(Rp)이거나 이를 포함하고, m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. 특정 구현예에서, 3'-윙의 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)m(Np)n이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 3'-윙의 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)m(Sp)n이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 3'-윙의 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)m(Rp)n이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 3'-윙의 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)m(Sp)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 3'-윙의 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)m(Rp)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 3'-윙의 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)m(Sp)이다. 특정 구현예에서, 3'-윙의 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)m(Rp)이다. 특정 구현예에서, 3'-윙의 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)m(Sp)이고, Sp는 5'-말단으로부터의 ds 올리고뉴클레오티드의 마지막 뉴클레오티드간 연결의 연결 인 배열이다. 특정 구현예에서, 3'-윙의 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)m(Rp)이고, Rp는 5'-말단으로부터의 올리고뉴클레오티드의 마지막 뉴클레오티드간 연결의 연결 인 배열이다. 특정 구현예에서, 본 발명에 기재된 바와 같이, m은 2이고; 특정 구현예에서, m은 3이고; 특정 구현예에서, m은 4이고; 특정 구현예에서, m은 5이고; 특정 구현예에서, m은 6이다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 영역(예를 들어, 코어)의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)m(Rp/Op)n 또는 (Rp/Op)n(Sp)m이거나 이를 포함하고, 각 변수는 독립적으로 본 발명에 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 영역(예를 들어, 코어)의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)m(Rp)n 또는 (Rp)n(Sp)m이거나 이를 포함하고, 각 변수는 독립적으로 본 발명에 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 영역(예를 들어, 코어)의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)m(Op)n 또는 (Op)n(Sp)m이거나 이를 포함하고, 각 변수는 독립적으로 본 발명에 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 영역(예를 들어, 코어)의 백본 키랄 중심 패턴은 (Np)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y 또는 [(Rp/Op)n(Sp)m]y(Np)t이거나 이를 포함하고, y는 1~50이고, 각각의 다른 변수는 독립적으로 본 발명에 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 영역(예를 들어, 코어)의 백본 키랄 중심 패턴은 (Np)t[(Rp)n(Sp)m]y 또는 [(Rp)n(Sp)m]y(Np)t이거나 이를 포함하고, 각 변수는 독립적으로 본 발명에 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 영역(예를 들어, 코어)의 백본 키랄 중심 패턴은 [(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k, [(Rp/Op)n(Sp)m]y, (Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y, (Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k이거나 이를 포함하고, k는 1~50이고, 각각의 다른 변수는 독립적으로 본 발명에 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 영역(예를 들어, 코어)의 백본 키랄 중심 패턴은 [(Op)n(Sp)m]y(Rp)k, [(Op)n(Sp)m]y, (Sp)t[(Op)n(Sp)m]y, (Sp)t[(Op)n(Sp)m]y(Rp)k이거나 이를 포함하고, 각 변수는 독립적으로 본 발명에 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 영역(예를 들어, 코어)의 백본 키랄 중심 패턴은 [(Rp)n(Sp)m]y(Rp)k, [(Rp)n(Sp)m]y, (Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y, (Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)k이거나 이를 포함하고, 각 변수는 독립적으로 본 발명에 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 코어 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 코어 영역을 포함하고, 코어 영역의 각각의 당은 2'-OR1을 함유하지 않으며, R1은 본 발명에 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 코어 영역을 포함하고, 코어 영역의 각각의 당은 독립적으로 천연 DNA 당이다. 특정 구현예에서, 코어의 백본 키랄 중심 패턴은 (Rp)(Sp)m이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 코어의 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)(Sp)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 코어의 백본 키랄 중심 패턴은 (Np)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y 또는 [(Rp/Op)n(Sp)m]y(Np)t이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 코어의 백본 키랄 중심 패턴은 (Np)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y 또는 [(Rp/Op)n(Sp)m]y(Np)t이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 코어의 백본 키랄 중심 패턴은 (Np)t[(Rp)n(Sp)m]y 또는 [(Rp)n(Sp)m]y(Np)t이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 코어의 백본 키랄 중심 패턴은 [(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k, [(Rp/Op)n(Sp)m]y, (Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y, (Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 코어의 백본 키랄 중심 패턴은 [(Op)n(Sp)m]y(Rp)k, [(Op)n(Sp)m]y, (Sp)t[(Op)n(Sp)m]y, (Sp)t[(Op)n(Sp)m]y(Rp)k이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 코어의 백본 키랄 중심 패턴은 [(Rp)n(Sp)m]y(Rp)k, [(Rp)n(Sp)m]y, (Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y, 또는 (Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)k이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 코어의 백본 키랄 중심 패턴은 [(Rp)n(Sp)m]y(Rp)k를 포함한다. 특정 구현예에서, 코어의 백본 키랄 중심 패턴은 [(Rp)n(Sp)m]y(Rp)를 포함한다. 특정 구현예에서, 코어의 백본 키랄 중심 패턴은 [(Rp)n(Sp)m]y를 포함한다. 특정 구현예에서, 코어의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y를 포함한다. 특정 구현예에서, 코어의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)k를 포함한다. 특정 구현예에서, 코어의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)를 포함한다. 특정 구현예에서, 코어의 백본 키랄 중심 패턴은 [(Rp)n(Sp)m]y(Rp)k이다. 특정 구현예에서, 코어의 백본 키랄 중심 패턴은 [(Rp)n(Sp)m]y(Rp)이다. 특정 구현예에서, 코어의 백본 키랄 중심 패턴은 [(Rp)n(Sp)m]y이다. 특정 구현예에서, 코어의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y이다. 특정 구현예에서, 코어의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)k이다. 특정 구현예에서, 코어의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)이다. 특정 구현예에서, 각각의 n은 1이다. 특정 구현예에서, 각각의 t는 1이다. 특정 구현예에서, t는 12, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. 특정 구현예에서, 각각의 t 및 n은 1이다. 특정 구현예에서, 각각의 n은 2 이상이다. 특정 구현예에서, k는 1이다. 특정 구현예에서, k는 2~10이다.
특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)m(Rp)n, (Rp)n(Sp)m, (Np)t(Rp)n(Sp)m, (Sp)t(Rp)n(Sp)m, (Np)t[(Rp)n(Sp)m]2, (Sp)t[(Rp)n(Sp)m]2, (Np)t(Op)n(Sp)m, (Sp)t(Op)n(Sp)m, (Np)t[(Op)n(Sp)m]2, 또는 (Sp)t[(Op)n(Sp)m]2이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 패턴은 (Np)t(Op/Rp)n(Sp)m(Op/Rp)n(Sp)m이다. 특정 구현예에서, 패턴은 (Np)t(Op/Rp)n(Sp)1-5(Op/Rp)n(Sp)m이다. 특정 구현예에서, 패턴은 (Np)t(Op/Rp)n(Sp)2-5(Op/Rp)n(Sp)m이다. 특정 구현예에서, 패턴은 (Np)t(Op/Rp)n(Sp)2(Op/Rp)n(Sp)m이다. 특정 구현예에서, 패턴은 (Np)t(Op/Rp)n(Sp)3(Op/Rp)n(Sp)m이다. 특정 구현예에서, 패턴은 (Np)t(Op/Rp)n(Sp)4(Op/Rp)n(Sp)m이다. 특정 구현예에서, 패턴은 (Np)t(Op/Rp)n(Sp)5(Op/Rp)n(Sp)m이다.
특정 구현예에서, Np는 Sp이다. 특정 구현예에서, (Op/Rp)는 Op이다. 특정 구현예에서, (Op/Rp)는 Rp이다. 특정 구현예에서, Np는 Sp이고, (Op/Rp)는 Rp이다. 특정 구현예에서, Np는 Sp이고, (Op/Rp)는 Op이다. 특정 구현예에서, Np는 Sp이고, 적어도 하나의 (Op/Rp)는 Rp이고, 적어도 하나의 (Op/Rp)는 Op이다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Rp)n(Sp)m, (Np)t(Rp)n(Sp)m, 또는 (Sp)t(Rp)n(Sp)m이거나 이를 포함하고, m은 2보다 크다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Rp)n(Sp)m, (Np)t(Rp)n(Sp)m, 또는(Sp)t(Rp)n(Sp)m이거나 이를 포함하고, n은 1이며, 적어도 하나의 t는 1보다 크고, 적어도 하나의 m은 2보다 크다.
특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴이 Rp로 시작하는 코어 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 높은 활성 및/또는 개선된 특성을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴이 Rp로 끝나는 코어 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 높은 활성 및/또는 개선된 특성을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴이 Rp로 시작하는 코어 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 이의 특성, 예를 들어 안정성에 영향을 크게 미치지 않으면서 높은 활성(예를 들어, 표적 절단)을 제공한다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴이 Rp로 끝나는 코어 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 이의 특성, 예를 들어 안정성에 영향을 크게 미치지 않으면서 높은 활성(예를 들어, 표적 절단)을 제공한다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 Rp로 시작하여 Sp로 끝난다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 Rp로 시작하여 Rp로 끝난다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 Sp로 시작하여 Rp로 끝난다.
특정 구현예에서, RNAi 올리고뉴클레오티드 또는 이의 영역(예를 들어, 코어)의 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k(Op), (Op)[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Op), (Op)(Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Op), 또는 (Op)(Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k(Op)이거나 이를 포함하고, k는 1~50이고, 각각의 다른 변수는 독립적으로 본 발명에 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, RNAi 올리고뉴클레오티드의 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k(Op), (Op)[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Op), (Op)(Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Op), 또는 (Op)(Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k(Op)이거나 이를 포함하고, f, g, h, 및 j는 각각 독립적으로 1~50이고, 각각의 다른 변수는 독립적으로 본 발명에 기재된 바와 같고, 올리고뉴클레오티드는 백본 키랄 중심 패턴이 본 발명에 기재된 바와 같이 [(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k, [(Rp/Op)n(Sp)m]y, (Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y, 또는 (Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k이거나 이를 포함하는 코어 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k(Op)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)(Op)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Op)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)(Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Op)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)(Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k(Op)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)(Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)(Op)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)k(Op)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)(Op)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)[(Rp)n(Sp)m]y(Op)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y(Op)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)k(Op)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은(Op)(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)(Op)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 각각의 n은 1이다. 특정 구현예에서, k는 1이다. 특정 구현예에서, k는 2~10이다.
특정 구현예에서, RNAi 올리고뉴클레오티드 또는 이의 영역(예를 들어, 코어)의 백본 키랄 중심 패턴은(Np)f(Op)g[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k(Op)h(Np)j, (Np)f(Op)g[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Op)h(Np)j, (Np)f(Op)g(Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Op)h(Np)j, 또는 (Np)f(Op)g(Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k(Op)h(Np)j이거나 이를 포함하고, f, g, h, 및 j는 각각 독립적으로 1~50이고, 각각의 다른 변수는 독립적으로 본 발명에 기재된 바와 같다.
특정 구현예에서, RNAi 올리고뉴클레오티드의 백본 키랄 중심 패턴은 (Np)f(Op)g[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k(Op)h(Np)j, (Np)f(Op)g[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Op)h(Np)j, (Np)f(Op)g(Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Op)h(Np)j, 또는 (Np)f(Op)g(Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k(Op)h(Np)j이거나 이를 포함하고, 올리고뉴클레오티드는 백본 키랄 중심 패턴이 본 발명에 기재된 바와 같이 [(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k, [(Rp/Op)n(Sp)m]y, (Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y, 또는 (Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k이거나 이를 포함하는 코어 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, RNAi 올리고뉴클레오티드의 백본 키랄 중심 패턴은 (Np)f(Op)g[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k(Op)h(Np)j, (Np)f(Op)g[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Op)h(Np)j, (Np)f(Op)g(Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Op)h(Np)j, 또는 (Np)f(Op)g(Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k(Op)h(Np)j이거나 이를 포함하고, 올리고뉴클레오티드는 백본 키랄 중심 패턴이 본 발명에 기재된 바와 같이 [(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k, [(Rp/Op)n(Sp)m]y, (Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y, 또는 (Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k이거나 이를 포함하는 코어 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Np)f(Op)g[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k(Op)h(Np)j이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Np)f(Op)g[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)(Op)h(Np)j이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Np)f(Op)g[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Op)h(Np)j이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Np)f(Op)g(Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Op)h(Np)j이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Np)f(Op)g(Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k(Op)h(Np)j이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Np)f(Op)g(Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)(Op)h(Np)j이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Np)f(Op)g[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)k(Op)h(Np)j이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Np)f(Op)g[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)(Op)h(Np)j이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Np)f(Op)g[(Rp)n(Sp)m]y(Op)h(Np)j이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Np)f(Op)g(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y(Op)h(Np)j이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Np)f(Op)g(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)k(Op)h(Np)j이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 (Np)f(Op)g(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)(Op)h(Np)j이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 Np는 Sp이다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 Np는 Rp이다. 특정 구현예에서, 5' 말단 Np는 Sp이다. 특정 구현예에서, 3' 말단 Np는 Sp이다. 특정 구현예에서, 각각의 Np는 Sp이다. 특정 구현예에서, (Np)f(Op)g[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k(Op)h(Np)j는 (Sp)(Op)g[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)k(Op)h(Sp)이다.
특정 구현예에서, (Np)f(Op)g[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k(Op)h(Np)j는 (Sp)(Op)g[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)(Op)h(Sp)이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)(Op)g[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)(Op)h(Sp)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)(Sp)(Op)g[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)(Op)h(Sp)이다. 특정 구현예에서, (Np)f(Op)g[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Op)h(Np)j는 (Sp)(Op)g[(Rp)n(Sp)m]y(Op)h(Sp)이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)(Op)g[(Rp)n(Sp)m]y(Op)h(Sp)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)(Op)g[(Rp)n(Sp)m]y(Op)h(Sp)이다.
특정 구현예에서, (Np)f(Op)g(Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Op)h(Np)j는 (Sp)(Op)g(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y(Op)h(Sp)이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)(Op)g(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y(Op)h(Sp)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)(Op)g(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y(Op)h(Sp)이다. 특정 구현예에서, (Np)f(Op)g(Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k(Op)h(Np)j는 (Sp)(Op)g(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)k(Op)h(Sp)이다.
특정 구현예에서, (Np)f(Op)g(Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k(Op)h(Np)j는 (Sp)(Op)g(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)(Op)h(Sp)이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)(Op)g(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)(Op)h(Sp)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)(Op)g(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)(Op)h(Sp)이다. 특정 구현예에서, 각각의 n은 1이다. 특정 구현예에서, f는 1이다. 특정 구현예에서, g는 1이다. 특정 구현예에서, g는 1보다 크다. 특정 구현예에서, g는 2이다. 특정 구현예에서, g는 3이다. 특정 구현예에서, g는 4이다. 특정 구현예에서, g는 5이다. 특정 구현예에서, g는 6이다. 특정 구현예에서, g는 7이다. 특정 구현예에서, g는 8이다. 특정 구현예에서, g는 9이다. 특정 구현예에서, g는 10이다. 특정 구현예에서, h는 1이다. 특정 구현예에서, h는 1보다 크다. 특정 구현예에서, h는 2이다. 특정 구현예에서, h는 3이다. 특정 구현예에서, h는 4이다. 특정 구현예에서, h는 5이다. 특정 구현예에서, h는 6이다. 특정 구현예에서, h는 7이다. 특정 구현예에서, h는 8이다. 특정 구현예에서, h는 9이다. 특정 구현예에서, h는 10이다. 특정 구현예에서, j는 1이다. 특정 구현예에서, k는 1이다. 특정 구현예에서, k는 2~10이다.
특정 구현예에서, RNAi 올리고뉴클레오티드 또는 이의 영역(예를 들어, 코어)의 백본 키랄 중심 패턴은 [(Rp/Op)n(Sp)m]y, (Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y, (Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]yRp, [(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k, (Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k, (Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k(Op)h, (Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Rp)k(Op)h(Np)j이거나 이를 포함하고, 각각의 변수는 독립적으로 본 발명에 기재된 바와 같다.
특정 구현예에서, 제공된 백본 키랄 중심 패턴에서, 적어도 하나의 (Rp/Op)는 Rp이다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 (Rp/Op)는 Op이다. 특정 구현예에서, 각각의 (Rp/Op)는 Rp이다. 특정 구현예에서, 각각의 (Rp/Op)는 Op이다. 특정 구현예에서, 패턴의 [(Rp)n(Sp)m]y 또는 [(Rp/Op)n(Sp)m]y 중 적어도 하나는 RpSp이다. 특정 구현예에서, 패턴의 [(Rp)n(Sp)m]y 또는 [(Rp/Op)n(Sp)m]y 중 적어도 하나는 RpSp이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 패턴의 [(Rp)n(Sp)m]y 또는 [(Rp/Op)n(Sp)m]y 중 적어도 하나 및 패턴의 [(Rp)n(Sp)m]y 또는 [(Rp/Op)n(Sp)m]y 중 적어도 하나는 RpSpSp이거나 이를 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 패턴의 [(Rp)n(Sp)m]y는 (RpSp)[(Rp)n(Sp)m](y- 1)이고; 특정 구현예에서, 패턴의 [(Rp)n(Sp)m]y는 (RpSp)[RpSpSp(Sp)(m-2)][(Rp)n(Sp)m](y- 2)이다. 특정 구현예에서, (Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)는 (Sp)t(RpSp)[(Rp)n(Sp)m](y-1)(Rp)이다. 특정 구현예에서, (Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)는 (Sp)t(RpSp)[RpSpSp(Sp)(m-2)][(Rp)n(Sp)m](y-2)(Rp)이다. 특정 구현예에서, 각각의 [(Rp/Op)n(Sp)m]은 독립적으로 [Rp(Sp)m]이다. 특정 구현예에서, (Sp)t의 첫 번째 Sp는 5'에서 3'으로 ds 올리고뉴클레오티드의 첫 번째 뉴클레오티드간 연결의 연결 인 입체화학을 나타낸다. 특정 구현예에서, (Sp)t의 첫 번째 Sp는 5'에서 3'으로의 영역(예를 들어, 코어)의 첫 번째 뉴클레오티드간 연결의 연결 인 입체화학을 나타낸다. 특정 구현예에서, (Np)j의 마지막 Np는 5'에서 3'으로 올리고뉴클레오티드의 마지막 뉴클레오티드간 연결의 연결 인 입체화학을 나타낸다. 특정 구현예에서, 마지막 Np는 Sp이다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 영역(예를 들어, 5'-윙)의 백본 키랄 중심 패턴은 Sp(Op)3이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 영역(예를 들어, 5'-윙)의 백본 키랄 중심 패턴은 Rp(Op)3이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 영역(예를 들어, 3'-윙)의 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)3 Sp이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 영역(예를 들어, 3'-윙)의 백본 키랄 중심 패턴은 (Op)3 Rp이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 영역(예를 들어, 코어)의 백본 키랄 중심 패턴은 Rp(Sp)4 Rp(Sp)4 Rp이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 영역(예를 들어, 코어)의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)5 Rp(Sp)4 Rp이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 영역(예를 들어, 코어)의 백본 키랄 중심 패턴은 (Sp)5 Rp(Sp)5이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 또는 영역(예를 들어, 코어)의 백본 키랄 중심 패턴은 Rp(Sp)4 Rp(Sp)5이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 백본 키랄 중심 패턴은 Np(Op)3 Rp(Sp)4 Rp(Sp)4 Rp(Op)3 Np이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 백본 키랄 중심 패턴은 Np(Op)3(Sp)5 Rp(Sp)4 Rp(Op)3 Np이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 백본 키랄 중심 패턴은 Np(Op)3(Sp)5 Rp(Sp)5(Op)3 Np이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 백본 키랄 중심 패턴은 Np(Op)3 Rp(Sp)4 Rp(Sp)5(Op)3 Np이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 백본 키랄 중심 패턴은 Sp(Op)3 Rp(Sp)4 Rp(Sp)4 Rp(Op)3 Sp이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 백본 키랄 중심 패턴은 Sp(Op)3(Sp)5 Rp(Sp)4 Rp(Op)3 Sp이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 백본 키랄 중심 패턴은 Sp(Op)3(Sp)5 Rp(Sp)5(Op)3 Sp이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 백본 키랄 중심 패턴은 Sp(Op)3 Rp(Sp)4 Rp(Sp)5(Op)3 Sp이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 백본 키랄 중심 패턴은 Rp(Op)3 Rp(Sp)4 Rp(Sp)4 Rp(Op)3 Rp이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 백본 키랄 중심 패턴은 Rp(Op)3(Sp)5 Rp(Sp)4 Rp(Op)3 Rp이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 백본 키랄 중심 패턴은 Rp(Op)3(Sp)5 Rp(Sp)5(Op)3 Rp이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 백본 키랄 중심 패턴은 Rp(Op)3 Rp(Sp)4 Rp(Sp)5(Op)3 Rp이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, m, y, t, n, k, f, g, h, 및 j는 각각 독립적으로 1~25이다.
특정 구현예에서, m은 1~25이다. 특정 구현예에서, m은 1~20이다. 특정 구현예에서, m은 1~15이다. 특정 구현예에서, m은 1~10이다. 특정 구현예에서, m은 1~5이다. 특정 구현예에서, m은 2~20이다. 특정 구현예에서, m은 2~15이다. 특정 구현예에서, m은 2~10이다. 특정 구현예에서, m은 2~5이다. 특정 구현예에서, m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25이다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴에서, 각각의 m은 독립적으로 2 이상이다. 특정 구현예에서, 각각의 m은 독립적으로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. 특정 구현예에서, 각각의 m은 독립적으로 2~3, 2~5, 2~6, 또는 2~10이다. 특정 구현예에서, m은 2이다. 특정 구현예에서, m은 3이다. 특정 구현예에서, m은 4이다. 특정 구현예에서, m은 5이다. 특정 구현예에서, m은 6이다. 특정 구현예에서, m은 7이다. 특정 구현예에서, m은 8이다. 특정 구현예에서, m은 9이다. 특정 구현예에서, m은 10이다. 특정 구현예에서, m이 2개 이상 존재하는 경우, 이들은 동일하거나 상이할 수 있고, 이들 각각은 독립적으로 본 발명에 기술된 바와 같다.
특정 구현예에서, y는 1~25이다. 특정 구현예에서, y는 1~20이다. 특정 구현예에서, y는 1~15이다. 특정 구현예에서, y는 1~10이다. 특정 구현예에서, y는 1~5이다. 특정 구현예에서, y는 2~20이다. 특정 구현예에서, y는 2~15이다. 특정 구현예에서, y는 2~10이다. 특정 구현예에서, y는 2~5이다. 특정 구현예에서, y는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25이다. 특정 구현예에서, y는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. 특정 구현예에서, y는 1이다. 특정 구현예에서, y는 2이다. 특정 구현예에서, y는 3이다. 특정 구현예에서, y는 4이다. 특정 구현예에서, y는 5이다. 특정 구현예에서, y는 6이다. 특정 구현예에서, y는 7이다. 특정 구현예에서, y는 8이다. 특정 구현예에서, y는 9이다. 특정 구현예에서, y는 10이다.
특정 구현예에서, t는 1~25이다. 특정 구현예에서, t는 1~20이다. 특정 구현예에서, t는 1~15이다. 특정 구현예에서, t는 1~10이다. 특정 구현예에서, t는 1~5이다. 특정 구현예에서, t는 2~20이다. 특정 구현예에서, t는 2~15이다. 특정 구현예에서, t는 2~10이다. 특정 구현예에서, t는 2~5이다. 특정 구현예에서, t는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25이다. 특정 구현예에서, 각각의 t는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. 특정 구현예에서, t는 2 이상이다. 특정 구현예에서, t는 1이다. 특정 구현예에서, t는 2이다. 특정 구현예에서, t는 3이다. 특정 구현예에서, t는 4이다. 특정 구현예에서, t는 5이다. 특정 구현예에서, t는 6이다. 특정 구현예에서, t는 7이다. 특정 구현예에서, t는 8이다. 특정 구현예에서, t는 9이다. 특정 구현예에서, t는 10이다. 특정 구현예에서, t가 2개 이상 존재하는 경우, 이들은 동일하거나 상이할 수 있고, 이들 각각은 독립적으로 본 발명에 기술된 바와 같다.
특정 구현예에서, n은 1~25이다. 특정 구현예에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25이다. 특정 구현예에서, n은 1이다. 특정 구현예에서, n은 2이다. 특정 구현예에서, n은 3이다. 특정 구현예에서, n은 4이다. 특정 구현예에서, n은 5이다. 특정 구현예에서, n은 6이다. 특정 구현예에서, n은 7이다. 특정 구현예에서, n은 8이다. 특정 구현예에서, n은 9이다. 특정 구현예에서, n은 10이다. 특정 구현예에서, n이 2개 이상 존재하는 경우, 이들은 동일하거나 상이할 수 있고, 이들 각각은 독립적으로 본 발명에 기술된 바와 같다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴에서, n이 적어도 1개 이상 존재하는 경우 1이고, 일부 경우, 각각의 n은 1이다.
특정 구현예에서, k는 1~25이다. 특정 구현예에서, k는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25이다. 특정 구현예에서, k는 1이다. 특정 구현예에서, k는 2이다. 특정 구현예에서, k는 3이다. 특정 구현예에서, k는 4이다. 특정 구현예에서, k는 5이다. 특정 구현예에서, k는 6이다. 특정 구현예에서, k는 7이다. 특정 구현예에서, k는 8이다. 특정 구현예에서, k는 9이다. 특정 구현예에서, k는 10이다.
특정 구현예에서, f는 1~25이다. 특정 구현예에서, f는 1~20이다. 특정 구현예에서, f는 1~10이다. 특정 구현예에서, f는 1~5이다. 특정 구현예에서, f는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25이다. 특정 구현예에서, f는 1이다. 특정 구현예에서, f는 2이다. 특정 구현예에서, f는 3이다. 특정 구현예에서, f는 4이다. 특정 구현예에서, f는 5이다. 특정 구현예에서, f는 6이다. 특정 구현예에서, f는 7이다. 특정 구현예에서, f는 8이다. 특정 구현예에서, f는 9이다. 특정 구현예에서, f는 10이다.
특정 구현예에서, g는 1~25이다. 특정 구현예에서, g는 1~20이다. 특정 구현예에서, g는 1~9이다. 특정 구현예에서, g는 1~5이다. 특정 구현예에서, g는 2~10이다. 특정 구현예에서, g는 2~5이다. 특정 구현예에서, g는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25이다. 특정 구현예에서, g는 1이다. 특정 구현예에서, g는 2이다. 특정 구현예에서, g는 3이다. 특정 구현예에서, g는 4이다. 특정 구현예에서, g는 5이다. 특정 구현예에서, g는 6이다. 특정 구현예에서, g는 7이다. 특정 구현예에서, g는 8이다. 특정 구현예에서, g는 9이다. 특정 구현예에서, g는 10이다.
특정 구현예에서, h는 1~25이다. 특정 구현예에서, h는 1~10이다. 특정 구현예에서, h는 1~5이다. 특정 구현예에서, h는 2~10이다. 특정 구현예에서, h는 2~5이다. 특정 구현예에서, h는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25이다. 특정 구현예에서, h는 1이다. 특정 구현예에서, h는 2이다. 특정 구현예에서, h는 3이다. 특정 구현예에서, h는 4이다. 특정 구현예에서, h는 5이다. 특정 구현예에서, h는 6이다. 특정 구현예에서, h는 7이다. 특정 구현예에서, h는 8이다. 특정 구현예에서, h는 9이다. 특정 구현예에서, h는 10이다.
특정 구현예에서, j는 1~25이다. 특정 구현예에서, j는 1~10이다. 특정 구현예에서, j는 1~5이다. 특정 구현예에서, j는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25이다. 특정 구현예에서, j는 1이다. 특정 구현예에서, j는 2이다. 특정 구현예에서, j는 3이다. 특정 구현예에서, j는 4이다. 특정 구현예에서, j는 5이다. 특정 구현예에서, j는 6이다. 특정 구현예에서, j는 7이다. 특정 구현예에서, j는 8이다. 특정 구현예에서, j는 9이다. 특정 구현예에서, j는 10이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 n은 1이고, 적어도 하나의 m은 2 이상이다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 n은 1이고, 적어도 하나의 t는 2 이상이며, 적어도 하나의 m은 3 이상이다. 특정 구현예에서, 각각의 n은 1이다. 특정 구현예에서, t는 1이다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 t는 1보다 크다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 t는 2보다 크다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 t는 3보다 크다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 t는 4보다 크다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 m은 1보다 크다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 m은 2보다 크다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 m은 3보다 크다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 m은 4보다 크다. 특정 구현예에서, 백본 키랄 중심 패턴은 하나 이상의 아키랄 천연 포스페이트 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, m, t, 및 n(또는, t가 패턴에 없는 경우 m 및 n)의 합계는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 이상이다. 특정 구현예에서, 합계는 5이다. 특정 구현예에서, 합계는 6이다. 특정 구현예에서, 합계는 7이다. 특정 구현예에서, 합계는 8이다. 특정 구현예에서, 합계는 9이다. 특정 구현예에서, 합계는 10이다. 특정 구현예에서, 합계는 11이다. 특정 구현예에서, 합계는 12이다. 특정 구현예에서, 합계는 13이다. 특정 구현예에서, 합계는 14이다. 특정 구현예에서, 합계는 15이다.
특정 구현예에서, 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결에 있는 다수의 연결 인은 Sp이다. 특정 구현예에서, 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%는 Sp 연결 인을 갖는다. 특정 구현예에서, 모든 키랄 뉴클레오티드간 연결의 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%는 Sp 연결 인을 갖는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 모든 뉴클레오티드간 연결의 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%는 Sp 연결 인을 갖는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 20%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 30%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 40%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 50%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 60%이다.
특정 구현예에서, 백분율은 적어도 65%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 70%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 75%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 80%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 90%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 95%이다. 특정 구현예에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 뉴클레오티드간 연결은 Sp 연결 인을 갖는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 적어도 5개의 뉴클레오티드간 연결은 Sp 연결 인을 갖는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 적어도 6개의 뉴클레오티드간 연결은 Sp 연결 인을 갖는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 적어도 7개의 뉴클레오티드간 연결은 Sp 연결 인을 갖는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 적어도 8개의 뉴클레오티드간 연결은 Sp 연결 인을 갖는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 적어도 9개의 뉴클레오티드간 연결은 Sp 연결 인을 갖는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 적어도 10개의 뉴클레오티드간 연결은 Sp 연결 인을 갖는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 적어도 11개의 뉴클레오티드간 연결은 Sp 연결 인을 갖는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 적어도 12개의 뉴클레오티드간 연결은 Sp 연결 인을 갖는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 적어도 13개의 뉴클레오티드간 연결은 Sp 연결 인을 갖는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 적어도 14개의 뉴클레오티드간 연결은 Sp 연결 인을 갖는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 적어도 15개의 뉴클레오티드간 연결은 Sp 연결 인을 갖는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 뉴클레오티드간 연결은 Rp 연결 인을 갖는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 이하의 뉴클레오티드간 연결은 Rp 연결 인을 갖는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드에 있는 하나 이하의 뉴클레오티드간 연결은 Rp 연결 인을 갖는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드에 있는 2개 이하의 뉴클레오티드간 연결은 Rp 연결 인을 갖는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드에 있는 3개 이하의 뉴클레오티드간 연결은 Rp 연결 인을 갖는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드에 있는 4개 이하의 뉴클레오티드간 연결은 Rp 연결 인을 갖는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드에 있는 5개 이하의 뉴클레오티드간 연결은 Rp 연결 인을 갖는 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결이다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드에 있는 뉴클레오티드간 연결의 전부, 본질적으로 전부 또는 대부분(예를 들어, 올리고뉴클레오티드에 있는 모든 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결, 또는 모든 키랄 뉴클레오티드간 연결, 또는 모든 뉴클레오티드간 연결의 약 50%~100%, 55%~100%, 60%~100%, 65%~100%, 70%~100%, 75%~100%, 80%~100%, 85%~100%, 90%~100%, 55%~95%, 60%~95%, 65%~95%, 또는 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 이상)은, 하나 또는 소수의 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, 올리고뉴클레오티드에 있는 모든 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결, 또는 모든 키랄 뉴클레오티드간 연결, 또는 모든 뉴클레오티드간 연결의 1, 2, 3, 4, 또는 5개, 및/또는 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만)이 Rp 배열인 것을 제외하고, Sp 배열이다. 특정 구현예에서, 코어에 있는 뉴클레오티드간 연결의 전부, 본질적으로 전부 또는 대부분(예를 들어, 코어에 있는 모든 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결, 또는 모든 키랄 뉴클레오티드간 연결, 또는 모든 뉴클레오티드간 연결의 약 50%~100%, 55%~100%, 60%~100%, 65%~100%, 70%~100%, 75%~100%, 80%~100%, 85%~100%, 90%~100%, 55%~95%, 60%~95%, 65%~95%, 또는 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 이상)은, 하나 또는 소수의 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, 코어에 있는 모든 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결, 또는 모든 키랄 뉴클레오티드간 연결, 또는 모든 뉴클레오티드간 연결의 1, 2, 3, 4, 또는 5개, 및/또는 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만)이 Rp 배열인 것을 제외하고, Sp 배열이다. 특정 구현예에서, 코어에 있는 뉴클레오티드간 연결의 전부, 본질적으로 전부 또는 대부분(예를 들어, 코어에 있는 모든 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결, 또는 모든 키랄 뉴클레오티드간 연결, 또는 모든 뉴클레오티드간 연결의 약 50%~100%, 55%~100%, 60%~100%, 65%~100%, 70%~100%, 75%~100%, 80%~100%, 85%~100%, 90%~100%, 55%~95%, 60%~95%, 65%~95%, 또는 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 이상)은, 하나 또는 소수의 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, 코어에 있는 모든 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결, 또는 모든 키랄 뉴클레오티드간 연결, 또는 모든 뉴클레오티드간 연결의 1, 2, 3, 4, 또는 5개, 및/또는 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만)이 Rp 배열의 포스포로티오에이트를 제외하고, Sp 배열의 포스포로티오에이트이다. 특정 구현예에서, 코어에 있는 각각의 뉴클레오티드간 연결은, Rp 배열의 하나의 포스포로티오에이트를 제외하고, Sp 배열의 포스포로티오에이트이다. 특정 구현예에서, 코어에 있는 각각의 뉴클레오티드간 연결은, Rp 배열의 하나의 포스포로티오에이트를 제외하고, Sp 배열의 포스포로티오에이트이다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 Rp 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 하나 이하의 Rp 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 2개 이상의 Rp 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 3개 이상의 Rp 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 4개 이상의 Rp 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 5개 이상의 Rp 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드에 있는 모든 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 약 5%~50%는 Rp이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드에 있는 모든 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 약 5%~40%는 Rp이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드에 있는 모든 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 약 10%~40%는 Rp이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드에 있는 모든 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 약 15%~40%는 Rp이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드에 있는 모든 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 약 20%~40%는 Rp이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드에 있는 모든 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 약 25%~40%는 Rp이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드에 있는 모든 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 약 30%~40%는 Rp이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드에 있는 모든 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결의 약 35%~40%는 Rp이다.
특정 구현예에서, Rp 뉴클레오티드간 연결 대신에, 천연 포스페이트 연결은, 임의의 변형, 예를 들어 당 변형(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 R5s와 같은 5'-변형)으로 유사하게 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 변형은 천연 포스페이트 연결의 안정성을 향상시킨다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 백본 키랄 중심 패턴을 갖는 ds 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 특정 구현예에서, 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물 내의 올리고뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 공통 백본 키랄 중심 패턴을 공유한다.
특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결의 적어도 약 25%는 키랄 제어되고 Sp 연결 인을 갖는다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결의 적어도 약 30%는 키랄 제어되고 Sp 연결 인을 갖는다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결의 적어도 약 40%는 키랄 제어되고 Sp 연결 인을 갖는다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결의 적어도 약 50%는 키랄 제어되고 Sp 연결 인을 갖는다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결의 적어도 약 60%는 키랄 제어되고 Sp 연결 인을 갖는다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결의 적어도 약 65%는 키랄 제어되고 Sp 연결 인을 갖는다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결의 적어도 약 70%는 키랄 제어되고 Sp 연결 인을 갖는다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결의 적어도 약 75%는 키랄 제어되고 Sp 연결 인을 갖는다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결의 적어도 약 80%는 키랄 제어되고 Sp 연결 인을 갖는다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결의 적어도 약 85%는 키랄 제어되고 Sp 연결 인을 갖는다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결의 적어도 약 90%는 키랄 제어되고 Sp 연결 인을 갖는다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결의 적어도 약 95%는 키랄 제어되고 Sp 연결 인을 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명은 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물, 예를 들어 키랄 제어 dsRNAi 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공하며, 조성물은 비무작위 또는 제어된 수준의 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 복수의 올리고뉴클레오티드는 공통 염기 서열을 공유하고, 1~50, 1~40, 1~30, 1~25, 1~20, 1~15, 1~10, 5~50, 5~40, 5~30, 5~25, 5~20, 5~15, 5~10, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 이상의 키랄 뉴클레오티드간 연결에서 독립적으로 동일한 배열의 연결 인을 공유한다.
특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 2~30개의 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 5~30개의 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 10~30개의 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결을 포함한다.
특정 구현예에서, 백분율은 약 5%~100%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 965, 96%, 98%, 또는 99%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 965, 96%, 98%, 또는 99%이다.
특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드에서의 백본 키랄 중심 패턴은 io-is-io-is-io, io-is-is-is-io, io-is-is-is-io-is, is-io-is-io, is-io-is-io, is-io-is-io-is, is-io-is-io-is-io, is-io-is-io-is-io-is-io, is-io-is-is-is-io, is-is-io-is-is-is-io-is-is, is-is-is-io-is-io-is-is-is, is-is-is-is-io-is-io-is-is-is-is, is-is-is-is-is, is-is-is-is-is-is, is-is-is- is-is-is-is, is-is-is-is-is-is-is-is, is-is-is-is-is-is-is-is-is, 또는 ir-ir-ir의 패턴을 포함하며, is는 Sp 배열의 뉴클레오티드간 연결을 나타내고; io는 아키랄 뉴클레오티드간 연결을 나타내며; ir은 Rp 배열의 뉴클레오티드간 연결을 나타낸다.
특정 구현예에서, Sp 배열의 뉴클레오티드간 연결(Sp 연결 인을 가짐)은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 아키랄 뉴클레오티드간 연결은 천연 포스페이트 연결이다. 특정 구현예에서, Rp 배열의 뉴클레오티드간 연결(Rp 연결 인을 가짐)은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, Sp 배열의 각각의 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 각각의 아키랄 뉴클레오티드간 연결은 천연 포스페이트 연결이다. 특정 구현예에서, Rp 배열의 각각의 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, Sp 배열의 각각의 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이고, 각각의 아키랄 뉴클레오티드간 연결은 천연 포스페이트 연결이고, Rp 배열의 각각의 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이다.
특정 구현예에서, 키랄 제어 올리고뉴클레오티드 조성물 내의 dsRNAi 올리고뉴클레오티드 각각은 상이한 유형의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 천연 포스페이트 연결 및 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 천연 포스페이트 연결 및 적어도 2개의 변형 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 천연 포스페이트 연결 및 적어도 3개의 변형 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 천연 포스페이트 연결 및 적어도 4개의 변형 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 천연 포스페이트 연결 및 적어도 5개의 변형 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 천연 포스페이트 연결 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 변형 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 각각의 변형 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 트리에스테르 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 각각의 변형 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 트리에스테르 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, RNAi 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 천연 포스페이트 연결 및 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 연속적 변형 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, RNAi 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 천연 포스페이트 연결 및 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 연속적 변형 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 천연 포스페이트 연결 및 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 연속적 포스포로티오에이트 트리에스테르 뉴클레오티드간 연결을 포함한다.
특정 구현예에서, 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물 내의 올리고뉴클레오티드 각각은 서로에 대해 상이한 입체화학 및/또는 상이한 P-변형을 갖는 적어도 2개의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 2개의 뉴클레오티드간 연결은 서로에 대해 상이한 입체화학을 갖고, ds 올리고뉴클레오티드는 각각 교대 연결 인 입체화학을 포함하는 백본 키랄 중심 패턴을 포함한다.
특정 구현예에서, 연결은 키랄 보조체를 포함하고, 이는 예를 들어, 반응, 예를 들어 ds 올리고뉴클레오티드 합성 사이클에서의 커플링 반응의 입체선택성을 제어하는 데 사용된다. 특정 구현예에서, 포스포로티오에이트 트리에스테르 연결은 키랄 보조체를 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 포스포로티오에이트 트리에스테르 연결은 대상체에게 올리고뉴클레오티드 조성물을 투여할 때까지 및/또는 투여하는 동안 의도적으로 유지된다.
특정 구현예에서, 키랄 연결 인 중심을 제외한 ds 올리고뉴클레오티드의 모든 다른 키랄 중심이 입체정의된(예를 들어, 당의 탄소 키랄 중심, 이는 예를 들어 ds 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 포스포아미다이트에서 정의됨) 많은 ds 올리고뉴클레오티드 및 이의 조성물의 순도, 특히 입체화학적 순도, 특히 부분입체이성체 순도는, 키랄 뉴클레오티드간 연결을 형성할 때 커플링 단계에서 키랄 연결 인에서의 입체선택성(당업자에 의해 이해되는 바와 같이, ds 올리고뉴클레오티드가 하나 초과의 키랄 중심을 포함하는 ds 올리고뉴클레오티드 합성의 많은 경우 부분입체선택성)에 의해 제어될 수 있다. 특정 구현예에서, 커플링 단계는 연결 인에서 60%의 입체선택성(다른 키랄 중심이 있는 경우 부분입체선택성)을 갖는다. 이러한 커플링 단계 후, 형성된 새로운 뉴클레오티드간 연결은 60%의 입체화학적 순도(ds 올리고뉴클레오티드의 경우, 다른 키랄 중심의 존재를 고려할 때 일반적으로 부분입체이성체 순도)를 갖는 것으로 언급될 수 있다. 특정 구현예에서, 각각의 커플링 단계는 독립적으로 적어도 60%의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 커플링 단계는 독립적으로 적어도 70%의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 커플링 단계는 독립적으로 적어도 80%의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 커플링 단계는 독립적으로 적어도 85%의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 커플링 단계는 독립적으로 적어도 90%의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 커플링 단계는 독립적으로 적어도 91%의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 커플링 단계는 독립적으로 적어도 92%의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 커플링 단계는 독립적으로 적어도 93%의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 커플링 단계는 독립적으로 적어도 94%의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 커플링 단계는 독립적으로 적어도 95%의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 커플링 단계는 독립적으로 적어도 96%의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 커플링 단계는 독립적으로 적어도 97%의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 커플링 단계는 독립적으로 적어도 98%의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 커플링 단계는 독립적으로 적어도 99%의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 커플링 단계는 독립적으로 적어도 99.5%의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 커플링 단계는 독립적으로 거의 100%의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 커플링 단계는 분석 방법(예를 들어, NMR, HPLC 등)에 의해 분석되는 커플링 단계로부터의 모든 검출가능한 생성물이 의도된 입체선택성을 갖는다는 점에서 사실상 100%의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결은 일반적으로 적어도 0%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99.5%, 또는 거의 100%(특정 구현예에서, 적어도 90%; 특정 구현예에서, 적어도 95%; 특정 구현예에서, 적어도 96%; 특정 구현예에서, 적어도 97%; 특정 구현예에서, 적어도 98%; 특정 구현예에서, 적어도 99%)의 입체선택성으로 형성된다. 특정 구현예에서, 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결은, 이의 키랄 연결 인에서 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99.5% 또는 사실상 100%(특정 구현예에서, 적어도 90%; 특정 구현예에서, 적어도 95%; 특정 구현예에서, 적어도 96%; 특정 구현예에서, 적어도 97%; 특정 구현예에서, 적어도 98%; 특정 구현예에서, 적어도 99%)의 입체화학적 순도(다중 키랄 중심을 갖는 올리고뉴클레오티드의 경우 일반적으로 부분입체이성체 순도)를 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 이의 키랄 연결 인에서 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99.5%, 또는 사실상 100%(특정 구현예에서, 적어도 90%; 특정 구현예에서, 적어도 95%; 특정 구현예에서, 적어도 96%; 특정 구현예에서, 적어도 97%; 특정 구현예에서, 적어도 98%; 특정 구현예에서, 적어도 99%)의 입체화학적 순도(다중 키랄 중심을 갖는 올리고뉴클레오티드의 경우 일반적으로 부분입체이성체 순도)를 갖는다. 특정 구현예에서, 키랄 비제어 뉴클레오티드간 연결은 일반적으로 60%, 70%, 80%, 85%, 또는 90% 미만(특정 구현예에서, 60% 미만; 특정 구현예에서, 70% 미만; 특정 구현예에서, 80% 미만; 특정 구현예에서, 85% 미만; 특정 구현예에서, 90% 미만)의 입체선택성으로 형성된다. 특정 구현예에서, 각각의 키랄 비제어 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 60%, 70%, 80%, 85%, 또는 90% 미만(특정 구현예에서, 60% 미만; 특정 구현예에서, 70% 미만; 특정 구현예에서, 80% 미만; 특정 구현예에서, 85% 미만; 특정 구현예에서, 90% 미만)의 입체선택성으로 형성된다. 특정 구현예에서, 키랄 비제어 뉴클레오티드간 연결은, 이의 키랄 연결 인에서 60%, 70%, 80%, 85%, 또는 90% 미만(특정 구현예에서, 60% 미만; 특정 구현예에서, 70% 미만; 특정 구현예에서, 80% 미만; 특정 구현예에서, 85% 미만; 특정 구현예에서, 90% 미만)의 입체화학적 순도(다중 키랄 중심을 갖는 올리고뉴클레오티드의 경우 일반적으로 부분입체이성체 순도)를 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 키랄 비제어 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 이의 키랄 연결 인에서 60%, 70%, 80%, 85%, 또는 90% 미만(특정 구현예에서, 60% 미만; 특정 구현예에서, 70% 미만; 특정 구현예에서, 80% 미만; 특정 구현예에서, 85% 미만; 특정 구현예에서, 90% 미만)의 입체화학적 순도(다중 키랄 중심을 갖는 올리고뉴클레오티드의 경우 일반적으로 부분입체이성체 순도)를 갖는다.
특정 구현예에서, 단량체(당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 특정 구현예에서 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 포스포아미다이트) 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 커플링은 독립적으로 약 60%, 70%, 80%, 85%, 또는 90% 미만의 입체선택성[올리고뉴클레오티드 합성의 경우, 일반적으로, 형성된 연결 인 키랄 중심(들)에 대한 부분입체선택성]을 갖는다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 커플링은 약 60%, 70%, 80%, 85%, 또는 90% 미만의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 적어도 2개의 커플링은 독립적으로 약 60%, 70%, 80%, 85%, 또는 90% 미만의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 적어도 3개의 커플링은 독립적으로 약 60%, 70%, 80%, 85%, 또는 90% 미만의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 적어도 4개의 커플링은 독립적으로 약 60%, 70%, 80%, 85%, 또는 90% 미만의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 적어도 5개의 커플링은 독립적으로 약 60%, 70%, 80%, 85%, 또는 90% 미만의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 커플링은 독립적으로 약 60%, 70%, 80%, 85%, 또는 90% 미만의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 키랄 비제어 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 약 60%, 70%, 80%, 85%, 또는 90% 미만의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 입체선택성은 약 60% 미만이다. 특정 구현예에서, 입체선택성은 약 70% 미만이다. 특정 구현예에서, 입체선택성은 약 80% 미만이다. 특정 구현예에서, 입체선택성은 약 90% 미만이다. 특정 구현예에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 커플링은 독립적으로 약 90% 미만의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 커플링은 약 90% 미만의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 적어도 2개의 커플링은 약 90% 미만의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 적어도 3개의 커플링은 약 90% 미만의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 적어도 4개의 커플링은 약 90% 미만의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 적어도 5개의 커플링은 약 90% 미만의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 커플링은 독립적으로 약 90% 미만의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 커플링은 독립적으로 약 85% 미만의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 커플링은 독립적으로 약 85% 미만의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 커플링은 독립적으로 약 80% 미만의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 커플링은 독립적으로 약 80% 미만의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 커플링은 독립적으로 약 70% 미만의 입체선택성을 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 커플링은 독립적으로 약 70% 미만의 입체선택성을 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명의 ds 올리고뉴클레오티드 및 조성물은 고순도를 갖는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 ds 올리고뉴클레오티드 및 조성물은 높은 입체화학적 순도를 갖는다. 특정 구현예에서, 입체화학적 순도, 예를 들어 부분입체이성체 순도는 약 60%~100%이다. 특정 구현예에서, 부분입체이성체 순도는 약 60%~100%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다. 특정 구현예에서, 부분입체이성체 순도는 적어도 60%이다. 특정 구현예에서, 부분입체이성체 순도는 적어도 70%이다. 특정 구현예에서, 부분입체이성체 순도는 적어도 80%이다. 특정 구현예에서, 부분입체이성체 순도는 적어도 85%이다. 특정 구현예에서, 부분입체이성체 순도는 적어도 90%이다. 특정 구현예에서, 부분입체이성체 순도는 적어도 91%이다. 특정 구현예에서, 부분입체이성체 순도는 적어도 92%이다. 특정 구현예에서, 부분입체이성체 순도는 적어도 93%이다. 특정 구현예에서, 부분입체이성체 순도는 적어도 94%이다. 특정 구현예에서, 부분입체이성체 순도는 적어도 95%이다. 특정 구현예에서, 부분입체이성체 순도는 적어도 96%이다. 특정 구현예에서, 부분입체이성체 순도는 적어도 97%이다. 특정 구현예에서, 부분입체이성체 순도는 적어도 98%이다. 특정 구현예에서, 부분입체이성체 순도는 적어도 99%이다. 특정 구현예에서, 부분입체이성체 순도는 적어도 99.5%이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 화합물(예를 들어, 올리고뉴클레오티드, 키랄 보조체 등)은 다중 키랄 요소(예를 들어, 다중 탄소 및/또는 인(예를 들어, 키랄 뉴클레오티드간 연결의 연결 인) 키랄 중심)를 포함한다. 특정 구현예에서, 제공된 화합물(예를 들어, ds 올리고뉴클레오티드)의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이상의 키랄 요소는 각각 독립적으로 본원에 기재된 바와 같은 부분입체이성체 순도를 갖는다. 특정 구현예에서, 제공된 화합물(예를 들어, ds 올리고뉴클레오티드)의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이상의 키랄 탄소 중심은 각각 독립적으로 본원에 기재된 바와 같은 부분입체이성체 순도를 갖는다. 특정 구현예에서, 제공된 화합물의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이상의 키랄 인 중심은 각각 독립적으로 본원에 기재된 바와 같은 부분입체이성체 순도를 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 키랄 원소는 독립적으로, 본원에 기재된 바와 같은 부분입체이성체 순도를 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 키랄 중심은 독립적으로, 본원에 기재된 바와 같은 부분입체이성체 순도를 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 키랄 탄소 중심은 독립적으로, 본원에 기재된 바와 같은 부분입체이성체 순도를 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 키랄 인 중심은 독립적으로, 본원에 기재된 바와 같은 부분입체이성체 순도를 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 키랄 인 중심은 독립적으로 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 부분입체이성체 순도를 갖는다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 특정 구현예에서, 커플링의 부분입체선택성 또는 키랄 연결 인 중심의 부분입체이성체 순도는 이량체 형성의 부분입체선택성 또는 동일하거나 비견되는 조건에서 제조된 이량체의 부분입체이성체 순도를 통해 평가될 수 있고, 이러한 이량체는 동일한 5'- 및 3'-뉴클레오시드 및 뉴클레오티드간 연결을 갖는다.
다양한 기술이 키랄 요소의 입체화학(예를 들어, 키랄 연결 인의 배열) 및/또는 백본 키랄 중심 패턴의 식별 또는 확인, 및/또는 입체선택성(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 합성에서 커플링 단계의 부분입체선택성) 및/또는 입체화학적 순도(예를 들어, 뉴클레오티드간 연결, 화합물(예를 들어, 올리고뉴클레오티드) 등의 부분입체이성체 순도)의 평가에 활용될 수 있다. 예시적인 기술은 NMR[예를 들어, 1D(1차원) 및/또는 2D(2차원) 1H-31P HETCOR(이핵 상관 분광법(heteronuclear correlation spectroscopy))], HPLC, RP-HPLC, 질량 분석법, LC- MS, 및 입체특이성 뉴클레아제 등에 의한 뉴클레오티드간 연결의 절단(이는 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있음)을 포함한다. 유용한 뉴클레아제의 예는 벤조나제, 미세구균 뉴클레아제, 및 svPDE(뱀독 포스포디에스테라제)(이들은 Rp 연결 인을 갖는 특정 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, Rp 포스포로티오에이트 연결)에 특이적임); 및 뉴클레아제 P1, 녹두 뉴클레아제, 및 뉴클레아제 S1(이들은 Sp 연결 인을 갖는 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, Sp 포스포로티오에이트 연결)에 특이적임)을 포함한다. 임의의 특정 이론에 구애되고자 함이 없이, 본 발명은 적어도 일부 경우에 특정 뉴클레아제에 의한 올리고뉴클레오티드의 절단이 구조적 요소, 예를 들어 화학적 변형(예를 들어, 당의 2'-변형), 염기 서열, 또는 입체화학적 맥락에 의해 영향을 받을 수 있음에 주목한다. 예를 들어, 일부 경우에, Rp 연결 인을 갖는 뉴클레오티드간 연결에 특이적인 벤조나제 및 미세구균 뉴클레아제는 Sp 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결에 의해 플랭킹된 격리된 Rp 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 절단할 수 없었음이 관찰된다.
특정 구현예에서, 공통 염기 서열, 공통 백본 연결 패턴, 및 공통 백본 키랄 중심 패턴을 공유하는 ds 올리고뉴클레오티드는 공통 백본 인 변형 패턴 및 공통 염기 변형 패턴을 공유한다. 특정 구현예에서, 공통 염기 서열, 공통 백본 연결 패턴, 및 공통 백본 키랄 중심 패턴을 공유하는 sd 올리고뉴클레오티드 조성물은 공통 백본 인 변형 패턴 및 공통 뉴클레오시드 변형 패턴을 공유한다. 특정 구현예에서, 공통 염기 서열, 공통 백본 연결 패턴, 및 공통 백본 키랄 중심 패턴을 공유하는 ds 올리고뉴클레오티드는 동일한 구조를 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명은 RNAi 넉다운을 유도할 수 있는 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 ds 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공하며, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드는 특정 ds 올리고뉴클레오티드 유형의 것이고, 조성물은 동일 염기 서열을 갖는 ds 올리고뉴클레오티드의 실질적 라세미 제제에 비해 특정 ds 올리고뉴클레오티드 유형의 ds 올리고뉴클레오티드가 풍부하다는 점에서 키랄 제어된 것이다.
특정 구현예에서, 공통 염기 서열, 공통 백본 연결 패턴, 및 공통 백본 키랄 중심 패턴을 갖는 ds 올리고뉴클레오티드는 공통 백본 인 변형 패턴 및 공통 염기 변형 패턴을 갖는다. 특정 구현예에서, 공통 염기 서열, 공통 백본 연결 패턴, 및 공통 백본 키랄 중심 패턴을 갖는 ds 올리고뉴클레오티드는 공통 백본 인 변형 패턴 및 공통 뉴클레오시드 변형 패턴을 갖는다. 특정 구현예에서, 공통 염기 서열, 공통 백본 연결 패턴, 및 공통 백본 키랄 중심 패턴을 갖는 ds 올리고뉴클레오티드는 동일한 구조를 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명은 복수의 ds 올리고뉴클레오티드를 포함하는 dsRNAi 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 키랄 제어 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 염기 서열이 본원에 개시된 dsRNAi 서열 또는 이의 일부(예를 들어, 표 1A 또는 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D의 다양한 염기 서열(각각의 T는 독립적으로 U로 대체될 수 있고 그 반대도 가능함)이거나 이에 상보적인 dsRNAi 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 염기 서열이 본원에 개시된 dsRNAi 서열 또는 이의 일부(예를 들어, 표 1A 또는 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D의 다양한 염기 서열)이거나 이에 상보적인 염기 서열을 포함하는, dsRNAi 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 염기 서열이 본원에 개시된 dsRNAi 서열 또는 이의 일부(예를 들어, 표 1A 또는 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D의 다양한 염기 서열(각각의 T는 독립적으로 U로 대체될 수 있고 그 반대도 가능함)이거나 이에 상보적인 염기 서열의 15개 인접 염기를 포함하는, dsRNAi 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 dsRNAi 서열 또는 이의 일부(예를 들어, 표 1A 또는 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D의 다양한 염기 서열(각각의 T는 독립적으로 U로 대체될 수 있고 그 반대도 가능함)이거나 상보적인 염기 서열의 0~3개의 불일치를 갖는 15개 인접 염기를 포함하는 염기 서열을 갖는 dsRNAi 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 dsRNAi 올리고뉴클레오티드가 키랄 제어되지 않는 적어도 하나의 키랄 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 dsRNAi 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 키랄 비제어 키랄 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 dsRNAi 올리고뉴클레오티드를 제공하며, dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 염기 서열은 본원에 개시된 dsRNAi 서열 또는 이의 일부(예를 들어, 표 1A 또는 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D의 다양한 염기 서열(각각의 T는 독립적으로 U로 대체될 수 있고 그 반대도 가능함)이거나 이에 상보적인 염기 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 키랄 비제어 키랄 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 dsRNAi 올리고뉴클레오티드를 제공하며, dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 염기 서열은 본원에 개시된 dsRNAi 서열 또는 이의 일부(예를 들어, 표 1A 또는 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D의 다양한 염기 서열(각각의 T는 독립적으로 U로 대체될 수 있고 그 반대도 가능함)이거나 이에 상보적인 염기 서열이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 키랄 비제어 키랄 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 RNAi 올리고뉴클레오티드를 제공하며, dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 염기 서열은 본원에 개시된 dsRNAi 서열 또는 이의 일부(예를 들어, 표 1A 또는 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D의 다양한 염기 서열(각각의 T는 독립적으로 U로 대체될 수 있고 그 반대도 가능함)이거나 이에 상보적인 염기 서열의 15개 인접 염기를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 키랄 비제어 키랄 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 dsRNAi 올리고뉴클레오티드를 제공하며, dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 염기 서열은 본원에 개시된 dsRNAi 서열 또는 이의 일부(예를 들어, 표 1A 또는 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D의 다양한 염기 서열(각각의 T는 독립적으로 U로 대체될 수 있고 그 반대도 가능함)이거나 이에 상보적인 염기 서열의 0~3개의 불일치를 갖는 15개 인접 염기를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 키랄 제어 키랄 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 dsRNAi 올리고뉴클레오티드를 제공하며, dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 염기 서열은 본원에 개시된 dsRNAi 서열 또는 이의 일부(예를 들어, 표 1A 또는 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D의 다양한 염기 서열(각각의 T는 독립적으로 U로 대체될 수 있고 그 반대도 가능함)이거나 이에 상보적인 염기 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 키랄 제어 키랄 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 dsRNAi 올리고뉴클레오티드를 제공하며, RNAi 올리고뉴클레오티드의 염기 서열은 본원에 개시된 dsRNAi 서열 또는 이의 일부(예를 들어, 표 1A 또는 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D의 다양한 염기 서열(각각의 T는 독립적으로 U로 대체될 수 있고 그 반대도 가능함)이거나 이에 상보적인 염기 서열이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 키랄 제어 키랄 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 dsRNAi 올리고뉴클레오티드를 제공하며, dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 염기 서열은 본원에 개시된 dsRNAi 서열 또는 이의 일부(예를 들어, 표 1A 또는 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D의 다양한 염기 서열(각각의 T는 독립적으로 U로 대체될 수 있고 그 반대도 가능함)이거나 이에 상보적인 염기 서열의 15개 인접 염기를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 키랄 제어 키랄 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 RNAi 올리고뉴클레오티드를 제공하며, RNAi 올리고뉴클레오티드의 염기 서열은 본원에 개시된 RNAi 서열 또는 이의 일부(예를 들어, 표 1A 또는 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D의 다양한 염기 서열(각각의 T는 독립적으로 U로 대체될 수 있고 그 반대도 가능함)이거나 이에 상보적인 염기 서열의 0~3개의 불일치를 갖는 15개 인접 염기를 포함한다.
특정 구현예에서, 동일한 ds 올리고뉴클레오티드 유형의 ds 올리고뉴클레오티드는 공통 백본 인 변형 패턴 및 공통 뉴클레오시드 변형 패턴을 갖는다. 특정 구현예에서, 동일한 ds 올리고뉴클레오티드 유형의 ds 올리고뉴클레오티드는 공통 당 변형 패턴을 갖는다. 특정 구현예에서, 동일한 ds 올리고뉴클레오티드 유형의 ds 올리고뉴클레오티드는 공통 염기 변형 패턴을 갖는다. 특정 구현예에서, 동일한 ds 올리고뉴클레오티드 유형의 ds 올리고뉴클레오티드는 공통 뉴클레오시드 변형 패턴을 갖는다. 특정 구현예에서, 동일한 ds 올리고뉴클레오티드 유형의 ds 올리고뉴클레오티드는 동일한 구성을 갖는다. 특정 구현예에서, 동일한 ds 올리고뉴클레오티드 유형의 ds 올리고뉴클레오티드는 동일하다. 특정 구현예에서, 동일한 ds 올리고뉴클레오티드 유형의 ds 올리고뉴클레오티드는 동일한 ds 올리고뉴클레오티드이다(당업자가 이해하는 바와 같이, 이러한 ds 올리고뉴클레오티드는 각각 독립적으로 ds 올리고뉴클레오티드의 다양한 형태 중 하나로 존재할 수 있고, ds 올리고뉴클레오티드와 동일하거나 상이한 형태일 수 있음). 특정 구현예에서, 동일한 ds 올리고뉴클레오티드 유형의 ds 올리고뉴클레오티드는 각각 독립적으로 동일한 ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 제약상 허용가능한 염이다.
특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드 조성물 내 복수의 ds 올리고뉴클레오티드 또는 특정 ds 올리고뉴클레오티드 유형의 ds 올리고뉴클레오티드는 sdRNAi 올리고뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 복수의 dsRNAi 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키랄 제어 dsRNAi 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공하며, ds 올리고뉴클레오티드는
1) 공통 염기 서열;
2) 공통 백본 연결 패턴; 및
3) 하나 이상의 키랄 뉴클레오티드간 연결(키랄 제어 뉴클레오티드간 연결)에서 동일한 연결 인 입체화학을 공유하고, 조성물은 공통 염기 서열 및 백본 연결 패턴을 공유하는 올리고뉴클레오티드의 실질적 라세미 제제에 비해 복수의 올리고뉴클레오티드가 풍부하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 특정 구현예에서, "하나 이상" 또는 "적어도 하나"는 1~50, 1~40, 1~30, 1~25, 1~20, 1~15, 1~10, 5~50, 5~40, 5~30, 5~25, 5~20, 5~15, 5~10, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상이다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 유형은 4) 추가 화학적 모이어티(존재하는 경우)에 의해 추가로 정의된다.
특정 구현예에서, 백분율은 적어도 약 10%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 약 20%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 약 30%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 약 40%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 약 50%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 약 60%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 약 70%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 약 75%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 약 80%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 약 85%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 약 90%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 약 91%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 약 92%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 약 93%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 약 94%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 약 95%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 약 96%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 약 97%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 약 98%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 약 99%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 (DS)nc를 초과하고, DS 및 nc는 각각 독립적으로 본 발명에 기재된 바와 같다.
특정 구현예에서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 동일한 구성을 공유한다. 특정 구현예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 동일하다(동일한 입체이성체). 특정 구현예에서, 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물, 예를 들어 키랄 제어 dsRNAi 올리고뉴클레오티드 조성물은 복수의 ds 올리고뉴클레오티드가 동일하고(동일한 입체이성체), 조성물이 임의의 다른 입체이성체를 함유하지 않는 입체순수 ds 올리고뉴클레오티드 조성물이다. 당업자는 공정, 선택성, 정제 등이 완결성을 달성하지 못할 수 있으므로 하나 이상의 다른 입체이성체가 불순물로서 존재할 수 있음을 이해할 것이다.
특정 구현예에서, 제공된 조성물은 표적 핵산(예를 들어, 전사체(예를 들어, 조성물의 올리고뉴클레오티드와 혼성화되는 pre-mRNA, 성숙 mRNA, 다른 유형의 RNA 등))과 접촉될 때, 표적 핵산 및/또는 이에 의해 암호화된 산물의 수준이 기준 조건에서 관찰되는 것에 비해 감소되는 것을 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 기준 조건은 조성물의 부재, 기준 조성물의 존재, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 기준 조건은 조성물의 부재이다. 특정 구현예에서, 기준 조건은 기준 조성물의 존재이다. 특정 구현예에서, 기준 조성물은 올리고뉴클레오티드가 표적 핵산과 혼성화되지 않는 조성물이다. 특정 구현예에서, 기준 조성물은 올리고뉴클레오티드가 표적 핵산에 충분히 상보적인 서열을 포함하지 않는 조성물이다. 특정 구현예에서, 제공된 조성물은 키랄 제어 올리고뉴클레오티드 조성물이고, 기준 조성물은 키랄 제어되지 않는다는 것을 제외하고는 동일한 비-키랄 제어 올리고뉴클레오티드 조성물(예를 들어, 키랄 제어 올리고뉴클레오티드 조성물 내 복수의 올리고뉴클레오티드와 동일한 구성의 올리고뉴클레오티드의 라세미 제제)이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 RNAi 넉다운을 유도할 수 있는 복수의 dsRNAi 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키랄 제어 dsRNAi 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공하며, 올리고뉴클레오티드는
1) 공통 염기 서열;
2) 공통 백본 연결 패턴; 및
3) 하나 이상(예를 들어, 1~50, 1~40, 1~30, 1~25, 1~20, 1~15, 1~10, 5~50, 5~40, 5~30, 5~25, 5~20, 5~15, 5~10, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상)의 키랄 뉴클레오티드간 연결(키랄 제어 뉴클레오티드간 연결)에서 동일한 연결 인 입체화학을 공유하고,
조성물은 공통 염기 서열 및 백본 연결 패턴을 공유하는 올리고뉴클레오티드의 실질적 라세미 제제에 비해 복수의 올리고뉴클레오티드가 풍부하고, ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 dsRNAi 넉다운 시스템에서 전사체와 접촉될 때, 전사체의 넉다운이 조성물의 부재, 기준 조성물의 존재, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기준 조건에서 관찰되는 것에 비해 개선되는 것을 특징으로 한다.
상기에 나타내고 당업계에서 이해되는 바와 같이, 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 염기 서열은 ds 올리고뉴클레오티드 내 뉴클레오시드 잔기의(예를 들어, 아데닌, 시토신, 구아노신, 티민, 및 우라실과 같은 표준 천연 발생 뉴클레오티드에 대하여, 당 및/또는 염기 구성성분의) 동일성 및/또는 변형 상태, 및/또는 이러한 잔기의 혼성화 특성(즉, 특정 상보적 잔기와 혼성화할 수 있는 능력)을 지칭할 수 있다.
본원에 나타낸 바와 같이, ds 올리고뉴클레오티드 구조적 요소(예를 들어, 당 변형, 백본 연결, 백본 키랄 중심, 백본 인 변형 등의 패턴) 및 이들의 조합은 놀랍게도 개선된 특성 및/또는 생체활성을 제공할 수 있다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 표적 유전자 또는 이의 유전자 생성물의 발현, 수준, 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 mRNA(pre-mRNA 또는 성숙 mRNA)를 절단하고/하거나 mRNA 스플라이싱을 변경하거나 방해함으로써, 표적 유전자 mRNA에의 어닐링 후 번역을 입체적으로 차단하여 표적 유전자 또는 이의 유전자 생성물의 발현, 수준, 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 dsRNAi 올리고뉴클레오티드 조성물은 표적 유전자 또는 이의 유전자 생성물의 발현, 수준, 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 dsRNAi 올리고뉴클레오티드 조성물은 표적 mRNA(pre-mRNA 또는 성숙 mRNA)를 절단하고/하거나 mRNA 스플라이싱을 변경하거나 방해함으로써, HTT mRNA에의 어닐링 후 번역을 입체적으로 차단하여 표적 유전자 또는 이의 유전자 생성물의 발현, 수준, 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 조성물, 예를 들어 dsdRNAi 올리고뉴클레오티드 조성물은 올리고뉴클레오티드 입체이성체가 아닌 조성물에서의 올리고뉴클레오티드가 상기 ds 올리고뉴클레오티드 입체이성체의 제조 공정에서, 일부 경우에는 특정 정제 절차 후에, 발생하는 불순물이라는 점에서 단일 ds 올리고뉴클레오티드 입체이성체의 실질적으로 순수한 제제이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 키랄 제어되고 특정 구현예에서는 입체순수한 ds 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공한다. 예를 들어 특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이, 제공된 조성물은 비무작위 또는 제어된 수준의 하나 이상의 개별 올리고뉴클레오티드 유형을 포함한다. 특정 구현예에서, 동일한 올리고뉴클레오티드 유형의 올리고뉴클레오티드는 동일하다.
3. 당
변형 당을 비롯한 다양한 당이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 올리고뉴클레오티드에 혼입되는 경우 개선된 특성 및/또는 활성을 제공할 수 있는 당 변형 및 이의 패턴(임의로 다른 구조적 요소(예를 들어, 뉴클레오티드간 연결 변형 및 이의 패턴, 이의 백본 키랄 중심 패턴 등)와 조합됨)을 제공한다.
가장 흔한 자연 발생적 뉴클레오시드는 핵염기 아데노신(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 또는 우라실(U)에 연결된 리보스 당(예를 들어, RNA에서) 또는 데옥시리보스 당(예를 들어, DNA에서)을 포함한다. 특정 구현예에서, 당, 예를 들어 (달리 언급하지 않는 한) 표 1의 많은 올리고뉴클레오티드에 있는 다양한 당은
Figure pct00395
의 구조를 갖는 천연 DNA 당(DNA 핵산 또는 올리고뉴클레오티드에서)이고, 핵염기는 1' 위치에 부착되고, 3' 및 5' 위치는 뉴클레오티드간 연결에 연결된다(당업자에 의해 이해되는 바와 같이, ds 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 있는 경우, 5' 위치는 5'-말단기(예를 들어, -OH)에 연결될 수 있고, ds 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 있는 경우, 3' 위치는 3'-말단기(예를 들어, -OH)에 연결될 수 있음). 특정 구현예에서, 당은
Figure pct00396
의 구조를 갖는 천연 RNA 당(RNA 핵산 또는 올리고뉴클레오티드에서)이고, 핵염기는 1' 위치에 부착되고, 3' 및 5' 위치는 뉴클레오티드간 연결에 연결된다(당업자에 의해 이해되는 바와 같이, ds 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 있는 경우, 5' 위치는 5'-말단기(예를 들어, -OH)에 연결될 수 있고, ds 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 있는 경우, 3' 위치는 3'-말단기(예를 들어, -OH)에 연결될 수 있음). 특정 구현예에서, 당은 천연 DNA 당 또는 천연 RNA 당이 아니라는 점에서 변형 당이다. 특히, 변형 당은 개선된 안정성을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 변형 당을 사용하여 하나 이상의 혼성화 특성을 변경 및/또는 최적화할 수 있다. 특정 구현예에서, 변형 당을 사용하여 표적 인식을 변경 및/또는 최적화할 수 있다. 특정 구현예에서, 변형 당을 사용하여 Tm을 최적화할 수 있다. 특정 구현예에서, 변형 당을 사용하여 올리고뉴클레오티드 활성을 개선시킬 수 있다.
당은 다양한 위치에서 뉴클레오티드간 연결에 결합될 수 있다. 비제한적인 예로서, 뉴클레오티드간 연결은 당의 2', 3', 4', 또는 5' 위치에 결합될 수 있다. 특정 구현예에서, 천연 핵산에서 가장 일반적인 바와 같이, 뉴클레오티드간 연결은 5' 위치에서 하나의 당과 연결되고, 3' 위치에서 다른 당과 연결된다.
특정 구현예에서, 당은 임의로 치환된 천연 DNA 또는 RNA 당이다. 특정 구현예에서, 당은 임의로 치환된
Figure pct00397
이다. 특정 구현예에서, 2' 위치는 임의로 치환된다. 특정 구현예에서, 당은
Figure pct00398
이다. 특정 구현예에서, 당은
Figure pct00399
또는
Figure pct00400
의 구조를 가지며, R1s, R2s, R3s, R4s, 및 R5s 각각은 독립적으로 -H, 적합한 치환기 또는 적합한 당 변형이다(예를 들어, US 9394333, US 9744183, US 9605019, US 9982257, US 20170037399, US 20180216108, US 20180216107, US 9598458, WO 2017/062862, WO 2018/067973, WO 2017/160741, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/098264, WO 2018/022473, WO 2018/223056, WO 2018/223073, WO 2018/223081, WO 2018/237194, WO 2019/032607, WO2019/032612, WO 2019/055951, 및/또는 WO 2019/075357에 기재된 것들, 이들 각각의 치환기, 당 변형, R1s, R2s, R3s, R4s, 및 R5s의 설명, 및 변형 당은 독립적으로 본원에 참조로 포함됨). 특정 구현예에서, 당은
Figure pct00401
의 구조를 갖는다. 특정 구현예에서, R4s는 -H이다. 특정 구현예에서, 당은
Figure pct00402
의 구조를 가지며, R2s는 -H, 할로겐, 또는 -OR이다(R은 임의로 치환된 C1-6 지방족임). 특정 구현예에서, R2s는 -H이다. 특정 구현예에서, R2s는 -F이다. 특정 구현예에서, R2s는 -OMe이다. 특정 구현예에서, R2s는 -OCH2CH2OMe이다.
특정 구현예에서, 당은
Figure pct00403
의 구조를 가지며, R2s와 R4s는 함께 -Ls-를 형성하고, Ls는 공유 결합 또는 임의로 치환된 2가 C1-6 지방족 또는 1~4개의 헤테로원자를 갖는 헤테로지방족이다. 특정 구현예에서, 각각의 헤테로원자는 독립적으로 질소, 산소, 또는 황으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, Ls는 임의로 치환된 C2-O-CH2-C4이다. 특정 구현예에서, Ls는 C2-O-CH2-C4이다. 특정 구현예에서, Ls는 C2-O-(R)-CH(CH2CH3)-C4이다. 특정 구현예에서, Ls는 C2-O-(S)-CH(CH2CH3)-C4이다.
특정 구현예에서, 변형 당은 -F; -CF3, -CN, -N3, -NO, -NO2, -OR', -SR', 또는 -N(R')2(각각의 R'은 독립적으로 임의로 치환된 C1-10 지방족임); -O-(C1-C10 알킬), -S-(C1-C10 알킬), -NH-(C1-C10 알킬), 또는 -N(C1-C10 알킬)2; -O-(C2-C10 알케닐), -S-(C2-C10 알케닐), -NH-(C2-C10 알케닐), 또는 -N(C2-C10 알케닐)2; -O-(C2-C10 알키닐), -S-(C2-C10 알키닐), -NH-(C2-C10 알키닐), 또는 -N(C2-C10 알키닐)2; 또는 -O--(C1-C10 알킬렌)-O--(C1-C10 알킬), -O-(C1-C10 알킬렌)-NH-(C1-C10 알킬) 또는 -O-(C1-C10 알킬렌)-NH(C1-C10 알킬)2, -NH-(C1-C10 알킬렌)-O-(C1-C10 알킬), 또는 -N(C1-C10 알킬)-(C1-C10 알킬렌)-O-(C1-C10 알킬)로부터 독립적으로 선택되는 2' 위치의 하나 이상의 치환기(일반적으로 하나의 치환기이고 종축 위치에 있는 경우가 많음)를 포함하고, 알킬, 알킬렌, 알케닐, 및 알키닐 각각은 독립적으로 그리고 임의로 치환된다. 특정 구현예에서, 치환기는 -O(CH2)nOCH3, -O(CH2)nNH2, MOE, DMAOE, 또는 DMAEOE이고, n은 1 내지 약 10이다.
특정 구현예에서, 리보스의 2'-OH는 -H, -F; -CF3, -CN, -N3, -NO, -NO2, -OR', -SR', 또는 -N(R')2(각각의 R'은 독립적으로 본 발명에 기재되어 있음); -O-(C1-C10 알킬), -S-(C1-C10 알킬), -NH-(C1-C10 알킬), 또는 -N(C1-C10 알킬)2; -O-(C2-C10 알케닐), -S-(C2-C10 알케닐), -NH-(C2-C10 알케닐), 또는 -N(C2-C10 알케닐)2; -O-(C2-C10 알키닐), -S-(C2-C10 알키닐), -NH-(C2-C10 알키닐), 또는 -N(C2-C10 알키닐)2; 또는 -O-(C1-C10 알킬렌)-O--(C1-C10 알킬), -O-(C1-C10 알킬렌)-NH-(C1-C10 알킬) 또는 -O-(C1-C10 알킬렌)-NH(C1-C10 알킬)2, -NH-(C1-C10 알킬렌)-O-(C1-C10 알킬), 또는 -N(C1-C10 알킬)-(C1-C10 알킬렌)-O-(C1-C10 알킬)로부터 선택되는 기로 대체되고, 알킬, 알킬렌, 알케닐, 및 알키닐 각각은 독립적으로 그리고 임의로 치환된다. 특정 구현예에서, 2'-OH는 -H로 대체된다(데옥시리보스). 특정 구현예에서, 2'-OH는 -F로 대체된다. 특정 구현예에서, 2'-OH는 -OR'로 대체된다. 특정 구현예에서, 2'-OH는 -OMe로 대체된다. 특정 구현예에서, 2'-OH는 -OCH2CH2OMe로 대체된다.
특정 구현예에서, 당 변형은 2'-변형이다. 일반적으로 사용되는 2'-변형은 2'-OR을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, R은 임의로 치환된 C1-6 지방족이다. 특정 구현예에서, 변형은 2'-OR이고, R은 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 특정 구현예에서, 변형은 2'-OMe이다. 특정 구현예에서, 변형은 2'-MOE이다. 특정 구현예에서, 2'-변형은 S-cEt이다. 특정 구현예에서, 변형 당은 LNA 당이다. 특정 구현예에서, 2'-변형은 -F이다.
특정 구현예에서, 당 변형은 당 모이어티를 다른 환형 또는 비환형 모이어티로 대체한다. 이러한 모이어티의 예는 당업계에 널리 알려져 있으며, 모르폴리노(임의로 포스포로디아미데이트 연결을 가짐), 글리콜 핵산 등에 사용되는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, ATXN3 올리고뉴클레오티드의 당의 하나 이상이 변형된다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 각각의 당은 독립적으로 변형된다. 특정 구현예에서, 변형 당은 2'-변형을 포함한다. 특정 구현예에서, 각각의 변형 당은 독립적으로 2'-변형을 포함한다. 특정 구현예에서, 2'-변형은 2'-OR이고, R은 임의로 치환된 C1--6 지방족이다. 특정 구현예에서, 2'-변형은 2'-OMe이다. 특정 구현예에서, 2'-변형은 2'-MOE이다. 특정 구현예에서, 2'-변형은 LNA 당 변형이다. 특정 구현예에서, 2'-변형은 2'-F이다. 특정 구현예에서, 각각의 당 변형은 독립적으로 2'-변형이다. 특정 구현예에서, 각각의 당 변형은 독립적으로 2'-OR이다. 특정 구현예에서, 각각의 당 변형은 독립적으로 2'-OR이고, R은 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 특정 구현예에서, 각각의 당 변형은 2'-OMe이다. 특정 구현예에서, 각각의 당 변형은 2'-MOE이다. 특정 구현예에서, 각각의 당 변형은 독립적으로 2'-OMe 또는 2'-MOE이다. 특정 구현예에서, 각각의 당 변형은 독립적으로 2'-OMe, 2'-MOE, 또는 LNA 당이다.
당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 당, 핵염기, 뉴클레오티드간 연결 등의 변형은 올리고뉴클레오티드에서 조합되어 사용될 수 있고 종종 조합되어 사용된다(예를 들어, 표 1의 다양한 올리고뉴클레오티드 참조). 예를 들어, 당 변형과 핵염기 변형의 조합은 2'-F(당) 5-메틸(핵염기) 변형 뉴클레오시드이다. 특정 구현예에서, 조합은 리보실 산소 원자의 S로의 대체 및 2'-위치에서의 치환이다.
특정 구현예에서, 당은 US 9394333, US 9744183, US 9605019, US 9598458, US 9982257, US 10160969, US 10479995, US 2020/0056173, US 2018/0216107, US 2019/0127733, US 10450568, US 2019/0077817, US 2019/0249173, US 2019/0375774, WO 2018/223056, WO 2018/223073, WO 2018/223081, WO 2018/237194, WO 2019/032607, WO 2019/055951, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, 및/또는 WO 2019/032612에 기재된 것이고, 각각의 당은 독립적으로 본원에 참조로 포함된다.
올리고뉴클레오티드 또는 이의 유사체를 제조하는 데 유용한 다양한 추가의 당이 당업계에 알려져 있으며 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
4. 핵염기
제공된 ds 올리고뉴클레오티드에서 다양한 핵염기가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 핵염기는 천연 핵염기이며, 가장 일반적으로 발생하는 것은 A, T, C, G, 및 U이다. 특정 구현예에서, 핵염기는 A, T, C, G, 또는 U가 아니라는 점에서 변형 핵염기이다. 특정 구현예에서, 핵염기는 임의로 치환된 A, T, C, G, 또는 U, 또는 A, T, C, G, 또는 U의 치환된 호변이성체이다. 특정 구현예에서, 핵염기는 임의로 치환된 A, T, C, G, 또는 U, 예를 들어 5mC, 5-하이드록시메틸 C 등이다. 특정 구현예에서, 핵염기는 알킬-치환된 A, T, C, G, 또는 U이다. 특정 구현예에서, 핵염기는 A이다. 특정 구현예에서, 핵염기는 T이다. 특정 구현예에서, 핵염기는 C이다. 특정 구현예에서, 핵염기는 G이다. 특정 구현예에서, 핵염기는 U이다. 특정 구현예에서, 핵염기는 5mC이다. 특정 구현예에서, 핵염기는 치환된 A, T, C, G, 또는 U이다. 특정 구현예에서, 핵염기는 A, T, C, G, 또는 U의 치환된 호변이성체이다. 특정 구현예에서, 치환은 핵염기 내의 특정 작용기를 보호하여 올리고뉴클레오티드 합성 중에 바람직하지 않은 반응을 최소화한다. 올리고뉴클레오티드 합성에서 핵염기 보호에 적합한 기술은 당업계에 널리 알려져 있으며 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 변형 핵염기는 ds 올리고뉴클레오티드의 특성 및/또는 활성을 개선시킨다. 예를 들어 많은 경우에, C 대신 5mC를 사용하여 특정의 바람직하지 않은 생물학적 효과(예를 들어, 면역 반응)를 조절할 수 있다. 특정 구현예에서, 서열 동일성을 결정할 때, 동일한 수소 결합 패턴을 갖는 치환된 핵염기는 비치환 핵염기와 동일하게 처리되며, 예를 들어 5mC는 C와 동일하게 처리될 수 있다[예를 들어, C 대신 5mC를 갖는 ds 올리고뉴클레오티드(예를 들어, AT5mCG)는 상응하는 위치(들)에 C를 갖는 ds 올리고뉴클레오티드(예를 들어, ATCG)와 동일한 염기 서열을 갖는 것으로 간주된다].
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 A, T, C, G, 또는 U를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 임의로 치환된 A, T, C, G, 또는 U를 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 5-메틸시티딘, 5-하이드록시메틸시티딘, 5-포르밀시토신, 또는 5-카복실시토신을 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 5-메틸시티딘을 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 각각의 핵염기는 임의로 치환된 A, T, C, G, 및 U, 및 임의로 치환된 A, T, C, G, 및 U의 호변이성체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 각각의 핵염기는 임의로 보호된 A, T, C, G, 및 U이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 각각의 핵염기는 임의로 치환된 A, T, C, G, 또는 U이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 각각의 핵염기는 A, T, C, G, Uㄹ 및 5mC로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 핵염기는 임의로 치환된 2AP 또는 DAP이다. 특정 구현예에서, 핵염기는 임의로 치환된 2AP이다. 특정 구현예에서, 핵염기는 임의로 치환된 DAP이다. 특정 구현예에서, 핵염기는 2AP이다. 특정 구현예에서, 핵염기는 DAP이다.
특정 구현예에서, 핵염기는 천연 핵염기이거나 천연 핵염기에서 유래된 변형 핵염기이다. 예는 우라실, 티민, 아데닌, 시토신, 및 구아닌(임의로 각각의 아미노기는 아실 보호기로 보호됨), 2-플루오로우라실, 2-플루오로시토신, 5-브로모우라실, 5-요오도우라실, 2,6-디아미노퓨린, 아자시토신, 피리미딘 유사체, 예컨대 슈도이소시토신 및 슈도우라실, 및 기타 변형 핵염기, 예컨대 8-치환 퓨린, 잔틴, 또는 하이포잔틴(후자의 두 가지는 자연 분해 산물임)을 포함한다. 변형 핵염기의 특정 예는 문헌[Chiu and Rana, RNA, 2003, 9, 1034-1048, Limbach et al. Nucleic Acids Research, 1994, 22, 2183-2196 및 Revankar and Rao, Comprehensive Natural Products Chemistry, vol. 7, 313]에 개시되어 있다. 특정 구현예에서, 변형 핵염기는 치환 우라실, 티민, 아데닌, 시토신, 또는 구아닌이다. 특정 구현예에서, 변형 핵염기는, 예를 들어 수소 결합 및/또는 염기쌍 형성 측면에서 우라실, 티민, 아데닌, 시토신, 또는 구아닌의 작용성 대체물이다. 특정 구현예에서, 핵염기는 임의로 치환된 우라실, 티민, 아데닌, 시토신, 5-메틸시토신, 또는 구아닌이다. 특정 구현예에서, 핵염기는 우라실, 티민, 아데닌, 시토신, 5-메틸시토신, 또는 구아닌이다.
특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 5-메틸시토신을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 염기 서열이 본원(예를 들어, 표 1A 또는 표 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D)에 개시된 ds 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 각각의 T는 독립적으로 U로 대체될 수 있고 그 반대도 가능하고, 각각의 시토신은 임의로 그리고 독립적으로 5-메틸시토신으로 대체되거나 그 반대도 가능하다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 특정 구현예에서, 5mC는 올리고뉴클레오티드의 염기 서열과 관련하여 C로 처리될 수 있다(이러한 올리고뉴클레오티드는 C 위치에 핵염기 변형을 포함한다)(예를 들어, 표 1A 또는 표 1B, 또는 표 1C 또는 표 1D의 다양한 올리고뉴클레오티드 참조). 올리고뉴클레오티드의 설명에서, 일반적으로 달리 언급되지 않는 한, 핵염기, 당, 및 뉴클레오티드간 연결은 변형되지 않은 것이다.
특정 구현예에서, 변형 염기는 임의로 치환된 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 또는 우라실, 또는 이의 호변이성체이다. 특정 구현예에서, 변형 핵염기는 다음과 같은 하나 이상의 변형에 의해 변형된 변형 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 또는 우라실이다:
1) 핵염기는 아실, 할로겐, 아미노, 아지드, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 헤테로시클릴, 헤테로아릴, 카복실, 하이드록실, 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 치환 실릴, 및 이들의 조합으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 임의로 치환된 기로 변형됨;
2) 핵염기의 하나 이상의 원자는 탄소, 질소, 및 황으로부터 선택되는 상이한 원자로 독립적으로 대체됨;
3) 핵염기에서의 하나 이상의 이중결합은 독립적으로 수소화됨; 또는
4) 하나 이상의 아릴 또는 헤테로아릴 고리는 독립적으로 핵염기 내로 삽입됨.
특정 구현예에서, 변형 핵염기는 당업계(예를 들어, WO2017/210647)에 알려진 변형 핵염기이다. 특정 구현예에서, 변형 핵염기는 하나 이상의 아릴 및/또는 헤테로아릴 고리, 예컨대 페닐 고리가 부가된 확장된 크기의 핵염기이다.
특정 구현예에서, 변형 핵염기는 5-치환 피리미딘, 6-아자피리미딘, 알킬 또는 알키닐 치환 피리미딘, 알킬 치환 퓨린, 및 N-2, N-6 및 O-6 치환 퓨린으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 변형 핵염기는 2-아미노프로필아데닌, 5-하이드록시메틸 시토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 6-N-메틸구아닌, 6-N-메틸아데닌, 2-프로필아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-프로피닐(-C≡C-CH 3 ) 우라실, 5-프로피닐시토신, 6-아조우라실, 6-아조시토신, 6-아조티민, 5-리보실우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실, 8-아자 및 기타 8-치환 퓨린, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸, 5-할로우라실, 및 5-할로시토신, 7-메틸구아닌, 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 3-데아자아데닌, 6-N- 벤조일아데닌, 2-N-이소부티릴구아닌, 4-N-벤조일시토신, 4-N-벤조일우라실, 5-메틸 4-N- 벤조일시토신, 5-메틸 4-N-벤조일우라실, 범용 염기, 소수성 염기, 무차별 염기, 크기-확장된 염기, 및 플루오르화 염기로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 변형 핵염기는 삼환 피리미딘, 예컨대 1,3-디아자페녹사진-2-온, 1,3-디아자페노티아진-2-온, 또는 9-(2-아미노에톡시)-1,3-디아자페녹사진-2-온(G-clamp)이다. 특정 구현예에서, 변형 핵염기는 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 복소환으로 대체된 것, 예를 들어 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘, 또는 2-피리돈이다.
특정 구현예에서, 변형 핵염기는 치환된다. 특정 구현예에서, 변형 핵염기는 예를 들어, 헤테로원자, 알킬기, 또는 연결 모이어티(형광 모이어티, 비오틴 또는 아비딘 모이어티, 또는 다른 단백질 또는 펩티드에 연결됨)를 함유하도록 치환된다. 특정 구현예에서, 변형 핵염기는 가장 고전적인 의미에서는 핵염기가 아니지만 핵염기와 유사하게 기능하는 "범용 염기"이다. 범용 염기의 하나의 예로는 3-니트로피롤이 있다.
특정 구현예에서, 제공된 기술에 사용될 수 있는 뉴클레오시드는 변형 핵염기 및/또는 변형 당을 포함한다(예를 들어, 4-아세틸시티딘; 5-(카복시하이드록실메틸)우리딘; 2'-O-메틸시티딘; 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘; 5-카복시메틸아미노메틸우리딘; 디하이드로우리딘; 2'-O-메틸슈도우리딘; 베타,D-갈락토실큐에오신; 2'-O-메틸구아노신; N6-이소펜테닐아데노신; 1-메틸아데노신; 1-메틸슈도우리딘; 1-메틸구아노신; 1-메틸이노신; 2,2-디메틸구아노신; 2-메틸아데노신; 2-메틸구아노신; N7-메틸구아노신; 3-메틸-시티딘; 5-메틸시티딘; 5-하이드록시메틸시티딘; 5-포르밀시토신; 5-카복실시토신; N6-메틸아데노신; 7-메틸구아노신; 5-메틸아미노에틸우리딘; 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘; 베타,D-만노실큐에오신; 5-메톡시카보닐메틸우리딘; 5-메톡시우리딘; 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신; N-((9-베타,D-리보푸라노실-2-메틸티오퓨린-6-일)카바모일)트레오닌; N-((9-베타,D-리보푸라노실퓨린-6-일)-N-메틸카바모일)트레오닌; 우리딘-5-옥시아세트산 메틸에스테르; 우리딘-5-옥시아세트산 (v); 슈도우리딘; 큐에오신; 2-티오시티딘; 5-메틸-2-티오우리딘; 2-티오우리딘; 4-티오우리딘; 5-메틸우리딘; 2'-O-메틸-5-메틸우리딘; 및 2'-O-메틸우리딘). 특정 구현예에서, 핵염기 예를 들어 변형 핵염기는 예를 들어, 항체, 항체 단편, 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 수용체 리간드, 또는 킬레이팅 모이어티와 같은 하나 이상의 생체분자 결합 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 핵염기는 5-브로모우라실, 5-요오도우라실, 또는 2,6-디아미노퓨린이다. 특정 구현예에서, 핵염기는 형광 또는 생체분자 결합 모이어티에 의한 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 치환기는 형광 모이어티이다.
특정 구현예에서, 치환기는 비오틴 또는 아비딘이다.
특정 구현예에서, 핵염기는 US 9394333, US 9744183, US 9605019, US 9598458, US 9982257, US 10160969, US 10479995, US 2020/0056173, US 2018/0216107, US 2019/0127733, US 10450568, US 2019/0077817, US 2019/0249173, US 2019/0375774, WO 2018/223056, WO 2018/223073, WO 2018/223081, WO 2018/237194, WO 2019/032607, WO 2019/055951, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, 및/또는 WO 2019/032612에 기재된 것이고, 각각의 핵염기는 독립적으로 본원에 참조로 포함된다.
5. 추가 화학적 모이어티
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 추가 화학적 모이어티를 포함한다. 다양한 추가 화학적 모이어티, 예를 들어 표적화 모이어티, 탄수화물 모이어티, 지질 모이어티 등이 당업계에 알려져 있으며, 제공된 올리고뉴클레오티드의 특성 및/또는 활성, 예를 들어 안정성, 반감기, 활성, 전달, 약력학적 특성, 약동학적 특성 등을 조절하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 특정 추가 화학적 모이어티는 중추 신경계의 세포를 포함하는(이에 한정되지 않음) 원하는 세포, 조직 및/또는 기관으로의 올리고뉴클레오티드의 전달을 촉진한다. 특정 구현예에서, 특정 추가 화학적 모이어티는 올리고뉴클레오티드의 내재화를 촉진한다. 특정 구현예에서, 특정 추가 화학적 모이어티는 올리고뉴클레오티드 안정성을 증가시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명은 다양한 추가 화학적 모이어티를 올리고뉴클레오티드에 혼입시키기 위한 기술을 제공한다.
특정 구현예에서 추가 화학적 모이어티를 포함하는 ds 올리고뉴클레오티드는 기준 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 추가 화학적 모이어티를 갖지 않지만 그 외에는 동일한 기준 올리고뉴클레오티드에 비해 증가된 조직으로의 전달 및/또는 조직에서의 활성을 보여준다.
특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티의 비제한적인 예는 올리고뉴클레오티드에 혼입될 때 하나 이상의 특성을 개선시킬 수 있는 탄수화물 모이어티, 표적화 모이어티 등을 포함한다. 특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는 글루코스, GluNAc(N-아세틸 아민 글루코사민), 및 아니스아미드 모이어티로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 2개 이상의 추가 화학적 모이어티를 포함할 수 있고,추가 화학적 모이어티는 동일 카테고리의 것(예를 들어, 탄수화물 모이어티, 당 모이어티, 표적화 모이어티 등)이거나 동일 카테고리의 것이 아니다.
특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는 표적화 모이어티이다. 특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는 탄수화물 모이어티이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는 지질 모이어티이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는 예를 들어 세포 수용체, 예컨대 시그마 수용체, 아시알로당단백질 수용체 등에 대한 리간드 모이어티이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 리간드 모이어티는 시그마 수용체에 대한 리간드 모이어티일 수 있는 아니스아미드 모이어티이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 리간드 모이어티는 아시알로당단백질 수용체에 대한 리간드 모이어티일 수 있는 GalNAc 모이어티이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는 간으로의 전달을 촉진한다.
특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 링커 및 추가 화학적 모이어티(예를 들어, 표적화 모이어티)를 포함할 수 있고/있거나, 키랄 제어되거나 키랄 제어되지 않을 수 있고/있거나, 본원에 기재된 바와 같은 염기 서열 및/또는 하나 이상의 변형 및/또는 포맷을 가질 수 있다.
당업계에 알려진 많은 것을 비롯한, 다양한 링커, 탄수화물 모이어티 및 표적화 모이어티가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 탄수화물 모이어티는 표적화 모이어티이다. 특정 구현예에서, 표적화 모이어티는 탄수화물 모이어티이다.
특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 전달에 적합한 추가 화학적 모이어티, 예를 들어 글루코스, GluNAc(N-아세틸 아민 글루코사민), 아니사미드, 또는 다음으로부터 선택되는 구조를 포함한다:
Figure pct00404
,
Figure pct00405
,
Figure pct00406
,
Figure pct00407
,
Figure pct00408
,
Figure pct00409
,
Figure pct00410
,
Figure pct00411
,
Figure pct00412
, 및
Figure pct00413
. 특정 구현예에서, n은 1이다. 특정 구현예에서, n은 2이다. 특정 구현예에서, n은 3이다. 특정 구현예에서, n은 4이다. 특정 구현예에서, n은 5이다. 특정 구현예에서, n은 6이다. 특정 구현예에서, n은 7이다. 특정 구현예에서, n은 8이다.
특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는 다양한 ds 올리고뉴클레오티드에 혼입된 다양한 추가 화학적 모이어티의 예를 포함하여 실시예에 기재된 것 중 임의의 것이다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드에 접합된 추가 화학적 모이어티는 중추 신경계의 세포에 ds 올리고뉴클레오티드를 표적화할 수 있다.
특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는 세포 수용체 리간드를 포함하거나 세포 수용체 리간드이다. 특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는 단백질 바인더를 포함하거나 단백질 바인더이고, 예를 들어 세포 표면 단백질에 결합한다. 특히, 이러한 모이어티는 상응하는 수용체 또는 단백질을 발현하는 세포로의 ds 올리고뉴클레오티드의 표적화된 전달에 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드의 추가 화학적 모이어티는 아니스아미드 또는 이의 유도체 또는 유사체를 포함하고, ds 올리고뉴클레오티드를 시그마 1 수용체와 같은 특정 수용체를 발현하는 세포에 표적화할 수 있다.
특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 표적을 발현하는 신체 세포 및/또는 조직에 투여하기 위해 제형화된다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드에 접합된 추가 화학적 모이어티는 올리고뉴클레오티드를 세포에 표적화할 수 있다.
특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는 임의로 치환된 페닐,
Figure pct00414
,
Figure pct00415
,
Figure pct00416
,
Figure pct00417
, 및
Figure pct00418
로부터 선택되고, n'은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고, 각각의 다른 변수는 본 발명에 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, Rs는 F이다. 특정 구현예에서, Rs는 OMe이다. 특정 구현예에서, Rs는 OH이다. 특정 구현예에서, Rs는 NHAc이다. 특정 구현예에서, Rs는 NHCOCF3이다. 특정 구현예에서, R'은 H이다. 특정 구현예에서, R은 H이다. 특정 구현예에서, R2s는 NHAc이고, R5s는 OH이다. 특정 구현예에서, R2s는 p-아니소일이고, R5s는 OH이다. 특정 구현예에서, R2s는 NHAc이고, R5s는 p-아니소일이다. 특정 구현예에서, R2s는 OH이고, R5s는 p-아니소일이다. 특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는
Figure pct00419
,
Figure pct00420
,
Figure pct00421
,
Figure pct00422
,
Figure pct00423
,
Figure pct00424
,
Figure pct00425
,
Figure pct00426
,
Figure pct00427
,
Figure pct00428
,
Figure pct00429
,
Figure pct00430
,
Figure pct00431
,
Figure pct00432
및
Figure pct00433
로부터 선택된다. 특정 구현예에서, n'은 1이다. 특정 구현예에서, n'은 0이다. 특정 구현예에서, n''은 1이다. 특정 구현예에서, n''은 2이다.
특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는 아시알로당단백질 수용체(ASGPR) 리간드이거나 이를 포함한다.
임의의 특정 이론에 구애되고자 함이 없이, 본 발명은 ASGPR1이 또한 마우스의 해마 영역 및/또는 소뇌 Purkinje 세포층에서 발현되는 것으로 보고되었음에 주목한다. http://mouse.brain-map.org/experiment/show/2048
다양한 다른 ASGPR 리간드가 당업계에 알려져 있고 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, ASGPR 리간드는 탄수화물이다. 특정 구현예에서, ASGPR 리간드는 GalNac 또는 이의 유도체 또는 유사체이다. 특정 구현예에서, ASGPR 리간드는 문헌[Sanhueza et al. J. Am. Chem. Soc., 2017, 139 (9), pp 3528-3536]에 기재된 것이다. 특정 구현예에서, ASGPR 리간드는 문헌[Mamidyala et al. J. Am. Chem. Soc., 2012, 134, pp 1978-1981]에 기재된 것이다. 특정 구현예에서, ASGPR 리간드는 US 20160207953에 기재된 것이다. 특정 구현예에서, ASGPR 리간드는 예를 들어 US 20160207953에 개시된 치환된-6,8-디옥사바이시클로[3.2.1]옥탄-2,3-디올 유도체이다. 특정 구현예에서, ASGPR 리간드는 예를 들어 US 20150329555에 기재된 것이다. 특정 구현예에서, ASGPR 리간드는 예를 들어 US 20150329555에 개시된 치환된-6,8-디옥사바이시클로[3.2.1]옥탄-2,3-디올 유도체이다. 특정 구현예에서, ASGPR 리간드는 US 8877917, US 20160376585, US 10086081, 또는 US 8106022에 기재된 것이다. 이들 문헌에 기재된 ASGPR 리간드는 본원에 참조로 포함된다. 당업자는 ASGPR에 대한 화학적 모이어티의 결합을 평가하기 위해 이들 문헌에 기재된 것을 포함하여 다양한 기술이 당업계에 알려져 있고 본 발명에 따라 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 ASGPR 리간드에 접합된다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 ASGPR 리간드를 포함한다. 특정 구현예에서, ASGPR 리간드를 포함하는 추가 화학적 모이어티는
Figure pct00434
,
Figure pct00435
,
Figure pct00436
,
Figure pct00437
,
Figure pct00438
,
Figure pct00439
,
Figure pct00440
,
Figure pct00441
,
Figure pct00442
, 또는
Figure pct00443
이고, 각각의 변수는 독립적으로 본 발명에 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, R은 -H이다. 특정 구현예에서, R'은 -C(O)R이다.
특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는
Figure pct00444
이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는
Figure pct00445
이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는
Figure pct00446
이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는
Figure pct00447
이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는 임의로 치환된
Figure pct00448
이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는
Figure pct00449
이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는
Figure pct00450
이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는
Figure pct00451
이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는
Figure pct00452
이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는
Figure pct00453
이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는 예를 들어 올리고뉴클레오티드 표적 세포에 결합할 수 있는 하나 이상의 모이어티를 포함한다. 예를 들어 특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는 하나 이상의 단백질 리간드 모이어티를 포함하고, 예를 들어 특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는 다중 모이어티(이들 각각은 독립적으로 ASGPR 리간드임)를 포함한다. 특정 구현예에서, Mod 001, Mod083, Mod071, Mod153, 및 Mod155에서와 같이, 추가 화학적 모이어티는 3개의 이러한 리간드를 포함한다.
Mod001:
Figure pct00454
Mod083:
Figure pct00455
Mod071:
Figure pct00456
Mod077:
Figure pct00457
Mod102:
Figure pct00458
Mod105:
Figure pct00459
Mod152(특정 구현예에서, -C(O)-는 Mod153과 같은 링커의 -NH-에 연결):
Figure pct00460
;
Mod153:
Figure pct00461
Mod154(특정 구현예에서, -C(O)-는 Mod155와 같은 링커의 -NH-에 연결):
Figure pct00462
;
Mod155:
Figure pct00463
.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는
Figure pct00464
를 포함하고, 각각의 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 각각의 -OR'은 -OAc이고, -N(R')2는 -NHAc이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는
Figure pct00465
를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 R'은 -H이다. 일부 구현예에서, 각각의 -OR'은 -OH이고, 각각의 -N(R')2는 -NHC(O)R이다. 일부 구현예에서, 각각의 -OR'은 -OH이고, 각각의 -N(R')2는 -NHAc이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는
Figure pct00466
(L025)를 포함한다. 일부 구현예에서, -CH2- 연결 부위는 당에서 C5 연결 부위로서 사용된다. 일부 구현예에서, 고리 상의 연결 부위는 당에서 C3 연결 부위로서 사용된다. 이러한 모이어티는
Figure pct00467
와 같은 포스포아미다이트, 예를 들어
Figure pct00468
를 사용하여 도입될 수 있다(당업자는 하나 이상의 다른 기, 예컨대 -OH, -NH2-, -N(i-Pr)2, -OCH2CH2CN 등에 대한 보호기가 대안적으로 사용될 수 있고, 때로는 올리고뉴클레오티드 탈보호 및/또는 절단 단계 중에, 다양한 적합한 조건에서 제거될 수 있음을 이해한다). 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 2개, 3개 이상(예를 들어, 3개 이하)의
Figure pct00469
를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 2개, 3개 이상(예를 들어, 3개 이하)의
Figure pct00470
를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 모이어티의 카피는 본원에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드간 연결, 예를 들어 천연 포스페이트 연결에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 5'-말단에 있을 때, -CH2- 연결 부위는 -OH에 결합된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는
Figure pct00471
를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는
Figure pct00472
를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 -OR'은 -OAc이고, -N(R')2는 -NHAc이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는
Figure pct00473
를 포함한다. 특히,
Figure pct00474
는 비견되고/되거나 더 우수한 활성 및/또는 특성을 갖는
Figure pct00475
를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이는 동일한 수의
Figure pct00476
에 대해(예를 들어, Mod001과 비교했을 때) 개선된 제조 효율 및/또는 더 낮은 비용을 제공한다.
특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는 본원(예를 들어, 표 1)에 기재된 Mod 기이다.
특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는 Mod001이다. 특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는 Mod083이다. 특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티, 예를 들어 Mod 기는 ds 올리고뉴클레오티드의 나머지에 직접(예를 들어, 링커 없이) 접합된다. 특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는 ds 올리고뉴클레오티드의 나머지에 링커를 통해 접합된다. 특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티, 예를 들어 Mod 기는 ds 올리고뉴클레오티드의 핵염기, 당, 및/또는 뉴클레오티드간 연결에 직접 및/또는 링커를 통해 연결될 수 있다. 특정 구현예에서, Mod 기는 당에 직접 또는 링커를 통해 연결된다. 특정 구현예에서, Mod 기는 5'-말단 당에 직접 또는 링커를 통해 연결된다. 특정 구현예에서, Mod 기는 5' 탄소를 통해 5' 말단 당에 직접 또는 링커를 통해 연결된다. 예를 들어, 표 1A 및 표 1B 또는 표 1C 또는 표 1D의 다양한 ds 올리고뉴클레오티드 참조. 특정 구현예에서, Mod 기는 3'-말단 당에 직접 또는 링커를 통해 연결된다. 특정 구현예에서, Mod 기는 3' 탄소를 통해 3' 말단 당에 직접 또는 링커를 통해 연결된다. 특정 구현예에서, Mod 기는 핵염기에 직접 또는 링커를 통해 연결된다. 특정 구현예에서, Mod 기는 뉴클레오티드간 연결에 직접 또는 링커를 통해 연결된다. 특정 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오티드는 L001을 통해 올리고뉴클레오티드 사슬의 5'-말단에 연결된 Mod001을 포함한다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 추가 화학적 모이어티는 (예를 들어, 당, 염기, 뉴클레오티드간 연결 등의) 다양한 위치, 예를 들어 5'-말단, 3'-말단, 또는 중간 위치에서 ds 올리고뉴클레오티드 사슬에 연결될 수 있다. 특정 구현예에서, 이는 5'-말단에 연결된다. 특정 구현예에서, 이는 3'-말단에 연결된다. 특정 구현예에서, 이는 중간에서 뉴클레오티드에 연결된다.
Mod012, Mod039, Mod062, Mod085, Mod086, 및 Mod094를 포함하는(이에 한정되지 않음) 특정 추가의 화학적 모이어티(예를 들어, 지질 모이어티, 표적화 모이어티, 탄수화물 모이어티), 및 추가 화학적 모이어티를 ds 올리고뉴클레오티드 사슬에 연결하기 위한 다양한 링커(L001, L003, L004, L008, L009, 및 L010을 포함하지만, 이에 한정되지 않음)는 WO 2017/062862, WO 2018/067973, WO 2017/160741, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/098264, WO 2018/022473, WO 2018/223056, WO 2018/223073, WO 2018/223081, WO 2018/237194, WO 2019/032607, WO2019032612, WO 2019/055951, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, 및/또는 WO 2019/032612에 기재되어 있으며, 각각의 추가 화학적 모이어티 및 링커는 독립적으로 본원에 참조로 포함되고, 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는 디곡시제닌 또는 비오틴 또는 이의 유도체이다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 링커, 예를 들어 L001 L004, L008, 및/또는 추가 화학적 모이어티, 예를 들어 Mod012, Mod039, Mod062, Mod085, Mod086, 또는 Mod094를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커, 예를 들어 L001, L003, L004, L008, L009, L110 등은 Mod, 예를 들어 Mod012, Mod039, Mod062, Mod085, Mod086, Mod094, Mod152, Mod153, Mod154, Mod155 등에 연결된다. L001: -CH2- 연결 부위에서 나타낸 바와 같이, 존재하는 경우 -NH-를 통해 Mod에 연결되고, 포스페이트 연결(염 형태로 존재할 수 있으며 O 또는 PO로 표시될 수 있는 -O-P(O)(OH)-O-) 또는 포스포로티오에이트 연결(염 형태로 존재할 수 있으며, 포스포로티오에이트가 키랄 제어되지 않는 경우 *로 표시될 수 있거나; 또는 포스포로티오에이트가 키랄 제어되고 Sp 배열을 갖는 경우 *S, S, 또는 Sp로 표시될 수 있거나, 또는 포스포로티오에이트가 키랄 제어되고 Rp 배열을 갖는 경우 *R, R, 또는 Rp로 표시될 수 있는 -O-P(O)(SH)-O-)을 통해 ds 올리고뉴클레오티드 사슬의 5'-말단 또는 3'-말단에 연결되는 -NH-(CH2)6- 링커(C6 링커, C6 아민 링커 또는 C6 아미노 링커로도 알려짐). Mod가 존재하지 않는 경우, L001은 -NH-를 통해 -H에 연결됨;
L003:
Figure pct00477
링커. 특정 구현예에서, 이는 존재하는 경우 아미노기를 통해 Mod(Mod가 없는 경우, -H)에 연결되고, 예를 들어 연결(예를 들어, 포스페이트 연결(O 또는 PO) 또는 포스포로티오에이트 연결(키랄 제어되지 않거나 키랄 제어될 수 있음(Sp 또는 Rp)))을 통해 올리고뉴클레오티드 사슬의 5'-말단 또는 3'-말단에 연결됨; L004: -NH(CH2)4CH(CH2OH)CH2-의 구조를 갖는 링커(여기서, -NH-는 Mod(-C(O)-를 통해) 또는 -H에 연결되고, -CH2- 연결 부위는 연결, 예를 들어 포스포디에스테르(염 형태로 존재할 수 있으며 O 또는 PO로 표시될 수 있는 -O-P(O)(OH)-O-), 포스포로티오에이트(염 형태로 존재할 수 있으며, 포스포로티오에이트가 키랄 제어되지 않는 경우 *로 표시될 수 있거나; 또는 포스포로티오에이트가 키랄 제어되고 Sp 배열을 갖는 경우 *S, S, 또는 Sp로 표시될 수 있거나, 또는 포스포로티오에이트가 키랄 제어되고 Rp 배열을 갖는 경우 *R, R, 또는 Rp로 표시될 수 있는 -O-P(O)(SH)-O-), 또는 포스포로디티오에이트(염 형태로 존재할 수 있으며, PS2 또는 D로 표시될 수 있는 -O-P(S)(SH)-O-) 연결을 통해 올리고뉴클레오티드 사슬(예를 들어, 3'-말단)에 연결됨). 예를 들어, L004 바로 앞의 별표(예를 들어, *L004)는 연결이 포스포로티오에이트 연결임을 나타내고, L004 바로 앞의 별표의 부재는 연결이 포스포디에스테르 연결임을 나타낸다. 예를 들어, ...mAL004로 끝나는 올리고뉴클레오티드에서, 링커 L004는 (-CH2- 부위를 통해) 3'-말단 당(2'-OMe 변형되고 핵염기 A에 연결됨)의 3' 위치에 포스포디에스테르 연결을 통해 연결되고, L004 링커는 -NH-를 통해 -H에 연결된다. 이와 유사하게, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드에서, L004 링커는 (-CH2- 부위를 통해) 3'-말단 당의 3' 위치에 포스포디에스테르 연결을 통해 연결되고, L004는 -NH-를 통해 예를 들어 Mod012, Mod085, Mod086 등에 연결됨; L008: -C(O)-(CH2)9-의 구조를 갖는 링커(여기서, -C(O)-는 Mod(-NH-를 통해) 또는 -OH(Mod가 표시되지 않은 경우)에 연결되며, -CH2- 연결 부위는 연결, 예를 들어 포스포디에스테르(염 형태로 존재할 수 있으며 O 또는 PO로 표시될 수 있는 -O-P(O)(OH)-O-), 포스포로티오에이트(염 형태로 존재할 수 있으며, 포스포로티오에이트가 키랄 제어되지 않는 경우 *로 표시될 수 있거나; 포스포로티오에이트가 키랄 제어되고 Sp 배열을 갖는 경우 *S, S, 또는 Sp로 표시될 수 있거나, 포스포로티오에이트가 키랄 제어되고 Rp 배열을 갖는 경우 *R, R, 또는 Rp로 표시될 수 있는 -O-P(O)(SH)-O-), 또는 포스포로디티오에이트(염 형태로 존재할 수 있으며, PS2 또는 D로 표시될 수 있는 -O-P(S)(SH)-O-) 연결을 통해 올리고뉴클레오티드 사슬(예를 들어, 5'-말단)에 연결됨). 예를 들어, 5'-L008mN * mN * mN * mN * N * N * N * N * N * N * N * N * N * N * mN * mN * mN * mN-3'의 서열을 갖고, OXXXXXXXXX XXXXXXXX의 입체화학/연결을 갖는 예시적인 올리고뉴클레오티드(N은 염기이고, O는 천연 포스페이트 뉴클레오티드간 연결이고, X는 입체무작위 포스포로티오에이트임)에서, L008은 -C(O)-를 통해 -OH에 연결되고, 포스페이트 연결("입체화학/연결"에 "O"로 표시)을 통해 올리고뉴클레오티드 사슬의 5'-말단에 연결되고; 5'-Mod062L008mN * mN * mN * mN * N * N * N * N * N * N * N * N * N * N * mN * mN * mN * mN-3'의 서열을 갖고, OXXXXXXXXX XXXXXXXX의 입체화학/연결을 갖는 다른 예시적인 올리고뉴클레오티드(N은 염기임)에서, L008은 -C(O)-를 통해 Mod062에 연결되고, 포스페이트 연결("입체화학/연결"에 "O"로 표시)을 통해 올리고뉴클레오티드 사슬의 5'-말단에 연결됨;
L009: -CH2CH2CH2-. 특정 구현예에서, Mod가 없는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 L009가 존재하는 경우, L009의 한쪽 말단은 -OH에 연결되고 다른쪽 말단은 예를 들어 연결(예를 들어, 포스페이트 연결(O 또는 PO) 또는 포스포로티오에이트 연결(키랄 제어되지 않거나 키랄 제어될 수 있음(Sp 또는 Rp)))을 통해 올리고뉴클레오티드 사슬의 5'-탄소에 연결됨; L010:
Figure pct00478
. 특정 구현예에서, Mod가 없는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 L010이 존재하는 경우, L010의 5'-탄소는 -OH에 연결되고 3'-탄소는 예를 들어 연결(예를 들어, 포스페이트 연결(O 또는 PO) 또는 포스포로티오에이트 연결(키랄 제어되지 않거나 키랄 제어될 수 있음(Sp 또는 Rp)))을 통해 올리고뉴클레오티드 사슬의 5'-탄소에 연결됨; Mod012(특정 구현예에서, -C(O)-는 L001, L004, L008 등과 같은 링커의 -NH-에 연결):
L010은 n001R과 함께 사용되어
Figure pct00479
의 구조를 갖는 L010n001R을 형성하고, 연결 인의 배열은 Rp이다. 일부 구현예에서, 다수의 L010n001R이 사용될 수 있다. 예를 들어, 다음의 구조를 갖는 L023L010n001RL010n001RL010n001R(올리고뉴클레오티드 사슬의 5'-말단에서 5'-탄소에 결합되고, 각 연결 인은 독립적으로 Rp임):
Figure pct00480
;
L023은 n001과 함께 사용되어
Figure pct00481
의 구조를 갖는 L023n001을 형성함.
L023은 n009과 함께 사용되어
Figure pct00482
의 구조를 갖는 WV-42644에서와 같이 L023n001을 형성함.
일부 구현예에서, L023n001L009n001L009n001이 사용될 수 있다. 예를 들어, WV-42643에서와 같이 L023n001L009n001L009n001
Figure pct00483
;
일부 구현예에서, L023n009L009n009이 사용될 수 있다. 예를 들어, WV-42646에서와 같이
Figure pct00484
;
일부 구현예에서, L023n009L009n009L009n009이 사용될 수 있다. 예를 들어, WV-42648에서와 같이
Figure pct00485
;
일부 구현예에서, L025가 사용될 수 있다; WV-41390에서와 같이,
Figure pct00486
; 여기서 -CH2- 연결 부위는 당(예를 들어, DNA 당)의 C5 연결 부위로서 사용되고 다른 단위(예를 들어, 당의 3')에 연결되고, 고리 상의 연결 부위는 C3 연결 부위로서 사용되고 다른 단위(예를 들어, 탄소의 5'-탄소)에 연결되고, 이들 각각은 독립적으로, 예를 들어 연결(예를 들어, 포스페이트 연결(O 또는 PO) 또는 포스포로티오에이트 연결(키랄 제어되지 않거나 키랄 제어될 수 있음(Sp 또는 Rp)))을 통해 연결된다. L025가 어떠한 변형도 없이 5'-말단에 있는 경우, -CH2- 연결 부위는 -OH에 결합된다. 예를 들어, 다양한 올리고뉴클레오티드에서 L025L025L025-는
Figure pct00487
의 구조를 가지며(다양한 염 형태로 존재할 수 있음), 표시된 바와 같은 연결(예를 들어, 포스페이트 연결(O 또는 PO) 또는 포스포로티오에이트 연결(키랄 제어되지 않거나 키랄 제어될 수 있음(Sp 또는 Rp)))을 통해 올리고뉴클레오티드 사슬의 5'-탄소에 연결됨;
일부 구현예에서, L026이 사용될 수 있다; WV-44444에서와 같이,
Figure pct00488
;
일부 구현예에서, L027이 사용될 수 있다; WV-44445에서와 같이,
Figure pct00489
;
일부 구현예에서, mU가 사용될 수 있다; WV-42079에서와 같이,
Figure pct00490
;
일부 구현예에서, fU가 사용될 수 있다; WV-44433에서와 같이,
Figure pct00491
;
일부 구현예에서, dT가 사용될 수 있다; WV-44434에서와 같이,
Figure pct00492
;
일부 구현예에서, POdT 또는 PO4-dT가 사용될 수 있다; WV-44435에서와 같이,
Figure pct00493
;
일부 구현예에서, PO5MRdT가 사용될 수 있다; WV-44436에서와 같이,
Figure pct00494
;
일부 구현예에서, PO5MSdT가 사용될 수 있다; WV-44437에서와 같이,
Figure pct00495
;
일부 구현예에서, VPdT가 사용될 수 있다; WV-44438에서와 같이,
Figure pct00496
;
일부 구현예에서, 5mvpdT가 사용될 수 있다; WV-44439에서와 같이,
Figure pct00497
;
일부 구현예에서, 5mrpdT가 사용될 수 있다; WV-44440에서와 같이,
Figure pct00498
;
일부 구현예에서, 5mspdT가 사용될 수 있다; WV-44441에서와 같이,
Figure pct00499
;
일부 구현예에서, PNdT가 사용될 수 있다; WV-44442에서와 같이,
Figure pct00500
;
일부 구현예에서, SPNdT가 사용될 수 있다; WV-44443에서와 같이,
Figure pct00501
;
일부 구현예에서, 5ptzdT가 사용될 수 있다; WV-44446에서와 같이,
Figure pct00502
;
Figure pct00503
; Mod039(특정 구현예에서, -C(O)-는 L001, L003, L004, L008, L009, L110 등과 같은 링커의 -NH-에 연결):
Figure pct00504
; Mod062(특정 구현예에서, -C(O)-는 L001, L003, L004, L008, L009, L110 등과 같은 링커의 -NH-에 연결):
Figure pct00505
; Mod085(특정 구현예에서, -C(O)-는 L001, L003, L004, L008, L009, L110 등과 같은 링커의 -NH-에 연결):
Figure pct00506
; Mod086(특정 구현예에서, -C(O)-는 L001, L003, L004, L008, L009, L110 등과 같은 링커의 -NH-에 연결):
Figure pct00507
; Mod094(특정 구현예에서, 뉴클레오티드간 연결에 연결되거나, 연결, 예를 들어 포스페이트 연결, 포스포로티오에이트 연결(임의로 키랄 제어됨) 등을 통해 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 또는 3'-말단에 연결된다. 예를 들어, 5'-mN * mN * mN * mN * N * N * N * N * N * N * N * N * N * N * mN * mN * mN * mNMod094-3'의 서열을 갖고, XXXXX XXXXX XXXXX XXO의 입체화학/연결을 갖는 예시적인 올리고뉴클레오티드(N은 염기임)에서, Mod094는 포스페이트기(아래 표시되어 있지 않으며, 염 형태로 존재할 수 있고; "입체화학/연결"에 "O"로 표시됨(...XXXX O ))를 통해 올리고뉴클레오티드 사슬의 3'-말단(3'-말단 당의 3'-탄소)에 연결됨):
Figure pct00508
.
특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티는 WO 2012/030683에 기재된 것이다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 WO 2012/030683에 기재된 화학 구조(예를 들어, 링커, 지질, 가용화 기, 및/또는 표적 리간드)를 포함한다.
특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 번호 5,688,941; 6,294,664; 6,320,017; 6,576,752; 5,258,506; 5,591,584; 4,958,013; 5,082,830; 5,118,802; 5,138,045; 6,783,931; 5,254,469; 5,414,077; 5,486,603; 5,112,963; 5,599,928; 6,900,297; 5,214,136; 5,109,124; 5,512,439; 4,667,025; 5,525,465; 5,514,785; 5,565,552; 5,541,313; 5,545,730; 4,835,263; 4,876,335; 5,578,717; 5,580,731; 5,451,463; 5,510,475; 4,904,582; 5,082,830; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,828,979; 5,595,726; 5,214,136; 5,245,022; 5,317,098; 5,371,241; 5,391,723; 4,948,882; 5,218,105; 5,112,963; 5,567,810; 5,574,142; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 5,585,481; 5,292,873; 5,552,538; 5,512,667; 5,597,696; 5,599,923; 7,037,646; 5,587,371; 5,416,203; 5,262,536; 5,272,250; 또는 8,106,022에 기재된 추가의 화학적 모이어티 및/또는 변형(예를 들어, 핵염기, 당, 뉴클레오티드간 연결 등)을 포함한다.
특정 구현예에서, 추가 화학적 모이어티, 예를 들어 Mod는 링커를 통해 연결된다. 다양한 링커가 당업계에서 이용가능하고 본 발명에 따라 사용될 수 있다(예를 들어 다양한 모이어티와 단백질(예를 들어, 항체-약물 접합체를 형성하기 위한 항체), 핵산 등의 접합체에 사용되는 것). 특정의 유용한 링커는 US 9982257, US 20170037399, US 20180216108, US 20180216107, US 9598458, WO 2017/062862, WO 2018/067973, WO 2017/160741, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/098264, WO 2018/223056, WO 2018/237194, WO 2019/032607, WO 2019/055951, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, 및/또는 WO 2019/032612에 기재되어 있으며, 각각의 링커 모이어티는 독립적으로 본원에 참조로 포함된다. 특정 구현예에서, 링커는 비제한적인 예로서 L001, L004, L009 또는 L010이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함하지만, 링커 외에는 추가 화학적 모이어티를 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함하지만, 링커 외에는 추가 화학적 모이어티를 포함하지 않으며, 링커는 L001, L004, L009, 또는 L010이다.
본원에 나타낸 바와 같이, 특정 구현예에서, 제공된 기술은 요구되고/되거나 필요한 것으로 보고된 특정 구조적 요소(예를 들어, 변형, 연결 배열 및/또는 패턴 등, 예를 들어 WO 2019/219581에 보고된 것)를 사용하지 않고 높은 수준의 활성 및/또는 원하는 특성을 제공할 수 있다(단, 이러한 특정 구조적 요소가 본 발명에 따른 다양한 다른 구조적 요소와 조합하여 ds 올리고뉴클레오티드에 혼입될 수 있음). 예를 들어 특정 구현예에서, 본 발명의 ds 올리고뉴클레오티드는 표적 뉴클레오시드(예를 들어, 표적 아데노신)의 반대편 뉴클레오시드에 대해 3' 방향에 더 적은 수의 뉴클레오시드를 갖고/갖거나, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이 유리하지 않거나 허용되지 않는 것으로 보고된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하고/하거나, Sp 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이 유리하지 않거나 허용되지 않는 것으로 보고된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 Sp 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하고/하거나, Rp 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이 유리하지 않거나 허용되지 않는 것으로 보고된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 Rp 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하고/하거나, 특정 올리고뉴클레오티드 특성 및/또는 활성에 대해 유리하거나 요구되는 것으로 보고된 것과 비교하여 하나 이상의 위치에서 다른 변형(예를 들어, 뉴클레오티드간 연결 변형, 당 변형 등) 및/또는 입체화학을 포함한다(예를 들어, 2'-MOE의 존재, 특정 위치에서 포스포로티오에이트 연결의 부재, 특정 위치에서 Sp 포스포로티오에이트 연결의 부재, 및/또는 특정 위치에서 Rp 포스포로티오에이트 연결의 부재는 특정 올리고뉴클레오티드 특성 및/또는 활성에 유리하거나 필요한 것으로 보고되었고; 본원에 나타낸 바와 같이, 제공된 기술은 2'-MOE의 사용, 하나 이상의 이러한 특정 위치에서의 포스포로티오에이트 연결의 회피, 하나 이상의 이러한 특정 위치에서의 Sp 포스포로티오에이트 연결의 회피, 및/또는 하나 이상의 이러한 특정 위치에서의 Rp 포스포로티오에이트 연결의 회피 없이 원하는 특성 및/또는 높은 활성을 제공할 수 있다). 추가적으로 또는 대안적으로, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 특정 변형(예를 들어, 염기 변형, 당 변형(예를 들어, 2'-F), 연결 변형(예를 들어, 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결), 추가의 모이어티 등) 및 수준, 패턴, 및 이들의 조합의 사용과 같이 이전에 인식되지 않은 구조적 요소를 포함한다.
예를 들어 특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이, 제공된 d 올리고뉴클레오티드는 표적 뉴클레오시드(예를 들어, 표적 아데노신)의 반대편 뉴클레오시드에 대해 3' 방향에 최대 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 뉴클레오시드를 포함한다.
대안적으로 또는 추가적으로, 본원에 기재된(예를 들어, 특정 실시예에 예시된) 바와 같이, 표적 뉴클레오시드(예를 들어, 표적 아데노신)의 반대편 뉴클레오시드에 대해 3' 방향에 있는 구조적 요소에 있어서, 특정 구현예에서, 표적 뉴클레오시드(예를 들어, 표적 아데노신)의 반대편 뉴클레오시드에 대해 3' 방향에 있는 뉴클레오티드간 연결의 약 50%~100%(예를 들어, 약 또는 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%)는 각각 독립적으로 변형 뉴클레오티드간 연결이고, 임의로 키랄 제어된다. 특정 구현예에서, 표적 뉴클레오시드의 반대편 뉴클레오시드에 대해 3' 방향에 있는 최대 1, 2, 또는 3개의 뉴클레오티드간 연결은 천연 포스페이트 연결이다. 특정 구현예에서, 이러한 뉴클레오티드간 연결은 천연 포스페이트 연결이 아니다. 특정 구현예에서, 최대 1개의 이러한 뉴클레오티드간 연결은 천연 포스페이트 연결이다. 특정 구현예에서, 최대 2개의 이러한 뉴클레오티드간 연결은 천연 포스페이트 연결이다. 특정 구현예에서, 최대 3개의 이러한 뉴클레오티드간 연결은 천연 포스페이트 연결이다. 특정 구현예에서, 각각의 변형 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 포스포로티오에이트 또는 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이다(예를 들어, n001). 특정 구현예에서, 각각의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어된다. 특정 구현예에서, 표적 뉴클레오시드의 반대편 뉴클레오시드에 대해 3' 방향에 있는 최대 1, 2, 또는 3개의 뉴클레오티드간 연결은 Rp 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이다.
대안적으로 또는 추가적으로, 본원에 기재된(예를 들어, 특정 실시예에 예시된) 바와 같이, 특정 구현예에서, 표적 뉴클레오시드(예를 들어, 표적 아데노신)의 반대편 뉴클레오시드에 대해 5' 방향에 있는 뉴클레오티드간 연결의 약 50%~100%(예를 들어, 약 또는 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%)는 각각 독립적으로 변형 뉴클레오티드간 연결이고, 임의로 키랄 제어된다. 특정 구현예에서, 표적 뉴클레오시드(예를 들어, 표적 아데노신)의 반대편 뉴클레오시드에 대해 5' 방향에 있는 0개 또는 최대 1, 2, 또는 3개의 뉴클레오티드간 연결은 변형 뉴클레오티드간 연결이 아니다. 특정 구현예에서, 표적 뉴클레오시드(예를 들어, 표적 아데노신)의 반대편 뉴클레오시드에 대해 5' 방향에 있는 0개 또는 최대 1, 2, 또는 3개의 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이 아니다. 특정 구현예에서, 표적 뉴클레오시드(예를 들어, 표적 아데노신)의 반대편 뉴클레오시드에 대해 5' 방향에 있는 0개 또는 최대 1, 2, 또는 3개의 뉴클레오티드간 연결은 Sp 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이 아니다. 특정 구현예에서, 표적 뉴클레오시드(예를 들어, 표적 아데노신)의 반대편 뉴클레오시드에 대해 5' 방향에 있는 최대 1, 2, 또는 3개의 뉴클레오티드간 연결은 천연 포스페이트 연결이다. 특정 구현예에서, 이러한 뉴클레오티드간 연결은 천연 포스페이트 연결이 아니다. 특정 구현예에서, 최대 1개의 이러한 뉴클레오티드간 연결은 천연 포스페이트 연결이다. 특정 구현예에서, 최대 2개의 이러한 뉴클레오티드간 연결은 천연 포스페이트 연결이다. 특정 구현예에서, 최대 3개의 이러한 뉴클레오티드간 연결은 천연 포스페이트 연결이다. 특정 구현예에서, 각각의 변형 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 포스포로티오에이트 또는 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결이다(예를 들어, n001). 특정 구현예에서, 표적 뉴클레오시드의 반대편 뉴클레오시드에 대해 5' 방향에는 2, 3, 또는 4개의 연속적인 뉴클레오티드간 연결이 없고, 각각은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이 아니다. 특정 구현예에서, 표적 뉴클레오시드의 반대편 뉴클레오시드에 대해 5' 방향에는 2, 3, 또는 4개의 연속적인 뉴클레오티드간 연결이 없고, 각각은 키랄 제어되고 Sp 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이 아니다. 특정 구현예에서, 표적 뉴클레오시드(예를 들어, 표적 아데노신)의 반대편 뉴클레오시드에 대해 5' 방향에 있는 0개 또는 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 뉴클레오티드간 연결은 Rp 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 표적 뉴클레오시드(예를 들어, 표적 아데노신)의 반대편 뉴클레오시드에 대해 5' 방향에 있는 뉴클레오티드간 연결의 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 또는 32개, 또는 약 50%~100%(예를 들어, 약 또는 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%)는 각각 독립적으로 키랄 제어되고 Sp 뉴클레오티드간 연결이다. 특정 구현예에서, 표적 뉴클레오시드(예를 들어, 표적 아데노신)의 반대편 뉴클레오시드에 대해 5' 방향에 있는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결의 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 또는 32개, 또는 약 50%~100%(예를 들어, 약 또는 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%)는 각각 독립적으로 키랄 제어되고 Sp이다. 특정 구현예에서, 표적 뉴클레오시드(예를 들어, 표적 아데노신)의 반대편 뉴클레오시드에 대해 5' 방향에 있는 각각의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결은 키랄 제어된다. 특정 구현예에서, 표적 뉴클레오시드(예를 들어, 표적 아데노신)의 반대편 뉴클레오시드에 대해 5' 방향에 있는 각각의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결은 Sp이다.
6. 올리고뉴클레오티드 및 조성물의 생성
ds 올리고뉴클레오티드 및 조성물의 생성을 위해 다양한 방법이 사용될 수 있고 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 기존의 포스포아미다이트 화학을 사용하여 입체무작위 올리고뉴클레오티드 및 조성물을 제조할 수 있고, 특정 시약 및 키랄 제어 기술을 사용하여 키랄 제어 올리고뉴클레오티드 조성물을 제조할 수 있으며, 이는 예를 들어 US 9982257, US 20170037399, US 20180216108, US 20180216107, US 9598458, WO 2017/062862, WO 2018/067973, WO 2017/160741, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/098264, WO 2018/223056, WO 2018/237194, WO 2019/032607, WO 2019/055951, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, 및/또는 WO 2019/032612에 기재된 바와 같고, 각각의 시약 및 방법은 본원에 참조로 포함된다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 및 이의 조성물의 키랄 제어/입체선택적 제조는, 예를 들어 단량체 포스포아미다이트의 일부로서 키랄 보조체의 사용을 포함한다. 이러한 키랄 보조 시약 및 포스포아미다이트의 예는 US 9982257, US 20170037399, US 20180216108, US 20180216107, US 9598458, WO 2017/062862, WO 2018/067973, WO 2017/160741, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/098264, WO 2018/223056, WO 2018/237194, WO 2019/032607, WO 2019/055951, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, 및/또는 WO 2019/032612에 기재되어 있으며, 각각의 키랄 보조 시약 및 포스포아미다이트는 독립적으로 본원에 참조로 포함된다. 특정 구현예에서, 키랄 보조체는 WO 2018/022473, WO 2018/098264, WO 2018/223056, WO 2018/223073, WO 2018/223081, WO 2018/237194, WO 2019/032607, WO 2019/055951, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, 및/또는 WO 2019/032612 중 어느 하나에 기재된 키랄 보조체이고, 각각의 키랄 보조체는 독립적으로 본원에 참조로 포함된다.
특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 합성 사이클, 시약 및 조건을 포함한 키랄 제어 제조 기술은 US 9982257, US 20170037399, US 20180216108, US 20180216107, US 9598458, WO 2017/062862, WO 2018/067973, WO 2017/160741, WO 2017/192679, WO 2017/210647, and/WO 2018/098264, WO 2018/022473, WO 2018/223056, WO 2018/223073, WO 2018/223081, WO 2018/237194, WO 2019/032607, WO2019032612, WO 2019/055951, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, 및/또는 WO 2019/032612, WO 2018/223056, WO 2018/223073, WO 2018/223081, WO 2018/237194, WO 2019/032607, WO 2019/055951, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, 및/또는 WO 2019/032612에 기재되어 있으며, 각각의 올리고뉴클레오티드 합성 방법, 사이클, 시약 및 조건은 독립적으로 본원에 참조로 포함된다.
일단 합성되면, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드 및 조성물은 일반적으로 추가로 정제된다. 적합한 정제 기술은 당업자에게 널리 알려져 있고 당업자에 의해 실시되며, US 9982257, US 20170037399, US 20180216108, US 20180216107, US 9598458, WO 2017/062862, WO 2018/067973, WO 2017/160741, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/098264, WO 2018/223056, WO 2018/237194, WO 2019/032607, WO 2019/055951, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, 및/또는 WO 2019/032612에 기재된 것을 포함하지만 이에 한정되지 않고, 각각의 정제 기술은 독립적으로 본원에 참조로 포함된다.
특정 구현예에서, 사이클은 커플링, 캡핑, 변형 및 탈차단을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구현예에서, 사이클은 커플링, 캡핑, 변형, 캡핑 및 탈차단을 포함하거나 이로 이루어진다. 이러한 단계는 일반적으로, 나열된 순서대로 수행되지만, 특정 구현예에서는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 특정 단계, 예를 들어 캡핑 및 변형의 순서가 변경될 수 있다. 원하는 경우, 당업자가 합성에서 종종 수행하는 바와 같이 변환율, 수율 및/또는 순도를 개선하기 위해 하나 이상의 단계가 반복될 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서 커플링이 반복될 수 있으며; 특정 구현예에서, 변형(예를 들어, =O를 인스톨(install)하기 위한 산화, =S를 인스톨하기 위한 황화 등)이 반복될 수 있으며; 특정 구현예에서, 커플링은 P(III) 연결을 특정 상황에서 더 안정할 수 있는 P(V) 연결로 변환할 수 있는 변형 후에 반복되며, 커플링은 통상적으로 새로 형성된 P(III) 연결을 P(V) 연결로 변환하기 위한 변형이 뒤따른다. 특정 구현예에서, 단계들이 반복되는 경우 상이한 조건들(예를 들어, 농도, 온도, 시약, 시간 등)이 사용될 수 있다.
예를 들어, 다양한 경로를 통해 대상체에 투여하기 위한, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드를 제형화하고/하거나 제약 조성물을 제조하기 위한 기술은 당업계에서 용이하게 이용가능하고 본 발명에 따라 사용될 수 있다(예를 들어, US 9982257, US 20170037399, US 20180216108, US 20180216107, US 9598458, WO 2017/062862, WO 2018/067973, WO 2017/160741, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/098264, WO 2018/223056, 또는 WO 2018/237194 및 이들 문헌에 인용된 참고 문헌에 기재된 것).
예를 들어, 다양한 경로를 통해 대상체에 투여하기 위한, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드를 제형화하고/하거나 제약 조성물을 제조하기 위한 기술은 당업계에서 용이하게 이용가능하고 본 발명에 따라 사용될 수 있다(예를 들어, US 9982257, US 20170037399, US 20180216108, US 20180216107, US 9598458, WO 2017/062862, WO 2018/067973, WO 2017/160741, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/098264, WO 2018/223056, 또는 WO 2018/237194 및 이들 문헌에 인용된 참고 문헌에 기재된 것).
특정 구현예에서, 유용한 키랄 보조체는
Figure pct00509
,
Figure pct00510
,
Figure pct00511
, 또는
Figure pct00512
, 또는 이의 염의 구조를 가지며, RC11은 -LC1-RC1이고, LC1은 임의로 치환된 --CH2-이다. RC1은 R, -Si(R)3, -SO2R, 또는 전자 구인성 기이고, RC2와 RC3는 이들의 사이에 개재된 원자와 함께, 질소 원자 외에도 0~2개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 3~10원 포화 고리를 형성한다. 특정 구현예에서, 유용한 키랄 보조체는
Figure pct00513
또는
Figure pct00514
의 구조를 가지며, RC1은 R, -Si(R)3, 또는 -SO2R이고, RC2와 RC3는 이들의 사이에 개재된 원자와 함께, 질소 원자 외에도 0~2개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 3~7원 포화 고리를 형성한다. 형성된 고리는 임의로 치환된 5원 고리이다. 특정 구현예에서, 유용한 키랄 보조체는
Figure pct00515
,
Figure pct00516
,
Figure pct00517
, 또는
Figure pct00518
, 또는 이의 염의 구조를 갖는다. 특정 구현예에서, 유용한 키랄 보조체는
Figure pct00519
또는
Figure pct00520
의 구조를 갖는다. 특정 구현예에서, 유용한 키랄 보조체는 DPSE 키랄 보조체이다. 특정 구현예에서, 키랄 보조체의 순도 또는 입체화학적 순도는 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 85%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 90%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 95%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 96%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 97%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 98%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 99%이다.
특정 구현예에서, LC1은 -CH2-이다. 특정 구현예에서, LC1은 치환된 -CH2-이다. 특정 구현예에서, LC1은 일치환된 -CH2-이다.
특정 구현예에서, RC1은 R이다. 특정 구현예에서, RC1은 임의로 치환된 페닐이다. 특정 구현예에서, RC1은 -SiR3이다. 특정 구현예에서, RC1은 -SiPh2Me이다. 특정 구현예에서, RC1은 -SO2R이다. 특정 구현예에서, R은 수소가 아니다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 페닐이다. 특정 구현예에서, R은 페닐이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-6 지방족이다. 특정 구현예에서, R은 C1-6 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 메틸이다. 특정 구현예에서, R은 t-부틸이다.
특정 구현예에서, RC1은 -C(O)R, -OP(O)(OR)2, -OP(O)(R)2, -P(O)(R)2, -S(O)R, -S(O)2R 등과 같은 전자 구인성 기이다. 특정 구현예에서, 전자 구인성 기 RC1 기를 포함하는 키랄 보조체는 천연 RNA 당에 결합된 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결 및/또는 음으로 하전되지 않은 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결을 제조하는 데 특히 유용하다.
특정 구현예에서, RC2와 RC3는 이들의 사이에 개재된 원자와 함께, 질소 원자 외에는 헤테로원자를 갖지 않는 임의로 치환된 3~10원(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10원) 포화 고리를 형성한다. 특정 구현예에서, RC2와 RC3는 이들의 사이에 개재된 원자와 함께, 질소 원자 외에는 헤테로원자를 갖지 않는 임의로 치환된 5원 포화 고리를 형성한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 ds 올리고뉴클레오티드 및 이의 조성물의 제조를 위한 유용한 시약을 제공한다. 특정 구현예에서, 포스포아미다이트는 본원에 기재된 바와 같은 뉴클레오시드, 핵염기, 및 당을 포함한다. 특정 구현예에서, 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이 핵염기 및 당은 올리고뉴클레오티드 합성을 위해 적절히 보호된다. 특정 구현예에서, 포스포아미다이트는 RNS-P(OR)N(R)2의 구조를 가지며, RNS는 임의로 보호된 뉴클레오시드 모이어티이다. 특정 구현예에서, 포스포아미다이트는 RNS-P(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2의 구조를 갖는다. 특정 구현예에서, 포스포아미다이트는 고리 BA 또는 고리 BA의 호변이성체이거나 고리 BA 또는 고리 BA의 호변이성체를 포함하는 핵염기를 포함하고, 고리 BA는 BA-I, BA-I-a, BA-I-b, BA-II, BA-II-a, BA-II-b, BA-III, BA-III-a, BA-III-b, BA-IV, BA-IV-a, BA-IV-b, BA-V, BA-V-a, BA-V-b, 또는 BA-VI의 구조를 가지며, 핵염기는 임의로 치환되거나 보호된다. 특정 구현예에서, 포스포아미다이트는 키랄 보조 모이어티를 포함하고, 인은 키랄 보조 모이어티의 산소 및 질소 원자에 결합된다. 특정 구현예에서, 포스포아미다이트는
Figure pct00521
,
Figure pct00522
,
Figure pct00523
, 또는
Figure pct00524
, 또는 이의 염의 구조를 가지며, RNS는 보호된 뉴클레오시드 모이어티(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 합성을 위해 적절하게 보호된 5'-OH 및/또는 핵염기)이고, 각각의 다른 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, 포스포아미다이트는
Figure pct00525
또는
Figure pct00526
의 구조를 가지며, RNS는 보호된 뉴클레오시드 모이어티(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 합성을 위해 적절하게 보호된 5'-OH 및/또는 핵염기)이고, RC1은 R, -Si(R)3, 또는 -SO2R이고, RC2와 RC3는 이들의 사이에 개재된 원자와 함께, 질소 원자 외에도 0~2개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 3~7원 포화 고리를 형성하고, 커플링은 뉴클레오티드간 연결을 형성한다. 특정 구현예에서, RNS의 5'-OH는 보호된다. 특정 구현예에서, RNS의 5'-OH는 -ODMTr로서 보호된다. 특정 구현예에서, RNS는 3'-O-를 통해 인에 결합된다. 특정 구현예에서, RC2와 RC3에 의해 형성되는 고리는 임의로 치환된 5원 고리이다. 특정 구현예에서, 포스포아미다이트는
Figure pct00527
,
Figure pct00528
,
Figure pct00529
, 또는
Figure pct00530
, 또는 이의 염의 구조를 갖는다. 특정 구현예에서, 포스포아미다이트는
Figure pct00531
또는
Figure pct00532
의 구조를 갖는다.
특정 구현예에서, 포스포아미다이트의 순도 또는 입체화학적 순도는 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 85%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 90%이다. 특정 구현예에서, 백분율은 적어도 95%이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 올리고뉴클레오티드 또는 조성물의 제조 방법으로서, 올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 자유 -OH, 예를 들어 자유 5'-OH를 본원에 기재된 바와 같은 포스포아미다이트와 커플링시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 올리고뉴클레오티드를 제공하고, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형 뉴클레오티드간 연결을 포함하고, 각각은 독립적으로 -O5-PL(W)(RCA)-O3-의 구조를 가지며,
PL은 P 또는 P(=W)이고,
W는 O, S, 또는 WN이고,
WN은 =N-C(-N(R1)2=N+(R1)2Q-이고,
Q-는 음이온이고,
RCA는 임의로 캡핑된 키랄 보조 모이어티이거나 이를 포함하고,
O5는 당의 5'-탄소에 결합된 산소이고,
O3는 당의 3'-탄소에 결합된 산소이다.
특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 임의로 키랄 제어된다. 특정 구현예에서, 변형 뉴클레오티드간 연결은 임의로 키랄 제어된다.
특정 구현예에서, 제공된 방법은 이러한 변형 뉴클레오티드간 연결로부터 RCA를 제거하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 제거 후, RCA에 대한 결합은 -OH로 대체된다. 특정 구현예에서, 제거 후, RCA에 대한 결합은 =O로 대체되고, WN에 대한 결합은 -N=C(N(R1)2)2로 대체된다.
특정 구현예에서, PL은 P=S이고, RCA가 제거될 때, 이러한 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결로 변환된다.
특정 구현예에서, PL은 P=WN이고, RCA가 제거될 때, 이러한 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00533
의 구조를 갖는 뉴클레오티드간 연결로 변환된다. 특정 구현예에서,
Figure pct00534
의 구조를 갖는 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00535
의 구조를 갖는다. 특정 구현예에서,
Figure pct00536
의 구조를 갖는 뉴클레오티드간 연결은
Figure pct00537
의 구조를 갖는다.
특정 구현예에서, PL은 P이다(예를 들어, 포스포아미다이트와 5'-OH의 커플링으로부터 새로 형성된 뉴클레오티드간 연결에서). 특정 구현예에서, W는 O 또는 S이다. 특정 구현예에서, W는 S이다(예를 들어, 황화 후). 특정 구현예에서, W는 O이다(예를 들어, 산화 후). 특정 구현예에서, 음으로 하전되지 않은 특정 뉴클레오티드간 연결 또는 중성 뉴클레오티드간 연결은 적합한 조건에서 P(III) 포스파이트 트리에스테르 뉴클레오티드간 연결을 아지도 이미다졸리늄 염(예를 들어,
Figure pct00538
를 포함하는 화합물)과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, 아지도 이미다졸리늄 염은 PF6 -의 염이다. 특정 구현예에서, 아지도 이미다졸리늄 염은
Figure pct00539
의 염이다. 특정 구현예에서, 아지도 이미다졸리늄 염은 2-아지도-1,3-디메틸이미다졸리늄 헥사플루오로포스페이트이다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, Q-는 시스템에(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 합성에서) 존재하는 다양한 적합한 음이온일 수 있고, 사이클, 공정 단계, 시약, 용매 등에 따라 올리고뉴클레오티드 제조 공정 중에 달라질 수 있다. 특정 구현예에서, Q-는 PF6 -이다.
특정 구현예에서, RCA는
Figure pct00540
또는
Figure pct00541
이고, RC4는 -H 또는 -C(O)R'이고, 각각의 다른 변수는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, RCA는
Figure pct00542
또는
Figure pct00543
이고, RC1은 R, -Si(R)3, 또는 -SO2R이고, RC2와 RC3는 이들의 사이에 개재된 원자와 함께, 질소 원자 외에도 0~2개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 3~7원 포화 고리를 형성하고, RC4는 -H 또는 -C(O)R'이다. 특정 구현예에서, RC4는 -H이다. 특정 구현예에서, RC4는 -C(O)CH3이다. 특정 구현예에서, RC2와 RC3는 함께, 임의로 치환된 5원 고리를 형성한다.
특정 구현예에서, RC4는 -H이다(예를 들어, 포스포아미다이트와 5'-OH의 커플링으로부터 새로 형성된 뉴클레오티드간 연결에서). 특정 구현예에서, RC4는 -C(O)R이다(예를 들어, 아민의 캡핑 후). 특정 구현예에서, R은 메틸이다.
특정 구현예에서, 각각의 키랄 제어 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결은 독립적으로 -O5-PL(W)(RCA)-O3-로부터 변환된다.
8. 특성화 및 평가
특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드 및 이의 조성물의 특성 및/또는 활성은 당업자에게 이용가능한 다양한 기술, 예를 들어 생화학적 분석법, 세포 기반 분석법, 동물 모델, 임상 시험 등을 사용하여 특성화 및/또는 평가될 수 있다.
특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 조성물, 예를 들어, dsRNAi 올리고뉴클레오티드 조성물을 식별 및/또는 특성화하는 방법은 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 조성물을 제공하는 단계 및 기준 조성물 대비 전달을 평가하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 ds 올리고뉴클레오티드 조성물, 예를 들어, dsRNAi 올리고뉴클레오티드 조성물을 식별 및/또는 특성화하는 방법으로서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 조성물을 제공하는 단계 및 기준 조성물 대비 세포 흡수를 평가하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 ds 올리고뉴클레오티드 조성물, 예를 들어 dsRNAi 올리고뉴클레오티드 조성물을 확인 및/또는 특성화하는 방법으로서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 조성물을 제공하는 단계 및 기준 조성물 대비 표적 유전자 및/또는 이에 의해 암호화된 생성물의 전사체의 감소를 평가하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 ds 올리고뉴클레오티드 조성물, 예를 들어 dsRNAi 올리고뉴클레오티드 조성물을 식별 및/또는 특성화하는 방법으로서, 복수의 ds 올리고뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 조성물을 제공하는 단계 및 기준 조성물 대비 타우 수준의 감소, 이의 응집 및/또는 퍼짐을 평가하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, dsRNAi 올리고뉴클레오티드, 및 이의 조성물의 특성 및/또는 활성은 각각 기준 ds 올리고뉴클레오티드 및 이의 조성물과 비교된다.
특정 구현예에서, 기준 ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 입체무작위 ds 올리고뉴클레오티드 조성물이다. 특정 구현예에서, 기준 ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 모든 뉴클레오티드간 연결이 포스포로티오에이트인 ds 올리고뉴클레오티드의 입체무작위 조성물이다. 특정 구현예에서, 기준 ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 전부 포스페이트 연결을 갖는 ds DNA 올리고뉴클레오티드 조성물이다. 특정 구현예에서, 기준 ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 키랄 제어되지 않는다는 점을 제외하고는 제공된 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물과 동일하다. 특정 구현예에서, 기준 ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 상이한 입체화학 패턴을 갖는다는 점을 제외하고는 제공된 키랄 제어 올리고뉴클레오티드 조성물과 동일하다. 특정 구현예에서, 기준 ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 하나 이상의 당, 염기, 및/또는 뉴클레오티드간 연결의 상이한 변형, 또는 변형 패턴을 갖는 것을 제외하고는 제공된 ds 올리고뉴클레오티드 조성물과 유사하다. 특정 구현예에서,ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 입체무작위이며, 기준 ds 올리고뉴클레오티드 조성물도 입체무작위이지만, 이들은 당 및/또는 염기 변형(들), 또는 이의 패턴과 관련하여 상이하다.
특정 구현예에서, 기준 조성물은 동일한 염기 서열 및 동일한 화학적 변형을 갖는 ds 올리고뉴클레오티드의 조성물이다. 특정 구현예에서, 기준 조성물은 동일한 염기 서열 및 동일한 화학적 변형 패턴을 갖는 ds 올리고뉴클레오티드의 조성물이다. 특정 구현예에서, 기준 조성물은 동일한 염기 서열 및 화학적 변형을 갖는 ds 올리고뉴클레오티드의 키랄 비제어(또는 입체무작위) 조성물이다. 특정 구현예에서, 기준 조성물은 동일한 구성의 ds 올리고뉴클레오티드의 키랄 비제어(또는 입체무작위) 조성물이지만, 그 외에는 제공된 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물과 동일하다.
특정 구현예에서, 기준 ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 상이한 염기 서열을 갖는 ds 올리고뉴클레오티드의 것이다. 특정 구현예에서, 기준 ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 RNAi를 표적화하지 않는 ds 올리고뉴클레오티드의 것이다(예를 들어, 특정 분석을 위한 음성 대조군으로서).
특정 구현예에서, 기준 조성물은 본원에 기술된 화학적 변형을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 동일한 염기 서열을 갖지만 상이한 화학적 변형을 갖는 ds 올리고뉴클레오티드의 조성물이다. 특정 구현예에서, 기준 조성물은 동일한 염기 서열을 갖지만, 상이한 뉴클레오티드간 연결 패턴 및/또는 뉴클레오티드간 연결의 입체화학 및/또는 화학적 변형을 갖는 ds 올리고뉴클레오티드의 조성물이다.
유전자 생성물의 검출을 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 이의 발현, 수준, 및/또는 활성은 제공된 올리고뉴클레오티드의 도입 또는 투여 후에 변경될 수 있다. 예를 들어, 전사체 및 이의 넉다운은 qPCR로 검출 및 정량화될 수 있으며 단백질 수준은 웨스턴 블롯을 통해 결정될 수 있다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 효능 평가는 세포에서 시험관 내에서 또는 생화학적 분석법에서 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 당업자에게 이용가능한 다양한 방법, 예를 들어, 짐노틱(gymnotic) 전달, 형질감염, 리포펙션 등을 통해 세포에 도입될 수 있다.
특정 구현예에서, 추정 dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 효능은 시험관내에서 시험될 수 있다.
특정 구현예에서, 추정 dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 효능은 유전자 또는 이의 유전자 생성물의 발현, 수준, 및/또는 활성을 시험하는 임의의 알려진 방법을 사용하여 시험관내에서 시험될 수 있다.
특정 구현예에서, dsRNAi 가용성 응집체는 면역블롯팅에 의해 관찰될 수 있다.
특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 질환의 세포 또는 동물 모델에서 테스트된다.
특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드가 투여된 동물 모델은 안전성 및/또는 효능에 대해 평가될 수 있다.
특정 구현예에서, 행동, 염증 및 독성에 대한 임의의 효과를 포함하여, 동물에게 ds 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것의 효과(들)가 평가될 수 있다. 특정 구현예에서, 투약 후, 동물은 그루밍 문제, 음식 섭취 결여, 및 임의의 기타 무기력 징후를 비롯한 독성 징후에 대해 관찰될 수 있다. 특정 구현예에서, 마우스 모델에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 투여 후, 동물은 뒷발 클래스핑 표현형의 발병 타이밍에 대해 모니터링될 수 있다.
특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드를 동물에 투여한 후, 동물을 희생시킬 수 있고, 조직 또는 세포의 분석을 수행하여 RNAi 활성의 변화, 또는 기타 생화학적 변화 또는 기타 변화를 확인할 수 있다. 특정 구현예에서, 부검 후, 간, 심장, 폐, 신장 및 비장이 수집되고, 고정되고, 조직병리학적 평가를 위해 처리될 수 있다(헤마톡실린 및 에오신-염색 조직 슬라이드의 표준 광학 현미경 검사).
특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드를 동물에 투여한 후, 행동 변화를 모니터링하거나 평가할 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 평가는 과학 문헌에 기술된 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
본원에 기술된 동물에서의 테스트의 다양한 효과는 또한 dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 투여 후 인간 대상체 또는 환자에서 모니터링될 수 있다.
또한, 인간 대상체에서의 dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 효능은 올리고뉴클레오티드의 투여 후 증상의 감소, 또는 질환 증상의 악화 또는 발병 속도의 감소를 포함하지만 이에 한정되지 않는 당업계에 알려진 임의의 다양한 파라미터를 평가함으로써 측정될 수 있다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드로 인간을 치료한 후, 또는 시험관 내에서 세포 또는 조직을 올리고뉴클레오티드와 접촉시킨 후, 세포 및/또는 조직을 분석을 위해 수집한다.
특정 구현예에서, 다양한 세포 및/또는 조직에서 표적 핵산 수준은 당업계에서 이용가능한 방법에 의해 정량화될 수 있으며, 이들 중 다수는 구매가능한 키트 및 물질로 달성될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 노던 블롯 분석, 경쟁적 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR), 정량적 실시간 PCR 등을 포함한다. RNA 분석은 전체 세포 RNA 또는 폴리(A)+ mRNA에 대해 수행될 수 있다. 프로브 및 프라이머는 검출할 핵산에 혼성화되도록 설계된다. 실시간 PCR 프로브 및 프라이머를 설계하는 방법은 잘 알려져 있고 당업계에서 널리 실시되고 있다. 예를 들어, RNAi RNA를 검출하고 정량화하기 위해, 예시적인 방법은 올리고뉴클레오티드 또는 조성물로 처리된 세포 또는 동물로부터 전체 RNA(예를 들어, mRNA 포함)를 단리하고 RNA를 역전사 및/또는 정량적 실시간 PCR로 처리하는 것을 포함하며, 이는 예를 들어 본원에 또는 문헌[Moon et al. 2012 Cell Metab. 15: 240-246]에 기술되어 있다.
특정 구현예에서, 단백질 수준은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 웨스턴 블롯 분석(면역블로팅), 면역세포화학, 형광-활성화 세포 분류(FACS), 면역조직화학, 면역침전, 단백질 활성 분석(예를 들어, 카스파아제 활성 분석), 및 정량적 단백질 분석에서 평가되거나 정량화될 수 있다. 마우스, 래트, 원숭이 및 인간 단백질의 검출에 유용한 항체는 구매가능하거나 필요한 경우 생성될 수 있다. 예를 들어, 다양한 RNAi 항체가 보고되었다.
ds 올리고뉴클레오티드 또는 다른 핵산의 수준을 탐지하기 위한 다양한 기술이 당업계에서 알려져 있고/있거나 이용가능하다. 이러한 기술은 예를 들어 전달, 세포 흡수, 안정성, 분포 등을 평가하기 위해 투여될 때 dsRNAi 올리고뉴클레오티드를 검출하는 데 유용하다.
특정 구현예에서, 선택 기준은 다양한 분석으로부터 생성된 데이터를 평가하고 특정 특성 및 활성을 갖는 특히 바람직한 ds 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 바람직한 dsRNAi 올리고뉴클레오티드를 선택하는 데 사용된다. 특정 구현예에서, 선택 기준은 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만 또는 약 1 nM 미만의 IC50을 포함한다. 특정 구현예에서, 안정성 분석에 대한 선택 기준은 제1일에서의 적어도 50%의 안정성[올리고뉴클레오티드의 적어도 50%가 여전히 잔존하고/하거나 검출가능함]을 포함한다. 특정 구현예에서, 안정성 분석에 대한 선택 기준은 제2일에서의 적어도 50%의 안정성을 포함한다. 특정 구현예에서, 안정성 분석에 대한 선택 기준은 제3일에서의 적어도 50%의 안정성을 포함한다. 특정 구현예에서, 안정성 분석에 대한 선택 기준은 제4일에서의 적어도 50%의 안정성을 포함한다. 특정 구현예에서, 안정성 분석에 대한 선택 기준은 제5일에서의 적어도 50%의 안정성을 포함한다. 특정 구현예에서, 안정성 분석에 대한 선택 기준은 제5일에서의 적어도 80%[올리고뉴클레오티드의 적어도 80%가 잔존함]를 포함한다.
특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 효능은 병태, 장애, 또는 질환, 또는 생물학적 경로의 변화를 모니터링, 측정 또는 탐지함으로써 직접적으로 또는 간접적으로 평가된다.
특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 효능은 넉다운에 의해 영향을 받는 반응의 변화를 모니터링, 측정, 또는 탐지함으로써 직접적으로 또는 간접적으로 평가된다.
특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드(예를 들어, dsRNAi 올리고뉴클레오티드)를 서열 분석에 의해 분석하여 어떤 다른 유전자(예를 들어, 표적 유전자가 아닌 유전자)가 제공된 ds 올리고뉴클레오티드(예를 들어, dsRNAi 올리고뉴클레오티드)의 염기 서열에 대하여 상보성인 서열을 갖는지를 결정하거나 어느 것이 제공된 ds 올리고뉴클레오티드(예를 들어, dsRNAi 올리고뉴클레오티드)의 염기 서열로부터 0, 1, 2개 이상의 불일치를 갖는지를 결정할 수 있다. 만약에 있다면, 이러한 잠재적인 오프-타겟의 ds 올리고뉴클레오티드에 의한 넉다운이 ds 올리고뉴클레오티드(예를 들어, dsRNAi 올리고뉴클레오티드)의 잠재적 오프-타겟 효과를 평가하기 위해 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, 오프-타겟 효과는 또한 의도하지 않은 효과로 지칭되고/되거나 방관자(비-표적) 서열 또는 유전자에 대한 혼성화와 관련된다.
특정 구현예에서, 특정한 생물학적 효과(예를 들어, 표적 유전자 또는 이의 유전자 생성물의 수준, 발현, 및/또는 활성의 감소)를 제공하는 능력에 대해 평가 및 테스트된 dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 병태, 장애, 또는 질환을 치료, 개선, 및/또는 예방하는 데 사용될 수 있다.
9. 생물학적 활성 올리고뉴클레오티드
특정 구현예에서, 본 발명은 dsRNAi 제제로서 작용할 수 있는 ds 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 제공된 조성물은 구조적 유전자, 유전자 제어 및/또는 종결 영역, 및/또는 자가 복제 시스템(예컨대 바이러스 또는 플라스미드 DNA)의 가닥에 완전히 또는 부분적으로 상보적인 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 제공된 조성물은 RNAi 제제 또는 다른 RNA 간섭 시약(RNAi 제제 또는 iRNA 제제), shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 자가 절단 RNA, 리보자임, 이의 단편 및/또는 이의 변이체(예컨대 펩티딜 트랜스퍼라제 23S rRNA, RNase P, 그룹 I 및 그룹 II 인트론, GIR1 분지 리보자임, 리드자임, 헤어핀 리보자임, 해머헤드 리보자임, HDV 리보자임, 포유류 CPEB3 리보자임, VS 리보자임, glmS 리보자임, CoTC 리보자임 등), 마이크로RNA, 마이크로RNA 모방체, 슈퍼미르, 앱타머, 안티미르, 안타고미르, Ul 어댑터, 트리플렉스 형성 올리고뉴클레오티드, RNA 활성제, 긴 비암호화 RNA, 짧은 비암호화 RNA(예를 들어, piRNA), 면역조절 올리고뉴클레오티드(예컨대 면역자극 올리고뉴클레오티드, 면역억제 올리고뉴클레오티드), GNA, LNA, ENA, PNA, TNA, 모르폴리노, G-쿼드루플렉스(RNA 및 DNA), 항바이러스성 올리고뉴클레오티드, 및 데코이 올리고뉴클레오티드이거나 이로서 작용하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 제공된 조성물은 하나 이상의 하이브리드(예를 들어, 키메라) 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "하이브리드"는 올리고뉴클레오티드의 혼합된 구조적 요소를 광범위하게 지칭한다. 하이브리드 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, (1) 혼합된 부류의 뉴클레오티드(예를 들어 단일 분자 내의 부분 DNA 및 부분 RNA(예를 들어, DNA-RNA))를 갖는 올리고뉴클레오티드 분자; (2) DNA:RNA 염기쌍이 분자내 또는 분자간; 또는 둘 다에서 발생하도록 하는 상이한 부류의 핵산의 상보적인 쌍; (3) 2종 이상의 백본 또는 뉴클레오티드간 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
특정 구현예에서, 제공된 조성물은 단일 분자 내에 1종 초과의 핵산 잔기를 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 DNA 부분 및 RNA 부분을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 비변형 부분 및 변형 부분을 포함할 수 있다.
제공된 ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이, 임의의 다양한 변형을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 예를 들어 의도된 용도에 비추어 특정한 변형이 선택된다. 특정 구현예에서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드(또는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 이중 가닥 부분)의 한 가닥 또는 양 가닥 모두를 변형시키는 것이 바람직하다. 특정 구현예에서, 두 가닥(또는 부분)은 상이한 변형을 포함한다. 특정 구현예에서, 두 가닥은 동일한 변형을 포함한다. 당업자는 본 발명의 방법에 의해 가능해진 변형의 정도 및 유형은, 변형의 수많은 치환이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 변형의 예는 본원에 기재되어 있으며 제한하려는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 어구 "안티센스 가닥"은 관심 대상의 타겟 서열에 실질적으로 또는 100% 상보적인 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 어구 "안티센스 가닥" 및 "가이드 가닥"은 헤어핀 또는 덤벨 타입 구조를 형성할 수 있는 단분자성 올리고뉴클레오티드뿐만 아니라, 두 개의 별개의 가닥으로부터 형성된 올리고뉴클레오티드 둘 모두의 안티센스 영역을 포함한다. siRNA와 같은 이중 가닥 RNAi 제제와 관련하여, 안티센스 가닥은, RISC에 우선적으로 혼입되고 RNA 표적의 RISC-매개 넉다운을 표적화하는 가닥이다. 이중 가닥 RNAi 제제와 관련하여, 용어 "안티센스 가닥" 및 "가이드 가닥"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며; 용어 "센스 가닥" 또는 "패신저 가닥"은 안티센스 가닥이 아닌 가닥과 관련하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
어구 "센스 가닥"은 타겟 서열, 예컨대, 메신저 RNA 또는 DNA의 서열과 전부 또는 일부 동일한 뉴클레오시드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
"표적 서열"은 이의 발현 또는 활성이 조절될 임의의 핵산 서열을 의미한다. 표적 핵산은 DNA 또는 RNA, 예컨대 내인성 DNA 또는 RNA, 바이러스 DNA 또는 바이러스 RNA, 또는 유전자, 바이러스, 박테리아, 진균, 포유동물, 또는 식물에 의해 암호화되는 기타 RNA일 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 서열은 질환 또는 장애와 관련이 있다. RNA 간섭 및 RNase H-매개 넉다운과 관련하여, 표적 서열은 일반적으로 RNA 표적 서열이다.
"특이적으로 혼성화할 수 있는" 및 "상보적인"은 핵산이 전형적인 왓슨-크릭 또는 다른 비-전형적인 타입에 의해 또 다른 핵산 서열로 수소 결합(들)을 형성할 수 있다는 것을 의미한다. 본 발명의 핵 분자에 관하여, 이의 상보적 서열을 갖는 핵산 분자에 대한 결합 자유 에너지는 핵산의 관련 기능, 예를 들어, RNAi 활성을 진행시킬 수 있기에 충분하다. 핵산 분자에 대한 결합 자유 에너지의 측정은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Turner et al, 1987, CSH Symp. Quant. Biol. LII pp.123-133; Frier et al., 1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-9377; Turner et al., 1987, J. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785] 참조).
상보성 백분율은 제2 핵산 서열과 수소 결합(예를 들어, 왓슨-크릭 염기쌍)을 형성할 수 있는 핵산 분자에서 인접 잔기의 백분율을 지칭한다(예를 들어, 10개 중 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개가 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 100% 상보성임). "완전 상보성" 또는 100% 상보성은 핵산 서열의 인접 잔기 모두가 제2 핵산 서열에서 동일한 수의 인접 잔기와 수소 결합할 것임을 의미한다. 완전 상보성보다 적은은 두 가닥의 뉴클레오시드 단위 전부는 아니지만 일부가 서로 수소 결합할 수 있는 상황을 지칭한다. "실질적으로 상보적인"은 비상보적이 되도록 선택되는 오버행과 같은 폴리뉴클레오티드 가닥의 영역을 배제하고 90% 이상 상보성을 나타내는 폴리뉴클레오티드 가닥을 지칭한다. 특이적 결합은 특이적 결합이 요망되는 조건 하에, 즉, 생체내 검정 또는 치료적 처지의 경우에 생리학적 조건 하에, 또는 시험관내 검정의 경우에 검정이 수행되는 조건 하에 비-표적 서열에 대한 올리고머 화합물의 비-특이적 결합을 방지하도록 충분한 정도의 상보성을 필요로 한다. 특정 구현예에서, 비-표적 서열은 상응하는 표적 서열과 적어도 5개의 뉴클레오티드가 상이하다.
치료제로서 사용될 때, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 제약 조성물로서 투여된다. 특정 구현예에서, 제약 조성물은 치료적 유효량의 제공된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 제약상 허용가능한 염, 및 제약상 허용가능한 희석제, 제약상 허용가능한 부형제 및 제약상 허용가능한 담체로부터 선택되는 하나 이상의 제약상 허용가능한 불활성 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 제약 조성물은 정맥내 주사, 경구 투여, 협측 투여, 흡입, 코 투여, 국소 투여, 안투여, 또는 귀 투여용으로 제형화된다. 추가 구현예에서, 제약 조성물은 정제, 환제, 캡슐, 리퀴드, 흡입제, 코 스프레이 용액, 좌제, 현탁액, 겔, 콜로이드, 분산액, 현탁액, 용액, 에멀젼, 연고, 로션, 점안제, 또는 점이제이다.
10. 올리고뉴클레오티드 및 조성물의 투여
당업계에 공지된 다양한 기술을 포함하여, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드 및 이의 조성물(전형적으로 치료 목적을 위한 제약 조성물)을 투여하기 위한 많은 전달 방법, 요법 등이 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 조성물, 예를 들어, dsRNAi 올리고뉴클레오티드 조성물은 비견되는 기준 ds 올리고뉴클레오티드 조성물보다 더 낮은 용량 및/또는 빈도로 투여되고 비견하거나 개선된 효과를 갖는다. 특정 구현예에서, 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 예를 들어 표적 전사체의 넉다운을 개선하는 데 있어서 비견되는, 그렇지 않으면 동일한 입체무작위 기준 ds 올리고뉴클레오티드 조성물의 용량 및/또는 빈도보다 더 낮은 용량 및/또는 빈도로, 비견되거나 개선된 효과를 가지고서 투여된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 ds 올리고뉴클레오티드 및 이의 조성물의 특성 및 활성, 예를 들어 넉다운 활성, 안정성, 독성 등을 화학적 변형 및/또는 입체화학에 의해 조절 및 최적화할 수 있음을 인식한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 화학적 변형 및/또는 입체화학을 통해 ds 올리고뉴클레오티드의 특성 및/또는 활성을 최적화하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 개선된 특성 및/또는 활성을 갖는 ds 올리고뉴클레오티드 및 이의 조성물을 제공한다. 임의의 이론에 구애되고자 함이 없이, 예를 들어 더 우수한 활성, 안정성, 전달, 분포, 독성, 약동학, 약력학 및/또는 효능 프로파일로 인해, 본 출원인은 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드 및 이의 조성물이 비견되거나 더 우수한 효능을 달성하기 위해 더 낮은 투여량 및/또는 감소된 빈도로 투여될 수 있고, 특정 구현예에서, 향상된 효과를 제공하기 위해 더 높은 투여량 및/또는 증가된 빈도로 투여될 수 있음을 주지하고 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 공통 염기 서열을 공유하는 복수의 ds 올리고뉴클레오티드를 포함하는 ds 올리고뉴클레오티드 조성물을 투여하는 방법에서, 동일 공통 염기 서열의 기준 ds 올리고뉴클레오티드 조성물에 비해 개선된 전달을 특징으로 하는 복수의 ds 올리고뉴클레오티드를 포함하는 ds 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는 개선을 제공한다.
특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드, 조성물 및 방법은 개선된 전달을 제공한다. 특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드, 조성물 및 방법은 개선된 세포질 전달을 제공한다. 특정 구현예에서, 개선된 전달은 세포 집단에 대한 것이다. 특정 구현예에서, 개선된 전달은 조직에 대한 것이다. 특정 구현예에서, 개선된 전달은 기관에 대한 것이다. 특정 구현예에서, 개선된 전달은 유기체, 예를 들어 환자 또는 대상체에 대한 것이다. 개선된 전달을 제공하는 예시적인 구조적 요소(예를 들어, 화학적 변형, 입체화학, 이들의 조합 등), 올리고뉴클레오티드, 조성물 및 방법이 본 발명에 광범위하게 기술되어 있다.
다양한 투약 요법을 이용하여 본 발명의 ds 올리고뉴클레오티드 및 조성물을 투여할 수 있다. 특정 구현예에서, 다중 단위 용량이 기간에 의해 분리되어 투여된다. 특정 구현예에서, 주어진 조성물은 하나 이상의 용량을 포함할 수 있는 권장된 투여 요법을 갖는다. 특정 구현예에서, 투여 요법은 각각이 동일한 길이의 기간만큼 서로 분리되어 있는 복수의 용량을 포함하고; 특정 구현예에서, 투여 요법은 복수의 용량 및 개별 용량을 분리하는 적어도 2개의 상이한 기간을 포함한다. 특정 구현예에서, 투여 요법 내의 모든 용량은 동일한 단위 용량의 양이다. 특정 구현예에서, 투여 요법 내의 상이한 용량은 상이한 양이다. 특정 구현예에서, 투여 요법은 제1 용량 양의 제1 용량에 이어, 제1 용량 양과 상이한 제2 용량 양의 하나 이상의 추가 용량을 포함한다. 특정 구현예에서, 투약 요법은 제1 용량 양의 제1 용량에 이어, 제1 용량(또는 또 다른 이전의 용량) 양과 동일하거나 상이한 제2(또는 후속) 용량 양의 하나 이상의 추가 용량을 포함한다. 특정 구현예에서, 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 동일 서열의 키랄 비제어(예를 들어, 입체무작위) ds 올리고뉴클레오티드 조성물, 및/또는 동일 서열의 상이한 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물에 사용되는 것과는 상이한 투약 요법에 따라 투여된다. 특정 구현예에서, 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물은, 주어진 단위의 시간에 걸쳐 더 낮은 수준의 총 노출을 달성하고/하거나, 하나 이상의 더 낮은 단위 용량을 포함하고/하거나, 주어진 단위의 시간에 걸쳐 더 적은 수의 투약을 포함한다는 점에서 동일 서열의 키랄 비제어(예를 들어, 입체무작위) ds 올리고뉴클레오티드 조성물의 것과 비교하여 감소된 투약 요법에 따라 투여된다. 이론에 의해 제한되고자 함이 없이, 본 출원인은 특정 구현예에서, 더 짧은 투여 요법 및/또는 더 긴 투여 간격이 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물의 개선된 안전성, 생체이용률, 및/또는 효능 때문일 수 있음을 주지하고 있다. 특정 구현예에서, 개선된 전달성(및 기타 특성) 덕분에, 제공된 조성물은 더 낮은 투여량 및/또는 더 낮은 빈도로 투여되어 생물학적 효과, 예를 들어, 임상 효능을 달성할 수 있다.
11. 제약 조성물
치료제로서 사용될 때, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 제약 조성물로서 투여된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 제공된 화합물, 예를 들어 ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 제약상 허용가능한 염 및 제약 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 치료 및 임상 목적을 위해, 본 발명의 ds 올리고뉴클레오티드는 제약 조성물로서 제공된다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명의 ds 올리고뉴클레오티드는 이의 산, 염기 또는 염 형태로 제공될 수 있다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 산 형태, 예를 들어 천연 포스페이트 연결의 경우 -OP(O)(OH)O- 형태일 수 있고; 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결의 경우 -OP(O)(SH)O- 형태일 수 있으며; 기타 등등이다. 특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 염 형태, 예를 들어 천연 포스페이트 연결의 경우 나트륨 염에서 -OP(O)(ONa)O- 형태일 수 있고; 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결의 경우 나트륨 염에서 -OP(O)(SNa)O- 형태일 수 있고; 기타 등등이다. 달리 언급되지 않는 한, 본 발명의 ds 올리고뉴클레오티드는 산, 염기 및/또는 염 형태로 존재할 수 있다.
특정 구현예에서, 제약 조성물은 액체 조성물이다. 특정 구현예에서, 적합한 용매, 예를 들어 물 또는 제약상 허용가능한 완충제를 사용하여 고체 ds 올리고뉴클레오티드 조성물을 용해시키거나 농축된 ds 올리고뉴클레오티드 조성물을 희석함으로써 제약 조성물이 제공된다. 특정 구현예에서, 액체 조성물은 제공된 ds 올리고뉴클레오티드의 음이온 형태 및 하나 이상의 양이온을 포함한다. 특정 구현예에서, 액체 조성물은 약산성, 약 중성, 또는 염기성 범위의 pH 값을 갖는다. 특정 구현예에서, 액체 조성물의 pH는 약 생리학적 pH, 예를 들어 약 7.4이다.
특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 이의 표적을 발현하는 신체 세포 및/또는 조직에 투여 및/또는 접촉하기 위한 것으로 제형화된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 제공된 dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 신체 세포 및/또는 조직에 투여하기 위한 것으로 제형화된다. 특정 구현예에서 이러한 체세포 및/또는 조직은 면역세포, 혈액세포, 심장세포, 폐세포, 근육세포, 시신경세포, 간세포, 신장세포, 뇌세포, 중추 신경계 세포, 또는 말초 신경계 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 이러한 신체 세포 및/또는 조직은 간의 뉴런 또는 세포 및/또는 조직이다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드 및 조성물의 광범위한 분포는 뇌실질내 투여, 척추강내 투여, 또는 뇌실내 투여에 의해 달성될 수 있다. 특정 구현예에서, 제약 조성물은 정맥내 주사, 경구 투여, 협측 투여, 흡입, 코 투여, 국소 투여, 안투여 또는 귀 투여용으로 제형화된다. 특정 구현예에서, 제약 조성물은 정제, 환제, 캡슐, 리퀴드, 흡입제, 코 스프레이 용액, 좌제, 현탁액, 겔, 콜로이드, 분산액, 현탁액, 용액, 에멀젼, 연고, 로션, 점안제, 또는 점이제이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 제약상 허용가능한 불활성 성분(예를 들어, 제약상 허용가능한 부형제, 제약상 허용가능한 담체 등)과 혼합된 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드 또는 이의 조성물을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 당업자는 제약 조성물이 제공된 ds 올리고뉴클레오티드 또는 조성물의 제약상 허용가능한 염을 포함한다는 것을 인식할 것이다. 특정 구현예에서, 제약 조성물은 키랄 제어 ds 올리고뉴클레오티드 조성물이다. 특정 구현예에서, 제약 조성물은 입체순수 ds 올리고뉴클레오티드 조성물이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 ds 올리고뉴클레오티드의 염 및 이의 제약 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 염은 제약상 허용가능한 염이다. 특정 구현예에서, 제약 조성물은 선택적으로 이의 염 형태인 ds 올리고뉴클레오티드, 및 나트륨 염을 포함한다. 특정 구현예에서, 제약 조성물은 임의로 이의 염 형태인 올리고뉴클레오티드, 및 염화나트륨을 포함한다. 특정 구현예에서, (예를 들어, 수성 용액, 제약 조성물 등의 조건 하에서) 염기에 공여될 수 있는 ds 올리고뉴클레오티드의 각각의 수소 이온은 비-H+ 양이온으로 대체된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드의 제약상 허용가능한 염은 전부-금속 이온 염이며, 여기서 각각의 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, 천연 포스페이트 연결, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 등)의 각각의 수소 이온(예를 들어, -OH, -SH 등의 것)은 금속 이온으로 대체된다. 제약 조성물을 위한 다양한 적합한 금속 염이 당업계에 널리 공지되어 있고 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 제약상 허용가능한 염은 소듐 염이다. 특정 구현예에서, 제약상 허용가능한 염은 마그네슘 염이다. 특정 구현예에서, 제약상 허용가능한 염은 칼슘 염이다. 특정 구현예에서, 제약상 허용가능한 염은 포타슘 염이다. 특정 구현예에서, 제약상 허용가능한 염은 암모늄 염(양이온 N(R)4 +)이다. 특정 구현예에서, 제약상 허용가능한 염은 하나 이하의 유형의 양이온을 포함한다. 특정 구현예에서, 제약상 허용가능한 염은 2가지 이상의 유형의 양이온을 포함한다. 특정 구현예에서, 양이온은 Li+, Na+, K+, Mg2 +, 또는 Ca2 +이다. 특정 구현예에서, 제약상 허용가능한 염은 전부-나트륨 염이다. 특정 구현예에서, 제약상 허용가능한 염은 전부-나트륨 염이며, 여기서, 만약 있다면, 천연 포스페이트 연결(산 형태 -O-P(O)(OH)-O-)인 각각의 뉴클레오티드간 연결은 이의 나트륨 염 형태(-O-P(O)(ONa)-O-)로 존재하며, 만약 있다면, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결(산 형태 -O-P(O)(SH)-O-)인 각각의 뉴클레오티드간 연결은 이의 나트륨 염 형태(-O-P(O)(SNa)-O-)로 존재한다.
핵산 및/또는 올리고뉴클레오티드를 전달하기 위한 다양한 기술이 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 예를 들어, 다양한 초분자 나노캐리어를 사용하여 핵산을 전달할 수 있다. 예시적인 나노캐리어는 리포솜, 양이온성 중합체 착물 및 다양한 중합체성 화합물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 다양한 폴리양이온에 의한 핵산의 착물화는 세포내 전달을 위한 또 다른 접근법이며; 이는 페길화된 폴리양이온, 폴리에틸렌아민(PEI) 착물, 양이온성 블록 공중합체, 및 덴드리머의 사용을 포함한다. PEI 및 폴리아미도아민 덴드리머를 포함한 몇몇 양이온성 나노캐리어는 엔도솜으로부터 내용물을 방출하는 것을 돕는다. 다른 접근법은 중합체자 나노입자, 미소구체, 리포솜, 덴드리머, 생분해성 중합체, 콘쥬게이트, 프로드러그, 무기 콜로이드, 예컨대 황 또는 철, 항체, 임플란트, 생분해성 임플란트, 생분해성 미소구체, 삼투압 제어 임플란트, 지질 나노입자, 에멀젼, 유성 용액, 수성 용액, 생분해성 중합체, 폴리(락티드-코글리콜산), 폴리(락트산), 리퀴드 데포, 중합체 미셀, 양자점 및 리포플렉스의 사용을 포함한다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드는 또 다른 분자에 접합된다.
치료 및/또는 진단 응용에서, 본 발명의 화합물, 예를 들어, ds 올리고뉴클레오티드는 전신 및 국소 또는 국부 투여를 포함하는 다양한 투여 방식을 위하여 제형화될 수 있다. 기술 및 제형은 일반적으로 문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy (20th ed. 2000)]에서 찾을 수 있다.
염기성 모이어티에 대한 제약상 허용가능한 염은 일반적으로 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 아세테이트, 벤젠술포네이트, 베실레이트, 벤조에이트, 바이카보네이트, 바이타르트레이트, 브로마이드, 칼슘 에데테이트, 칸실레이트, 카보네이트, 시트레이트, 에데테이트, 에디실레이트, 에스톨레이트, 에실레이트, 푸마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루타메이트, 글리콜릴라르사닐레이트, 헥실레소르시네이트, 하이드라바민, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 하이드록시나프토에이트, 요오다이드, 이세티오네이트, 락테이트, 락토비오네이트, 말레이트, 말레에이트, 만델레이트, 메실레이트, 뮤케이트, 납실레이트, 니트레이트, 파모에이트(엠보네이트), 판토테네이트, 포스페이트/디포스페이트, 폴리갈락투로네이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 수브아세테이트, 숙시네이트, 설페이트, 탄네이트, 타르트레이트, 또는 테오클레이트를 포함한다. 다른 제약상 허용가능한 염은 예를 들어, 문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy (20th ed. 2000)]에서 찾을 수 있다. 바람직한 제약상 허용가능한 염은 예를 들어 아세테이트, 벤조에이트, 브로마이드, 카보네이트, 시트레이트, 글루코네이트, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 말레에이트, 메실레이트, 납실레이트, 파모에이트(엠보네이트), 포스페이트, 살리실레이트, 숙시네이트, 술페이트 또는 타르트레이트를 포함한다.
특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 WO 2005/060697, WO 2011/076807, 또는 WO 2014/136086에 기술된 제약 조성물로 제형화된다.
치료되는 특정 병태, 장애, 또는 질환에 따라, 제공된 약제, 예를 들어, ds 올리고뉴클레오티드는 액체 또는 고체 투여 형태로 제형화되고 전신 또는 국소 투여될 수 있다. 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 당업자에게 공지된 바와 같이 정시 또는 지속 저 방출 형태로 전달될 수 있다. 제형화 및 투여 기술은 문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy (20th ed. 2000)]에서 찾을 수 있다. 적합한 경로는 경구, 협측, 흡입 스프레이, 설하, 직장, 경피, 질, 경점막, 비강 또는 장 투여; 근육내, 피하, 수내 주사와, 척수강내, 직접적 뇌실내, 정맥내, 관절내, 흉골내, 활액내, 간내, 병변내, 두개내, 복강내, 비강내 또는 안내 주사를 비롯한 비경구 전달 또는 또 다른 전달 방식을 포함한다.
주사를 위해, 제공된 약제, 예를 들어 올리고뉴클레오티드는 수성 용액, 예컨대 생리학적으로 상용성인 완충액, 예컨대 행크액(Hank's solution), 링거액 또는 생리 식염수 완충액 중에서 제형화되고 희석될 수 있다. 이러한 경점막 투여를 위해, 침투될 장벽에 적절한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
다양한 투여 방식에 적합한 투여량으로 본 발명을 실시하기 위한 화합물, 예를 들어 제공된 ds 올리고뉴클레오티드를 제형화하기 위한 제약상 허용가능한 담체의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 담체의 적절한 선택 및 적합한 제조 관행에 의해, 본 발명의 조성물, 예를 들어 용액으로 제형화된 조성물은 다양한 경로를 통하여, 예를 들어 비경구적으로, 예컨대 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 다음 중 임의의 것 또는 다음의 것 모두를 추가로 포함한다: 염화칼슘 이수화물, 염화마그네슘 육수화물, 염화칼륨, 염화나트륨, 무수 제이인산나트륨, 제일인산나트륨 이수화물, 및/또는 주사용 물. 특정 구현예에서, 조성물은 다음 중 임의의 것 또는 다음의 것 모두를 추가로 포함한다: 염화칼슘 이수화물(0.21 mg) USP, 염화마그네슘 육수화물(0.16 mg) USP, 염화칼륨(0.22 mg) USP, 염화나트륨(8.77 mg) USP, 무수 제이인산나트륨(0.10 mg) USP, 제일인산나트륨 이수화물(0.05 mg) USP, 및 주사용 물 USP.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 다음 중 임의의 것 또는 다음의 것 모두를 추가로 포함한다: 콜레스테롤, (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노) 부타노에이트(DLin-MC3-DMA), 1,2-디스테아로일-sn- 글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 알파-(3'-{[1,2-디(미리스틸옥시)프로판옥시]카보닐아미노}프로필)-오메가-메톡시, 폴리옥시에틸렌(PEG2000-C-DMG), 무수 제일인산칼륨 NF, 염화나트륨, 제이인산나트륨 칠수화물, 및 주사용 물. 특정 구현예에서, RNAi 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물의 pH는 약 7.0이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 다음 중 임의의 것 또는 다음의 것 모두를 추가로 포함한다: 6.2 mg의 콜레스테롤 USP, 13.0 mg의 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노) 부타노에이트(DLin-MC3-DMA), 3.3 mg의 1 ,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1.6 mg의 α-(3'-{[1,2-디(미리스틸옥시)프로판옥시]카보닐아미노}프로필)-ω-메톡시, 폴리옥시에틸렌(PEG2000-C-DMG), 0.2 mg의 무수 제일인산칼륨 NF, 8.8 mg의 염화나트륨 USP, 2.3 mg의 제이인산나트륨 칠수화물 USP, 및 주사용 물 USP(대략 1 mL의 총 부피).
제공된 화합물, 예를 들어, ds 올리고뉴클레오티드는 당해 분야에 잘 알려진 제약상 허용가능한 담체를 사용하여 경구 투여에 적합한 투여량으로 용이하게 제형화될 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 담체는 제공된 올리고뉴클레오티드가 예를 들어 치료받을 대상체(예를 들어, 환자)에 의한 경구 섭취를 위해 정제, 환제, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화될 수 있게 한다.
코 또는 흡입 전달을 위해, 제공된 화합물, 예를 들어 ds 올리고뉴클레오티드는 당업자에게 공지된 방법에 의해 제형화될 수 있으며, 예를 들어, 가용화, 희석 또는 분산 물질의 예, 예컨대, 식염수, 방부제, 예컨대 벤질 알코올, 흡수 촉진제, 및 플루오로카본을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 볼루스 주사에 의한 것과 같은 제공된 화합물, 예를 들어 ds 올리고뉴클레오티드의 특이적 국소화 방법은 중위 유효 농도(EC50)를 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50배만큼 감소시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 표적화된 조직은 뇌 조직이다. 특정 구현예에서, 표적화된 조직은 선조체 조직이다. 특정 구현예에서, EC50의 감소는 이를 필요로 하는 환자에서 약리학적 결과를 달성하는 데 필요한 용량을 감소시키기 때문에 바람직하다.
특정 구현예에서, 제공된 ds 올리고뉴클레오티드는 매월, 2개월마다, 90일마다, 3개월마다, 6개월마다, 1년에 2회 또는 1년에 1회 주사 또는 주입에 의해 전달된다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 제약 조성물은 활성 성분, 예를 들어 ds 올리고뉴클레오티드가 의도된 목적을 달성하기 위한 유효량으로 함유된 조성물을 포함한다. 유효량의 결정은 특히 본원에 제공된 상세한 개시 내용에 비추어 당업자의 능력 내에 있다.
활성 성분에 더하여, 제약 조성물은 활성 화합물을 제약상 사용될 수 있는 제제로 가공하는 것을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 적합한 제약상 허용가능한 담체를 함유할 수 있다. 경구 투여용으로 제형화된 제제는 정제, 당의정, 캡슐, 또는 용액의 형태일 수 있다.
특정 구현예에서, 경구용 제약 조성물은 활성 화합물을 고체 부형제와 조합하고, 임의로, 생성된 혼합물을 분쇄하고, 원할 경우 적합한 보조제를 첨가한 후 과립의 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 수득함으로써 얻어질 수 있다. 적합한 부형제는 특히 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함하는 당과 같은 충전제; 셀룰로스 제제, 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트래거캔스, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로스, 소듐 카복시메틸-셀룰로스(CMC), 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP: 포비돈)이다. 원하는 경우, 붕해제, 예컨대 가교 폴리비닐피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 이의 염, 예컨대 알긴산나트륨이 첨가될 수 있다.
특정 구현예에서, 당의정 코어에는 적합한 코팅이 제공된다. 이 목적을 위해, 임의로 검 아라빅, 활석, 폴리비닐피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및/또는 이산화티타늄, 래커 용액 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있는 농축 당 용액이 사용될 수 있다. 활성 화합물 용량의 상이한 조합을 확인하거나 특성화하기 위해 염료 또는 안료가 정제 또는 당의정 코팅에 첨가될 수 있다.
경구로 사용될 수 있는 제약 제제는 젤라틴으로 만들어진 푸시-피트(push-fit) 캡슐과, 젤라틴 및 가소제, 예컨대 글리세롤 또는 소르비톨로 만들어진 연질, 밀봉 캡슐을 포함한다. 푸시-피트 캡슐은 활성 성분, 예를 들어 ds 올리고뉴클레오티드를 락토스와 같은 충전제, 전분과 같은 결합제, 및/또는 활석 또는 스테아르산마그네슘과 같은 활택제 및 선택적으로 안정화제와의 혼합물 형태로 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물, 예를 들어 ds 올리고뉴클레오티드는 적합한 액체, 예컨대 지방 오일, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 용해 또는 현탁될 수 있다. 또한, 안정화제가 첨가될 수 있다.
특정 구현예에서, 제공된 조성물은 지질을 포함한다. 특정 구현예에서, 지질은 활성 화합물, 예를 들어 올리고뉴클레오티드에 접합된다. 특정 구현예에서, 지질은 활성 화합물에 접합되지 않는다. 특정 구현예에서, 지질은 C10-C40 선형, 포화, 또는 부분 불포화 지방족 사슬을 포함한다. 특정 구현예에서, 지질은 하나 이상의 C1-4 지방족 기로 임의로 치환된, C10-C40 선형, 포화, 또는 부분 불포화 지방족 사슬을 포함한다. 특정 구현예에서, 지질은 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 감마-리놀렌산, 도코사헥사엔산 (시스-DHA), 투르비나르산 및 디리놀레일 알코올로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 활성 화합물은 제공된 올리고뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 조성물은 지질 및 활성 화합물을 포함하고, 표적화 화합물 또는 모이어티 또는 또 다른 지질인 또 다른 성분을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 지질은 아미노 지질; 양친매성 지질; 음이온성 지질; 아포지단백질; 양이온성 지질; 저분자량 양이온성 지질; CLinDMA 및 DLinDMA와 같은 양이온성 지질; 이온화가능한 양이온성 지질; 클로킹(cloaking) 성분; 헬퍼 지질; 리포펩티드; 중성 지질; 중성 쯔비터이온성 지질; 소수성 소분자; 소수성 비타민; PEG-지질; 하나 이상의 친수성 중합체로 변형된 하전되지 않은 지질; 인지질; 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민과 같은 인지질; 스텔스 지질; 스테롤; 콜레스테롤; 표적화 지질; 또는 제약 용도에 적합한 본원에 기술되거나 당업계에 보고된 또 다른 지질이다. 특정 구현예에서, 조성물은 지질 및 또 다른 지질의 하나 이상의 기능을 매개할 수 있는 또 다른 지질의 일부를 포함한다. 특정 구현예에서, 표적화 화합물 또는 모이어티는 화합물(예를 들어, ds 올리고뉴클레오티드)을 특정 세포 또는 조직 또는 세포 또는 조직의 하위세트로 표적화할 수 있다. 특정 구현예에서, 표적화 모이어티는 특정 표적, 수용체, 단백질, 또는 또 다른 세포내 성분(subcellular component)의 세포- 또는 조직-특이적 발현을 이용하도록 설계된다. 특정 구현예에서, 표적화 모이어티는 조성물을 세포 또는 조직에 표적화하고/하거나 표적, 수용체, 단백질 또는 또 다른 세포내 성분에 결합하는 리간드(예를 들어, 소분자, 항체, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 압타머 등)이다.
활성 화합물, 예를 들어 ds 올리고뉴클레오티드의 전달을 위한 특정한 예시적 지질은 활성 화합물의 기능을 허용한다(예를 들어, 상기 기능을 막지 않거나 방해하지 않는다). 특정 구현예에서, 지질은 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 감마-리놀렌산, 도코사헥사엔산(시스-DHA), 투르비나르산 또는 디리놀레일 알코올이다.
본 발명에 기술된 바와 같이, 지방산과의 접합과 같은 지질 접합은 ds 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 특성을 개선시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 활성 화합물, 예를 들어 ds 올리고뉴클레오티드의 전달을 위한 조성물은 원하는 대로 활성 화합물을 특정 세포 또는 조직으로 표적화할 수 있다. 특정 구현예에서, 활성 화합물 전달용 조성물은 활성 화합물을 근육 세포 또는 조직으로 표적화할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 활성 화합물의 전달과 관련된 조성물 및 방법을 제공하며, 여기서 조성물은 활성 화합물 및 지질을 포함한다. 간 세포 또는 조직에 대한 다양한 구현예, 지질은 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 감마-리놀렌산, 도코사헥사엔산(시스-DHA), 투르비나르산 및 디리놀레일 알코올로부터 선택된다.
특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 핵산을 중추신경계 또는 간계, 또는 세포 또는 조직 또는 이의 일부로 전달하도록 디자인된 전달 방법 또는 조성물을 통해, 중추신경계 또는 간계, 또는 세포 또는 조직 또는 이의 일부로 전달된다.
특정 구현예에서, dsRNAi 올리고뉴클레오티드는 다음 중 임의의 하나 이상을 포함하는 조성물 또는 다음 중 임의의 하나 이상의 용도를 수반하는 전달 방법을 통해 전달된다: 트랜스페린 수용체 표적 나노입자; 양이온성 리포솜 기반 전달 전략; 양이온성 리포솜; 고분자 나노입자; 바이러스 담체; 레트로바이러스; 아데노 관련 바이러스; 안정한 핵산 지질 입자; 고분자; 세포 투과 펩티드; 지질; 덴드리머; 중성 지질; 콜레스테롤; 지질 유사 분자; 융합생성 지질; 친수성 분자; 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 유도체; 차폐 지질; 페길화된 지질; PEG-C-DMSO; PEG-C-DMSA; DSPC; 이온화 지질; 구아니디늄계 콜레스테롤 유도체; 이온코팅 나노입자; 금속이온 코팅 나노입자; 망간이온코팅 나노입자; 안구빈딘-1; 나노겔; 분지형 핵산 구조로의 dsRNAi의 혼입; 및/또는 2, 3, 4개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 분지형 핵산 구조로의 dsRNAi의 혼입.
특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 동결건조된다. 특정 구현예에서, ds 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 동결건조되고, 동결건조된 ds 올리고뉴클레오티드는 바이알 내에 있다. 특정 구현예에서, 바이알은 질소로 다시 충전된다. 특정 구현예에서, 동결건조된 ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 투여 전에 재구성된다. 특정 구현예에서, 동결건조된 ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 투여 전에 염화나트륨 용액으로 재구성된다. 특정 구현예에서, 동결건조된 ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 투여 전에 0.9% 염화나트륨 용액으로 재구성된다. 특정 구현예에서, 재구성은 투여를 위한 임상 부위에서 일어난다. 특정 구현예에서, 동결건조된 조성물에서, ds 올리고뉴클레오티드 조성물은 키랄 제어되거나 적어도 하나의 키랄 제어 뉴클레오티드간 연결 및/또는 ds 올리고뉴클레오티드 표적을 포함한다.
II. 실시예
제공된 올리고뉴클레오티드 및 이의 조성물의 특성 및/또는 활성을 평가하기 위해 다양한 기술이 이용될 수 있다. 일부의 이러한 기술이 본 실시예에 기술되어 있다. 당업자는 다른 많은 기술이 용이하게 이용될 수 있음을 인식한다. 본원에서 입증된 바와 같이, 제공된 올리고뉴클레오티드 및 조성물은 특히, 예를 들어 이의 표적 핵산의 수준을 감소시키는 데 있어서 고도의 활성을 가질 수 있다.
제공된 기술(화합물(올리고뉴클레오티드, 시약 등), 조성물, 방법(제조 방법, 사용 방법, 평가 방법 등) 등)의 특정 실시예를 본원에 제시하였다.
실시예 1. 올리고뉴클레오티드 합성
올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 조성물(입체무작위 및 키랄 제어 둘 다)을 제조하기 위한 다양한 기술은 예를 들어, US 9394333, US 9744183, US 9605019, US 9598458, US 9982257, US 10160969, US 10479995, US 2020/0056173, US 2018/0216107, US 2019/0127733, US 10450568, US 2019/0077817, US 2019/0249173, US 2019/0375774, WO 2018/223056, WO 2018/223073, WO 2018/223081, WO 2018/237194, WO 2019/032607, WO 2019/055951, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, 및/또는 WO 2019/032612에 기재된 방법 및 시약을 포함하여, 알려져 있고 본 발명에 따라 사용될 수 있고, 각각의 방법 및 시약은 본원에 참조로 포함된다. 입체무작위 및 키랄 제어 가이드 가닥 서열은 앞서 언급된 개시 내용의 예시된 바와 같이 합성 절차를 사용하여 제조하였다. 각각의 패신저 가닥은 서열의 양쪽 말단에서 전달 비히클로 GalNAc 모이어티를 공유 연결하도록 설계하였다. 5'-GalNAc 변형이 있는 올리고뉴클레오티드는 서열의 5'-말단에서 C6-아미노 변형자 링커를 결합하여 합성하였다. 전달 비히클로 3'-GalNAc 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드는 3'-C6 아미노 변형 지지체를 이용하여 합성하였다. 앞선 개시 내용에 예시된 바와 같이 탈보호 조건을 사용하여 CPG로부터 단일 가닥을 절단하였다. 미정제 올리고뉴클레오티드를 함유하는 생성된 아미노 기를 염화나트륨 구배를 사용하는 AKTA 순수 시스템 상의 이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 목적 생성물을 탈염하고 추가로 GalNAc 산과의 접합에 사용하였다. 접합 반응이 완료된 것으로 확인된 후, 물질을 이온 교환 크로마토그래피로 추가로 정제하고 탈염하여 목적 물질을 수득하였다. 가이드 가닥 및 패신저 가닥에 PN 연결을 도입하기 위해 WO2019/200185에 예시된 조건을 활용하여 올리고뉴클레오티드 서열의 목적 위치에 특정 PN 커플링 사이클을 도입하였다.
특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적합한 키랄 보조제, 예를 들어 DPSE 및 PSM 키랄 보조제를 사용하여 제조되었다. 다양한 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 표 1A-1D의 것들 및 이들의 조성물은 본 발명에 따라 제조되었다.
제공된 올리고뉴클레오티드 및 이의 조성물의 특성 및/또는 활성을 평가하기 위해 다양한 기술이 이용될 수 있다. 일부의 이러한 기술이 본 실시예에 기술되어 있다. 당업자는 다른 많은 기술이 용이하게 이용될 수 있음을 인식한다. 본원에서 입증된 바와 같이, 제공된 올리고뉴클레오티드 및 조성물은 특히, 예를 들어 이의 표적 핵산의 수준을 감소시키는 데 있어서 고도의 활성을 가질 수 있다.
실시예 2. 제공된 올리고뉴클레오티드 및 조성물은 시험관내에서 마우스 트랜스티레틴 (mTTR) 및 마우스 인자 VII(mF7)를 효과적으로 넉다운시킬 수 있다.
마우스 TTR 또는 인자 VII에 대한 다양한 siRNA를 설계하고 구성하였다. 다수의 siRNA를 하나 또는 일정 범위의 농도로 마우스 원발성 간세포에서 시험관 내에서 테스트하였다. 일부 siRNA를 마우스(예를 들어, C57BL6 야생형 마우스)에서 테스트하였다.
siRNA 활성의 시험관내 측정을 위한 예시 프로토콜: siRNA 활성 측정을 위해, 특정 농도의 siRNA를 10,000개 세포/웰로 96-웰 플레이트에 플레이팅된 마우스 원발성 간세포에 짐노틱 방식으로 전달하였다. 48시간 처리 후, SV96 Total RNA Isolation 키트(Promega)를 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. RNA 샘플로부터의 cDNA 생성은 제조업체의 설명서에 따라 High-Capacity cDNA Reverse Transcription 키트(Thermo Fisher)를 사용하여 수행하였으며 iQ Multiplex Powermix(Bio-Rad)를 사용하여 CFX 시스템에서 qPCR 분석을 수행하였다. 마우스 TTR mRNA의 경우, 다음의 qPCR 분석을 사용하였다: IDT Taqman qPCR 분석 ID Mm.PT.58.11922308.
마우스 인자 VII mRNA의 경우, 다음의 qPCR 분석을 사용하였다. Thermofisher Taqman qPCR 분석 ID Mm00487332_m1. 마우스 HPRT를 노멀라이저(정방향 5'CAAACTTTGCTTTCCCCTGGTT3', 역방향 5'TGCCTGTATCCAACACTTC3', 프로브 5'/5HEX/ACCAGCAAG/Zen/CTTGCAACCTTAACC/3IABkFQ/3')로서 사용하였다. mRNA 넉다운 수준을 모의 처리 대비 mRNA 잔존 백분율로서 계산하였다.
표 2는 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 TTR mRNA 잔존 백분율(500 pM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D.: 측정되지 않음
　 　 500 pM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율
(mTTR/ mHPRT)-1		 잔존 mRNA 백분율
(mTTR/mHPRT)-2		 평균
WV-20167 WV-28310 40.38 32.27 36.32
WV-20169 WV-28311 42.91 34.94 38.93
WV-20170 WV-28311 28.64 34.78 31.71
WV-20171 WV-28311 25.11 30.15 27.63
WV-20172 WV-28311 27.00 30.52 28.76
WV-20173 WV-28311 54.68 60.68 57.68
WV-20174 WV-28311 36.47 38.24 37.36
WV-20175 WV-28311 46.82 44.90 45.86
WV-20176 WV-28311 41.86 40.67 41.27
WV-20177 WV-28311 50.98 61.96 56.47
WV-20178 WV-28311 28.99 34.79 31.89
WV-20179 WV-28311 28.88 37.07 32.98
WV-20180 WV-28311 　N.D. 11.30 11.30
WV-20181 WV-28311 73.38 72.53 72.95
WV-20182 WV-28311 47.02 51.02 49.02
WV-20183 WV-28311 72.55 60.64 66.59
WV-20184 WV-28311 58.51 57.05 57.78
WV-20169 WV-28312 49.49 39.57 44.53
WV-20170 WV-28312 46.39 37.53 41.96
WV-20171 WV-28312 29.17 24.20 26.68
WV-20172 WV-28312 37.87 31.88 34.87
WV-20173 WV-28312 58.20 58.73 58.46
WV-20174 WV-28312 36.89 41.81 39.35
WV-20175 WV-28312 37.90 45.09 41.49
WV-20176 WV-28312 30.45 35.39 32.92
WV-20177 WV-28312 46.75 58.99 52.87
WV-20178 WV-28312 31.14 41.09 36.11
WV-20179 WV-28312 42.46 50.67 46.57
WV-20180 WV-28312 40.20 42.08 41.14
WV-20181 WV-28312 93.65 98.19 95.92
WV-20182 WV-28312 76.10 71.81 73.96
WV-20183 WV-28312 97.06 88.93 92.99
WV-20184 WV-28312 71.15 70.67 70.91
WV-20169 WV-28313 40.02 49.99 45.01
WV-20170 WV-28313 32.03 35.16 33.59
WV-20171 WV-28313 15.42 22.23 18.82
WV-20172 WV-28313 23.95 25.93 24.94
WV-20173 WV-28313 41.75 55.68 48.71
WV-20174 WV-28313 25.86 36.69 31.28
WV-20175 WV-28313 25.59 46.11 35.85
WV-20176 WV-28313 23.82 34.25 29.03
WV-20177 WV-28313 42.40 57.10 49.75
WV-20178 WV-28313 30.77 39.98 35.37
WV-20179 WV-28313 37.23 51.45 44.34
WV-20180 WV-28313 26.15 41.49 33.82
WV-20181 WV-28313 81.35 99.41 90.38
WV-20182 WV-28313 43.29 60.42 51.85
WV-20183 WV-28313 64.22 　N.D. 64.22
WV-20184 WV-28313 52.24 　N.D. 52.24
WV-20169 WV-28314 28.92 　N.D. 28.92
WV-20170 WV-28314 25.36 　N.D. 25.36
WV-20171 WV-28314 18.05 　N.D. 18.05
WV-20172 WV-28314 20.50 　N.D. 20.50
WV-20173 WV-28314 55.87 　N.D. 55.87
WV-20174 WV-28314 32.63 　N.D. 32.63
WV-20175 WV-28314 33.26 　N.D. 33.26
WV-20176 WV-28314 28.50 　N.D. 28.50
WV-20177 WV-28314 46.98 　N.D. 46.98
WV-20178 WV-28314 24.87 　N.D. 24.87
WV-20179 WV-28314 28.78 　N.D. 28.78
WV-20180 WV-28314 24.43 33.41 28.92
WV-20181 WV-28314 80.17 72.26 76.22
WV-20182 WV-28314 36.55 52.66 44.60
WV-20183 WV-28314 69.35 86.28 77.82
WV-20184 WV-28314 46.26 68.01 57.14
표 3은 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 F7 mRNA 잔존 백분율(150 pM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D.: 측정되지 않음
　 　 150 pM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mF7/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mF7/mHPRT)-2 평균
WV-34349 WV-34350 65.14 48.88 57.01
WV-34351 WV-34367 43.79 39.64 41.71
WV-34352 WV-34367 50.89 46.81 48.85
WV-34353 WV-34367 47.90 47.11 47.50
WV-34354 WV-34367 68.79 82.39 75.59
WV-34355 WV-34367 43.54 69.78 56.66
WV-34356 WV-34367 51.26 68.28 59.77
WV-34357 WV-34367 41.81 49.34 45.57
WV-34358 WV-34367 69.27 66.21 67.74
WV-34359 WV-34367 49.76 58.58 54.17
WV-34360 WV-34367 45.56 64.72 55.14
WV-34361 WV-34367 45.11 50.85 47.98
WV-34362 WV-34367 102.08 124.08 113.08
WV-34363 WV-34367 60.25 85.27 72.76
WV-34364 WV-34367 75.67 101.06 88.37
WV-34365 WV-34367 69.15 63.76 66.45
WV-34366 WV-34367 60.09 46.53 53.31
WV-34351 WV-34368 46.28 48.91 47.60
WV-34352 WV-34368 45.04 53.96 49.50
WV-34353 WV-34368 38.31 61.02 49.67
WV-34354 WV-34368 66.32 94.62 80.47
WV-34355 WV-34368 60.68 88.88 74.78
WV-34356 WV-34368 58.13 79.17 68.65
WV-34357 WV-34368 35.65 48.21 41.93
WV-34358 WV-34368 62.61 68.59 65.60
WV-34359 WV-34368 49.50 53.20 51.35
WV-34360 WV-34368 58.62 67.11 62.87
WV-34361 WV-34368 43.13 82.32 62.72
WV-34362 WV-34368 89.64 133.38 111.51
WV-34363 WV-34368 62.37 100.69 81.53
WV-34364 WV-34368 88.26 104.36 96.31
WV-34365 WV-34368 68.99 69.42 69.21
WV-34366 WV-34368 54.89 52.90 53.90
WV-34351 WV-34369 39.32 44.58 41.95
WV-34352 WV-34369 49.55 52.60 51.08
WV-34353 WV-34369 38.87 59.47 49.17
WV-34354 WV-34369 73.25 96.87 85.06
WV-34355 WV-34369 37.51 80.37 58.94
WV-34356 WV-34369 47.19 68.48 57.83
WV-34357 WV-34369 41.36 45.90 43.63
WV-34358 WV-34369 68.31 54.30 61.31
WV-34359 WV-34369 41.06 40.42 40.74
WV-34360 WV-34369 58.44 57.76 58.10
WV-34361 WV-34369 40.72 61.73 51.22
WV-34362 WV-34369 79.25 100.36 89.80
WV-34363 WV-34369 53.21 78.07 65.64
WV-34364 WV-34369 93.71 114.65 104.18
WV-34365 WV-34369 79.94 73.00 76.47
WV-34366 WV-34369 63.95 56.42 60.19
WV-34351 WV-34370 32.90 38.12 35.51
WV-34352 WV-34370 40.51 43.71 42.11
WV-34353 WV-34370 29.93 48.13 39.03
WV-34354 WV-34370 76.90 94.72 85.81
WV-34355 WV-34370 52.12 74.11 63.11
WV-34356 WV-34370 69.57 77.23 73.40
WV-34357 WV-34370 41.00 38.47 39.74
WV-34358 WV-34370 57.30 62.49 59.89
WV-34359 WV-34370 42.60 36.37 39.48
WV-34360 WV-34370 52.17 62.64 57.40
WV-34361 WV-34370 39.45 43.27 41.36
WV-34362 WV-34370 81.50 86.32 83.91
WV-34363 WV-34370 60.45 56.48 58.47
WV-34364 WV-34370 89.18 95.62 92.40
WV-34365 WV-34370 58.91 50.69 54.80
WV-34366 WV-34370 41.60 39.37 40.48
표 4는 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 TTR mRNA 잔존 백분율(500, 150, 및 50 pM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D.: 측정되지 않음
　 　 500 pM 150 pM 50 pM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-1		 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-2		 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-1		 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-2		 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-1		 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-2		 평균
WV-20167 WV-28310 22.22 6.59 14.40 29.48 21.94 25.71 58.12 47.68 52.90
WV-36831 WV-28310 109.82 114.13 111.98 119.25 122.80 121.02 114.53 130.99 122.76
WV-36832 WV-28310 57.98 38.94 48.46 101.03 80.94 90.98 110.08 99.86 104.97
WV-36833 WV-28310 101.36 　N.D. 101.36 108.87 　　N.D. 108.87 110.39 　　N.D. 110.39
WV-36834 WV-28310 96.91 111.96 104.44 119.42 112.86 116.14 117.68 120.44 119.06
WV-36835 WV-28310 104.97 94.56 99.76 133.50 128.15 130.82 120.56 115.19 117.88
WV-36836 WV-28310 96.51 85.30 90.90 135.00 105.41 120.20 114.44 123.74 119.09
WV-36837 WV-28310 46.94 35.51 41.22 74.49 82.60 78.55 97.29 103.88 100.59
WV-36838 WV-28310 20.95 5.35 13.15 40.83 9.24 25.03 66.52 28.78 47.65
WV-36839 WV-28310 34.07 14.35 24.21 71.33 22.97 47.15 84.87 55.24 70.05
WV-36840 WV-28310 31.35 10.35 20.85 59.08 22.62 40.85 86.17 48.16 67.17
WV-36841 WV-28310 30.04 　　N.D. 30.04 61.36 　　N.D. 61.36 74.19 　　N.D. 74.19
WV-36842 WV-28310 20.16 6.77 13.46 48.02 14.57 31.29 75.48 44.70 60.09
WV-36843 WV-28310 24.49 12.21 18.35 59.84 21.53 40.68 81.30 49.09 65.19
WV-36844 WV-28310 21.68 8.69 15.19 47.21 17.13 32.17 84.38 45.38 64.88
WV-36845 WV-28310 11.20 6.55 8.88 33.74 11.95 22.84 68.59 35.65 52.12
WV-36846 WV-28310 15.27 18.44 16.85 37.87 48.53 43.20 67.42 70.96 69.19
WV-36847 WV-28310 15.04 17.97 16.51 42.44 48.18 45.31 65.69 73.10 69.39
WV-36848 WV-28310 　　N.D. 22.54 22.54 　　N.D. 47.52 47.52 　　N.D. 80.26 80.26
WV-36849 WV-28310 19.70 23.05 21.38 53.22 62.29 57.75 28.14 33.45 30.80
WV-36850 WV-28310 17.11 19.76 18.44 44.30 53.61 48.96 70.96 80.27 75.62
WV-36851 WV-28310 12.92 13.91 13.42 33.72 40.17 36.94 64.14 60.46 62.30
WV-36852 WV-28310 15.56 12.71 14.13 44.60 40.38 42.49 73.03 70.20 71.62
WV-36853 WV-28310 13.76 10.35 12.06 35.83 36.91 36.37 72.69 60.84 66.76
WV-36854 WV-28310 6.78 18.91 12.85 22.57 41.53 32.05 51.62 74.70 63.16
WV-36855 WV-28310 9.52 27.47 18.49 29.51 66.44 47.98 75.55 85.49 80.52
WV-36856 WV-28310 　N.D. 27.95 27.95 　N.D. 61.28 61.28 　N.D. 96.91 96.91
WV-36857 WV-28310 31.39 53.30 42.34 72.19 84.15 78.17 105.17 110.88 108.02
표 5는 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 TTR mRNA 잔존 백분율(500, 150, 및 50 pM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D.: 측정되지 않음
　 　 500 pM 150 pM 50 pM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-1		 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-2		 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-1		 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-1		 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균
WV-20167 WV-28310 10.08 7.51 8.79 24.67 20.11 22.39 33.37 48.14 40.75
WV-20167 WV-36860 8.06 11.00 9.53 25.33 19.35 22.34 48.14 46.24 47.19
WV-20167 WV-36861 8.80 8.69 8.74 31.28 25.15 28.21 62.43 38.86 50.64
WV-36838 WV-28310 15.92 9.65 12.79 32.43 21.28 26.85 47.04 52.61 49.82
WV-20167 WV-38058 12.26 9.79 11.03 42.11 31.88 37.00 76.07 45.21 60.64
WV-20167 WV-38059 11.34 11.38 11.36 34.62 37.11 35.87 70.58 49.21 59.89
WV-20167 WV-38060 15.35 14.04 14.69 41.68 43.36 42.52 76.82 60.03 68.43
WV-20167 WV-38061 15.03 15.46 15.25 39.02 44.24 41.63 69.35 57.06 63.21
WV-20167 WV-38062 20.83 19.31 20.07 29.25 43.66 36.45 77.17 68.49 72.83
WV-20167 WV-38063 14.46 18.71 16.59 28.23 42.18 35.20 61.75 60.94 61.35
WV-20167 WV-38064 14.59 9.34 11.96 27.66 22.07 24.86 53.07 47.44 50.26
WV-20167 WV-38065 25.98 12.58 19.28 46.64 33.51 40.08 65.63 52.02 58.82
WV-20167 WV-38066 22.61 17.76 20.19 50.34 41.48 45.91 67.89 49.85 58.87
WV-20167 WV-38067 37.19 30.41 33.80 48.85 62.55 55.70 68.47 64.60 66.53
WV-20167 WV-38068 67.15 66.08 66.61 92.36 85.59 88.98 121.38 88.36 104.87
WV-20167 WV-38069 25.04 22.34 23.69 52.22 47.48 49.85 58.04 76.38 67.21
WV-20167 WV-38070 22.07 25.88 23.97 41.44 47.80 44.62 70.23 54.36 62.29
WV-20167 WV-38071 17.64 22.17 19.90 27.46 40.44 33.95 41.89 61.33 51.61
WV-20167 WV-38073 13.26 9.01 11.14 26.72 25.57 26.14 35.87 37.96 36.91
WV-20167 WV-38073 16.83 13.56 15.20 33.66 21.23 27.44 53.40 50.83 52.11
WV-20167 WV-38074 17.63 12.14 14.88 39.00 25.29 32.14 48.86 41.36 45.11
WV-20167 WV-38075 17.77 16.60 17.18 48.45 36.40 42.43 67.81 43.58 55.69
WV-20167 WV-38076 23.07 20.46 21.77 39.69 37.45 38.57 56.79 40.72 48.75
WV-20167 WV-38077 25.51 16.02 20.77 57.81 45.60 51.70 72.33 50.94 61.63
WV-20167 WV-38078 23.73 20.69 22.21 43.45 43.57 43.51 66.42 45.57 55.99
WV-20167 WV-38079 17.77 20.17 18.97 30.38 39.19 34.78 66.15 44.95 55.55
실시예 3. 제공된 올리고뉴클레오티드 및 조성물은 생체내에서 활성이다
마우스 TTR siRNA 활성의 생체내 측정: 모든 동물 절차는 Biomere(Worcester, MA)의 IACUC 지침에 따라 수행하였다. 8~10주령의 수컷 C57BL/6 마우스에 제1일에 원하는 올리고뉴클레오티드 농도로 2 또는 6 mg/kg의 용량을 견갑골 사이 부위에 피하 투여로 투여하였다. 중간 채혈을 위해, 전혈을 테일 스닙으로 혈청 분리기 튜브에 채취하고 처리된 혈청 샘플을 -70℃에서 보관하였다. 제8일에 동물을 CO2 질식 후 개흉술 및 말기 혈액 수집에 의해 안락사시켰다. 혈액 샘플을 심장 천자를 통해 혈청 분리기 튜브에 수집하고 처리된 혈청 샘플을 -70℃에서 보관하였다. 식염수로 심장 관류 후, 간 샘플을 채취하고 드라이 아이스에서 급속동결시켰다. 혈청 내 마우스 TTR 단백질 농도를 Mouse Prealbumin ELISA 키트(Novus Biologicals 또는 Crystal Chem)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 평가하였다.
표 6은 PBS 대조군 대비 마우스 TTR 단백질 잔존 백분율을 나타낸다. N = 5. N.D.: 측정되지 않음
　 　 2 mg/kg
　 PBS WV-20167/28310 WV-20170/28314 WV-20183/28311
동물 No. mTTR 단백질 잔존 백분율 동물 No. mTTR 단백질 잔존 백분율 동물 No. mTTR 단백질 잔존 백분율 동물 No. mTTR 단백질 잔존 백분율
1 86.15 6 30.68 11 21.79 16 55.76
2 119.24 7 25.31 12 24.02 17 55.04
3 96.87 8 34.07 13 18.46 18 54.99
4 101.21 9 39.21 14 20.92 19 64.25
5 96.54 10 26.47 15 20.56 20 72.68
평균 100 평균 31.15 평균 21.15 평균 60.54
6 mg/kg 　 　
WV-20167/28310 WV-20170/28314 WV-20183/28311 　 　
동물 No. mTTR 단백질 잔존 백분율 동물 No. mTTR 단백질 잔존 백분율 동물 No. mTTR 단백질 잔존 백분율 　 　
21 8.95 26 3.83 31 28.8 　 　
22 5.7 27 4.33 32 34.6 　 　
23 5.95 28 4.89 33 36.53 　 　
24 5.97 29 3.94 34 39.44 　 　
25 13.24 30 3.23 35 45.6 　 　
평균 7.96 평균 4.04 평균 36.99 　 　
실시예 4. 제공된 올리고뉴클레오티드 및 조성물은 더 오랜 지속시간동안 생체내에서 활성이다
마우스 TTR siRNA 활성의 생체내 측정: 모든 동물 절차는 Biomere(Worcester, MA)의 IACUC 지침에 따라 수행하였다. 8~10주령의 수컷 C57BL/6 마우스에 제1일에 원하는 올리고뉴클레오티드 농도로 6 mg/kg의 용량을 견갑골 사이 부위에 피하 투여로 투여하였다. 혈액 샘플을 제8일, 제15일, 제22일, 제29일, 제36일, 및 제43일에 테일 스닙으로 혈청 분리기 튜브에 수집하고 처리된 혈청 샘플을 -70℃에서 보관하였다. 혈청 내 마우스 TTR 단백질 농도를 Mouse Prealbumin ELISA 키트(Novus Biologicals)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 평가하였다.
표 7은 PBS 대조군 대비 마우스 TTR 단백질 잔존 백분율을 나타낸다. N = 5. N.D.: 측정되지 않음
　 PBS
일차 동물 1 동물 2 동물 3 동물 4 동물 5 평균
1 135.65 112.62 77.03 76.9 97.79 100
8 117.21 115.99 76.18 74.14 116.47 100
15 119.9 108.19 59.91 83.16 128.84 100
22 109.62 101.21 80.95 87.12 121.1 100
29 142.01 87.52 75.09 79.65 115.73 100
36 115.25 115.35 105.23 71.22 92.96 100
43 106.86 113.19 116.54 68.79 94.62 100
　 WV-20167/28310
일차 동물 6 동물 7 동물 8 동물 9 동물 10 평균
1 120.7 106.43 124 121.65 119.73 118.5
8 10.26 14.68 8 12.66 9.6 11.04
15 33.38 43.97 35.94 36.62 30.37 36.06
22 67.29 83.77 86.46 89.26 63.58 78.07
29 97.59 112.79 36.38 111.62 90.79 89.83
36 96.33 107.97 101.59 117.86 108.02 106.35
43 88.85 110.11 119.21 132.27 104.66 111.02
　 WV-20170/28314
일차 동물 11 동물 12 동물 13 동물 14 동물 15 평균
1 111.59 109.64 122.69 138.83 81.47 112.84
8 N.D. N.D. 3.36 N.D. N.D. 3.36
15 13.28 14.84 20.28 13.69 16.64 15.75
22 37.05 46.55 66.57 33.01 31.41 42.92
29 70.68 75.3 82.14 41.87 114.55 76.91
36 88.77 79.44 85.91 66.93 N.D. 80.26
43 102.89 79.63 116.54 77.16 96.35 94.51
실시예 5. 제공된 올리고뉴클레오티드 및 조성물은 시험관내에서 마우스 트 랜스티레틴(mTTR)을 효과적으로 넉다운시킬 수 있다.
마우스 TTR에 대한 다양한 siRNA를 설계하고 구성하였다. 다수의 siRNA를 하나 또는 일정 범위의 농도로 마우스 원발성 간세포에서 시험관 내에서 테스트하였다. 일부 siRNA를 마우스(예를 들어, C57BL6 야생형 마우스)에서 테스트하였다.
siRNA 활성의 시험관내 측정을 위한 예시 프로토콜: siRNA 활성 측정을 위해, 특정 농도의 siRNA를 10,000개 세포/웰로 96-웰 플레이트에 플레이팅된 마우스 원발성 간세포에 짐노틱 방식으로 전달하였다. 48시간 처리 후, SV96 Total RNA Isolation 키트(Promega)를 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. RNA 샘플로부터의 cDNA 생성은 제조업체의 설명서에 따라 High-Capacity cDNA Reverse Transcription 키트(Thermo Fisher)를 사용하여 수행하였으며 iQ Multiplex Powermix(Bio-Rad)를 사용하여 CFX 시스템에서 qPCR 분석을 수행하였다. 마우스 TTR mRNA의 경우, 다음의 qPCR 분석을 사용하였다: IDT Taqman qPCR 분석 ID Mm.PT.58.11922308. 마우스 HPRT를 노멀라이저(정방향 5'CAAACTTTGCTTTCCCCTGGTT3', 역방향 5'TGCCTGTATCCAACACTTC3', 프로브 5'/5HEX/ACCAGCAAG/Zen/CTTGCAACCTTAACC/3IABkFQ/3')로서 사용하였다. mRNA 넉다운 수준을 모의 처리 대비 mRNA 잔존 백분율로서 계산하였다.
표 8은 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 TTR mRNA 잔존 백분율(1000, 300, 및 100 pM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D.: 측정되지 않음
　 　 1000 pM 300 pM 100 pM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-2		 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-2		 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-1		 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-2		 평균
WV-20167 WV-40362 7.37 12.03 9.70 29.25 35.63 32.44 44.31 47.88 46.10
WV-20167 WV-40363 7.90 5.93 6.92 24.75 29.60 27.17 59.68 46.05 52.86
WV-20167 WV-40364 14.31 15.09 14.70 42.71 42.74 42.72 64.31 43.31 53.81
WV-20167 WV-40365 5.81 13.65 9.73 22.52 42.09 32.30 51.92 51.07 51.50
WV-20167 WV-40366 5.36 24.05 14.70 28.88 39.09 33.98 61.57 56.27 58.92
WV-20169 WV-40362 6.86 10.74 8.80 29.83 35.36 32.60 38.68 42.89 40.79
WV-20169 WV-40363 7.23 6.47 6.85 23.79 35.98 29.89 51.94 51.92 51.93
WV-20169 WV-40364 12.44 20.37 16.40 41.75 51.88 46.81 64.96 46.36 55.66
WV-20169 WV-40365 6.41 12.50 9.45 27.36 26.53 26.94 55.04 52.87 53.95
WV-20169 WV-40366 5.38 24.63 15.00 31.54 23.17 27.35 61.01 55.49 58.25
WV-20170 WV-40362 5.90 4.71 5.31 21.43 27.32 24.38 53.12 40.86 46.99
WV-20170 WV-40363 6.90 10.54 8.72 21.32 29.74 25.53 45.66 31.99 38.83
WV-20170 WV-40364 6.69 12.18 9.44 25.73 26.77 26.25 44.94 49.94 47.44
WV-20170 WV-40365 3.00 13.34 8.17 26.71 28.11 27.41 55.72 44.74 50.23
WV-20170 WV-40366 4.46 17.53 10.99 20.93 18.36 19.65 53.39 53.46 53.43
WV-20171 WV-40362 4.88 4.73 4.80 25.57 26.77 26.17 43.46 29.41 36.44
WV-20171 WV-40363 3.78 8.83 6.30 14.28 19.73 17.00 30.23 30.75 30.49
WV-20171 WV-40364 3.1 12.341 7.75 28.42 26.21 27.32 47.00 38.35 42.68
WV-20171 WV-40365 2.13 8.55 5.34 19.51 17.13 18.32 54.40 40.88 47.64
WV-20171 WV-40366 3.26 9.37 6.31 23.77 16.06 19.91 N.D. 41.10 41.10
WV-20172 WV-40362 4.81 6.33 5.57 26.55 47.86 37.21 44.67 48.51 46.59
WV-20172 WV-40363 2.21 8.71 5.46 24.50 15.80 20.15 37.06 35.63 36.35
WV-20172 WV-40364 2.82 10.5 6.66 18.34 21.90 20.12 54.86 62.99 58.92
WV-20172 WV-40365 2.75 8.14 5.45 21.56 12.57 17.07 43.04 35.57 39.30
WV-20172 WV-40366 3.43 7.93 5.68 29.41 20.77 25.09 43.06 40.82 41.94
WV-20173 WV-40362 8.09 19.75 13.92 57.44 25.78 41.61 79.01 74.59 76.80
WV-20173 WV-40363 4.65 15.43 10.04 30.91 32.20 31.56 61.93 54.63 58.28
WV-20173 WV-40364 14.58 32.45 23.51 62.63 53.15 57.89 84.18 76.66 80.42
WV-20173 WV-40365 4.72 N.D. 4.72 35.18 34.82 35.00 46.65 55.65 51.15
WV-20173 WV-40366 20.70 14.31 17.51 49.17 52.41 50.79 65.83 62.61 64.22
WV-20174 WV-40362 5.26 6.93 6.10 23.32 27.10 25.21 45.67 52.46 49.07
WV-20174 WV-40363 3.15 8.51 5.83 31.44 19.72 25.58 52.76 41.46 47.11
WV-20174 WV-40364 4.58 10.33 7.45 28.20 25.36 26.78 47.45 44.91 46.18
WV-20174 WV-40365 6.78 6.34 6.56 24.75 27.82 26.28 44.37 40.62 42.50
WV-20174 WV-40366 8.18 7.51 7.85 21.31 31.51 26.41 57.27 43.01 50.14
WV-20175 WV-40362 5.59 8.76 7.18 39.70 24.40 32.05 57.70 53.15 55.42
WV-20175 WV-40363 2.99 7.69 5.34 26.20 18.62 22.41 38.56 N.D. 38.56
WV-20175 WV-40364 12.09 14.45 13.27 47.72 49.23 48.48 57.02 58.36 57.69
WV-20175 WV-40365 6.81 6.23 6.52 28.22 29.90 29.06 58.91 44.24 51.58
WV-20175 WV-40366 17.21 21.39 19.30 48.81 42.27 45.54 65.46 42.50 53.98
WV-20176 WV-40362 4.54 5.89 5.21 21.80 20.41 21.11 40.18 31.97 36.07
WV-20176 WV-40363 5.60 8.32 6.96 26.17 26.17 26.17 38.71 41.56 40.13
WV-20176 WV-40364 7.85 6.72 7.28 25.34 37.89 31.62 62.22 52.50 57.36
WV-20176 WV-40365 6.15 11.28 8.71 27.66 31.41 29.54 53.06 28.81 40.94
WV-20176 WV-40366 6.28 16.62 11.44 26.05 63.25 44.65 48.94 53.11 51.02
WV-20177 WV-40362 12.35 18.22 15.28 49.76 55.57 52.67 61.16 66.35 63.75
WV-20177 WV-40363 9.83 10.05 9.94 35.66 44.99 40.33 72.85 63.27 68.06
WV-20177 WV-40364 35.24 42.42 38.83 95.13 81.27 88.20 87.67 64.74 76.20
WV-20177 WV-40365 7.77 20.49 14.13 37.26 27.12 32.19 62.42 60.16 61.29
WV-20177 WV-40366 18.87 51.23 35.05 59.02 21.57 40.29 72.05 72.96 72.50
WV-20178 WV-40362 6.70 8.67 7.69 26.32 31.37 28.84 50.68 55.46 53.07
WV-20178 WV-40363 6.52 12.27 9.39 34.41 30.05 32.23 47.08 36.72 41.90
WV-20178 WV-40364 6.97 16.00 11.48 33.08 52.60 42.84 54.91 53.81 54.36
WV-20178 WV-40365 4.41 15.90 10.16 26.30 32.79 29.55 49.41 44.61 47.013
WV-20178 WV-40366 5.44 N.D. 5.44 24.82 22.77 23.79 60.54 56.40 58.47
WV-20179 WV-40362 7.48 10.52 9.00 37.37 44.66 41.01 65.98 38.84 52.41
WV-20179 WV-40363 4.95 17.23 11.09 27.22 24.07 25.65 N.D. 48.08 48.08
WV-20179 WV-40364 10.16 31.42 20.79 61.13 28.58 44.86 76.64 68.51 72.58
WV-20179 WV-40365 3.38 N.D. 3.38 23.94 23.91 23.93 61.94 53.93 57.94
WV-20179 WV-40366 9.46 22.61 16.04 46.20 40.67 43.44 67.37 65.53 66.45
WV-20180 WV-40362 3.75 8.55 6.15 21.80 87.72 54.76 42.55 40.27 41.41
WV-20180 WV-40363 3.60 13.09 8.35 30.21 29.17 29.69 46.53 45.61 46.07
WV-20180 WV-40364 3.96 15.43 9.69 35.83 22.43 29.13 61.90 58.09 59.99
WV-20180 WV-40365 3.19 7.94 5.56 22.57 13.92 18.24 48.30 40.49 44.40
WV-20180 WV-40366 3.80 10.58 7.19 32.93 34.51 33.72 43.35 50.01 46.68
WV-20181 WV-40362 34.30 67.43 50.87 94.09 21.17 57.63 97.73 98.17 97.95
WV-20181 WV-40363 27.05 63.63 45.34 72.72 73.71 73.21 98.34 100.33 99.34
WV-20181 WV-40364 54.22 74.30 64.26 109.17 87.17 98.17 94.63 97.06 95.84
WV-20181 WV-40365 28.47 N.D. 28.47 73.41 70.01 71.71 90.12 98.63 94.38
WV-20181 WV-40366 63.14 44.48 53.81 91.57 87.11 89.34 106.33 108.89 107.61
WV-20182 WV-40362 7.41 17.25 12.33 34.45 31.90 33.17 67.80 66.10 66.95
WV-20182 WV-40363 6.14 14.28 10.21 42.49 N.D. 42.49 74.54 67.57 71.05
WV-20182 WV-40364 6.39 14.26 10.32 38.53 33.63 36.08 55.37 56.34 55.85
WV-20182 WV-40365 12.69 10.51 11.60 32.98 40.19 36.59 56.20 54.92 55.56
WV-20182 WV-40366 12.46 12.29 12.37 32.75 38.69 35.72 60.97 50.31 55.64
WV-20183 WV-40362 25.21 37.76 31.48 72.43 61.40 66.91 83.05 88.69 85.87
WV-20183 WV-40363 17.73 26.69 22.21 62.85 49.44 56.15 78.66 75.83 77.24
WV-20183 WV-40364 40.84 47.17 44.00 78.77 86.93 82.85 84.29 96.39 90.34
WV-20183 WV-40365 27.55 22.20 24.88 52.51 66.16 59.33 94.82 81.84 88.33
WV-20183 WV-40366 52.38 69.83 61.11 75.88 82.44 79.16 98.08 67.02 82.55
WV-20184 WV-40362 10.09 13.38 11.73 35.80 32.74 34.27 61.83 51.98 56.91
WV-20184 WV-40363 7.73 8.86 8.30 31.68 40.66 36.17 52.06 55.34 53.70
WV-20184 WV-40364 16.73 13.37 15.05 36.47 50.37 43.42 71.54 68.46 70.00
WV-20184 WV-40365 9.49 10.73 10.11 42.21 N.D. 42.21 63.87 45.73 54.80
WV-20184 WV-40366 8.19 23.03 15.61 37.39 34.04 35.72 62.51 66.27 64.39
표 9는 마우스 원발성 간세포에서 마우스 TTR mRNA 넉다운의 IC50 백분율을 나타낸다.
가이드 패신저 IC50 (pM) 95% CI
WV-39295 WV-40363 33.72 25.41~44.79
WV-39296 WV-40363 28.64 23.72~34.58
WV-20167 WV-40363 16.62 13.35~20.67
WV-39297 WV-40363 425.2 163.0~1232
WV-39298 WV-40363 27.80 17.98~42.99
WV-20169 WV-40363 11.29 7.58~16.74
WV-39299 WV-40363 12.61 7.81~20.42
WV-39300 WV-40363 21.50 15.52~29.79
WV-20170 WV-40363 12.14 9.59~15.36
표 10은 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 TTR mRNA 잔존 백분율(1500, 500, 및 150 pM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D.: 측정되지 않음
　 　 1500 pM 500 pM 150 pM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균
WV-20167 WV-28310 3.95 3.95 3.95 16.45 18.80 17.63 58.43 54.97 56.70
WV-20170 WV-28314 1.91 2.22 2.07 6.07 5.39 5.73 35.83 31.25 33.54
WV-38082 WV-28314 5.69 4.75 5.22 16.55 14.85 15.70 65.38 54.54 59.96
WV-38083 WV-28314 3.87 3.09 3.48 13.70 17.40 15.55 63.65 47.59 55.62
WV-38084 WV-28314 6.57 4.57 5.57 20.56 20.07 20.32 70.25 55.57 62.91
WV-38085 WV-28314 3.60 2.74 3.17 12.69 8.46 10.57 53.93 39.07 46.50
WV-38086 WV-28314 3.24 2.27 2.76 17.34 8.15 12.75 49.15 40.93 45.04
WV-38087 WV-28314 1.89 0.86 1.38 6.67 3.98 5.32 25.94 17.79 21.87
WV-38088 WV-28314 2.29 1.86 2.08 9.67 4.44 7.05 36.35 23.50 29.92
WV-38089 WV-28314 1.75 1.75 1.75 N.D. 4.82 4.82 55.75 24.67 40.21
WV-38090 WV-28314 4.35 4.77 4.56 16.40 13.58 14.99 58.83 48.66 53.74
WV-38091 WV-28314 3.96 3.53 3.74 17.65 15.23 16.44 55.09 47.10 51.10
WV-38092 WV-28314 4.94 3.28 4.11 13.17 11.28 12.22 53.21 43.48 48.34
WV-38093 WV-28314 3.85 3.14 3.50 15.40 12.17 13.78 51.71 39.78 45.75
WV-38094 WV-28314 3.40 2.72 3.06 13.40 9.34 11.37 40.87 34.08 37.47
WV-38095 WV-28314 2.94 2.29 2.61 17.64 10.81 14.23 51.66 34.35 43.00
WV-38096 WV-28314 3.63 3.01 3.32 12.13 8.10 10.11 54.01 33.26 43.64
WV-38097 WV-28314 3.13 2.07 2.60 30.86 9.96 20.41 62.62 32.88 47.75
WV-38098 WV-28314 3.21 3.59 3.40 13.02 11.91 12.47 51.93 39.34 45.63
WV-38099 WV-28314 3.63 3.27 3.45 15.62 13.69 14.65 54.14 50.27 52.20
WV-38100 WV-28314 4.12 3.40 3.76 12.06 14.09 13.08 56.83 47.30 52.06
WV-38101 WV-28314 4.50 4.57 4.54 16.52 13.32 14.92 56.39 50.58 53.48
WV-38102 WV-28314 5.33 3.42 4.38 18.15 10.30 14.22 47.72 47.80 47.76
WV-38103 WV-28314 4.67 2.98 3.82 20.99 12.71 16.85 54.94 40.61 47.77
WV-38104 WV-28314 3.89 3.53 3.71 17.26 9.52 13.39 54.91 39.61 47.26
WV-38105 WV-28314 3.16 1.95 2.55 N.D. 8.64 8.64 54.50 27.77 41.13
WV-38106 WV-28314 4.34 4.03 4.19 15.63 15.33 15.48 62.14 47.23 54.69
WV-38107 WV-28314 2.22 1.83 2.03 8.48 8.65 8.56 44.25 31.27 37.76
WV-38108 WV-28314 4.64 3.53 4.08 14.78 13.13 13.95 60.80 41.51 51.16
WV-38109 WV-28314 3.25 2.96 3.11 13.23 11.55 12.39 53.71 44.86 49.28
WV-38110 WV-28314 5.56 4.11 4.84 18.41 9.33 13.87 51.87 44.41 48.14
WV-38111 WV-28314 3.99 3.18 3.59 17.15 10.19 13.67 52.16 38.23 45.20
WV-38112 WV-28314 3.82 3.31 3.57 13.62 9.63 11.62 52.34 35.13 43.74
WV-38113 WV-28314 3.73 2.43 3.08 23.73 9.66 16.69 47.05 42.22 44.64
WV-38114 WV-28314 4.51 3.81 4.16 14.16 18.70 16.43 61.69 63.97 62.83
WV-38115 WV-28314 3.13 2.76 2.94 13.96 13.88 13.92 47.65 41.83 44.74
WV-38116 WV-28314 4.63 2.88 3.76 10.39 11.82 11.11 50.04 43.95 46.99
WV-38117 WV-28314 3.14 2.76 2.95 9.44 10.25 9.84 47.09 40.57 43.83
WV-38118 WV-28314 5.04 3.51 4.27 14.72 7.73 11.23 49.19 42.76 45.97
WV-38119 WV-28314 2.63 2.20 2.41 15.54 11.01 13.27 45.33 31.55 38.44
WV-38120 WV-28314 5.02 3.21 4.11 13.31 8.80 11.05 48.51 37.27 42.89
WV-38121 WV-28314 2.60 2.28 2.44 18.27 8.05 13.16 47.10 31.86 39.48
WV-38122 WV-28314 4.14 4.81 4.48 11.45 16.14 13.80 50.63 51.86 51.24
WV-38123 WV-28314 3.79 3.26 3.52 15.64 15.43 15.54 55.79 48.60 52.19
WV-38124 WV-28314 5.25 3.95 4.60 13.32 12.48 12.90 56.94 52.72 54.83
WV-38125 WV-28314 3.62 3.43 3.53 16.42 15.46 15.94 53.97 49.01 51.49
WV-38126 WV-28314 5.30 3.65 4.47 12.21 8.29 10.25 50.01 43.21 46.61
WV-38127 WV-28314 2.04 1.46 1.75 9.47 5.67 7.57 37.00 19.09 28.04
WV-38128 WV-28314 3.97 3.42 3.70 10.60 8.87 9.73 43.75 26.64 35.19
WV-38129 WV-28314 2.35 1.36 1.85 10.69 5.45 8.07 35.88 24.05 29.96
WV-38130 WV-28314 4.64 5.20 4.92 10.76 16.56 13.66 66.33 59.81 63.07
WV-38131 WV-28314 3.55 3.21 3.38 11.19 12.45 11.82 53.37 44.39 48.88
WV-38132 WV-28314 4.01 4.24 4.13 9.46 9.69 9.57 48.70 44.22 46.46
WV-38133 WV-28314 3.32 2.83 3.07 11.60 13.72 12.66 51.97 48.79 50.38
WV-38134 WV-28314 5.04 2.90 3.97 16.70 9.51 13.11 49.46 43.88 46.67
WV-38135 WV-28314 2.93 2.90 2.91 17.14 12.61 14.88 48.48 40.59 44.53
WV-38136 WV-28314 4.28 3.31 3.80 9.80 7.35 8.58 48.77 31.64 40.21
WV-38137 WV-28314 3.01 1.84 2.42 12.94 5.68 9.31 42.95 24.14 33.55
WV-38138 WV-28314 3.66 4.40 4.03 9.00 11.25 10.13 56.14 51.22 53.68
WV-38139 WV-28314 2.86 3.05 2.95 10.59 10.68 10.64 49.76 46.66 48.21
WV-38140 WV-28314 3.64 3.66 3.65 10.49 10.04 10.27 50.79 49.06 49.93
WV-38141 WV-28314 2.80 2.46 2.63 14.16 14.84 14.50 53.33 46.05 49.69
WV-38142 WV-28314 4.19 3.45 3.82 13.65 8.27 10.96 49.46 43.94 46.70
WV-38143 WV-28314 3.46 2.57 3.01 16.07 13.16 14.61 50.83 38.52 44.68
WV-38144 WV-28314 4.31 3.43 3.87 12.68 8.17 10.42 50.41 28.88 39.65
WV-38145 WV-28314 2.33 1.89 2.11 13.52 4.59 9.06 40.04 22.05 31.05
WV-38146 WV-28314 3.34 3.98 3.66 9.09 9.36 9.22 49.18 47.55 48.37
표 11은 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 TTR mRNA 잔존 백분율(300 pM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D.: 측정되지 않음
　 　 300 pM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mF7/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mF7/mHPRT)-2 평균
WV-20167 WV-36860 4.96 7.55 6.25
WV-20170 WV-36860 4.66 4.30 4.48
WV-36980 WV-36860 10.45 12.15 11.30
WV-36981 WV-36860 11.70 17.11 14.40
WV-36982 WV-36860 15.92 18.13 17.03
WV-36983 WV-36860 13.71 15.55 14.63
WV-36984 WV-36860 11.85 18.24 15.04
WV-36985 WV-36860 12.44 14.93 13.69
WV-36986 WV-36860 18.07 18.17 18.12
WV-36987 WV-36860 17.20 18.34 17.77
WV-36988 WV-36860 10.55 14.15 12.35
WV-36989 WV-36860 14.72 20.00 17.36
WV-36990 WV-36860 22.40 28.32 25.36
WV-36991 WV-36860 16.07 21.66 18.87
WV-36992 WV-36860 N.D. 25.82 25.82
WV-36993 WV-36860 19.83 20.94 20.39
WV-36994 WV-36860 22.87 29.77 26.32
WV-36995 WV-36860 12.82 19.02 15.92
WV-36996 WV-36860 7.65 10.26 8.95
WV-36997 WV-36860 11.30 15.70 13.50
WV-36998 WV-36860 20.41 24.08 22.25
WV-36999 WV-36860 10.21 14.35 12.28
WV-37000 WV-36860 10.37 22.91 16.64
WV-37001 WV-36860 14.19 13.64 13.91
WV-37002 WV-36860 15.51 18.74 17.12
WV-37003 WV-36860 14.41 16.53 15.47
WV-37004 WV-36860 13.00 17.81 15.40
WV-37005 WV-36860 18.85 24.90 21.88
WV-37006 WV-36860 30.86 37.82 34.34
WV-37007 WV-36860 14.46 28.59 21.52
WV-37008 WV-36860 19.63 33.41 26.52
WV-37009 WV-36860 21.78 24.35 23.07
WV-37010 WV-36860 28.91 32.02 30.46
WV-37011 WV-36860 14.68 18.32 16.50
WV-37012 WV-36860 9.58 13.44 11.51
WV-37013 WV-36860 12.23 15.55 13.89
WV-37014 WV-36860 13.76 19.67 16.71
WV-37015 WV-36860 8.07 11.92 9.99
WV-37016 WV-36860 9.08 16.83 12.96
WV-37017 WV-36860 9.89 13.94 11.91
WV-37018 WV-36860 13.06 15.27 14.16
WV-37019 WV-36860 17.71 21.43 19.57
WV-37020 WV-36860 11.88 16.12 14.00
WV-37021 WV-36860 17.48 21.88 19.68
WV-37022 WV-36860 27.35 32.90 30.12
WV-37023 WV-36860 14.85 27.62 21.24
WV-37024 WV-36860 20.58 28.68 24.63
WV-37025 WV-36860 22.78 22.02 22.40
WV-37026 WV-36860 23.29 27.62 25.46
WV-37027 WV-36860 11.40 14.66 13.03
WV-37028 WV-36860 9.12 12.89 11.01
WV-37029 WV-36860 14.10 15.81 14.95
WV-37030 WV-36860 18.51 23.80 21.15
WV-37031 WV-36860 12.70 12.94 12.82
WV-37032 WV-36860 12.11 21.10 16.61
WV-37033 WV-36860 19.41 16.91 18.16
WV-37034 WV-36860 20.27 19.93 20.10
WV-37035 WV-36860 29.52 30.52 30.02
WV-37036 WV-36860 20.19 25.96 23.08
WV-37037 WV-36860 25.20 33.74 29.47
WV-37038 WV-36860 37.69 52.95 45.32
WV-37039 WV-36860 26.60 32.58 29.59
WV-37040 WV-36860 26.40 45.42 35.91
WV-37041 WV-36860 39.05 31.95 35.50
WV-37042 WV-36860 39.92 35.74 37.83
WV-37043 WV-36860 16.06 20.28 18.17
WV-37044 WV-36860 8.92 11.41 10.17
WV-37045 WV-36860 13.40 14.47 13.94
WV-37046 WV-36860 14.78 20.31 17.54
WV-37047 WV-36860 11.98 18.60 15.29
WV-37048 WV-36860 10.16 18.77 14.46
WV-37049 WV-36860 15.14 14.47 14.80
WV-37050 WV-36860 14.01 15.40 14.71
WV-37051 WV-36860 17.92 19.96 18.94
WV-37052 WV-36860 11.95 16.30 14.13
WV-37053 WV-36860 20.31 22.86 21.58
WV-37054 WV-36860 22.15 31.45 26.80
WV-37055 WV-36860 19.01 21.43 20.22
WV-37056 WV-36860 17.25 29.98 23.61
WV-37057 WV-36860 20.18 22.55 21.36
WV-37058 WV-36860 21.88 22.30 22.09
WV-37059 WV-36860 22.52 20.27 21.40
WV-37060 WV-36860 7.08 9.99 8.53
WV-37061 WV-36860 17.59 18.37 17.98
WV-37062 WV-36860 17.97 25.49 21.73
WV-37063 WV-36860 13.41 15.27 14.34
WV-37064 WV-36860 11.58 20.70 16.14
WV-37065 WV-36860 22.02 19.12 20.57
WV-37066 WV-36860 24.22 26.13 25.17
WV-37067 WV-36860 29.39 26.95 28.17
WV-37068 WV-36860 19.04 18.36 18.70
WV-37069 WV-36860 29.43 28.57 29.00
WV-37070 WV-36860 35.17 47.16 41.17
WV-37071 WV-36860 18.85 19.74 19.29
WV-37072 WV-36860 29.00 19.56 24.28
WV-37073 WV-36860 32.87 28.97 30.92
WV-37074 WV-36860 34.42 33.66 34.04
WV-37075 WV-36860 18.54 17.28 17.91
WV-37076 WV-36860 18.08 18.80 18.44
WV-37077 WV-36860 20.97 19.73 20.35
WV-37078 WV-36860 17.84 16.48 17.16
WV-37079 WV-36860 16.73 11.51 14.12
WV-37080 WV-36860 17.05 14.78 15.91
WV-37081 WV-36860 16.89 16.25 16.57
WV-37082 WV-36860 15.86 16.90 16.38
WV-37083 WV-36860 32.12 30.15 31.14
WV-37084 WV-36860 29.69 30.52 30.10
WV-37085 WV-36860 43.72 42.64 43.18
WV-37086 WV-36860 37.71 40.91 39.31
WV-37087 WV-36860 37.78 28.62 33.20
WV-37088 WV-36860 42.60 40.64 41.62
WV-37089 WV-36860 47.89 38.09 42.99
WV-37090 WV-36860 31.94 35.73 33.84
WV-37091 WV-36860 20.27 17.99 19.13
WV-37092 WV-36860 16.69 13.96 15.32
WV-37093 WV-36860 27.10 24.23 25.67
WV-37094 WV-36860 18.15 24.11 21.13
WV-37095 WV-36860 23.06 16.50 19.78
WV-37096 WV-36860 21.05 20.91 20.98
WV-37097 WV-36860 28.37 29.09 28.73
WV-37098 WV-36860 22.55 19.14 20.85
WV-37099 WV-36860 35.95 38.93 37.44
WV-37100 WV-36860 48.24 43.85 46.05
WV-37101 WV-36860 62.03 52.51 57.27
WV-37102 WV-36860 63.45 54.72 59.08
WV-37103 WV-36860 50.88 43.76 47.32
WV-37104 WV-36860 53.22 55.81 54.51
WV-37105 WV-36860 62.45 59.58 61.02
WV-37106 WV-36860 55.27 51.08 53.17
WV-37107 WV-36860 28.10 21.88 24.99
WV-37108 WV-36860 27.57 22.02 24.80
WV-37109 WV-36860 35.51 29.47 32.49
WV-37110 WV-36860 20.08 21.07 20.57
WV-37111 WV-36860 45.48 30.09 37.79
WV-37112 WV-36860 26.92 23.32 25.12
WV-37113 WV-36860 42.08 36.71 39.39
WV-37114 WV-36860 27.89 20.92 24.40
WV-37115 WV-36860 45.99 40.94 43.46
WV-37116 WV-36860 52.11 39.68 45.90
WV-37117 WV-36860 59.72 58.26 58.99
WV-37118 WV-36860 59.87 52.26 56.07
WV-37119 WV-36860 66.99 43.20 55.09
WV-37120 WV-36860 53.22 38.95 46.08
WV-37121 WV-36860 77.16 68.69 72.92
WV-37122 WV-36860 62.07 52.14 57.11
WV-37123 WV-36860 29.03 27.82 28.43
WV-37124 WV-36860 31.49 26.84 29.17
WV-37125 WV-36860 33.05 29.99 31.52
WV-37126 WV-36860 29.24 27.84 28.54
WV-37127 WV-36860 26.69 24.59 25.64
WV-37128 WV-36860 24.17 21.53 22.85
WV-37129 WV-36860 32.63 29.59 31.11
WV-37130 WV-36860 34.42 22.15 28.28
WV-37131 WV-36860 36.55 32.52 34.53
WV-37132 WV-36860 41.37 35.96 38.67
WV-37133 WV-36860 61.38 54.90 58.14
WV-37134 WV-36860 59.51 49.42 54.46
WV-37135 WV-36860 51.57 43.19 47.38
WV-37136 WV-36860 52.03 45.12 48.58
WV-37137 WV-36860 64.51 65.73 65.12
WV-37138 WV-36860 66.68 60.05 63.36
WV-37139 WV-36860 59.06 61.02 60.04
WV-37140 WV-36860 54.71 51.79 53.25
WV-37141 WV-36860 61.43 63.45 62.44
WV-37142 WV-36860 53.31 44.70 49.00
WV-37143 WV-36860 55.33 52.49 53.91
WV-37144 WV-36860 54.11 48.60 51.35
WV-37145 WV-36860 65.86 72.58 69.22
WV-37146 WV-36860 59.99 45.20 52.59
WV-37147 WV-36860 48.91 58.42 53.67
WV-37148 WV-36860 76.15 78.10 77.12
WV-37149 WV-36860 63.99 66.80 65.39
WV-37150 WV-36860 77.66 68.63 73.15
WV-37151 WV-36860 52.66 48.07 50.37
WV-37152 WV-36860 82.36 68.59 75.48
WV-37153 WV-36860 69.32 72.20 70.76
WV-37154 WV-36860 83.46 66.38 74.92
WV-37155 WV-36860 51.65 57.70 54.67
WV-37156 WV-36860 46.34 59.01 52.68
WV-37157 WV-36860 49.27 56.39 52.83
WV-37158 WV-36860 57.36 52.83 55.10
WV-37159 WV-36860 49.17 57.70 53.44
WV-37160 WV-36860 50.97 56.57 53.77
WV-37161 WV-36860 45.80 52.23 49.01
WV-37162 WV-36860 47.43 55.55 51.49
WV-37163 WV-36860 58.36 59.39 58.88
WV-37164 WV-36860 69.41 74.03 71.72
WV-37165 WV-36860 58.38 63.70 61.04
WV-37166 WV-36860 77.37 71.77 74.57
WV-37167 WV-36860 55.82 62.63 59.22
WV-37168 WV-36860 82.45 74.57 78.51
WV-37169 WV-36860 69.31 61.24 65.27
WV-37170 WV-36860 62.78 63.48 63.13
WV-37171 WV-36860 59.69 62.51 61.10
WV-37172 WV-36860 48.90 52.06 50.48
WV-37173 WV-36860 53.34 53.26 53.30
WV-37174 WV-36860 41.51 43.72 42.62
WV-37175 WV-36860 59.39 56.94 58.17
WV-37176 WV-36860 48.80 42.83 45.81
WV-37177 WV-36860 41.85 49.79 45.82
WV-37178 WV-36860 43.61 53.46 48.53
WV-37179 WV-36860 72.22 70.68 71.45
WV-37180 WV-36860 55.66 60.85 58.26
WV-37181 WV-36860 77.03 66.20 71.62
WV-37182 WV-36860 67.07 68.51 67.79
WV-37183 WV-36860 74.15 64.31 69.23
WV-37184 WV-36860 60.93 56.36 58.64
WV-37185 WV-36860 61.54 71.20 66.37
WV-37186 WV-36860 56.82 63.59 60.20
WV-37187 WV-36860 58.65 59.88 59.27
WV-37188 WV-36860 40.87 50.23 45.55
WV-37189 WV-36860 60.76 61.28 61.02
WV-37190 WV-36860 52.86 55.59 54.22
WV-37191 WV-36860 51.29 54.07 52.68
WV-37192 WV-36860 44.53 51.97 48.25
WV-37193 WV-36860 43.44 55.82 49.63
WV-37194 WV-36860 47.94 52.99 50.46
WV-37195 WV-36860 78.18 74.89 76.54
WV-37196 WV-36860 63.23 65.80 64.52
WV-37197 WV-36860 75.99 80.42 78.21
WV-37198 WV-36860 78.13 84.00 81.07
WV-37199 WV-36860 73.88 74.96 74.42
WV-37200 WV-36860 66.51 71.03 68.77
WV-37201 WV-36860 57.03 77.37 67.20
WV-37202 WV-36860 63.86 74.89 69.37
WV-37203 WV-36860 70.26 80.10 75.18
WV-37204 WV-36860 66.38 68.55 67.46
WV-37205 WV-36860 78.93 71.67 75.30
WV-37206 WV-36860 77.74 77.71 77.73
WV-37207 WV-36860 81.80 88.59 85.19
WV-37208 WV-36860 73.80 69.00 71.40
WV-37209 WV-36860 63.50 79.72 71.61
WV-37210 WV-36860 68.59 72.71 70.65
WV-37211 WV-36860 87.57 95.25 91.41
WV-37212 WV-36860 79.02 88.59 83.81
WV-37213 WV-36860 79.76 94.58 87.17
WV-37214 WV-36860 N.D. 79.85 79.85
WV-37215 WV-36860 84.42 89.24 86.83
WV-37216 WV-36860 80.77 85.09 82.93
WV-37217 WV-36860 69.35 87.78 78.57
WV-37218 WV-36860 75.86 82.70 79.28
WV-37219 WV-36860 75.97 80.08 78.03
WV-37220 WV-36860 65.12 77.99 71.56
WV-37221 WV-36860 75.99 88.34 82.17
WV-37222 WV-36860 74.35 74.70 74.52
WV-37223 WV-36860 77.78 88.76 83.27
WV-37224 WV-36860 68.06 78.57 73.32
WV-37225 WV-36860 64.01 84.68 74.35
WV-37226 WV-36860 70.70 74.04 72.37
WV-37227 WV-36860 92.04 89.72 90.88
WV-37228 WV-36860 79.82 88.77 84.30
WV-37229 WV-36860 83.68 97.66 90.67
WV-37230 WV-36860 89.52 82.54 86.03
WV-37231 WV-36860 88.86 96.62 92.74
WV-37232 WV-36860 78.97 95.50 87.24
WV-37233 WV-36860 67.62 89.80 78.71
WV-37234 WV-36860 85.88 88.72 87.30
WV-37235 WV-36860 20.97 22.92 21.95
WV-37236 WV-36860 17.96 22.66 20.31
표 12는 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 TTR mRNA 잔존 백분율(1000, 300, 및 100 pM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D.: 측정되지 않음
　 　 1000 pM 300 pM 100 pM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균
WV-41841 WV-40363 12.24 14.12 13.18 16.82 18.55 17.68 44.46 42.52 43.49
WV-41842 WV-40363 18.98 12.60 15.79 21.86 17.00 19.43 40.96 35.70 38.33
WV-41843 WV-40363 12.84 7.75 10.29 20.74 18.31 19.52 47.24 31.88 39.56
WV-41844 WV-40363 12.20 13.86 13.03 20.25 26.75 23.50 47.97 33.65 40.81
WV-41845 WV-40363 19.45 13.29 16.37 42.67 37.50 40.08 65.63 39.03 52.33
WV-41846 WV-40363 12.57 9.18 10.87 33.29 22.90 28.10 72.75 39.24 55.99
WV-41847 WV-40363 30.22 N.D. 30.22 71.44 67.23 69.34 120.84 78.65 99.74
WV-41848 WV-40363 13.18 2.31 7.74 21.38 33.83 27.61 76.24 N.D. 76.24
WV-41849 WV-40363 71.01 80.33 75.67 69.02 75.82 72.42 112.70 83.84 98.27
WV-41850 WV-40363 19.56 11.43 15.49 17.14 24.03 20.58 55.26 40.33 47.80
WV-41851 WV-40363 13.88 9.05 11.47 19.36 31.71 25.53 53.90 39.04 46.47
WV-41852 WV-40363 10.47 12.24 11.35 19.22 24.45 21.83 60.37 31.67 46.02
WV-41853 WV-40363 16.53 17.51 17.02 32.86 37.24 35.05 72.33 37.79 55.06
WV-41854 WV-40363 9.86 10.35 10.10 25.67 27.52 26.59 75.44 38.48 56.96
WV-41855 WV-40363 36.06 35.07 35.56 81.81 62.91 72.36 124.09 77.32 100.70
WV-41856 WV-40363 16.31 14.25 15.28 23.56 40.28 31.92 96.48 69.35 82.91
WV-41857 WV-40363 81.80 58.71 70.25 76.98 77.04 77.01 107.24 89.99 98.61
WV-41858 WV-40363 25.97 12.41 19.19 28.29 24.37 26.33 88.48 63.60 76.04
WV-41859 WV-40363 21.09 7.52 14.31 25.63 26.67 26.15 71.09 59.36 65.23
WV-41860 WV-40363 19.97 29.21 24.59 39.57 30.80 35.18 84.73 61.76 73.25
WV-41861 WV-40363 19.47 22.74 21.11 48.92 30.60 39.76 76.88 54.99 65.93
WV-41862 WV-40363 21.84 19.74 20.79 49.72 38.08 43.90 91.69 65.27 78.48
WV-41863 WV-40363 14.69 13.82 14.25 40.60 33.91 37.25 82.85 52.50 67.67
WV-41864 WV-40363 18.77 16.52 17.64 27.95 37.75 32.85 76.72 70.37 73.55
WV-41865 WV-40363 20.79 11.65 16.22 26.39 29.96 28.18 72.78 46.96 59.87
WV-41866 WV-40363 37.68 24.28 30.98 48.84 42.00 45.42 90.90 74.84 82.87
WV-41867 WV-40363 9.44 4.14 6.79 13.26 13.52 13.39 47.73 29.71 38.72
WV-41868 WV-40363 9.34 14.66 12.00 20.57 14.51 17.54 53.96 31.43 42.70
WV-41869 WV-40363 8.18 10.25 9.21 20.08 15.84 17.96 45.84 34.16 40.00
WV-41870 WV-40363 9.41 10.03 9.72 21.64 23.59 22.62 62.04 47.29 54.67
WV-41871 WV-40363 37.89 35.38 36.64 64.95 67.41 66.18 100.49 80.89 90.69
WV-41872 WV-40363 5.05 4.52 4.79 8.33 14.77 11.55 33.71 34.14 33.93
WV-41873 WV-40363 9.31 5.11 7.21 11.80 14.00 12.90 53.31 22.90 38.11
WV-41874 WV-40363 14.20 9.23 11.71 18.51 20.10 19.30 76.48 41.45 58.96
WV-41875 WV-40363 67.73 35.01 51.37 74.00 66.34 70.17 114.20 85.75 99.97
WV-41876 WV-40363 10.48 13.58 12.03 13.85 17.20 15.53 54.18 35.37 44.77
WV-41877 WV-40363 5.97 11.06 8.52 15.38 18.40 16.89 48.50 28.16 38.33
WV-41878 WV-40363 5.85 5.52 5.68 7.43 14.41 10.92 47.23 34.12 40.68
WV-41879 WV-40363 5.63 6.74 6.18 9.62 21.27 15.44 46.87 32.91 39.89
WV-41880 WV-40363 10.29 8.44 9.37 15.31 28.63 21.97 51.46 47.33 49.40
WV-41881 WV-40363 9.92 4.17 7.05 10.33 14.46 12.39 43.85 21.59 32.72
WV-41882 WV-40363 13.65 5.75 9.70 10.88 15.83 13.35 55.85 36.53 46.19
WV-41883 WV-40363 9.07 3.28 6.17 8.94 13.46 11.20 45.02 33.10 39.06
WV-41884 WV-40363 10.71 19.29 15.00 28.36 19.07 23.72 52.92 40.91 46.91
WV-41885 WV-40363 N.D. 12.96 12.96 23.88 13.45 18.66 41.25 29.12 35.18
WV-41886 WV-40363 4.17 5.94 5.06 12.97 11.50 12.23 39.75 31.68 35.71
WV-41887 WV-40363 4.80 3.90 4.35 10.94 12.86 11.90 29.11 31.18 30.15
WV-41888 WV-40363 6.46 5.25 5.85 10.21 20.24 15.23 40.51 30.90 35.71
WV-41889 WV-40363 13.27 4.90 9.09 13.00 15.52 14.26 46.61 28.85 37.73
WV-41890 WV-40363 15.63 6.01 10.82 12.18 19.22 15.70 52.87 42.09 47.48
WV-41891 WV-40363 36.52 13.82 25.17 34.15 45.99 40.07 82.93 69.08 76.00
WV-41892 WV-40363 11.43 15.85 13.64 11.28 20.93 16.11 55.21 48.83 52.02
WV-41893 WV-40363 48.93 57.98 53.45 60.30 73.86 67.08 105.27 90.58 97.93
실시예 6. 제공된 올리고뉴클레오티드 및 조성물은 시험관내에서 마우스 트랜스티레틴(mTTR)을 효과적으로 넉다운시킬 수 있다.
마우스 TTR에 대한 다양한 siRNA를 설계하고 구성하였다. 다수의 siRNA를 하나 또는 일정 범위의 농도로 마우스 원발성 간세포에서 시험관 내에서 테스트하였다. 일부 siRNA를 마우스(예를 들어, C57BL6 야생형 마우스)에서 테스트하였다.
siRNA 활성의 시험관내 측정을 위한 예시 프로토콜: siRNA 활성 측정을 위해, 특정 농도의 siRNA를 10,000개 세포/웰로 96-웰 플레이트에 플레이팅된 마우스 원발성 간세포에 짐노틱 방식으로 전달하였다. 48시간 처리 후, SV96 Total RNA Isolation 키트(Promega)를 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. RNA 샘플로부터의 cDNA 생성은 제조업체의 설명서에 따라 High-Capacity cDNA Reverse Transcription 키트(Thermo Fisher)를 사용하여 수행하였으며 iQ Multiplex Powermix(Bio-Rad)를 사용하여 CFX 시스템에서 qPCR 분석을 수행하였다. 마우스 TTR mRNA의 경우, 다음의 qPCR 분석을 사용하였다: IDT Taqman qPCR 분석 ID Mm.PT.58.11922308. 마우스 HPRT를 노멀라이저(정방향 5'CAAACTTTGCTTTCCCCTGGTT3', 역방향 5'TGCCTGTATCCAACACTTC3', 프로브 5'/5HEX/ACCAGCAAG/Zen/CTTGCAACCTTAACC/3IABkFQ/3')로서 사용하였다. mRNA 넉다운 수준을 모의 처리 대비 mRNA 잔존 백분율로서 계산하였다.
표 13은 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 TTR mRNA 잔존 백분율(1500, 500, 및 150 pM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D.: 측정되지 않음
　 　 1500 pM 500 pM 150 pM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균
WV-36838 WV-28310 4.78 6.16 5.47 6.76 10.19 8.47 18.80 26.37 22.59
WV-20167 WV-28310 6.44 5.87 6.15 5.41 6.55 5.98 18.95 28.62 23.79
WV-38670 WV-28310 34.75 53.82 44.29 74.53 85.75 80.14 78.70 87.42 83.06
WV-38671 WV-28310 13.34 22.07 17.70 26.51 32.91 29.71 53.34 54.79 54.07
WV-38672 WV-28310 8.76 12.61 10.69 18.32 23.18 20.75 38.99 44.87 41.93
WV-38673 WV-28310 7.53 11.99 9.76 13.38 14.73 14.05 29.86 33.98 31.92
WV-38674 WV-28310 7.11 12.59 9.85 11.88 15.23 13.55 33.65 35.09 34.37
WV-38675 WV-28310 6.56 10.15 8.35 10.16 14.26 12.21 22.57 26.20 24.38
WV-38676 WV-28310 8.05 8.49 8.27 11.99 13.55 12.77 29.09 33.58 31.34
WV-38677 WV-28310 7.61 8.70 8.15 12.52 15.12 13.82 30.43 35.58 33.00
WV-38678 WV-28310 5.65 6.34 5.99 8.72 11.26 9.99 22.45 31.68 27.06
WV-38679 WV-28310 6.96 9.08 8.02 8.45 9.88 9.16 20.26 27.50 23.88
WV-38680 WV-28310 6.60 7.87 7.24 8.05 11.79 9.92 22.73 29.50 26.11
WV-38681 WV-28310 7.05 9.18 8.12 8.64 14.03 11.34 21.39 34.24 27.81
WV-38682 WV-28310 7.73 8.77 8.25 9.64 10.63 10.13 27.06 33.41 30.23
WV-38683 WV-28310 8.63 10.90 9.76 11.67 13.18 12.42 26.30 34.73 30.51
WV-38684 WV-28310 6.37 8.52 7.44 7.45 9.74 8.59 23.87 25.98 24.92
WV-38685 WV-28310 5.93 7.11 6.52 9.21 11.13 10.17 17.97 29.56 23.76
WV-38686 WV-28310 4.76 6.12 5.44 7.98 12.38 10.18 27.64 31.31 29.47
WV-38687 WV-28310 5.96 8.38 7.17 6.85 8.19 7.52 17.15 24.69 20.92
WV-38688 WV-28310 6.60 6.82 6.71 7.41 9.84 8.63 19.52 27.74 23.63
WV-38689 WV-28310 7.92 10.35 9.14 9.66 14.63 12.15 24.21 31.35 27.78
WV-38690 WV-28310 9.44 10.95 10.19 13.44 20.90 17.17 44.40 53.75 49.08
WV-36838 WV-36860 9.64 9.47 9.55 11.40 18.35 14.87 27.23 43.32 35.27
WV-38670 WV-36860 47.13 57.26 52.20 56.95 65.93 61.44 74.12 84.89 79.50
WV-38671 WV-36860 21.08 24.23 22.66 41.42 48.49 44.95 56.63 73.49 65.06
WV-38672 WV-36860 8.33 10.90 9.61 19.81 28.09 23.95 53.76 67.37 60.56
WV-38673 WV-36860 9.28 12.76 11.02 15.29 26.40 20.84 36.73 48.22 42.47
WV-38674 WV-36860 9.72 12.07 10.90 18.45 26.19 22.32 46.77 63.83 55.30
WV-38675 WV-36860 8.85 11.04 9.94 14.39 18.05 16.22 31.57 43.68 37.62
WV-38676 WV-36860 9.38 11.90 10.64 15.10 21.39 18.24 43.86 56.07 49.97
WV-38677 WV-36860 11.74 14.89 13.32 19.99 26.72 23.36 38.90 45.24 42.07
WV-38678 WV-36860 6.09 8.01 7.05 8.66 12.09 10.37 29.67 29.78 29.72
WV-38679 WV-36860 5.90 6.93 6.41 9.93 12.17 11.05 28.08 34.17 31.13
WV-38680 WV-36860 5.07 6.71 5.89 9.21 11.39 10.30 29.31 38.52 33.92
WV-38681 WV-36860 7.15 8.47 7.81 9.34 12.97 11.16 27.08 36.99 32.03
WV-38682 WV-36860 7.74 9.77 8.76 10.21 12.23 11.22 33.92 40.78 37.35
WV-38683 WV-36860 9.32 11.36 10.34 13.67 16.91 15.29 32.30 43.92 38.11
WV-38684 WV-36860 6.96 8.92 7.94 9.34 11.10 10.22 31.40 38.88 35.14
WV-38685 WV-36860 8.19 9.65 8.92 17.01 17.75 17.38 29.17 38.02 33.59
WV-38686 WV-36860 6.82 9.13 7.98 10.45 12.98 11.71 26.63 37.42 32.02
WV-38687 WV-36860 6.47 7.10 6.79 12.29 13.65 12.97 26.65 40.32 33.49
WV-38688 WV-36860 7.11 8.03 7.57 12.57 16.32 14.44 33.72 48.26 40.99
WV-38689 WV-36860 8.93 9.52 9.22 19.21 18.30 18.76 43.50 53.09 48.30
WV-38690 WV-36860 29.40 32.54 30.97 53.13 47.10 50.11 73.07 74.04 73.56
표 14는 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 TTR mRNA 잔존 백분율(1500, 500, 및 150 pM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D.: 측정되지 않음
　 　 1500 pM 500 pM 150 pM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균
WV-20167 WV-28310 2.14 2.13 2.13 3.84 3.75 3.79 10.75 11.50 11.13
WV-20167 WV-36860 1.95 2.04 1.99 4.32 3.94 4.13 9.85 9.88 9.87
WV-20170 WV-28310 1.93 1.87 1.90 3.05 2.75 2.90 6.20 5.96 6.08
WV-20170 WV-36860 1.87 2.29 2.08 3.77 3.23 3.50 7.90 7.79 7.84
WV-37856 WV-28310 3.61 2.81 3.21 7.75 4.83 6.29 20.74 19.52 20.13
WV-37857 WV-28310 3.18 2.81 3.00 7.54 6.24 6.89 26.43 23.14 24.78
WV-37874 WV-28310 71.32 71.58 71.45 91.66 92.47 92.06 82.83 82.81 82.82
WV-37875 WV-28310 79.08 75.27 77.18 97.35 93.96 95.66 97.76 97.54 97.65
WV-37892 WV-28310 2.57 2.64 2.60 6.08 5.78 5.93 16.86 16.78 16.82
WV-37893 WV-28310 1.99 1.88 1.94 3.54 3.68 3.61 10.16 10.57 10.37
WV-38703 WV-28310 2.67 2.81 2.74 6.37 6.14 6.25 19.77 22.14 20.96
WV-38704 WV-28310 3.44 3.44 3.44 6.94 6.78 6.86 24.82 22.99 23.91
WV-38705 WV-28310 40.98 26.10 33.54 83.19 57.86 70.52 85.33 89.22 87.27
WV-38706 WV-28310 36.47 33.27 34.87 79.02 61.53 70.27 96.22 98.60 97.41
WV-38707 WV-28310 1.65 1.64 1.65 2.71 2.79 2.75 11.77 12.04 11.90
WV-38708 WV-28310 1.92 1.94 1.93 3.98 3.79 3.89 8.28 8.07 8.17
WV-37856 WV-36860 4.11 4.28 4.20 11.06 10.94 11.00 26.16 25.89 26.02
WV-37857 WV-36860 3.54 3.50 3.52 12.29 12.61 12.45 24.47 23.07 23.77
WV-37874 WV-36860 68.59 69.82 69.21 81.35 86.08 83.71 80.88 80.02 80.45
WV-37875 WV-36860 87.42 66.61 77.01 104.70 75.74 90.22 77.59 99.62 88.60
WV-37892 WV-36860 2.53 2.67 2.60 6.69 5.90 6.29 18.31 18.42 18.36
WV-37893 WV-36860 2.22 2.58 2.40 4.47 4.68 4.58 8.79 9.06 8.93
WV-38703 WV-36860 2.96 3.05 3.00 7.73 7.75 7.74 15.13 16.86 15.99
WV-38704 WV-36860 3.61 3.74 3.68 8.83 8.59 8.71 23.69 22.57 23.13
WV-38705 WV-36860 48.37 48.88 48.62 80.89 80.85 80.87 104.36 103.44 103.90
WV-38706 WV-36860 42.63 47.69 45.16 70.80 68.41 69.61 88.46 86.25 87.36
WV-38707 WV-36860 1.96 2.06 2.01 3.30 3.60 3.45 8.20 8.52 8.36
WV-38708 WV-36860 2.19 1.75 1.97 4.20 3.94 4.07 20.65 9.82 15.23
표 15는 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 TTR mRNA 잔존 백분율(300 및 100 pM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D.: 측정되지 않음
　 　 300 pM 100 pM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-1		 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-2		 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-1		 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-2		 평균
WV-37856 WV-40362 19.14 19.60 19.37 32.79 60.24 46.52
WV-37874 WV-40362 72.88 68.84 70.86 68.25 92.19 80.22
WV-37892 WV-40362 1.97 2.65 2.31 4.39 11.53 7.96
WV-40539 WV-40362 2.15 3.18 2.66 5.15 13.06 9.10
WV-40540 WV-40362 35.81 39.94 37.87 51.71 95.45 73.58
WV-40541 WV-40362 8.39 9.49 8.94 15.67 33.26 24.47
WV-40542 WV-40362 40.68 47.35 44.01 47.46 74.58 61.02
WV-40543 WV-40362 84.06 N.D. 84.06 71.83 88.15 79.99
WV-40544 WV-40362 24.13 23.19 23.66 42.33 61.56 51.94
WV-37857 WV-40362 6.01 N.D. 6.01 12.62 30.78 21.70
WV-37875 WV-40362 66.29 58.23 62.26 74.22 84.39 79.31
WV-37893 WV-40362 2.81 3.01 2.91 6.54 11.65 9.09
WV-40545 WV-40362 2.05 2.27 2.16 7.00 10.86 8.93
WV-40546 WV-40362 5.74 6.09 5.91 15.96 26.23 21.10
WV-40547 WV-40362 86.05 83.11 84.58 75.97 85.26 80.62
WV-40548 WV-40362 68.26 69.91 69.08 68.25 79.56 73.91
WV-40549 WV-40362 33.88 38.55 36.21 53.52 61.76 57.64
WV-40550 WV-40362 4.31 5.17 4.74 9.66 16.74 13.20
WV-38704 WV-40362 1.92 2.23 2.07 5.50 7.01 6.26
WV-38706 WV-40362 56.29 76.07 66.18 77.92 92.39 85.15
WV-38708 WV-40362 2.07 1.96 2.01 5.58 8.45 7.01
WV-40552 WV-40362 0.53 0.52 0.52 0.67 0.99 0.83
WV-40796 WV-40362 30.68 36.77 33.72 45.85 35.79 40.82
WV-40553 WV-40362 67.09 67.40 67.25 N.D. 67.84 67.84
WV-40797 WV-40362 2.34 2.58 2.46 4.68 9.72 7.20
WV-40555 WV-40362 20.65 27.89 24.27 40.66 51.56 46.11
WV-40556 WV-40362 1.15 1.11 1.13 1.83 3.10 2.46
WV-37856 WV-40363 8.63 13.12 10.87 26.15 41.69 33.92
WV-37874 WV-40363 62.50 61.86 62.18 77.87 88.17 83.02
WV-37892 WV-40363 0.51 0.65 0.58 0.76 0.92 0.84
WV-40539 WV-40363 11.29 N.D. 11.29 31.65 30.95 31.30
WV-40540 WV-40363 63.43 83.64 73.53 78.70 75.62 77.16
WV-40541 WV-40363 36.81 40.62 38.72 66.34 66.57 66.46
WV-40542 WV-40363 2.60 2.82 2.71 5.34 8.50 6.92
WV-40543 WV-40363 11.69 14.44 13.06 33.12 40.22 36.67
WV-40544 WV-40363 35.04 40.17 37.60 54.56 67.07 60.81
WV-37857 WV-40363 6.17 8.24 7.20 23.45 28.25 25.85
WV-37875 WV-40363 27.16 35.49 31.32 55.62 58.21 56.92
WV-37893 WV-40363 5.31 N.D. 5.31 22.77 20.81 21.79
WV-40545 WV-40363 27.39 21.95 24.67 37.26 40.02 38.64
WV-40546 WV-40363 32.94 42.86 37.90 55.36 58.87 57.12
WV-40547 WV-40363 53.68 57.83 55.76 68.83 75.06 71.95
WV-40548 WV-40363 2.28 N.D. 2.28 3.44 6.18 4.81
WV-40549 WV-40363 53.24 89.24 71.24 77.22 81.69 79.46
WV-40550 WV-40363 6.14 10.46 8.30 21.02 32.11 26.57
WV-38704 WV-40363 0.64 0.75 0.70 1.06 1.31 1.19
WV-38706 WV-40363 28.57 62.83 45.70 74.13 58.06 66.09
WV-38708 WV-40363 18.91 24.61 21.76 49.00 49.33 49.16
WV-40552 WV-40363 1.29 1.74 1.52 2.35 5.16 3.75
WV-40796 WV-40363 32.41 35.36 33.88 48.21 64.51 56.36
WV-40553 WV-40363 36.59 36.14 36.37 53.39 72.68 63.04
WV-40797 WV-40363 101.33 98.62 99.98 92.36 95.55 93.96
WV-40555 WV-40363 46.02 60.72 53.37 74.42 91.30 82.86
WV-40556 WV-40363 0.83 0.79 0.81 1.03 1.64 1.33
WV-37856 WV-40364 7.47 10.71 9.09 33.82 29.38 31.60
WV-37874 WV-40364 75.54 89.39 82.47 92.77 81.22 86.99
WV-37892 WV-40364 3.77 4.22 3.99 10.56 20.53 15.54
WV-40539 WV-40364 7.69 7.94 7.82 15.08 33.77 24.42
WV-40540 WV-40364 71.89 60.91 66.40 85.07 79.92 82.50
WV-40541 WV-40364 103.05 119.53 111.29 106.03 97.25 101.64
WV-40542 WV-40364 55.01 67.12 61.07 81.80 89.07 85.43
WV-40543 WV-40364 2.88 3.97 3.43 17.35 22.71 20.03
WV-40544 WV-40364 7.56 12.97 10.27 N.D. 33.60 33.60
WV-37857 WV-40364 62.03 79.96 70.99 93.37 81.41 87.39
WV-37875 WV-40364 83.79 80.06 81.92 88.03 85.21 86.62
WV-37893 WV-40364 1.57 2.51 2.04 2.96 6.08 4.52
WV-40545 WV-40364 2.31 2.84 2.58 6.72 8.68 7.70
WV-40546 WV-40364 64.11 106.42 85.27 105.26 87.19 96.22
WV-40547 WV-40364 79.40 98.68 89.04 102.73 91.19 96.96
WV-40548 WV-40364 0.65 0.58 0.61 0.99 1.18 1.09
WV-40549 WV-40364 6.59 40.61 23.60 76.37 34.85 55.61
WV-40550 WV-40364 43.88 68.23 56.06 91.61 73.77 82.69
WV-38704 WV-40364 5.59 6.29 5.94 15.37 30.74 23.05
WV-38706 WV-40364 62.63 63.30 62.96 70.47 85.78 78.13
WV-38708 WV-40364 2.25 1.96 2.10 5.02 9.31 7.16
WV-40552 WV-40364 76.38 113.04 94.71 103.23 91.86 97.55
WV-40796 WV-40364 79.89 104.99 92.44 104.37 98.77 101.57
WV-40553 WV-40364 2.34 2.10 2.22 14.27 22.75 18.51
WV-40797 WV-40364 5.22 10.08 7.65 35.07 35.64 35.35
WV-40555 WV-40364 82.01 84.64 83.32 99.13 87.24 93.18
WV-40556 WV-40364 7.86 8.03 7.95 15.48 29.11 22.29
WV-37856 WV-40365 16.52 23.35 19.94 32.42 66.57 49.50
WV-37874 WV-40365 90.68 76.33 83.51 120.32 94.07 107.19
WV-37892 WV-40365 19.60 12.76 16.18 37.97 35.48 36.73
WV-40539 WV-40365 22.08 13.19 17.64 46.36 48.14 47.25
WV-40540 WV-40365 62.11 52.76 57.44 93.14 103.12 98.13
WV-40541 WV-40365 90.98 74.62 82.80 117.81 111.99 114.90
WV-40542 WV-40365 16.76 10.63 13.70 46.16 43.11 44.63
WV-40543 WV-40365 65.91 42.83 54.37 70.88 94.77 82.83
WV-40544 WV-40365 21.28 21.60 21.44 32.26 45.94 39.10
WV-37857 WV-40365 23.70 13.84 18.77 38.09 43.53 40.81
WV-37875 WV-40365 96.57 76.55 86.56 97.98 93.03 95.51
WV-37893 WV-40365 10.40 5.58 7.99 12.32 23.03 17.68
WV-40545 WV-40365 9.58 5.29 7.44 18.20 28.85 23.52
WV-40546 WV-40365 83.14 74.39 78.76 102.03 104.63 103.33
WV-40547 WV-40365 91.56 56.75 74.16 101.91 113.91 107.91
WV-40548 WV-40365 9.25 4.84 7.04 15.40 26.43 20.91
WV-40549 WV-40365 58.03 53.80 55.91 78.30 82.72 80.51
WV-40550 WV-40365 13.47 6.91 10.19 14.37 28.25 21.31
WV-38704 WV-40365 18.84 19.10 18.97 31.88 40.27 36.07
WV-38706 WV-40365 71.63 59.55 65.59 74.87 100.88 87.87
WV-38708 WV-40365 9.18 5.43 7.31 16.02 28.91 22.47
WV-40552 WV-40365 10.13 7.76 8.94 16.45 24.26 20.36
WV-40796 WV-40365 63.00 52.31 57.66 82.62 84.45 83.54
WV-40553 WV-40365 68.22 51.92 60.07 66.41 100.39 83.40
WV-40797 WV-40365 6.97 N.D. 6.97 13.05 24.16 18.61
WV-40555 WV-40365 46.23 39.73 42.98 54.14 71.82 62.98
WV-40556 WV-40365 9.78 7.84 8.81 16.64 27.05 21.85
WV-37856 WV-40366 21.25 18.03 19.64 34.52 41.08 37.80
WV-37874 WV-40366 80.85 77.50 79.18 99.10 125.34 112.22
WV-37892 WV-40366 23.50 17.67 20.58 31.86 47.88 39.87
WV-40539 WV-40366 26.56 18.72 22.64 42.76 55.59 49.17
WV-40540 WV-40366 96.75 88.81 92.78 93.69 118.06 105.88
WV-40541 WV-40366 79.18 88.92 84.05 105.73 122.69 114.21
WV-40542 WV-40366 14.45 8.95 11.70 19.94 26.73 23.34
WV-40543 WV-40366 60.46 59.64 60.05 79.07 83.34 81.20
WV-40544 WV-40366 34.78 19.97 27.37 39.90 52.21 46.05
WV-37857 WV-40366 N.D. 16.31 16.31 33.17 51.40 42.28
WV-37875 WV-40366 94.86 90.47 92.67 100.02 109.77 104.89
WV-37893 WV-40366 11.74 8.38 10.06 24.86 38.09 31.48
WV-40545 WV-40366 13.08 8.57 10.82 21.10 31.30 26.20
WV-40546 WV-40366 75.98 N.D. 75.98 85.77 106.67 96.22
WV-40547 WV-40366 104.64 83.88 94.26 93.09 112.45 102.77
WV-40548 WV-40366 9.16 10.31 9.73 14.63 23.28 18.96
WV-40549 WV-40366 88.66 77.61 83.14 85.27 89.09 87.18
WV-40550 WV-40366 15.63 9.26 12.45 26.09 38.01 32.05
WV-38704 WV-40366 21.83 16.41 19.12 32.25 50.52 41.39
WV-38706 WV-40366 74.20 60.70 67.45 97.14 102.29 99.71
WV-38708 WV-40366 11.72 8.26 9.99 20.30 27.84 24.07
WV-40552 WV-40366 7.08 6.10 6.59 11.33 19.38 15.36
WV-40796 WV-40366 85.16 64.19 74.67 88.56 81.93 85.24
WV-40553 WV-40366 77.45 56.47 66.96 82.29 82.12 82.20
WV-40797 WV-40366 N.D. 4.79 4.79 16.93 21.88 19.41
WV-40555 WV-40366 63.12 53.63 58.38 97.04 85.53 91.29
WV-40556 WV-40366 14.77 9.47 12.12 21.70 37.37 29.54
표 16은 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 TTR mRNA 잔존 백분율(1000, 300, 및 100 pM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D.: 측정되지 않음
　 　 1000 pM 300 pM 100 pM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/HPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균
WV-20170 WV-40363 7.35 7.04 7.20 17.96 12.47 15.22 29.23 28.46 28.85
WV-40836 WV-40363 21.09 12.56 16.83 36.04 28.19 32.12 48.25 69.21 58.73
WV-40837 WV-40363 30.63 23.56 27.09 50.90 54.67 52.79 73.91 72.12 73.01
WV-40838 WV-40363 12.53 14.29 13.41 35.87 33.01 34.44 43.45 59.25 51.35
WV-40839 WV-40363 19.08 27.61 23.35 56.17 60.08 58.13 78.08 141.60 109.84
WV-37896 WV-40363 11.72 25.05 18.38 40.55 41.32 40.94 48.61 50.45 49.53
WV-37900 WV-40363 22.19 29.23 25.71 60.59 47.83 54.21 64.53 65.04 64.79
WV-40840 WV-40363 18.35 22.20 20.28 53.05 43.69 48.37 56.56 60.28 58.42
WV-40841 WV-40363 28.30 38.83 33.56 61.39 62.49 61.94 69.26 84.16 76.71
WV-40842 WV-40363 14.73 13.80 14.27 39.62 29.16 34.39 52.53 70.35 61.44
WV-40843 WV-40363 33.41 24.59 29.00 47.32 54.22 50.77 68.43 84.06 76.25
WV-40844 WV-40363 15.31 14.37 14.84 40.00 33.21 36.60 43.83 60.76 52.29
WV-40845 WV-40363 27.56 37.55 32.55 59.80 66.87 63.33 82.84 100.84 91.84
WV-20171 WV-40363 4.80 4.67 4.73 13.25 10.00 11.62 22.26 23.65 22.95
WV-40846 WV-40363 9.52 12.50 11.01 29.56 26.08 27.82 37.91 44.65 41.28
WV-40847 WV-40363 13.62 21.75 17.69 48.17 41.13 44.65 52.65 62.28 57.46
WV-40848 WV-40363 12.19 11.20 11.69 30.64 24.77 27.71 36.07 40.54 38.30
WV-40849 WV-40363 21.25 20.96 21.10 44.05 39.29 41.67 50.67 64.82 57.75
WV-40850 WV-40363 8.59 8.78 8.68 27.39 21.37 24.38 40.64 67.47 54.05
WV-40851 WV-40363 12.02 13.89 12.96 39.28 35.95 37.61 55.45 77.18 66.32
WV-40852 WV-40363 13.11 18.39 15.75 37.88 40.57 39.22 51.19 64.76 57.97
WV-40853 WV-40363 23.52 35.34 29.43 57.76 60.55 59.16 71.01 101.47 86.24
WV-40854 WV-40363 9.45 16.28 12.87 31.74 34.37 33.06 46.58 40.28 43.43
WV-40855 WV-40363 20.60 27.24 23.92 56.22 46.95 51.58 59.79 75.58 67.68
WV-40856 WV-40363 9.51 11.54 10.52 112.77 57.30 85.04 45.55 43.19 44.37
WV-40857 WV-40363 15.19 23.76 19.47 46.61 47.86 47.23 58.28 63.09 60.68
WV-38107 WV-40363 6.76 7.35 7.05 19.46 16.27 17.87 27.23 32.01 29.62
WV-40858 WV-40363 12.03 12.11 12.07 29.90 22.57 26.24 46.14 78.54 62.34
WV-40859 WV-40363 25.61 22.43 24.02 50.73 42.01 46.37 66.99 88.59 77.79
WV-40860 WV-40363 14.43 12.00 13.22 32.79 29.92 31.36 40.75 51.12 45.93
WV-40861 WV-40363 20.60 26.22 23.41 45.16 57.88 51.52 64.89 74.57 69.73
WV-40862 WV-40363 12.97 13.90 13.44 31.29 30.70 30.99 43.89 56.15 50.02
WV-40863 WV-40363 20.98 24.20 22.59 58.79 40.48 49.64 61.06 65.22 63.14
WV-40864 WV-40363 17.32 23.31 20.32 55.25 45.84 50.54 54.47 63.20 58.83
WV-40865 WV-40363 31.57 34.07 32.82 68.07 57.26 62.67 72.99 78.61 75.80
WV-40866 WV-40363 14.91 10.52 12.72 35.98 24.83 30.40 44.31 76.93 60.62
WV-40867 WV-40363 29.62 29.97 29.79 59.59 47.23 53.41 66.93 87.50 77.22
WV-40868 WV-40363 16.63 13.57 15.10 30.32 24.59 27.46 45.41 50.56 47.98
WV-40869 WV-40363 32.09 38.31 35.20 54.16 52.59 53.37 78.45 108.82 93.64
표 17은 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 TTR mRNA 잔존 백분율(300, 100, 및 30 pM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D.: 측정되지 않음
　 　 300 pM 100 pM 30 pM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균
WV-20170 WV-40870 26.39 22.52 24.45 45.59 38.59 42.09 58.85 53.11 55.98
WV-20170 WV-40871 24.43 17.14 20.79 51.95 45.72 48.83 53.10 54.58 53.84
WV-20170 WV-40872 22.62 22.12 22.37 36.53 35.49 36.01 53.60 55.33 54.46
WV-20170 WV-40873 24.03 23.16 23.59 50.98 48.60 49.79 59.90 65.20 62.55
WV-20170 WV-40874 32.54 28.04 30.29 52.97 44.22 48.59 60.30 69.09 64.69
WV-20170 WV-40875 28.94 27.72 28.33 49.27 50.96 50.11 49.13 60.95 55.04
WV-20170 WV-40876 26.66 24.00 25.33 40.23 N.D. 40.23 61.39 61.86 61.63
WV-20170 WV-40877 31.64 28.58 30.11 48.11 50.61 49.36 68.73 70.03 69.38
WV-20170 WV-40878 27.10 23.04 25.07 41.49 34.10 37.79 50.58 71.44 61.01
WV-20170 WV-40879 32.38 23.76 28.07 44.54 45.75 45.14 53.65 59.37 56.51
WV-20170 WV-40881 29.44 27.88 28.66 54.71 49.40 52.05 69.42 62.19 65.80
WV-20170 WV-40882 29.90 31.56 30.73 49.26 55.60 52.43 59.38 61.94 60.66
WV-20170 WV-40883 25.35 24.16 24.76 38.69 35.87 37.28 46.48 58.87 52.67
WV-20170 WV-40884 33.34 26.13 29.74 52.03 46.60 49.31 55.94 63.50 59.72
WV-20170 WV-40885 30.07 24.64 27.36 40.22 50.83 45.52 57.31 65.49 61.40
WV-20170 WV-40886 25.17 21.76 23.46 45.56 44.08 44.82 65.38 71.08 68.23
WV-20170 WV-40887 27.37 19.82 23.60 47.66 40.68 44.17 45.25 62.30 53.77
WV-20170 WV-40888 37.63 24.41 31.02 57.86 49.41 53.64 58.08 64.88 61.48
WV-20170 WV-40889 29.88 28.40 29.14 49.79 47.27 48.53 61.22 71.96 66.59
WV-20170 WV-40890 33.04 31.30 32.17 54.45 60.93 57.69 59.05 68.45 63.75
WV-38708 WV-40870 27.72 25.82 26.77 52.69 49.46 51.08 56.26 65.04 60.65
WV-38708 WV-40871 27.11 23.67 25.39 52.20 50.09 51.15 50.51 64.68 57.60
WV-38708 WV-40872 17.21 23.51 20.36 46.31 46.74 46.53 57.88 62.44 60.16
WV-38708 WV-40873 25.95 17.58 21.77 38.56 37.08 37.82 50.12 55.70 52.91
WV-38708 WV-40874 34.60 32.26 33.43 61.76 56.40 59.08 58.01 63.67 60.84
WV-38708 WV-40875 16.49 16.66 16.57 33.44 33.80 33.62 43.79 48.04 45.92
WV-38708 WV-40876 19.13 18.07 18.60 38.39 40.97 39.68 40.86 N.D. 40.86
WV-38708 WV-40877 34.00 30.82 32.41 50.47 52.29 51.38 68.70 62.10 65.40
WV-38708 WV-40878 34.75 34.91 34.83 74.04 63.62 68.83 64.16 65.95 65.06
WV-38708 WV-40879 23.53 23.94 23.73 44.51 45.01 44.76 52.67 62.15 57.41
WV-38708 WV-40881 27.85 31.21 29.53 53.91 58.06 55.98 68.98 68.21 68.59
WV-38708 WV-40882 16.07 12.82 14.44 43.32 34.24 38.78 38.97 40.79 39.88
WV-38708 WV-40883 39.77 33.01 36.39 55.31 49.16 52.23 61.55 63.98 62.76
WV-38708 WV-40884 30.66 29.18 29.92 61.02 60.10 60.56 63.95 70.95 67.45
WV-38708 WV-40885 37.17 34.25 35.71 54.21 60.26 57.24 77.94 71.99 74.97
WV-38708 WV-40886 42.56 33.47 38.01 60.24 69.73 64.99 61.29 85.68 73.48
WV-38708 WV-40887 36.08 29.91 33.00 66.12 60.82 63.47 73.05 71.85 72.45
WV-38708 WV-40888 25.62 23.85 24.73 62.50 60.49 61.49 57.08 62.64 59.86
WV-38708 WV-40889 42.87 42.31 42.59 70.29 60.52 65.40 77.53 72.19 74.86
WV-38708 WV-40890 35.77 35.81 35.79 85.18 63.51 74.35 58.53 69.72 64.13
WV-20170 WV-40363 21.07 16.24 18.66 36.61 36.01 36.31 41.13 51.98 46.56
WV-38708 WV-40363 32.33 24.96 28.64 46.84 40.47 43.65 54.54 65.25 59.90
WV-20167 WV-40362 25.67 19.69 22.68 52.39 57.14 54.76 50.77 68.74 59.76
WV-38704 WV-40362 51.23 50.40 50.81 70.91 70.07 70.49 76.11 79.19 77.65
표 18은 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 TTR mRNA 잔존 백분율(500 및 150 pM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D.: 측정되지 않음
　 　 500 pM 150 pM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균
WV-41894 WV-40363 12.15 9.57 10.86 44.47 51.04 47.76
WV-41895 WV-40363 60.06 67.53 63.79 61.67 80.92 71.29
WV-41896 WV-40363 70.93 81.76 76.35 86.66 104.01 95.33
WV-41897 WV-40363 43.99 45.52 44.75 42.77 62.09 52.43
WV-41898 WV-40363 16.05 18.99 17.52 49.79 78.78 64.29
WV-41899 WV-40363 28.89 41.37 35.13 34.69 39.68 37.18
WV-41900 WV-40363 5.59 6.07 5.83 11.39 8.40 9.89
WV-41901 WV-40363 N.D. 9.79 9.79 9.58 10.78 10.18
WV-41902 WV-40363 2.89 4.30 3.59 4.43 7.17 5.80
WV-41903 WV-40363 2.64 3.03 2.83 6.84 6.09 6.47
WV-41904 WV-40363 2.22 2.10 2.16 4.54 4.15 4.34
WV-41905 WV-40363 2.32 2.19 2.26 3.76 4.34 4.05
WV-41906 WV-40363 1.70 1.71 1.71 5.40 4.98 5.19
WV-41907 WV-40363 2.90 2.55 2.72 5.62 6.69 6.15
WV-41908 WV-40363 3.32 2.62 2.97 4.13 3.32 3.73
WV-41909 WV-40363 3.28 3.73 3.51 4.93 4.46 4.70
WV-41910 WV-40363 2.80 4.64 3.72 3.54 4.98 4.26
WV-41911 WV-40363 2.52 2.48 2.50 5.01 6.61 5.81
WV-41912 WV-40363 2.43 2.70 2.56 4.18 5.33 4.75
WV-41913 WV-40363 2.40 3.36 2.88 4.07 5.41 4.74
WV-41914 WV-40363 2.19 2.34 2.26 3.62 5.08 4.35
WV-41915 WV-40363 20.08 24.28 22.18 12.31 14.58 13.45
WV-41916 WV-40363 26.00 33.95 29.97 101.38 81.86 91.62
WV-41917 WV-40363 4.88 5.62 5.25 6.47 5.78 6.12
WV-41918 WV-40363 2.98 4.26 3.62 2.97 3.12 3.05
WV-41919 WV-40363 3.69 5.58 4.63 5.54 5.54 5.54
WV-41920 WV-40363 3.15 3.78 3.46 5.18 6.29 5.73
WV-41921 WV-40363 4.73 7.42 6.08 7.49 9.81 8.65
WV-41922 WV-40363 2.30 2.59 2.44 3.75 3.19 3.47
WV-41923 WV-40363 3.73 5.08 4.40 6.32 5.71 6.02
WV-41924 WV-40363 3.96 5.50 4.73 8.17 10.12 9.14
WV-41925 WV-40363 2.64 4.05 3.34 4.83 6.00 5.42
WV-41926 WV-40363 4.25 5.09 4.67 2.97 3.97 3.47
WV-41927 WV-40363 2.57 3.78 3.17 2.83 3.93 3.38
WV-41928 WV-40363 2.60 2.38 2.49 3.21 4.41 3.81
WV-41929 WV-40363 2.78 2.54 2.66 4.48 5.08 4.78
WV-41930 WV-40363 1.83 3.93 2.88 16.15 26.00 21.07
WV-41931 WV-40363 4.25 2.83 3.54 4.10 4.49 4.29
WV-41932 WV-40363 2.97 4.98 3.98 2.96 3.49 3.22
WV-41933 WV-40363 4.83 5.49 5.16 5.68 5.24 5.46
WV-41934 WV-40363 5.41 7.24 6.32 3.18 4.97 4.07
WV-41935 WV-40363 4.26 4.47 4.36 2.94 3.86 3.40
WV-41936 WV-40363 4.04 4.72 4.38 3.41 5.16 4.28
WV-41937 WV-40363 22.43 22.50 22.47 7.82 9.35 8.58
WV-20170 WV-40363 2.73 2.31 2.52 11.66 19.99 15.83
WV-41938 WV-40363 27.09 37.76 32.43 75.33 84.05 79.69
WV-41939 WV-40363 86.04 90.31 88.17 94.64 107.26 100.95
WV-41940 WV-40363 111.64 108.10 109.87 102.19 102.88 102.53
WV-41941 WV-40363 76.88 85.72 81.30 71.71 77.15 74.43
WV-41942 WV-40363 56.56 63.75 60.15 103.53 105.50 104.51
WV-41943 WV-40363 70.45 79.76 75.10 72.87 66.87 69.87
WV-41944 WV-40363 16.32 20.09 18.21 14.44 16.87 15.65
WV-41945 WV-40363 19.68 20.03 19.86 24.19 25.21 24.70
WV-41946 WV-40363 14.42 19.72 17.07 27.36 40.07 33.71
WV-41947 WV-40363 10.57 14.29 12.43 22.58 29.17 25.87
WV-41948 WV-40363 11.59 15.29 13.44 22.87 23.83 23.35
WV-41949 WV-40363 10.85 12.65 11.75 14.97 25.27 20.12
WV-41950 WV-40363 12.40 16.09 14.25 21.19 30.19 25.69
WV-41951 WV-40363 13.11 17.41 15.26 22.75 30.72 26.74
WV-41952 WV-40363 11.45 15.94 13.70 10.10 12.13 11.12
WV-41953 WV-40363 10.59 16.95 13.77 12.48 14.97 13.73
WV-41954 WV-40363 10.32 13.96 12.14 19.48 24.92 22.20
WV-41955 WV-40363 8.92 11.51 10.21 23.68 28.39 26.03
WV-41956 WV-40363 9.81 12.06 10.93 22.42 23.75 23.09
WV-41957 WV-40363 9.50 15.64 12.57 19.57 16.88 18.23
WV-41958 WV-40363 14.08 22.07 18.07 22.14 25.84 23.99
WV-41959 WV-40363 58.55 59.68 59.12 46.12 41.69 43.91
WV-41960 WV-40363 55.65 65.66 60.65 62.63 70.24 66.43
WV-41961 WV-40363 13.49 17.60 15.55 12.09 14.06 13.07
WV-41962 WV-40363 7.06 8.32 7.69 17.54 24.01 20.77
WV-41963 WV-40363 11.74 14.15 12.95 22.83 32.42 27.62
WV-41964 WV-40363 16.30 19.92 18.11 20.34 30.64 25.49
WV-41965 WV-40363 22.30 27.14 24.72 30.50 33.28 31.89
WV-41966 WV-40363 9.95 15.82 12.88 20.30 23.16 21.73
WV-41967 WV-40363 13.56 19.47 16.51 21.89 31.48 26.69
WV-41968 WV-40363 16.73 23.13 19.93 18.56 23.89 21.22
WV-41969 WV-40363 7.65 11.54 9.59 11.09 13.36 12.23
WV-41970 WV-40363 10.24 7.35 8.79 16.93 28.54 22.73
WV-41971 WV-40363 8.59 10.87 9.73 13.98 26.41 20.19
WV-41972 WV-40363 10.05 12.53 11.29 18.62 23.66 21.14
WV-41973 WV-40363 8.62 12.05 10.33 15.28 17.75 16.51
WV-41974 WV-40363 11.82 20.17 16.00 21.19 21.48 21.33
WV-41975 WV-40363 10.49 15.48 12.98 16.91 22.66 19.78
WV-41976 WV-40363 8.68 20.46 14.57 15.64 23.37 19.51
WV-41977 WV-40363 9.57 22.41 15.99 15.65 14.73 15.19
WV-41978 WV-40363 13.32 17.37 15.34 18.48 30.22 24.35
WV-41979 WV-40363 13.53 17.93 15.73 19.53 32.25 25.89
WV-41980 WV-40363 8.92 16.45 12.69 20.99 30.79 25.89
WV-41981 WV-40363 43.01 47.35 45.18 34.24 48.80 41.52
WV-20171 WV-40363 9.94 10.84 10.39 12.13 17.95 15.04
WV-41982 WV-40363 137.03 136.65 136.84 56.16 68.38 62.27
WV-41939 WV-40363 90.32 117.89 104.11 32.26 51.97 42.12
WV-41983 WV-40363 129.71 114.72 122.22 75.99 73.93 74.96
WV-41984 WV-40363 78.18 88.65 83.42 51.48 54.12 52.80
WV-41985 WV-40363 100.80 99.58 100.19 64.13 62.14 63.14
WV-41986 WV-40363 68.50 79.10 73.80 47.25 45.52 46.39
WV-41987 WV-40363 14.74 16.44 15.59 7.56 7.72 7.64
WV-41988 WV-40363 27.40 38.77 33.08 16.69 19.28 17.98
WV-41989 WV-40363 52.06 63.28 57.67 13.23 13.10 13.16
WV-41990 WV-40363 39.26 48.12 43.69 9.63 11.93 10.78
WV-41991 WV-40363 18.98 26.81 22.89 6.95 7.27 7.11
WV-41992 WV-40363 12.23 22.60 17.42 7.86 8.91 8.38
WV-41993 WV-40363 15.12 17.06 16.09 8.57 11.88 10.22
WV-41994 WV-40363 11.02 15.08 13.05 8.35 7.88 8.11
WV-41995 WV-40363 18.98 20.28 19.63 10.63 9.71 10.17
WV-41996 WV-40363 12.99 17.58 15.28 6.51 7.30 6.90
WV-41997 WV-40363 46.26 56.39 51.32 10.48 11.84 11.16
WV-41998 WV-40363 53.98 56.69 55.34 15.65 16.09 15.87
WV-41999 WV-40363 25.22 28.49 26.86 8.35 8.61 8.48
WV-42000 WV-40363 17.98 17.33 17.65 9.44 10.71 10.08
WV-42001 WV-40363 15.45 19.03 17.24 9.14 8.30 8.72
WV-42002 WV-40363 83.51 80.91 82.21 44.30 47.84 46.07
WV-42003 WV-40363 100.25 90.39 95.32 65.55 61.39 63.47
WV-41961 WV-40363 15.42 17.38 16.40 8.16 7.37 7.76
WV-42004 WV-40363 59.55 66.48 63.01 20.07 24.78 22.42
WV-42005 WV-40363 114.07 121.81 117.94 45.87 41.93 43.90
WV-42006 WV-40363 53.02 67.33 60.18 19.00 17.62 18.31
WV-42007 WV-40363 12.40 12.69 12.55 6.52 4.94 5.73
WV-42008 WV-40363 17.99 18.29 18.14 9.20 10.95 10.08
WV-42009 WV-40363 23.79 23.43 23.61 15.03 12.62 13.82
WV-42010 WV-40363 17.32 18.32 17.82 9.96 8.72 9.34
WV-42011 WV-40363 12.53 13.79 13.16 8.33 6.70 7.52
WV-42012 WV-40363 31.07 35.66 33.36 3.03 3.77 3.40
WV-42013 WV-40363 54.79 53.54 54.17 7.17 8.23 7.70
WV-42014 WV-40363 23.47 39.85 31.66 5.27 5.89 5.58
WV-42015 WV-40363 16.09 22.38 19.23 10.91 11.90 11.41
WV-42016 WV-40363 10.60 14.33 12.47 13.69 13.63 13.66
WV-42017 WV-40363 15.37 23.57 19.47 14.87 14.16 14.52
WV-42018 WV-40363 12.90 18.53 15.72 16.00 16.53 16.27
WV-42019 WV-40363 17.06 27.24 22.15 22.35 24.23 23.29
WV-42020 WV-40363 42.13 52.57 47.35 7.82 8.08 7.95
WV-42021 WV-40363 52.13 57.33 54.73 12.44 13.94 13.19
WV-42022 WV-40363 101.26 122.82 112.04 47.56 57.90 52.73
WV-42023 WV-40363 13.69 18.82 16.25 12.87 9.95 11.41
WV-31807 WV-40363 10.98 16.48 13.73 9.14 8.09 8.62
표 19는 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 TTR mRNA 잔존 백분율(500, 125, 및 31 pM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D.: 측정되지 않음
　 　 500 pM 125 pM 31 pM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균
WV-20167 WV-43768 4.03 3.55 3.79 14.88 18.00 16.44 33.08 44.15 38.62
WV-20170 WV-43769 3.33 3.92 3.63 15.05 19.90 17.48 46.89 43.93 45.41
WV-20171 WV-43769 2.34 2.90 2.62 10.09 12.76 11.42 32.50 36.14 34.32
WV-38708 WV-43769 2.88 4.37 3.62 14.77 22.91 18.84 45.11 53.07 49.09
WV-43256 WV-43769 4.11 4.61 4.36 16.31 24.85 20.58 43.61 53.08 48.34
WV-41825 WV-41828 3.15 4.71 3.93 15.41 20.74 18.07 44.16 52.39 48.27
WV-43770 WV-42080 1.34 2.11 1.72 5.93 11.25 8.59 24.44 32.93 28.68
WV-43771 WV-42080 1.38 2.27 1.83 5.87 9.06 7.46 19.99 31.20 25.60
WV-43772 WV-42080 2.10 2.44 2.27 11.29 9.76 10.52 35.17 35.67 35.42
WV-43773 WV-42080 7.68 7.11 7.40 22.29 22.91 22.60 54.76 47.86 51.31
WV-41826 WV-41828 3.61 4.90 4.26 15.66 19.64 17.65 46.23 43.39 44.81
WV-43774 WV-42080 1.59 3.24 2.41 7.52 11.37 9.45 29.94 39.62 34.78
WV-43775 WV-42080 1.76 2.52 2.14 7.37 8.59 7.98 23.53 36.17 29.85
WV-42078 WV-42080 2.28 3.97 3.13 9.02 16.95 12.99 39.73 52.74 46.24
WV-42079 WV-42080 4.69 7.16 5.93 16.22 20.62 18.42 35.94 44.44 40.19
표 20은 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 TTR mRNA 잔존 백분율(200 pM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D.: 측정되지 않음
　 　 200 pM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mF7/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mF7/mHPRT)-2 평균
WV-38708 WV-40363 6.44 6.95 6.69
WV-43256 WV-40363 13.06 18.60 15.83
WV-43257 WV-40363 7.69 5.90 6.80
WV-43258 WV-40363 15.21 15.12 15.17
WV-43259 WV-40363 10.73 11.38 11.05
WV-43260 WV-40363 42.99 37.27 40.13
WV-43261 WV-40363 17.93 20.41 19.17
WV-43262 WV-40363 20.17 8.09 14.13
WV-43263 WV-40363 24.34 23.55 23.94
WV-43264 WV-40363 33.66 28.56 31.11
WV-43265 WV-40363 15.56 13.92 14.74
WV-43266 WV-40363 28.89 30.84 29.87
WV-43267 WV-40363 14.38 16.58 15.48
WV-43268 WV-40363 39.44 38.15 38.79
WV-43269 WV-40363 49.12 48.65 48.88
WV-43270 WV-40363 31.51 23.15 27.33
WV-43271 WV-40363 33.89 34.08 33.99
WV-43272 WV-40363 56.74 47.45 52.09
WV-43273 WV-40363 70.13 57.57 63.85
WV-43274 WV-40363 49.67 45.44 47.56
WV-43275 WV-40363 68.37 61.26 64.82
WV-43276 WV-40363 68.37 63.82 66.09
WV-43277 WV-40363 68.33 65.82 67.07
WV-43278 WV-40363 73.49 59.33 66.41
WV-43279 WV-40363 56.09 49.51 52.80
WV-43280 WV-40363 89.62 87.28 88.45
WV-38708 WV-43281 25.36 26.56 25.96
WV-43256 WV-43281 19.85 16.95 18.40
WV-43257 WV-43281 23.93 22.69 23.31
WV-43258 WV-43281 53.95 44.29 49.12
WV-43259 WV-43281 28.39 32.96 30.67
WV-43260 WV-43281 82.39 51.48 66.93
WV-43261 WV-43281 28.72 26.38 27.55
WV-43262 WV-43281 41.97 39.01 40.49
WV-43263 WV-43281 53.41 51.61 52.51
WV-43264 WV-43281 44.38 50.39 47.38
WV-43265 WV-43281 36.33 33.54 34.93
WV-43266 WV-43281 59.68 59.75 59.72
WV-43267 WV-43281 33.56 35.37 34.47
WV-43268 WV-43281 62.17 54.54 58.36
WV-43269 WV-43281 51.66 56.42 54.04
WV-43270 WV-43281 55.92 53.77 54.85
WV-43271 WV-43281 57.34 56.94 57.14
WV-43272 WV-43281 74.73 69.66 72.19
WV-43273 WV-43281 91.70 73.80 82.75
WV-43274 WV-43281 72.14 69.11 70.63
WV-43275 WV-43281 80.95 98.20 89.57
WV-43276 WV-43281 79.52 67.01 73.27
WV-43277 WV-43281 68.33 76.65 72.49
WV-43278 WV-43281 102.23 94.33 98.28
WV-43279 WV-43281 85.34 78.50 81.92
WV-43280 WV-43281 94.42 98.23 96.32
WV-38708 WV-43282 67.25 47.17 57.21
WV-43256 WV-43282 80.18 45.92 63.05
WV-43257 WV-43282 78.48 53.13 65.81
WV-43258 WV-43282 96.26 76.28 86.27
WV-43259 WV-43282 68.05 55.62 61.83
WV-43260 WV-43282 116.61 85.12 100.87
WV-43261 WV-43282 93.29 70.02 81.66
WV-43262 WV-43282 85.72 N.D. 85.72
WV-43263 WV-43282 84.77 57.28 71.03
WV-43264 WV-43282 83.76 60.99 72.38
WV-43265 WV-43282 85.64 51.63 68.64
WV-43266 WV-43282 107.49 72.69 90.09
WV-43267 WV-43282 71.17 61.39 66.28
WV-43268 WV-43282 107.42 86.48 96.95
WV-43269 WV-43282 86.41 76.52 81.46
WV-43270 WV-43282 85.38 84.95 85.16
WV-43271 WV-43282 68.86 56.55 62.70
WV-43272 WV-43282 89.31 62.63 75.97
WV-43273 WV-43282 89.73 69.26 79.49
WV-43274 WV-43282 95.38 82.62 89.00
WV-43275 WV-43282 94.26 73.01 83.63
WV-43276 WV-43282 104.28 77.85 91.06
WV-43277 WV-43282 103.76 84.21 93.98
WV-43278 WV-43282 84.96 105.06 95.01
WV-43279 WV-43282 88.33 75.68 82.00
WV-43280 WV-43282 99.88 87.58 93.73
WV-38708 WV-43283 13.42 3.63 8.53
WV-43256 WV-43283 32.95 13.42 23.18
WV-43257 WV-43283 28.45 13.39 20.92
WV-43258 WV-43283 93.60 54.73 74.17
WV-43259 WV-43283 38.74 22.70 30.72
WV-43260 WV-43283 83.80 74.33 79.07
WV-43261 WV-43283 30.08 12.38 21.23
WV-43262 WV-43283 43.40 24.88 34.14
WV-43263 WV-43283 49.54 24.79 37.16
WV-43264 WV-43283 73.00 57.37 65.19
WV-43265 WV-43283 35.70 21.34 28.52
WV-43266 WV-43283 90.65 67.64 79.14
WV-43267 WV-43283 43.91 34.17 39.04
WV-43268 WV-43283 82.18 76.22 79.20
WV-43269 WV-43283 57.24 29.12 43.18
WV-43270 WV-43283 60.93 24.38 42.65
WV-43271 WV-43283 57.07 33.65 45.36
WV-43272 WV-43283 90.41 74.02 82.21
WV-43273 WV-43283 82.27 55.10 68.69
WV-43274 WV-43283 93.24 70.07 81.66
WV-43275 WV-43283 80.11 67.69 73.90
WV-43276 WV-43283 80.56 85.74 83.15
WV-43277 WV-43283 67.58 57.35 62.46
WV-43278 WV-43283 90.30 74.76 82.53
WV-43279 WV-43283 88.07 64.96 76.52
WV-43280 WV-43283 108.49 102.18 105.33
표 21은 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 TTR mRNA 잔존 백분율(500, 125, 및 31 pM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D.: 측정되지 않음
　 　 500 pM 125 pM 31 pM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균
WV-42079 WV-42080 2.93 3.64 3.29 10.84 21.29 16.06 32.30 40.01 36.16
WV-43987 WV-42080 4.84 10.35 7.59 30.68 31.57 31.12 66.64 60.53 63.59
WV-43988 WV-42080 2.93 4.89 3.91 16.30 17.19 16.74 45.70 40.57 43.14
WV-43989 WV-42080 4.39 7.83 6.11 23.04 23.65 23.34 60.20 54.36 57.28
WV-43990 WV-42080 4.59 5.75 5.17 22.90 22.03 22.47 51.05 50.60 50.82
WV-43991 WV-42080 6.63 9.64 8.14 23.36 31.46 27.41 66.91 62.75 64.83
WV-43992 WV-42080 11.06 9.84 10.45 31.51 28.20 29.85 65.24 56.62 60.93
WV-43993 WV-42080 4.09 5.66 4.88 16.15 18.08 17.11 45.42 68.98 57.20
WV-43256 WV-42080 7.23 8.28 7.76 25.74 27.70 26.72 54.26 61.48 57.87
WV-43994 WV-42080 5.19 N.D. 5.19 19.79 19.94 19.86 43.10 39.64 41.37
WV-43773 WV-42080 9.14 7.83 8.49 21.96 26.24 24.10 43.55 49.39 46.47
WV-43995 WV-42080 7.15 7.27 7.21 27.11 25.76 26.44 51.18 64.90 58.04
WV-43996 WV-42080 5.39 6.20 5.80 24.95 20.45 22.70 47.37 45.00 46.18
WV-43997 WV-42080 6.90 9.86 8.38 24.28 31.71 28.00 56.75 59.04 57.90
WV-43998 WV-42080 11.13 12.06 11.59 22.02 25.61 23.81 36.85 46.31 41.58
표 22는 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 TTR mRNA 잔존 백분율(300, 100, 및 30 pM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D.: 측정되지 않음
　 　 300 pM 100 pM 30 pM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균
WV-42079 WV-42080 31.65 21.04 26.35 47.14 31.61 39.38 74.20 64.86 69.53
WV-44454 WV-42080 73.88 65.91 69.89 90.99 81.23 86.11 92.84 88.19 90.51
WV-44455 WV-42080 55.03 46.31 50.67 71.33 62.85 67.09 87.81 95.62 91.72
WV-44456 WV-42080 96.65 76.09 86.37 94.65 94.87 94.76 136.75 86.60 111.68
WV-44457 WV-42080 78.48 58.81 68.64 88.37 71.21 79.79 111.33 99.04 105.19
WV-44458 WV-42080 89.72 81.79 85.75 100.21 97.15 98.68 129.88 89.02 109.45
WV-44459 WV-42080 77.99 78.91 78.45 97.49 99.55 98.52 113.94 121.14 117.54
WV-44460 WV-42080 101.83 102.23 102.03 124.56 97.10 110.83 84.12 72.88 78.50
WV-44461 WV-42080 84.32 91.90 88.11 100.37 88.32 94.35 86.67 105.75 96.21
표 23은 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 TTR mRNA 잔존 백분율(300 및 100 pM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D.: 측정되지 않음
　 　 300 pM 100 pM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-1		 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-2		 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-1		 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-2		 평균
WV-41826 WV-41828 22.58 20.88 21.73 67.61 53.81 60.71
WV-43775 WV-42080 10.31 10.88 10.59 42.45 34.78 38.61
WV-43774 WV-42080 10.24 12.44 11.34 40.84 43.10 41.97
WV-45141 WV-42080 12.02 12.19 12.11 47.21 31.18 39.19
WV-45142 WV-42080 16.57 17.19 16.88 46.39 41.80 44.09
WV-42079 WV-42080 19.20 15.77 17.48 55.89 47.83 51.86
WV-42078 WV-42080 22.35 17.94 20.15 53.96 48.32 51.14
WV-45149 WV-42080 27.40 21.58 24.49 46.75 41.65 44.20
WV-45156 WV-42080 27.97 29.48 28.72 61.19 55.30 58.25
WV-44448 WV-42080 27.68 28.02 27.85 57.69 58.55 58.12
WV-45143 WV-42080 26.23 23.82 25.02 55.76 60.24 58.00
WV-45150 WV-42080 27.69 25.14 26.41 58.40 49.24 53.82
WV-45157 WV-42080 46.70 44.42 45.56 71.59 86.66 79.13
WV-44449 WV-42080 17.98 17.43 17.70 42.91 37.02 39.97
WV-45144 WV-42080 22.54 15.81 19.17 51.94 36.45 44.19
WV-45151 WV-42080 16.99 17.37 17.18 44.43 41.63 43.03
WV-45158 WV-42080 21.86 24.49 23.18 49.40 40.59 44.99
WV-44450 WV-42080 17.02 14.31 15.67 49.00 43.14 46.07
WV-45145 WV-42080 20.17 14.43 17.30 55.71 39.80 47.75
WV-45152 WV-42080 17.20 15.47 16.34 51.18 53.79 52.48
WV-45159 WV-42080 16.92 16.12 16.52 61.15 55.71 58.43
WV-44451 WV-42080 31.28 21.74 26.51 75.71 52.55 64.13
WV-45146 WV-42080 28.22 17.12 22.67 45.15 40.25 42.70
WV-45153 WV-42080 21.24 21.05 21.14 52.74 46.81 49.78
WV-45160 WV-42080 35.76 31.61 33.68 89.05 75.58 82.32
WV-44452 WV-42080 12.26 11.98 12.12 57.45 38.54 48.00
WV-45147 WV-42080 10.41 12.29 11.35 31.96 35.53 33.74
WV-45154 WV-42080 9.40 11.32 10.36 44.76 42.97 43.86
WV-45161 WV-42080 18.93 15.93 17.43 49.15 49.86 49.50
WV-44453 WV-42080 9.88 10.59 10.23 38.62 28.15 33.39
WV-45148 WV-42080 12.19 17.25 14.72 40.06 30.75 35.41
WV-45155 WV-42080 11.36 12.40 11.88 37.41 33.19 35.30
WV-45162 WV-42080 18.64 16.76 17.70 N.D. 40.05 40.05
표 24는 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 TTR mRNA 잔존 백분율(300, 100, 및 30 pM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D.: 측정되지 않음
　 　 300 pM 100 pM 30 pM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균
WV-44447 WV-41828 74.61 59.39 67.00 96.54 105.15 100.85 129.43 129.30 129.36
WV-42079 WV-42080 4.68 4.23 4.45 16.69 10.73 13.71 44.52 26.62 35.57
WV-44433 WV-42080 11.32 7.51 9.42 35.27 21.12 28.20 65.71 56.94 61.33
WV-44434 WV-42080 14.87 12.30 13.58 42.12 30.49 36.31 87.93 71.34 79.64
WV-44435 WV-42080 18.26 12.88 15.57 39.55 32.96 36.26 83.92 77.31 80.62
WV-44436 WV-42080 28.93 21.30 25.11 63.96 53.80 58.88 118.86 96.85 107.85
WV-44437 WV-42080 28.07 22.75 25.41 56.45 41.16 48.81 90.25 64.93 77.59
WV-44438 WV-42080 9.55 7.88 8.71 27.96 23.96 25.96 62.76 37.54 50.15
WV-44439 WV-42080 10.32 6.84 8.58 25.67 22.25 23.96 53.10 26.34 39.72
WV-44444 WV-42080 9.56 6.49 8.02 20.36 13.00 16.68 49.91 32.61 41.26
WV-44440 WV-42080 9.27 6.49 7.88 28.50 17.29 22.89 65.84 23.48 44.66
WV-44441 WV-42080 8.47 5.55 7.01 23.88 13.06 18.47 67.84 28.89 48.36
WV-44445 WV-42080 14.87 9.01 11.94 33.96 27.14 30.55 61.72 32.80 47.26
WV-44442 WV-42080 17.21 12.74 14.97 37.41 25.56 31.48 96.68 39.89 68.28
WV-44446 WV-42080 14.36 10.42 12.39 31.51 30.02 30.76 50.94 39.63 45.28
표 25는 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 TTR mRNA 잔존 백분율(300 및 100 pM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D.: 측정되지 않음
　 　 300 pM 100 pM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균
WV-20167 WV-43769 40.66 29.46 35.06 55.67 64.69 60.18
WV-20170 WV-43769 41.53 22.31 31.92 64.17 54.96 59.56
WV-41918 WV-43769 43.65 20.15 31.90 61.52 43.31 52.42
WV-44353 WV-43769 86.03 88.28 87.16 88.92 94.23 91.57
WV-44354 WV-43769 77.09 65.39 71.24 80.35 74.83 77.59
WV-44355 WV-43769 76.32 76.02 76.17 83.00 82.86 82.93
WV-38708 WV-43769 34.30 22.03 28.16 51.66 46.20 48.93
WV-44144 WV-43769 75.12 59.00 67.06 89.02 88.87 88.95
WV-44145 WV-43769 85.19 77.53 81.36 93.56 94.43 93.99
WV-44163 WV-43768 75.30 63.52 69.41 111.99 82.91 97.45
표 26은 마우스 원발성 간세포에서 마우스 TTR mRNA 넉다운의 IC50 백분율을 나타낸다.
가이드 패신저 IC50 (pM) 95% CI
WV-38708 WV-40363 8.22 6.47~10.43
WV-38708 WV-42940 18.29 12.89~25.98
WV-42078 WV-42080 5.62 4.82~6.56
WV-42078 WV-42941 15.44 9.68~24.57
실시예 7. 제공된 올리고뉴클레오티드 및 조성물은 생체내에서 활성이다
마우스 TTR siRNA 활성의 생체내 측정: 모든 동물 절차는IACUC 지침에 따라 수행하였다. 제공된 올리고뉴클레오티드 및 조성물의 효능 및 간 노출을 평가하기 위해, 8~10주령의 수컷 C57BL/6 마우스에 제1일에 원하는 올리고뉴클레오티드 농도로 0.6, 2, 또는 6 mg/kg을 피하 투여하였다. 제8일에 동물을 CO2 질식 후 개흉술 및 말기 혈액 수집에 의해 안락사시켰다. PBS로 심장 관류 후, 간 샘플을 채취하고 드라이 아이스에서 급속동결시켰다. 간의 전체 RNA를 TRIzol 및 bromochloropropane으로 조직 용해한 후 SV96 Total RNA Isolation 키트(Promega)를 사용하여 추출하였다. RNA 샘플로부터의 cDNA 생성은 제조업체의 설명서에 따라 High-Capacity cDNA Reverse Transcription 키트(Thermo Fisher)를 사용하여 수행하였으며 iQ Multiplex Powermix(Bio-Rad)를 사용하여 CFX 시스템에서 qPCR 분석을 수행하였다. 마우스 TTR mRNA의 경우, 다음의 qPCR 분석을 사용하였다: IDT Taqman qPCR 분석 ID Mm.PT.58.11922308. 간의 올리고뉴클레오티드 축적을 하이브리드 ELISA를 통해 측정하였다.
제공된 올리고뉴클레오티드 및 조성물의 지속성을 평가하기 위해, 8~10주령의 수컷 C57BL/6 마우스에 제1일에 원하는 올리고뉴클레오티드 농도로 2 또는 6 mg/kg의 용량을 피하 투여로 투여하였다. 제1일(투여 전) 및 이어서 매주, 전혈을 악하 출혈을 통해 혈청 분리기 튜브로 수집하고 처리된 혈청 샘플을 -70℃에서 보관하였다. 혈청 내 마우스 TTR 단백질 농도를 Mouse Prealbumin ELISA 키트(Crystal Chem)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 평가하였다.
표 27은 PBS 대조군 대비 마우스 TTR mRNA 잔존 백분율을 나타낸다. N = 5. N.D.: 측정되지 않음
WV-20167/WV-36860
PBS 0.6 mg/kg 2 mg/kg 6 mg/kg
동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율 동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율 동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율 동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율
1 126.89 6 81.73 11 38.85 16 35.76
2 86.61 7 70.20 12 42.98 17 17.77
3 95.66 8 75.48 13 40.83 18 20.10
4 93.00 9 65.90 14 48.03 19 11.25
5 97.84 10 77.26 15 42.39 20 10.30
평균 100 평균 74.11 평균 42.62 평균 19.03
WV-20170/WV-36807 WV-38708/WV-36807
0.6 mg/kg 2 mg/kg 6 mg/kg 0.6 mg/kg
동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율 동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율 동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율 동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율
21 59.04 26 27.62 31 8.38 36 74.11
22 64.79 27 24.76 32 9.90 37 51.80
23 57.41 28 39.43 33 4.61 38 75.30
24 63.78 29 33.50 34 6.79 39 58.13
25 61.99 30 28.70 35 14.13 40 75.99
평균 61.40 평균 30.80 평균 8.76 평균 67.07
WV-38708/WV-36807
2 mg/kg 6 mg/kg
동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율 동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율
41 14.89 46 3.01
42 12.19 47 5.27
43 19.18 48 3.76
44 23.48 49 2.98
45 17.54 50 3.94
평균 17.46 평균 3.79
표 28은 간 조직에서 안티센스 가닥의 축적을 나타낸다. N = 5. N.D.: 측정되지 않음
WV-20167/WV-36860
PBS 0.6 mg/kg 2 mg/kg 6 mg/kg
동물 No. 안티센스 가닥
(조직 g당 ug)		 동물 No. 안티센스 가닥
(조직 g당 ug)		 동물 No. 안티센스 가닥 %
(조직 g당 ug)		 동물 No. 안티센스 가닥
(조직 g당 ug)
1 0.000 6 0.024 11 0.031 16 0.055
2 0.000 7 0.048 12 0.084 17 0.121
3 0.000 8 0.032 13 0.069 18 0.113
4 0.000 9 0.025 14 0.049 19 0.101
5 0.000 10 0.026 15 0.042 20 0.131
평균 0.000 평균 0.031 평균 0.055 평균 0.104
WV-20170/WV-36807 WV-38708/WV-36807
0.6 mg/kg 2 mg/kg 6 mg/kg 0.6 mg/kg
동물 No. 안티센스 가닥
(조직 g당 ug)		 동물 No. 안티센스 가닥
(조직 g당 ug)		 동물 No. 안티센스 가닥
(조직 g당 ug)		 동물 No. 안티센스 가닥
(조직 g당 ug)
21 0.040 26 0.066 31 0.057 36 0.017
22 0.024 27 0.032 32 0.062 37 0.015
23 0.006 28 0.015 33 0.110 38 0.011
24 0.000 29 0.019 34 0.072 39 0.004
25 0.000 30 0.022 35 0.103 40 0.010
평균 0.014 평균 0.031 평균 0.081 평균 0.012
WV-38708/WV-36807
2 mg/kg 6 mg/kg
동물 No. 안티센스 가닥
(조직 g당 ug)		 동물 No. 안티센스 가닥
(조직 g당 ug)
41 0.063 46 0.298
42 0.088 47 0.365
43 0.065 48 0.196
44 0.092 49 0.229
45 0.050 50 0.322
평균 0.072 평균 0.282
표 29는 PBS 대조군 대비 마우스 TTR 단백질 잔존 백분율을 나타낸다. N = 5. N.D.: 측정되지 않음
PBS
일차 동물 1 동물 2 동물 3 동물 4 동물 5 평균
1 91 114 104 91 100 100
8 103 120 98 91 87 100
15 91 100 112 103 93 100
22 94 107 91 102 106 100
29 93 101 87 108 111 100
36 87 102 95 112 104 100
43 98 95 95 101 112 100
WV-20167/WV-36860, 2 mg/kg
일차 동물 6 동물 7 동물 8 동물 9 동물 10 평균
1 97 105 72 80 90 89
8 54 48 39 51 44 47
15 68 70 62 62 63 65
22 90 96 80 92 92 90
29 85 116 82 98 91 94
36 115 120 108 88 122 110
43 102 115 99 99 94 102
WV-20167/WV-36860, 6 mg/kg
일차 동물 11 동물 12 동물 13 동물 14 동물 15 평균
1 92 102 109 119 92 103
8 18 18 19 18 16 18
15 33 38 39 30 34 35
22 57 78 72 55 66 66
29 72 80 85 71 81 78
36 90 119 104 96 100 102
43 94 98 115 105 106 104
WV-20170/WV-36807, 2 mg/kg
일차 동물 16 동물 17 동물 18 동물 19 동물 20 평균
1 65 83 95 83 103 86
8 36 37 43 41 34 38
15 53 47 49 60 55 53
22 67 76 71 84 76 75
29 78 85 85 103 69 84
36 90 93 93 96 93 93
43 88 93 94 117 79 94
WV-20170/WV-36807, 6 mg/kg
일차 동물 21 동물 22 동물 23 동물 24 동물 25 평균
1 108 129 100 105 107 110
8 9 11 4 8 15 10
15 17 19 9 19 29 19
22 39 40 18 39 58 39
29 67 69 41 56 79 62
36 90 94 61 84 110 88
43 108 114 80 90 107 100
WV-38708/WV-36807, 2 mg/kg
일차 동물 26 동물 27 동물 28 동물 29 동물 30 평균
1 120 102 117 99 141 116
8 32 31 21 22 30 27
15 46 40 38 36 44 41
22 77 79 69 65 70 72
29 85 69 82 77 87 80
36 100 95 92 98 103 98
43 106 101 91 113 119 106
WV-38708/WV-36807, 6 mg/kg
동물 31 동물 32 동물 33 동물 34 동물 35 평균
일차 102 103 107 105 117 107
1 7 4 4 5 7 6
8 13 9 7 11 12 10
15 27 20 19 27 30 25
22 48 38 40 52 63 48
29 77 66 66 72 83 73
36 82 89 77 115 94 91
43 102 103 107 105 117 107
실시예 8. 제공된 올리고뉴클레오티드 및 조성물은 생체내에서 활성이다
마우스 TTR siRNA 활성의 생체내 측정: 모든 동물 절차는IACUC 지침에 따라 수행하였다. 제공된 올리고뉴클레오티드 및 조성물의 효능 및 간 노출을 평가하기 위해, 8~10주령의 수컷 C57BL/6 마우스에 제1일에 원하는 올리고뉴클레오티드 농도로 0.6, 2, 또는 6 mg/kg을 피하 투여하였다. 제8일에 동물을 CO2 질식 후 개흉술 및 말기 혈액 수집에 의해 안락사시켰다. PBS로 심장 관류 후, 간 샘플을 채취하고 드라이 아이스에서 급속동결시켰다. 간의 전체 RNA를 TRIzol 및 bromochloropropane으로 조직 용해한 후 SV96 Total RNA Isolation 키트(Promega)를 사용하여 추출하였다. RNA 샘플로부터의 cDNA 생성은 제조업체의 설명서에 따라 High-Capacity cDNA Reverse Transcription 키트(Thermo Fisher)를 사용하여 수행하였으며 iQ Multiplex Powermix(Bio-Rad)를 사용하여 CFX 시스템에서 qPCR 분석을 수행하였다. 마우스 TTR mRNA의 경우, 다음의 qPCR 분석을 사용하였다: IDT Taqman qPCR 분석 ID Mm.PT.58.11922308. 간의 올리고뉴클레오티드 축적을 하이브리드 ELISA를 통해 측정하였다.
제공된 올리고뉴클레오티드 및 조성물의 지속성을 평가하기 위해, 8~10주령의 수컷 C57BL/6 마우스에 제1일에 원하는 올리고뉴클레오티드 농도로 2 또는 6 mg/kg의 용량을 피하 투여로 투여하였다. 제1일(투여 전) 및 이어서 매주, 전혈을 악하 출혈을 통해 혈청 분리기 튜브로 수집하고 처리된 혈청 샘플을 -70℃에서 보관하였다. 혈청 내 마우스 TTR 단백질 농도를 Mouse Prealbumin ELISA 키트(Crystal Chem)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 평가하였다.
표 30은 PBS 대조군 대비 마우스 TTR mRNA 잔존 백분율을 나타낸다. N = 5. N.D.: 측정되지 않음
WV-41826/WV-41828
PBS 0.6 mg/kg 2 mg/kg 6 mg/kg
동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율 동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율 동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율 동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율
1 97.15 6 32.47 11 4.20 16 0.79
2 99.64 7 21.18 12 5.27 17 1.12
3 104.22 8 26.82 13 4.30 18 0.46
4 101.70 9 31.64 14 1.34 19 1.08
5 97.29 10 34.12 15 1.72 20 0.72
평균 100.00 평균 29.25 평균 3.36 평균 0.83
WV-42078/WV-42080 WV-42079/WV-42080
0.6 mg/kg 2 mg/kg 6 mg/kg 0.6 mg/kg
동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율 동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율 동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율 동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율
21 25.18 26 4.08 31 0.70 36 17.31
22 28.20 27 3.27 32 0.96 37 17.10
23 17.05 28 4.45 33 0.78 38 35.99
24 10.34 29 4.04 34 0.48 39 11.06
25 41.64 30 4.54 35 0.60 40 19.05
평균 24.48 평균 4.08 평균 0.71 평균 20.10
WV-42079/WV-42080
2 mg/kg 6 mg/kg
동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율 동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율
41 3.64 46 0.99
42 4.47 47 0.60
43 3.67 48 0.79
44 5.35 49 2.29
45 6.34 50 0.69
평균 4.69 평균 1.07
표 31은 간 조직에서 안티센스 가닥의 축적을 나타낸다. N = 5. N.D.: 측정되지 않음
WV-41826/WV-41828
PBS 0.6 mg/kg 2 mg/kg 6 mg/kg
동물 No. 안티센스 가닥
(조직 g당 ug)		 동물 No. 안티센스 가닥
(조직 g당 ug)		 동물 No. 안티센스 가닥 %
(조직 g당 ug)		 동물 No. 안티센스 가닥
(조직 g당 ug)
1 0.000 6 0.076 11 0.182 16 0.360
2 0.000 7 0.111 12 0.223 17 0.472
3 0.000 8 0.078 13 0.228 18 0.335
4 0.000 9 0.107 14 0.191 19 0.429
5 0.000 10 0.098 15 0.203 20 0.438
평균 0.000 평균 0.094 평균 0.206 평균 0.407
WV-42078/WV-42080 WV-42079/WV-42080
0.6 mg/kg 2 mg/kg 6 mg/kg 0.6 mg/kg
동물 No. 안티센스 가닥
(조직 g당 ug)		 동물 No. 안티센스 가닥
(조직 g당 ug)		 동물 No. 안티센스 가닥
(조직 g당 ug)		 동물 No. 안티센스 가닥
(조직 g당 ug)
21 1.820 26 12.395 31 61.452 36 1.682
22 2.338 27 13.538 32 55.954 37 1.812
23 2.160 28 14.009 33 45.669 38 2.348
24 2.080 29 14.480 34 44.396 39 1.631
25 2.287 30 10.596 35 57.765 40 1.589
평균 2.137 평균 13.003 평균 53.047 평균 1.812
WV-42079/WV-42080
2 mg/kg 6 mg/kg
동물 No. 안티센스 가닥
(조직 g당 ug)		 동물 No. 안티센스 가닥
(조직 g당 ug)
41 11.650 46 52.453
42 9.906 47 48.244
43 9.640 48 56.305
44 9.509 49 51.949
45 9.667 50 48.769
평균 10.074 평균 51.544
표 32는 PBS 대조군 대비 마우스 TTR 단백질 잔존 백분율을 나타낸다. N = 5. N.D.: 측정되지 않음
PBS
일차 동물 1 동물 2 동물 3 동물 4 동물 5 평균
1 91 108 101 119 80 100
8 93 125 82 115 84 100
15 84 119 94 114 89 100
22 91 107 99 114 89 100
29 109 93 95 115 88 100
36 100 112 78 116 93 100
43 95 99 91 116 99 100
50 99 101 77 119 104 100
57 94 115 86 105 100 100
64 84 116 85 126 89 100
WV-41826/WV-41828, 0.6 mg/kg
일차 동물 6 동물 7 동물 8 동물 9 동물 10 평균
1 133 99 120 62 74 97
8 22 5 2 17 15 12
15 23 9 6 29 20 17
22 33 23 14 42 34 29
29 57 49 38 67 57 53
36 77 76 66 76 82 75
43 116 98 97 95 108 103
WV-41826/WV-41828, 2 mg/kg
일차 동물 11 동물 12 동물 13 동물 14 동물 15 평균
1 85 86 101 124 127 105
8 4 1 4 3 4 3
15 5 3 6 5 6 5
22 8 5 9 6 7 7
29 17 14 18 13 15 15
36 28 31 33 20 27 28
43 57 51 37 55 47 49
50 76 82 71 49 62 68
57 80 89 83 55 73 76
64 113 98 90 65 98 93
WV-42078/WV-42080, 0.6 mg/kg
일차 동물 16 동물 17 동물 18 동물 19 동물 20 평균
1 135 91 106 103 123 112
8 16 13 23 11 18 16
15 23 15 29 16 24 21
22 31 21 34 21 31 28
29 49 38 47 40 44 44
36 63 47 65 48 60 57
43 93 65 79 84 85 81
WV-42078/WV-42080, 2 mg/kg
일차 동물 21 동물 22 동물 23 동물 24 동물 25 평균
1 103 112 118 143 93 114
8 9 4 3 3 4 4
15 13 5 4 5 4 6
22 17 5 5 6 6 8
29 28 11 10 10 10 14
36 38 14 14 14 14 19
43 52 33 28 28 29 34
50 55 45 37 37 44 43
57 68 58 56 52 65 60
64 83 98 85 86 85 87
WV-42079/WV-42080, 0.6 mg/kg
일차 동물 26 동물 27 동물 28 동물 29 동물 30 평균
1 93 128 88 114 123 109
8 2 21 19 16 20 16
15 6 24 29 19 20 19
22 15 36 39 26 35 30
29 45 61 50 49 55 52
36 64 79 58 79 70 70
43 104 110 82 110 109 103
WV-42079/WV-42080, 2 mg/kg
일차 동물 31 동물 32 동물 33 동물 34 동물 35 평균
1 N.D. 114 62 111 146 108
8 3 3 8 4 2 4
15 4 4 12 5 4 6
22 6 7 18 7 6 9
29 14 16 37 14 15 19
36 24 27 46 21 25 29
43 46 51 53 81 75 61
50 66 63 65 75 68 68
57 89 88 77 88 91 87
64 114 99 88 123 156 116
실시예 9. 제공된 올리고뉴클레오티드 및 조성물은 생체내에서 활성이다
마우스 TTR siRNA 활성의 생체내 측정: 모든 동물 절차는 Alpha Preclinical(North Grafton, MA)의 IACUC 지침에 따라 수행하였다. 제공된 올리고뉴클레오티드 및 조성물의 지속성을 평가하기 위해, 8~10주령의 수컷 C57BL/6 마우스에 제1일에 원하는 올리고뉴클레오티드 농도로 0.5 또는 1.5 mg/kg의 용량을 피하 투여로 투여하였다. 제1일(투여 전) 및 이어서 매주, 전혈을 테일 스닙으로 혈청 분리기 튜브로 수집하고 처리된 혈청 샘플을 -70℃에서 보관하였다. 혈청 내 마우스 TTR 단백질 농도를 Mouse Prealbumin ELISA 키트(Crystal Chem)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 평가하였다.
표 33은 PBS 대조군 대비 마우스 TTR 단백질 잔존 백분율을 나타낸다. N = 5. N.D.: 측정되지 않음
PBS
일차 동물 1 동물 2 동물 3 동물 4 동물 5 평균
1 100 100 110 105 86 100
8 99 101 112 95 93 100
15 87 105 106 111 91 100
22 97 103 113 100 86 100
29 91 118 101 103 87 100
36 76 122 112 116 75 100
43 124 62 116 115 83 100
WV-42078/WV-42080, 0.5 mg/kg
일차 동물 6 동물 7 동물 8 동물 9 동물 10 평균
1 115 120 107 90 97 106
8 33 30 32 37 37 34
15 34 27 29 39 32 32
22 53 43 46 48 51 48
29 62 53 55 47 75 59
36 86 57 80 55 87 73
43 136 79 75 60 101 90
WV-42078/WV-40363, 0.5 mg/kg
일차 동물 11 동물 12 동물 13 동물 14 동물 15 평균
1 113 120 105 102 112 110
8 44 42 41 37 51 43
15 48 54 50 48 49 50
22 67 80 82 67 70 73
29 98 91 96 89 90 93
36 123 103 108 93 91 104
43 96 114 84 97 100 98
WV-38708/WV-42080, 0.5 mg/kg
일차 동물 16 동물 17 동물 18 동물 19 동물 20 평균
1 114 81 100 124 102 104
8 40 29 34 36 36 35
15 46 37 39 41 41 41
22 72 66 60 64 74 67
29 74 67 63 60 83 69
36 101 90 90 125 135 108
43 80 84 90 77 131 92
WV-20167/WV-36860, 1.5 mg/kg
일차 동물 21 동물 22 동물 23 동물 24 동물 25 평균
1 95 94 119 118 111 108
8 79 69 52 54 37 58
15 93 73 71 75 53 73
22 99 81 91 113 85 94
29 106 108 95 107 90 101
36 81 94 136 92 129 106
43 85 104 176 144 120 126
WV-41826/WV-41828, 1.5 mg/kg
일차 동물 26 동물 27 동물 28 동물 29 동물 30 평균
1 93 89 104 91 120 99
8 5 5 N.D. 4 10 6
15 9 10 3 12 11 9
22 18 20 6 20 20 17
29 28 32 N.D. 35 45 35
36 36 51 23 35 42 37
43 41 64 37 68 57 53
WV-42078/WV-42080, 1.5 mg/kg
일차 동물 31 동물 32 동물 33 동물 34 동물 35 평균
1 124 109 119 113 118 117
8 1 3 6 5 2 4
15 6 5 7 8 8 7
22 10 9 10 12 10 10
29 16 16 21 23 17 18
36 22 20 26 43 20 26
43 45 39 49 65 37 47
WV-42078/WV-40363, 1.5 mg/kg
일차 동물 36 동물 37 동물 38 동물 39 동물 40 평균
1 97 106 82 85 96 93
8 15 12 14 17 5 13
15 17 17 23 23 9 18
22 31 35 36 43 15 32
29 39 59 39 55 29 44
36 80 85 52 91 39 69
43 76 101 88 102 58 85
WV-38708/WV-42080, 1.5 mg/kg
일차 동물 41 동물 42 동물 43 동물 44 동물 45 평균
1 88 98 96 109 75 93
8 14 9 10 7 14 11
15 20 12 12 10 22 15
22 35 24 23 21 33 27
29 43 38 28 30 39 36
36 65 65 53 50 54 57
43 59 74 58 57 58 61
WV-38708/WV-40363, 1.5 mg/kg
일차 동물 46 동물 47 동물 48 동물 49 동물 50 평균
1 104 101 108 103 91 102
8 11 14 12 10 11 12
15 17 17 14 16 16 16
22 33 34 26 30 34 31
29 60 38 36 52 51 47
36 73 58 66 60 83 68
43 101 129 76 132 92 106
실시예 10. 제공된 올리고뉴클레오티드 및 조성물은 생체내에서 활성이다
마우스 TTR siRNA 활성의 생체내 측정: 모든 동물 절차는 Alpha Preclinical(North Grafton, MA)의 IACUC 지침에 따라 수행하였다. 제공된 올리고뉴클레오티드 및 조성물의 지속성을 평가하기 위해, 8~10주령의 수컷 C57BL/6 마우스에 제1일에 원하는 올리고뉴클레오티드 농도로 0.5 또는 1.5 mg/kg의 용량을 피하 투여로 투여하였다. 제1일(투여 전) 및 이어서 매주, 전혈을 테일 스닙으로 혈청 분리기 튜브로 수집하고 처리된 혈청 샘플을 -70℃에서 보관하였다. 혈청 내 마우스 TTR 단백질 농도를 Mouse Prealbumin ELISA 키트(Novus Biologicals 또는 Crystal Chem)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 평가하였다.
표 34는 PBS 대조군 대비 마우스 TTR 단백질 잔존 백분율을 나타낸다. N = 5. N.D.: 측정되지 않음
PBS
일차 동물 1 동물 2 동물 3 동물 4 동물 5 평균
1 87 101 102 108 102 100
8 102 110 96 103 90 100
15 95 113 95 108 90 100
22 108 104 99 101 87 100
29 78 118 100 105 98 100
36 85 113 101 110 91 100
43 89 117 98 108 88 100
WV-41826/WV-41828, 1.5 mg/kg
일차 동물 6 동물 7 동물 8 동물 9 동물 10 평균
1 104 96 84 75 106 93
8 8 2 10 8 10 8
15 9 7 10 9 10 9
22 13 11 14 15 14 13
29 18 16 20 22 19 19
36 33 33 30 29 36 32
43 50 44 45 46 46 46
WV-42904/WV-41828, 1.5 mg/kg
일차 동물 11 동물 12 동물 13 동물 14 동물 15 평균
1 82 88 87 93 91 88
8 10 8 N.D. 13 16 12
15 13 11 11 16 16 13
22 22 20 25 18 25 22
29 37 31 N.D. 29 19 29
36 53 53 55 40 57 52
43 64 62 72 55 72 65
WV-42905/WV-42080, 1.5 mg/kg
일차 동물 16 동물 17 동물 18 동물 19 동물 20 평균
1 106 107 N.D. 107 93 103
8 6 13 15 12 12 11
15 4 11 15 11 13 11
22 4 17 20 15 18 15
29 N.D. 29 23 30 26 27
36 N.D. 30 47 39 44 40
43 N.D. 35 65 52 58 52
WV-42906/WV-42080, 1.5 mg/kg
일차 동물 21 동물 22 동물 23 동물 24 동물 25 평균
1 108 107 105 108 102 106
8 11 9 5 10 11 9
15 10 10 11 12 12 11
22 15 18 14 17 18 16
29 25 35 24 24 23 26
36 35 50 36 40 35 39
43 48 63 56 60 46 55
WV-42905/WV-40363, 1.5 mg/kg
일차 동물 26 동물 27 동물 28 동물 29 동물 30 평균
1 99 111 105 107 84 101
8 20 21 20 24 21 21
15 21 20 21 22 23 21
22 40 33 33 35 34 35
29 57 54 49 53 56 54
36 65 70 67 63 66 66
43 79 81 81 83 93 83
WV-42906/WV-40363, 1.5 mg/kg
일차 동물 31 동물 32 동물 33 동물 34 동물 35 평균
1 125 113 110 105 119 114
8 19 16 20 21 21 19
15 21 21 22 19 23 21
22 34 33 44 36 36 36
29 53 57 41 53 63 54
36 68 73 70 69 84 73
43 86 98 88 96 89 91
실시예 11. 제공된 올리고뉴클레오티드 및 조성물은 생체내에서 활성이다
마우스 TTR siRNA 활성의 생체내 측정: 모든 동물 절차는 Alpha Preclinical(North Grafton, MA)의 IACUC 지침에 따라 수행하였다. 제공된 올리고뉴클레오티드 및 조성물의 효능 및 간 노출을 평가하기 위해, 8~10주령의 수컷 C57BL/6 마우스에 제1일에 원하는 올리고뉴클레오티드 농도로 0.5 또는 1.5 mg/kg을 견갑골 사이 부위에 피하 투여하였다. 동물을 제8일차에 안락사시켰다. 식염수로 심장 관류 후, 간 샘플을 채취하고 드라이 아이스에서 급속동결시켰다. 간의 전체 RNA를 TRIzol 및 bromochloropropane으로 조직 용해한 후 SV96 Total RNA Isolation 키트(Promega)를 사용하여 추출하였다. RNA 샘플로부터의 cDNA 생성은 제조업체의 설명서에 따라 High-Capacity cDNA Reverse Transcription 키트(Thermo Fisher)를 사용하여 수행하였으며 iQ Multiplex Powermix(Bio-Rad)를 사용하여 CFX 시스템에서 qPCR 분석을 수행하였다. 마우스 TTR mRNA의 경우, 다음의 qPCR 분석을 사용하였다: IDT Taqman qPCR 분석 ID Mm.PT.58.11922308.
제공된 올리고뉴클레오티드 및 조성물의 지속성을 평가하기 위해, 8~10주령의 수컷 C57BL/6 마우스에 제1일에 원하는 올리고뉴클레오티드 농도로 1.5 mg/kg을 견갑골 사이 부위에 피하 투여하였다. 제1일(투여 전) 및 이어서 매주, 전혈을 테일 스닙으로 혈청 분리기 튜브로 수집하고 처리된 혈청 샘플을 -70℃에서 보관하였다. 혈청 내 마우스 TTR 단백질 농도를 Mouse Prealbumin ELISA 키트(Novus Biologicals 또는 Crystal Chem)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 평가하였다.
표 35는 PBS 대조군 대비 마우스 TTR mRNA 잔존 백분율을 나타낸다. N = 5. N.D.: 측정되지 않음
WV-42078/WV-42080 WV-42078/WV-42941
PBS 0.5 mg/kg 1.5 mg/kg 0.5 mg/kg
동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율 동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율 동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율 동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율
1 91.74 6 45.07 11 16.07 16 15.61
2 73.63 7 24.87 12 8.96 17 34.14
3 120.91 8 17.46 13 4.70 18 32.83
4 106.99 9 41.95 14 6.72 19 14.46
5 106.74 10 22.71 15 4.45 20 17.12
평균 100.00 평균 30.41 평균 8.18 평균 22.83
WV-42078/WV-42941
1.5 mg/kg
동물 No. mTTR mRNA 잔존 백분율
21 4.23
22 4.49
23 6.29
24 4.87
25 4.94
평균 4.96
표 36은 PBS 대조군 대비 마우스 TTR 단백질 잔존 백분율을 나타낸다. N = 5. N.D.: 측정되지 않음
PBS
일차 동물 1 동물 2 동물 3 동물 4 동물 5 평균
1 102 106 121 77 94 100
8 104 95 111 87 104 100
15 105 99 106 92 98 100
22 107 111 93 90 99 100
29 119 107 104 72 98 100
36 106 81 94 96 122 100
43 109 97 94 99 102 100
WV-42078/WV-42080, 1.5 mg/kg
일차 동물 6 동물 7 동물 8 동물 9 동물 10 평균
1 96 80 69 117 105 93
8 3 5 3 6 5 4
15 3 10 5 6 7 6
22 7 13 10 10 10 10
29 11 13 17 16 11 14
36 24 30 34 33 20 28
43 29 49 71 52 63 53
WV-42078/WV-42941, 1.5 mg/kg
일차 동물 11 동물 12 동물 13 동물 14 동물 15 평균
1 98 93 95 69 90 89
8 10 7 7 15 4 9
15 16 14 16 27 13 17
22 23 21 26 37 19 25
29 49 41 40 66 45 48
36 56 47 69 79 60 62
43 75 67 86 69 104 80
실시예 12. 제공된 올리고뉴클레오티드 및 조성물은 시험관내에서 포스파타 제 및 텐신 상동체(PTEN)를 효과적으로 넉다운시킬 수 있다.
PTEN에 대한 다양한 siRNA를 설계하고 구성하였다. 다수의 siRNA를 하나 또는 일정 범위의 농도로 iCell Neuron 및 마우스 H2K 세포주에서 시험관 내에서 테스트하였다.
siRNA 활성의 시험관내 측정을 위한 예시 프로토콜: siRNA 활성 측정을 위해, 특정 농도의 siRNA를 6일 동안 400,000개 세포/웰로 96-웰 플레이트에 플레이팅된 iCell Neuron에 짐노틱 방식으로 전달하였다. 이어서, 전체 RNA를 SV96 Total RNA Isolation 키트(Promega)를 사용하여 추출하였다. 제조업체의 지침에 따라 High-Capacity Reverse Transcription 키트(Thermo Fisher)를 사용하여 RNA 샘플로부터 cDNA를 생성하고, qPCR 분석을 iQ Multiplex Powermix(Bio-Rad)와 함께 CFX 시스템을 사용하여 수행하였다. 마우스 H2K 세포 분석을 위해, 세포를 4일 동안 예비분화한 후, RNA 추출 전 추가로 4일 동안 siRNA로 처리하였다. 인간 PTEN mRNA의 경우, 다음의 qPCR 분석을 사용하였다(Thermo Fisher Hs02621230_s1). 인간 SRSF9를 노멀라이저(정방향 5' TGGAATATGCCCTGCGTAAA 3', 역방향 5' TGGTGCTTCTCTCAGGATAAAC, 프로브 5'/5HEX/TG GAT GAC A/Zen/C CAA ATT CCG CTC TCA/3IABkFQ/3')로서 사용하였다. 마우스 PTEN mRNA의 경우, 다음의 qPCR 분석을 사용하였다(Thermo Fisher Mm00477208_m1). 마우스 HPRT를 노멀라이저로서 사용하였다. mRNA 넉다운 수준을 모의 처리 대비 mRNA 잔존 백분율로서 계산하였다.
표 37 은 iCell Neuron에서 측정된, 인간 SRSF9 대조군 대비 인간 PTEN mRNA 잔존 백분율(15 및 5 μM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D .: 측정되지 않음
　 　 15 μM 5 μM
가이 드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (PTEN/
SRSF9)-1 		잔존 mRNA 백분율 (PTEN/
SRSF9)-2 		평균 잔존 mRNA 백분율 (PTEN/
SRSF9)-1 		잔존 mRNA 백분율 (PTEN/
SRSF9)-2 		평균
WV-40986 WV-41023 37.3 32.1 34.7 49.3 36.9 43.1
WV-40986 WV-41024 49.7 37.6 43.7 55.3 58.2 56.8
WV-40986 WV-41025 37.2 27.7 32.5 44.5 49.2 46.9
WV-40986 WV-41026 37.8 26.1 32.0 57.9 53.8 55.9
WV-40986 WV-41027 35.6 33.2 34.4 63.2 65 64.1
WV-40986 WV-41028 52.7 48.6 50.7 74.3 91.8 83.1
WV-40986 WV-41029 58.5 51.6 55.1 115.4 69.6 92.5
WV-40990 WV-41023 55 34.2 44.6 102.4 107.7 105.1
WV-40990 WV-41024 34.6 34.8 34.7 112.6 134.8 123.7
WV-40990 WV-41025 34.3 32 33.2 130.9 145.3 138.1
WV-40990 WV-41026 25.6 24.4 25.0 117.9 120.7 119.3
WV-40990 WV-41027 31 33.9 32.5 105.1 79.6 92.4
WV-40990 WV-41028 38.3 40.2 39.3 99.8 93.3 96.6
WV-40990 WV-41029 44.8 39.1 42.0 75.5 ND 75.5
WV-40398 WV-40399 80.6 82.8 81.7 123.7 119.8 121.8
표 38 은 iCell Neuron에서 측정된, 인간 SRSF9 대조군 대비 인간 PTEN mRNA 잔존 백분율(15 및 5 μM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D .: 측정되지 않음
15　 μM 5　 μM
가이드　 패신저　 잔존 mRNA 백분율 (PTEN/ SRSF9)-1 잔존 mRNA 백분율 (PTEN/ SRSF9)-2 평균　 잔존 mRNA 백분율 ( PTEN / SRSF9)-1 잔존 mRNA 백분율 ( PTEN / SRSF9)-2 평균　
WV-42309 WV-41025 17.8 21.7 19.75 28.2 28.7 28.5
WV-42310 WV-41025 23.7 11.8 17.75 42 39.5 40.8
WV-42311 WV-41025 23.6 24.3 23.95 39.8 44.7 42.3
WV-42312 WV-41025 34 33.2 33.6 49 57.7 53.4
WV-42323 WV-41025 19.5 18 18.75 29.9 33.4 31.7
WV-42324 WV-41025 23.2 24.9 24.05 39.6 42.8 41.2
WV-42325 WV-41025 21.3 17.6 19.45 29.6 36.2 32.9
WV-42326 WV-41025 33.1 21.5 27.3 36.5 38.5 37.5
WV-40986 WV-41025 36.6 35 35.8 62.9 62.3 62.6
WV-40999 WV-41025 34.9 54.7 44.8 72.5 77.3 74.9
표 39 는 iCell Neuron에서 측정된, 인간 SRSF9 대조군 대비 인간 PTEN mRNA 잔존 백분율(15 및 5 μM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D .: 측정되지 않음
15　 μM　 5　 μM
가이드　 패신저　 잔존 mRNA 백분율 (PTEN/　
SRSF9 )-1　		 잔존 mRNA 백분율 (PTEN/　
SRSF9 )-2　		 평균　 잔존 mRNA 백분율 (PTEN/　
SRSF9 )-1　		 잔존 mRNA 백분율 (PTEN/　
SRSF9 )-2　		 평균　
WV-42309 WV-41023 35.2 31.2 33.2 40.9 63.9 52.4
WV-42309 WV-40399 30.0 35.3 32.7 81.2 ND 81.2
WV-42309 WV-42643 43.1 42.8 43.0 43.4 67.3 55.4
WV-42309 WV-42644 36.8 26.4 31.6 46.9 53.4 50.2
WV-42309 WV-42645 38.0 43.2 40.6 ND 50.5 50.5
WV-42309 WV-42646 42.8 47.4 45.1 60.0 62.6 61.3
WV-42309 WV-42647 22.3 34.5 28.4 43.0 51.0 47.0
WV-42309 WV-42648 19.9 24.5 22.2 44.8 46.8 45.8
WV-42309 WV-42649 17.4 22.2 19.8 56.4 ND 56.4
WV-42309 WV-41025 30.0 35.7 32.9 68.5 ND 68.5
WV-42309 WV-42650 30.5 19.5 25.0 24.4 ND 24.4
WV-42309 WV-42651 33.8 49.0 41.4 33.6 ND 33.6
WV-42309 WV-42652 27.1 15.2 21.2 24.6 ND 24.6
WV-42309 WV-42653 25.7 15.9 20.8 27.8 ND 27.8
WV-42309 WV-42654 25.8 29.4 27.6 39.5 ND 39.5
WV-42309 WV-42655 22.8 21.3 22.1 30.4 ND 30.4
WV-40398 WV-40399 69.1 79.8 74.5 96.1 ND 96.1
표 40 은 iCell Neuron에서 측정된, 인간 SRSF9 대조군 대비 인간 PTEN mRNA 잔존 백분율(5 μM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D .: 측정되지 않음
5 μM　
가이드　 패신저　 잔존 mRNA 백분율 (PTEN/　
SRSF9)-1　		 잔존 mRNA 백분율 (PTEN/　
SRSF9)-2　		 평균　
WV-42310 WV-41025 55.2 49.7 52.5
WV-43223 WV-41025 66.3 38.0 52.2
WV-43224 WV-41025 56.9 45.0 51.0
WV-43225 WV-41025 74.4 60.6 67.5
WV-43226 WV-41025 79.4 55.1 67.3
WV-43227 WV-41025 61.4 32.6 47.0
WV-43228 WV-41025 64.1 43.2 53.7
WV-43229 WV-41025 52.6 41.1 46.9
WV-43230 WV-41025 56.1 44.5 50.3
WV-42310 WV-43232 53.1 55.5 54.3
WV-43223 WV-43232 45.7 50.9 48.3
WV-43224 WV-43232 51.0 51.2 51.1
WV-43225 WV-43232 70.6 71.9 71.3
WV-43226 WV-43232 55.2 54.7 55.0
WV-43227 WV-43232 45.2 66.5 55.9
WV-43228 WV-43232 54.6 67.0 60.8
WV-43229 WV-43232 33.3 40.0 36.7
WV-43230 WV-43232 50.2 66.5 58.4
WV-42310 WV-43233 49.0 30.7 39.9
WV-43223 WV-43233 44.7 29.0 36.9
WV-43224 WV-43233 46.5 37.1 41.8
WV-43225 WV-43233 68.2 48.1 58.2
WV-43226 WV-43233 58.1 40.1 49.1
WV-43227 WV-43233 42.4 35.0 38.7
WV-43228 WV-43233 51.9 46.6 49.3
WV-43229 WV-43233 35.0 32.8 33.9
WV-43230 WV-43233 46.0 50.9 48.5
WV-42310 WV-43234 39.9 31.7 35.8
WV-43223 WV-43234 31.0 31.3 31.2
WV-43224 WV-43234 41.4 34.9 38.2
WV-43225 WV-43234 60.4 47.2 53.8
WV-43226 WV-43234 50.0 36.1 43.1
WV-43227 WV-43234 30.0 30.8 30.4
WV-43228 WV-43234 36.6 38.8 37.7
WV-43229 WV-43234 28.5 26.2 27.4
WV-43230 WV-43234 44.4 32.5 38.5
WV-42310 WV-43235 57.2 33.6 45.4
WV-43223 WV-43235 ND 32.7 32.7
WV-43224 WV-43235 48.8 27.6 38.2
WV-43225 WV-43235 52.8 38.2 45.5
WV-43226 WV-43235 55.7 37.2 46.5
WV-43227 WV-43235 39.5 30.3 34.9
WV-43228 WV-43235 52.5 40.0 46.3
WV-43229 WV-43235 33.6 27.1 30.4
WV-43230 WV-43235 52.0 43.6 47.8
WV-42310 WV-43236 ND 31.9 31.9
WV-43223 WV-43236 ND 25.7 25.7
WV-43224 WV-43236 ND 29.0 29.0
WV-43225 WV-43236 ND 35.1 35.1
WV-43226 WV-43236 ND 34.1 34.1
WV-43227 WV-43236 ND 28.7 28.7
WV-43228 WV-43236 ND 40.1 40.1
WV-43229 WV-43236 ND 24.0 24.0
WV-43230 WV-43236 ND 37.8 37.8
WV-42310 WV-43237 28.0 26.7 27.4
WV-43223 WV-43237 28.6 26.9 27.8
WV-43224 WV-43237 33.7 28.5 31.1
WV-43225 WV-43237 45.7 37.4 41.6
WV-43226 WV-43237 26.9 32.3 29.6
WV-43227 WV-43237 24.8 28.4 26.6
WV-43228 WV-43237 35.6 45.9 40.8
WV-43229 WV-43237 23.5 29.2 26.4
WV-43230 WV-43237 38.2 41.6 39.9
WV-42310 WV-43238 35.4 31.5 33.5
WV-43223 WV-43238 29.8 29.0 29.4
WV-43224 WV-43238 35.5 34.0 34.8
WV-43225 WV-43238 62.3 54.0 58.2
WV-43226 WV-43238 36.9 38.7 37.8
WV-43227 WV-43238 27.3 30.9 29.1
WV-43228 WV-43238 39.0 49.8 44.4
WV-43229 WV-43238 28.4 34.0 31.2
WV-43230 WV-43238 46.0 46.3 46.2
표 41 은 iCell 뉴런 세포주에서 측정된, 인간 SFRS 대조군 대비 마우스 PTEN mRNA 잔존 백분율(15 및 5 μM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D .: 측정되 지 않음
　 　 15 uM 5 pM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mPTEN/
mHPRT)-1		 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-2		 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-1		 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/
mHPRT)-2		 평균
WV-42309 WV-41025 51.0 44.8 47.9 63.5 69.2 66.4
WV-42309 WV-44331 44.2 N.D. 44.2 59.5 83.6 71.6
WV-42309 WV-44332 36.7 23.6 30.2 56.6 70.8 63.7
WV-42309 WV-44333 30.9 31.7 31.3 58.2 60.7 59.5
WV-42309 WV-44334 43.2 35.6 39.4 73.4 53.3 63.4
WV-42309 WV-44337 45.9 39.7 42.8 48.3 40.1 44.2
WV-42309 WV-44338 50.1 52.7 51.4 62.4 58.6 60.5
WV-42309 WV-44372 45.4 N.D. 45.4 55.8 57.5 56.7
WV-42309 WV-44373 31.8 26.8 29.3 123.0 68.1 95.6
WV-42309 WV-44374 41.4 28.4 34.9 170.5 109.9 140.2
WV-42309 WV-44375 37.6 27.2 32.4 185.1 179.9 182.5
WV-42309 WV-44376 36.9 42.7 39.8 162.8 172.6 167.7
WV-40398 WV-40399 109.8 113.3 111.6 64.2 63.1 63.7
표 42 는 H2K 세포주에서 측정된, 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 PTEN mRNA 잔존 백분율(10, 3, 및 1 μM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D .: 측정되지 않음
　 　 10 μM 3 μM 1 μM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mPTEN/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균
WV-40986 WV-41025 44.1 47.6 45.9 55.5 59.9 57.7 69.6 59.5 64.6
WV-40999 WV-41025 49.0 50.0 49.5 60.3 62.4 61.3 81.4 77.5 79.5
WV-42309 WV-41025 36.7 34.4 35.5 54.0 50.1 52.1 52.5 54.3 53.4
WV-42310 WV-41025 41.9 48.5 45.2 58.8 59.3 59.1 66.1 67.7 66.9
WV-42311 WV-41025 40.5 44.4 42.5 56.2 60.2 58.2 67.4 66.2 66.8
WV-42312 WV-41025 45.6 52.5 49.0 58.2 60.5 59.4 68.5 71.3 69.9
WV-42323 WV-41025 33.4 40.3 36.9 52.8 53.0 52.9 65.8 67.8 66.8
WV-42324 WV-41025 37.5 43.2 40.4 53.8 55.5 54.7 59.8 66.7 63.3
WV-42325 WV-41025 24.0 28.5 26.2 43.9 46.2 45.0 62.3 65.1 63.7
WV-42326 WV-41025 30.4 32.1 31.3 55.2 52.1 53.6 65.2 68.8 67.0
표 43 은 H2K 세포주에서 측정된, 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 PTEN mRNA 잔존 백분율(15 및 5 μM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D .: 측정되지 않음
　 　 15 μM 5 μM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mPTEN/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균
WV-40398 WV-40399 62.9 62.7 62.8 86.1 78.2 82.2
WV-42309 WV-41023 48.9 48.6 48.8 68.2 70.2 69.2
WV-42309 WV-42643 50.7 49.0 49.9 67.2 63.5 65.4
WV-42309 WV-42644 34.7 35.2 35.0 53.8 59.2 56.5
WV-42309 WV-42645 27.5 31.2 29.4 55.1 57.4 56.3
WV-42309 WV-42646 23.5 26.9 25.2 67.6 67.3 67.5
WV-42309 WV-42647 17.6 19.7 18.7 55.2 55.6 55.4
WV-42309 WV-42648 25.8 29.8 27.8 57.9 54.9 56.4
WV-42309 WV-42649 23.7 24.2 24.0 60.9 58.3 59.6
WV-42309 WV-40399 50.5 49.6 50.1 68.0 69.6 68.8
WV-42309 WV-41025 49.3 44.9 47.1 73.9 71.4 72.7
WV-42309 WV-42650 37.2 37.0 37.1 59.1 57.5 58.3
WV-42309 WV-42651 34.6 32.3 33.5 53.4 48.5 51.0
WV-42309 WV-42652 26.5 25.2 25.9 45.2 44.8 45.0
WV-42309 WV-42653 37.3 37.9 37.6 64.8 60.6 62.7
WV-42309 WV-42654 22.1 22.4 22.3 47.5 45.8 46.7
WV-42309 WV-42655 32.3 37.8 35.1 73.7 67.3 70.5
표 44 는 H2K 세포주에서 측정된, 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 PTEN mRNA 잔존 백분율(15 및 5 μM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D .: 측정되지 않음
　 　 15 μM 5 μM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mPTEN/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균
WV-42310 WV-41025 35.5 42.1 38.8 58.8 40.5 49.6
WV-43223 WV-41025 31.3 36.3 33.8 57.7 42.2 50.0
WV-43224 WV-41025 36.6 39.3 37.9 57.5 41.7 49.6
WV-43225 WV-41025 51.7 49.2 50.4 73.2 59.8 66.5
WV-43226 WV-41025 53.6 47.2 50.4 71.2 62.3 66.8
WV-43227 WV-41025 48.2 50.6 49.4 64.1 56.8 60.5
WV-43228 WV-41025 55.7 55.5 55.6 69.2 68.1 68.6
WV-43229 WV-41025 39.6 34.4 37.0 55.2 52.3 53.7
WV-43230 WV-41025 47.3 43.0 45.2 59.9 56.8 58.4
WV-42310 WV-43232 27.5 30.4 29.0 66.2 48.4 57.3
WV-43223 WV-43232 25.6 28.4 27.0 57.5 43.1 50.3
WV-43224 WV-43232 31.0 32.8 31.9 55.8 42.4 49.1
WV-43225 WV-43232 47.7 47.9 47.8 77.3 57.4 67.3
WV-43226 WV-43232 43.6 43.5 43.6 73.9 52.4 63.1
WV-43227 WV-43232 36.2 38.1 37.1 64.0 50.9 57.4
WV-43228 WV-43232 50.0 47.7 48.9 75.2 58.6 66.9
WV-43229 WV-43232 30.8 29.5 30.2 56.8 46.4 51.6
WV-43230 WV-43232 42.2 45.4 43.8 69.3 53.7 61.5
WV-42310 WV-43233 31.8 38.2 35.0 58.4 46.9 52.7
WV-43223 WV-43233 22.1 27.3 24.7 44.7 40.1 42.4
WV-43224 WV-43233 29.0 33.6 31.3 52.5 42.9 47.7
WV-43225 WV-43233 44.0 41.8 42.9 66.2 60.0 63.1
WV-43226 WV-43233 43.0 42.7 42.8 64.8 54.5 59.6
WV-43227 WV-43233 34.9 38.4 36.7 58.0 49.9 54.0
WV-43228 WV-43233 51.0 48.5 49.8 70.5 53.8 62.1
WV-43229 WV-43233 26.1 29.9 28.0 48.9 40.0 44.5
WV-43230 WV-43233 39.1 39.4 39.3 65.9 51.7 58.8
WV-42310 WV-43234 26.7 31.8 29.2 54.5 47.1 50.8
WV-43223 WV-43234 26.0 28.3 27.1 44.5 39.5 42.0
WV-43224 WV-43234 32.5 35.7 34.1 53.3 46.1 49.7
WV-43225 WV-43234 48.3 52.9 50.6 80.4 62.5 71.5
WV-43226 WV-43234 44.1 46.1 45.1 62.5 50.2 56.4
WV-43227 WV-43234 35.4 36.5 35.9 59.1 47.5 53.3
WV-43228 WV-43234 48.7 54.7 51.7 75.1 62.7 68.9
WV-43229 WV-43234 26.2 39.0 32.6 52.6 45.9 49.3
WV-43230 WV-43234 41.7 55.9 48.8 58.8 58.9 58.8
WV-42310 WV-43235 27.0 35.0 31.0 58.7 44.9 51.8
WV-43223 WV-43235 24.6 29.1 26.8 50.1 40.3 45.2
WV-43224 WV-43235 31.8 34.2 33.0 52.2 44.4 48.3
WV-43225 WV-43235 47.9 48.6 48.2 75.0 56.1 65.6
WV-43226 WV-43235 44.0 45.0 44.5 74.6 51.3 63.0
WV-43227 WV-43235 29.2 36.5 32.9 64.0 42.7 53.4
WV-43228 WV-43235 44.3 48.5 46.4 70.6 59.0 64.8
WV-43229 WV-43235 26.4 34.0 30.2 48.8 41.9 45.4
WV-43230 WV-43235 44.1 45.0 44.5 61.5 60.7 61.1
WV-42310 WV-43236 26.9 31.8 29.4 53.0 45.1 49.0
WV-43223 WV-43236 25.2 26.6 25.9 46.4 36.2 41.3
WV-43224 WV-43236 31.5 30.5 31.0 54.5 46.3 50.4
WV-43225 WV-43236 45.4 47.7 46.5 72.3 54.9 63.6
WV-43226 WV-43236 36.0 41.0 38.5 56.4 52.7 54.5
WV-43227 WV-43236 29.1 30.0 29.5 54.0 48.9 51.4
WV-43228 WV-43236 47.2 46.2 46.7 76.7 56.7 66.7
WV-43229 WV-43236 24.1 28.5 26.3 51.4 35.8 43.6
WV-43230 WV-43236 40.8 41.3 41.0 58.2 59.8 59.0
WV-42310 WV-43237 28.3 34.3 31.3 52.3 50.4 51.4
WV-43223 WV-43237 26.0 29.1 27.5 48.0 42.6 45.3
WV-43224 WV-43237 32.5 33.4 32.9 52.4 54.7 53.6
WV-43225 WV-43237 39.9 41.9 40.9 62.2 57.7 59.9
WV-43226 WV-43237 40.2 47.0 43.6 75.8 66.3 71.1
WV-43227 WV-43237 35.3 40.5 37.9 54.1 48.5 51.3
WV-43228 WV-43237 45.3 48.2 46.8 71.6 69.1 70.4
WV-43229 WV-43237 26.0 31.2 28.6 46.3 46.3 46.3
WV-43230 WV-43237 32.9 33.4 33.2 66.2 57.8 62.0
WV-42310 WV-43238 28.9 33.7 31.3 88.2 51.0 69.6
WV-43223 WV-43238 27.3 27.5 27.4 47.8 48.8 48.3
WV-43224 WV-43238 27.5 32.5 30.0 55.2 65.4 60.3
WV-43225 WV-43238 41.3 46.0 43.6 67.0 77.8 72.4
WV-43226 WV-43238 31.9 38.6 35.2 61.7 64.4 63.1
WV-43227 WV-43238 30.8 33.8 32.3 57.6 57.0 57.3
WV-43228 WV-43238 47.0 48.4 47.7 75.3 86.0 80.6
WV-43229 WV-43238 23.3 27.9 25.6 47.5 44.8 46.1
WV-43230 WV-43238 46.1 43.2 44.7 53.2 71.7 62.4
표 45 는 H2K 세포주에서 측정된, 마우스 HPRT 대조군 대비 마우스 PTEN mRNA 잔존 백분율(10, 3, 및 1 μM siRNA 처리에서)을 나타낸다. N = 2. N.D .: 측정되지 않음
　 　 10 μM 3 μM 1 μM
가이드 패신저 잔존 mRNA 백분율 (mPTEN/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-1 잔존 mRNA 백분율 (mTTR/mHPRT)-2 평균
WV-42309 WV-41025 48.5 37.0 42.8 65.9 55.2 60.6 69.4 58.4 63.9
WV-42309 WV-44331 35.1 43.2 39.2 49.3 51.4 50.4 55.3 58.5 56.9
WV-42309 WV-44332 40.3 46.8 43.6 58.0 58.4 58.2 66.9 66.2 66.5
WV-42309 WV-44333 58.4 44.2 51.3 63.0 71.9 67.4 67.5 81.0 74.3
WV-42309 WV-44334 48.3 42.0 45.1 62.1 71.4 66.7 77.9 82.9 80.4
WV-42309 WV-44337 58.0 58.9 58.5 69.7 79.4 74.6 80.1 89.1 84.6
WV-42309 WV-44338 53.8 40.9 47.3 60.9 53.7 57.3 67.2 68.0 67.6
WV-42309 WV-44372 41.9 48.9 45.4 52.8 58.3 55.5 66.2 61.6 63.9
WV-42309 WV-44373 48.5 56.0 52.2 58.8 64.4 61.6 76.0 75.7 75.8
WV-42309 WV-44374 66.1 52.3 59.2 76.1 72.7 74.4 81.0 84.3 82.7
WV-42309 WV-44375 51.8 61.2 56.5 74.4 81.0 77.7 76.5 87.9 82.2
WV-42309 WV-44376 46.2 53.6 49.9 57.8 62.4 60.1 78.0 76.6 77.3
WV-40398 WV-40399 58.6 70.8 64.7 62.3 68.5 65.4 63.7 72.4 68.0
실시예 13. 모든 PN 변형 아지드에 대한 합성 및 실험 절차:
2- 아지도 -(1,3-디메틸-3,4,5,6- 테트라하이드로피리미디늄 ) 헥사플루오로포 스페이트(1d)의 합성. PN 코드: n025
Figure pct00544
2- 클로로 -1,3-디메틸-3,4,5,6- 테트라하이드로피리미디늄 클로라이드(1b)의 합성.
아르곤 분위기 하에서, 건조된 2구 둥근 바닥 플라스크(1리터) 내의 1,3-디메틸테트라하이드로피리미딘-2(1H)-온, 1a(25.0 g, 0.195 mol, 1.0 당량)에 무수 사염화탄소(375 mL)를 첨가하였다. 새롭게 증류된 옥살릴 클로라이드(25.0 mL, 0.29 2mol, 1.5 당량)를 추가 깔대기를 사용하여 20분에 걸쳐 반응 혼합물에 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 48시간 동안 65℃까지 가열하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 5% CH3OH:CH2Cl2; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산), 반응 혼합물을 실온까지 냉각하고, 디에틸 에테르(300 mL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 수득된 반응 혼합물을 여과하고, 침전물을 디에틸 에테르(3 x 500 mL)로 세척하였다. 화합물을 고진공에서 건조하여 2-클로로-1,3-디메틸-3,4,5,6-테트라하이드로피리미디늄 클로라이드, 1b를 갈색 고체(31 g, 87% 수율)로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ in ppm 3.97 (t, 4H, J = 5.8 Hz), 3.51 (s, 6H), 2.37-2.31 (m, 2H).
MS: C6H12Cl2N2 ([M-Cl]+)에 대한 m/z 계산치, 147.06; 실측치 146.95.
2- 클로로 -1,3-디메틸-3,4,5,6- 테트라하이드로피리미디늄 헥사플루오로포스페이트(1c)의 합성.
아르곤 분위기 하에서, 건조된 둥근 바닥 플라스크(1리터) 내의 2-클로로-1,3-디메틸-3,4,5,6-테트라하이드로피리미디늄 클로라이드, 1b(31.0 g, 0.169 mol, 1.0 당량)에 CH2Cl2(310 mL)를 첨가하였다. 용액에 KPF6(31.16 g, 0.169 mol, 1.0 당량)을 10분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 5% CH3OH:CH2Cl2; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산), 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 필터 케이크를 CH2Cl2(150 mL)로 세척하였다. 여과액을 감압하에 농축 건조하여 미정제 생성물을 수득하였다. 미정제 생성물을 CH2Cl2(25 mL)에 용해시켰다. 디에틸 에테르를 적가하여 화합물을 침전시켰다. 침전이 완료된 후, 용매를 따라내어 생성물을 수득하였다. 수득물을 진공하에 건조하여 2-클로로-1,3-디메틸-3,4,5,6-테트라하이드로피리미디늄 헥사플루오로포스페이트(1c)를 백색 고체(45.0 g, 91% 수율)로서 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ in ppm = 3.84 (s, 4H), 3.47 (s, 6H), 2.30 (s, 2H).
19F NMR (500 MHz, CDCl3): δ in ppm = -73.02 및 -74.54.
2- 아지도 -(1,3-디메틸-3,4,5,6- 테트라하이드로피리미디늄 ) 헥사플루오로포 스페이트(1d)의 합성.
아르곤 분위기 하에서, 건조된 둥근 바닥 플라스크(1리터) 내의 2-클로로-1,3-디메틸-3,4,5,6-테트라하이드로피리미디늄 헥사플루오로포스페이트(1c)(45.0 g, 0.154 mol, 1.0 당량)에 무수 아세토니트릴(450 mL)을 첨가하였다. 용액에 아지드화나트륨(14.99 g, 0.231 mol, 1.5 당량)을 10분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 8시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 5% CH3OH:CH2Cl; TLC 탄화 - 닌히드린), 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, CH3CN(30 mL)으로 세척하였다. 수득된 여과액을 감압하에 건조하여 미정제 생성물을 수득하였다. 미정제 화합물을 CH3CN(150 mL)에 용해시켰다. 디에틸 에테르와 헥산의 혼합물을 적가하여 생성물을 침전시켰다. 침전이 완료된 후, 용매를 따라내고 고체를 진공하에 건조하였다. 상기 침전 과정을 2회 더 반복하여 순수한 2-아지도-(1,3-디메틸-3,4,5,6-테트라하이드로피리미디늄) 헥사플루오로포스페이트, 1d를 백색 고체(26 g, 57% 수율)로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ in ppm = 3.59 (t, 4H, J = 6.0 Hz), 3.33 (s, 6H), 2.26-2.20 (m, 2H).
19F NMR (400 MHz, CDCl3): δ in ppm = -72.99 및 -74.88. MS: C6H12F6N5P ([M-PF6]+)에 대한 m/z 계산치, 154.11; 실측치 154.29. IR (KBr 펠릿): N3 (2184 cm-1)
2- 아지도 -(1,3-디메틸-4,5,6,7- 테트라하이드로 -1H-1,3- 디아제피늄 ) 헥사플 루오로포스페이트(2f)의 합성. PN 코드: n026
Figure pct00545
1,3-디아제판-2-티온(2b)의 합성
아르곤 분위기 하에서, 건조된 둥근 바닥 플라스크(1리터) 내의 부탄-1,4-디아민, 2a(50.0 g, 0.567 mol, 1.0 당량)에 DMSO(500 mL)를 첨가하였다. 빙욕을 사용하여 용액을 0℃로 냉각하고 추가 깔대기를 사용하여 이황화탄소(41.2 mL, 0.682 mol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 70℃에서 16시간 동안 가열하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 5% CH3OH:CH2Cl2), 반응 혼합물을 실온까지 냉각하였다. 침전된 고체를 여과하고 고진공에서 건조하여 32.0 g의 생성물을 수득하였다. 수득된 여과액을 물(1.0리터)로 희석하고 유기층을 CH2Cl2(3 x 1000 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 황산나트륨 상에서 건조하고 감압하에 증발시켜 미정제 생성물을 수득하였다. 수득된 미정제 생성물을 최소 부피의 CH2Cl2에 용해시킨 후 헥산을 적가하여 침전시켰다. 침전물을 여과하고 고진공에서 건조하여 3-디아제판-2-티온, 2b(18.0 g)를 백색 고체로서 수득하였다(50 g, 68% 수율).
1 H NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 6.69 (s, 2H), 3.28-3.24 (m, 4H), 1.77-1.74 (m, 4H).
1,3-디메틸-1,3- 디아제판 -2-온(2c)의 합성.
아르곤 분위기 하에서, 건조된 단목 둥근 바닥 플라스크(1리터) 내의 1,3-디아제판-2-티온, 2b(21.0 g, 0.161 mol, 1.0 당량)에 CH2Cl2(100 mL)를 첨가하고, 빙욕을 사용하여 용액을 냉각하였다. 용액에 벤질트리메틸암모늄 클로라이드(BTAC, 1.49 g, 0.008 mol, 2 mol%)를 첨가한 후 메틸 요오다이드(65.0 mL, 1.044 mol, 6.5 당량) 및 50% 수성 NaOH 용액(58.68 mL)을 각각 적가하였다. 반응 혼합물을 8시간 동안 100℃까지 가열하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 5% CH3OH:CH2Cl2), 반응 혼합물을 실온까지 냉각하였다. 유기층을 클로로포름(3 x 1000 mL)으로 추출하였다. 합한 유기층을 황산나트륨 상에서 건조하고 용매를 감압하에 제거하여 미정제 생성물을 수득하였다. 화합물을 실리카 겔(100~200 메쉬) 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하고, 생성물을 헥산 중 30~80% 에틸 아세테이트로 용리하여 1,3-디메틸-1,3-디아제판-2-온, 2c를 연황색 오일(9.00 g, 39% 수율)로서 수득하였다.
1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 3.13-3.11 (m, 4H), 2.84 (s, 6H), 1.68-1.65 (m, 4H).
2- 클로로 -1,3-디메틸-4,5,6,7- 테트라하이드로 -1H-1,3- 디아제피늄 클로라이드(2d)의 합성.
아르곤 분위기 하에서, 건조된 2구 둥근 바닥 플라스크(1리터) 내의 1,3-디메틸-1,3-디아제판-2-온, 2c(25.0 g, 0.176 mol, 1.0 당량)에 무수 사염화탄소(250 mL)를 첨가하였다. 새롭게 증류된 옥살릴 클로라이드((22.6 mL, 0.264 mol, 1.5 당량)를 추가 깔대기를 사용하여 20분에 걸쳐 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 16시간 동안 70℃까지 가열하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 10% CH3OH:CH2Cl2), 반응 혼합물을 실온까지 냉각한 후, 디에틸 에테르(500 mL)로 희석하고, 5분 동안 교반하였다. 여과 후 침전물을 수집하고 디에틸 에테르(2 x 500 mL)로 세척하였다. 수득된 미정제 생성물을 최소 부피의 용매에 용해시키고 50% 에틸 아세테이트 및 헥산을 첨가하여 침전시켰다. 화합물을 여과를 통해 수집하고 진공하에 건조하여 2-클로로-1,3-디메틸-4,5,6,7-테트라하이드로-1H-1,3-디아제피늄 클로라이드, 2d를 백색 고체(30.0 g)로서 수득하였다. 미정제 화합물을 추가 정제 없이 다음 반응에 직접 사용하였다.
2- 클로로 -(-1,3-디메틸-4,5,6,7- 테트라하이드로 -1H-1,3- 디아제피늄 ) 헥사플 루오로포스페이트(2e)의 합성.
아르곤 분위기 하에서, 건조된 둥근 바닥 플라스크(1리터) 내의 2-클로로-1,3-디메틸-4,5,6,7-테트라하이드로-1H-1,3-디아제피늄 클로라이드, 2d(30.0g, 0.152 mol, 1.0 당량)에 CH2Cl2(300 mL)를 첨가하였다. 용액에 KPF6(42.02 g, 0.228 mol, 1.5 당량)을 10분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4.5시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 10% CH3OH:CH2Cl2), 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 필터 케이크를 CH2Cl2(150 mL)로 세척하고, 여과액을 농축 건조하였다. 미정제 화합물을 CH2Cl2에 용해시키고 물(2 x 500 mL)로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨 상에서 건조하고 용매를 감압하에 제거하여 2-클로로-1,3-디메틸-4,5,6,7-테트라하이드로-1H-1,3-디아제피늄 헥사플루오로포스페이트, 2e를 백색 고체(25.0 g, 54% 수율)로서 수득하였다.
1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 3.90 (t, 4H, J = 5.9 Hz), 3.38 (s, 6H), 2.09-2.07 (m, 4H).
19 F NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = -72.66 및 -74.16.
2- 아지도 -(1,3-디메틸-4,5,6,7- 테트라하이드로 -1H-1,3- 디아제피늄 ) 헥사플루오로포스페이트(2f)의 합성.
아르곤 분위기 하에서, 건조된 둥근 바닥 플라스크(1리터) 내의 2-클로로-1,3-디메틸-4,5,6,7-테트라하이드로-1H-1,3-디아제피늄 헥사플루오로포스페이트, 2e(25.0 g, 0.081 mol, 1.0 당량)에 무수 CH3CN(250 mL)을 첨가하였다. 용액에 아지드화나트륨(7.95 g, 0.122 mol, 1.5 당량)을 10분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 10% CH3OH:CH2Cl; TLC 탄화 - 닌히드린), 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, CH3CN(30 mL)으로 세척하였다. 유기층을 감압하에 증발시켜 미정제 생성물을 수득하였다. 미정제 생성물을 CH3CN(50 mL)에 용해시키고 -78℃에서 디에틸 에테르를 첨가하여 생성물을 침전시켰다. 용매를 제거하고 수득된 고체를 진공하에 건조하였다. 상기 침전 과정을 2회 반복하여 2-아지도-(1,3-디메틸-4,5,6,7-테트라하이드로-1H-1,3-디아제피늄)헥사플루오로포스페이트, 2f를 담황색 고체(21.0 g, 82% 수율)로서 수득하였다.
1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 3.63 (t, 4H, J = 5.5 Hz), 3.51 (d, 4H, J = 25.5 Hz), 3.25 (s, 6H), 3.15 (s, 6H), 2.02-1.96 (m, 4H), 1.89 (s, 4H).
19 F NMR (500 MHz, CDCl 3 ): δ in ppm = -72.15, -72.56, -73.67, 및 -74.08.
MS: C67H14F6N5P ([M-PF6]+)에 대한 m/z 계산치, 168.22; 실측치 168.15. IR (KBr 펠릿): N3 (2162 cm-1)
1- 아지도(피롤리딘-1-일)메틸렌 ) 피롤리디늄 ) 헥사플루오로포스페이트 , (3e)의 합성
PN 코드: n004
Figure pct00546
디(피롤리딘-1-일)메타논(3b)의 합성.
무수 THF(1380 mL)를 건조된 3구 둥근 바닥 플라스크(3리터) 내의 피롤리딘, 3a(117 mL, 1.424 mol, 1.0 당량)에 첨가하였다. 용액에 트리에틸아민(212 mL, 1.521 mol, 1.1 당량)을 첨가하고, 반응 혼합물을 빙욕을 사용하여 0℃까지 냉각하였다.　반응 혼합물에 트리포스겐(70.0 g, 0.236 mol, 0.16 당량, 224 mL THF 중) 용액을 적하 깔때기를 사용하여 30분에 걸쳐 적가하였다. 생성된 침전 혼합물을 70℃에서 2시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온까지 냉각하고 추가로 2시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 완료되었음을 나타냈다(TLC - 5% CH3OH:CH2Cl2; TLC 탄화 - KMnO4).　이어서, 반응 혼합물을 Buckner 깔대기와 Whatman 여과지를 통해 여과하였다. 수득된 케이크를 THF(250 mL)로 세척하였다. 여과액을 수집하고 용매를 감압하에 제거하여 디(피롤리딘-1-일)메타논, 3b를 갈색 액체(124.0 g, 52% 수율)로서 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ in ppm = 3.37 (t, 8H, J = 6.9 Hz), 1.81-1.84 (m, 8H).
MS: C9H16N2O ([M+H]+)에 대한 m/z 계산치, 169.24; 실측치 169.11.
1-( 클로로(피롤리딘-1-일)메틸렌 ) 피롤리디늄 클로라이드(3c)의 합성
아르곤 분위기 하에 실온에서, 건조된 3구 둥근 바닥 플라스크(3리터) 내의 디(피롤리딘-1-일)메탄온, 3b(124 g, 0.737 mol, 1.0 당량)에 건조 CH2Cl2(1340 mL)를 첨가하였다. 용액에 건조 CH2Cl2(520 mL) 중의 옥살릴 클로라이드(63.2 mL, 0.737 mol, 1.0 당량)의 용액을 적하 깔때기를 사용하여 실온에서 40분에 걸쳐 적가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 5시간 동안 60℃까지 가열하였다. TLC는 반응이 완료되었음을 나타냈다(TLC - 5% CH3OH:CH2Cl2; TLC 탄화 - KMnO4).　이어서, 용매를 증발 건조하여 1-(클로로(피롤리딘-1-일)메틸렌)피롤리디늄 클로라이드, 3c를 갈색 액체(160.0 g)로서 수득하였다. 미정제 물질을 다음 단계에 직접 사용하였다.
1-( 클로로(피롤리딘-1-일)메틸렌 ) 피롤리디늄 헥사플루오로포스페이트(3d)의 합성
실온에서, 건조된 둥근 바닥 플라스크(2리터) 내의 1-(클로로(피롤리딘-1-일)메틸렌)피롤리디늄 클로라이드, 3c(160 g, 0.71 7mol, 1.0 당량)에 물(1525 mL)을 첨가하였다. 용액에 KPF6(158.9 g, 0.863 mol, 1.2 당량, 326 mL 물 중)의 포화 용액을 적하 깔대기를 사용하여 20분에 걸쳐 적가하였다. 생성물의 일부를 첨가하며 침전시켰다. 실온에서 추가로 10분 동안 교반을 계속하였다. 이어서, 반응 혼합물을 Whatman 여과지를 사용하여 Buckner 깔때기를 통해 여과하였다. 고체를 물(1500 mL)로 세척하고 고진공에서 건조하여 미정제 생성물을 수득하였다. 미정제 생성물을 아세톤(110 mL)에 용해시키고 디에틸 에테르(1000 mL)를 적가하여 침전시켰다. 상기 침전법을 1회 더 반복하여 1-(클로로(피롤리딘-1-일)메틸렌)피롤리디늄 헥사플루오로포스페이트, 3d를 크림색 고체 (142.1 g, 60% 수율)로서 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ in ppm = 3.92 (t, 8H, J = 6.2 Hz), 2.10 (t, 8H, J = 6.5 Hz).
1- 아지도(피롤리딘-1-일)메틸렌 ) 피롤리디늄 ) 헥사플루오로포스페이트(3e)의 합성
욕 온도를 28℃로 유지하면서, 건조된 둥근 바닥 플라스크(500 mL) 내의 1-(클로로(피롤리딘-1-일)메틸렌)피롤리디늄 헥사플루오로포스페이트, 3d(71.0 g, 0.213 mol, 1.0 당량)에 아세토니트릴(3 x 100 mL)과 공비시켰다. 화합물을 고진공 펌프에서 1시간 동안 건조하였다. 아르곤 분위기 하에서, 플라스크에 무수 CH3CN(213 mL)을 첨가하였다. 용액에 아지드화나트륨(3.58 g, 0.055 mol)을 첨가하고 30℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 5% CH3OH:CH2Cl2; TLC 탄화 - 닌히드린), 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, CH3CN(50 mL)으로 세척하였다. 유기층을 감압하에 제거하여 미정제 생성물을 수득하였다. 수득된 고체를 CH3CN(60 mL)에 용해시키고 디에틸 에테르(850 mL)를 적가하여 침전시켰다. 상기 침전법을 1회 더 반복하여 3e를 백색 고체(65.1 g, 89% 수율)로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ in ppm = 3.77 (t, 8H, J = 6.5 Hz), 2.03-2.06 (m, 8H).
19F NMR (400 MHz, CDCl3): δ in ppm = -73.36 및 -75.26. MS: C9H16N5PF6 ([M-PF6]+)에 대한 m/z 계산치, 194.26; 실측치 194.16. IR (KBr 펠릿): N3 (2153 cm-1)
N -( 아지도(디메틸아미노)메틸렌 )- N - 메틸메탄아미늄 헥사플루오로포스페이트의 합성, (2). PN 코드: n003
Figure pct00547
둥근 바닥 플라스크 내의, 시판되는 N-(클로로(디메틸아미노)메틸렌)-N-메틸메탄아미늄 헥사플루오로포스페이트(V)(1)(35.0 g, 124.7 mmol, 1.0 당량)에 아세토니트릴(100 mL)을 첨가하였다. 용액에 아지드화나트륨(12.2 g, 187.1 mmol, 1.5 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하였다.　케이크를 아세토니트릴(3 x 40 mL)로 세척하였다. 여과액을 수집하고, 용매를 감압하에 제거하여 미정제 생성물을 수득하였다. 잔류물을 아세톤(15 mL)에 용해시킨 후, 톨루엔을 첨가하여 생성물을 침전시켜 N-(아지도(디메틸아미노)메틸렌)-N-메틸메탄아미늄 헥사플루오로포스페이트, (2)를 백색 고체(35.4g, 99% 수율)로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, 아세토니트릴-d3) δ 3.12(s, 12H).
19F NMR (400 MHz, 아세토니트릴-d3 ): δ in ppm = -69.57 및 -70.83
4-(아지도(모폴리노)메틸렌)모폴리늄 헥사플루오로포스페이트(4b)의 합성.
PN 코드: n008
Figure pct00548
둥근 바닥 플라스크 내의, 시판되는 4-[클로로(모르폴리늄-4-일리덴)메틸]모르폴린 클로라이드, 4a(41.2 g, 0.115 mole, 1.0 당량)에 아세토니트릴(115 mL)을 첨가하였다. 용액에 아지드화나트륨(11.2 g, 0.172 mole, 1.5 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하였다.　케이크를 아세토니트릴(3 x 40 mL)로 세척하였다. 여과액을 수집하고, 용매를 감압하에 제거하여 미정제 생성물을 수득하였다. 잔류물을 1:1의 톨루엔:아세톤(160 mL)에 용해시키고, 결정화 형성을 위해 밤새 냉동실에 두었다. 화합물을 여과로 수집하고 진공하에 건조하여 4-(아지도(모폴리노)메틸렌)모폴리늄 헥사플루오로포스페이트, 4b(27 g, 64% 수율)를 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, 아세토니트릴-d3) δ 3.86 - 3.71 (m, 4H), 3.65 - 3.58 (m, 2H), 2.34 (br.s, 8H).
19F NMR (400 MHz, 아세토니트릴-d3 ): δ in ppm = -71.98 및 -73.80
2- 클로로 -1-(4-(디메틸아미노)부틸)-3- 메틸 -4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트(WV-015A)의 합성, PN 코드: n029
Figure pct00549
1-( 프로프 -2-인-1-일) 이미다졸리딘 -2-온(2).
0℃에서 1-클로로-2-이소시아나토에탄, 1(100 g, 947.66 mmol)을 THF(1000 mL) 중 프로프-2-인-1-아민(프로파길 아민, 57.42 g, 1.04 mol, 1.0 당량)의 교반 용액에 첨가하였다. 용액을 20℃까지 가온시키고, NaH(39.80 g, 995.05 mmol, 60% 순도, 0.99 당량)를 첨가하고, 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. TLC는 프로프-2-인-1-아민이 완전히 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 반응물을 아세트산(50.0 mL)으로 ??칭하고, THF를 감압하에 제거하고, 잔류물을 물 400 mL로 희석하고, 에틸 아세테이트 900 mL(300mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트/헥산으로부터 결정화하여 정제하여 1-(프로프-2-인-1-일)이미다졸리딘-2-온(2)을 백색 고체(89 g, 75.65% 수율)로서 수득하였다.
1- 메틸 -3-( 프로프 -2-인-1-일) 이미다졸리딘 -2-온(3).
THF(900 mL) 중 1-(프로프-2-인-1-일)이미다졸리딘-2-온(2)(89 g, 716.93 mmol, 1.0 당량)의 용액에 0℃에서 NaH(57.35 g, 1.43 mol, 60% 순도, 2.0 당량)를 첨가하고, 15분 후에 MeI(122.11 g, 860.32 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0~20℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 2가 완전히 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 H2O 500 mL를 첨가하여 ??칭하고, EtOAc 1500 mL(500 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0~0/1)로 정제하여 1-메틸-3-(프로프-2-인-1-일)이미다졸리딘-2-온(3)을 황색 오일(99 g, 미정제)로서 수득하였다.
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 0:1), Rf = 0.6
1-(4-(디메틸아미노) 부트 -2-인-1-일)-3- 메틸이미다졸리딘 -2-온(4).
디옥산(1000 mL) 중 1-메틸-3-(프로프-2-인-1-일)이미다졸리딘-2-온(3)(99 g, 716.53 mmol, 1.0 당량)의 용액에 CuCl(92.22 g, 931.48 mmol, 1.3 당량), 파라포름알데하이드(20 g, 2.53 mmol), 및 N-메틸메탄아민(84.80 g, 752.35 mmol, 40% 순도, 1.05 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 55℃에서 6시간 동안 교반하였다. LCMS는 목적하는 질량이 검출된 것으로 나타났다. Na2CO3 500 g을 반응 혼합물에 첨가한 후 1시간 동안 교반하고, 혼합물을 여과하고, 여과액을 감압하에 농축하였다. 잔류물을 RP-MPLC(DAC-150 Agela C18, 450 ml/분, 5~25% 40분; 25~25% 40분)로 정제하여 미정제 혼합물을 수득하였다. 미정제물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 에틸 아세테이트/메탄올 = 1/0~5/1)로 정제하여 1-(4-(디메틸아미노)부트-2-인-1-일)-3-메틸이미다졸리딘-2-온(4)을 황색 오일(50 g, 35.74% 수율)로서 수득하였다. LCMS (M+H+): 196.2
TLC(에틸 아세테이트: 메탄올 = 5:1), Rf = 0.4
1-(4-(디메틸아미노)부틸)-3- 메틸이미다졸리딘 -2-온(4A).
EtOH(500 mL) 중 1-(4-(디메틸아미노)부트-2-인-1-일)-3-메틸이미다졸리딘-2-온(4)(30 g, 153.64 mmol, 1.0 당량), Ni(10 g)의 혼합물를 탈기시키고, H2로 3회 퍼징한 후, 혼합물을 H2 분위기(15 psi) 하에 80℃에서 12시간 동안 교반하였다. LCMS는 화합물 4가 완전히 소모되었고, 목적하는 질량을 갖는 하나의 주 피크가 검출된 것으로 나타났다. 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과액을 감압하에 농축하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 디클로로메탄: 메탄올 = 1/0~0/1)로 정제하여 1-(4-(디메틸아미노)부틸)-3-메틸이미다졸리딘-2-온(4A)을 황색 오일(30 g, 미정제)로서 수득하였다.
LCMS (M+H+): 200.3. TLC(DCM: MeOH = 5:1, Rf = 0.2)
2- 클로로 -1-(4-(디메틸아미노)부틸)-3- 메틸 -4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 클로라이드(5A).
톨루엔(50 mL) 중 1-(4-(디메틸아미노)부틸)-3-메틸이미다졸리딘-2-온(4A)(15 g, 75.27 mmol, 1.0 당량)의 용액에 (COCl)2(191.06 g, 1.51 mol)을 첨가하고, 혼합물을 65℃에서 12시간 동안 교반하였다. LCMS는 목적하는 질량이 검출된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 용매를 제거하였다. 미정제 생성물을 15℃에서 ACN 100 mL로부터 재결정화하여 정제하여 2-클로로-1-(4-(디메틸아미노)부틸)-3-메틸-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-3-윰 클로라이드(5A)를 갈색 고체(10 g, 52.27% 수율)로서 수득하였다. LCMS (M+H+): 218.3
2- 클로로 -1-(4-(디메틸아미노)부틸)-3- 메틸 -4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트(WV-015A)
DCM(50 mL) 및 H2O(30 mL) 중 2-클로로-1-(4-(디메틸아미노)부틸)-3-메틸-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-3-윰 클로라이드(5A)(9.75 g, 38.36 mmol, 1.0 당량)의 용액에 칼륨;헥사플루오로포스페이트(7.06 g, 38.3 6 mmol, 1.0 당량)를 15℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 15℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물로부터 다수의 고체를 침전시켰다. 반응 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 DCM(30 mL x 2)으로 세척하고, 감압하에 농축하여 미정제물 10g을 수득하였다. 미정제물을 H2O 200 mL에 첨가하고, 여과하고, 필터 케이크는 목적하는 화합물 2-클로로-1-(4-(디메틸아미노)부틸)-3-메틸-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트(WV-015A)(8.2 g, 58.75% 수율)였다.
2- 아지도 -1-(4-(디메틸아미노)부틸)-3- 메틸 -4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트(WV-015A)
건조된 둥근 바닥 플라스크(500 mL) 내의 2-클로로-1-(4-(디메틸아미노)부틸)-3-메틸-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트(WV-015A)(5.5 g, 15.1 mmol, 1.0 당량)의 용액에 건조 아세토니트릴(300 mL)을 첨가하고, 0˚C까지 냉각하였다. 용액에 아지드화나트륨(1.18 g, 18.2 mmol, 1.2당량)을 첨가하고 2시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 완료된 것으로 나타났다 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하였다. 여과액을 감압하에 증발시켜 미정제 화합물을 수득하였다.
MS (ESI) 371.31 (M+1)+
부탄-1-설포닐 아지드(WLS-05)의 합성. PN 코드: n020
Figure pct00550
부탄-1- 설포닐 아지드( WLS -05).
물(95 mL) 중 아지드화나트륨(15.56 g, 0.24 mol) 용액에 부탄-1-설포닐 아세톤(320 mL) 중 클로라이드(25 g, 0.16 mol) 용액을 아르곤 분위기 하에 0℃에서 1분 동안 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 만들고 3시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC로 모니터링), 아세톤을 감압하에 제거하고 반응 혼합물을 EtOAc(100 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 감압 농축하였다. 미정제 생성물을 EtOAc:헥산을 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 부탄-1-설포닐 아지드(WLS - 05)(23.53 g, 90 %)를 연갈색 오일로서 수득하였다. TLC 이동상 세부 사항: 헥산 중 10% EtOAC. 1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 3.32 (m, 2H, CH2), 1.91 (m, 2H, CH2), 1.51 (m, 2H, CH2), 0.99 (t, J = 7.3 Hz, 3H, CH3).
MS: C4H9N3O2S ([M+Na]+)에 대한 m/z 계산치, 186.18; 실측치 186.15. IR (KBr) = 2135 cm 1
6-(2,2,2- 트리플루오로아세트아미도 ) 헥산 -1- 설포닐 아지드( WLS - 06)의 합성. PN 코드: n021
Figure pct00551
2,2,2-트리플루오로-N-(6-하이드록시헥실)아세트아미드(WLS-06b)
MeOH(375 mL) 중 6-아미노 헥산올(50 g, 0.43 mol) 및 트리에틸아민(148.6 mL, 1.06 mol, 2.5 당량)의 혼합물을 0℃까지 냉각시켰다. 아르곤 분위기 하에서 20분에 걸쳐 트리플루오로아세트산 무수물(83 mL, 0.59 mol)을 적가하고, 반응물을 실온까지 가온하고 4시간 동안 교반하고, 농축하고, 미정제 생성물을 EtOAc:헥산을 사용하여 실리카겔(100~200 메쉬) 크로마토그래피로 정제하여 화합물 2,2,2-트리플루오로-N-(6-하이드록시헥실)아세트아미드(WLS-06b)(87.57 g, 96%)를 백색 고체로서 수득하였다. TLC 이동상 세부 사항: DCM 중 5% MeOH 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ in ppm = 6.67 (s, 1H, NH), 3.64 (t, J = 6.5 Hz, 2H, CH2), 3.36 (m, 2H, CH2), 1.69 (s, 1H, OH), 1.59 (m, 4H, 2 x CH2), 1.39 (m, 4H, 2 x CH2). MS: C8H14F3NO2 ([M-H]+)에 대한 m/z 계산치, 212.20; 실측치 212.04.
6-(2,2,2- 트리플루오로아세트아미도 ) 헥실 메탄설포네이트 ( WLS -06c).
아르곤 분위기 하에서 WLS-06b(50 g, 0.23 mol)를 피리딘(500 mL)에 용해시켰다. 이어서 반응 혼합물을 0℃까지 냉각하고 메실클로라이드(19 mL, 0.25 mol)를 40분에 걸쳐 적가하였다. 이어서, 반응물을 실온까지 가온시켰다. 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC 모니터링), 반응물을 물(500 mL)로 ??칭하고 EtOAc(3 x 300 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 감압 농축하였다. 미정제 생성물을 MeOH: DCM을 사용하여 실리카겔(100~200 메쉬) 크로마토그래피로 정제하여 화합물 WLS -06c(57.76 g, 85%)를 백색 고체로서 수득하였다. TLC 이동상 세부 사항: DCM 중 5% MeOH 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ in ppm = 6.71 (s, 1H, NH), 4.23 (t, J = 6.4 Hz, 2H, CH2), 3.36 (m, 2H, CH2), 3.01 (s, 3H, CH3), 1.77 (m, 2H, CH2), 1.61 (m, 2H, CH2), 1.46 (m, 2H, CH2), 1.39 (m, 2H, CH2). MS: C9H16F3NO4S ([M+H]+)에 대한 m/z 계산치, 292.29; 실측치 292.17.
S-(6-(2,2,2-트리플루오로아세트아미도)헥실) 에탄티오에이트(WLS-06d).
아르곤 분위기 하에서 WLS-06c(74 g, 0.254 mol)를 건조 DMF(1480 mL)에 용해시켰다. 이어서, 티오아세트산칼륨(58.06 g, 0.509 mol)을 실온에서 반응 혼합물에 조금씩 첨가하였다(첨가 후 점착성 액체가 형성됨, 40분 동안 교반한 후, 점착성 액체가 투명한 용액으로 변환됨). 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC 모니터링), RM을 물(600 mL)로 희석하고 디에틸 에테르(3 x 700 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 감압 농축하였다. 미정제 화합물을 EtOAc:헥산을 사용하여 실리카 겔(100~200 메쉬) 크로마토그래피로 정제하여 화합물 WLS -06d(62.26 g, 90%)를 오일로서 수득하였다. TLC 이동상 세부 사항: DCM 중 5% MeOH 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ in ppm = 6.56 (s, 1H, NH), 3.36 (m, 2H, CH2), 2.85 (d, J = 7.3 Hz, 2H, CH2), 2.33 (s, 3H, CH3), 1.59 (m, 4H, 2 x CH2), 1.38 (m, 4H, 2 x CH2). MS: C10H16F3NO2S ([M-H]+)에 대한 m/z 계산치, 270.30; 실측치 270.17.
6-(2,2,2- 트리플루오로아세트아미도 ) 헥산 -1- 설포닐 클로라이드( WLS -06e).
아르곤 분위기 하에서 WLS-06d(24 g, 0.088 mol)를 건조 MeCN(432 mL)에 용해시켰다. 이어서 반응 혼합물을 빙욕에서 0℃까지 냉각시켰다. 2N HCL(43.2 mL)을 15분에 걸쳐 적가하고, 동일 온도에서 10분 동안 교반하였다. 이어서 N-클로로석신이미드(52.00 g, 0.390 mol)를 40분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 만들고 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC 모니터링), 반응물을 물(200 mL)로 희석하고 0℃에서 포화 중탄산나트륨 용액으로 ??칭하였다. 이어서 디에틸 에테르(3 x 300 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 감압 농축하였다. 미정제 화합물을 EtOAc:헥산을 사용하여 실리카 겔(100~200 메쉬) 크로마토그래피로 정제하여 화합물 WLS -06e(23.75 g, 91%)를 수득하였다. TLC 이동상 세부 사항: 헥산 중 30% EtOAC. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ in ppm = 6.42 (s, 1H, NH), 3.68 (m, 2H, CH2), 3.38 (m, 2H, CH2), 2.06 (m, 2H, CH2), 1.65 (m, 2H, CH2), 1.55 (m, 2H, CH2), 1.42 (m, 2H, CH2). MS: C8H13ClF3NO3S ([M-H]+)에 대한 m/z 계산치, 294.70; 실측치 294.07.
6-(2,2,2- 트리플루오로아세트아미도 ) 헥산 -1- 설포닐 아지드( WLS -06).
아르곤 분위기 하에서 WLS-06e(20 g, 0.078 mol)를 MeCN(295 mL)에 용해시키고 NaN3(5.46 g, 0.084 mol)을 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC 모니터링), 반응물을 물(300 mL)로 희석하고 에틸 아세테이트(3 x 200 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 감압 농축하였다. 미정제 화합물을 소량의 DCM에 용해시키고 헥산을 적가하여 침전시켰다. 침전물 화합물을 여과하고 헥산으로 세척하여 백색 고체 화합물 WLS -06(18.45 g, 90%)을 수득하였다. TLC 이동상 세부 사항: 헥산 중 30% EtOAC. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ in ppm = 6.33 (s, 1H, NH), 3.36 (m, 4H, CH2), 1.94 (m, 2H, CH2), 1.64 (m, 2H, CH2), 1.52 (m, 2H, CH2), 1.42 (m, 2H, CH2). MS: C8H13F3N4O3S ([M-H]+)에 대한 m/z 계산치, 301.27; 실측치 301.08. 19F NMR (400 MHz, CDCl3): δ in ppm = -75.78. IR (KBr) = 2147 cm-1.
모르폴린-4- 카보닐 아지드( WLS - 08)의 합성
Figure pct00552
모르폴린-4-카보닐 클로라이드(WLS-08b)
트리포스겐(8.57 g, 0.029 mol)을 DCM(754 mL)에 용해시키고 염 빙욕을 사용하여 -5℃까지 냉각한 후, DCM(75 mL) 중 모르폴린(5.0 g, 0.057 mol) 및 트리에틸아민(11.9 mL, 0.085 mol)의 용액을 45분에 걸쳐 반응 혼합물에 천천히 적가하였다. 반응 혼합물을 동일한 온도에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC 모니터링), 반응 혼합물을 물로 세척하고 DCM으로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 감압 농축하였다. 미정제 화합물을 EtOAc-헥산을 사용하여 실리카 겔(100~200 메쉬) 크로마토그래피로 정제하여 WLS-08b(2.4 g, 28%)를 오일로서 수득하였다. TLC 이동상 세부 사항: DCM 중 5% MeOH 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ in ppm = 3.73 (s, 6H, 3 x CH2), 3.65 (m, 2H, CH2). MS: C5H8ClNO2 ([M+H]+)에 대한 m/z 계산치, 150.57; 실측치 149.88.
모르폴린-4- 카보닐 아지드( WLS -08)
아르곤 분위기 하에서 WLS-08b(6.7 g, 0.045 mol)를 MeCN(100 mL)에 용해시키고 NaN3(3.78 g, 0.058 mol)을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC 모니터링), 반응물을 물(200 mL)로 희석하고 디에틸 에테르(300 mL), 포화 탄산나트륨(100 mL), 및 염수(100mL)로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 미정제 화합물을 EtOAc-헥산을 사용하여 실리카 겔(100~200 메쉬) 크로마토그래피로 정제하여 WLS-08(4.20 g, 60%)을 오일로서 수득하였다. TLC 이동상 세부 사항: DCM 중 5% MeOH 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ in ppm = 3.67 (m, 4H, 2 x CH2), 3.56 (m, 2H, CH2), 3.45 (t, J = 4.9 Hz, 2H, CH2). MS: C5H8N4O2 ([M+H]+)에 대한 m/z 계산치, 157.14; 실측치 156.80.
피페리딘-1- 카보닐 아지드( WLS - 09)의 합성
Figure pct00553
피페리딘-1- 염화카보닐 ( WLS -09b)
트리포스겐(12.19 g, 0.041 mol)을 DCM(525 mL)에 용해시키고 염 빙욕을 사용하여 -5℃까지 냉각한 후, 피페리딘(7.00 g, 0.082 mol) 및 트리에틸아민(22.97 mL, 0.164 mol)의 용액을 45분에 걸쳐 반응 혼합물에 천천히 적가하였다. 반응 혼합물을 동일한 온도에서 추가로 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC 모니터링), 반응 혼합물을 물로 세척하고 유기층을 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 미정제 화합물 WLS-09b(11.5 g)를 다음 단계에 직접 사용하였다. TLC 이동상 세부 사항: DCM 중 5% MeOH
피페리딘-1-카보닐 아지드(WLS-09)
아르곤 분위기 하에서 미정제 WLS-09b(11.5 g, 0.078 mol)를 MeCN(157 mL)에 용해시키고 NaN3(6.09 g, 0.094 mol)을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC 모니터링), 반응 혼합물을 물(200 mL)로 희석하고 디에틸 에테르(300 mL), 포화 탄산나트륨(100 mL), 및 염수(100mL)로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 미정제 화합물을 EtOAc-헥산을 사용하여 실리카 겔(100~200 메쉬) 크로마토그래피로 정제하여 WLS-09(2단계에서, 4.42 g, 33%)을 오일로서 수득하였다. TLC 이동상 세부 사항: DCM 중 5% MeOH 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ in ppm = 3.50 (m, 2H, CH2), 3.36 (m, 2H, CH2), 3.45 (t, J = 4.9 Hz, 2H, CH2), 1.59 (m, 6H, 3 x CH2). MS: C6H10N4O ([M+H]+)에 대한 m/z 계산치, 155.17; 실측치 154.91.
피롤리딘-1-카보닐 아지드(WLS-10)의 합성
Figure pct00554
피롤리딘-1-카보닐 클로라이드(WLS-10b)
트리포스겐(12.50 g, 0.042 mol)을 DCM(450 mL)에 용해시키고 염 빙욕을 사용하여 -5℃까지 냉각한 후, 피롤리딘(6.00 g, 0.084 mol) 및 트리에틸아민(23.56 mL, 0.168 mol)의 용액을 20분에 걸쳐 반응 혼합물에 적가하였다. 반응 혼합물을 동일한 온도에서 추가로 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC 모니터링), 반응물을 물로 세척하고 유기층을 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 미정제 화합물 WLS-10b(10.0 g)를 다음 단계에 직접 사용하였다. TLC 이동상 세부 사항: DCM 중 5% MeOH
피롤리딘-1-카보닐 아지드(WLS-10)
아르곤 분위기 하에서 미정제 WLS-10b(10.0 g, 0.075 mol)를 MeCN(137 mL)에 용해시키고 NaN3(5.84 g, 0.090 mol)을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 6시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC 모니터링), 반응 혼합물을 물(200 mL)로 희석하고 디에틸 에테르(300 mL), 포화 탄산나트륨(100 mL), 및 염수(100mL)로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 미정제 화합물을 EtOAc-헥산을 사용하여 실리카 겔(100~200 메쉬) 크로마토그래피로 정제하여 WLS-10(2단계에서, 6.00 g, 57%)을 오일로서 수득하였다. TLC 이동상 세부 사항: DCM 중 5% MeOH 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ in ppm = 3.45 (m, 2H, CH2), 3.33 (m, 2H, CH2), 1.90 (m, 4H, 2 xCH2). MS: C5H8N4O ([M+H]+)에 대한 m/z 계산치, 141.15; 실측치 140.80.
4-(2,2,2- 트리플루오로아세틸 )피페라진-1- 카보닐 아지드( WLS - 11)의 합성
Figure pct00555
2,2,2-트리플루오로-1-(피페라진-1-일)에탄-1-온(WLS-11b)
에틸 트리플루오로아세테이트(6.93 mL, 0.058 mol)를 THF(50 mL) 중 피페라진(5.0 g, 0.058 mol)의 현탁액에 실온에서 질소 하에 첨가하고 60분 동안 교반하고 농축하여 용매를 제거하였다. 유성 잔류물을 에테르에 용해시키고 여과하고 필터 케이크를 에테르로 세척하였다. 여과액을 농축하고 MeOH-DCM을 사용하여 실리카 겔(100~200 메쉬) 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 WLS-11b(6.51 g, 61%)를 오일로서 수득하였다. TLC 이동상 세부 사항: DCM 중 5% MeOH MS: C6H9F3N2O ([M+H]+)에 대한 m/z 계산치, 183.15; 실측치 182.65.
4-(2,2,2-트리플루오로아세틸)피페라진-1-카보닐 클로라이드(WLS-11c)
트리포스겐(5.29 g, 0.018 mol)을 DCM(487 mL)에 용해시키고 염 빙욕을 사용하여 -5℃까지 냉각한 후, WLS-11b(6.50 g, 0.036 mol) 및 트리에틸아민(9.97 mL, 0.071 mol)의 용액을 20분에 걸쳐 반응 혼합물에 천천히 적가하였다. 반응 혼합물을 동일한 온도에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC 모니터링), 반응물을 물로 세척하고 유기층을 황산나트륨으로 건조하고, 감압하에 농축하였다. 미정제 화합물 WLS-11c(8.1 g)를 다음 단계에 직접 사용하였다. TLC 이동상 세부 사항: DCM 중 5% MeOH
4-(2,2,2-트리플루오로아세틸)피페라진-1-카보닐 아지드(WLS-11)
아르곤 분위기 하에서 미정제 WLS-11c(8.1 g, 0.033 mol, 1.0 당량)를 MeCN(111 mL)에 용해시키고 NaN3(2.58 g, 0.040 mol)을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC 모니터링), 반응 혼합물을 물(200 mL)로 희석하고 디에틸 에테르(300 mL), 포화 탄산나트륨(100 mL), 및 염수(100mL)로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 미정제 화합물을 EtOAc-헥산을 사용하여 실리카 겔(100~200 메쉬) 크로마토그래피로 정제하여 WLS-11(2단계에서, 6.31 g, 70%)을 오일로서 수득하였다. TLC 이동상 세부 사항: DCM 중 5% MeOH 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ in ppm = 3.65 (m, 6H, 2 x CH2), 3.55 (d, J = 2.5 Hz, 2H, CH2). MS: C7H8F3N5O2 ([M+H]+)에 대한 m/z 계산치, 252.17; 실측치 252.00.
4- 메틸피페라진 -1- 카보닐 아지드( WLS - 12)의 합성
Figure pct00556
4- 메틸피페라진 -1- 카보닐 클로라이드( WLS -12b)
트리포스겐(7.40 g, 0.025 mol)을 CH2Cl2(750 mL)에 용해시키고 염 빙욕을 사용하여 -5℃까지 냉각한 후, CH2Cl2(150 mL) 중 N-메틸피페라진(5.00 g, 0.050 mol) 및 디이소프로필에틸레인(17.38 mL, 0.100 mol)의 용액을 30분에 걸쳐 반응 혼합물에 천천히 적가하였다. 반응 혼합물을 동일한 온도에서 추가로 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC 모니터링), RM을 물로 세척하고 유기층을 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 미정제 화합물 WLS-12b(8.0 g)를 다음 단계에 직접 사용하였다. TLC 이동상 세부 사항: DCM 중 5% MeOH
4- 메틸피페라진 -1- 카보닐 아지드( WLS -12)
아르곤 분위기 하에서 미정제 WLS-12b(8.0 g, 0.049 mol)를 MeCN(112 mL)에 용해시키고 NaN3(3.83 g, 0.059 mol)을 0℃에서 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC 모니터링), 반응 혼합물을 물(200 mL)로 희석하고 디에틸 에테르(300 mL), 포화 탄산나트륨(100 mL), 및 염수(100mL)로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 미정제 화합물을 EtOAc-헥산을 사용하여 실리카 겔(100~200 메쉬) 크로마토그래피로 정제하여 WLS-12(2단계에서, 3.60 g, 43%)을 오일로서 수득하였다. TLC 이동상 세부 사항: DCM 중 5% MeOH 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ in ppm = 3.58 (t, J = 5.1 Hz, 2H, CH2), 3.46 (t, J = 5.1 Hz, 2H, CH2), 2.38 (m, 4H, 2 x CH2), 2.30 (s, 3H, CH3). MS: C6H11N5O ([M+H]+)에 대한 m/z 계산치, 170.19; 실측치 169.81.
4-(6-(2,2,2- 트리플루오로아세트아미도 ) 헥사노일 )피페라진-1- 카보닐 아지드(WLS-13)의 합성
Figure pct00557
N-(tert-부톡시카보닐)-피페라진(WLS-13a: 1-Boc-피페라진).
피페라진(12 g, 139.3 mmol)을 건조 CH2Cl2(240 mL)에 용해시키고 용액을 0℃까지 냉각시켰다. 반응 혼합물에 건조 CH2Cl2(160 mL) 중 디-tert-부틸 디카보네이트(Boc2O)(15.2 g, 69.64 mmol) 용액을 적가하였다(20분에 걸쳐). 이어서 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후 생성된 침전물을 여과하고 CH2Cl2(2 x 40 mL)로 세척하고, 합한 여과액을 분리하여 H2O(3 x 80 mL), 염수(60 mL)로 세척하고 Na2SO4로 건조하고 여과하고 감압하에 농축하였다. 미정제 생성물을 CH2Cl2:MeOH를 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 WLS -13a(11.6g, 45%)를 백색 고체로서 수득하였다. TLC 이동상 세부 사항: DCM 중 20% MeOH 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ in ppm = 3.32 (t, J = 4.8 Hz, 4H, 2 x CH2,), 2.74 (t, J = 4.5 Hz, 3H, 2 x CH2), 1.68 (s, 1H, NH), 1.40 (s, 9H, 3 x CH3). MS: C9H19N2O2 ([M+H]+)에 대한 m/z 계산치, 187.25; 실측치 187.04.
6- (2,2,2-트리플루오로아세트아미도)헥산산 ( WLS -13b)
MeOH(80 mL) 중 6-아미노 헥산산(21 g, 0.160 mol) 및 트리에틸아민(22.4 mL, 0.160 mol)의 용액을 0℃까지 냉각시켰다. 트리플루오로아세트산 무수물(24 mL, 0.192 mol)을 아르곤 분위기 하에서 20분에 걸쳐 적가하고 반응물을 실온으로 만들고 16시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 용매를 증발시켰다. 미정제 화합물을 0℃까지 냉각시키고, 2 N HCl(400 mL)을 적가하였다. 첨가 후 침전물 화합물을 여과하여 백색 화합물을 수득하였다. 여과액에서 나머지 화합물을 제거하기 위해 여과액을 NaCl로 포화시킨 용액을 디에틸 에테르(2 x 200 mL)로 추출하였다. 고체 화합물 또한 디에틸 에테르(200 mL)에 용해시키고 물(2 x 200 mL)로 세척하였다. 합합 유기층(고체 및 여과액으로부터)을 황산나트륨으로 건조시키고 증발시켰다. 미정제 화합물을 소량의 디에틸 에테르에 용해시키고 헥산을 적가하여 침전시켰다. 침전물 화합물을 여과하고 헥산으로 세척하여 화합물 WLS -13b(33.0 g, 91%)를 백색 고체로서 수득하였다. TLC 이동상 세부 사항: DCM 중 10% MeOH 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ in ppm = 12.00 (s, 1H, COOH), 9.39 (s, 1H, NH), 3.17 (dd, J = 13.1, 6.9 Hz, 2H, CH2), 2.20 (t, J = 7.6 Hz, 2H, CH2), 1.50 (m, 4H, 2 x CH2), 1.26 (m, 2H, CH2). MS: C8H12F3NO3 ([M-H]+)에 대한 m/z 계산치, 226.18; 실측치 226.02.
( Tert -부틸 4-(6-(2,2,2- 트리플루오로아세트아미도 ) 헥사노일 )피페라진-1- 카복실레이트 (WLS-13c).
무수 메틸렌 클로라이드(375 mL) 중 WLS-13b(15.00 g, 0.066 mol) 및 1-하이드록시벤즈트리아졸(9.72 g, 0.072 mol)의 용액에 에틸 3-(디메틸아미노)프로필 카보디이미드, 하이드로클로라이드 염(13.8 g, 0.072)을 아르곤 분위기 하에 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 이어서 WLS-13a(12.3 g, 0.066 mol) 및 디이소프로필에틸아민(13.8 mL, 0.793 mol)을 첨가하고 혼합물은 균질한 용액이 되었다. 반응 혼합물을 0℃에서 3시간 동안 교반하였다. 용액을 서서히 실온까지 가온하고 실온에서 추가로 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLS 모니터링), RM을 0℃까지 냉각하고 얼음물(400 mL)로 ??칭하였다. 별도의 유기층을 5% 중탄산나트륨 용액으로 세척하였다. (2 x 500mL). 합한 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축시켰다. 미정제 생성물을 소량의 CH2Cl2에 용해시키고 헥산을 적가하여 침전시켰다. 침전물 화합물을 여과하고 헥산으로 세척하여 화합물 WLS -13c(33.0 g, 91%)를 백색 고체로서 수득하였다. TLC 이동상 세부 사항: DCM 중 5% MeOH 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ in ppm = 9.38 (s, 1H, NH), 3.41 (m, 2H, CH2), 3.26 (s, 2H, CH2), 3.16 (dd, J = 13.0, 6.8 Hz, 3H, CH, CH2), 2.30 (t, J = 7.5 Hz, 2H, CH2), 1.48 (m, 5H, CH, 2 x CH2), 1.40 (s, 9H, 3 x CH3), 1.28 (m, 4H, 2 x CH2). MS: C17H28F3N3O4 ([M-H]+)에 대한 m/z 계산치, 394.42; 실측치 394.33.
2,2,2- 트리플루오로 -N-(6-옥소-6-(피페라진-1-일) 헥실 )아세트아미드( WLS -13d)
WLS -13c(18.30 g, 0.046 mol)를 CH2Cl2(725 mL)에 용해시키고 아르곤 분위기 하에서 0℃까지 냉각시켰다. 이어서 TFA:CH2Cl2(1;1, 181.3 mL) 용액을 0℃에서 45분에 걸쳐 적가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온으로 만들고 4시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC 모니터링), 베이스 트랩을 사용하여 용매를 증발 건조시켜 미정제 화합물을 수득하였다. 미정제 화합물을 15% MeOH:CH2Cl2(100 mL)에 용해시키고 0℃까지 냉각시키고 포화 중탄산나트륨 용액(pH: 최대 중성까지)으로 ??칭하였다. 이어서 400 mL의 물을 첨가하고 15% MeOH:CH2Cl2(6 x 300 mL, 수성층에 생성물이 없을 때까지 추출)로 추출하였다. 합한 유기층을 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축시켜 미정제 WLS -13d(12.82 g)를 오일로서 수득하였다. 미정제 화합물을 다음 반응에 직접 사용하였다. TLC 이동상 세부 사항: DCM 중 10% MeOH MS: C12H20F3N3O2 ([M-H]+)에 대한 m/z 계산치, 294.31; 실측치 294.17.
4-(6-(2,2,2- 트리플루오로아세트아미도 ) 헥사노일 )피페라진-1- 카보닐 클로라이드(WLS-13e).
무수 THF(610 mL) 중 WLS-13d(12.2 g, 0.041 mol) 및 디이소프로필에틸아민(29.0 mL, 0.166 mol)의 용액에 THF(190 mL) 중 트리프소겐(6.13 g, 0.021) 용액을 아르곤 분위기 하에 0℃에서 30분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 동일한 온도에서 추가로 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 만들고 추가로 3시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC 모니터링), 반응물을 여과하고 고체를 THF로 세척하였다. 여과액을 증발 건조시켰다. 미정제 생성물을 CH2Cl2(300 mL)에 용해시키고 물(2 x 300 mL)로 세척하였다. 합한 유기층을 황산나트륨 상에서 건조하고 여과하고 감압하에 농축시켰다. 미정제 화합물을 헥산:에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔(100~200 메쉬) 크로마토그래피로 정제하여 WLS-13e(2단계에서, 6.5 g, 33%)를 연황색 고체로서 수득하였다. TLC 이동상 세부 사항: DCM 중 10% MeOH 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ in ppm = 7.27 (s, 1H, NH), 3.71 (m, 6H, 3 x CH2), 3.58 (d, J = 15.9 Hz, 2H, CH2), 3.49 (m, H, CH), 3.39 (m, 2H, CH2), 2.37 (t, 2H, J = 7.1 Hz, CH2), 1.65 (m, 4H, 2 x CH2), 1.39 (m, 2H, CH2). MS: C13H19ClF3N3O3 ([M-H]+)에 대한 m/z 계산치, 356.76; 실측치 355.98.
4-(6-(2,2,2- 트리플루오로아세트아미도 ) 헥사노일 )피페라진-1- 카보닐 아지드(WLS-13)
물(8.2 mL) 중 아지드화나트륨(1.31 g, 0.020 mol) 용액에 아세톤(22.2 mL) 중 WLS-13e(6 g, 0.017 mol) 용액을 아르곤 분위기 하에 0℃에서 20분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 만들고 3시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC 모니터링), 아세톤을 감압하에 제거하였다. 이어서 물(100 mL)을 첨가하고 EtOAc(80 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고 용매를 감압하에 제거하였다. 미정제 화합물을 EtOAc:헥산을 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 WLS -13(2.01 g, 33%)을 연갈색 오일로서 수득하였다. TLC 이동상 세부 사항: DCM 중 5% MeOH 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ in ppm = 7.00 (s, 1H, NH), 3.60 (m, 4H, 3 x CH2), 3.47 (t, J = 7.2 Hz, 4H, 2 x CH2), 3.41 (m, 2H, CH2), 2.36 (t, J = 6.2 Hz, 2H, CH2), 1.65 (m, 4H, 2 x CH2), 1.39 (m, 2H, CH2). MS: C13H19F3N6O3 ([M-H]+)에 대한 m/z 계산치, 363.33; 실측치 355.98.
2- 아지도 -1-부틸-3- 메틸 -4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로 - 포스페이트 (V)(WLS-43)
Figure pct00558
화합물 WLS -43b의 제조
깨끗하고 건조한 3구 3리터 둥근 바닥 플라스크에 에탄-1,2-디아민(1000 mL, 14.975 mol, 25.65 당량)을 자석 교반 막대와 함께 넣고 화합물 WLS -43a(80 g, 0.584 mol, 1.0 당량)를 추가 깔때기를 사용하여 0℃에서 적가하였다. 첨가를 마친 후, 반응 혼합물을 25℃까지 가온하고 추가 1시간 동안 손대지 않은 상태로 두었다. 이어서 헥산 600 mL를 반응 혼합물에 첨가하고 25℃에서 16시간 동안 격렬하게 교반하였다. TLC는, 반응이 완료되었고, 출발 물질이 소모되었으며, 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다(TLC - 10% MeOH:EtOAc; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산).　헥산 층을 분별 깔대기를 사용하여 분리하고 황산나트륨으로 건조하고 감압하에 증발 건조하여 화합물 WLS -43b(44.0 g)를 미정제 무색 오일로서 수득하였다.　미정제 화합물을 추가 정제 없이 다음 단계에 직접 사용하였다.　MS: C6H16N2 ([M+H]+)에 대한 m/z 계산치, 117.21; 실측치 117.15.
화합물 WLS -43c의 제조
WLS -43b(44.0 g, 0.379 mol, 1.0 당량)를 아르곤 분위기 하에서 깨끗하고 건조한 1 L 2구 RBF에 넣었다. 이어서 440 mL의 THF를 RBF에 추가하였다. 빙욕(0℃)에서 RB를 냉각시켰다. 1,1'-카보닐디이미다졸(63.24 g, 0.390 mol, 1.03 당량)을 10분에 걸쳐 반응 혼합물에 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 15℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 완료되었고 출발 물질이 소모되었으며 생성물이 형성된 것으로 나타났다(TLC - 10% MeOH:EtOAc; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산). 반응이 종료된 후 용매를 건조하고 실리카겔 컬럼크로마토그래피(100~200 메쉬)로 정제하였다. 생성물을 80% 에틸 아세테이트:헥산 내지 EtOAc로 용리하였다. 분획 함유 생성물을 증발시켜 WLS-43c(35.02 g, 65% 수율)을 무색 오일로서 수득하였다.
1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 4.77 (s, 1H), 3.45-3.48 (m, 4H), 3.18 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 1.52-1.46 (m, 2H), 1.34 (td, 2H, J = 15.0 Hz, 7.3 Hz), 0.93 (t, 3H, J = 7.6 Hz).
MS: C7H14N2O ([M+H]+)에 대한 m/z 계산치, 143.20; 실측치 143.46.
화합물 WLS -43d의 제조
WLS -43c(30.0 g, 0.211 mol, 1.0 당량)를 아르곤 분위기 하에서 깨끗하고 건조한 2L 3구 RBF에 넣었다. 이어서 출발 물질이 포함된 RBF에 건조 DMF 450 mL를 첨가하였다. 빙욕 (0℃)에서 반응 혼합물을 냉각시켰다. 이어서 반응 혼합물에 60% NaH(10.14 g, 0.253 mol)를 0℃에서 20분에 걸쳐 조금씩 첨가하고 동일한 온도에서 40분간 교반하였다. 이어서 메틸 요오다이드(39.4 mL, 0.633 mol)를 0℃에서 15분 동안 반응 혼합물에 적가하였다. 이어서 반응 혼합물을 실온으로 만들고 2시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 완료되었고 출발 물질이 소모되었으며 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다(TLC - EtOAc; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산). 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 빙욕에서 0℃까지 냉각하고 얼음물(1 L)로 ??칭하였다. 이어서 에틸 아세테이트(2 x 800 mL)로 추출하였다. 유기층을 얼음물(2 x 1000 mL)로 세척하고 황산나트륨으로 건조하고 여과하고 농축 건조시켰다. 미정제 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(100~200 메쉬)로 정제하였다. 생성물을 10%~40% 에틸 아세테이트:헥산으로 용리하였다. 분획 함유 생성물을 증발시켜 WLS -43d(18.0 g, 55% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 3.28 (s, 4H), 3.18 (t, 2H, J = 7.3 Hz), 2.78 (s, 3H), 1.51-1.44 (m, 2H), 1.38-1.30 (m, 2H), 0.93 (t, 3H, J = 7.3 Hz). MS: C8H16N2O ([M+H]+)에 대한 m/z 계산치, 157.23; 실측치 157.48.
화합물 WLS -43e의 제조
WLS -43d(30.0 g, 0.192 mol, 1.0 당량)를 아르곤 분위기 하에서 깨끗하고 건조한 1 L 단목 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 이어서 아르곤 분위기 하에서, 출발 물질이 포함된 RBF에 건조 톨루엔 300 mL를 첨가하였다. 이어서 추가 깔대기를 사용하여 실온에서 30분에 걸쳐 옥살릴 클로라이드(247.0 mL, 2.880 mol)를 적가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 72시간 동안 65℃까지 가열하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 5% MeOH:DCM; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산) 용매를 증발 건조시켜 미정제 화합물을 수득하였다. 미정제 화합물을 톨루엔(200 mL)과 함께 동시 증발시키고 차가운 에틸 아세테이트:헥산(70:30, 2 x 1000 mL), 디에틸 에테르:헥산(20:80, 1000 mL)으로 세척하고 건조시켜 미정제 WLS -43e(34.0 g)를 갈색 반고체로서 수득하였다. 미정제 화합물을 추가 정제 없이 다음 단계에 직접 사용하였다.
MS: C8H16Cl2N2 ([M-Cl]+)에 대한 m/z 계산치, 175.68; 실측치 176.89.
화합물 WLS-43f의 제조
WLS -43e(29.0 g, 0.137 mol, 1.0 당량)를 깨끗하고 건조한 1 L 단목 둥근 바닥 플라스크에 넣고 아르곤 분위기 하에서 290 mL DCM에 용해시켰다. 이어서 KPF6 수용액(25.28 g, 0.137 mol, 물 188 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 5% MeOH:DCM), 반응 혼합물을 얼음물에 붓고 DCM(2 x 400 mL)으로 추출하였다. 합한 유기층을 물(400 mL)로 세척하고 황산나트륨으로 건조하고 여과하고 증발 건조시켰다. 이어서, 잔류물을 DCM에 용해시키고, 교반 하에 디에틸 에테르를 적가하여 생성물을 침전시켰다. 용매를 따라내고 고체를 고진공하에 건조하였다. 상기 침전 과정을 2회 더 반복하여 WLS -43f(35.0 g, 80% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 4.14-4.04 (m, 4H), 3.53 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 3.23 (s, 3H), 1.67-1.61 (m, 2H), 1.41-1.35 (m, 2H), 0.96 (t, 3H, J = 7.2 Hz). 19 F NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ in ppm = -73.18 및 -74.70
화합물 WLS-43의 제조
WLS -43f(39.5 g, 0.123 mol, 1.0 당량)를 깨끗하고 건조한 1 L 단목 둥근 바닥 플라스크에 넣고 아르곤 분위기 하에서 200 mL 건조 MeCN에 용해시켰다. 이어서, 아지드화나트륨(12.01 g, 0.185 mol, 1.5 당량)을 RM에 조금씩 첨가하고 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 5% MeOH:DCM; TLC 탄화 - 닌히드린), 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 MeCN(20 mL)으로 세척하였다. 유기층을 증발 건조시켰다. 미정제 화합물을 최소량의 MeCN에 용해시키고 -78에서 디에틸에테르(500 mL)를 적가하여 침전시켰다. 상기 침전 과정을 2회 더 반복하여 WLS -43(38.0 g, 94% 수율)을 연황색 고체로서 수득하였다. 1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 3.98-3.94 (m, 2H), 3.89-3.85 (m, 2H), 3.40 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 3.20 (s, 3H), 1.64-1.59 (m, 2H), 1.35 (td, 2H, J = 15.0 Hz, J = 7.3 Hz), 0.95 (t, 3H, J = 7.6 Hz). 19 F NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = -73.49 및 -75.01. MS: C8H16F6N5P ([M-PF6]+)에 대한 m/z 계산치, 182.25; 실측치 182.17. IR (KBr 펠릿): N3 (2174 cm-1)
2- 아지도 -1,3- 디부틸 -4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트 (V)(WLS-44)
Figure pct00559
화합물 WLS -44b의 제조
깨끗하고 건조한 2구 500 mL 둥근 바닥 플라스크에 WLS-44a(20.0 g, 0.232 mol, 1.0 당량)를 자석 교반 막대와 함께 넣고 DMF(200 mL)를 첨가하여 용해시켰다. 이어서 빙욕를 사용하여 RBF를 0℃까지 냉각시켰다. 이어서, 0℃에서 40분에 걸쳐 수소화나트륨(18.58 g, 0.465 mol, 2.0 당량)을 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 이어서 브로모 부탄(100 mL, 0.927 mol, 4.0 당량)을 추가 깔때기를 사용하여 0℃에서 20분 동안 적가하고 2시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 완료되었고 출발 물질이 소모되었으며 생성물이 형성된 것으로 나타났다(TLC - 30% EtOAc; 헥산, TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산).　반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 얼음에 붓고 에틸 아세테이트(100 mL x 2)로 추출하고 유기층을 얼음물(1000 mL x 2)로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고 증발 건조하여 미정제 화합물을 수득하였다. 미정제 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(100~200 메쉬)로 정제하였다. 생성물을 15%~30% 에틸 아세테이트:헥산으로 용리하였다. 분획 함유 생성물을 증발시켜 WLS -44b(40.0 g, 87% 수율)을 황색 액체로서 수득하였다.
1 H NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 3.27 (s, 4H), 3.17 (t, 4H, J = 7.4 Hz), 1.44-1.51 (m, 4H), 1.33 (dt, 4H, J = 22.5 Hz, 7.2 Hz) 0.93 (t, 6H, J = 7.4 Hz).
화합물 WLS -44c의 제조
WLS -44b(40.0 g, 0.202 mol, 1.0 당량)를 아르곤 분위기 하에서 깨끗하고 건조한 1 L 2구 RBF에 넣었다. 이어서 아르곤 분위기 하에서, SM이 포함된 RBF에 건조 톨루엔 400 mL를 첨가하였다. 이어서 추가 깔때기를 사용하여 30분에 걸쳐 옥살릴 클로라이드(309.0 mL, 3.603 mol, 17.86 당량)를 적가하였다. 이어서 반응 혼합물을 65℃까지 72시간 동안 가열하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 5% MeOH:DCM; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산) 용매를 회전식 증발기 상에서 증발시켜 미정제 화합물을 수득하였다. 미정제 화합물을 디에틸 에테르(2 x 500 mL), 차가운 에틸 아세테이트(2 x 400 mL), 및 30% 에틸 아세테이트:헥산(1000 mL)으로 세척하였다. 세척 후 용매를 따라내고 고진공에서 건조하여 미정제 WLS -44c(50.0 g)를 갈색 점착성 액체로서 수득하였다. 1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 4.32 (s, 4H), 3.65 (t, 4H, J = 7.4 Hz), 1.65-1.72 (m, 4H), 1.38 (dt, 4H, J = 22.5 Hz, 7.4 Hz), 0.97 (t, 6H, J = 7.4 Hz). MS: C11H22Cl2N2 ([M-Cl]+)에 대한 m/z 계산치, 217.76; 실측치 217.07.
화합물 WLS -44d의 제조
WLS -44c(50.0 g, 0.197 mol, 1.0)를 아르곤 분위기 하에서 깨끗하고 건조한 1 L 단목 RBF에 넣었다. 아르곤 분위기 하에서, SM이 포함된 RBF에 DCM 400 mL를 첨가하였다. 이어서 KPF6 수용액(36.35 g, 0.197 mol, 1.0 당량, 물 200 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 10% MeOH:DCM; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산), 반응 혼합물을 얼음물(400 mL)에 붓고 DCM(2 x 500 mL)으로 추출하였다. 합한 유기층을 물(400 mL)로 세척하고 황산나트륨으로 건조하고 여과하고 증발 건조시켰다. 이어서, 잔류물을 DCM(15 mL)에 용해시키고 교반 하에 디에틸 에테르(600 mL)를 적가하여 생성물을 침전시켰다. 용매를 따라내고 고체를 고진공하에 건조하였다. 상기 침전 과정을 1회 더 반복하여 WLS-44d(54.0 g, 75% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다. 1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 4.10 (s, 4H), 3.54 (t, 4H, J = 7.6 Hz), 1.62-1.68 (m, 4H), 1.36 (td, 4H, J = 15.0 Hz, 7.3 Hz), 0.96 (t, 6H, J = 7.2 Hz).
화합물 WLS-44의 제조
WLS -44d(50.0 g, 0.138 mol, 1.0 당량)를 아르곤 분위기 하에서 깨끗하고 건조한 1 L 단목 RBF에 넣었다. 아르곤 분위기 하에서, SM이 포함된 RBF에 건조 MeCN 250 mL를 첨가하였다. 이어서, 아지드화나트륨(13.44 g, 0.207 mol, 1.5 당량)을 10분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 5% MeOH:DCM; TLC 탄화 - 닌히드린), 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 MeCN(50 mL)으로 세척하였다. 유기층을 증발 건조시켰다. 미정제 화합물을 드라이아이스 및 메탄올 욕을 사용하여 -20℃까지 냉각한 후, 헥산을 첨가하고, 얼마 후 화합물이 고체를 형성한 후 헥산을 따라내고 고체를 고진공에서 건조시켜 WLS-44(39.0 g, 77% 수율)를 연황색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 3.91 (s, 4H), 3.43 (t, 4H, J = 7.7 Hz), 1.60-1.67 (m, 4H), 1.36 (dt, 4H, J = 22.4 Hz, 7.4 Hz), 0.95 (t, 6H, J = 7.4 Hz). 19 F NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = -73.10 및 -74.99. MS: C11H22F6N5P ([M-PF6]+)에 대한 m/z 계산치, 224.33; 실측치 224.20. IR (KBr 펠릿): N3 (2173 cm-1)
2- 아지도 -1- 헥실 -3- 메틸 -4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포 스페이트(V)(WLS-45)의 합성
Figure pct00560
화합물 WLS -45b의 제조
깨끗하고 건조한 3구 3리터 둥근 바닥 플라스크에 에탄-1,2-디아민(1133 mL, 16.972 mol, 28.0 당량)을 자석 교반 막대와 함께 넣고 화합물 WLS -45a(100 g, 0.606 mol, 1.0 당량)를 추가 깔때기를 사용하여 0℃에서 적가하였다. 첨가를 마친 후, 반응 혼합물을 25℃까지 가온하고 추가 1시간 동안 손대지 않은 상태로 두었다. 이어서 헥산 600 mL를 반응 혼합물에 첨가하고 25℃에서 16시간 동안 격렬하게 교반하였다. TLC는, 반응이 완료되었고, 출발 물질이 소모되었으며, 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다(TLC - 10% MeOH:EtOAc; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산).　헥산 층을 분별 깔대기를 사용하여 분리하고 황산나트륨으로 건조하고 감압하에 증발 건조하여 화합물 WLS -45b(60.0 g)를 미정제 무색 오일로서 수득하였다.　미정제 화합물을 추가 정제 없이 다음 단계에 직접 사용하였다.　 1 H NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 2.82-2.79 (m, 2H), 2.66 (t, 2H, J = 5.9 Hz), 2.60 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 1.52-1.45 (m, 2H), 1.36-1.27 (m, 9H), 0.89 (t, 3H, J = 6.9 Hz).
MS: C8H20N2 ([M+H]+)에 대한 m/z 계산치, 145.26; 실측치 145.00.
화합물 WLS -45c의 제조
WLS -45b(60.0 g, 0.416 mol, 1.0 당량)를 아르곤 분위기 하에서 깨끗하고 건조한 1 L 단목 RBF에 넣었다. 이어서 600 mL의 THF를 RBF에 추가하였다. 빙욕(0℃)에서 RB를 냉각시켰다. RM에 1,1'-카보닐디이미다졸(69.46 g, 0.428 mol, 1.03 당량)을 10분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 15℃에서 16시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 완료되었고 출발 물질이 소모되었으며 생성물이 형성된 것으로 나타났다(TLC - 10% MeOH:EtOAc; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산). 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 THF(100 mL)로 세척하였다. 여과액을 건조하고 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(100~200 메쉬)로 정제하였다. 생성물을 80% 에틸 아세테이트:헥산 내지 EtOAc로 용리하였다. 분획 함유 생성물을 증발시켜 WLS-45c(58.0 g, 82% 수율)을 무색 오일로서 수득하였다. 1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 4.84 (s, 1H), 3.41 (s, 4H), 3.17 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 1.49 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 1.30 (d, 6H, J = 15.0 Hz, 2.1 Hz), 0.88 (t, 3H, J = 7.6 Hz). MS: C9H18N2O ([M+H]+)에 대한 m/z 계산치, 171.26; 실측치 171.10.
화합물 WLS -45d의 제조
WLS -45c(48.0 g, 0.282 mol, 1.0 당량)를 아르곤 분위기 하에서 깨끗하고 건조한 2L 3구 RBF에 넣었다. 이어서 SM이 포함된 RBF에 건조 DMF 800 mL를 첨가하였다. 빙욕 (0℃)에서 RB를 냉각시켰다. 이어서 RM에 60% NaH(8.13 g, 0.338 mol, 1.2 당량)를 0℃에서 20분에 걸쳐 조금씩 첨가하고 동일한 온도에서 45분간 교반하였다. 이어서 메틸 요오다이드(53 mL, 0.851 mol, 3.02 당량)를 0℃에서 30분 동안 반응 혼합물에 적가하였다. 이어서 RM을 실온으로 만들고 3시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 완료되었고 출발 물질이 소모되었으며 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다(TLC - EtOAc; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산). 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 빙욕에서 0℃까지 냉각하고 얼음물(200 mL)로 ??칭하였다. 이어서 에틸 아세테이트(3 x 300 mL)로 추출하였다. 유기층을 얼음물(2 x 500 mL)로 세척하고 황산나트륨으로 건조하고 여과하고 농축 건조시켰다. 미정제 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(100~200 메쉬)로 정제하였다. 생성물을 40%~50% 에틸 아세테이트:헥산으로 용리하였다. 분획 함유 생성물을 증발시켜 WLS -45d(36.4 g, 70% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 3.27 (s, 4H), 3.17 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 2.78 (s, 3H), 1.50-1.45 (m, 2H), 1.29 (s, 7H), 0.88 (t, 3H, J = 6.9 Hz).
화합물 WLS -45e의 제조
WLS -45d(43.0 g, 0.233 mol, 1.0 당량)를 아르곤 분위기 하에서 깨끗하고 건조한 2L 3구 RBF에 넣었다. 이어서 아르곤 분위기 하에서, SM이 포함된 RBF에 건조 톨루엔 430 mL를 첨가하였다. 이어서 추가 깔대기를 사용하여 실온에서 30분에 걸쳐 옥살릴 클로라이드(300 mL, 3.498 mol, 15 당량)를 적가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 72시간 동안 65℃까지 가열하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 5% MeOH:DCM; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산) 용매를 증발 건조시켜 미정제 화합물을 수득하였다. 미정제 화합물을 DCM-헥산(3회)을 사용하여 침전시키고 고체를 고진공하에 건조하여 미정제 WLS -45e(48.0 g)를 오일로서 수득하였다. 미정제 화합물을 추가 정제 없이 다음 단계에 직접 사용하였다. MS: C10H20Cl2N2 ([M-Cl]+)에 대한 m/z 계산치, 203.73; 실측치 203.43.
화합물 WLS-45f의 제조
WLS -45e(48.0 g, 0.201 mol, 1.0 당량)를 깨끗하고 건조한 21 L 단목 RBF에 넣고 아르곤 분위기 하에서 480 mL DCM에 용해시켰다. 이어서 KPF6 수용액(36.95 g, 0.201 mol, 1.0 당량, 물 240 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 5% MeOH:DCM), 반응 혼합물을 얼음물에 붓고 DCM(2 x 400 mL)으로 추출하였다. 합한 유기층을 물(400 mL)로 세척하고 황산나트륨으로 건조하고 여과하고 증발 건조시켰다. 이어서, 잔류물을 DCM에 용해시키고, 교반 하에 헥산을 적가하여 생성물을 침전시켰다. 용매를 따라내고 고체를 고진공하에 건조하였다. 상기 침전 과정을 2회 더 반복하여 WLS -45f(58.35 g, 83% 수율)을 황색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 4.14-4.03 (m, 4H), 3.51 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 3.22 (s, 3H), 1.64 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 1.31 (d, 6H, J = 4.8 Hz), 0.89 (t, 3H, J = 6.9 Hz). 19 F NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = -73.16 및 -74.68. MS: C10H20ClF6N2P ([M-Cl]+)에 대한 m/z 계산치, 203.73; 실측치 203.96.
화합물 WLS -45의 제조
WLS -45f(58.35 g, 0.167 mol, 1.0 당량)를 깨끗하고 건조한 1 L 단목 RBF에 넣고 아르곤 분위기 하에서 292 mL 건조 MeCN에 용해시켰다. 이어서, 아지드화나트륨(16.31 g, 0.251 mol, 1.5 당량)을 RM에 조금씩 첨가하고 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 5% MeOH:DCM; TLC 탄화 - 닌히드린), 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 MeCN(200 mL)으로 세척하였다. 유기층을 증발 건조시켰다. 미정제 화합물을 최소량의 MeCN에 용해시키고 디에틸에테르로 첨가하여 점착성 액체를 형성하고 용매를 따라내고 화합물을 건조시켰다. 이러한 과정을 2회 반복하였다. 이어서 헥산을 점착성 액체에 첨가하고 -30℃에서 교반하여 고체를 수득하였다. 용매를 따라내고 고체를 건조하여 WLS - 45(55.0 g, 93% 수율)을 연황색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 3.97-3.92 (m, 2H), 3.88-3.83 (m, 2H), 3.37 (t, 2H, J = 7.7 Hz), 3.19 (s, 3H), 1.63-1.57 (m, 2H), 1.31 (s, 6H), 0.89 (t, 3H, J = 6.7 Hz). 19 F NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = -73.45 및 -74.97. MS: C10H20F6N5P ([M-PF6]+)에 대한 m/z 계산치, 210.30; 실측치 210.19.
IR (KBr 펠릿): N3 (2173 cm-1)
2- 아지도 -1,3- 디헥실 -4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페 이트(V)(WLS-46)의 합성
Figure pct00561
화합물 WLS -46b의 제조
깨끗하고 건조한 2구 3리터 둥근 바닥 플라스크에 에탄-1,2-디아민(1133 mL, 16.972 mol, 28.0 당량)을 자석 교반 막대와 함께 넣고 화합물 WLS -46a(100 g, 0.606 mol, 1.0 당량)를 추가 깔때기를 사용하여 0℃에서 적가하였다. 첨가를 마친 후, 반응 혼합물을 25℃까지 가온하고 추가 1시간 동안 손대지 않은 상태로 두었다. 이어서 헥산 600 mL를 반응 혼합물에 첨가하고 25℃에서 16시간 동안 격렬하게 교반하였다. TLC는, 반응이 완료되었고, 출발 물질이 소모되었으며, 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다(TLC - 10% MeOH:EtOAc; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산).　헥산층은 분별 깔대기를 사용하여 분리하였다. 다시 300 mL의 헥산을 아민 층에 첨가하고 4시간 동안 교반하였다. 이어서 헥산 층을 분리하고 이전 헥산 층과 합한 후 황산나트륨으로 건조하고 감압하에 증발 건조하여 화합물 WLS -46b(60 g)를 미정제 무색 액체로 수득하였다.
MS: C8H20N2 ([M+H]+)에 대한 m/z 계산치, 145.26; 실측치 145.00.
화합물 WLS -46c의 제조
WLS -46b(40.0 g, 0.277 mol, 1.0 당량)를 깨끗하고 건조한 1 L 단목 RBF에 넣고 THF 400 mL를 첨가하여 용해시켰다. 빙욕 (0 ℃)에서 RB를 냉각시켰다. RM에 1,1'-카보닐디이미다졸(45.13 g, 0.278 mol, 1.0 당량)을 15분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 15℃에서 16시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 완료되었고 출발 물질이 소모되었으며 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다(TLC - 10% MeOH:EtOAc; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산). 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 에틸 아세테이트(150 mL)로 세척하였다. 합한 여과액을 증발 건조하고 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(100~200 메쉬)를 사용하여 정제하였다. 생성물을 30% 에틸 아세테이트:헥산 내지 에틸 아세테이트로 용리하였다. 분획 함유 생성물을 증발시켜 WLS -46c(29.0 g, 61% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 4.84 (s, 1H), 3.41 (s, 4H), 3.17 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 1.49 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 1.30 (d, 6H, J = 2.1 Hz), 0.87-0.90 (m, 3H). MS: C9H18N2O ([M+H]+)에 대한 m/z 계산치, 171.26; 실측치 171.10.
화합물 WLS -46d의 제조
WLS -46c(29.0 g, 0.170 mol, 1.0 당량)를 깨끗하고 건조한 1 L 2구 RBF에 넣고 아르곤 분위기 하에서 464 mL DMF에 용해시켰다. 빙욕 (0℃)에서 RB를 냉각시켰다. 이어서 RM에 NaH(8.18 g, 0.204 mol, 1.2 당량)를 0℃에서 20분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 이어서 브로모 헥산(71.56 mL, 0.512 mol, 3.0 당량)를 0℃에서 30분 동안 반응 혼합물에 적가하였다. 이어서 RM을 실온으로 만들고 3시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 완료되었고 출발 물질이 소모되었으며 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다(TLC - 50% EtOAc:헥산; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산). 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 빙욕에서 0℃까지 냉각하고 얼음물로 ??칭하였다. 이어서 에틸 아세테이트(2 x 700 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 얼음물(2 x 1000 mL)로 세척하고 황산나트륨으로 건조하고 여과하고 농축 건조시켰다. 미정제 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(100~200 메쉬)로 정제하였다. 생성물을 10%~15% 에틸 아세테이트:헥산으로 용리하였다. 분획 함유 생성물을 증발시켜 WLS -46d(29.0 g, 67% 수율)을 황색 액체로서 수득하였다.
1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 3.27 (s, 4H), 3.16 (t, 4H, J = 7.6 Hz), 1.48 (q, 4H, J = 7.1 Hz), 1.29 (s, 12H), 0.88 (t, 6H, J = 6.9 Hz). MS: C15H30N2O ([M+H]+)에 대한 m/z 계산치, 255.42; 실측치 255.27.
화합물 WLS -46e의 제조
WLS -46d(29.0 g, 0.114 mol, 1.0 당량)를 깨끗하고 건조한 1 L 단목 RBF에 넣고 아르곤 분위기 하에서 240 mL 건조 톨루엔에 용해시켰다. 이어서 추가 깔때기를 사용하여 30분에 걸쳐 반응 혼합물에 옥살릴 클로라이드(146.5 mL, 1.708 mol, 15.0 당량)를 적가하였다. 이어서 반응 혼합물을 70℃까지 64시간 동안 가열하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 5% MeOH:DCM; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산) 용매를 증발 건조하여 미정제 화합물을 수득하였다. 미정제 화합물을 최소량의 에틸 아세테이트에 용해시키고 헥산을 적가하여 침전시켰다. 용매를 따라내고 고체를 건조시켰다. 상기 침전 과정을 1회 더 반복하여 WLS -46e(34.0 g, 96% 수율)을 갈색 반고체로서 수득하였다.
1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 4.33 (s, 4H), 3.65 (s, 4H), 1.69 (s, 4H), 1.30 (d, 12H, J = 28.2 Hz), 0.90 (t, 6H, J = 6.2 Hz).
화합물 WLS-46f의 제조
WLS -46e(34.0 g, 0.110 mol, 1.0 당량)를 깨끗하고 건조한 1 L 단목 RBF에 넣고 아르곤 분위기 하에서 196 mL DCM에 용해시켰다. 이어서 KPF6 수용액(20.20 g, 0.110 mol, 1.0 당량, 물 110 mL 중)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 10% MeOH:DCM; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산), 반응 혼합물을 얼음물에 붓고 DCM(2 x 400 mL)으로 추출하였다. 합한 유기층을 물(400 mL)로 세척하고 황산나트륨으로 건조하고 여과하고 증발 건조시켰다. 이어서, 잔류물을 DCM(50 mL)에 용해시키고 교반 하에 디에틸 에테르(500 mL)를 적가하여 생성물을 침전시켰다. 용매를 따라내고 고체를 고진공하에 건조하였다. 상기 침전 과정을 1회 더 반복하여 WLS -46f(37.0 g, 80% 수율)을 연갈색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 4.10 (s, 4H), 3.54 (t, 4H, J = 7.6 Hz), 1.65 (q, 4H, J = 7.3 Hz), 1.32 (d, 12H, J = 2.1 Hz), 0.88-0.91 (m, 6H). 19 F NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = -72.87 및 -74.76 MS: C15H30ClF6N2P ([M-PF6]+)에 대한 m/z 계산치, 273.86; 실측치 273.25.
화합물 WLS -46의 제조.
WLS -46f(37.0 g, 0.088 mol, 1.0 당량)를 깨끗하고 건조한 1 L 단목 RBF에 넣고 아르곤 분위기 하에서 185 mL 건조 MeCN에 용해시켰다. 이어서, 아지드화나트륨(8.61 g, 0.132 mol, 1.5 당량)을 RM에 첨가하고 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 5% MeOH:DCM; TLC 탄화 - 닌히드린), 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 MeCN(50 mL)으로 세척하였다. 유기층을 증발 건조시켰다. 미정제 화합물을 DCM(15 mL)에 용해시키고 헥산(500 mL)을 적가하여 침전시켰다. 용매를 따라내고 고체를 고진공하에 건조하여 WLS -46(27.0 g, 72% 수율)을 연황색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 3.92 (s, 4H), 3.45 (t, 4H, J = 7.7 Hz), 1.64 (q, 4H, J = 7.4 Hz), 1.31 (s, 12H), 0.88-0.91 (m, 6H). 19 F NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = -73.13 및 -75.02
MS: C15H30F6N5P ([M-PF6]+)에 대한 m/z 계산치, 280.44; 실측치 280.26. IR (KBr 펠릿): N3 (2167 cm-1)
2-아지도-1,3-디에틸-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트(V)(WLS-56)의 합성
Figure pct00562
1,3- 디에틸이미다졸리딘 -2-온( WLS -56B).
DMF(300 mL) 중 이미다졸리딘-2-온(WLS -56A)(20 g, 0.2325 mol, 1.0 당량)의 교반 용액에 수소화나트륨(오일 중 60% 분산액)(28 g, 0.696 mol, 3.0 당량)을 0℃에서 1시간에 걸쳐 조금씩 첨가하고, 추가로 1시간 더 교반하였다. 이어서 에틸 요오다이드(73.9 mL, 0.9808 mol, 4.0 당량)를 0℃에서 50분에 걸쳐 적가하였다. 이어서 반응 혼합물을 실온으로 만들고 5시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 상기 반응물을 얼음물(300 mL)로 희석하고 에틸 아세테이트(2 x 500 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 차가운 염수 용액(3 x 100 mL)으로 세척하고, Na2SO4로 건조하고 감압하에 농축하였다. 미정제물을 30% EA/헥산에서 용리되는 실리카 겔(230~400 메쉬) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 연황색 오일(21 g, 63%)을 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ in ppm = 3.28 (s, 4H), 3.24 (q, 4H, J = 7.3 Hz), 1.10 (t, 6H, J = 7.2 Hz). MS (ESI) 143.15 (M+1)+.
2- 클로로 -1,3- 디에틸 -4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 클로라이드( WLS -56C).
톨루엔(360 mL) 중 1,3-디에틸이미다졸리딘-2-온(WLS-56B)(36 g, 0.2531 mol)의 용액에 옥살릴 클로라이드(325 mL, 3.796 mol, 15 당량)를 아르곤 하에 0℃에서 1시간에 걸쳐 적가하였다. 이어서 혼합물을 70℃에서 70시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 반응물을 감압하에 농축하여 디에틸 에테르(2 x 200 mL)로 처리된 미정제물을 수득하였다. 고체를 침전시키고, 여과하고, 디에틸 에테르(3 x 30 mL)로 세척하고 진공하에 건조하여 미정제물(40 g)을 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
1H NMR ( 500 MHz , CDCl3 ): δ in ppm = 4.36 (s, 4H), 3.73 (q, 4H, J = 7.3 Hz), 1.35 (t, 6H, J = 7.2 Hz). MS (ESI) 161.14 (M-Cl)+.
2- 클로로 -1,3- 디에틸 -4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트 (V)(WLS-56D).
DCM(400 mL) 중 2-클로로-1,3-디에틸-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-3-윰 클로라이드(WLS-56C)(40 g, 0.2040 mol, 1.0 당량)의 교반 용액에 실온에서 50분에 걸쳐 물(200 mL) 중 KPF6(37.54 g, 0.2040 mol, 1.0 당량)의 용액을 적가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 이어서 혼합물을 셀라이트 베드를 통해 여과하고 DCM(3 x 80 mL)으로 세척하였다. 유기층을 물(3 x 100 mL)로 세척하고 Na2SO4로 건조하고 여과하고 증발 건조하였다. 점착성 잔류물을 DCM(50 mL)에 재용해하고 디에틸 에테르(150 mL)를 교반하면서 -78℃에서 미리 냉각시키기 위해 적가하였다. 갈색 고체가 침전되었다. 고체를 여과하고 에테르(2 x 50 mL)로 세척하고 진공하에서 건조하여 목적하는 화합물 2-클로로-1,3-디에틸-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트(V)(WLS-56D)(38 g, 60%)를 수득하였다.
1H NMR ( 500 MHz , CDCl3 ): δ in ppm = 4.12 (s, 4H), 3.65 (m, 4H), 1.33 (m, 6H).
MS ( ESI ) 161.14 (M-PF6)+.
2- 아지도 -1,3- 디에틸 -4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트 (V)(WLS-56D).
아세토니트릴(360 mL) 중 2-클로로-1,3-디에틸-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트(V)(WLS-56D)(WLS-56D)(36 g, 0.1176 mol, 1.0 당량)의 사전 냉각 용액에 아지드화나트륨(11.40 g, 0.1765 mol, 1.0 당량)을 N2 분위기 하에서 20분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 이어서 혼합물을 셀라이트 베드를 통해 여과하고 아세토니트릴(2 x 100 mL)로 세척하였다. 여과액을 진공하에 증발시켜 점착성 물질을 수득하였다. 잔류물을 다시 DCM(45 mL)에 용해시키고 -78℃에서 교반하면서 디에틸 에테르(200 mL)에 적가하였다. 고체를 침전시키고, 여과하고, 에테르(2 x 50 mL)로 세척하고, 진공하에 건조하여 목적하는 화합물(30 g, 81%)을 수득하였다.
1H NMR ( 400 MHz , CDCl3 ): δ in ppm = 3.93 (s, 4H), 3.54 (q, 4H, J = 7.3 Hz), 1.31 (t, 6H, J = 7.4 Hz). MS (ESI) 168.23 (M+)+.
19F NMR ( 400 MHz , CDCl3 ): δ in ppm = -73.13 및 -75.03. IR ( KBr 펠릿): N3 (2175.31 cm-1)
2- 아지도 -1,3- 디프로필 -4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스 페이트(V)(WLS-57)의 합성
Figure pct00563
1,3-디프로필이미다졸리딘-2-온(WLS-57B).
DMF(225 mL) 중 이미다졸리딘-2-온(15 g, 0.17 mol, 1.0 당량)의 교반 용액에 수소화나트륨(20.9 g, 0.52 mol)을 0℃에서 40분에 걸쳐 조금씩 첨가하고, 1시간 동안 보관하였다. 이어서 1-브로모프로판(63.5 mL, 0.69 mol, 1.2 당량)을 30분에 걸쳐 적가하고 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 상기 반응물을 얼음물(300 mL)로 희석하고 에틸 아세테이트(3 x 400 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 차가운 염수 용액(3 x 100 mL)으로 세척하고, Na2SO4로 건조하고 진공하에 농축하였다. 미정제물을 30% EA/헥산에서 용리되는 실리카 겔(230~400 메쉬) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 3-디프로필이미다졸리딘-2-온(WLS-57B)을 연황색 오일(21 g, 71%)로서 수득하였다.
1H NMR ( 500 MHz , CDCl3 ): δ in ppm = 3.21 (s, 4H), 3.07 (t, 4H, J = 7.6 Hz), 1.45 (td, 4H, J = 14.8 Hz, 7.6 Hz), 0.83 (t, 6H, J = 7.2 Hz).
MS ( ESI ) 171.25 (M+1)+.
2- 클로로 -1,3- 디프로필 -4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 클로라이드( WLS -57C).
톨루엔(150 mL) 중 1,3-디프로필이미다졸리딘-2-온(WLS-57B)(15 g, 0.088 mol, 1.0 당량)의 냉각 용액에 옥살릴 클로라이드(113 mL, 1.32 mol, 15.0 당량)를 아르곤 분위기 하에서 30분에 걸쳐 적가하였다. 상기 혼합물을 70℃에서 72시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 이어서 반응물을 감압하에 농축시켜 미정제물을 수득하고 이를 n-헥산(3 x 75 mL)에 이어 디에틸 에테르((2 x 100 mL)로 처리하여 갈색을 띤 고체를 수득하였다. 고체를 진공하에 건조하여 미정제물(18 g)을 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
1H NMR ( 500 MHz , CDCl3 ): δ in ppm = 4.32 (s, 4H), 3.61 (t, 4H, J = 7.6 Hz), 1.76 (td, 4H, J = 14.8 Hz, 7.6 Hz), 0.99 (t, 6 H, J = 7.6 Hz). MS ( ESI ) 189.18 (M-Cl)+.
2- 클로로 -1,3- 디프로필 -4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트 (V)(WLS-57C).
DCM(160 mL) 중 2-클로로-1,3-디프로필-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-3-윰 클로라이드(WLS-57C)(16 g, 0.0714 mol, 1.0 당량)의 교반 용액에 실온에서 30분에 걸쳐 물(80 mL) 중 KPH6(13.14 g, 0.0714 mol, 1.0 당량)의 용액을 첨가하였다. 상기 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 이어서 혼합물을 셀라이트 베드를 통해 여과하고 베드를 DCM(2 x 100 mL)으로 세척하였다. 합한 유기층을 물(3 x 100 mL)로 세척하고 Na2SO4로 건조하고 증발 건조하였다. 잔류물을 다시 DCM(30 mL)에 용해시킨 후 교반 하에 디에틸 에테르(200 mL)를 첨가하였다. 고체를 침전시켜 여과하고 에테르(2 x 50 mL)로 세척하고, 진공하에 건조하여 2-클로로-1,3-디프로필-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트(V)(WLS-57C)를 붉은색을 띤 고체(16 g, 67%)로서 수득하였다. 1H NMR ( 500 MHz , CDCl3): δ in ppm = 4.11 (s, 4H), 3.52 (t, 4H, J = 7.6 Hz), 1.71 (td, 4H, J = 15.1 Hz, 7.6 Hz), 0.97 (t, 6H, J = 7.2 Hz). MS (ESI) 189.19 (M-PF6)+.
2- 아지도 -1,3- 디프로필 -4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트 (V)(WLS-57)
아세토니트릴(110 mL) 중 2-클로로-1,3-디프로필-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트(V)(WLS-57D)(11 g, 0.032 mol, 1.0 당량)의 교반된 냉각 용액에 아지드화나트륨(3.2 g, 0.049 mol, 1.0 당량)을 질소 하에서 20분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 상기 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 이어서 혼합물을 셀라이트 베드를 통해 여과하고 아세토니트릴(2 x 100 mL)로 세척하였다. 여과액을 진공하에 증발시켜 미정제물을 수득하였다. 잔류물을 DCM(30 mL)에 용해시킨 후 교반 하에 디에틸 에테르(200 mL)를 첨가하였다. 고체를 꺼내 여과하고 에테르(2 x 50 mL)로 세척하고, 진공하에 건조하여 2-아지도-1,3-디프로필-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트(V)(WLS-57)를 갈색을 띤 고체(10 g, 89%)로서 수득하였다. 1H NMR ( 400 MHz , CDCl3): δ in ppm = 3.93 (s, 4H), 3.42 (t, 4H, J = 7.6 Hz), 1.70 (td, 4H, J = 15 Hz, 7.6 Hz), 0.97 (t, 6H, J = 7.4 Hz). MS ( ESI ) 196.25 (M-PF6)+. 19F NMR (400 MHz, CDCl3): δ in ppm = -73.3 및 -74.8. IR (KBr 펠릿): N3 (2175 cm-1).
2- 아지도 -1,3- 디이소프로필 -4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로 포스페이트(V)(WLS-58)의 합성
Figure pct00564
1,3- 디이소프로필이미다졸리딘 -2-온( WLS -58B)
톨루엔(340 mL) 중 이미다졸리딘-2-온(WLS-58B)(20 g, 0.23 mol, 1.0 당량)의 교반 용액에 수산화칼륨(52 g, 0.92 몰, 4.0 당량), 탄산칼륨(6.41 g, 0.046 mol, 0.2 당량), 및 테트라부틸암모늄 클로라이드(3.22 g, 0.011 mol, 0.05 당량)을 N2 분위기 하에 실온에서 첨가하였다. 이어서 2-브로모 프로판(87.24 mL, 0.92 mol, 4.0 당량)을 천천히 첨가하였다. 상기 혼합물을 90℃에서 20시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 이어서 혼합물을 얼음물(200 mL)로 희석하고 DCM(2 x 400 mL)으로 추출하였다. 합한 유기상을 염수 용액(2 x 100 mL)으로 세척하고, Na2SO4로 건조하고 감압하에 농축하였다. 미정제물을 30% EA/헥산에서 용리되는 실리카 겔(230~400 메쉬) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 1,3-디이소프로필이미다졸리딘-2-온(WLS-58B)을 연황색 시럽(18 g, 45%)으로서 수득하였다.
1H NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 4.09 (m, 2H), 3.17 (s, 4H), 1.06 (d, 12H, J = 6.7 Hz) MS ( ESI ) 171.24 (M+1)+. 2- 클로로 -1,3- 디이소프로필 -4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 클로라이드(WLS-58C).
톨루엔(100 mL) 중 1,3-디이소프로필이미다졸리딘-2-온(WLS -58B)(15 g, 0.0588 mol, 1.0 당량)의 빙냉 용액에 옥살릴 클로라이드(76.2 mL, 0.088 mol, 15.0 당량)를 아르곤 분위기 하에서 30분에 걸쳐 적가하였다. 상기 혼합물을 70℃에서 72시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 이어서, 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 40% EA/헥산(3 x 75 mL)으로 처리한 미정제물을 수득하고 30분 동안 교반하였다. 이어서 고체를 침전시키고, 여과하고 디에틸 에테르(2 x 50 mL)로 세척하였다. 화합물을 진공하에 건조하여 2-클로로-1,3-디이소프로필-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-3-윰 클로라이드(WLS -58C)를 갈색을 띤 고체(13 g, 미정제)로서 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
1H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 4.31 (m, 6H), 1.41 (d, 12H, J = 6.5 Hz). MS (ESI) 189.14 (M-Cl)+
2- 클로로 -1,3- 디이소프로필 -4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트 (V)(WLS-58D).
DCM(200 mL) 중 2-클로로-1,3-디이소프로필-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-3-윰 클로라이드(WLS -58C)(20 g, 0.0888 mol, 1.0 당량)의 교반 용액에 물(100 mL) 중 KPH6(16.3 g, 0.0888 mol, 1.0 당량)의 용액을 30분에 걸쳐 적가하였다. 상기 반응 혼합물을 4시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 이어서 혼합물을 셀라이트 베드를 통해 여과하고 베드를 DCM(2 x 130 mL)으로 세척하였다. 유기층을 물(3 x 100 mL)로 세척하고 Na2SO4로 건조하고 여과하고 증발 건조하였다. 잔류물을 DCM(25 mL)에 용해시킨 후 교반 하에 디에틸 에테르(165 mL)를 첨가하였다. 침전된 고체를 여과하고 에테르(2 x 50 mL)로 세척하고 진공하에서 건조하여 2-클로로-1,3-디이소프로필-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트(V)(WLS-58D)를 연갈색 고체(18 g, 61%)로서 수득하였다.
1H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 4.29 (m, 2H), 4.07 (s, 4H), 1.37 (d, 12H, J = 6.9 Hz), MS (ESI) 189.15 (M-PF6) +.
2- 아지도 -1,3- 디이소프로필 -4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트 (V)(WLS-58)
아세토니트릴(180 mL) 중 2-클로로-1,3-디이소프로필-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트(V)(WLS-58D)(18 g, 0.032 mol, 1.0 당량)의 교반된 냉각 용액에 아지드화나트륨(5.25 g, 0.080 mol, 1.0 당량)을 N2 분위기 하에서 20분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 상기 혼합물을 4시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 이어서 혼합물을 셀라이트 베드를 통해 여과하고 베드를 아세토니트릴(2 x 100 mL)로 세척하였다. 여과액을 진공하에 증발시켜 미정제물을 수득하였다. 잔류물을 DCM(25 mL)에 용해시킨 후 교반 하에 디에틸 에테르(150 mL)를 첨가하였다. 침전된 고체를 여과하고 에테르(2 x 50 mL)로 세척하고 진공하에서 건조하여 2-아지도-1,3-디이소프로필-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트(V)(WLS-58)를 갈색을 띤 고체(17 g, 92%)로서 수득하였다.
1H NMR ( 500 MHz , CDCl3 ): δ in ppm = 4.18 (m, 2H), 3.86 (s, 4H), 1.33 (d, 12H, J = 6.2 Hz) MS ( ESI ) 196.26 (M-PF6)+. 19F NMR ( 500 MHz , CDCl3 ): δ in ppm = -72.86 및 -74.37
IR ( KBr 펠릿): N3 (2165 cm-1)
2- 아지도 -1,3-디((E)-펜트-2-엔-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트(V)(WLS-60)의 합성
Figure pct00565
화합물 WLS - 60a2의 제조
WLS - 60a1(41.60 g, 0.400 mol, 1.0 당량)를 아르곤 분위기 하에서 깨끗하고 건조한 500 mL 2구 RBF에 넣었다. 이어서 SM이 포함된 RBF에 피리딘 41 mL를 첨가하였다. 추가 깔때기를 사용하여 반응 혼합물에 프로피온알데히드(30.23 mL, 0.519 mol, 1.3 당량)를 적가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 70℃에서 4시간 동안 가열 환류시켰다. 반응이 완료된 후(TLC - 10% MeOH:DCM), 반응 혼합물을 실온에서 냉각시켰다. pH 2 미만까지 50% H2SO4를 첨가하였다. 물을 첨가하고 EtOAc(2 x 500 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 증발 건조시켜 WLS-60a2(32.0 g, 80% 수율)을 무색 오일로서 수득하였다.
WLS-60a2를 추가 정제 없이 다음 반응에 직접 사용하였다.
1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm =10.63 (bs, 1H), 7.15 (dt, 1H, J = 15.4 Hz, 6.4 Hz), 5.83 (dt, 1H, J = 15.8 Hz, 1.7 Hz), 2.29-2.24 (m, 2H), 1.09 (t, 3H, J = 7.2 Hz).
화합물 WLS - 60a3의 제조
WLS - 60a2(32.0 g, 0.320 mol, 1.0 당량)를 아르곤 분위기 하에서 깨끗하고 건조한 500 mL 단목 RBF에 넣고 EtOH(73 mL)에 이어 톨루엔(30 mL)을 첨가하였다. 빙욕에서 RB를 냉각하고 H2SO4(2.75 mL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 100℃에서 20시간 동안 가열하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 10% MeOH:DCM), 반응 혼합물을 실온에서 냉각시켰다. 휘발성 물질을 증발시켰다. 잔류물을 DCM(2 x 600 mL)으로 추출하고 포화 NaHCO3(500 mL) 용액에 이어 물(500 ml)로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조하고 진공하에 건조하여 WLS - 60a3(31.0 g, 76% 수율)을 연황색 오일로서 수득하였다.
WLS-60a3을 추가 정제 없이 다음 반응에 직접 사용하였다.
1 H NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 7.08-6.98 (m, 1H), 5.81 (dt, 1H, J = 15.7 Hz, 1.7 Hz), 4.21-4.15 (m, 2H), 2.26-2.15 (m, 2H), 1.28 (t, 3H, J = 7.1Hz), 1.076 (t, 3H, J = 7.4 Hz).
화합물 WLS - 60a4의 제조
수소화알루미늄리튬(12.18 g, 0.321 mol, 1.87 당량)을 아르곤 분위기 하에서 깨끗하고 건조한 2 L 2구 RBF에 넣었다. 이어서 건조 디에틸 에테르 366 mL를 첨가하고 0℃까지 냉각하였다. 이어서 AlCl3(15.15 g, 0.114 mol, 0.66 당량, 에테르 611 mL 중)을 50분에 걸쳐 RBF에 적가하였다. 첨가 완료 후 실온으로 만들고 30분 동안 교반하였다. 다시 0℃까지 냉각하고 20분에 걸쳐 WLS-60a3(22.00 g 0.172 mol, 1.0 당량)을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 만들고 1시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 10% MeOH:DCM, PMA 탄화) 반응 혼합물을 0℃까지 냉각하였다. 이어서 반응 혼합물을 20% NaOH 용액(70 mL)으로 ??칭하고 45분 동안 교반하였다. 잔류물을 에테르(2 x 600 mL)로 추출하고 물(500 ml)로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조하고 진공하에 건조하여 WLS - 60a4(12.0 g, 81% 수율)을 연황색 오일로서 수득하였다.
WLS-60a4를 추가 정제 없이 다음 반응에 직접 사용하였다.
1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 5.77-5.72 (m, 1H), 5.66-5.60 (m, 1H), 4.09 (t, 2H, J = 5.9 Hz), 2.09-2.04 (m, 2H), 1.00 (t, 3H, J = 7.6 Hz).
화합물 WLS - 60a5의 제조
WLS - 60a4(12.00 g, 0.139 mol, 1.0 당량)를 아르곤 분위기 하에서 깨끗하고 건조한 500 mL 2구 RBF의 에테르 240 mL에 넣고, 0℃까지 냉각하고, PBr3(15.9 mL, 0.167 mol, 1.2 당량)을 20분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 실온까지 가온하고 4시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 10% MeOH:DCM) 반응 혼합물을 0℃까지 냉각하였다. 이어서 조심스럽게 얼음물(70 mL)로 ??칭하고 디에틸 에테르(2 x 150 mL)로 추출하고 물(300 ml)로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조하고 진공하에 건조하여 WLS - 60a5(11.0 g, 53% 수율)을 무색 오일로서 수득하였다.
WLS-60a5를 추가 정제 없이 다음 반응에 직접 사용하였다.
1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 5.82 (dt, 1H, J = 15.1 Hz, 6.2 Hz), 5.71-5.65 (m, 1H), 3.96 (d, 2H, J = 7.6 Hz), 2.12-2.06 (m, 2H), 1.01 (m, 3H).
화합물 WLS -60b의 제조
깨끗하고 건조한 2구 500 mL 둥근 바닥 플라스크에 WLS-60a(10.0 g, 0.116 mol, 1.0 당량)를 자석 교반 막대와 함께 넣고 DMF(150 mL)를 첨가하여 용해시켰다. 이어서 빙욕를 사용하여 RBF를 0℃까지 냉각시켰다.　0℃에서 30분에 걸쳐 수소화나트륨(9.29 g, 0.232 mol, 3.0 당량)을 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 이어서 WLS-60a5(60.12 g, 0.403 mol, 3.47 당량)을 추가 깔때기를 사용하여 0℃에서 20분에 걸쳐 적가하고 반응 혼합물을 5시간 동안 교반하였다. TLC 모니터링에서 출발 물질이 소모되었고 생성물이 형성된 것으로 나타났다(TLC - 50% EtOAc; 헥산, TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산).　반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 얼음에 붓고 에틸 아세테이트(500 mL x 2)로 추출하고 유기층을 얼음물(500 mL x 2)로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고 증발 건조하여 미정제 화합물을 수득하였다. 미정제 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(100~200 메쉬)로 정제하였다. 생성물을 15%~20% 에틸 아세테이트:헥산으로 용리하였다. 분획 함유 생성물을 증발시켜 WLS -60b(18.4 g, 71% 수율)을 황색 액체로서 수득하였다.
1 H NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 5.69-5.62 (m, 2H), 5.41-5.33 (m, 2H), 3.74 (dd, 4H, J = 6.5, J =1.1 Hz), 3.22 (s, 4H), 2.08- 2.00 (m, 4H), 0.99 (t, 6H, J = 7.4 Hz).
화합물 WLS -60c의 제조
WLS -60b(25.0 g, 0.112 mol, 1.0 당량)를 아르곤 분위기 하에서 깨끗하고 건조한 2 L 2구 RBF에 넣었다. 이어서 아르곤 분위기 하에서, 건조 톨루엔 350 mL를 첨가하였다. 추가 깔대기를 사용하여 실온에서 45분에 걸쳐 옥살릴 클로라이드(144 mL, 1.679 mol, 14.93 당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 72시간 동안 65℃까지 가열하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 10% MeOH:DCM; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산) 용매를 회전식 증발기 상에서 증발시켜 미정제 화합물을 수득하였다. 미정제 화합물을 헥산(2 x 500 mL)으로 세척한 후, 용매를 따라내고 고진공에서 건조하여 미정제 WLS -60c(31.0 g)를 갈색 점착성 액체로서 수득하였다. WLS -60c을 추가 정제 없이 다음 반응에 직접 사용하였다. 1 H NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 5.97-5.92 (m, 2H), 5.48-5.33 (m, 4H), 4.23 (s, 6H), 2.17- 2.03 (m, 4H), 1.01 (t, 6H, J = 7.4 Hz). MS: C13H22Cl2N2 + [M-Cl]에 대한 m/z 계산치, 계산치 241.78; 실측치 241.21.
화합물 WLS -60d의 제조
WLS -60c(31.0 g, 0.112 mol, 1.0 당량)를 아르곤 분위기 하에서 깨끗하고 건조한 2 L 단목 RBF에 넣었다. 아르곤 분위기 하에서, DCM 310 mL를 첨가하였다. 이어서 KPF6 수용액(20.58 g, 0.112 mol, 1.0 당량, 물 124 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 10% MeOH:DCM; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산), 반응 혼합물을 얼음물(400 mL)에 붓고 DCM(2 x 500 mL)으로 추출하였다. 합한 유기층을 물(400 mL)로 세척하고 황산나트륨으로 건조하고 여과하고 증발 건조시켰다. 잔류물을 DCM(15 mL)에 용해시키고 교반 하에 디에틸 에테르(2 x 500 mL)를 적가하여 생성물을 침전시켰다. 용매를 따라내고 고체를 고진공하에 건조하였다. 상기 침전 과정을 1회 더 반복하여 WLS -60d(39.0 g, 90% 수율)을 회백색 고체로서 수득하였다. 1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 5.92-5.86 (m, 2H), 5.42-5.36 (m, 2H), 4.11 (d, 4H, J = 6.9 Hz), 4.02 (s, 4H), 2.13- 2.07 (m, 4H), 1.01 (t, 6H, J = 7.6 Hz). 19 F NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = -72.96, - 74.48.
화합물 WLS -60의 제조
WLS -60d(39.0 g, 0.101 mol, 1.0 당량)를 아르곤 분위기 하에서 깨끗하고 건조한 1 L 2구 RBF에 넣었다. 아르곤 분위기 하에서, 건조 MeCN 390 mL를 첨가하였다. 아지드화나트륨(9.84 g, 0.151 mol, 1.5 당량)을 10분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 5% MeOH:DCM; TLC 탄화 - 닌히드린), 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 MeCN(40 mL)으로 세척하였다. 유기층을 증발 건조시켰다. 미정제 화합물을 에테르 및 헥산으로 세척하여 갈색 점착성 액체를 수득하고 이를 고진공에서 건조시켜 WLS-60(32.0 g, 81% 수율)을 갈색 점착성 액체로서 수득하였다.
1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in = 5.89-5.84 (m, 2H), 5.44-5.40 (m, 2H), 4.04 (d, 4H, J = 5.5 Hz), 3.87 (s, 4H), 2.13- 2.08 (m, 4H), 1.01 (q, 6H, J = 7.1 Hz). 19 F NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = -73.22 및 -74.74. MS: C13H22F6N5P ([M-PF6]+)에 대한 m/z 계산치, 248.35; 실측치 248.80. IR (KBr 펠릿): N3 (2170 cm-1)
2- 아지도 -1,3-디((Z)-펜트-2-엔-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트(V)(WLS-61)의 합성
Figure pct00566
화합물 WLS - 61a2의 제조
WLS - 61a1(19.00 g, 0.221 mol, 1.0 당량)를 아르곤 분위기 하에서 깨끗하고 건조한 1 L 2구 RBF의 건조 에테르 380 mL에 넣고, 0℃까지 냉각하고, PBr3(25.2 mL, 0.265 mol, 1.2 당량)을 20분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 실온까지 만들고 4시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 30% EtOAc:헥산; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산) 반응 혼합물을 0℃까지 냉각하였다. 이어서 조심스럽게 얼음물(70 mL)로 ??칭하고 디에틸 에테르(2 x 500 mL)로 추출하고 물(300 ml)로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조하고 진공하에 건조시켜 WLS - 61a2(24.0 g, 73% 수율)를 무색 오일로서 수득하였다. WLS-60a2를 추가 정제 없이 다음 반응에 직접 사용하였다. 1 H NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 5.74-5.66 (m, 1H), 5.63-5.57 (m, 1H), 4.00 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 2.20-2.09 (m, 2H), 1.02 (t, 3H, J = 7.6 Hz).
화합물 WLS -61b의 제조
깨끗하고 건조한 2구 500 mL 둥근 바닥 플라스크에 WLS-61a(5.0 g, 0.058 mol, 1.0 당량)를 자석 교반 막대와 함께 넣고 DMF(100 mL)를 첨가하여 용해시켰다. 이어서 빙욕를 사용하여 RBF를 0℃까지 냉각시켰다.　0℃에서 30분에 걸쳐 수소화나트륨(4.64 g, 0.116 mol)을 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 이어서 WLS - 61a2(21.63 g, 0.145 mol, 2.5 당량)을 추가 깔때기를 사용하여 0℃에서 30분에 걸쳐 적가하고 반응 혼합물을 0℃에서 30분 동안 및 실온에서 3시간 동안 교반하였다. TLC 모니터링에서 출발 물질이 소모되었고 생성물이 형성된 것으로 나타났다(TLC - 30% EtOAc; 헥산, TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산).　반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 얼음에 붓고 에틸 아세테이트(1000 mL x 2)로 추출하고 유기층을 얼음물(1200 mL x 2)로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고 증발 건조하여 미정제 화합물을 수득하였다. 미정제 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(100~200 메쉬)로 정제하였다. 생성물을 5%~10% 에틸 아세테이트:헥산으로 용리하였다. 분획 함유 생성물을 증발시켜 WLS -61b(9.69 g, 75% 수율)을 황색 액체로서 수득하였다.
1 H NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 5.63-5.56 (m, 2H), 5.36-5.29 (m, 2H), 3.84 (dt, 4H, J = 7.1, J =0.6 Hz), 3.23 (s, 4H), 2.15- 2.07 (m, 4H), 0.98 (t, 6H, J = 7.5 Hz).
MS: C13H22N2O ([M+H]+)에 대한 m/z 계산치, 223.33; 실측치 223.37.
화합물 WLS -61c의 제조
WLS -61b(30.0 g, 0.135 mol, 1.0 당량)를 아르곤 분위기 하에서 깨끗하고 건조한 2L 3구 RBF에 넣었다. 이어서 아르곤 분위기 하에서, 건조 톨루엔 300 mL를 첨가하였다. 추가 깔대기를 사용하여 실온에서 30분에 걸쳐 옥살릴 클로라이드(173.6 mL, 2.024 mol, 15.0 당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 72시간 동안 65℃까지 가열하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 10% MeOH:DCM; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산) 용매를 회전식 증발기 상에서 증발시켜 미정제 화합물을 수득하였다. 미정제 화합물을 헥산(2 x 500 mL)으로 세척한 후, 용매를 따라내고 고진공에서 건조하여 미정제 WLS -61c(38.0 g)를 갈색 점착성 액체로서 수득하였다. WLS -61c을 추가 정제 없이 다음 반응에 직접 사용하였다. MS: C13H22Cl2N2 + [M+-Cl]에 대한 m/z 계산치, 계산치 241.78; 실측치 241.27.
화합물 WLS -61d의 제조
WLS -61c(37.0 g, 0.133 mol, 1.0 당량)를 아르곤 분위기 하에서 깨끗하고 건조한 1 L 단목 RBF에 넣었다. 아르곤 분위기 하에서, DCM 370 mL를 첨가하였다. 이어서 KPF6 수용액(24.57 g, 0.133 mol, 1.0 당량, 물 148 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 10% MeOH:DCM; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산), 반응 혼합물을 얼음물(400 mL)에 붓고 DCM(2 x 500 mL)으로 추출하였다. 합한 유기층을 물(400 mL)로 세척하고 황산나트륨으로 건조하고 여과하고 증발 건조시켰다. 잔류물을 DCM(40 mL)에 용해시키고 교반 하에 디에틸 에테르(1000 mL)를 적가하여 생성물을 침전시켰다. 용매를 따라내고 고체를 고진공하에 건조하였다. 상기 침전 과정을 1회 더 반복하여 WLS -61d(48.0 g, 93% 수율)을 회백색 고체로서 수득하였다. 1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 5.92-5.79 (m, 2H), 5.44-5.33 (m, 2H), 4.21 (d, 4H, J = 7.6 Hz), 4.03 (s, 4H), 2.16-2.09 (m, 4H), 1.01 (t, 6H, J = 7.2 Hz). 19 F NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = -73.12, - 74.64. MS: C13H22ClF6N2P+ [M+-Cl]에 대한 m/z 계산치, 계산치 241.78; 실측치 241.18.
화합물 WLS -61의 제조
WLS -61d(48.0 g, 0.124 mol, 1.0 당량)를 아르곤 분위기 하에서 깨끗하고 건조한 1 L 2구 RBF에 넣었다. 아르곤 분위기 하에서, 건조 MeCN 480 mL를 첨가하였다. 아지드화나트륨(12.103 g, 0.186 mol, 1.5 당량)을 10분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 5% MeOH:DCM; TLC 탄화 - 닌히드린), 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 MeCN(40 mL)으로 세척하였다. 유기층을 증발 건조시켰다. 미정제 화합물을 DCM(100 mL)에 용해시키고 -78℃에서 에테르 및 헥산을 첨가하여 침전시키고, 용매를 따라내고 고체를 고진공하에 건조시켜 WLS -61(28.0 g, 57% 수율)을 갈색 고체로서 수득하였다. 1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in = 5.80-5.75 (m, 2H), 5.43-5.36 (m, 2H), 4.12 (d, 4H, J = 6.9 Hz), 3.86 (s, 4H), 2.13- 2.08 (m, 4H), 1.00 (q, 6H, J = 7.1 Hz).
19 F NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = -73.26 및 -74.78. MS: C13H22F6N5P ([M-PF6]+)에 대한 m/z 계산치, 248.35; 실측치 248.24. IR (KBr 펠릿): N3 (2171 cm-1)
2- 아지도 -1,3- 비스 (2- 메톡시에틸 )-4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로 -포스페이트(V)(WLS-64)의 합성
Figure pct00567
1,3- 비스(2-메톡시에틸)이미다졸리딘 -2-온( WLS -64B).
DMF(20 mL) 중 이미다졸리딘-2-온(WLS -64A)(20 g, 0.23 mol, 1.0 당량)의 용액에 수소화나트륨(28 g, 0.69 mol, 3.0 당량)을 70℃에서 40분에 걸쳐 조금씩 첨가하고, 동일한 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서 DMF(60 mL) 중 2-클로로에틸 메틸 에테르(63.9 mL, 0.69 mol, 3.0 당량)의 용액을 30분에 걸쳐 적가하였다. 상기 혼합물을 70℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 상기 반응물을 얼음물(300 mL)로 희석하고 에틸 아세테이트(2 x 500 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 차가운 염수 용액(3 x 100 mL)으로 세척하고, Na2SO4로 건조하고 감압하에 농축하였다. 미정제물을 80% EA/헥산에서 용리되는 실리카 겔(60~120 메쉬) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 1,3-비스(2-메톡시에틸)이미다졸리딘-2-온(WLS-64B)을 무색 오일(29 g, 62%)로서 수득하였다.
1H NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 3.52 (t, 4H, J = 5.2 Hz)), 3.42 (s, 4H), 3.37 (t, 4H, J = 5.3 Hz), 3.35 (s, 6H). MS (ESI) 203.21 (M+1)+.
2- 클로로 -1,3- 비스 (2- 메톡시에틸 )-4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 클로라이드(WLS-64C).
톨루엔(150 mL) 중 WLS -64B(15 g, 0.074 mol, 1.0 당량)의 냉각 용액에 옥살릴 클로라이드(95 mL, 1.1138 mol, 15.0 당량)를 아르곤 분위기 하에서 25분에 걸쳐 적가하였다. 상기 혼합물을 70℃에서 72시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 상기 반응 혼합물을 감압하에 농축시켜 미정제 화합물을 수득하였다. 미정제물을 n-헥산(2 x 100 mL) 및 40% EA/헥산(3 x 100 mL)으로 0℃에서 처리하였다. 0℃에서 고체 침전물이 관찰된 후, 용매를 따라내고 화합물을 진공하에 건조시켜 갈색 점착성 시럽(17g, 미정제)을 수득하고, 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ in ppm = 4.38 (d, 4H, J = 18.6 Hz), 3.89 (t, 4H, J = 4.9 Hz) 3.66 (t, 4H, J = 4.9 Hz), 3.39 (s, 6H). MS (ESI) 221.19 (M-Cl)+.
2- 클로로 -1,3- 비스 (2- 메톡시에틸 )-4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트 (V)(WLS-64D).
DCM(140 mL) 중 WLS-64C(14 g, 0.0544 mol, 1.0 당량)의 교반 용액에 실온에서 30분에 걸쳐 물(70 mL) 중 KPH6(10 g, 0.0544 mol, 1.0 당량)의 용액을 적가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 이어서 혼합물을 셀라이트 베드를 통해 여과하고 DCM(3 x 100 mL)으로 세척하였다. 유기층을 물(2 x 100 mL)로 세척하고 Na2SO4로 건조하고 여과하고 증발 건조하였다. 잔류물을 DCM(15 mL)에 용해시킨 후 디에틸 에테르(125 mL)를 첨가하고 -78℃까지 냉각시켰다. 침천된 고체를 여과하고, 에테르(2 x 50 mL)로 세척하고, 진공하에 건조하여 갈색 고체(25 g, 64%)를 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ in ppm = 4.21 (td, 4H, J = 10.8 Hz, 5.3 Hz), 3.78 (m, 4H), 3.62 (q, 4H, J = 5.5 Hz), 3.38 (d, 6H, J = 2.8 Hz). MS (ESI) 221.18 (M-PF6)+.
2- 아지도 -1,3- 비스 (2- 메톡시에틸 )-4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트 (V)(WLS-64).
아세토니트릴(125 mL) 중 WLS-64D(12.5 g, 0.034 mol, 1.0 당량)의 냉각 용액에 아지드화나트륨(3.32 g, 0.051 mol, 1.5 당량)을 N2 분위기 하에서 20분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 이어서 혼합물을 셀라이트 베드를 통해 여과하고 베드를 아세토니트릴(2 x 80 mL)로 세척하였다. 여과액을 진공하에 증발시켜 미정제물을 수득하였다. 잔류물을 다시 DCM(25 mL)에 용해시킨 후 디에틸 에테르(150 mL)를 -60℃까지 냉각하고 40분 동안 교반하였다. 고체를 침전시키고 이를 여과하고 에테르(2 x 50 mL)로 세척하고 고진공하에 건조하여 갈색을 띤 점착성 물질(11 g, 86%)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ in ppm = 3.98 (s, 4H), 3.64 (q, 4H, J = 4.4 Hz), 3.59 (dt, 4H, J = 14.2 Hz, 5.3 Hz), 3.40 (d, 6H, J = 8.3 Hz). MS (ESI) 228.25 (M-PF6) +. 19F NMR (500 MHz, CDCl3): δ in ppm = -72.95 및 -74.46. IR (KBr 펠릿): N3 (2173 cm-1)
5- 아지도 -1- 메틸 -4-(6-(2,2,2- 트리플루오로아세트아미도 ) 헥실 )-3,4- 디하이 드로-2H-피롤-1-윰 헥사플루오로포스페이트(V)(WLS-66)
Figure pct00568
( WLS -66B)의 합성:
1,4-디옥산(650 mL, 13 vol.) 중 WLS -66A(50 g, 0.58 mol, 1.0 당량)의 용액에 수소화나트륨(27.18 g, 0.67 mol, 1.17 당량)을 0℃에서 30분에 걸쳐 조금씩 첨가하고 65℃에서 3시간 동안 추가로 교반하였다. 이어서 요오도메탄(63.8 mL, 1.07 mol, 1.8 당량)을 0℃에서 45분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 만들고 16시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 상기 혼합물을 셀라이트 베드를 통해 여과하고 DCM(2 x 100 mL)으로 세척하였다. 여과액을 감압하에 농축하여 미정제 화합물을 수득하고 이를 2% MeOH/DCM에서 용리한 실리카겔(230~400 메쉬) 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 WLS -66B를 미색 고체(18 g, 31%)로서 수득하였다. 1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 5.10 (s, 1H), 3.41 (m, 4H), 2.79 (s, 3H). MS (ESI) 101.01 (M+1)+.
( WLS -66C)의 합성:
DMF(350 mL, 25 vol.) 중 WLS -66B(14 g, 0.1398 mol, 1.0 당량)의 교반 용액에 수소화나트륨(60%)(8.38 g, 0.2097 mol, 1.5 당량)을 아르곤 분위기 하에 0℃에서 30분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물에 DMF(70 ml, 5 vol.) 중 알킬 브로마이드(58.71 g, 0.2097 mol, 1.5 당량) 용액을 1시간에 걸쳐 적가하였다. 이어서 혼합물을 추가로 3시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 상기 반응물을 얼음물(300 mL)로 희석하고 에틸 아세테이트(3 x 400 mL)로 추출하고, Na2SO4 로 건조하고 감압하에 농축하였다. 미정제물을 2% MeOH/DCM에서 용리되는 실리카 겔(230~400 메쉬) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 3WLS-66C을 연황색 오일(16.5 g, 39%)로서 수득하였다.
1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 4.55 (s, 1H), 3.27 (s, 4H), 3.17 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 3.09 (t, 2H, J = 5.9 Hz), 2.78 (s, 3H), 1.50 (q, 4H, J = 7.3 Hz), 1.44 (s, 9H), 1.32 (m, 4H). MS (ESI) 300.33 (M+1)+.
( WLS -66D)의 합성:
DCM(180 mL, 10 vol.) 중 WLS -66C(18 g, 0.06012 mol, 1.0 당량)의 교반 용액에 트리플루오로아세트산(23.1 mL, 0.3006 mol., 5.0 당량)을 0℃에서 적가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 이어서, 반응 혼합물을 톨루엔과 공동 증류한 감압하에 증발시키고 건조하여 황색을 띠는 점착성 물질(20 g, 미정제)를 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
1 H NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 7.65 (d, 2H, J = 36.6 Hz), 3.21 (s, 4H), 3.04 (t, 2H, J = 7.1 Hz), 2.77 (m, 2H), 2.63 (s, 3H), 1.52 (m, 2H), 1.42 (m, 2H), 1.28 (m, 4H). MS (ESI) 200.25 (M+1)+.
( WLS -66E)의 합성
DCM(300 mL) 중 WLS -66D(20 g, 0.06410 mol, 1.0 당량)의 교반된 냉각 용액에 트리에틸아민(26.87 mL, 0.1923 mol, 3.0 당량)을 30분에 걸쳐 적가하였다. 이어서 에틸 트리플루오로아세테이트(11.48 mL, 0.09615 mol, 1.5 당량)를 15분에 걸쳐 적가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 상기 반응물을 얼음물(100 mL)로 희석하고 DCM(3 x 100 mL)로 추출한 후, Na2SO4 로 건조하고 감압하에 농축하였다. 미정제 화합물을 90% EA/헥산으로 용리되는 염기성 실리카겔(100~200 메쉬) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 WLS -66E를 미색 고체(2단계에서, 9.9 g, 56%)로서 수득하였다.
1 H NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 7.43 (s, 1H), 3.33 (q, 2H, J = 6.5 Hz), 3.29 (t, 4H, J = 3.6 Hz), 3.20 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 2.77 (s, 3H), 1.59 (m, 2H), 1.51 (m, 2H), 1.41 (m, 2H), 1.30 (m, 2H). MS (ESI) 296.3 (M+1)+.
( WLS -66F)의 합성
톨루엔(120 mL, 10 vol.) 중 WLS -66E(12 g, 0.0405 mol, 1.0 당량)의 냉각 용액에 옥살릴 클로라이드(52.6 mL, 0.6089 mol, 15 당량)를 아르곤 분위기 하에서 20분에 걸쳐 적가하였다. 상기 혼합물을 70℃에서 72시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 상기 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 미정제 화합물을 수득하고 이를 디에틸 에테르(2 x 60 mL)로 처리하고, 용매를 따라내고 진공하에 건조시켜 WLS -66F를 갈색 물질(16 g, 미정제)로서 수득하고, 이를 추가 정제 없이 추가 단계에 사용하였다.
1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 11.30 (s, 1H), 4.30 (t, 4H, J = 6.9 Hz), 3.66 (m, 4H), 3.32 (d, 3H, J = 5.5 Hz), 1.80 (m, 4H), 1.42 (m, 4H). MS (ESI) 314.31 (M+1)+.
( WLS -66G)의 합성
아세토니트릴(62.5 mL) 중 WLS -66F(5 g, 0.0142 mol, 1.0 당량)의 교반된 냉각 용액에 고체 KPH6(3.41 g, 0.0185 mol, 1.3 당량)을 10분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 이어서 혼합물을 셀라이트 베드를 통해 여과하고 아세토니트릴(2 x 20 mL)로 세척하였다. 여과액을 감압하에 증발시켜 미정제 화합물을 수득하였다. 잔류물을 다시 아세토니트릴(5 mL)에 용해한 후 -78℃에서 디에틸 에테르(60 mL)로 처리하고 용매를 따라내고 진공하에 건조하여 WLS -66G를 갈색 점착성 물질(4 g, 미정제)로서 수득하였다.
1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 4.13 (s, 4H), 3.62 (m, 4H), 3.26 (s, 3H), 1.64 (m, 4H), 1.41 (d, 4H, J = 15.8 Hz). MS (ESI) 314.26 (M+1)+.
( WLS -66G)의 합성
아세토니트릴(480 mL) 중 WLS -66G(48 g, 0.1044 mol, 1.0 당량)의 교반된 냉각 용액에 아지드화나트륨(10.18 g, 0.1566 mol, 1.5 당량)을 20시간에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 이어서 혼합물을 셀라이트 베드를 통해 여과하고 아세토니트릴(2 x 100 mL)로 세척하였다. 여과액을 진공하에 증발시켜 미정제 화합물을 수득하였다. 잔류물을 아세토니트릴(25 mL)에 용해시킨 후 디에틸 에테르(200 mL)를 첨가하고 -78℃까지 냉각시켰다. 고체를 침전시키지 않고, 용매를 따라내고 진공하에 건조하여 갈색 점착성 액체(44 g)를 수득하였다.
1 H NMR ( 500 MHz , DMSO -D6): δ in ppm = 9.43 (s, 1H), 3.81 (ddd, 4H, J1 = 23.1 Hz, J2 = 15.5 Hz, J3 = 4.5 Hz)), 3.34 (t, 4H, J = 6.9 Hz), 3.13 (s, 3H), 1.51 (m, 4H), 1.28 (s, 4H). MS (ESI) 321.34 (M+1)+.
19 F NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = -69.325 및 -70.837
IR (KBr 펠릿): N3 (2169.53 cm-1)
( WLS -66A2)의 합성:
WLS -66A1(40 g, 0.3413 mol, 1.0 당량)에 수성 HBr(47%)(118 mL, 1.0239 mol, 3.0 당량)을 0℃에서 30분에 걸쳐 적가하였다. 상기 혼합물을 110℃에서 24시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 용매를 진공하에 증발시켜 미정제 화합물(WLS -66A2)을 연황색 반고체(80 g)로서 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
1 H NMR ( 500 MHz , CDCl3 )): δ in ppm = 7.90 (s, 2H, -NH2), 3.42 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 3.09 (q, 2H, J = 6.4 Hz), 1.87 (m, 4H), 1.51 (m, 4H). MS (ESI) 180.15 (M, M+2)+.
( WLS -66A3)의 합성:
DCM(800 mL, 10 vol.) 중 WLS -66A2(80 g, 0.3065 mol, 1.0 당량)의 교반된 냉각 용액에 트리에틸아민(95.5 mL, 0.6743 mol, 2.2 당량)을 20분에 걸쳐 적가하였다. 이어서 Boc 무수물(187 ml, 0.8582 mol, 2.8 당량)을 45분에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 실온으로 만들고 16시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 혼합물을 DCM(500 mL)으로 희석하고 물(4 x 200 mL)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조하고 진공하에 증발시켜 미정제 화합물을 수득하였다. 잔류물을 8% EA/헥산으로 용리되는 실리카 겔(230~400 메쉬) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 WLS - 66A3을 연황색 시럽(2단계에서, 57 g, 59%)으로서 수득하였다.
1 H NMR ( 400 MHz , CDCl3 ): δ in ppm = 4.55 (s, 1H, -NH), 3.40 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 3.11 (q, 2H, J = 6.4 Hz), 1.83 (m, 2H), 1.49 (m, 13H), 1.34 (m, 2H). MS (ESI) 280.24 (M+)+.
2- 아지도 -1-(( 4Z,7Z )- 데카 -4,7- 디엔 -1-일)-3- 메틸 -4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트(V)(WV-RA-016A)의 합성
Figure pct00569
화합물 2C의 제조
THF(1500 mL) 중 화합물 2A(76 g, 903.51 mmol)의 용액에 TosCl(206.70 g, 1.08 mol) 및 KOH(76.04 g, 1.36 mol)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 4시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 2A가 완전히 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물에서 불용성 물질을 여과하고 여과액을 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 2/1)로 정제하였다. 화합물 2C(210 g, 97.53% 수율)가 황색 오일로서 수득하였다.
TLC: 석유 에테르 에틸 아세테이트 = 5:1, Rf = 0.4
화합물 2의 제조
DCM(800 mL) 중 화합물 1(72.8 g, 865.47 mmol)의 용액에 DIEA(257.27 g, 1.99 mol)를 0℃에서 첨가한 후 MOMCl(143.89 g, 1.79 mol)를 적가하였다. 혼합물을 N2 하에 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 1이 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 포화 NH4Cl 용액(1000 mL)을 첨가하고, 층을 분리하고, 수성 혼합물을 DCM(2 x 500 mL)으로 추가로 추출하였다. 합한 유기 분획을 건조하고(Na2SO4) 용매를 진공에서 제거하였다. 화합물 2(70 g, 63.11% 수율)를 무색 오일로서 수득하였다. 1 HNMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ = 4.61 (s, 2H), 3.61 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.35 (s, 3H), 2.30 (dt, J = 2.7, 7.0 Hz, 2H), 1.94 (t, J = 2.6 Hz, 1H), 1.80 (quin, J = 6.6 Hz, 2H)
TLC: 석유 에테르 에틸 아세테이트 = 2:1, Rf = 0.6
화합물 3의 제조
테트라부틸암모늄 클로라이드(33.83 g, 121.71 mmol), 탄산이나트륨(64.50 g, 608.57 mmol), 및 요오도구리(77.27 g, 405.72 mmol)를 각각 미세하게 분쇄하고 무수 상태로 교반하면서 0℃에서 건조 DMF(1000 mL)에 현탁시켰다. 이어서, 화합물 2(52 g, 405.72 mmol)를 한꺼번에 첨가하고 20분 동안 계속 교반하였다. 화합물 2C(116.02 g, 486.86 mmol)를 적가하고 현탁액을 N2 하에 40℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 2가 소모되었고 하나의 새로운 주요 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 포화 NH4Cl 500 mL, H2O 500 mL로 희석하고 에틸 아세테이트(500 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 포화 염수(500*2 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 5/1)로 정제하였다. 화합물 3(24 g, 30.45% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
1 HNMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ = 4.62 (s, 2H), 3.60 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.36 (s, 3H), 3.11 (quin, J = 2.3 Hz, 2H), 2.28 (tt, J = 2.3, 7.0 Hz, 2H), 2.17 (tq, J = 2.3, 7.5 Hz, 2H), 1.77 (quin, J = 6.7 Hz, 2H), 1.11 (t, J = 7.5 Hz, 3H). TLC: 석유 에테르 에틸 아세테이트 = 5:1, Rf = 0.8
화합물 3의 제조
헥산(90 mL)과 EtOAc(30 mL)의 혼합 용매 중 화합물 3(11 g, 56.62 mmol)의 용액에 퀴놀린(146.27 mg, 1.13 mmol) 및 LINDLAR CATALYST(11.69 g, 5.66 mmol, 10% 순도)를 H2 분위기(15 psi) 하에서 첨가하였다. 혼합물을 15℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 3이 완전히 소모되었고, 2개의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 두 배치의 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 10/ 1)로 정제하였다. 화합물 4(17 g, 75.70% 수율)를 무색 오일로서 수득하였다.
1 HNMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ = 5.57 - 5.17 (m, 4H), 4.69 - 4.58 (m, 2H), 3.56 - 3.50 (m, 2H), 3.38 - 3.36 (m, 3H), 2.86 - 2.65 (m, 2H), 2.22 - 2.05 (m, 4H), 1.74 - 1.60 (m, 2H), 1.02 - 0.92 (m, 3H). TLC: 석유 에테르 에틸 아세테이트 = 5:1, Rf = 0.8
화합물 5의 제조
HCl(6 M, 142.88 mL)를 MeOH(150 mL) 중 화합물 4(17 g, 85.73 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 70℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 4가 완전히 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 1 M NaOH로 약 pH 7까지 ??칭한 후 EtOAc(3 × 200 mL)로 추출하고 합한 유기층을 염수(200 mL)로 세척하고 건조(Na2SO4)하고 농축하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 1/1)로 정제하였다. 화합물 5(9 g, 68.06% 수율)를 황색 액체로서 수득하였다.
TLC: 석유 에테르 에틸 아세테이트 = 5:1, Rf = 0.3
화합물 6의 제조
NBS(20.77 g, 116.69 mmol)를 N2 하에서 DCM(300 mL) 중 PPh3(30.61 g, 116.69 mmol)의 빙냉 용액에 조금씩 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반한 후 DCM(50 mL) 중 화합물 5(9 g, 58.35 mmol)의 용액을 천천히 첨가하였다. 혼합물을 빙욕에서 2시간 동안 교반하고 15℃에서 3시간 더 교반하였다. TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 5:1, Rf = 0.9)는 화합물 5가 완전히 소모되었고 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 H2O(100 mL)로 ??칭하고 CH2Cl2(3 × 200 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 진공하에 농축하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 3/1)로 정제하였다. 화합물 6(10 g, 46.05 mmol, 78.93% 수율)을 무색 액체 수득하였다.
1 HNMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ = 5.58 - 5.21 (m, 4H), 3.47 - 3.37 (m, 2H), 2.88 - 2.68 (m, 2H), 2.23 (td, J = 7.4, 14.9 Hz, 2H), 2.13 - 2.06 (m, 2H), 1.98 - 1.89 (m, 2H), 1.04 - 0.92 (m, 3H)
TLC: 석유 에테르 에틸 아세테이트 = 5:1, Rf = 0.9
화합물 7의 제조
헥산(50 mL) 중 화합물 6(9.5 g, 43.75 mmol)의 용액에 에탄-1,2-디아민(78.38 g, 1.30 mol)을 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 0~15℃에서 5시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 6이 완전히 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 혼합물을 감압하에 농축하였다. 화합물 7(8.59 g, 미정제)이 무색 오일로서 수득하였다.
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 5:1, Rf = 0)
화합물 8의 제조
THF(90mL) 중 화합물 7(8.59 g, 43.75 mmol) 및 CDI(7.09 g, 43.75 mmol)의 용액을 15℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 7이 완전히 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 1/0)로 정제하여 미정제물(4.4 g)을 수득하였다. 이어서 미정제물을 역상 HPLC(컬럼: Welch Xtimate C18 250*70mm#10um; 이동상: [물(10 mM NH4HCO3)-ACN]; B%: 45%~65%, 20분)로 정제하였다. 화합물 8(2.5 g, 25.70% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
1 HNMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ = 5.53 - 5.18 (m, 4H), 3.41 (s, 4H), 3.25 - 3.13 (m, 2H), 2.82 - 2.62 (m, 2H), 2.14 - 2.05 (m, 3H), 2.02 (br d, J = 3.6 Hz, 1H), 1.65 - 1.50 (m, 2H), 1.02 - 0.89 (m, 3H). TLC: 석유 에테르 에틸 아세테이트 = 0:1, Rf = 0.25
화합물 9의 제조
Figure pct00570
DMF(20 mL) 중 화합물 8(2.1 g, 9.45 mmol)의 용액에 NaH(1.13 g, 28.34 mmol, 60% 순도)를 0℃에서 첨가하고 반응물을 0.5시간 동안 교반한 후 MeI(6.70 g, 47.23 mmol)을 상기 반응 혼합물에 첨가하고 15℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 8이 소모되었고 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 15℃에서 H2O(50 mL)을 첨가하여 ??칭하고, 에틸 아세테이트(30 mL* 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 0/1)로 정제하였다. 화합물 9(2.23 g, 9.44 mmol, 100.00% 수율)을 무색 오일로서 수득하였다.
1 HNMR ( 400 MHz , 클로로포름-d) δ = 5.61 - 5.13 (m, 4H), 3.31 - 3.25 (m, 4H), 3.23 - 3.15 (m, 2H), 2.82 - 2.70 (m, 5H), 2.15 - 1.98 (m, 4H), 1.63 - 1.50 (m, 2H), 1.02 - 0.92 (m, 3H)
TLC: 석유 에테르 에틸 아세테이트 = 0:1, Rf = 0.4
화합물 10의 제조
Tol(20 mL) 중 화합물 9(2 g, 8.46 mmol)의 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 퍼징한 후 혼합물에 (COCl)2(10.74 g, 84.62 mmol)를 첨가하고 N2 분위기 하에 65℃에서 24시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 완료되었고, 출발 물질이 소모되었으며, 목적하는 생성물이 수득된 것으로 나타났다. LCMS는 목적하는 질량이 검출된 것으로 나타났다. 이어서 혼합물을 진공에서 농축시켰다. 화합물 10(2.46 g, 미정제, Cl)을 검갈색 고체로서 수득하였다.
LCMS (M + H+): 255.2. TLC: 석유 에테르 에틸 아세테이트 = 0:1, Rf = 0
화합물 WV-RA-016의 제조
CAN(30 mL) 중 화합물 10(2.4 g, 8.24 mmol, Cl)의 용액에 칼륨;헥사플루오로포스페이트(1.52 g, 8.24 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 15℃에서 2시간 동안 교반하였다. 많은 수의 고체를 반응 혼합물로부터 침전시켰다. 반응 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 DCM(30 mL * 2)으로 세척하고, 유기층을 농축하였다. 미정제물을 EtOAc 20 mL로 희석하고 H2O(10 mL * 3)로 추출하였다. 유기층을 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 화합물 WV-RA-016(3.3 g, 97.70% 수율, PF6)을 갈색 고체로서 수득하였다.
1 HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 5.59 - 5.14 (m, 4H), 3.23 - 3.18 (m, 4H), 3.08 - 2.98 (m, 2H), 2.79 - 2.66 (m, 2H), 2.62 (s, 3H), 2.10 - 1.98 (m, 4H), 1.52 - 1.40 (m, 2H), 0.96 - 0.87 (m, 3H)
19 F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ = -69.19 (s, 1F), -71.08 (s, 1F)
31 P NMR ( 162 MHz , DMSO -d 6 ) δ = -135.42 (s, 1P), -139.81 (s, 1P), -144.19 (s, 1P), -148.59 (s, 1P), -152.98 (s, 1P). LCMS (M + H+): 255.2, LCMS 순도: 97.77% 순도
화합물 WV-RA-016A의 제조
ACN(3 mL) 중 WV-RA-016 (100 mg, 249.52 umol PF6) 용액에 NaN3(20 mg, 307.65 umol)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. LCMS는 de-N2 질량이 검출된 것으로 나타났다. 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 여과액을 진공에서 농축하였다. 잔류물을 2 mL CH3CN에 용해하고 용액을 에테르에 부어 침전물을 형성하고 여과한 후 고체를 목적하고 유기상을 2M NaOH로 약 pH 13으로 조정한 후 NaClO(수성) 20 mL를 추가하여 ??칭하였다. 화합물 WV-RA-016A (80 mg, 미정제, PF6)를 갈색 오일로서 수득하였다.
1 HNMR ( 400 MHz , DMSO -d 6 ) δ = 5.57 - 5.06 (m, 3H), 3.80 - 3.48 (m, 4H), 3.39 - 3.30 (m, 3H), 3.27 - 3.15 (m, 2H), 2.87 - 2.72 (m, 3H), 2.12 - 1.90 (m, 4H), 1.64 - 1.37 (m, 2H), 1.00 - 0.83 (m, 4H)
19 FNMR (376 MHz, DMSO-d6) δ = -69.22 (s, 1F), -71.11 (s, 1F)
31 PNMR ( 162 MHz , DMSO -d 6 ) δ = -135.42 (s, 1P), -139.81 (s, 1P), -144.19 (s, 1P), -148.59 (s, 1P), -152.98 (s, 1P). LCMS (M -N2): 234.3
2- 아지도 -1- 도데실 -3- 메틸 -4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로 포스페이트(WV-DL-045)의 합성
Figure pct00571
1.　화합물 2의 제조
1구 둥근 바닥 플라스크에 에탄-1,2-디아민(337.59 g, 5.62 mol)을 자석 교반 막대와 함께 놓고 화합물 1(50 g, 200.62 mmol)을 0℃에서 천천히 첨가하였다. 첨가를 마친 후, 반응 혼합물을 25℃까지 가온하고 추가 1시간 동안 손대지 않은 상태로 두었다. 헥산 300 mL를 반응 혼합물에 첨가하고 25℃에서 12시간 동안 격렬하게 교반하였다. LCMS는 반응이 완료되었고 출발 물질이 소모되었으며 생성물이 수득된 것으로 나타났고, 헥산 층을 따라내고 감압하에 건조하여 화합물 2(123 g)를 무색 오일로서 수득하였다.
LCMS: (M+H+) 229.2
화합물 3의 제조
2개 배치 병행.　THF(630 mL) 중 화합물 2(61.5 g, 269.25 mmol) 및 CDI(43.66 g, 269.25 mmol)의 용액을 15℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 완료되었고, 출발 물질이 소모되었으며, 생성물이 수득된 것으로 나타났다. 미정제 반응 혼합물(126 g 규모)을 추가 정제를 위해 또 다른 2개의 배치 미정제 생성물(123 g 규모) 및 (84 g 규모)에 합했다. 합한 미정제 생성물을 석유 에테르: 에틸 아세테이트(10/1 내지 1/12)로 용리되는 실리카 겔 상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물 3(95 g, 65.09% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.
TLC(에틸 아세테이트:　메탄올 = 10:　1) Rf1 = 0.50
화합물 4의 제조
6개 배치 병행. DMF(650 mL) 중 화합물 3(40 g, 157.23 mmol)의 용액에 NaH(7.55 g, 188.67 mmol, 60% 순도)를 0℃에서 첨가하고 반응물을 0.5시간 동안 교반한 후 CH3I(66.95 g, 471.68 mmol)을 상기 반응 혼합물에 첨가하고 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 완료되었고 출발 물질이 소모되었으며 생성물이 수득된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 25℃에서 H2O(1000 mL)을 첨가하여 ??칭하고, 에틸 아세테이트(1000 mL* 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 1/0)로 정제하여 화합물 4(232 g, 미정제)를 황색 오일로서 수득하였다.
1 H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ = 3.25 - 3.17 (m, 4H), 3.09 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.70 (d, J = 1.6 Hz, 3H), 1.45 - 1.36 (m, 2H), 1.28 - 1.14 (m, 19H), 0.85 - 0.76 (m, 3H)
TLC(석유 에테르:　에틸 아세테이트= 0:　1) Rf1 = 0.5
화합물 5의 제조
Tol.(250 mL) 중 화합물 4(30 g, 111.76 mmol, 1 당량)의 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 퍼징한 후 혼합물에 염화옥살릴(212.78 g, 1.68 mol, 146.75 mL, 15 당량)을 첨가하고 N2 분위기 하에 65℃에서 72시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응이 완료되었고, 출발 물질이 소모되었으며, 목적하는 생성물이 수득된 것으로 나타났다. 이어서 혼합물을 진공에서 농축시켰다. 흰색 고체를 냉각된 EtOAc(100 mL*2)로 세척한 후 고체를 진공에서 농축하여 생성물 5(20 g, 미정제)를 흰색 고체로서 수득하였다.
LCMS: M+, 287.3
화합물 WV-DL-044의 제조.
DCM(46 mL) 및 H2O(26 mL) 중 화합물 5(8 g, 24.74 mmol)의 용액에 헥사플루오로포스페이트(4.55 g, 24.74 mmol)을 25℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 완료되었고 출발 물질이 소모되었으며 목적하는 생성물이 수득된 것으로 나타났다. 여과액을 H2O(10 mL * 2)로 세척하고 흰색 고체는 목적하는 화합물이었다. 생성물 WV-DL-044(6.5 g, 60.69% 수율, F6P)를 흰색 고체로서 수득하였다.?? 생성물을 분석 및 전달을 위해 또 다른 두 개의 배치 생성물(2.5 g 및 2.55g)과 합하였다. 최종적으로, 11.5g의 생성물을 수득하였다.
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트= 0:　1) Rf = 0.0
지질 아지드 WV-DL-045의 제조
2.2 g의 WV-DL-044 및 495 mg의 NaN3를 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 건조 ACN을 첨가하여 현탁액을 형성하고 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 CAN으로 세척하였다. 여과액을 회전증발기에서 건조시킨 후 최소량의 ACN에 재용해시키고 용액을 디에틸 에테르로 침전시켜 1.75 g의 폭신한 흰색 고체를 수득하였다.
1H NMR (600 MHz, 클로로포름-d) δ 3.87 (dd, J = 12.1, 8.1 Hz, 1H), 3.81 - 3.75 (m, 1H), 3.29 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 3.12 (s, 2H), 1.57 - 1.50 (m, 1H), 1.22 (s, 3H), 1.19 (s, 6H), 0.84 - 0.78 (m, 2H).
13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 154.76, 77.29, 77.07, 76.86, 49.38, 47.03, 46.52, 33.13, 31.90, 29.61, 29.61, 29.54, 29.42, 29.34, 29.05, 26.97, 26.47, 22.68, 14.11.
2- 아지도 -1- 헥사데실 -3- 메틸 -4,5- 디하이드로 -1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오 로포스페이트(V)(WLS-41)의 합성
Figure pct00572
화합물 WLS -41b의 제조
깨끗하고 건조한 2구 3리터 둥근 바닥 플라스크에 에탄-1,2-디아민(306 mL, 4.585 mol, 28.0 당량)을 자석 교반 막대와 함께 넣고 화합물 WLS -41a(50 g, 0.164 mol, 1.0 당량)를 추가 깔때기를 사용하여 0℃에서 적가하였다. 첨가를 마친 후, 반응 혼합물을 25℃까지 가온하고 추가 1시간 동안 손대지 않은 상태로 두었다. 이어서 헥산 300 mL를 반응 혼합물에 첨가하고 25℃에서 16시간 동안 격렬하게 교반하였다. TLC는, 반응이 완료되었고, 출발 물질이 소모되었으며, 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다(TLC - 10% MeOH:EtOAc; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산).　헥산층은 분별 깔대기를 사용하여 분리하였다. 300 mL의 헥산을 다시 아민 층에 첨가하고 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 이어서 헥산 층을 분리하여 이전 헥산 층과 합하고 황산나트륨으로 건조하고 감압하에 증발 건조하여 화합물 WLS -41b(48 g)를 미정제 무색 액체로서 수득하였다.
MS: C18H40N2 ([M+H]+)에 대한 m/z 계산치, 285.53; 실측치 285.38.
화합물 WLS -41c의 제조
WLS -41b(48.0 g, 0.169 mol, 1.0 당량)를 아르곤 분위기 하에서 깨끗하고 건조한 1 L 2구 RBF에 넣었다. 이어서 491 mL의 THF를 RBF에 추가하였다. 빙욕(0℃)에서 RB를 냉각시켰다. RM에 1,1'-카보닐디이미다졸(28.17 g, 0.174 mol, 1.03)을 10분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 15℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 완료되었고 출발 물질이 소모되었으며 생성물이 형성된 것으로 나타났다(TLC - 10% MeOH:EtOAc; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산). 반응이 종료된 후 용매를 건조하고 실리카겔 컬럼크로마토그래피(100~200 메쉬)로 정제하였다. 생성물을 50% 에틸 아세테이트:헥산으로 용리하였다. 분획 함유 생성물을 증발시켜 WLS -41c(37.1 g, 71% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 4.33 (s, 1H), 3.40-3.43 (m, 4H), 3.17 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 1.50 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 1.25-1.30 (m, 28H), 0.88 (d, 3H, J = 13.6 Hz).
MS: C19H38N2O ([M+H]+)에 대한 m/z 계산치, 311.53; 실측치 311.42.
화합물 WLS -41d의 제조
WLS -41c(29.0 g, 0.093 mol, 1.0 당량)를 아르곤 분위기 하에서 깨끗하고 건조한 1 L 2구 RBF에 넣었다. 이어서 SM이 포함된 RBF에 건조 DMF 471 mL를 첨가하였다. 빙욕 (0℃)에서 RB를 냉각시켰다. 이어서 RM에 60% NaH(4.48 g, 0.112 mol, 1.20 당량)를 0℃에서 15분에 걸쳐 조금씩 첨가하고 동일한 온도에서 30분간 교반하였다. 이어서 메틸 요오다이드(17.4 mL, 0.281 mol, 3.0 당량)를 0℃에서 15분 동안 반응 혼합물에 적가하였다. 이어서 RM을 실온으로 만들고 3시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 완료되었고 출발 물질이 소모되었으며 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다(TLC - EtOAc; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산). 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 빙욕에서 0℃까지 냉각하고 얼음물(1 L)로 ??칭하였다. 이어서 에틸 아세테이트(3 x 1000 mL)로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축 건조시켰다. 미정제 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(100~200 메쉬)로 정제하였다. 생성물을 25%~35% 에틸 아세테이트:헥산으로 용리하였다. 분획 함유 생성물을 증발시켜 WLS -41d(29.0 g, 96% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다. 1 H NMR ( 500 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 3.27 (s, 4H), 3.16 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 2.78 (s, 3H), 1.48 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 1.29 (s, 7H), 1.25 (s, 22H), 0.88 (t, 3H, J = 6.9 Hz).
MS: C20H40N2O ([M+H]+)에 대한 m/z 계산치, 325.55; 실측치 325.41.
화합물 WLS -41e의 제조
WLS -41d(30.0 g, 0.092 mol, 1.0 당량)를 아르곤 분위기 하에서 깨끗하고 건조한 1 L 2구 RBF에 넣었다. 이어서 아르곤 분위기 하에서, SM이 포함된 RBF에 건조 톨루엔 249 mL를 첨가하였다. 이어서 추가 깔대기를 사용하여 실온에서 30분에 걸쳐 옥살릴 클로라이드(118.9 mL, 1.386 mol, 15.0)를 적가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 72시간 동안 65℃까지 가열하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 에틸 아세테이트; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산) 용매를 증발 건조시켜 미정제 화합물을 수득하였다. 미정제 화합물을 차가운 에틸 아세테이트(2 x 100 mL)로 세척하고 건조시켜 미정제 WLS -41e(33.0 g)를 갈색 고체로서 수득하였다.
MS: C20H40Cl2N2O ([M-Cl]+)에 대한 m/z 계산치, 344.00; 실측치 343.30.
화합물 WLS -41f의 제조
WLS -41e(20.0 g, 0.053 mol, 1.0 당량)를 깨끗하고 건조한 500 mL 단목 RBF에 넣고 아르곤 분위기 하에서 115 mL DCM에 용해시켰다. 이어서 KPF6 수용액(9.70 g, 0.053 mol, 1.0 당량, 물 65 mL 중)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 5% MeOH:DCM; TLC 탄화 - 포스포몰리브덴산), 반응 혼합물을 얼음물에 붓고 DCM(2 x 400 mL)으로 추출하였다. 합한 유기층을 물(400 mL)로 세척하고 황산나트륨으로 건조하고 여과하고 증발 건조시켰다. 이어서, 잔류물을 DCM(70 mL)에 용해시키고 교반 하에 디에틸 에테르(500 mL)를 적가하여 생성물을 침전시켰다. 용매를 따라내고 고체를 고진공하에 건조하여 WLS-41f(18.0 g, 70% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다. MS: C20H40ClF6N2P ([M-PF6]+)에 대한 m/z 계산치, 344.00; 실측치 343.34.
화합물 WLS -41의 제조
WLS -41f(18.0 g, 0.037 mol, 1.0 당량)를 깨끗하고 건조한 500 mL 단목 RBF에 넣고 아르곤 분위기 하에서 90 mL 건조 MeCN에 용해시켰다. 이어서, 아지드화나트륨(3.58 g, 0.055 mol, 1.5 당량)을 RM에 첨가하고 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(TLC - 에틸 아세테이트; TLC 탄화 - 닌히드린), 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 MeCN(20 mL)으로 세척하였다. 유기층을 증발 건조시켰다. 미정제 화합물을 MeCN(70 mL)에 용해시키고 디에틸에테르(500 mL)를 적가하여 침전시켰다. 용매를 따라내고 고체를 고진공하에 건조하여 WLS -41(14.1 g, 77% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = 3.94-4.00 (m, 2H), 3.85-3.90 (m, 2H), 3.41 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 3.21 (s, 3H), 1.62 (t, 2H, J = 7.1 Hz), 1.26 (s, 27H), 0.88 (t, 3H, J = 6.8 Hz).
19 F NMR ( 400 MHz , CDCl 3 ): δ in ppm = -73.35 및 -75.24. MS: C20H40F6N5P ([M-PF6]+)에 대한 m/z 계산치, 350.57; 실측치 350.40. IR (KBr 펠릿): N3 (2179 cm-1)
다음의 아지드는 상업적으로 구입한 것이다:
Figure pct00573
;
Figure pct00574
;
Figure pct00575
;
Figure pct00576
;
Figure pct00577
;
Figure pct00578
;
Figure pct00579
;
Figure pct00580
.
실시예 14. 모르폴린 당 변형 PN 화학 에 대한 합성 및 실험 절차:
클로로 시약(2)에 대한 일반 실험 절차(A)
Figure pct00581
디티올(360 mmol)을 아르곤(3000 mL 단목 플라스크) 하에서 톨루엔(720 mL)에 용해시킨 후 4-메틸모르폴린(35.4 mL, 792 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 아르곤 분위기 하에서 톨루엔(720 mL) 중 삼염화인(720 mL, 396 mmol)의 빙냉 용액에 캐뉼라를 통해 30분에 걸쳐 적가하였다. 1시간 동안 실온까지 가온한 후, 혼합물을 진공/아르곤 하에서 조심스럽게 여과하였다. 생성된 여과액을 회전 증발(Ar로 플러싱)로 농축한 후 고진공하에 2시간 동안 건조하였다. 생성된 미정제 화합물을 걸쭉한 오일로서 단리하고 이를 THF에 용해시켜 1 M 스톡 용액을 수득하고, 수득한 용액을 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
2에 대한 데이터: 일반 절차 A에 따라 화합물 1로부터 합성됨. 31P NMR (243 MHz, THF-CDCl3 , 1:2) δ 168.77, 161.4
단량체(5 및 6)에 대한 일반 실험 절차(B)
Figure pct00582
5'-ODMTr 보호된 뉴클레오시드 3 또는 4 (6.9 mmol)를 3구 250 mL 둥근 바닥 플라스크에서 무수 톨루엔(50 mL)으로 동시 증발시킨 후 고진공하에 18시간 동안 건조하였다. 건조된 뉴클레오시드를 아르곤 분위기 하에서 건조 THF(35 mL)에 용해시켰다. 이어서, 트리에틸아민(24.4 mmol, 3.5 당량)을 반응 혼합물에 첨가한 후 약 - 10℃로 냉각시켰다. 미정제 클로로 시약의 THF 용액(1 M 용액, 2.5 당량, 17.4 mmol)을 약 5분에 걸쳐 캐뉼라를 통해 상기 혼합물에 첨가한 후, 약 1시간에 걸쳐 서서히 실온까지 가온하였다. LCMS는 출발 물질이 소모된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 진공/아르곤 하에서 조심스럽게 여과하고 생성된 여과액을 감압하에 농축하여 황색 발포체를 수득하고 이를 고진공하에 밤새 추가로 건조하였다. 미정제 혼합물을 용리액으로 에틸 아세테이트 및 헥산을 사용하여 실리카 겔 컬럼[컬럼은 아세토니트릴, 이어서 에틸 아세테이트(5% TEA)를 사용하여 사전 비활성화한 후 에틸 아세테이트-헥산을 사용하여 평형화] 크로마토그래피로 정제하였다.
입체무작위 ( Rp / Sp ) 단량체 5: 수율 86%. 뉴클레오시드 3 및 클로로 시약 2를 사용하여 일반 절차 B에 따라 반응을 수행하였다. 31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ 171.62, 155.50, 146.84, 146.17; MS (ES) C35H39N2O7PS2 [M+K]+에 대한 m/z 계산치 733.16, 실측치: 733.40 [M + K]+.
입체무작위 ( Rp / Sp ) 단량체 6: 수율 73%.뉴클레오시드 4 및 클로로 시약 2를 사용하여 일반 절차 B에 따라 반응을 수행하였다. 31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ 121.87, 106.20, 93.58, 92.99; MS (ES) C35H40N3O6PS2 [M+K]+에 대한 m/z 계산치 773.28, 실측치: 773.70 [M + K]+.
PS- PN 이량체(7 및 8)에 대한 일반 실험 절차(C):
Figure pct00583
건조 아세토니트릴(0.5 mL) 중 단량체 5 또는 6(0.10 mmol, 2 당량, 건조 아세토니트릴과 함께 동시 증발로 사전 건조하고 이를 최소 12시간 동안 진공하에 보관)의 교반 용액에 실온에서 아르곤 분위기 하에 아세토니트릴(0.2 mL) 중 2-아지도-1,3-디메틸이미다졸리늄 헥사플루오로포스페이트(0.11 mmol, 2.25 당량) 용액을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 후, 건조 아세토니트릴(0.25 mL) 중 DMTr 보호된 알코올(0.05 mmol, 건조 아세토니트릴과의 동시 증발로 사전 건조하고 최소 12시간 동안 진공하에 보관) 및 1,8-디아자바이시클로[5.4.0]운데크-7-엔(건조 아세토니트릴 중 0.23 mmol, 5 당량, 0.23 ml의 1 M 용액)을 첨가하였다. 반응을 모니터링하고 LCMS로 분석하였다. 대략적인 반응 완료 시간 10~20분.
입체무작위 이량체 7: 5를 사용하여 일반 절차 C에 따라 반응을 수행하였다. MS (ES) C67H72N7O14PS [M+K]+에 대한 m/z 계산치 1300.42, 실측치: 1300.70 [M + K]+.
입체순수 ( Rp ) 이량체 8: 6를 사용하여 일반 절차 C에 따라 반응을 수행하였다. MS (ES) C67H73N8O13PS [M+K]+에 대한 m/z 계산치 1299.44, 실측치: 1299.65 [M + K]+.
PS-PS 이량체(9 및 10)에 대한 일반 실험 절차(D):
Figure pct00584
건조 아세토니트릴(0.5 mL) 중 단량체 5 또는 6(0.10 mmol, 2 당량, 건조 아세토니트릴과 함께 동시 증발로 사전 건조하고 이를 최소 12시간 동안 진공하에 보관)의 교반 용액에 실온에서 아르곤 분위기 하에 아세토니트릴 중 5-페닐-3H-1,2,4-디티아졸-3-온(0.12 mmol, 2.5 당량, 0.2 M)의 용액을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 후, 건조 아세토니트릴(0.2 mL) 중 DMTr 보호된 알코올(0.05 mmol, 1 당량, 건조 아세토니트릴과의 동시 증발로 사전 건조하고 최소 12시간 동안 진공하에 보관) 및 1,8-디아자바이시클로[5.4.0]운데크-7-엔(건조 아세토니트릴 중 0.23 mmol, 5 당량, 1 M 용액)을 첨가하였다. 반응이 완료되면(LCMS로 모니터링) 반응 혼합물을 LCMS로 분석하였다.
이량체 9: 단량체 5를 사용하여 일반 절차 D에 따라 반응을 수행하였다. 반응 완료 시간은 약 30분. MS (ES) 62H62N4O14PS2 [M]-에 대한 m/z 계산치 1181.34, 실측치: 1181.66 [M]-.
이량체 10: 단량체 6를 사용하여 일반 절차 D에 따라 반응을 수행하였다. 반응 완료 시간은 약 20시간. MS (ES) C62H63N5O13PS2 [M]-에 대한 m/z 계산치 1180.36, 실측치: 1180.71 [M]-.
추가 유용한 화합물
Figure pct00585
Figure pct00586
Figure pct00587
MOE -G 단량체 451: 수율 81%. 31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ 175.14, 158.52, 150.30, 148.81; MS (ES) C42H50N5O9PS2 [M+H]+에 대한 m/z 계산치 864.29, 실측치: 864.56 [M + H]+.
OMe -A 단량체 452: 수율 92%. 31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ 175.65, 159.27, 151.04, 150.10; MS (ES) C43H44N5O7PS2 [M+H]+에 대한 m/z 계산치 838.25, 실측치: 838.05 [M + H]+.
OMe -U 단량체 453: 수율 94%. 31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ 175.09, 162.04, 154.12, 153.58; MS (ES) C35H39N2O8PS2 [M+K]+에 대한 m/z 계산치 749.15, 실측치: 749.06 [M + K]+.
MOE -5-Me-C 단량체 454: 수율 91%. 31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ 175.53, 162.04, 153.78, 153.61; MS (ES) C45H50N3O9PS2 [M+H]+에 대한 m/z 계산치 872.28, 실측치: 872.16 [M + H]+.
f-G 단량체 455: 수율 97%. 31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ 176.88 (d), 161.94 (d), 154.16 (d), 152.48 (d); MS (ES) C39H43FN5O7PS2 [M+H]+에 대한 m/z 계산치 808.24, 실측치: 808.65 [M + H]+.
f-A 단량체 456: 수율 99%. 31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ 177.43 (d), 159.63 (d), 149.76 (d), 149.55 (d); MS (ES) C42H41FN5O6PS2 [M+H]+에 대한 m/z 계산치 826.23, 실측치: 826.56 [M + H]+.
dA 단량체 457: 수율 98%. 31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ 171.85, 154.47, 146.19, 144.48; MS (ES) C42H42N5O6PS2 [M+K]+에 대한 m/z 계산치 846.20, 실측치: 846.56 [M + K]+.
Mor -G 단량체 458: 수율 72%. 31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ 121.26, 105.98, 93.48, 93.24; MS (ES) C39H45N6O6PS2[M+K]+에 대한 m/z 계산치 827.22, 실측치: 827.60 [M + K]+.
Mor -A 단량체 459: 수율 37%. 31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ 121.87, 106.17, 93.23, 93.05; MS (ES) C42H43N6O5PS2 [M+K]+에 대한 m/z 계산치 845.21, 실측치: 845.32 [M + K]+.
Mor -C 단량체 460: 수율 68%. 31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ 122.34, 106.05, 93.33, 92.6116; MS (ES) C41H43N4O6PS2 [M+K]+에 대한 m/z 계산치 821.20, 실측치: 821.54 [M + K]+.
입체순수 모르폴린 단량체에 대한 일반 실험 절차
Figure pct00588
5'-ODMTr 보호된 모르폴린 뉴클레오시드(11.1 mmol)를 3구 250 mL 둥근 바닥 플라스크에서 무수 톨루엔(100 mL)으로 동시 증발시킨 후 고진공하에 18시간 동안 건조하였다. 건조된 뉴클레오시드를 아르곤 분위기 하에서 건조 THF(55 mL)에 용해시켰다. 이어서, 1-메틸이미다졸(44.2 mmol, 4 당량)을 반응 혼합물에 첨가한 후 약 - 10℃로 냉각시켰다[이 단계에서, B인 경우: GiBu 클로로트리메틸실란(0.9 당량)을 첨가함]. 미정제 클로로 시약의 THF 용액(1 M 용액, 1.8 당량, 19.9 mmol)을 약 3분에 걸쳐 캐뉼라를 통해 상기 혼합물에 첨가한 후, 약 1시간에 걸쳐 서서히 실온까지 가온하였다. LCMS는 출발 물질이 소모된 것으로 나타났다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 추가로 24시간 동안 교반하였다. 이어서 진공/아르곤 하에서 조심스럽게 여과하고 생성된 여과액을 감압하에 농축하여 황색 발포체를 수득하고 이를 고진공하에 밤새 추가로 건조하였다. 미정제 혼합물을 용리액으로 에틸 아세테이트 및 헥산을 사용하여 실리카 겔 컬럼[컬럼은 아세토니트릴, 이어서 에틸 아세테이트(5% TEA)를 사용하여 사전 비활성화한 후 에틸 아세테이트-헥산을 사용하여 평형화] 크로마토그래피로 정제하였다.
입체순수 모르폴린 단량체의 구조:
Figure pct00589
Figure pct00590
Figure pct00591
입체순수 ( Rp ) Csm01 -L- MMPC 단량체 701: 수율 39%. 31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ 137.80; MS (ES) C47H51N4O7PS [M+K]+에 대한 m/z 계산치 885.29, 실측치: 885.51 [M + K]+.
입체순수 ( Sp ) Csm01 -D- MMPC 단량체 702: 수율 28%. 31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ 137.42; MS (ES) C47H51N4O7PS [M+K]+에 대한 m/z 계산치 885.29, 실측치: 885.70 [M + K]+.
입체순수 ( Rp ) Gsm01 -L- MMPC 단량체 703: 수율 37%. 31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ 136.58; MS (ES) C45H55N6O6PS [M+K]+에 대한 m/z 계산치 891.31, 실측치: 891.48 [M + K]+.
입체순수 ( Sp ) Gsm01 -D- MMPC 단량체 704: 수율 38%. 31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ 136.56; MS (ES) C45H55N6O6PS [M+K]+에 대한 m/z 계산치 891.31, 실측치: 891.67 [M + K]+.
입체순수 ( Rp ) Tsm01 -L- MMPC 단량체 705: 수율 30%. 31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ 138.52; MS (ES) C41H48N3O7PS [M+Na]+에 대한 m/z 계산치 780.28, 실측치: 780.52 [M + Na]+.
입체순수 ( Sp ) Tsm01 -D- MMPC 단량체 706: 수율 25%. 31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ 137.62; MS (ES) C41H48N3O7PS [M+Na]+에 대한 m/z 계산치 780.28, 실측치: 780.81 [M + Na]+.
약어
1X 시약:　TEA-3HF :　TEA : H2O : DMSO = 5.0 : 1.8 : 15.5 : 77.7(v/v/v/v)
ADIH: 2-아지도-1,3-디메틸이미다졸륨 헥사플루오로포스페이트
CMIMT:　N-시아노메틸이미다졸륨 트리플레이트
CPG: 제어 기공 유리
DBU: 1,8-디아자바이시클로[5.4.0]운데크-7-엔
DCM: 디클로로메탄, CH2Cl2
DIPEA: 디이소프로필에틸아민
DMSO: 디메틸설폭사이드
DMTr: 4,4'-디메톡시트리틸
GalNAc:　N-아세틸갈락토사민
HF: 불화수소
HATU:　1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트
IBN: 이소부티로니트릴
MeCN: 아세토니트릴
MeIm:　N-메틸이미다졸
TCA: 트리클로로아세트산
TEA: 트리에틸아민
XH: 잔탄 하이드라이드.
키랄- 올리고(25 mol 규모)의 합성을 위한 일반 절차:
키랄-올리고의 자동 고체상 합성은 표 46(PO 연결의 경우, 일반 아미다이트 주기), 표 47(키랄 PS 연결의 경우, DPSE 아미다이트 주기), 및 표 48(입체무작위/키랄 모폴리노 PN 연결의 경우, MBR/MMPC 아미다이트 주기 P(V)), 표 49(입체무작위 PN 연결의 경우, 일반 아미다이트 주기), 및 표 50(키랄 PN 연결의 경우, PSM 아미다이트 주기)에 표시된 주기에 따라 수행하였다.
PO 연결용 일반 아미다이트 합성 주기
단계　 작업　 시약 및 용매　 부피　 대기 시간　
1　 탈트리틸화　 3% TCA / DCM　 10 mL 65초　
2　 커플링　 0.2 M 단량체 / 20% IBN-MeCN 0.5 M CMIMT / MeCN　 0.5 mL
1.0 mL		 8분　
3　 산화　 50 mM I2 / 피리딘-H2O(9:1, v/v)　 2.0 mL 1분　
4　 cap-2　 20% Ac2O, 30% 2,6-루티딘 / MeCN 20% MeIm / MeCN　 1.0 mL
1.0 mL		 45초　
키랄 PS 연결용 DPSE 아미다이트 합성 주기
단계　 작업　 시약 및 용매　 부피　 대기 시간　
1　 탈트리틸화　 3% TCA / DCM　 10 mL　 65초　
2　 커플링　 0.2 M 단량체 / 20% IBN-MeCN 0.5 M CMIMT / MeCN　 0.5 mL　
1.0 mL　		 8분　
3　 cap-1　 20% Ac2O, 30% 2,6-루티딘 / MeCN 2.0 mL　 2분　
4　 황화　 0.2 M XH / 피리딘　 2.0 mL　 6분　
5　 cap-2　 20% Ac2O, 30% 2,6-루티딘 / MeCN 20% MeIm / MeCN　 1.0 mL　
1.0 mL　		 45초　
입체무작위/키랄 PN 연결용 MBR/MMPC 아미다이트 주기 (P(V))
단계　 작업　 시약 및 용매　 부피　 대기 시간　
1　 탈트리틸화　 3% TCA / DCM　 10 mL　 65초　
2　 커플링　 0.2 M 단량체 / 20% IBN-MeCN 1.0 M DBU / MeCN　 0.5 mL　
1.0 mL　		 10분　
3　 cap-2　 20% Ac2O, 30% 2,6-루티딘 / MeCN 20% MeIm / MeCN　 1.0 mL　
1.0 mL　		 45초　
입체무작위 PN 연결용 일반 아미다이트 합성 주기
단계　 작업　 시약 및 용매　 부피　 대기 시간　
1　 탈트리틸화　 3% TCA / DCM　 10 mL　 65초　
2　 커플링　 0.2 M 단량체 / 20% IBN-MeCN 0.5 M CMIMT / MeCN　 0.5 mL　
1.0 mL　		 8분　
3　 이미드화　 0.5 M ADIH / MeCN　 2.0 mL　 6분　
4　 cap-2　 20% Ac2O, 30% 2,6-루티딘 / MeCN 20% MeIm / MeCN　 1.0 mL　
1.0 mL　		 45초　
키랄 PN 연결용 PSM 아미다이트 합성 주기
단계　 작업　 시약 및 용매　 부피　 대기 시간　
1　 탈트리틸화　 3% TCA / DCM　 10 mL　 65초　
2　 커플링　 0.2 M 단량체 / 20% IBN-MeCN 0.5 M CMIMT / MeCN　 0.5 mL　
1.0 mL　		 8분　
3　 cap-1　 20% Ac2O, 30% 2,6-루티딘 / MeCN　 2.0 mL　 2분　
4　 이미드화　 0.5 M 아지드 시약/MeCN　 2.0 mL　 6분　
5　 cap-2　 20% Ac2O, 30% 2,6-루티딘 / MeCN 20% MeIm / MeCN　 1.0 mL　
1.0 mL　		 45초　
C&D 조건( 25 mmol 규모)에 대한 일반 절차:
합성이 완료된 후 CPG 고체 지지체를 건조하고 50 mL 플라스틱 튜브로 옮겼다.　CPG를 28℃에서 3시간 동안 1X 시약(2.5 mL, 100 mL/umol)으로 처리한 후 진한 NH3(5.0 mL; 200 mL/umol)을 45℃에서 16시간 동안 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각하고 CPG를 막 여과로 분리하고 H2O 15 mL로 세척하였다.　미정제 물질(여과액)을 LTQ 및 RP-UPLC로 분석하였다.
GalNAc 접합 조건( 1 mmol 규모)에 대한 일반 절차:
플라스틱 튜브에 tri-GalNAc(2.0 당량), HATU(1.9 당량), 및 DIPEA(10 당량)를 무수 MeCN(0.5 mL)에 용해시켰다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반한 후 혼합물을 H2O(1 mL)의 아미노-올리고(1 mmol)에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응은 LC-MS 및 RP-UPLC로 모니터링하였다. 반응이 완료된 후 생성된 GalNAc 접합 올리고를 37℃에서 1시간 동안 진한 NH3 (2 mL)로 처리하였다. 용액을 진공하에 농축하여 MeCN 및 진한 NH3을 제거하였다.　이어서 잔류물을 역상 정제를 위해 H2O(10 mL)에 용해시켰다.
올리고 MS 데이터
올리고-ID　 계산치 [M]　 실측치 [M]　
WV-20170 7595.9 7595.5
WV-41918　 7691.1　 7690.7　
WV-38708　 7881.4　 7879.6　
WV-44144　 7850.4　 7850.6　
WV-44145　 7850.4　 7851.2　
WV-44163　 7719.2　 7719.7　
WV-44353　 7660.1　 7658.8　
WV-44354　 7660.1　 7660.3　
WV-44355　 7528.9　 7528.4　
실시예 15. 올리고뉴클레오티드 조성물의 제조.
올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 조성물(입체무작위 및 키랄 제어 둘 다)을 제조하기 위한 다양한 기술은 예를 들어, US 9982257, US 20170037399, US 20180216108, US 20180216107, US 9598458, WO 2017/062862, WO 2018/067973, WO 2017/160741, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/098264, WO 2018/223056, WO 2018/237194, WO 2019/032607, WO 2019/055951, WO 2019/075357, WO 2019/200185, WO 2019/217784, WO 2019/032612, WO 2020/191252, 및/또는 WO 2021/071858에 기재된 방법 및 시약을 포함하여, 알려져 있고 본 발명에 따라 사용될 수 있고, 각각의 방법 및 시약은 본원에 참조로 포함된다. 많은 올리고뉴클레오티드 및 이의 조성물, 예를 들어 표 1의 다양한 올리고뉴클레오티드 및 이의 조성물을 제조하고 평가하였다.
유용한 특정 사이클은 올리고뉴클레오티드 제조를 위한 예로서 아래에 기술하였다.
Figure pct00592
Figure pct00593
Figure pct00594
각각의 B는 독립적으로 본원에 기재된 BA(예를 들어, A, C, G, T, U 등)와 같은 핵염기이다. 각각의 BPRO는 독립적으로 본원에 기재된 BA(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 합성에 적합한 Abz, Cac, Gibu, T, U 등)와 같은 임의로 보호된 핵염기이다. 제시된 바와 같이, 고체 지지체 상의 것들을 포함하여 뉴클레오시드 또는 올리고뉴클레오티드에 단량체를 연결하기 위해 다양한 연결이 구성될 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 이러한 사이클은 다양한 다른 유형의 당의 -OH에 단량체를 커플링하는데 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 하나 이상의 DPSE 및/또는 PSM 주기를 포함한다.
실시예 16. PN에 대한 2'F 위치의 영향
마우스 TTR siRNA 활성의 생체내 측정: 모든 동물 절차는 Alpha Preclinical(North Grafton, MA)의 IACUC 지침에 따라 수행하였다. 제공된 올리고뉴클레오티드 및 조성물의 지속성을 평가하기 위해, 8~10주령의 수컷 C57BL/6 마우스에 제1일에 원하는 올리고뉴클레오티드 농도로 1.5 mg/kg의 용량을 피하 투여로 투여하였다. 제1일(투여 전) 및 이어서 매주, 전혈을 테일 스닙으로 혈청 분리기 튜브로 수집하고 처리된 혈청 샘플을 -70℃에서 보관하였다. 혈청 내 마우스 TTR 단백질 농도를 Mouse Prealbumin ELISA 키트(Crystal Chem)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 평가하였다.
PBS
일차 동물 1 동물 2 동물 3 동물 4 동물 5 평균
1 90 111 100 103 95 100
8 91 112 102 113 82 100
15 102 99 112 100 86 100
22 101 101 98 103 96 100
WV-41826/WV-41828, 1.5 mg/kg
일차 동물 6 동물 7 동물 8 동물 9 동물 10 평균
1 111 86 77 117 144 107
8 1 2 4 4 4 3
15 2 4 4 8 6 5
22 6 9 11 5 8 8
WV-43775/WV-42080, 1.5 mg/kg
일차 동물 11 동물 12 동물 13 동물 14 동물 15 평균
1 113 104 122 86 90 103
8 4 0 0 0 0 1
15 8 1 2 1 2 3
22 12 5 8 6 6 8
WV-42079/WV-42080, 1.5 mg/kg
일차 동물 16 동물 17 동물 18 동물 19 동물 20 평균
1 83 123 127 118 74 105
8 0 5 1 3 2 2
15 2 7 2 6 4 4
22 11 9 8 8 8 9
WV-43771/WV-42080, 1.5 mg/kg
일차 동물 21 동물 22 동물 23 동물 24 동물 25 평균
1 107 67 104 73 93 89
8 3 0 2 0 0 1
15 6 3 4 2 1 3
22 1 10 7 5 6 6
WV-43773/WV-42080, 1.5 mg/kg
일차 동물 26 동물 27 동물 28 동물 29 동물 30 평균
1 126 108 107 98 94 107
8 5 5 6 4 6 5
15 7 5 7 8 4 6
22 15 13 13 10 9 12
WV-43988/WV-42080, 1.5 mg/kg
일차 동물 31 동물 32 동물 33 동물 34 동물 35 평균
1 104 101 105 126 120 111
8 0 1 3 1 5 2
15 1 1 2 1 1 1
22 4 4 5 4 7 5
WV-43989/WV-42080, 1.5 mg/kg
일차 동물 36 동물 37 동물 38 동물 39 동물 40 평균
1 64 118 89 108 101 96
8 4 4 1 12 3 5
15 5 4 1 11 6 6
22 10 8 7 24 15 13
WV-43994/WV-42080, 1.5 mg/kg
일차 동물 41 동물 42 동물 43 동물 44 동물 45 평균
1 141 124 104 124 113 121
8 3 3 2 2 4 3
15 3 2 2 3 7 3
22 8 11 8 8 8 8
WV-43996/WV-42080, 1.5 mg/kg
일차 동물 46 동물 47 동물 48 동물 49 동물 50 평균
1 106 71 89 110 118 99
8 2 4 2 1 1 2
15 2 2 2 2 1 2
22 3 4 6 5 7 5
WV-43256/WV-42080, 1.5 mg/kg
일차 동물 51 동물 52 동물 53 동물 54 동물 55 평균
1 92 97 N,D. 104 101 99
8 4 6 2 3 9 5
15 9 9 6 6 8 7
22 21 22 15 14 21 18
실시예 17. 5'-PO( OEt ) 2 비닐 포스포네이트 -dT(WV- NU - 017)의 합성.
Figure pct00595
일반 반응식
Figure pct00596
1. 화합물 2의 제조
Figure pct00597
2개의 배치: DCM(2 L) 중 화합물 1(150 g, 275.43 mmol) 및 이미다졸(56.25 g, 826.30 mmol)의 용액에 TBSCl(83.03 g, 550.87 mmol, 67.50 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 15℃에서 16시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 1이 소모된 것으로 나타났다. 2개의 배치: 혼합물을 포화 NaHCO3(수성, 2 L * 2)으로 세척하고, 합한 수성층을 EtOAc(500 mL * 2)로 추출하고, 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 농축하여 미정제 화합물 2(362 g, 미정제)를 황색 오일로서 수득하였다.
TLC(석유 에테르 / 에틸 아세테이트 = 1: 1, 5%TEA) Rf = 0.39.
2. 화합물 3의 제조
Figure pct00598
H2O(360 mL) 및 CH3COOH(1440 mL) 중 화합물 2(362 g, 549.44 mmol)의 용액, 혼합물을 15℃에서 16시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 2가 소모된 것으로 나타났다. 혼합물에 포화 NaHCO3(수성, 3000 mL)을 첨가하고 유기층을 분리하고 수성층을 EtOAc(2000 mL * 3)로 추출하고 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고 여과하고 농축하여 미정제물을 수득하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르: 에틸 아세테이트= 30: 1 내지1: 2)로 정제하여 화합물 3(185 g, 94.45% 수율)를 흰색 고체로서 수득하였다.
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트= 1: 1) Rf = 0.24.
3. 화합물 4의 제조
Figure pct00599
DCM(500 mL) 중 화합물 3(110 g, 308.57 mmol)의 용액에 DMP(157.05 g, 370.28 mmol, 114.64 mL)을 0℃에서 조금씩 첨가하였다. 상기 혼합물을 30℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 3이 소모되었고, 새로운 스폿이 관찰된 것으로 나타났다. 2개의 배치: 혼합물에 0℃에서 5% Na2S2O3(2000 mL)를 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 20분 동안 교반한 후 포화 NaHCO3(2000 L)를 첨가하고 혼합물을 DCM(2000 L * 4) 및 에틸 아세테이트(2000 L * 4)로 추출하고 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고 여과하고 농축하여 화합물 4(190 g, 미정제)를 백색 고체로서 수득하였다.
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 1:3) Rf = 0.36.
4. 화합물 5의 제조
Figure pct00600
THF(400 L) 중 화합물 4A(216.28 g, 750.41 mmol)의 용액에 0℃에서 t-BuOK(1 M, 750 mL)를 첨가하고 0℃에서 10분 동안 교반한 후, 2시간 동안 20℃까지 가온하였다. 상기 혼합물을 THF(400 mL) 중 화합물 4(190 g, 536.01 mmol)의 용액에 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반한 후 6시간 동안 20℃까지 가온하였다. TLC는 반응이 완료된 것으로 나타났다. 반응 혼합물에 물(1000 mL)을 첨가하고 2상 혼합물을 EtOAc(2000 mL * 4) 및 DCM(1000 mL * 3)으로 추출하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조하고 여과하고 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 10:1 1:1, 0:1)로 정제하여 화합물 5(250 g, 미정제)를 황색 오일로서 수득하였다.
TLC(석유 에테르 / 에틸 아세테이트 = 1: 2), Rf = 0.32.
5. WV- NU -017의 제조
Figure pct00601
THF(1300 mL) 중 화합물 5(243 g, 497.35 mmol)의 용액에 TEA.3HF(320.71 g, 1.99mol, 324.28 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 15℃에서 16시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에테르: (에틸 아세테이트: 에틸 알코올=3:1) = 1: 1, Rf = 0.18)는 일부 화합물 5가 남아 있는 것으로 나타났다. 또한 새로운 스폿이 검출되었다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하고 pH가 7이 될 때까지 혼합물을 Na2CO3(수성, 포화, 약 1 L)로 중화시켰다. 혼합물을 감압하에 농축하여 대부분의 물을 제거하였다. EtOAc: EtOH = 10:1 (1 L * 2)을 농축된 반응 혼합물에 첨가하고, 이어서 이를 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, (에틸 아세테이트: 에틸 알코올 = 3: 1) / 석유 에테르 = 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%)로 정제하여 화합물 WV- NU -017(76 g, 38.51% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, CDCl3) δ = 9.59 (br s, 1H), 7.13 (d, J=1.1 Hz, 1H), 7.09 - 6.94 (m, 1H), 6.41 (t, J=6.6 Hz, 1H), 6.03 (ddd, J=1.8, 17.4, 19.6 Hz, 1H), 4.76 (br d, J=4.0 Hz, 1H), 4.50 (br d, J=2.4 Hz, 1H), 4.39 (br d, J=2.0 Hz, 1H), 4.21 - 4.00 (m, 4H), 2.43 (ddd, J=4.5, 6.3, 13.8 Hz, 1H), 2.18 (td, J=6.9, 13.8 Hz, 1H), 2.02 - 1.86 (m, 3H), 1.38 - 1.30 (m, 6H).
31 P NMR (162MHz, CDCl3) δ = 17.71.
13 C NMR (101MHz, CDCl3) δ = 163.76, 150.63, 149.04, 135.29, 118.47, 116.58, 111.67, 85.87, 85.65, 85.07, 73.91, 62.23, 39.15, 16.38, 12.66.
LCMS (M-H+): 373.1, 순도: 94.34%.
TLC(석유 에테르: (에틸 아세테이트: 에틸 알코올 = 3 : 1) = 1 : 1) Rf = 0.18;
실시예 18. 5'-PO( OMe ) 2 비닐 포스포네이트 -dT(WV- NU -010) 및 5'-PO 비닐 포 스포네이트-3'-CNE-dT 포스포아미다이트(WV-NU-10-CNE)의 합성
Figure pct00602
일반 반응식
Figure pct00603
2. 화합물 2의 제조
Figure pct00604
DCM(1.00 L) 중의 화합물 1(100.00 g, 183.62 mmol) 및 이미다졸(37.50 g, 550.86 mmol)의 용액에 TBSCl(55.35 g, 367.24 mmol)을 0℃에서 첨가하고 혼합물을 18℃에서 14시간 동안 교반하였다. TLC는 출발 물질이 소모된 것으로 나타났다. 혼합물을 포화 NaHCO3(200 mL) 및 염수(100 mL)로 세척하고 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 농축시켜 화합물 2를 백색 고체(120.98 g, 미정제)로서 수득하였다. 혼합물을 추가 정제 없이 다음 단계에 직접 사용하였다.
TLC(에틸 아세테이트: 석유 에테르 = 3:1, 5% TEA) Rf = 0.43.
2. 화합물 3 및 화합물 3A의 제조
Figure pct00605
DCM(1.20 L) 중 TFA(41.85 g, 367.00 mmol) 및 Et3SiH(64.01 g, 550.50 mmol)의 용액에 DCM(200.00 mL)에 용해된 화합물 2(120.9 g, 183.50 mmol)를 첨가하고 혼합물을 15℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. TLC는 출발 물질이 소모된 것으로 나타났다. 혼합물에 포화 NaHCO3(수성, 300 mL)를 첨가하고 유기상을 분리하고 수성층을 DCM(200 mL * 3)으로 추출하고 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고 여과하고 농축하여 미정제물을 수득하였다. 미정제 생성물을 MPLC(석유 에테르 /에틸 아세테이트 = 10:1 to 1:2)로 정제하여 화합물 3을 흰색 고체(36 g, 55.04% 수율)로서, 화합물 3A를 흰색 고체(50 g, 미정제)로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, CDCl3 ) δ = 9.08 (s, 1H), 6.04 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 4.37 (td, J = 3.5, 6.5 Hz, 1H), 3.84 - 3.74 (m, 2H), 3.67 - 3.58 (m, 1H), 2.22 (td, J = 6.8, 13.4 Hz, 1H), 2.13 - 2.03 (m, 1H), 1.78 (s, 3H), 0.81 - 0.77 (m, 3H), 0.77 (s, 9H), -0.04 (s, 6H);
TLC(석유 에테르 / 에틸 아세테이트 = 1:1) Rf = 0.24.
3. 화합물 3의 제조
Figure pct00606
HOAc(210.00 g, 3.50 mol)와 H2O(50mL)의 혼합물 중 화합물 3A(50 g, 106.21 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 18℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. TLC는 출발 물질이 소모된 것으로 나타났다. Na2CO3(수성)을 PH 8이 넘을 때까지 반응 혼합물에 첨가하고, 잔류물을 EtOAc(200 mL*3)로 추출하였다. 혼합물을 MPLC(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10:1, 1:1)로 정제하여 화합물 3을 흰색 고체(30 g, 79.23% 수율)로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, CDCl3 ) δ = 8.98 (br s, 1H), 7.38 (s, 1H), 6.15 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 4.50 (td, J = 3.5, 6.6 Hz, 1H), 3.96 - 3.88 (m, 2H), 3.81 - 3.67 (m, 1H), 2.81 - 2.69 (m, 1H), 2.39 - 2.17 (m, 2H), 1.91 (s, 3H), 0.99 - 0.84 (m, 9H), 0.09 (s, 6H).
4. 화합물 4의 제조
Figure pct00607
DCM(160 mL) 중 화합물 3(10 g, 28.05 mmol)의 용액에 DMP(14.28 g, 33.66 mmol, 10.42 mL)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 0~25℃에서 3시간 동안 교반하였다. 이 경우, TLC는 대부분의 출발 물질이 소모되었고 새로운 스폿이 관찰된 것으로 나타났다. 이어서 5% Na2S2O3(300 mL) 용액을 0℃에서 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 20분 동안 교반하였다. 이어서 포화 NaHCO3(300 mL)를 첨가하고, 혼합물을 DCM(200 mL*3)으로 추출하고, 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 화합물 4를 황색 오일(10 g, 미생물)로서 수득하였다. 혼합물을 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
TLC(석유 에테르 / 에틸 아세테이트 = 1:1) Rf = 0.38.
5. 화합물 5의 제조
Figure pct00608
THF(20 mL) 중 화합물 4A(7.20 g, 31.03 mmol)의 용액에 0℃에서 t-BuOK(1 M, 31.03 mL)를 첨가하고 0℃에서 10분 동안 교반한 후, 30분 동안 20℃까지 가온하였다. 상기 혼합물을 THF(20 mL) 중 화합물 4(10 g, 28.21 mmol)의 용액에 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반한 후 20분 동안 20℃까지 가온하였다. LCMS 및 TLC는 반응이 완료된 것으로 나타났다. 물(20 mL)을 반응물에 첨가하고 2상 혼합물을 EtOAc(30 mL*4)로 추출하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조하고 여과하고 농축하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 MPLC(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10:1 내지 1:4)로 정제하여 화합물 5를 흰색 고체(12 g, 92.36% 수율)로서 수득하였다. 미정제물 10g의 혼합물을 생성물과 함께 정제하였다.
1 H NMR (400MHz, CDCl3 ) δ = 8.82 (br s, 1H), 7.09 (s, 1H), 6.94 - 6.78 (m, 1H), 6.33 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 5.99 (ddd, J = 1.6, 17.4, 19.2 Hz, 1H), 4.41 - 4.24 (m, 2H), 3.76 (dd, J = 3.8, 11.1 Hz, 5H), 2.33 - 2.23 (m, 1H), 2.13 (td, J = 6.8, 13.6 Hz, 1H), 1.96 - 1.89 (m, 3H), 0.94 - 0.80 (m, 10H), 0.14 - 0.03 (m, 6H);
TLC(디클로로메탄: 메탄올 = 20:1) Rf = 0.36.
6. WV- NU -010의 제조
Figure pct00609
THF(80 mL) 중 화합물 5(13 g, 28.23 mmol)의 용액에 N,N-디에틸에탄아민;트리하이드로플루오라이드(22.75 g, 141.14 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 18℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC는 출발 물질의 일부가 여전히 존재하고 목적하는 물질이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하고 pH가 7이 될 때까지 혼합물을 Na2CO3(수성, 포화)로 중화시켰다. 수상을 동결 건조시켰다. 동결 건조 고체를 DCM: MeOH = 10:1(300 mL*2)로 세척하였다. 유기상을 농축시켰다. 수득된 잔류물을 실리카겔 상의 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄: 메탄올 = 100:1, 100:8)로 정제하여 WV- NU -010을 백색 고체(6.25 g, 62.54% 수율)로서 수득하였다. 혼합물을 다른 배치(8 g 규모)로 정제하였다. 총 10 g의 WV- NU -010을 흰색 고체로서 단리하였다.
1 H NMR :( 400MHz, CDCl3 ) δ = 9.54 (br s, 1H), 7.13 - 6.98 (m, 2H), 6.39 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 6.06 - 5.96 (m, 1H), 4.61 (br d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.50 (br d, J = 2.4 Hz, 1H), 4.44 - 4.36 (m, 1H), 3.79 - 3.71 (m, 6H), 2.43 (ddd, J = 4.5, 6.4, 13.8 Hz, 1H), 2.21 (td, J = 6.9, 13.7 Hz, 1H), 1.93 (s, 3H);
31 PNMR : (162MHz, CDCl3 ): δ = 20.54 (s, 1P);
LCMS : (M+H+): 347.0 LCMS 순도: 97.81%;
13 CNMR :　(101MHz, CDCl3) δ = 163.95, 150.75, 150.12, 150.06, 135.38, 116.99, 115.10, 111.65, 85.82, 85.61, 85.14, 73.93, 52.69, 39.00, 12.61;
HPLC : HPLC 순도: 98.25%;
TLC (디클로로메탄 / 메탄올) Rf = 0.24.
7. WV- NU -10- CNE - 포스포아미다이트의 제조
Figure pct00610
WV- NU -010(4.9 g, 14.15 mmol)을 무수 톨루엔으로 2번(25 mLx2) 동시 증발하고 고진공하에 1시간 동안 건조하였다.
DMF(35 mL) 중 WV- NU -010(4.9 g, 14.15 mmol) 용액에 5-에틸설파닐-2H-테트라졸(1.84 g, 14.15 mmol), 1-메틸이미다졸(2.32 g, 28.30 mmol), 및 화합물 1A(6.40 g, 21.23 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 N2 하에서 1시간 동안 교반하였다. TLC는 출발 물질이 소모되었고 목적하는 물질이 관찰된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 EtOAc(60 mL)로 희석하였다. 반응 혼합물을 수성 포화 NaHCO3 용액(50 mL*4)으로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축하였다. 컬럼을 석유 에테르/에틸 아세테이트(5%TEA 10분)에 이어서 석유 에테르(5분)로 용리하였다. 이렇게 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(석유 에테르: EtOAc = 10:1, 1:1 및 이어서 EtOAc/아세토니트릴 = 50:1, 30:1)로 정제하여 WV- NU -10- CNE - 포스포아미다이트를 백색 고체(4.4 g, 54.14% 수율)로서 수득하였다.
1 H NMR: (400MHz, CDCl3 ) δ = 8.96 (br s, 1H), 7.08 (s, 1H), 7.03 - 6.81 (m, 1H), 6.42 - 6.33 (m, 1H), 6.01 (dddd, J = 1.8, 8.7, 17.3, 19.3 Hz, 1H), 4.58 - 4.38 (m, 2H), 3.94 - 3.81 (m, 1H), 3.80 - 3.70 (m, 7H), 3.68 - 3.53 (m, 2H), 2.81 - 2.71 (m, 1H), 2.71 - 2.61 (m, 2H), 2.54 - 2.39 (m, 1H), 2.23 (dtd, J = 5.0, 6.8, 13.8 Hz, 1H), 1.93 (s, 3H), 1.22 - 1.15 (m, 12H);
31 PNMR : (162MHz, CDCl3 ) δ = 149.34 (s, 1P), 149.32 (s, 1P), 20.04 (s, 1P), 19.68 (s, 1P), 14.12 (s, 1P);
LCMS : (M-H+): 545.1, LCMS 순도: 93.80%;
13 CNMR :　(101MHz, CDCl3 ) δ = 163.84, 163.82, 150.58, 150.51, 148.58, 135.10, 135.02, 129.31, 118.68, 118.19, 117.80, 117.65, 116.79, 116.31, 111.73, 84.78, 84.74, 84.61, 84.53, 84.49, 84.39, 84.32, 75.66, 60.34, 58.05, 52.60, 52.54, 52.50, 52.47, 43.31, 38.42, 38.37, 24.59, 24.48, 24.45, 24.53, 20.45, 20.37, 20.36, 20.28, 14.16, 12.50, 12.48;
HPLC : HPLC 순도: 95.15%;
TLC (디클로로메탄 / 메탄올) Rf = 0.06.
실시예 19. 5'-(R)-Me-PO( OMe ) 2 - 포스포네이트 -dT(WV- NU -128) 및 5'-(R)-Me-PO(OMe) 2 -포스포네이트-3'-CNE-dT 포스포아미다이트(WV-NU-128-CNE)의 합성
Figure pct00611
일반 반응식
Figure pct00612
1. 화합물 12의 제조
Figure pct00613
THF(360 mL) 중 NaH(4.78 g, 119.40 mmol, 60% 순도)의 용액에 THF(200 mL) 중 비스(디메톡시포스포릴)메탄(46.19 g, 119.40 mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 20℃까지 가온하고, 1시간 동안 교반하였다. THF(200 mL) 중 LiBr(10.37 g, 119.40 mmol)의 용액을 첨가하고 생성된 슬러리를 교반한 후 0℃까지 냉각시켰다. 상기 혼합물에 THF(200 mL) 중 화합물 7(20 g, 54.27 mmol)의 용액을 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 0~20℃에서 11시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 7이 소모되었고, 2개의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 생성된 혼합물을 물(300 mL)로 희석하고 EtOAc(300 mL*3)로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 농축하여 황색 오일을 수득하였다. 미정제 화합물 12(25 g, 미정제)를 황색 오일로서 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/10 내지 0/1, 이어서 에틸 아세테이트/메탄올 = 10/1)로 정제하였다. 화합물 12(6.1 g, 24.40% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다.
LCMS : M+H+=475.2
TLC: (에틸 아세테이트: 석유 에테르 = 3:1), Rf = 0.20
2. 화합물 13의 제조
Figure pct00614
THF(61 mL) 중 화합물 12(6.1 g, 12.85 mmol)의 용액에 3HF.TEA(8.29 g, 51.42 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 12가 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 포화 수성 NaHCO3 (60 mL) 및 NaHCO3 고체를 pH 7~8까지 ??칭하고 20분 동안 교반하였다. 혼합물을 Na2SO4 건조하고 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 화합물 13(4.4 g, 미정제)을 황색 오일로서 수득하였다.
TLC: (석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 0:1) Rf = 0
3. 화합물 WV- NU -128의 제조
Figure pct00615
MeOH(220 mL) 중 화합물 13(5 g, 13.88 mmol)의 용액에 Josiphos SL-J216-1(425 mg, 1.39 mmol) (1Z,5Z)-시클로옥타-1,5-디엔;로듐( 1+); 테트라플루오로보레이트(230 mg) 및 아연; 트리플루오로메탄설포네이트(2.06 g, 5.55 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 H2(50 psi), 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. LCMS는 화합물 13이 소모되었고 목적하는 주 피크인 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 용매를 제거하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 0/1, 이어서 에틸 아세테이트/메탄올 = 10: 1)로 정제하였다. 미정제 화합물 WV- NU -128(4 g, 79.55% 수율)을 황색 고체로서 수득하였다.
LCMS : M+H+ = 363.2
TLC: (에틸 아세테이트: 메탄올 = 10:1), Rf = 0.36.
4. 화합물 WV-RA-128- CNE의 제조
Figure pct00616
DMF(28 mL) 중 화합물 WV- NU -128(4 g, 11.04 mmol) 용액에 5-에틸설파닐-2H-테트라졸(1.44 g, 11.04 mmol) 및 1-메틸이미다졸(1.81 g, 22.08 mmol)을 첨가하고, 이어서 3-비스(디이소프로필아미노)포스파닐옥시프로판니트릴(4.99 g, 16.56 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 WV-NU-128이 소모되었고, 2개의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 포화 수성 NaHCO3 (50 mL)을 0℃에서 반응 혼합물에 첨가하였다. 이어서 반응 혼합물을 EtOAc(20 mL)로 희석하고, EtOAc(20 mL * 3)로 추출하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 0/1, 이어서 에틸 아세테이트/아세토니트릴 = 10/1, 5% TEA)로 정제하였다. 화합물 WV-RA-128- CNE(2.5 g, 40.25% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
1 H NMR ( 400 MHz , CDCl3 ) δ = 7.11 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 6.29 - 6.15 (m, 1H), 4.44 - 4.29 (m, 1H), 3.93 - 3.79 (m,2H), 3.75 (dd, J = 5.9, 10.8 Hz, 7H), 3.63 (br d, J = 2.5 Hz, 2H), 2.74 - 2.60 (m, 2H), 2.53 - 2.36 (m, 1H), 2.34 - 2.21 (m, 1H),
2.19 - 2.06 (m, 2H), 1.93 (s, 3H), 1.78 - 1.61 (m, 1H), 1.21 - 1.09 (m, 15H)
13 C NMR ( 101 MHz , CDCl3 ) δ = 163.54, 135.21, 135.05, 111.51, 83.59, 83.50, 77.36, 77.05, 76.72, 52.35, 52.32,43.34 (dd, J = 7.3, 12.5 Hz, 1C), 30.82, 29.10, 24.66, 24.63, 24.59, 24.50 (dd, J = 2.9, 8.1 Hz, 1C), 16.21, 12.60
LCMS: M-H+ = 561.2, 순도 93.7%
TLC: (에틸 아세테이트: 메탄올 = 8:1) Rf = 0.45
실시예 20. 5'-Me-PO( OEt ) 2 - 비닐포스포네이트 -dT(WV- NU - 038)의 합성.
Figure pct00617
일반 반응식
Figure pct00618
1. 화합물 2의 제조
Figure pct00619
ACN(60 mL)과 H2O(60 mL)의 혼합물 중 화합물 1(15 g, 42.08 mmol)의 용액에 PhI(OAc)2(29.82 g, 92.57 mmol) 및 TEMPO(1.32 g, 8.42 mmol)를 20℃에서 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 완료된 것으로 나타났다. 생성된 혼합물을 농축 건조하여 잔류물을 수득하고, 이를 ACN(100 mL)으로 분쇄하고, 여과하고, 필터 케이크를 ACN(50 mL)으로 헹구고 건조하여 화합물 2(10.6 g, 68.00% 수율)를 흰색 고체로서 수득하였다. 합한 여과액을 감압하에 농축하고 건조하여 또 다른 부분의 미정제 생성물(7.4 g)을 수득하였다.
TLC(에틸 아세테이트 /석유 에테르 = 1:1) Rf = 0.01.
2. 화합물 3의 제조
Figure pct00620
DCM(70 mL) 중 화합물 2(7.4 g, 19.97 mmol)의 용액에 DIEA(5.16 g, 39.95 mmol, 6.96 mL) 및 피발로일 클로라이드(3.13 g, 25.97 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 -10~0℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 거의 완료된 것으로 나타났다. DCM 중 화합물 3의 미정제 갈색 용액(9.08 g, 100.00% 수율)을 다음 단계에 직접 사용하였다.
TLC(에틸 아세테이트 / 석유 에테르 = 1:1) Rf = 0.28.
3. 화합물 4의 제조
Figure pct00621
최종 단계로부터의 DCM 중 화합물 3(9.08 g, 19.97 mmol)의 미정제 용액에 TEA(6.06 g, 59.92 mmol)에 이어서 N-메톡시메탄아민; 염산염(5.85 g, 59.92 mmol) 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 거의 완료된 것으로 나타났다. 생성된 혼합물을 HCl(1 N, 60 mL*2)로 세척한 후 수성 NaHCO3(50 mL*2)로 세척하였다. 합한 유기층을 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 생성물을 미정제 갈색 고체(10 g)로서 수득하였다. 미정제 생성물을 실리카겔 상의 컬럼 크로마토그래피(석유 에테르: 에틸 아세테이트, 10%~60%)로 정제하였다. 화합물 4(2.7 g, 6.53 mmol, 32.69% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다.
TLC(석유 에테르 / 에틸 아세테이트 = 1:1) Rf = 0.43.
4. 화합물 5의 제조
Figure pct00622
THF(170 mL) 중 화합물 4(17.2 g, 41.59 mmol)의 용액에 MeMgBr(3 M, 27.73 mL)을 0℃에서 첨가하였다. 상기 혼합물을 0℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 완료된 것으로 나타났다. 생성된 혼합물을 교반 하에 포화 수성 NH4Cl (300 mL)에 붓고 EtOAc(100 mL*3)로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 농축하여 연황색 검을 수득하였다. 미정제 생성물을 실리카겔 상의 컬럼 크로마토그래피(석유 에테르: 에틸 아세테이트= 8: 1, 4: 1, 2: 1)로 정제하였다. 화합물 5(10.9 g, 67.14% 수율, 순도: 94.4% 초과)를 백색 고체로서 수득하였다.
HNMR (400MHz, CDCl3 ) Shift = 8.76 (br s, 1H), 7.95 (s, 1H), 6.41 (dd, J=5.7, 7.9 Hz, 1H), 4.55 - 4.41 (m, 2H), 2.33 - 2.21 (m, 4H), 2.03 - 1.87 (m, 4H), 0.92 (s, 9H), 0.14 (d, J=3.5 Hz, 6H)
LCMS (M+H+) 369.3;
TLC (석유 에테르/EtOAc = 1:1, 2회) Rf = 0.63.
5. 화합물 6의 제조
Figure pct00623
THF(100 mL) 중 NaH(4.78 g, 119.40 mmol, 60% 순도)의 현탁액에 THF(100 mL) 중 화합물 5A(34.41 g, 119.40 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 20℃까지 가온하고, 1시간 동안 교반하였다. THF(100 mL) 중 LiBr(10.37 g, 119.40 mmol)의 용액을 첨가하고 생성된 슬러리를 교반한 후 0℃까지 냉각시켰다. 상기 혼합물에 THF(100 mL) 중 화합물 5(20 g 미정제, 54.27 mmol)의 용액을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반한 후 20℃까지 가온하고 20℃에서 64시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 5가 남아 있고, 하나의 주 스폿이 검출된 것으로 나타났다. 생성된 혼합물을 물(400 mL)로 희석하고 EtOAc(400 mL*3)로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 농축하여 황색 오일을 수득하였다. 잔류물을 플래시 실리카겔 크로마토그래피로 정제하였다(ISCO®; 220 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, 100 mL/분의 0~50% 에틸 아세테이트/석유 에테르 구배의 용리제). 화합물 6(6.7 g, 21.69% 수율, 88.3% 순도)을 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS : (M+H+):503.1;
TLC(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1:3) Rf = 0.11.
6. 화합물 WV- NU -038의 제조
Figure pct00624
THF(64 mL) 중 화합물 6(6.4 g, 12.73 mmol)의 용액에 TEA.3HF(8.38 g, 50.93 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 15℃에서 12시간 동안 교반하였다. LCMS는 화합물 6의 일부가 남아 있고, 목적하는 질량을 갖는 하나의 주 피크가 검출된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 NaHCO3(수성, 포화, 64 mL)를 첨가하여 ??칭하고, 이어서 에틸 아세테이트(70 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래시 실리카겔 크로마토그래피로 정제하였다(ISCO®; 80 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, 100 mL/분의 0~60% 에틸 아세테이트/석유 에테르 구배의 용리제). 화합물 WV- NU -038(2.85 g, 56.35% 수율, 97.78% 순도)을 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ = 9.61 (s, 1H), 7.14 (s, 1H), 6.36 (t, J=6.8 Hz, 1H), 5.78 (d, J=17.9 Hz, 1H), 4.56 (br s, 1H), 4.36 (br s, 1H), 4.26 (br d, J=4.0 Hz, 1H), 4.13 - 3.96 (m, 4H), 2.36 (ddd, J=4.0, 6.3, 13.7 Hz, 1H), 2.25 - 2.12 (m, 4H), 1.92 (s, 3H), 1.38 - 1.28 (m, 7H)).
13C NMR (101MHz CDCl3,) δ = 163.77, 158.00, 157.92, 150.70, 135.49, 112.27, 111.75, 88.91, 88.69, 84.46, 73.57, 61.81, 61.65, 39.18, 16.61, 16.54, 16.41, 16.35, 16.30, 12.63).
31P NMR (162MHz, CDCl3) δ = 17.63 (s, 1P).
LCMS : (M+H+) = 389.1; LCMS 순도: 99.2%.
실시예 21. 5'-(R)-Me-PO( OEt ) 2 -dT(WV- NU -037) 및 5'-(S)-Me-PO( OEt ) 2 -dT(WV-NU-037A)의 합성
Figure pct00625
일반 반응식
Figure pct00626
1. 화합물 1의 제조
Figure pct00627
ACN(600 mL)과 H2O(600 mL)의 혼합물 중 화합물 WV- NU -041(150 g, 420.77 mmol)의 용액에 PhI(OAc)2(298.17 g, 925.70 mmol) 및 TEMPO(13.23 g, 84.15 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 완료된 것으로 나타났다. 생성된 혼합물을 농축 건조하여 잔류물을 수득하고, 이를 ACN(550 mL)으로 분쇄하고, 여과하고, 필터 케이크를 ACN(300 mL)으로 헹구고 건조하여 화합물 1(113.4 g, 72.75% 수율)을 흰색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, METHANOL-d 4 ) δ = 8.28 (s, 1H), 6.44 (dd, J=5.0, 9.0 Hz, 1H), 4.69 (d, J=4.4 Hz, 1H), 4.42 (s, 1H), 2.25 (dd, J=5.0, 13.4 Hz, 1H), 2.09 - 1.97 (m, 1H), 1.89 (s, 3H), 0.94 (s, 9H), 0.17 (d, J=4.8 Hz, 6H)
LCMS : (M+H+): 371.2
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 1:1)，Rf = 0.00
2. 화합물 2의 제조
Figure pct00628
DCM(1100 mL) 중 화합물 1(110 g, 296.92 mmol)의 용액에 DIEA(76.75 g, 593.84 mmol) 및 2,2-디메틸프로파노일 클로라이드(46.54 g, 385.99 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 -10~0℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 1이 조금 남아 있고, 2개의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. DCM 중 미정제 생성물 화합물 2(134.98 g, 100.00% 수율)를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
3. 화합물 3의 제조
Figure pct00629
DCM 중 화합물 2(134.9 g, 296.75 mmol)의 용액에 TEA(90.09 g, 890.26 mmol)를 첨가하고 이어서 N-메톡시메탄아민;염산염(86.84 g, 890.26 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 2가 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 생성된 혼합물을 HCl(1 N, 800 mL*2)로 세척한 후 수성 NaHCO3(600 mL*2)로 세척하였다. 합한 유기층을 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 잔류물을 미정제 백색 고체로서 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 0:1)로 정제하였다. 화합물 3(115 g, 93.71% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, CDCl3 ) δ = 8.62 (br s, 1H), 8.38 (s, 1H), 6.57 (dd, J=5.1, 9.3 Hz, 1H), 4.81 (s, 1H), 4.48 (br d, J = 4.0 Hz, 1H), 3.80 - 3.72 (m, 3H), 3.25 (s, 3H), 2.23 (dd, J = 5.1, 13.0 Hz, 1H), 2.09 - 2.01 (m, 1H), 1.97 (d, J = 1.0 Hz, 3H), 0.91(s, 9H), 0.10 (d, J = 3.8 Hz, 6H)
LCMS : (M+H+): 414.2
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 1:1), Rf = 0.39
4. 화합물 4의 제조
Figure pct00630
THF(1150 mL) 중 화합물 3(115 g, 278.09 mmol)의 용액에 MeMgBr(3 M, 185.39 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 3이 소모되었고, 2개의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 생성된 혼합물을 교반 하에 포화 수성 NH4Cl (1000 mL)에 붓고 EtOAc(500 mL*3)로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 농축하여 연황색 검을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 0:1)로 또 다른 배치 미정제물(Cpd.3의 14.5 g 규모)과 함께 정제하였다. 화합물 4(93.2 g, 90.95% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz,) CDCl3 δ = 7.96 (s, 1H), 6.41 (dd, J = 5.5, 8.2 Hz, 1H), 4.52 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 4.47 (td, J = 2.2,4.9 Hz, 1H), 2.30 - 2.23 (m, 4H), 2.00 - 1.92 (m, 4H), 0.92 (s, 9H), 0.13 (d, J = 3.5 Hz, 6H)
LCMS : (M+H+): 369.2
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 1:1), Rf = 0.61
5. 화합물 5의 제조
Figure pct00631
THF(594 mL) 중 NaH(21.49 g, 537.31 mmol, 60% 순도)의 용액에 THF(594 mL) 중 1-[디에톡시포스포릴메틸(에톡시)포스포릴]옥시에탄(154.86 g, 537.31 mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 20℃까지 가온하고, 1시간 동안 교반하였다. THF(594 mL) 중 LiBr(46.66 g, 537.31 mmol)의 용액을 첨가하고 생성된 슬러리를 교반한 후 0℃까지 냉각시켰다. 상기 혼합물에 THF(468 mL) 중 화합물 4의 용액을 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 0~20℃에서 71시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 4가 조금 남아 있고, 3개의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 생성된 혼합물을 물(100 mL)로 희석하고 EtOAc(100 mL*3)로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 농축하여 황색 오일을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 0:1)로 정제하였다. 화합물 5(48.74 g, 9.41% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS : (M+H+):503.1
TLC(에틸 아세테이트: 석유 에테르 = 3；1)，Rf = 0.28
6. 화합물 6의 제조
Figure pct00632
MeOH(100 mL) 중 화합물 5(40 g, 79.58 mmol)의 용액에 Pd/C(8 g, 10% 순도)(50% 물) 및 H2(15 psi)를 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. LCMS는 화합물 5이 소모되었고 주 피크는 목적하는 생성물인 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 여과하여 Pd/C를 제거한 후, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 화합물 6(40.16 g, 미정제)을 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS : (M+H+):505.2, 505.1
7. 화합물 WV- NU -039의 제조
Figure pct00633
THF(400 mL) 중 화합물 6(40.16 g, 79.58 mmol)의 용액에 N,N-디에틸에탄아민;트리하이드로플루오라이드(51.32 g, 318.33 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. LCMS는 화합물 6이 소모되었고 주 피크는 목적하는 생성물인 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 Na2CO3(수성, 포화, 400 mL)를 첨가하여 ??칭하고, 에틸 아세테이트(400 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 0:1)로 정제하였다. 화합물 WV- NU -039(30 g, 96.57% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다. 이어서 SFC(컬럼: DAICEL CHIRALPAK ADH(250 mm*30 mm,5 um); 이동상: [Neu-ETOH]; B%: 35%~35%, 8.5분)로 정제하였다. .
LCMS : (M+H+):390.9
8. 화합물 NU -037, WV- NU -037A의 제조
Figure pct00634
화합물 WV- NU -037(11.3 g, 37.43% 수율, 99.37% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz CDCl3 ,) δ = 9.49 - 9.10 (m, 1H), 7.11 (d, J=1.1 Hz, 1H), 6.22 (t, J=6.6 Hz, 1H), 4.54 (br d, J=4.9 Hz, 1H), 4.28 (br dd, J=4.0, 7.3 Hz, 1H), 4.20 - 4.00 (m, 4H), 3.68 (dd, J=5.1, 7.3 Hz, 1H), 2.38 (ddd, J=4.5, 6.6, 13.8 Hz, 1H), 2.29 - 1.97 (m, 3H), 1.93 (s, 3H), 1.83 - 1.63 (m, 1H), 1.34 (dt, J=3.7, 7.1 Hz, 6H), 1.17 (d, J=6.6 Hz, 3H).
13 C NMR (101MHz, CDCl3 δ = 163.91, 150.51, 135.20, 111.30, 89.49, 89.36, 83.53, 72.16, 61.94 (dd, J=6.6, 13.2 Hz, 1C), 58.29, 40.29, 31.55, 31.52, 29.95, 28.56, 18.38, 17.77, 17.69, 16.47, 16.40, 12.71
LCMS : (M+H+): 391.1; LCMS 순도: 99.37%
SFC : (AD-3_EtOH_IPAm_10-40_구배_4 ml), SFC 순도 =100.00%;
화합물 WV- NU -037A(16.2 g, 54.00% 수율, 100% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다.
1 HNMR (400MHz, CDCl3 ) δ = 8.93 (s, 1H), 7.19 (d, J=1.1 Hz, 1H), 6.29 (dd, J=6.3, 7.6 Hz, 1H), 4.35 (qd, J=3.5, 7.1 Hz, 1H), 4.22 - 4.02 (m, 4H), 3.88 - 3.75 (m, 2H), 2.37 (ddd, J=3.2, 6.1, 13.8 Hz, 1H), 2.31 - 2.14 (m, 1H), 2.13 - 2.02 (m, 2H), 1.95 (d, J=0.9 Hz, 3H), 1.69 (ddd, J=8.2, 15.4, 18.7 Hz, 1H), 1.34 (dt, J=5.5, 6.9 Hz, 6H), 1.17 (d, J=6.6 Hz, 3H).
13 CNMR (101MHz, CDCl3 ) δ = 163.88, 150.59, 135.33, 111.59, 89.39, 89.26, 83.94, 71.49, 61.84 (dd, J=6.2, 20.2 Hz, 1C), 40.02, 31.41, 31.38, 29.15, 27.75, 17.12, 17.06, 16.45 (dd, J=2.2, 5.9 Hz, 1C), 12.53
LCMS : (M+H+): 391.1; LCMS 순도: 100%
SFC : (AD-3_EtOH_IPAm_10-40_구배_4 ml), SFC 순도 =100.00%.
실시예 22. 5'-(R)-Me-PO( OEt ) 2 - 포스포네이트 -dT(WV- NU - 037)의 변형 합성 방법.
Figure pct00635
일반 반응식
Figure pct00636
1. 화합물 5의 제조
Figure pct00637
THF(900 mL) 중 NaH(23.88 g, 597.02 mmol, 60% 순도)의 용액에 THF(500 mL) 중 화합물 4A(172.07 g, 597.02 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 20~30℃까지 가온하고, 1시간 동안 교반하였다. THF(500 mL) 중 LiBr(51.85 g, 597.02 mmol)의 용액을 첨가하고 생성된 슬러리를 교반한 후 0℃까지 냉각시켰다. 상기 혼합물에 THF(500 mL) 중 화합물 4(50 g, 135.69 mmol)의 용액을 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 0~15℃에서 11시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 4가 완전히 소모되었고, 목적하는 생성물이 형성된 것으로 나타났다. 생성된 혼합물을 물(500 mL)로 희석하고 EtOAc(500 mL*3)로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 농축하여 황색 오일을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 5/1 내지 1:1)로 정제하였다. 화합물 5(63 g, 90.44% 수율, 97.9% 순도)을 황색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, CDCl3 ) δ = 8.98 (br s, 1H), 7.05 (s, 1H), 6.24 (t, J=6.8 Hz, 1H), 5.71 (d, J=17.2 Hz, 1H), 4.23 - 3.97 (m, 8H), 2.25 - 2.12 (m, 1H), 2.11 - 2.03 (m, 4H), 1.88 (s, 3H), 1.30 - 1.07 (m, 9H), 0.83 (s, 9H), 0.04 - 0.00 (m, 7H).
LCMS : (M+H+): 503.1.
TLC(에틸 아세테이트: 석유 에테르 = 3: 1), Rf = 0.16.
2. 화합물 6의 제조
Figure pct00638
THF(600 mL) 중 화합물 5(57 g, 113.41 mmol)의 용액에 N,N-디에틸에탄아민;트리하이드로플루오라이드(73.13 g, 453.63 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 15℃에서 6시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 5가 완전히 소모된 것으로 나타났다. 하나의 새로운 스폿은 목적하는 화합물이었다. 반응 혼합물을 포화 수성 NaHCO3 (20 mL) 및 NaHCO3 고체를 pH 7~8까지 ??칭하고 20분 동안 교반하였다. 혼합물을 Na2SO4 건조하고 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 화합물 6(44 g, 미정제)을 황색 고체로서 수득하였다.
TLC(에틸 아세테이트: 메탄올 = 15: 1), Rf = 0.43.
3. 화합물 WV- NU -037의 제조
Figure pct00639
MeOH(1840 mL) 중 화합물 6(43 g, 110.72 mmol)의 혼합물에 (1Z,5Z)-시클로옥타-1,5-디엔;로듐(1+);테트라플루오로보레이트(1.80 g, 4.43 mmol), Josiphos SL-J216-1(CAS#: 849924-43-2, 3.32 g, 5.09 mmol) 및 아연;트리플루오로메탄설포네이트(16.10 g, 44.29 mmol)를 첨가하였다. 그리고 시스템을 H2(50 psi) 하에 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. LC-MS는 화합물 6이 완전히 소모되었고 목적하는 MS가 포함된 하나의 주 피크가 검출된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 6 g의 미정제물과 합하였다. 잔류물을 플래시 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제하여(ISCO®; 80 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼 MeOH mL/분의 0~100% 에틸 아세테이트/석유 에테르 구배 및 10% 석유 에테르 구배의 용리제) 36.2 g(평균 중량 30.4 g)을 수득하였다. 그리고 미정제 18.5 g. 화합물 WV-NU-037(30.4 g, 77.88 mmol, 70.33% 수율)을 검갈색 고체로서 수득하였다. 그리고 미정제 18.5 g. 잔류물을 플래시 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제하였다(ISCO®; 220 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, 80 mL/분의 20:60:20, 100:0;20 에틸 아세테이트/석유/DCM 에테르 구배의 용리제). 이어서 200 mL(석유 에테르: 에틸 아세테이트= 1: 1)로 세척하여 39.8 g의 미색 고체를 수득하였다.
1 HNMR (400MHz, CDCl3 ) δ= 8.68 (br s, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.18 (t, J=6.5 Hz, 1H), 4.29 (br d, J=4.6 Hz, 2H), 4.20 - 4.04 (m, 4H), 3.66 (br dd, J=5.1, 7.3 Hz, 1H), 2.38 (td, J=6.7, 11.7 Hz, 1H), 2.26 - 1.97 (m, 4H), 1.93 (s, 4H), 1.84 - 1.70 (m, 1H), 1.34 (dt, J=4.5, 7.0 Hz, 7H), 1.17 (d, J=6.8 Hz, 3H)
31 PNMR (162MHz, CDCl3 ) δ= 31.55 (s, 1P), 31.49 (s, 1P)
13 CNMR (101MHz, CDCl3 ) δ= 163.52, 150.30, 135.35, 111.33, 89.42, 89.31, 83.74, 72.36, 62.15 (dd, J=6.6, 12.5 Hz, 1C), 40.18, 31.70, 29.92, 28.52, 18.34, 18.26, 16.43, 16.36, 12.63
SFC : 방법(AD-3_EtOH_IPAm_10-40_구배_4 ml_A) dr = 97.43: 2.57
LCMS (M+H+): 391.1; LCMS 순도: 99.37%
실시예 23. 5'-PO- 트리아졸릴 포스포네이트 -dT(WV- NU - 040)의 합성.
Figure pct00640
일반 반응식
Figure pct00641
1. 화합물 2A의 제조
Figure pct00642
THF(20 mL) 중 화합물 1A(10 g, 57.96 mmol)의 용액에 N2 하에 0℃에서 브로모(에티닐)마그네슘(0.5 M, 117.07 mL)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 1A가 완전히 소모되었고, 2개의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 0℃에서 포화 NH4Cl(수성, 50 mL)을 첨가하여 ??칭하고, 에틸 아세테이트(30 mL)로 희석하고 에틸 아세테이트(150 mL*3)로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 미정제물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10: 1 내지1: 1)로 정제하였다. 화합물 2A(5.2 g, 55.34% 수율)를 무색 오일로서 수득하였다.
LCMS: (M+H+): 163.3.
TLC(석유 에테르 : 에틸 아세테이트 = 1:1) Rf = 0.43
2. 화합물 4의 제조
Figure pct00643
피리딘(200 mL) 중 화합물 3(10 g, 28.05 mmol)의 용액에 PPh3(13.24 g, 50.49 mmol) 및 I2(10.68 g, 42.08 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 N2 분위기 하에 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. LCMS는 출발 물질 대부분이 소모되었고 목적하는 질량을 갖는 하나의 주 피크가 검출된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 포화 수성 Na2SO3(200 mL)로 ??칭하고, EtOAc(600 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(200 mL * 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10: 1 내지 0: 1)로 정제하였다. 화합물 4(4.8 g, 33.40% 수율, 91.041% 순도)를 무색 오일로서 수득하였다.
LCMS: (M+H+): 467.0;
TLC(석유 에테르 / 에틸 아세테이트 = 1: 3) Rf = 0.75.
3. 화합물 5의 제조
Figure pct00644
DMF(48 mL) 중 화합물 4(4.8 g, 10.29 mmol)의 용액에 NaN3(802.89 mg, 12.35 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 50℃에서 12시간 동안 교반하였다. LCMS는 화합물 4가 완전히 소모되었고, 목적하는 MS를 포함하는 하나의 주 피크가 검출된 것으로 나타났다. 반응을 H2O(6 mL)로 ??칭하고 TBME(6 mL*3)로 추출하였다. TBME(18 mL)의 황색 용액 중 화합물 5(3.93 g, 미정제)를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
LCMS: (M+H+): 382.3
4. 화합물 6의 제조
Figure pct00645
THF(20 mL) 중 화합물 5(3.93 g, 10.30 mmol)의 용액에 N,N-디에틸에탄아민;트리하이드로플루오라이드(6.64 g, 41.21 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 5의 일부가 남아 있고, 새로운 스폿이 검출된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하고 pH가 7이 될 때까지 혼합물을 Na2CO3(수성, 포화)로 중화시켰다. 혼합물을 감압하에 농축하여 대부분의 물을 제거하였다. DCM(40 mL)을 첨가하고, 이어서 혼합물을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 prep-TLC(SiO2, 석유 에테르: (에틸 아세테이트: 에틸 알코올 = 3: 1) = 1: 1)로 정제하였다. 화합물 6(2.7 g, 미정제)을 황색 오일로서 수득하였다.
TLC(석유 에테르: (에틸 아세테이트: 에틸 알코올 = 3: 1) = 1: 1) Rf = 0.24
5. WV- NU -040의 제조
Figure pct00646
DMF(20 mL) 중 화합물 6(2 g, 7.48 mmol) 및 1-[에톡시(에티닐)포스포릴]옥시에탄(1.42 g, 8.76 mmol)의 용액을 탈기하고 N2로 3회 퍼징하였다; 이어서 DIEA(1.93 g, 14.97 mmol), CuI(285.06 mg, 1.50 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 N2 분위기 하에 20℃에서 4시간 동안 교반하였다. LCMS는 대부분의 출발 물질이 사라지고 목적하는 물질이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 TMT 용액(8 mL)으로 희석하고 여과하고 여과액을 ACN(80 mL)으로 희석하고 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 EtOAc(100 mL * 3)로 세척하고 여과하고 감압하에 농축하여 생성물을 수득하였다. WV- NU -040(1.8 g, 3.92 mmol, 52.38% 수율, 93.513% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400 MHz, 중수소 산화물) δ ppm 8.39 (s, 1 H), 6.96 (s, 1 H), 6.07 (t, J=6.4 Hz, 1 H), 4.77 (d, J=4.4 Hz, 2 H), 4.37 (q, J=6.2 Hz, 1 H), 4.19 (q, J=4.9 Hz, 1 H), 4.01 - 4.14 (m, 4 H), 2.20 - 2.37 (m, 2 H), 1.73 (s, 3 H), 1.19 (s, 6 H)
31 P NMR (162 MHz, 중수소 산화물) δ ppm 8.67 (s, 1 P)
13 C NMR (101MHz, 중수소 산화물) δ = 166.21, 151.53, 137.29, 136.50, 134.08, 133.47, 133.14, 111.55, 85.38, 82.53, 70.15, 64.72, 64.66, 50.60, 36.90, 15.47, 15.41, 11.49.
LCMS: (M+H+): 430.1, LCMS 순도: 93.513%.
실시예 24. 5'-(POM) 2 -비닐 포스포네이트 -dT(WV- NU - 042)의 합성.
Figure pct00647
일반 반응식
Figure pct00648
1. 화합물 1B의 제조
Figure pct00649
ACN(400 mL) 중 화합물 1A(47 g, 202.49 mmol), 화합물 1C(152.48 g, 1.01 mol, 146.61 mL), TBAI(74.79 g, 202.49 mmol)의 혼합물을 85℃에서 15시간 동안 교반 환류시켰다. 이어서, 화합물 1C(61 g)를 첨가하고 반응 혼합물을 85℃에서 15시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 1A가 소모되었고, 새로운 스폿이 검출된 것으로 나타났다. 혼합물을 에틸 아세테이트(300 mL) 및 H2O(300 mL)로 희석하고 에틸 아세테이트(300 mL*3)로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 미정제물을 수득하였다. 미정제물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르: 에틸 아세테이트=10:1, 5:1, 3:1 내지 1:1)로 정제하였다. 화합물 1B(106 g, 82.75% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ = 5.77 - 5.68 (m, 8H), 2.78 - 2.59 (m, 2H), 1.25 (s, 36H).
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트= 1: 1), Rf = 0.43.
2. 화합물 2의 제조
Figure pct00650
3개의 배치: DCM(2 L) 중 화합물 1(234 g, 429.68 mmol) 및 이미다졸(87.75 g, 1.29 mol)의 용액에 TBSCl(97.14 g, 644.52 mmol, 78.98 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 15℃에서 16시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 1이 소모된 것으로 나타났다. 3개의 배치 혼합물을 합하고 포화 NaHCO3(수성, 4 L * 2)으로 세척하고, 합한 수성을 EtOAc(3 L* 2)로 추출하고, 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 농축하여 미정제물을 수득하였다. 화합물 2(850 g, 미정제)를 황색 오일로서 수득하였다.
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트= 1: 1) Rf = 0.39.
3. WV- NU -041의 제조
Figure pct00651
CH3COOH(1200 mL) 및 H2O(300 mL) 중 화합물 2(400 g, 607.11 mmol)의 용액을 15℃에서 16시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 2의 일부가 반응 혼합물에 남아 있고, 새로운 스폿이 검출된 것으로 나타났다. 반응 현탁액을 여과하여 백색 고체를 제거한 후, 여과액을 얼음물(2 L)에 첨가하였다. 생성된 백색 고체를 여과하여 미정제물을 수득하였다. 수성층을 EtOAc(2 L * 4)로 추출하였다. 합한 유기층을 포화 NaHCO3(수성, 1 L)으로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 미정제 물질을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르: 에틸 아세테이트= 5: 1, 3: 1, 1: 1 내지 0: 1)로 정제하였다. 화합물 WV- NU -041(100 g, 46.20% 수율)을 황색 고체로서 수득하였다.
1 HNMR (400MHz, CDCl3) Shift = 9.54 (br s, 1H), 7.42 (s, 1H), 6.16 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 4.51 - 4.46 (m, 1H), 3.96 - 3.87 (m, 2H), 3.82 - 3.68 (m, 1H), 2.32 (td, J = 6.8, 13.5 Hz, 1H), 2.21 (ddd, J = 3.7, 6.4, 13.2 Hz, 1H), 1.89 (s, 3H), 0.88 (s, 9H), 0.08 (s, 6H).
13 CNMR (101MHz, CDCl3) Shift = 164.30, 150.50, 137.15, 110.90, 87.60, 86.67, 71.55, 61.86, 40.53, 25.69, 20.72, 17.92, 12.44, -4.72, -4.88
LCMS : M + Na+ = 379.2, 순도: 96.33%.
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트= 1: 1) Rf = 0.24.
4. 화합물 3의 제조
Figure pct00652
DCM(300 mL) 중 화합물 WV- NU -041(40 g, 112.21 mmol)의 용액에 DMP(66.63 g, 157.09 mmol)를 0℃에서 조금씩 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반한 후, 25℃까지 가온하고 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 WV- NU -041이 소모되었고, 새로운 스폿이 관찰된 것으로 나타났다. 혼합물을 에틸 아세테이트(500 mL)로 희석하고 에틸 아세테이트(500 mL)를 사용하여 짧은 실리카 겔 패드(SiO2, 200 g)를 통해 여과하였다. 5% Na2SO3/포화 NaHCO3(1:1, 500 mL, 수성)을 0℃에서 첨가하고, 혼합물을 에틸 아세테이트(300 mL*2)로 추출하고, 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 농축하여 미정제 화합물 3(39 g, 미정제)을 백색 고체로서 수득하였다.
LCMS : M + H+ = 354.9.
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트 =1: 3) Rf = 0.36.
5. 화합물 4의 제조
Figure pct00653
THF(400 mL) 중 NaH(10.62 g, 265.58 mmol, 60% 순도)의 용액에 THF(600 mL) 중 화합물 1B(140 g, 221.32 mmol)를 N2 하에 -70℃~-60℃에서 30분에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 N2 하에 -70℃~-60℃에서 30분 동안 교반하였다. 상기 혼합물에 THF(400 mL) 중 화합물 3(31.38 g, 88.53 mmol)의 용액을 N2 하에 -70℃~-60℃에서 30분에 걸쳐 첨가하였다. 혼합물을 N2 하에 -70℃~-60℃에서 1시간 동안, 0℃에서 1시간 동안, 이어서 18℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 3이 소모된 것으로 나타났다. 혼합물을 0℃에서 포화 NH4Cl(1000 mL, 수성)에 첨가하고, 에틸 아세테이트(1000 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르: 에틸 아세테이트= 5: 1, 3: 1 내지 1: 1)로 정제하였다. 화합물 4(25 g, 42.74% 수율)를 무색 오일로서 수득하였다.
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트= 1: 1) Rf = 0.18.
6. WV- NU -042, (5'-(E)-(POM)2- VPdT )의 제조
Figure pct00654
0℃에서 HCOOH(150 mL) 및 H2O(150 mL) 중 화합물 4(35.5 g, 53.73 mmol)의 용액, 혼합물을 0~15℃에서 16시간 동안 교반하였다. TLC 및 LCMS는 화합물 4가 소모되었고, 새로운 스폿이 검출된 것으로 나타났다. 혼합물을 감압하에 농축하여 30℃ 수조에서 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 MPLC(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 20%, 50%, 100%)로 정제하였다. 화합물 WV- NU -042, (5'-(E)-(POM)2- VPdT )(18.6 g, 63.35% 수율)를 황색 검으로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, CDCl3) Shift = 8.92 (s, 1H), 7.06 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 7.01 - 6.84 (m, 1H), 6.28 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 6.08 - 5.90 (m, 1H), 5.70 - 5.57 (m, 3H), 5.54 (dd, J = 5.1, 12.3 Hz, 1H), 4.39 - 4.25 (m, 2H), 3.67 (br s, 1H), 2.35 (ddd, J = 4.7, 6.6, 13.8 Hz, 1H), 2.15 (td, J = 6.8, 13.7 Hz, 1H), 1.91 - 1.80 (m, 3H), 1.15 (d, J = 2.7 Hz, 18H).
13 C NMR (101MHz, CDCl3) Shift = 177.20, 176.89, 163.46, 150.33, 149.84, 149.78, 135.18, 118.20, 116.29, 111.74, 85.71, 85.48, 84.93, 81.56, 73.94, 60.40, 39.09, 38.76, 26.83, 26.81, 21.04, 14.19, 12.61.
31 P NMR (162MHz CDCl3,) Shift = 17.05.
LCMS : M + H+ = 547.2, 순도: 90.718%.
실시예 25. 비염기성 5'-비닐 포스포네이트 (WV-RA-009) 및 5'-비닐 포스포 네이트-3'-CNE 포스포아미다이트(WV-RA-009-CNE)의 합성
Figure pct00655
일반 반응식
Figure pct00656
1. 화합물 2의 제조
Figure pct00657
3개의 배치: 화합물 1(100 g, 257.17 mmol)을 무수 톨루엔(1500 mL)에 용해하고 AIBN(1.58 g, 9.64 mmol) 및 (n-Bu)3SnH(74.85 g, 257.17 mmol)를 첨가하였다. 용액을 12시간 동안 80℃까지 가열하였다. TLC는 화합물 1이 거의 남아 있지 않고 새로운 스폿이 관찰된 것으로 나타났다. 3개의 배치를 후처리를 위해 합하였다. 혼합물을 증발 건조시켜 미정제물(270 g)을 황색 오일로서 수득하였다.
미정제 혼합물(315 g)을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 100/1, 50/1)로 정제하여 화합물 2(120 g, 38.10% 수율)를 황색 오일로서 수득하고 120 g 미정제물은 추가 정제가 필요하다.
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트= 3: 1), Rf = 0.63
2. 화합물 3의 제조
Figure pct00658
3개의 배치: MeOH(1.2 L) 중 화합물 2(115 g, 324.50 mmol)의 용액에 NaOMe(52.59 g, 973.49 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. LCMS 및 TLC는 화합물 2가 소모된 것으로 나타났고, TLC는 새로운 스폿이 검출된 것으로 나타났다. 32개의 배치를 후처리를 위해 합하였다. NH4Cl(169 g)를 첨가하고 혼합물을 농축하여 화합물 3(115 g, 미정제)을 황색 오일로서 수득하였다.
TLC(에틸 아세테이트: 메탄올 = 10: 1), Rf = 0.21
3. 화합물 4의 제조
Figure pct00659
피리딘(550 mL) 중 화합물 3(55 g, 465.59 mmol)의 용액에 DMTCl(189.30 g, 558.70 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. LCMS는 화합물 3이 소모되었고 목적하는 물질이 관찰된 것으로 나타났다. 물(500 mL)을 첨가하고 혼합물을 EtOAc(500 mL*2)로 추출하였다. 합한 유기물을 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고 농축하여 미정제물을 수득하였다. 혼합물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르: 에틸 아세테이트= 10: 1, 3: 1, 1: 1, 5% TEA)로 정제하여 화합물 4(110 g, 56.19% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트= 1: 1), Rf = 0.43
4. 화합물 5의 제조
Figure pct00660
2개의 배치:　DCM(600 mL) 중 화합물 4(55 g, 130.80 mmol) 및 이미다졸(26.71 g, 392.39 mmol)의 용액에 TBSCl(29.57 g, 196.20 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 4가 소모되었고 새로운 스폿이 관찰된 것으로 나타났다. 2개의 배치를 후처리를 위해 합하였다. 물(500 mL)을 첨가하고 DCM(200 mL*2)로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 농축하여 화합물 5 (139 g, 미정제)를 황색 오일로서 수득하였다.
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트= 5: 1), Rf = 0.47
5. 화합물 6의 제조
Figure pct00661
HOAc(560 mL) 및 H2O(140 mL) 중 화합물 5(139 g, 259.93 mmol)의 용액을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 5가 소모된 것으로 나타났다. 혼합물을 얼음물(500 mL)에 붓고 NaHCO3 고체를 pH가 7이 될 때까지 첨가하고 잔류물을 EtOAc(300 mL*3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(300 mL)로 세척하고 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 미정제물을 수득하였다. 혼합물을 실리카겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 550/1, 5/1, 3:1)로 정제하여 화합물 6(35 g, 57.94% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
1 HNMR (400MHz, CDCl3 ) δ = 4.23 (td, J=3.8, 6.6 Hz, 1H), 3.97 (dd, J=5.4, 8.0 Hz, 2H), 3.79 - 3.68 (m, 2H), 3.61 - 3.50 (m, 1H), 2.06 - 2.01 (m, 1H), 1.91 - 1.81 (m, 1H), 0.89 (s, 8H), 0.08 (s, 6H)
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트=5:1), Rf = 0.25
6. 화합물 7의 제조
Figure pct00662
2개의 배치:　DCM(150 mL) 중 화합물 6(14.5 g, 62.39 mmol)의 용액에 DMP(31.76 g, 74.87 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 6이 소모된 것으로 나타났다. 2개의 배치를 후처리를 위해 합하였다. 혼합물을 포화 NaHCO3(750 mL)와 포화 Na2SO3(750 mL)의 혼합물에 부었다. 혼합물을 DCM(500 mL*2)으로 추출하고; 합한 유기물을 염수(500 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 화합물 7(28.7 g, 미정제)을 황색 오일로 수득하였다.
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트= 3: 1), Rf = 0.43
7. 화합물 8의 제조
Figure pct00663
THF(100 mL) 중 화합물 7A(43.09 g, 149.50 mmol)의 용액에 t-BuOK(1 M, 149.50 mL)를 0℃에서 첨가하고 0℃에서 10분 동안 교반한 후 30분 동안 25℃까지 가온하였다. THF(100 mL) 중 화합물 7(28.7 g, 124.58 mmol)의 용액을 0℃에서 상기 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반한 후 80분 동안 25℃까지 가온되도록 하였다. TLC는 화합물 7이 소모된 것으로 나타났다. 반응 혼합물에 물(100 mL)을 첨가하고 EtOAc(100 mL*4)로 추출하였다. 유기상을 건조(Na2SO4)하고, 여과하고 농축하여 화합물 8(45 g, 미정제)을 무색 오일로서 수득하였다.
혼합물을 실리카 컬럼(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1, 3/1)으로 정제하여 화합물 8(18 g, 40.00% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
1 HNMR (400MHz, CDCl3 ) δ = 6.86 - 6.68 (m, 1H), 6.08 - 5.82 (m, 1H), 4.32 - 4.26 (m, 1H), 4.20 - 4.13 (m, 1H), 4.12 - 3.99 (m, 6H), 2.04 - 1.93 (m, 1H), 1.88 - 1.79 (m, 1H), 1.59 (s, 2H), 1.33 (t, J=7.1 Hz, 6H), 0.90 (s, 9H), 0.15 - -0.02 (m, 6H)
TLC: (석유 에테르: 에틸 아세테이트= 1: 1), Rf = 0.15
8. 화합물 WV-RA-009의 제조
Figure pct00664
THF(200 mL) 중 화합물 8(20 g, 54.87 mmol)의 용액에 3HF.TEA(35.38 g, 219.49 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 8이 소모되었고, 새로운 스폿이 관찰된 것으로 나타났다. NaHCO3(300 mL, 수성)을 첨가하고 DCM(200 mL*2)로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 농축하여 미정제물을 수득하였다. 혼합물을 실리카 컬럼(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1, 3/1, 0:1)으로 정제하여 WV-RA-009(11.5 g, 82.14% 수율)을 무색 오일로서 수득하였다.
1 HNMR (400MHz, CDCl3 ) δ = 6.90 - 6.78 (m, 1H), 6.08 - 5.84 (m, 1H), 4.41 - 4.36 (m, 1H), 4.23 (td, J=3.1, 6.0 Hz, 1H), 4.12 - 4.00 (m, 6H), 3.44 (br s, 1H), 2.13 - 1.99 (m, 1H), 1.97 - 1.89 (m, 1H), 1.32 (dt, J=1.4, 7.1 Hz, 6H)
13 CNMR (101MHz CDCl3 ,) δ = 150.69, 150.63, 117.25, 115.37, 85.79, 85.58, 75.54, 67.31, 61.92 (t, J=6.2 Hz, 1C), 34.07, 16.35, 16.30
31 P NMR (162MHz, CDCl3 ) δ = 18.65 (s, 1P)
LCMS : (M+H+): 251.1, LCMS 순도: 100%(ELSD).
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트= 0: 1), Rf = 0.15
9. 화합물 WV-RA-009- CNE 포스포아미다이트의 제조.
Figure pct00665
화합물 WV-RA-009(4.5 g, 17.98 mmol)를 톨루엔(20 mL*3)과 함께 회전식 증발기에서 공비 증류로 건조시켰다.
DMF(32 mL) 중의 화합물 WV-RA-009(4.5 g, 17.98 mmol)의 용액에 N-메틸이미다졸(2.95 g, 35.97 mmol) 및 5-에틸설파닐-2H-테트라졸(2.34 g, 17.98 mmol)을 첨가한 후 3-비스(디이소프로필아미노)포스파닐옥시프로판니트릴(8.13 g, 26.98 mmol)을 적하했다. 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC는 WV-RA-009가 소모되었고, 새로운 스폿이 관찰된 것으로 나타났다. 혼합물을 포화 NaHCO3(200 mL)에 천천히 붓고, 혼합물을 EtOAc(100 mL*3)으로 추출하였다. 합한 유기물을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 농축하여 미정제물을 수득하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1, 3/1, 1/1, 5% TEA)로 2회 정제하여 WV-RA-009- CNE(3 g, 33.90% 수율, 91.55% 순도)를 무색 오일로서 수득하였다.
1 HNMR (400MHz CDCl3 ,) δ = 6.90 - 6.64 (m, 1H), 6.09 - 5.82 (m, 1H), 4.47 (br d, J=17.0 Hz, 1H), 4.30 - 4.19 (m, 1H), 4.12 - 3.95 (m, 6H), 3.86 - 3.69 (m, 2H), 3.64 - 3.52 (m, 2H), 2.68 - 2.55 (m, 2H), 2.09 - 1.89 (m, 2H), 1.29 (dt, J=2.2, 7.1 Hz, 7H), 1.23 - 1.11 (m, 14H)
31 PNMR (162MHz, CDCl3 ) δ = 148.22 (s, 1P), 148.11 (s, 1P), 148.32 - 147.99 (m, 1P), 30.79 (s, 1P), 18.38 (s, 1P), 18.33 (s, 1P), 18.22 (s, 1P)
13 CNMR (101MHz, CDCl3 ) δ = 149.83 (dd, J=5.9, 11.7 Hz, 1C), 118.10, 117.88, 117.55, 117.51, 116.23, 116.01, 84.75 (br dd, J=19.1, 21.3 Hz, 1C), 84.70 (br t, J=20.9 Hz, 1C), 67.61, 67.58, 61.76 (br t, J=3.7 Hz, 1C), 58.37, 58.29, 58.18, 58.10, 43.23 (dd, J=2.9, 12.5 Hz, 1C), 33.23 (dd, J=4.0, 9.2 Hz, 1C), 24.60, 24.54, 24.51, 24.39, 23.88, 20.34 (dd, J=4.0, 7.0 Hz, 1C), 16.36, 16.29
LCMS: 순도 91.55%(ELSD)
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트= 0: 1), Rf = 0.43
실시예 26. 5'-(R)-Me-PO( OEt ) 2 - 포스포네이트 (WV-RA-010) 및 5'-(R)-Me-PO(OEt) 2 -포스포네이트-3'-CNE 포스포아미다이트(WV-RA-010-CNE)의 합성
Figure pct00666
일반 반응식
Figure pct00667
1. 화합물 2의 제조
Figure pct00668
3개의 배치: 화합물 1(100 g, 257.17 mmol)을 무수 톨루엔(1500 mL)에 용해하고 AIBN(1.58 g, 9.64 mmol) 및 (n-Bu)3SnH(74.85 g, 257.17 mmol)를 첨가하였다. 용액을 12시간 동안 80℃까지 가열하였다. TLC는 화합물 1이 거의 남아 있지 않고 새로운 스폿이 관찰된 것으로 나타났다. 3개의 배치를 후처리를 위해 합하였다. 혼합물을 증발 건조시켰다.
정제: 미정제 혼합물(315 g)을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 100/1, 50/1)으로 정제하여 화합물 2(120 g, 38.10% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, CDCl3 ) δ = 7.98 - 7.91 (m, 4H), 7.29 - 7.21 (m, 4H), 5.48 (td, J=2.2, 6.4 Hz, 1H), 4.55 - 4.46 (m, 2H), 4.38 (dt, J=2.6, 4.6 Hz, 1H), 4.21 - 4.13 (m, 1H), 4.05 (dt, J=6.1, 9.2 Hz, 1H), 2.42 (d, J=5.6 Hz, 7H), 2.20 (tdd, J=2.8, 5.6, 13.5 Hz, 1H)
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트= 5: 1), Rf = 0.47
2. 화합물 3의 제조
Figure pct00669
3개의 배치: MeOH(1.2 L) 중 화합물 2(115 g, 324.50 mmol)의 용액에 NaOMe(52.59 g, 973.49 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. LCMS 및 TLC는 화합물 2가 소모되었고 새로운 스폿이 관찰된 것으로 나타났다. 2개의 배치를 후처리를 위해 합하였다. NH4Cl(169 g)를 첨가하고 혼합물을 농축하여 화합물 3(115 g, 미정제)을 황색 오일로서 수득하였다.
TLC(에틸 아세테이트: 메탄올=10:1), Rf =0.21
3. 화합물 4의 제조
Figure pct00670
피리딘(600 mL) 중 화합물 3(60 g, 507.91 mmol)의 용액에 DMTCl(206.51 g, 609.49 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. LCMS는 화합물 3이 소모되었고 목적하는 물질이 관찰된 것으로 나타났다. 물(600 mL)을 첨가하고 혼합물을 EtOAc(600 mL*2)로 추출하였다. 합한 유기물을 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고 농축하여 미정제물을 수득하였다. 미정제물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 15/1 내지 1/1)로 정제하여 화합물 4(89 g, 41.78% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: NEG (M-H+), 419.1
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트= 1: 1), Rf = 0.43
4. 화합물 5의 제조
Figure pct00671
2개의 배치: DCM(500 mL) 중 화합물 4(44.5 g, 105.83 mmol) 및 이미다졸(21.61 g, 317.48 mmol)의 용액에 TBSCl(23.93 g, 158.74 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 4가 소모되었고 새로운 스폿이 관찰된 것으로 나타났다. 2개의 배치를 후처리를 위해 합하였다. 물(500 mL)을 첨가하고 DCM(200 mL*2)로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 농축하여 화합물 5 (113 g, 미정제)를 황색 오일로서 수득하였다.
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트= 5: 1), Rf = 0.47
3. 화합물 6의 제조
Figure pct00672
2개의 배치:　HOAc(240 mL)와 H2O(60 mL)의 혼합물 중 화합물 5(56.5 g, 105.66 mmol)의 용액에 잔류물을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 5가 소모된 것으로 나타났다. 2개의 배치를 후처리를 위해 합하였다. 혼합물을 얼음물(500 mL)에 붓고 NaHCO3 고체를 pH가 7이 될 때까지 첨가하고 잔류물을 EtOAc(300 mL*3)로 추출하고 합한 유기물을 염수(300 mL)로 세척하고 Na2SO4로 건조하고 여과하고 농축하여 미정제물을 수득하였다. 혼합물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 50/1, 5/1, 3: 1)로 정제하여 화합물 6(28 g, 57.03% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 5:1), Rf = 0.25
4. 화합물 7의 제조
Figure pct00673
MeCN(150 mL) 및 H2O(150 mL) 중 화합물 6(13 g, 55.94 mmol)의 용액에 PhI(OAc)2(39.64 g, 123.07 mmol) 및 TEMPO(1.76 g, 11.19 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 6이 소모되었고 새로운 스폿이 관찰된 것으로 나타났다. 혼합물을 농축하여 화합물 7(27 g, 미정제)을 황색 오일로서 수득하였다.
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트=3:1), Rf = 0.04
5. 화합물 8의 제조
Figure pct00674
2개의 배치:　DCM(135 mL) 중 화합물 7(13.5 g, 54.79 mmol)의 용액에 DIEA(14.16 g, 109.59 mmol) 및 2,2-디메틸프로파노일 클로라이드(8.59 g, 71.23 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 7이 소모되었고 새로운 스폿이 관찰된 것으로 나타났다. DCM(135 mL) 중 황색 용액으로서 화합물 8(36.2 g, 미정제)을 다음 단계에 직접 사용하였다.
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트= 1: 1), Rf = 0.22
6. 화합물 9의 제조
Figure pct00675
2개의 배치:　최종 단계로부터 DCM(135 mL) 중 혼합물 화합물 8(18.1 g, 54.77 mmol)에 TEA(16.63 g, 164.30 mmol, 22.87 mL) 및 N-메톡시메탄아민;염산염(8.01 g, 82.15 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. LCMS는 출발 물질이 소모되었고 목적하는 물질이 관찰된 것으로 나타났다. 2개의 배치를 후처리를 위해 합하였다. 혼합물을 HCl(1 N, 100 mL)에 이어서 수성 NaHCO3(100 mL)로 세척하고, 유기물을 Na2SO4로 건조하고 여과하여 미정제물을 수득하였다. 혼합물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1, 3/1)으로 정제하여 화합물 9(15.8 g, 50.97% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: (M+H+): 290.1
7. 화합물 10의 제조
Figure pct00676
THF(180 mL) 중 화합물 9(15.8 g, 54.59 mmol)의 용액에 MeMgBr(3 M, 54.59 mL)을 0℃에서 적하하고 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 9가 소모된 것으로 나타났다. 혼합물을 포화 NH4Cl(200 mL)에 붓고 혼합물을 EtOAc(150 mL*3)로 추출하고, 합한 유기물을 Na2SO4로 건조하고 여과하고 농축하여 미정제물을 수득하였다. 혼합물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 20/1, 5/1)으로 정제하여 화합물 10(12 g, 85.11% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
1 HNMR (400MHz, CDCl3 ) δ = 4.47 - 4.41 (m, 1H), 4.18 (d, J=2.5 Hz, 1H), 4.11 - 4.01 (m, 2H), 2.19 (s, 3H), 2.01 - 1.75 (m, 2H), 0.90 (s, 10H), 0.11 (d, J=3.5 Hz, 6H)
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트 =3:1), Rf = 0.76
10. 화합물 11의 제조
Figure pct00677
THF(170 mL) 중 NaH(7.92 g, 198.03 mmol, 60% 순도)의 용액에 THF(110 mL) 중 화합물 7A(57.08 g, 198.03 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 20℃까지 가온하고, 1시간 동안 교반하였다. THF(100 mL) 중 LiBr(17.20 g, 198.03 mmol)의 용액을 첨가하고 생성된 슬러리를 교반한 후 0℃까지 냉각시켰다. 상기 혼합물에 THF(100 mL) 중 화합물 10(11 g, 45.01 mmol)의 용액을 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 0~20℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 10이 소모된 것으로 나타났다. 생성된 혼합물을 물(500 mL)로 희석하고 EtOAc(300 mL*3)로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 농축하여 황색 오일을 수득하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 =1 0/1, 3/1)로 정제하여 화합물 11(16 g, 86.49% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
1 HNMR (400MHz, CDCl3 ) δ = 5.73 (td, J=1.1, 18.7 Hz, 1H), 4.19 - 3.94 (m, 9H), 2.09 (dd, J=0.8, 3.3 Hz, 3H), 2.01 - 1.90 (m, 1H), 1.84 - 1.75 (m, 1H), 1.40 - 1.27 (m, 8H), 0.93 - 0.84 (m, 10H), 0.13 - 0.00 (m, 6H)
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 1:1), Rf = 0.20
11. 화합물 12의 제조
Figure pct00678
THF(150 mL) 중 화합물 11(15 g, 39.63 mmol)의 혼합물에 3HF.TEA(25.55 g, 158.51 mmol)를 첨가한 후 혼합물을 N2 분위기 하에 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 11이 소모된 것으로 나타났다. 포화 NaHCO3를 pH가 7이 될 때까지 혼합물에 첨가하고 잔류물을 DCM(150 mL*3)으로 추출하고 합한 유기물을 Na2SO4로 건조하고 여과하고 농축하여 미정제물을 수득하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 5/1, 0/1, 에틸 아세테이트: 디클로로메탄 = 10:1)로 정제하여 화합물 12(8.8 g, 80.00% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
1 HNMR (400MHz, CDCl3 ) δ = 5.73 (td, J=1.1, 18.7 Hz, 1H), 4.19 - 3.94 (m, 8H), 2.09 (dd, J=0.8, 3.3 Hz, 3H), 2.01 - 1.90 (m, 1H), 1.84 - 1.75 (m, 1H), 1.33 - 1.30 (m, 6H)
31 PNMR (162MHz, CDCl3 ) δ = 18.71
TLC(에틸 아세테이트: 메탄올=0:1), Rf = 0.20.
12. 화합물 WV-RA-010의 제조
Figure pct00679
MeOH(160mL) 중 화합물 12(8.7 g, 32.92 mmol), (1Z,5Z)-시클로옥타-1,5-디엔;로듐(1+), 테트라플루오로보레이트(534.76 mg, 1.32 mmol), 아연;트리플루오로메탄설포네이트(4.79 g, 13.17 mmol)에 Josiphos SL-J216-1(987.42 mg, 1.51 mmol)을 N2 하에서 첨가하였다. 현탁액을 진공하에 탈기시키고, H2로 여러번 퍼징하였다. 혼합물을 H2(50 psi) 하에 30℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 완료된 것으로 나타났다. 혼합물을 농축시켜 미정제물을 수득하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 20/1, 1/9, 에틸 아세테이트: 메탄올 = 20: 1)로 정제하여 WV-RA-010(8 g, 91.95% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
1 HNMR (400MHz, CDCl3 ) δ = 4.27 - 4.01 (m, 5H), 3.99 - 3.81 (m, 2H), 3.61 - 3.41 (m, 2H), 2.23 - 1.86 (m, 4H), 1.80 - 1.63 (m, 1H), 1.34 (t, J=7.0 Hz, 6H), 1.12 (d, J=6.6 Hz, 3H)
13 CNMR (101MHz, CDCl3 ) δ = 89.97, 89.85, 74.18, 66.68, 61.92, 35.71, 31.49, 31.46, 29.95, 28.55, 17.50, 17.43, 16.42, 16.36
31 PNMR (162MHz, CDCl3 ) δ = 32.07
LCMS: ELSD (M+H+), 267.1, 100% 순도
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트= 0: 1), Rf = 0.03; (에틸 아세테이트: 메탄올 = 10: 1), Rf = 0.35.
13. 화합물 WV-RA-010- CNE 포스포아미다이트의 제조.
Figure pct00680
WV-RA-010(3 g, 11.27 mmol)을 톨루엔(20 mL*3)과 함께 회전식 증발기에서 공비 증류로 건조하였다. DMF(24 mL)에 1-메틸이미다졸(1.85 g, 22.53 mmol) 및 5-에틸설파닐-2H-테트라졸(1.47 g, 11.27 mmol)을 첨가한 후 3-비스(디이소프로필아미노)포스파닐옥시프로판니트릴(5.09 g, 16.90mmol)을 적하했다. 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC는 WV-RA-010이 소모되었고 새로운 스폿이 관찰된 것으로 나타났다. 혼합물을 포화 NaHCO3(100 mL)에 붓고 혼합물을 에틸 아세테이트(50 mL*3)로 추출하고, 합한 유기물을 Na2SO4로 건조하고 여과하고 농축하여 미정제물을 수득하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1, 3/1, 1/1, 5%TEA)로 정제하여 WV-CA-010- CNE(1.7 g, 32.35% 수율)를 무색물로서 수득하였다.
1 HNMR (400MHz CDCl3 ,) δ = 4.29 - 4.18 (m, 1H), 4.17 - 4.02 (m, 4H), 4.01 - 3.49 (m, 7H), 2.71 - 2.59 (m, 2H), 2.24 - 2.08 (m, 1H), 2.07 - 1.92 (m, 3H), 1.74 - 1.49 (m, 2H), 1.37 - 1.28 (m, 7H), 1.24 - 1.15 (m, 12H), 1.10 (d, J=6.8 Hz, 3H)
13 CNMR (101MHz, CDCl3 ) δ = 117.58, 117.54, 89.31, 89.25, 75.58, 66.95, 61.36, 61.37, 58.07, 46.34, 46.30, 45.49, 45.45, 45.40, 43.20, 34.84, 30.87, 30.84, 30.81, 29.81, 29.79, 28.42, 28.38, 25.72, 24.54, 24.47, 24.39, 23.85, 23.15, 24.36, 22.98, 22.64, 24.29, 20.39, 20.31, 20.30, 20.23, 16.41, 16.35, 15.94, 15.40
31 PNMR (162MHz, CDCl3 ) δ = 148.02, 147.78, 31.73, 31.57 (s, 1P), 30.79 (s, 1P)
LCMS: ELSD, 96.42% 순도
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 0:1), Rf = 0.43
실시예 27. 5'-(R)-C-Me-5'- ODMTr -2'-F- dU의 합성.
Figure pct00681
일반 반응식
Figure pct00682
1. 화합물 2의 제조
Figure pct00683
피리딘(550.00 mL) 중 화합물 1(100.00 g, 406.19 mmol)의 용액에 DMTCl(165.16 g, 487.43 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 20시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 1이 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. MeOH(300 mL)를 첨가하고, 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 용매를 제거하였다. 잔류물을 EtOAc(500 mL)에 용해시키고 H2O(500 mL * 3)로 세척하였다. Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 미정제 생성물 화합물 2(285.00 g, 미정제)는 황색 고체로서, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
TLC(에틸 아세테이트: 석유 에테르 = 3:1, 5% TEA) Rf = 0.40
2. 화합물 2A의 제조
Figure pct00684
DCM(500.00 mL) 중 화합물 2(222.82 g, 406.19 mmol)의 용액에 이미다졸(41.48 g, 609.29 mmol) 및 TBSCl(91.83 g, 609.29 mmol, 74.66 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 20시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 2가 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 용매를 제거하였다. 잔류물을 EtOAc(500 mL)에 용해시키고, H2O(500 mL * 3)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 미정제 생성물 화합물 2A(330.00 g, 미정제)는 백색 고체로서, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
TLC(에틸 아세테이트: 석유 에테르 = 3:1) Rf = 0.65.
3. 화합물 3의 제조
Figure pct00685
AcOH(400.00 mL, 80% 수성) 중 화합물 2A(269.23 g, 406.19 mmol)의 용액을 25℃에서 15시간 동안 교반하였다. TLC는 일부 화합물 2A가 남아 있고 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3(수성)이 25℃에서 pH 7이 넘을 때까지 ??칭하고 EtOAc(500 mL)로 희석하고, EtOAc(500 mL * 3)로 추출하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 0/1 10% DCM)로 정제하였다. 60 g의 화합물 3 및 130 g의 화합물 2A를 단리하였다. 화합물 3(60.00 g, 40.98% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.
TLC(에틸 아세테이트: 석유 에테르 = 3:1）Rf = 0.45.
4. 화합물 4의 제조
Figure pct00686
MeCN(360.00 mL) 및 H2O(360.00 mL) 중 화합물 3(30.00 g, 83.23 mmol)의 용액에 TEMPO(2.62 g, 16.65 mmol) 및 PhI(OAc)2(58.98 g, 183.10 mmol)를 25℃에서 3시간 동안 첨가하였다. TLC는 화합물 3이 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 많은 용매를 제거하였다. 고체를 여과하고 고체를 MeCN으로 세척하였다. 다른 액체는 감압하에 농축한 후 포화 KOH(수성, 2 M)를 약 pH 12까지 용해하고, EtOAc(200 mL*3)로 세척한 후 HCl(수성, 1 M)을 약 pH 3까지 여과하여 황색 고체로서 농축하였다. 화합물 4(52.00 g, 138.87 mmol, 83.43% 수율)를 황색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, DMSO -d 6 ) δ = 7.96 (d, J=8.3 Hz, 1H), 5.99 (dd, J=3.1, 16.2 Hz, 1H), 5.71 (dd, J=2.2, 8.3 Hz, 1H), 5.34 - 5.03 (m, 1H), 4.70 - 4.48 (m, 1H), 4.30 (d, J=5.3 Hz, 1H), 0.86 (s, 9H), 0.08 (s, 6H).
LCMS : (M+H+): 374.9
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 1:1, Rf = 0)
5. 화합물 5의 제조
Figure pct00687
피리딘(50.00 mL) 중 화합물 4(26.00 g, 69.44 mmol)의 용액에 N-메톡시메탄아민 염산염(8.13 g, 83.33 mmol) 및 EtOAc(150.00 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 교반한 후 N2에서 T3P(46.40 g, 145.82 mmol, 43.36 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 3시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 4가 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 생성된 혼합물을 후처리를 위해 또 다른 배치(26 g 규모)과 합하였다. 생성된 혼합물을 HCl(1 M, 1.1 L)로 세척하고 수성층을 DCM(1 L*2)으로 추출하였다. 합한 유기층을 포화 수성 Na2CO3으로 pH가 12가 될 때까지 세척하고 Na2SO4로 건조하고 여과하고 농축하여 미정제 생성물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1 /0 내지 0 :1)로 정제하여 생성물(52 g)을 수득하였다. 화합물 5(26.00 g, 89.68%의 수율)를 황색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, CDCl3 ) δ = 8.91 (br s, 1H), 8.28 (d, J=8.2 Hz, 1H), 6.31 (dd, J=5.2, 11.6 Hz, 1H), 5.73 (dd, J=0.9, 8.2 Hz, 1H), 4.94 - 4.83 (m, 1H), 4.80 - 4.75 (m, 1H), 4.31 (td, J=3.9, 7.7 Hz, 1H), 3.66 (s, 3H), 3.17 (s, 3H), 1.95 (s, 1H), 1.65 (s, 1H), 1.16 (t, J=7.1 Hz, 1H), 0.86 - 0.77 (m, 9H), 0.02 (d, J=12.3 Hz, 6H)
LCMS : (M+H+): 418.1
TLC(에틸 아세테이트: 석유 에테르 = 1:1) Rf = 0.26.
6. 화합물 6의 제조
Figure pct00688
THF(500.00 mL) 중 화합물 5(52.00 g, 124.55 mmol)의 용액에 MeMgBr(3 M, 83.03 mL)을 -20~0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 -20~10℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 5가 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 포화 NH4Cl(500 mL)을 0℃에서 첨가하여 ??칭하고 EtOAc(600 mL)로 희석하고, EtOAc(600 mL * 3)로 추출하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1 /0 to 0:1)로 정제하여 생성물(29 g) 및 미정제 생성물(10 g)을 수득하였다. 화합물 6(29.00 g, 62.51% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, CDCl3 ) δ = 8.90 (br s, 1H), 7.83 (d, J=7.9 Hz, 1H), 5.95 - 5.77 (m, 2H), 5.10 - 4.90 (m, 1H), 4.56 (d, J=6.6 Hz, 1H), 4.37 (ddd, J=4.6, 6.6, 15.1 Hz, 1H), 2.27 (s, 3H), 1.04 - 0.86 (m, 10H), 0.13 (d, J=7.0 Hz, 6H)
LCMS : (M+H+): 373.0
TLC(에틸 아세테이트: 석유 에테르 = 1:1）Rf = 0.4
2. 화합물 7B의 제조
Figure pct00689
EtOAc(187.50 mL) 중 화합물 6(24.00 g, 64.44 mmol)의 용액에 H2O(750.00 mL) 중 포름산나트륨(204.65 g, 3.01 mol) 및 N2 중 [[(1R,2R)-2-아미노-1,2-디페닐-에틸]-(p-톨릴술포닐)아미노]-클로로-루테늄;1-이소프로필-4-메틸-벤젠(819.90 mg, 1.29 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 20시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 6이 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 혼합물을 DCM(1000 mL*3)으로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(1000 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 미정제물을 황색 고체로서 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/ 0 내지 0: 1)로 정제하여 생성물(19.8 g)을 수득한 후 MTBE로 세척하여 생성물(18 g)을 수득하였다. 화합물 7B(18.00 g, 74.59% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, CDCl3 ) δ = 8.15 (br s, 1H), 7.32 (d, J=7.9 Hz, 1H), 5.63 (d, J=8.2 Hz, 1H), 5.53 (dd, J=5.1, 14.6 Hz, 1H), 5.26 - 5.04 (m, 1H), 4.41 - 3.92 (m, 2H), 3.83 (br s, 1H), 2.86 (d, J=2.2 Hz, 1H), 1.13 (d, J=6.6 Hz, 3H), 0.79 (s, 9H), 0.00 (s, 6H)
HPLC : HPLC 순도 = 100%;
SFC : SFC 순도 =100% ee;
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 1:1) Rf = 0.23
8. 화합물 4의 제조
Figure pct00690
화합물 7B(9.00 g, 24.03 mmol)를 피리딘(150 mL) 및 톨루엔(150 mL*2)과 함께 회전식 증발기 상에서 공비 증류로 건조시켰다.
피리딘(90.00 mL) 및 THF(270.00 mL) 중 화합물 7B(9.00 g, 24.03 mmol)의 용액에 DMTC1(15.47 g, 45.66 mmol)에 이어서 AgNO3(7.02 g, 41.33 mmol, 6.95 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 20시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 7B가 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 혼합물에 톨루엔(200 mL)을 첨가하고, MeOH(1.3 mL)를 첨가하여 ??칭하고, 25℃에서 1시간 동안 교반한 후, 셀라이트를 통해 여과하고, 셀라이트 플러그를 톨루엔(150 mL)으로 완전히 세척하고, 감압하에 농축하여 미정제물을 수득하였다. 미정제 생성물 화합물 8B(16.26 g, 100.00% 수율)를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 1:1) Rf = 0.61.
9. 화합물 5'-(R)-C-Me-5'- ODMTr -2'-F- dU의 제조
Figure pct00691
THF(324.00 mL) 중 화합물 8B(32.40 g, 47.87 mmol)의 용액에 TBAF(1 M, 90.95 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 8B가 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 용매를 제거하였다. 잔류물을 EtOAc(300 mL)로 희석하고, 포화 NaCl(수성, 200 mL)로 세척하고 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 0: 1)로 정제하여 생성물(25 g)을 수득하였다. 화합물 5'-(R)-C-Me-5'-ODMTr-2'-F-dU(25.00 g, 92.83% 수율)를 황색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, CDCl3 ) δ = 7.47 (d, J=7.7 Hz, 2H), 7.38 (dd, J=9.0, 10.1 Hz, 4H), 7.30 - 7.23 (m, 2H), 7.22 - 7.18 (m, 1H), 6.83 (br d, J=7.7 Hz, 4H), 5.90 (dd, J=2.4, 17.6 Hz, 1H), 5.31 - 5.18 (m, 1H), 5.08 - 4.87 (m, 1H), 4.51 (td, J=5.9, 15.7 Hz, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.72 - 3.60 (m, 2H), 1.05 (d, J=6.4 Hz, 3H).
13 C NMR (101MHz, CDCl3 ) δ = 171.28, 163.37, 158.68, 158.59, 150.04, 146.03, 140.47, 136.06, 130.47, 130.31, 128.08, 127.90, 126.94, 113.23, 113.15, 102.57, 94.11, 92.24, 87.76, 87.43, 87.20, 85.77, 69.46, 69.42, 69.25, 60.45, 55.25, 55.24, 21.06, 17.66, 14.19.
LCMS : (M-H+): 561.2
HPLC : HPLC 순도 = 99.05%;
SFC : SFC 순도 =100% ee;
TLC(에틸 아세테이트: 석유 에테르 = 1:1, Rf = 0.18)
실시예 28. 5'-(R)-C-Me-5'- ODMTr -2'-F- dU - CNE 포스포아미다이트의 합성.
Figure pct00692
1. 화합물 5'-(R)-C-Me-5'- ODMTr -2'-F- dU - CNE - 포스포르아미다이트의 제조
Figure pct00693
DCM(49 mL) 중 5'-(R)-C-Me-5'-ODMTr-2'-F-dU(4.9 g, 8.71 mmol)의 용액에 DIEA(1.35 g, 10.45 mmol, 1.83 mL) 및 화합물 1A(2.69 g, 9.15 mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 0~15℃에서 3시간 동안 교반하였다. TLC는 5'-(R)-C-Me-5'-ODMTr-2'-F-dU가 소모되었고 2개의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 혼합물에 포화 NaHCO3(20 mL)을 첨가하고 DCM(50 mL* 3)으로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 MPLC(SiO2, 에틸 아세테이트/석유 에테르 = 0%, 20%, 40%, 60%, 70%, 100%, 5% TEA)로 정제하여 4.3 g(배치 1: 3.24 g, 배치 2: 1.06 g)의 화합물 5'-(R)-C-Me-5'-ODMTr-2'-F-dU-CNE-포스포아미다이트(4.3 g, 64.72% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.
배치 1:
1 H NMR: (400MHz, CDCl3) δ = 7.59 - 7.15 (m, 11H), 6.93 - 6.76 (m, 4H), 6.01 - 5.89 (m, 1H), 5.32 (s, 1H), 5.16 (dd, J=8.2, 14.9 Hz, 1H), 5.08 - 5.02 (m, 1H), 4.93 - 4.75 (m, 1H), 4.03 - 3.85 (m, 2H), 3.84 - 3.77 (m, 6H), 3.74 - 3.62 (m, 3H), 3.61 - 3.47 (m, 1H), 2.77 (dt, J=1.9, 6.2 Hz, 1H), 2.72 - 2.59 (m, 2H), 1.27 - 1.17 (m, 11H), 0.99 (dd, J=2.0, 6.6 Hz, 3H).
31 P NMR: (162MHz, CDCl3) δ = 150.63 (s, 1P), 150.54 (s, 1P), 150.34 (s, 1P), 150.27 (s, 1P), 14.14 (s, 1P).
HPLC : HPLC 순도 = 97.66 %;
LCMS : (M-H+): 761.3;
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 3:1), Rf1 = 0.53, Rf2 = 0.62.
5'-(S)-C-Me-5'- ODMTr -2'-F- dU의 합성.
Figure pct00694
일반 반응식
Figure pct00695
3. 화합물 2의 제조
Figure pct00696
피리딘(550.00 mL) 중 화합물 1(100.00 g, 406.19 mmol)의 용액에 DMTCl(165.16 g, 487.43 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 20시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 1이 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. MeOH(300 mL)를 첨가하고, 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 용매를 제거하였다. 잔류물을 EtOAc(500 mL)에 용해시키고 H2O(500 mL * 3)로 세척하였다. Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 미정제 생성물(285.00 g, 미정제)는 황색 고체로서, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
TLC(에틸 아세테이트: 석유 에테르 = 3:1, 5% TEA) Rf = 0.40
4. 화합물 2A의 제조
Figure pct00697
DCM(500.00 mL) 중 화합물 2(222.82 g, 406.19 mmol)의 용액에 이미다졸(41.48 g, 609.29 mmol) 및 TBSCl(91.83 g, 609.29 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 20시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 2가 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 용매를 제거하였다. 잔류물을 DCM(500 mL)으로 희석하고 H2O(500 mL * 3)로 세척하였다. Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 미정제 생성물(330.00 g, 미정제)는 백색 고체로서, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
TLC(에틸 아세테이트: 석유 에테르 = 3:1) Rf = 0.65
3. 화합물 3의 제조
Figure pct00698
AcOH(400.00 mL, 80% 수성) 중 화합물 2A(269.23 g, 406.19 mmol)의 용액을 25℃에서 15시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 2A가 조금 남아 있고, 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3(수성)을 25℃에서 pH 7을 넘을 때까지 ??칭한 후, EtOAc(500 mL)로 희석하고, EtOAc(500 mL *3)로 추출하였다. Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 0/1 10% DCM)로 정제하였다. 생성물(60 g)을 수득하고 130개의 화합물 2A를 회수하였다. 화합물 3(60.00 g, 40.98% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.
TLC(에틸 아세테이트: 석유 에테르 = 3:1) Rf = 0.45
4. 화합물 4의 제조
Figure pct00699
DCM(400.00 mL) 중 화합물 3(10.00 g, 27.74 mmol)의 용액에 DMP(14.12 g, 33.29 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 0~50℃에서 6시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 3이 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 포화 Na2S2O3(수성, 300 mL) 및 포화 NaHCO3(수성, 300 mL)을 0℃에서 첨가하여 ??칭하고, EtOAc(800 mL)로 희석하고, EtOAc(800 mL * 3)로 추출하였다. Na2SO4로 건조하고 여과하고 25℃에서 감압하에 농축하였다. 미정제 생성물 화합물 4(9.50 g, 황색 고체로서 미정제)를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
TLC(에틸 아세테이트: 석유 에테르 = 3:1) Rf = 0.37
5. 화합물 5의 제조
Figure pct00700
THF(200 mL) 중 MeMgBr(3 M, 35.33 mL)의 용액에 THF(300 mL) 중 화합물 4(9.5 0g, 26.50 mmol)를 -25℃에서 N2 하에 첨가하였다. 혼합물을 -25℃~25℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 4가 소모되었고, 2개의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 NH4Cl(3000 mL)을 0℃에서 첨가하여 ??칭하고, EtOAc(400 mL)로 희석하고, EtOAc(400 mL * 3)로 추출하였다. Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 0/1)로 정제하여 화합물 5A(1 g), 화합물 5B(0.6 g), 화합물 5A와 화합물 5B의 다른 혼합물을 수득하였다. 화합물 5A(1.00 g, 10.08% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다. 화합물 5B(600.00 g, 6.04% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다.
화합물 5A:
1 H NMR (400MHz, DMSO -d 6 ) δ = 7.89 (d, J=8.2 Hz, 1H), 5.82 (dd, J=2.2, 16.9 Hz, 1H), 5.53 (d, J=8.1 Hz, 1H), 5.09 (d, J=4.6 Hz, 1H), 5.05 - 4.87 (m, 1H), 4.22 (ddd, J=4.5, 6.7, 18.1 Hz, 1H), 3.73 - 3.65 (m, 1H), 3.62 (br d, J=6.7 Hz, 1H), 1.14 - 1.05 (m, 3H), 0.81 - 0.67 (m, 9H), 0.00 (d, J=2.3 Hz, 6H);
LCMS: (M+H+): 375.1; LCMS 순도 = 90.1%;
HPLC: 순도 97.9%;
TLC(에틸 아세테이트: 석유 에테르 = 1:1) 5A: Rf1 = 0.42; 5B: Rf2 = 0.47.
화합물 5B:
1 H NMR (400MHz, DMSO -d 6 ) δ = 7.78 (d, J=8.1 Hz, 1H), 5.84 (dd, J=4.0, 15.7 Hz, 1H), 5.60 - 5.49 (m, 1H), 5.14 - 5.03 (m, 1H), 4.98 - 4.89 (m, 1H), 4.32 (td, J=4.9, 12.0 Hz, 1H), 3.86 - 3.73 (m, 1H), 3.70 - 3.57 (m, 1H), 1.00 (d, J=6.6 Hz, 3H), 0.85 - 0.67 (m, 9H), 0.06 - -0.10 (m, 6H);
LCMS: (M+H+): 375.1;
HPLC: 순도 75.9%;
TLC(에틸 아세테이트: 석유 에테르 = 1:1) 5A: Rf1 = 0.42; 5B: Rf2 = 0.47.
6. 화합물 6A의 제조
Figure pct00701
화합물 5A(1.00 g, 2.67 mmol)를 피리딘(20 mL) 및 톨루엔(20 mL*2)과 함께 회전식 증발기 상에서 공비 증류로 건조시켰다. THF(30.00 mL) 및 피리딘(9.93 g, 125.49 mmol, 10.13 mL) 중 5A(1.00 g, 2.67 mmol)의 용액에 1-[클로로-(4-메톡시페닐)-페닐-메틸]-4-메톡시-벤젠(1.72 g, 5.07 mmol)을 첨가한 후 AgNO3(780.11 mg, 4.59 mmol)을 N2 하에서 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 20시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 5A가 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 혼합물에 톨루엔(30 mL)을 첨가하고, MeOH(0.1 mL)를 첨가하여 ??칭하고, 25℃에서 1시간 동안 교반한 후, 셀라이트를 통해 여과하고, 셀라이트 플러그를 톨루엔(20 mL)으로 완전히 세척하고, 감압하에 농축하여 미정제물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/ 0 내지 0/ 1)로 정제하여 생성물(1.1 g)을 수득하였다. 화합물 6A(1.10 g, 60.87% 수율)를 황색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, CDCl3 ) δ = 8.08 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.48 (br d, J=7.5 Hz, 2H), 7.43 - 7.27 (m, 9H), 6.93 (dd, J=4.0, 8.6 Hz, 4H), 6.15 (dd, J=3.1, 14.1 Hz, 1H), 5.68 (d, J=8.2 Hz, 1H), 5.09 - 4.87 (m, 1H), 4.34 (td, J=5.2, 14.5 Hz, 1H), 4.01 (br d, J=4.9 Hz, 1H), 3.91 (d, J=1.5 Hz, 7H), 3.83 (br dd, J=2.8, 6.7 Hz, 1H), 2.29 (s, 1H), 2.19 - 2.03 (m, 1H), 1.10 (d, J=6.4 Hz, 3H), 1.04 - 1.00 (m, 1H), 0.92 (s, 9H), 0.18 (s, 1H), 0.15 (s, 3H), 0.00 (s, 3H).
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 1:1) Rf = 0.64
6. 5'-(S)-C-Me-5'- ODMTr -2'-F- dU의 제조.
Figure pct00702
THF(15.00 mL) 중 화합물 6A(1.00 g, 1.48 mmol)의 용액에 TBAF(733.96 mg, 2.81 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 6A가 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 혼합물을 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 EtOAc(20 mL)로 용해시키고 NaCl(5%, 수성, 20 mL)로 세척하고, EtOAc(20 mL*3)로 추출하였다. Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/ 0 내지 0/ 1)로 정제하여 생성물(0.7 g)을 수득하였다. 화합물 5'-(S)-C-Me-5'-ODMTr-2'-F-dU(700.00 g, 84.07% 수율)를 황색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz CDCl3 , ) δ = 7.75 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.51 - 7.46 (m, 2H), 7.44 - 7.36 (m, 4H), 7.36 - 7.32 (m, 1H), 7.29 - 7.24 (m, 1H), 6.88 (dd, J=2.2, 8.9 Hz, 4H), 5.92 (dd, J=1.5, 18.0 Hz, 1H), 5.34 (s, 1H), 5.19 - 4.95 (m, 1H), 3.84 (d, J=1.1 Hz, 6H), 3.80 - 3.71 (m, 1H), 1.12 (d, J=6.5 Hz, 3H);
13 C NMR (101MHz, CDCl3 ) δ = 162.95, 158.70, 149.74, 145.60, 140.44, 136.26, 136.06, 130.71, 128.54, 127.98, 127.55, 126.79, 113.81, 113.19, 112.99, 112.34, 102.72, 102.47, 88.87, 88.60, 88.53, 88.26, 87.22, 85.76, 85.52, 69.12, 68.93, 68.52, 68.28, 55.61, 55.37, 54.88, 18.29;
LCMS: (M-H+): 561.2;
HPLC: 순도 93.2%;
TLC(에틸 아세테이트: 석유 에테르 = 1:1) Rf = 0.17.
실시예 29. 화합물 5'-(S)-C-Me-5'- ODMTr -2'-F- dU - CNE의 제조
Figure pct00703
화합물 5'-(S)-C-Me-5'- ODMTr -2'-F- dU(4.85 g, 8.62 mmol)를 톨루엔(10 mL *3)과 함께 회전식 증발기에서 공비 증류로 건조시켰다. DMF(48.5 mL) 중 화합물 5'-(S)-C-Me-5'-ODMTr-2'-F-dU(4.85 g, 8.62 mmol)의 용액에 N-메틸이미다졸(1.42 g, 17.24 mmol, 1.37 mL) 및 5-에틸설파닐-2H-테트라졸(1.12 g, 8.62 mmol)을 첨가하고, 탈기하고 N2로 3회 퍼징하였다. 이어서 3-비스(디이소프로필아미노)포스파닐옥시프로판니트릴(3.90 g, 12.93 mmol, 4.11 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 하에 15℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 5'-(S)-C-Me-5'- ODMTr -2'-F- dU가 소모되었고 2개의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 혼합물에 포화 NaHCO3(수성, 50 mL)을 첨가하고, 에틸 아세테이트(50 mL*3)로 추출하였다. 합한 유기층을 H2O(50 mL * 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 N2 분위기 하에 30℃ 수조에서 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 0:1)로 정제하여 생성물(4 g)을 수득하였다. 화합물 5'-(S)-C-Me-5'- ODMTr -2'-F- dU - CNE(4 g, 56.66% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, CDCl3) δ = 8.78 (br s, 1H), 8.00 - 7.79 (m, 1H), 7.41 - 7.08 (m, 10H), 6.86 - 6.64 (m, 4H), 5.93 (br t, J = 17.2 Hz, 1H), 5.46 (dd, J = 2.8, 8.1 Hz, 1H), 5.19 - 4.93 (m, 1H), 4.51 - 4.25 (m, 1H), 3.99 - 3.87 (m, 1H), 3.84 - 3.71 (m, 6H), 3.70 - 3.61 (m, 2H), 3.59 - 3.30 (m, 4H), 2.94 - 2.77 (m, 2H), 2.73 - 2.62 (m, 1H), 2.56 - 2.41 (m, 1H), 2.23 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 1.32 - 0.82 (m, 22H);
13 C NMR (101MHz, CDCl3) δ = 163.21, 163.07, 158.72, 158.65, 150.08, 149.95, 145.98, 139.98, 136.48, 136.25, 136.16, 130.76, 130.71, 128.60, 127.69, 127.05, 126.95, 117.76, 113.00, 102.41, 88.32, 87.08, 86.45, 69.83, 69.10, 68.62, 60.39, 58.26, 58.22, 58.16, 58.07, 57.88, 55.26, 55.21, 45.36, 45.30, 36.47, 31.44, 24.51, 22.94, 21.04, 20.28, 18.67, 14.20;
31 P NMR (162MHz, 클로로포름-d) δ = 150.70 (s, 1P), 150.65 (s, 1P), 150.63 (s, 1P), 150.54 (s, 1P), 14.18 (s, 1P);
LCMS : (M-H+): 761.2;
HPLC : HPLC 순도 = 52.15 % + 41.00 %;
TLC: (에틸 아세테이트: 석유 에테르 = 3:1), Rf1 = 0.32, Rf2 = 0.4.
실시예 30. 5'-(R)-C-Me-5'- ODMTr -2'- OMe -U의 합성.
Figure pct00704
일반 반응식
Figure pct00705
1. 화합물 5B의 제조
Figure pct00706
THF(140 mL) 중 화합물 4(19.00 g, 51.29 mmol)의 용액에 MeMgBr(3 M, 68.39 mL)(140 mL THF 중 용액)을 -20℃에서 10분에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 -20℃~20℃에서 30분 동안 교반하였다. TLC는 화합물 4가 부분적으로 남아 있고 새로운 스폿이 검출된 것으로 나타났다. 이어서 혼합물을 20℃에서 20분 동안 교반하였다. TLC 및 LCMS는 화합물 4가 부분적으로 남아 있고 새로운 스폿이 검출된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 포화 NH4Cl(200 mL)를 0℃에서 첨가하여 ??칭하고, EtOAc(500 mL)로 희석하고, EtOAc(500 mL*3)로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 MPLC(플래쉬 실리카(CS), 40~60μm, 60A, 220 g, 에틸 아세테이트/석유 에테르 = 0%, 10%, 20%, 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 100%)로 정제하여 화합물 5A(1.80 g, 9.08% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다. 화합물 5B(1.60 g, 8.07% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다.
TLC(플레이트 1: 석유 에테르: 에틸 아세테이트=1:3) Rf1=0.39,Rf2=0.32
화합물 5A
1 H NMR (400MHz, DMSO -d 6 ) δ = 11.26 (s, 1H), 7.98 (d, J=8.2 Hz, 1H), 5.75 (d, J=4.6 Hz, 1H), 5.58 (d, J=8.2 Hz, 1H), 5.10 (d, J=4.4 Hz, 1H), 4.19 (t, J=4.6 Hz, 1H), 3.72 (br t, J=4.9 Hz, 2H), 3.60 (br d, J=2.9 Hz, 1H), 3.25 (s, 3H), 1.07 (d, J=6.4 Hz, 3H), 0.79 (s, 9H), 0.00 (s, 6H)
LCMS (M+H+): 387.1
TLC(플레이트 1: 석유 에테르: 에틸 아세테이트=1:3) Rf1=0.39
화합물 5B
1 H NMR (400MHz, DMSO -d 6 ) δ = 11.28 (s, 1H), 7.80 (d, J=8.2 Hz, 1H), 5.77 (d, J=6.8 Hz, 1H), 5.58 (d, J=8.2 Hz, 1H), 5.07 (br s, 1H), 4.33 - 4.29 (m, 1H), 3.77 (dd, J=5.1, 6.6 Hz, 1H), 3.72 - 3.64 (m, 1H), 3.55 (dd, J=2.0, 4.0 Hz, 1H), 3.18 (s, 3H), 1.01 (d, J=6.6 Hz, 3H), 0.78 (s, 9H), 0.00 (s, 6H)
LCMS (M+H+): 387.2
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트=1:2) Rf2 = 0.32
5. 화합물 6B의 제조
Figure pct00707
화합물 5B(1.10 g, 2.85 mmol)를 피리딘(20 mL) 및 톨루엔(20 mL*2)과 함께 회전식 증발기 상에서 공비 증류로 건조시켰다. THF(33.00 mL) 및 피리딘(11.52 g, 145.70 mmol, 11.76 mL) 중 화합물 5B(1.10 g, 2.85 mmol)의 용액에 DMTC1(1.83 g, 5.41 mmol)를 첨가한 후 AgNO3(831.53 mg, 4.90 mmol, 823.30 uL)을 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 20시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 5B가 소모되었고, 새로운 스폿이 검출된 것으로 나타났다. 혼합물에 톨루엔(30 mL)을 첨가하고, MeOH(0.1 mL)를 첨가하여 ??칭하고, 25℃에서 1시간 동안 교반한 후, 셀라이트를 통해 여과하고, 셀라이트 플러그를 톨루엔(20 mL)으로 완전히 세척하고, 감압하에 농축하여 미정제물을 수득하였다. 화합물 6B(3.00 g, 미정제)를 황색 오일로서 수득하였다.
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트=1:1) Rf=0.43.
6. 화합물 5'-(R)-C-Me-5'- ODMTr -2'- OMe -U의 제조
Figure pct00708
THF(40.00 mL) 중 화합물 6B(1.96 g, 2.85 mmol)의 용액에 TBAF(1 M, 5.41 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 6B가 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 검출된 것으로 나타났다. 혼합물을 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 EtOAc(50 mL)로 용해시키고 NaCl(5%, 수성, 50 mL)로 세척하고 EtOAc(50 mL*3)로 추출하고 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 MPLC(SiO2, 실리카 겔을 석유 에테르(5%TEA), 에틸 아세테이트/석유 에테르 = 0%; 20%; 50%; 70%, 80% 내지 100%로 세척)로 정제하여 화합물 5'-(R)-C-Me-5'- ODMTr -2'- OMe -U (950.00 mg, 56.95% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, DMSO -d 6 ) δ = 11.37 (s, 1H), 7.44 (d, J=7.6 Hz, 2H), 7.36 - 7.19 (m, 8H), 6.90 (d, J=8.9 Hz, 4H), 5.78 - 5.71 (m, 1H), 5.21 - 5.13 (m, 2H), 4.30 (q, J=5.6 Hz, 1H), 3.78 - 3.64 (m, 8H), 3.52 - 3.42 (m, 1H), 3.34 (s, 3H), 0.79 (d, J=6.4 Hz, 3H)
13 C NMR (101MHz, DMSO -d 6 ) δ = 163.24, 158.58, 158.55, 150.82, 146.71, 140.99, 136.59, 136.48, 130.63, 128.33, 128.16, 127.07, 113.58, 113.52, 102.25, 87.59, 86.52, 86.29, 82.06, 69.89, 68.16, 58.10, 55.51, 55.49, 33.72, 23.07, 17.61, 15.20
HPLC 순도: 98.168%
LCMS (M+H+): 573.1
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트=1:2) Rf = 0.10
실시예 31. 화합물 5'-(R)-C-Me-5'- ODMTr -2'- OMe -U- CNE - 포스포아미다이트의 제조
Figure pct00709
DIEA(1.32 g, 10.23 mmol, 1.79 mL)를 Ar atm. 하에서 무수 DCM(50 mL) 중 화합물 1(4.9 g, 8.53 mmol)의 교반 용액에 연속적으로 첨가한 후 0℃에서 화합물 1A(43.25 mg, 182.73 umol)를 첨가하였다. 이어서 0℃~15℃에서 3시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 1이 부분적으로 남아 있고, 2개의 주 스폿이 검출된 것으로 나타났다. 이어서 화합물 1A(201.82 mg, 852.74 umol)를 첨가하였다. 0℃~15℃에서 1시간 동안 교반한 후, TLC는 화합물 1이 부분적으로 남아 있고 2개의 주 스폿이 검출된 것으로 나타났다. 혼합물에 포화 NaHCO3(수성, 20 mL)을 첨가하고 DCM(50 mL*3)으로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고 여과하고 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 MPLC(SiO2, 에틸 아세테이트/석유 에테르 = 0%, 20%, 40%, 60%, 70%, 100%, 5%TEA)로 정제하여 화합물 5'-(R)-C-Me-5'- ODMTr -2'-OMe-U-CNE-포스포아미다이트(4.0 g, 60.54% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, CDCl3 ) δ = 7.56 - 7.48 (m, 2H), 7.47 - 7.36 (m, 4H), 7.33 - 7.20 (m, 5H), 6.86 (td, J=2.5, 8.9 Hz, 4H), 5.94 (t, J=4.7 Hz, 1H), 5.06 (dd, J=1.2, 8.1 Hz, 1H), 4.91 - 4.71 (m, 1H), 4.04 - 3.86 (m, 4H), 3.82 (s, 6H), 3.76 - 3.65 (m, 3H), 3.53 (d, J=8.7 Hz, 4H), 2.71 - 2.53 (m, 3H), 1.27 - 1.22 (m, 10H), 1.01 (t, J=6.3 Hz, 3H)
31 P NMR (162MHz, CDCl3 ) δ = 150.16, 149.61, 14.16
LCMS: (M-H+): 773.3
HPLC 순도: 40.8% + 50.0%
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 1:3, 5%TEA) Rf1 = 0.60, Rf2 = 0.55
실시예 32. 5'-(S)-C-Me-5'- ODMTr -2'- OMe -U의 합성.
Figure pct00710
일반 반응식
Figure pct00711
1. 화합물 2의 제조
Figure pct00712
피리딘(80.00 mL) 중 화합물 1(10.00 g, 38.73 mmol)의 용액에 DMTCl(15.75 g, 46.48 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 0~20℃에서 16시간 동안 교반하였다. TLC는 출발 물질이 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 검출된 것으로 나타났다. 생성된 혼합물을 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트(300 mL) 및 H2O(150 mL)를 첨가하여 용해시키고 에틸 아세테이트(300 mL*3)로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 미정제물 (25 g)을 황색 고체로서 수득하였다. 화합물 2(25.00 g, 미정제)를 황색 오일로서 수득하였다.
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트=1:3, 5% TEA) Rf = 0.1.
2. 화합물 2A의 제조
Figure pct00713
DCM(200.00 mL) 중 화합물 2(24.00 g, 42.81 mmol)의 용액에 이미다졸(5.83 g, 85.62 mmol) 및 TBSCl(9.68 g, 64.21 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 14시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 2가 부분적으로 남아 있고, 하나의 주 스폿이 검출된 것으로 나타났다. 생성된 용액을 다른 배치 생성물(1 g 규모)과 합하고 DCM(300 mL)으로 희석하고 NaHCO3(수성, 100 mL) 및 염수(100 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 미정제물(28 g)을 수득하였다. 화합물 2A(26.88 g, 93.04% 수율 )(변환율로부터의 수율)를 백색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, CDCl3 ) δ = 9.29 (br s, 1H), 8.64 (br d, J=4.2 Hz, 1H), 8.19 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.40 - 7.25 (m, 12H), 7.20 (d, J=8.8 Hz, 2H), 6.89 - 6.81 (m, 5H), 5.98 (s, 1H), 5.28 (d, J=7.9 Hz, 1H), 4.43 (dd, J=5.0, 8.0 Hz, 1H), 4.11 (br d, J=8.2 Hz, 1H), 3.84 - 3.78 (m, 8H), 3.73 - 3.55 (m, 5H), 3.42 - 3.36 (m, 1H), 1.00 - 0.83 (m, 16H), 0.15 - 0.04 (m, 7H);
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트=1:3) Rf = 0.47.
3. 화합물 3의 제조
Figure pct00714
CH3COOH/H2O(V/V = 80%, 100 mL) 중 화합물 2A(27.00 g, 40.01 mmol)의 용액에. 혼합물을 20℃에서 16시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 2A가 소모되었고, 하나의 주 스폿이 검출된 것으로 나타났다. 생성된 용액을 에틸 아세테이트(300 mL)로 희석하고, 포화　NaHCO3(수성)을 약 pH 7까지 첨가한 후, 에틸 아세테이트(300 mL*3)로 추출하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 미정제물을 수득하였다. 미정제물을 MPLC(SiO2, 석유 에테르: 에틸 아세테이트=5:1 to 1:3)로 정제하였다. 화합물 3(10.00 g, 67.10% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz,) CDCl3 δ = 8.18 (br s, 1H), 7.56 (d, J=8.2 Hz, 1H), 5.62 (dd, J=2.1, 8.3 Hz, 1H), 5.55 (d, J=4.2 Hz, 1H), 4.25 (t, J=5.1 Hz, 1H), 3.91 - 3.86 (m, 2H), 3.65 (br dd, J=7.1, 11.9 Hz, 1H), 3.38 (s, 3H), 2.46 (br d, J=4.2 Hz, 1H), 0.81 (s, 9H), 0.01 (d, J=5.5 Hz, 6H);
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트=1:1) Rf = 0.28.
3. 화합물 4의 제조
Figure pct00715
DCM(50.00 mL) 중 화합물 3(3.00 g, 8.05 mmol)의 용액에 DMP(4.10 g, 9.66 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 3이 부분적으로 남아 있고 하나의 주 스폿이 검출된 것으로 나타났다. 혼합물을 희석하고 EtOAc(50 mL)를 첨가하고 Na2S2O3(5% 수성, 80 mL) 및 포화 NaHCO3(수성, 80 mL)를 0℃에서 첨가하여 ??칭하고, 20분 동안 교반하고 EtOAc(200 mL *3)로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 25℃ 수조에서 감압하에 농축하여 미정제물을 수득하였다. 화합물 4(2.50 g, 미정제)를 백색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, CDCl3 ) δ = 9.64 (s, 1H), 7.55 - 7.44 (m, 1H), 5.73 - 5.56 (m, 2H), 4.42 - 4.25 (m, 1H), 3.80 (br t, J=4.5 Hz, 1H), 3.42 - 3.20 (m, 3H), 0.78 (s, 9H), 0.07 - 0.14 (m, 6H);
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트=1:3) Rf = 0.18.
5. 화합물 5A 및 5B의 제조
Figure pct00716
THF(30 mL) 중 화합물 4(2.50 g, 6.75 mmol)의 용액에 MeMgBr(3 M, 9.00 mL)(30 mL THF 중 용액)을 -20℃에서 10분에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 -20℃~20℃에서 30분 동안 교반하였다. TLC는 화합물 4가 부분적으로 남아 있고 새로운 스폿이 검출된 것으로 나타났다. 이어서 혼합물을 20℃에서 20분 동안 교반하였다. TLC는 화합물 4가 부분적으로 남아 있고 새로운 스폿이 검출된 것으로 나타났다. 잔류물을 MPLC(SiO2, 석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 5:1, 3:1, 1:1 내지 1:2)로 정제하여 화합물 5A(320.00 mg, 12.27% 수율)(변환율로부터의 수율)를 백색 고체로서 수득하고 화합물 5B(480.00 mg, 18.37% 수율)(변환율로부터의 수율)를 백색 고체로서 수득하였다.
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트=1:2) Rf1 = 0.39,Rf2 = 0.32
화합물 5A:
1 H NMR (400MHz, DMSO -d 6 ) δ = 11.26 (s, 1H), 7.98 (d, J=8.2 Hz, 1H), 5.75 (d, J=4.6 Hz, 1H), 5.58 (d, J=8.2 Hz, 1H), 5.10 (d, J=4.4 Hz, 1H), 4.19 (t, J=4.6 Hz, 1H), 3.72 (br t, J=4.9 Hz, 2H), 3.60 (br d, J=2.9 Hz, 1H), 3.25 (s, 3H), 1.07 (d, J=6.4 Hz, 3H), 0.79 (s, 9H), 0.00 (s, 6H)
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트=1:2) Rf1 = 0.39
화합물 5B:
1 H NMR (400MHz, DMSO -d 6 ) δ = 11.28 (s, 1H), 7.80 (d, J=8.2 Hz, 1H), 5.77 (d, J=6.8 Hz, 1H), 5.58 (d, J=8.2 Hz, 1H), 5.07 (br s, 1H), 4.33 - 4.29 (m, 1H), 3.77 (dd, J=5.1, 6.6 Hz, 1H), 3.72 - 3.64 (m, 1H), 3.55 (dd, J=2.0, 4.0 Hz, 1H), 3.18 (s, 3H), 1.01 (d, J=6.6 Hz, 3H), 0.78 (s, 9H), 0.00 (s, 6H)
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트=1:2) Rf2 = 0.32
6. 화합물 6A의 제조
Figure pct00717
무수 THF (30.00 mL) 중 사전 정제된 화합물 5A(740.00 mg, 1.91 mmol), DMTC1(1.23 g, 3.63 mmol), 및 피리딘(7.10 g, 89.75 mmol, 7.24 mL)의 혼합물에　AgNO3(558.06 mg, 3.29 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 N2 하에 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 5A가 소모되었고 하나의 새로운 스폿이 검출된 것으로 나타났다. 혼합물을 MeOH(0.1 mL)를 첨가하여 ??칭하고 톨루엔(30 mL)으로 희석하였다. 추가로 1시간 동안 교반 후, 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 셀라이트 플러그를 톨루엔으로 세척하였다. 여과액을 진공에서 증발시켜 미정제물(2.4g)을 수득하였다. 화합물 6A(2.40 g, 미정제)를 황색 오일로서 수득하였다.
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트=1:1) Rf = 0.48.
7. 화합물 5'-(S)-C-Me-5'- ODMTr -2'- OMe -U의 제조
Figure pct00718
THF(12.00 mL) 중 화합물 6A(1.32 g, 1.92 mmol)의 용액에 TBAF(1 M, 3.64 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 6A가 소모되었고, 하나의 새로운 스폿이 검출된 것으로 나타났다. 혼합물을 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 EtOAc(50 mL)로 용해시키고 NaCl(5%, 수성, 50 mL)로 세척하고 EtOAc(50 mL*3)로 추출하고 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 MPLC(SiO2, 실리카 겔을 석유 에테르(5%TEA), 에틸 아세테이트/석유 에테르 = 0%; 20%; 50%; 70%, 80% 내지 100%로 세척)로 정제하였다. 화합물 5'-(S)-C-Me-5'- ODMTr -2'- OMe -U(800.00 mg, 72.51% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, DMSO -d 6 ) δ = 11.42 (s, 1H), 7.62 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.43 (br d, J=7.6 Hz, 2H), 7.34 - 7.19 (m, 7H), 6.88 (dd, J=5.3, 8.7 Hz, 4H), 5.81 - 5.73 (m, 2H), 5.58 (d, J=8.1 Hz, 1H), 5.11 (d, J=6.7 Hz, 1H), 4.22 - 4.11 (m, 1H), 3.83 - 3.72 (m, 8H), 3.55 (quin, J=5.7 Hz, 1H), 3.37 - 3.35 (m, 3H), 0.69 (d, J=6.2 Hz, 3H);
13 C NMR (101MHz, DMSO -d 6 ) δ = 163.35, 158.58, 158.55, 150.93, 146.56, 136.81, 136.70, 130.57, 128.41, 128.08, 113.47, 102.49, 86.37, 85.94, 69.64, 68.18, 57.99, 55.44, 17.66;
LCMS (M+Na+): 597.2, 97.26% 순도;
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트=1:1) Rf = 0.10.
화합물 5'-(S)-C-Me-5'- ODMTr -2'- OMe -U- CNE - 포스포아미다이트의 제조
Figure pct00719
DIEA(1.32 g, 10.23 mmol, 1.79 mL)를 Ar atm. 하에서 무수 DCM(50 mL) 중 화합물 1(4.9 g, 8.53 mmol)의 교반 용액에 연속적으로 첨가한 후 0℃에서 화합물 1A(43.25 mg, 182.73 umol)를 첨가하였다. 이어서 0℃~15℃에서 3시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 1이 부분적으로 남아 있고, 2개의 주 스폿이 검출된 것으로 나타났다. 이어서 화합물 1A(201.82 mg, 852.74 umol)를 첨가하고, 0℃~15℃에서 1시간 동안 교반한 후, TLC는 화합물 1이 부분적으로 남아 있고 2개의 주 스폿이 검출된 것으로 나타났다. 혼합물에 포화 NaHCO3(수성, 20 mL)을 첨가하고 DCM(50 mL*3)으로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고 여과하고 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 MPLC(SiO2, 에틸 아세테이트/석유 에테르 = 0%, 20%, 40%, 60%, 70%, 100%, 5%TEA)로 정제하여 화합물 5'-(S)-C-Me-5'- ODMTr -2'- OMe -U-CNE-포스포아미다이트(4.5 g, 68.11% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, CDCl3 ) δ = 8.56 (br s, 1H), 8.12 - 7.84 (m, 1H), 7.35 - 7.29 (m, 2H), 7.28 - 7.11 (m, 8H), 6.74 (ddd, J=3.0, 5.3, 8.6 Hz, 4H), 5.92 (t, J=4.0 Hz, 1H), 5.48 (t, J=8.1 Hz, 1H), 4.30 - 4.08 (m, 1H), 3.97 - 3.84 (m, 2H), 3.77 - 3.54 (m, 9H), 3.53 - 3.39 (m, 6H), 2.50 (t, J=6.2 Hz, 1H), 2.17 (t, J=6.3 Hz, 1H), 1.10 - 1.01 (m, 9H), 0.97 - 0.91 (m, 4H), 0.88 (br d, J=6.4 Hz, 2H)
31 P NMR (162MHz CDCl3 ,) δ = 150.40, 150.11, 14.16
LCMS: (M-H+): 773.3
HPLC 순도: 40.4% + 49.2%
TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트=1:3, 5%TEA) Rf1=0.60, Rf2=0.55
실시예 32. 5'-( R )- C -Me-5'- ODMTr -dT의 합성.
Figure pct00720
일반 반응식
Figure pct00721
1. 화합물 5B의 제조
Figure pct00722
격막으로 덮인 측면 암이 장착된 100 mL 둥근 바닥 플라스크에 [[(1R,2R)-2-아미노-1,2-디페닐-에틸]-(p-톨릴설포닐)아미노]-클로로-루테늄;1-이소프로필-4-메틸-벤젠(34.53 mg, 54.27 umol) 및 화합물 6(1.00 g, 2.71 mmol)을 채우고, 시스템을 질소로 플러싱하였다. 물(40.00 mL) 중 나트륨;포름산염;이수화물(11.75 g, 112.89 mmol)의 용액을 첨가한 후 EtOAc(10.00 mL)를 첨가하였다. 생성된 2상 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC는 출발 물질이 소모된 것으로 나타났다. 혼합물을 EtOAc(50 mL*3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(30 mL)로 세척하고 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 미정제물을 수득하였다. 혼합물을 MPLC(석유 에테르/MTBE = 10:1 내지 1:1)로 정제하여 화합물 5B를 황색 오일(1.00 g, 99.50% 수율)로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, DMSO -d6): δ = 11.30 (s, 1H), 7.67 (s, 1H), 6.16 (dd, J=5.6, 8.7 Hz, 1H), 5.04 (d, J=5.1 Hz, 1H), 4.49 (br d, J=5.1 Hz, 1H), 3.86 - 3.66 (m, 1H), 3.55 (d, J=4.2 Hz, 1H), 2.50 (br s, 12H), 2.22 - 2.05 (m, 1H), 1.96 (br dd, J=5.6, 12.9 Hz, 1H), 1.77 (s, 3H), 1.11 (d, J=6.2 Hz, 4H), 0.94 - 0.81 (m, 10H), 0.09 (s, 6H);
HPLC : HPLC 순도: 84.4%;
TLC(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1:1) Rf = 0.37.
2. 화합물 7B의 제조
Figure pct00723
화합물 5B(1.00 g, 2.70 mmol)를 피리딘(20 mL) 및 톨루엔(20 mL*2)과 함께 회전식 증발기 상에서 공비 증류로 건조시켰다.
피리딘(10.00 mL)과 THF(40.00mL)의 혼합물 중 화합물 5B(1.00 g, 2.70 mmol) 및 DMTC1(1.89 g, 5.59 mmol)의 용액을 탈기하고 N2로 3회 퍼징한 후 AgNO3(788.56 mg, 4.64 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 15시간 동안 교반하였다. TLC는 출발 물질이 소모된 것으로 나타났다. MeOH(1mL)를 첨가하고 15분 동안 교반한 후 혼합물을 여과하고 케이크를 톨루엔(20 mL*3)으로 세척하고 여과액을 농축하여 화합물 7B를 황색 오일(1.81 g, 미정제)로서 수득하였다. 혼합물을 추가 정제 없이 다음 단계에 직접 사용하였다.
TLC(석유 에테르 / 에틸 아세테이트) Rf = 0.63
3. 5'-(R)-C-Me-5'- ODMTr -dT의 제조
Figure pct00724
THF(20.00 mL) 중 화합물 7B(1.81 g, 2.69 mmol)의 용액에 TBAF(1 M, 5.11 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 3시간 동안 교반하였다.　TLC는 출발 물질이 소모된 것으로 나타났다. 혼합물을 농축시켜 미정제물을 수득한 후 포화 NaCl(5% 수성, 20 mL)를 첨가하고 EtOAc(20 mL*3)로 추출하였다. 합한 유기물을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 농축하여 미정제물을 수득하였다. 잔류물을 MPLC(석유 에테르/에틸 아세테이트 5:1, 1:1, 1:4, 5% TEA)로 정제하여 5'-(R)-C-Me-5'- ODMTr -dT를 흰색 고체(1.00 g, 66.55% 수율)로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, DMSO -d6): δ =11.38 (s, 1H), 7.52 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.43 - 7.31 (m, 6H), 7.30 - 7.22 (m, 1H), 7.13 (d, J=1.0 Hz, 1H), 6.99 - 6.90 (m, 4H), 6.18 (t, J=7.2 Hz, 1H), 5.33 (d, J=4.8 Hz, 1H), 4.56 (quin, J=4.1 Hz, 1H), 3.79 (d, J=2.4 Hz, 6H), 3.68 (t, J=3.3 Hz, 1H), 3.47 - 3.39 (m, 1H), 2.11 (dd, J=4.8, 7.1 Hz, 2H), 1.46 (s, 3H), 0.83 (d, J=6.4 Hz, 3H)
HPLC : HPLC 순도: 98.6%
LCMS : (M-H+) = 557.2; LCMS 순도: 100.0%
TLC(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1:1, 5% TEA) Rf = 0.02.
5'-(R)-C-Me-5'- ODMTr -dT- CNE - 포스포아미다이트의 제조
Figure pct00725
5'-(R)-C-Me-5'-ODMTr-dT(5 g, 8.95 mmol)를 톨루엔(50 mL)으로 건조하였다. 무수 DCM(50 mL) 중 DIEA(1.39 g, 10.74 mmol, 1.87 mL) 및 5'-(R)-C-Me-5'-ODMTr-dT(5 g, 8.95 mmol)의 용액에　N2 하에 0℃에서 화합물 1(2.76 g, 9.40 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 15℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC는 출발 물질이 소모되었고 2개의 새로운 스폿이 관찰된 것으로 나타났다. 혼합물을 포화 수성 NaHCO3(20 mL)을 첨가하여 ??칭하고 DCM(30mL* 3)으로 추출하였다. 합한 유기물을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 농축하여 미정제물을 수득하였다. 상기 미정제 물질을 전처리된 실리카 겔 컬럼을 사용하여 Teledyne의 Combiflash 장비로 정제하였다. 40 g의 실리카 겔 카트리지 컬럼을 먼저 5% Et3N(300 mL)을 함유하는 10% EtOAc/석유 에테르로 용리하여 전처리하고 미정제물을 메틸렌 클로라이드의 2:1 부피:부피 혼합물에 용해시켰다. 이어서 5% Et3N을 함유하는 석유 에테르를 5% Et3N을 함유하는 10% 석유 에테르/EtOAc로 평형화된 40 g의 실리카 컬럼 상에 로딩하였다. 샘플을 컬럼에 로딩한 후, 5% Et3N을 함유하는 10 내지 50% EtOAc/석유 에테르 구배를 사용하여 정제 프로세스를 실행한 후 잔류 용매를 제거하여 5'-(R)-C-Me-5'- ODMTr -dT- CNE - 포스 포아미다이트를 백색 고체(3.6 g, 53.00% 수율)로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz CDCl3 ,) δ = 8.11 (br s, 1H), 7.53 (br d, J=7.7 Hz, 3H), 7.42 (br t, J=8.2 Hz, 4H), 7.32 - 7.17 (m, 4H), 7.07 - 6.99 (m, 1H), 6.84 (br d, J=8.2 Hz, 4H), 6.31 (br dd, J=5.5, 8.7 Hz, 1H), 4.94 (br s, 1H), 3.96 - 3.73 (m, 10H), 3.72 - 3.41 (m, 4H), 2.65 (td, J=6.1, 18.0 Hz, 2H), 2.53 - 2.37 (m, 1H), 2.10 (br d, J=8.2 Hz, 1H), 1.47 (br s, 4H), 1.33 - 1.16 (m, 15H), 1.00 - 0.90 (m, 3H)
31 P NMR (162MHz, CDCl3) δ = 148.81 (s, 1P), 148.35 (s, 1P)
HPLC : HPLC 순도: 59.15%+35.91%
LCMS : LCMS 순도: 60.34%+37.17%
실시예 33. 5'-(S)-C-Me-5'- ODMTr -dT의 합성
Figure pct00726
일반 반응식
Figure pct00727
1. 화합물 2의 제조
Figure pct00728
H2O(250.00 mL)과 MeCN(250.00 mL)의 혼합물 중 화합물 1(63.00 g, 176.72 mmol)의 용액에 PhI(OAc)2(125.23 g, 388.79 mmol) 및 TEMPO(5.56 g, 35.34 mmol)를 10℃에서 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에테르/에틸 아세테이트=1:1, Rf=0)는 출발 물질이 소모된 것으로 나타났다. 혼합물을 농축하여 미정제물을 수득하고 혼합물에 MTBE(1 L)를 첨가하여 0.5시간 동안 교반한 후 여과하고 케이크를 MTBE(1 L*2)로 세척하고 케이크를 건조하여 화합물 2를 흰색 고체(126.00 g, 96.23% 수율)로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, DMSO ): δ = 11.21 (s, 1H), 7.89 (d, J=1.0 Hz, 1H), 6.18 (dd, J=5.9, 8.6 Hz, 1H), 4.61 - 4.41 (m, 1H), 4.17 (d, J=0.9 Hz, 1H), 2.51 - 2.26 (m, 3H), 2.09 - 1.85 (m, 2H), 1.74 - 1.58 (m, 3H), 0.90 - 0.58 (m, 10H), 0.00 (d, J=2.0 Hz, 6H)
LCMS : (M+H+): 371.1;
TLC(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1:1) Rf = 0.35.
2. 화합물 3의 제조
Figure pct00729
DCM(500.00 mL) 중 화합물 2(50.00 g, 134.96 mmol)의 용액에 DIEA(34.89 g, 269.92 mmol, 47.15 mL) 및 2,2-디메틸프로파노일 클로라이드(21.16 g, 175.45 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 -10~0℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. TLC는 출발 물질이 소모된 것으로 나타났다. DCM 중 혼합물을 다음 단계에 직접 사용하였다.
TLC(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1:1) Rf = 0.15
3. 화합물 4의 제조
Figure pct00730
DCM 중 혼합 화합물 3에 TEA(40.94 g, 404.55 mmol, 56.08 mL) 및 N-메톡시메탄아민 하이드로클로라이드(19.73 g, 202.27 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC는 출발 물질이 소모된 것으로 나타났다. 혼합물을 HCl(1 N, 100 mL)로 세척한 후 수성 NaHCO3(100 mL)로 세척하였다. 유기물을 Na2SO4로 건조하고, 여과하여 미정제물을 수득하였다. 혼합물을 실리카겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트=30/1, 0/1)로 정제하여 화합물 4를 백색 고체(95.50 g, 85.63% 수율) 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, CDCl 3 ): δ = 8.29 (s, 1H), 8.19 (br s, 1H), 6.46 (dd, J=5.1, 9.3 Hz, 1H), 4.71 (s, 1H), 4.38 (d, J=4.2 Hz, 1H), 3.65 (s, 3H), 3.15 (s, 3H), 2.18 - 2.08 (m, 1H), 2.00 - 1.90 (m, 1H), 1.87 (d, J=1.1 Hz, 3H), 0.88 - 0.74 (m, 10H), 0.00 (d, J=3.7 Hz, 6H)
TLC(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1:1) Rf = 0.43
4. 화합물 5의 제조
Figure pct00731
THF(1.20 L) 중 화합물 4(115.00 g, 278.09 mmol)의 용액에 MeMgBr(3 M, 185.39 mL)을 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC는 출발 물질이 소모된 것으로 나타났다. 혼합물을 0℃에서 물(1 L)을 첨가하고 EtOAc(300 mL*2)로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 화합물 5를 백색 고체(100.00 g, 97.58% 수율)로서 수득하였다. 혼합물을 추가 정제 없이 직접 사용하였다.
1 H NMR (400MHz, CDCl 3 ): δ = 8.81 (br s, 1H), 7.95 (s, 1H), 6.41 (dd, J=5.6, 8.1 Hz, 1H), 4.60 - 4.40 (m, 2H), 2.40 - 2.16 (m, 4H), 1.98 (s, 3H), 1.02 - 0.83 (m, 10H), 0.14 (d, J=3.3 Hz, 6H), 0.20 - 0.00 (m, 1H)
TLC(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1:1), Rf = 0.68
5. 화합물 6A의 제조
Figure pct00732
물(1.84 L)에 용해된 EtOAc(460.00 mL) 및 포름산나트륨(353.17 g, 5.19 mol)의 혼합물 중 화합물 5(46.00 g, 124.83 mmol)의 용액에, 이어서 N-[(1S,2S) -2-아미노-1,2-디페닐-에틸]-4-메틸-벤젠설폰아미드;클로로루테늄;1-이소프로필-4-메틸-벤젠(1.59 g, 2.50 mmol)을 첨가하였다. 생성된 2상 혼합물을 N2 하에 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC는 출발 물질이 소모된 것으로 나타났다. 혼합물을 EtOAc(500 mL*3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(300 mL)로 세척하고 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 미정제물을 수득하였다. 혼합물을 MPLC(석유 에테르/MTBE = 10:1 내지 1:1)로 7번 정제하여 화합물 6A를 황색 오일(25.60 g, 57. 53% 수율)로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, DMSO -d6): δ = 11.28 (s, 1H), 7.85 (s, 1H), 6.16 (t, J=6.8 Hz, 1H), 5.04 (d, J=4.6 Hz, 1H), 4.46 - 4.29 (m, 1H), 3.79 (br t, J=6.8 Hz, 1H), 3.59 (br s, 1H), 3.32 (s, 1H), 2.21 - 2.09 (m, 1H), 2.06 - 1.97 (m, 1H), 1.76 (s, 3H), 1.17 - 1.08 (m, 4H), 0.91 - 0.81 (m, 10H), 0.08 (s, 6H)
SFC : SFC 순도: 98.6%
TLC(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1:1) Rf = 0.38
6. 화합물 7A의 제조
Figure pct00733
화합물 6A(12.80 g, 34.55 mmol)를 피리딘(100 mL) 및 톨루엔(100 mL*2)과 함께 회전식 증발기 상에서 공비 증류로 건조시켰다.
피리딘(120.00 mL)과 THF(400.00 mL)의 혼합물 중 화합물 6A(12.80 g, 34.55 mmol) 및 DMTC1(1.89 g, 5.59 mmol)의 용액을 탈기하고 N2로 3회 퍼징한 후 AgNO3(10.09 g, 59.43 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 15시간 동안 교반하였다. TLC는 출발 물질이 소모된 것으로 나타났다. MeOH(5 mL)를 첨가하고 15분 동안 교반한 후 혼합물을 여과하고 케이크를 톨루엔(300 mL*3)으로 세척하였다. 여과액을 농축하여 화합물 7A를 황색 오일(46.50 g, 미정제)로서 수득하였다. 혼합물을 추가 정제 없이 다음 단계에 직접 사용하였다.
TLC(석유 에테르 / 에틸 아세테이트) Rf = 0.63
8. 5'-(S)-C-Me-5'- ODMTr -dT의 제조
Figure pct00734
THF(460.00 mL) 중 화합물 7A(46.50 g, 69.11 mmol)의 용액에 TBAF(1 M, 131.31 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 5시간 동안 교반하였다. TLC는 출발 물질이 완료된 것으로 나타났다. 혼합물을 농축시켜 미정제물을 수득한 후 포화 NaCl(5% 수성, 200 mL)를 첨가하고 EtOAc(200 mL*3)로 추출하였다. 합한 유기물을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 농축하여 미정제물을 수득하였다. 잔류물을 MPLC(석유 에테르/에틸 아세테트 5:1, 1:1, 1:4, 5% TEA)로 정제하여 5'-(S)-C-Me-5'-ODMTr-dT를 흰색 고체(29.00 g, 75.12% 수율)로서 수득하였다.
1 H NMR (400MHz, DMSO -d6): δ = 11.35 (s, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.58 - 7.53 (m, 1H), 7.44 (d, J=7.8 Hz, 2H), 7.37 - 7.24 (m, 6H), 7.23 - 7.17 (m, 1H), 6.87 (t, J=8.3 Hz, 4H), 6.13 (t, J=6.9 Hz, 1H), 5.21 (d, J=4.9 Hz, 1H), 4.23 (br s, 1H), 3.73 (d, J=2.9 Hz, 6H), 3.67 (t, J=3.7 Hz, 1H), 3.57 - 3.46 (m, 1H), 2.23 - 2.04 (m, 2H), 1.67 (s, 3H), 1.70 - 1.65 (m, 1H), 0.71 (d, J=6.2 Hz, 3H)
13 CNMR (101MHz, DMSO -d6): δ = 170.78, 164.16, 158.64, 158.59, 150.86, 146.71, 137.00, 136.75, 135.97, 130.65, 130.52, 128.38, 128.07, 127.11, 113.48, 110.11, 89.78, 86.41, 83.87, 70.58, 70.22, 60.21, 55.48, 21.20, 18.08, 14.53, 12.54
HPLC : HPLC 순도: 98.4%
LCMS : (M-H+) = 557.2; LCMS 순도: 99.0%
SFC : SFC 순도: 99.4%
TLC(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1:1, 5% TEA), Rf = 0.01
5'-(S)-C-Me-5'- ODMTr -dT- CNE - 포스포아미다이트의 제조
Figure pct00735
MeCN(50.00 mL) 중 5'-(S)-C-Me-5'- ODMTr -dT(5.00 g, 8.95 mmol) 용액에 5-에틸설파닐-2H-테트라졸(1.17 g, 8.95 mmol), 1-메틸이미다졸(1.47 g, 17.90 mmol, 1.43 mL), 및 화합물 1(4.05 g, 13.43 mmol, 4.26 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 N2 하에 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC 및 LCMS는 약간의 출발 물질이 소모되었고 목적하는 물질이 관찰된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 미정제물을 수득하고 잔류물을 EtOAc(20 mL)로 희석하였다. 반응 혼합물을 수성 포화 NaHCO3 용액(20 mL)으로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 농축하여 미정제물을 수득하였다. 혼합물을 MPLC(석유 에테르 5% TEA: 에틸 아세테이트 10:1 내지 1:1)로 정제하여 2개의 배치, 즉 배치 1(2.5 g) 및 배치 2(1.8 g)를 수득하였다. 5'-(S)-C-Me-5'-ODMTr-dT-CNE-포스포르아미다이트를 흰색 고체로 수득하였다(4.3g, 5.67mmol, 수율 63.31%).
배치 1:
1 H NMR (400MHz,) δ = 8.19 (br s, 1H), 7.69 - 7.60 (m, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.43 - 7.33 (m, 2H), 7.32 - 7.07 (m, 8H), 6.73 (ddd, J=3.7, 5.8, 9.0 Hz, 4H), 6.27 - 6.15 (m, 1H), 4.49 - 4.37 (m, 1H), 3.82 - 3.65 (m, 8H), 3.63 - 3.55 (m, 2H), 3.53 - 3.39 (m, 3H), 2.50 (t, J=6.3 Hz, 1H), 2.46 - 2.31 (m, 1H), 2.29 - 2.19 (m, 1H), 2.16 - 2.04 (m, 1H), 1.68 (s, 3H), 1.20 - 1.00 (m, 13H), 0.95 (d, J=6.8 Hz, 3H), 0.92 - 0.74 (m, 4H)
31 P NMR (162MHz, CDCl3 ) δ = 149.11 (s, 1P), 148.99 (s, 1P)
HPLC : HPLC 순도: 62.68%+32.65%
LCMS : LCMS 순도: 64.42%+32.87%
배치 2:
1 H NMR (400MHz, CDCl3 ) δ = 8.19 (br s, 1H), 7.69 - 7.60 (m, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.43 - 7.33 (m, 2H), 7.32 - 7.07 (m, 8H), 6.73 (ddd, J=3.7, 5.8, 9.0 Hz, 4H), 6.27 - 6.15 (m, 1H), 4.49 - 4.37 (m, 1H), 3.82 - 3.65 (m, 8H), 3.63 - 3.55 (m, 2H), 3.53 - 3.39 (m, 3H), 2.50 (t, J=6.3 Hz, 1H), 2.46 - 2.31 (m, 1H), 2.29 - 2.19 (m, 1H), 2.16 - 2.04 (m, 1H), 1.68 (s, 3H), 1.20 - 1.00 (m, 13H), 0.95 (d, J=6.8 Hz, 3H), 0.92 - 0.74 (m, 4H)
31 P NMR (162MHz, CDCl3 ) δ = 149.11 (s, 1P), 148.99 (s, 1P), 14.17 (s, 1P)
HPLC : HPLC 순도: 53.0% +41.24%
LCMS : LCMS 순도: 53.19%+42.83%
TLC(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1:3) Rf = 0.86, 0.88
실시예 34. 3'- LPSE 아미다이트 제조를 위한 일반 절차:
L- DPSE -Cl의 제조 절차:
Figure pct00736
L-DPSE 아미노 알코올(S-2-(메틸디페닐실릴)-1-((S)-피롤리딘-2-일)에탄올, 8.82 g, 28.5 mmol)을 35℃에서 무수 톨루엔(3x60 ml)과 함께 공비 증발로 3회 건조하고 고진공에서 밤새 추가로 건조하였다. 건조된 L-DPSE 아미노 알코올과 4-메틸모르폴린(5.82 g, 6.33 mL,57.5 mmole) 용액(무수 톨루엔(50 ml)에 용해됨)을 아르곤 하에서 -5℃에 냉각된 250 mL 3구 둥근 바닥 플라스크에 담긴 무수 톨루엔(25 ml) 중 PCl3(4.0 g, 2.5 mL,29.0 mmole)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 추가로 40분 동안 교반하였다. 이어서 중간 Frit, Airfree, Schlenk 튜브를 사용하여 아르곤 하에서 진공으로 침전된 백색 고체를 여과하였디. 저온(25℃)에서 아르곤 하에 용매를 제거하고 수득한 반고체 혼합물을 진공하에 밤새(약 15시간) 건조하고 다음 단계에 직접 사용하였다.
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 178.84
3'- LPSE 아미다이트 제조를 위한 일반 절차:
적절한 크기의 3구 플라스크에 있는 뉴클레오시드(1.0 당량)를 무수 톨루엔(15 mL/g)으로 3회 공비시켜 고진공에서 24시간 동안 건조하였다. 플라스크에 아르곤 하에서 무수 THF(0.3 M)를 첨가하고 용액을 -10˚C까지 냉각시켰다. 반응 혼합물에 트리에틸아민(5.0 당량)을 첨가한 후 L-DPSE-Cl(무수 THF 중 0.9 M 용액, 1.7 당량)을 5~10분에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온까지 가온하고 반응 진행을 LCMS로 모니터링하였다. 출발 물질이 사라진 후, 반응 혼합물을 빙욕에서 냉각시키고 물(1.0 당량)을 첨가하여 ??칭하고 10분 동안 교반한 후 무수 Mg2SO4(1.0 당량)를 첨가하고 10분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 공기가 없는 프릿 유리관을 통해 여과하고 무수 THF(50 mL)로 세척하고 용매를 감압하에 제거하였다. 수득된 고체를 정제 전에 밤새 고진공하에 건조시켰다. 이어서, 건조된 미정제 생성물을 용매로서 5% TEA를 갖는 에틸 아세테이트/헥산 혼합물을 사용하는 실리카 컬럼(3 컬럼 부피의 에틸 아세테이트 및 5% TEA로 사전 비활성화됨)으로 정제하여 3'-L-DPSE 아미다이트를 흰색 고체로서 수득하였다.
3'-L- DPSE -5'-PO( OMe ) 2 - 비닐포스포네이트 -dT 아미다이트(3'-L-DPSE-WV-NU- 010)의 제조:
Figure pct00737
뉴클레오시드 5'-PO(OMe)2-비닐포스포네이트-dT, WV- NU -010(7.0 g)을 일반 절차에 따라 3'-L-DPSE-5'-PO(OMe)2-비닐포스포네이트-dT 아미다이트(3'-L- DPSE -WV-NU-010)로 변환하여 백색 고체로서 11.8 g(87%)을 수득하였다.
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 152.41, 19.95.
1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.46 (ddt, J = 16.5, 7.6, 2.7 Hz, 4H), 7.33 - 7.17 (m, 6H), 6.93 - 6.88 (m, 1H), 6.75 (ddd, J = 22.6, 17.2, 4.4 Hz, 1H), 6.16 (dd, J = 7.5, 6.3 Hz, 1H), 5.85 (ddd, J = 19.2, 17.1, 1.8 Hz, 1H), 4.71 (dt, J = 8.7, 5.7 Hz, 1H), 4.38 (dp, J = 10.7, 3.6 Hz, 1H), 4.15 (tt, J = 5.6, 2.7 Hz, 1H), 3.68 (dd, J = 11.1, 3.7 Hz, 6H), 3.55 - 3.29 (m, 2H), 3.09 (tdd, J = 10.8, 8.8, 4.3 Hz, 1H), 2.11 (ddd, J = 13.9, 6.3, 3.3 Hz, 1H), 1.96 (s, 1H), 1.87 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 1.85 - 1.73 (m, 2H), 1.70 - 1.49 (m, 2H), 1.38 (ddd, J = 15.9, 10.4, 6.3 Hz, 2H), 1.26 - 1.11 (m, 2H), 0.60 (s, 3H).
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 171.07, 163.62, 163.59, 150.21, 150.19, 148.49, 148.43, 136.61, 135.84, 135.15, 134.57, 134.33, 129.48, 129.42, 127.97, 127.93, 127.81, 118.38, 116.50, 111.52, 85.02, 84.72, 84.70, 84.51, 84.48, 79.25, 79.16, 77.40, 77.28, 77.08, 76.76, 74.93, 74.91, 74.83, 74.81, 68.01, 67.98, 60.35, 52.60, 52.55, 52.47, 52.42, 47.03, 46.67, 38.12, 38.08, 27.18, 25.85, 25.82, 21.01, 17.58, 17.54, 14.19, 12.58, -3.00, -3.27.
LCMS: 화학식: C32H41N3O8P2Si; 분자량 계산치: 685.72; 분자량 실측치: 684.68 [M-H]; 686.58 [M+H].
3'-L- DPSE -5'-PO( OEt ) 2 - 비닐포스포네이트 -dT 아미다이트(3'-L-DPSE-WV-NU- 017)의 제조:
Figure pct00738
뉴클레오시드 5'-PO(OEt)2-비닐포스포네이트-dT, WV- NU -017(8.0g)을 일반 절차에 따라 3'-L-DPSE-5'-PO(OEt)2-비닐포스포네이트-dT 아미다이트(3'-L- DPSE -WV-NU-017)로 변환하여 백색 결정질 고체로서 13.5 g(88%)을 수득하였다.
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 152.44, 17.41.
1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 9.56 (s, 1H), 7.61 - 7.46 (m, 5H), 7.40 - 7.26 (m, 7H), 7.00 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 6.81 (ddd, J = 21.9, 17.1, 4.3 Hz, 1H), 6.27 (dd, J = 7.6, 6.2 Hz, 1H), 5.96 (ddd, J = 19.1, 17.1, 1.8 Hz, 1H), 4.79 (dt, J = 8.8, 5.7 Hz, 1H), 4.46 (dp, J = 10.3, 3.4 Hz, 1H), 4.24 (tt, J = 5.6, 2.8 Hz, 1H), 4.20 - 4.02 (m, 5H), 3.63 - 3.37 (m, 2H), 3.18 (tdd, J = 10.8, 8.8, 4.3 Hz, 1H), 2.18 (ddd, J = 13.9, 6.2, 3.2 Hz, 1H), 1.95 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 1.93 - 1.54 (m, 5H), 1.47 (dd, J = 14.8, 5.9 Hz, 2H), 1.39 - 1.16 (m, 8H), 0.69 (s, 3H).
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 171.09, 163.91, 163.77, 163.75, 150.32, 150.15, 147.57, 147.51, 136.66, 136.62, 136.09, 135.81, 135.08, 134.84, 134.59, 134.57, 134.49, 134.40, 134.32, 129.48, 129.42, 129.37, 127.98, 127.93, 127.90, 127.81, 119.77, 117.89, 111.89, 111.49, 85.86, 84.88, 84.80, 84.78, 84.59, 84.56, 79.24, 79.15, 78.91, 78.81, 77.45, 77.33, 77.13, 76.81, 74.94, 74.93, 74.85, 74.83, 68.02, 67.99, 62.08, 62.02, 61.96, 61.91, 61.87, 60.36, 47.15, 47.03, 46.80, 46.67, 45.92, 38.15, 38.11, 27.18, 27.14, 25.85, 25.81, 24.16, 21.03, 17.58, 17.54, 16.52, 16.46, 16.44, 16.40, 16.38, 14.20, 12.63, 12.42.
LCMS: 화학식: C34H45N3O8P2Si; 분자량 계산치: 713.78; 분자량 실측치: 712.27 [M-H); 714.26 [M+H].
3'-L- DPSE -5'-PO( OEt ) 2 - 트리아졸릴포스포네이트 -dT 아미다이트(3'-L-DPSE- WV-NU-040)의 제조:
Figure pct00739
뉴클레오시드 5'-PO(OEt)2-트리아졸릴포스포네이트-dT, WV- NU -040(8.5g)을 일반 절차에 따라 3'-L-DPSE-5'-PO(OEt)2-트리아졸릴포스포네이트-dT 아미다이트(3'-L-DPSE-WV-NU-040)로 변환하여 백색 고체로서 10.5 g(69%)을 수득하였다.
31P NMR (162 MHz, 클로로포름-d) δ 151.88, 6.69.
1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 8.08 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.61 - 7.48 (m, 4H), 7.33 (dpt, J = 6.5, 4.2, 2.1 Hz, 6H), 6.70 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 5.87 (dd, J = 7.3, 6.2 Hz, 1H), 4.89 - 4.79 (m, 1H), 4.64 (ddd, J = 14.7, 7.8, 4.3 Hz, 2H), 4.49 (dd, J = 14.5, 6.4 Hz, 1H), 4.33 - 4.20 (m, 3H), 4.20 - 4.08 (m, 1H), 3.95 (td, J = 5.9, 3.4 Hz, 1H), 3.66 - 3.42 (m, 2H), 3.20 (tddd, J = 10.9, 8.9, 4.5, 2.1 Hz, 1H), 2.22 - 1.98 (m, 3H), 1.94 (q, J = 1.2 Hz, 3H), 1.83 - 1.61 (m, 2H), 1.55 - 1.42 (m, 2H), 1.42 - 1.21 (m, 8H), 0.69 (d, J = 1.6 Hz, 3H).
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 171.12, 163.64, 149.91, 138.68, 136.65, 136.58, 136.30, 135.88, 134.60, 134.48, 134.45, 134.36, 132.19, 131.86, 129.45, 129.40, 127.95, 127.93, 111.58, 86.98, 82.80, 79.41, 79.32, 77.39, 77.07, 76.75, 71.86, 71.77, 68.07, 68.04, 63.08, 63.05, 63.02, 62.99, 60.38, 50.51, 47.04, 46.68, 37.85, 37.81, 27.22, 25.85, 25.81, 21.04, 17.60, 17.56, 16.31, 16.25, 14.20, 12.43, -3.23, -3.81.
LCMS: 화학식: C35H46N6O8P2Si; 분자량 계산치: 768.81; 분자량 실측치: 767.16 [M-H; 769.05 [M+H].
3'-L- DPSE -5'-(R)-Me- PO(OEt) 2 포스포네이트 -dT 아미다이트(3'-L-DPSE-WV-NU- 037)의 제조:
Figure pct00740
뉴클레오시드 5'-(R)-Me-PO(OEt)2 포스포네이트-dT, WV- NU -037을 일반 절차에 따라 3'-L-DPSE-5'-(R)-Me-PO(OEt)2 포스포네이트-dT 아미다이트(3'-L- DPSE -WV-NU-037)로 변환하여 백색 고체로서 12.5 g(86%)을 수득하였다.
31P NMR (162 MHz, 클로로포름-d) δ 148.87, 30.96.
1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.60 - 7.54 (m, 2H), 7.54 - 7.48 (m, 2H), 7.41 - 7.26 (m, 6H), 6.99 (t, J = 1.3 Hz, 1H), 6.09 (dd, J = 8.1, 5.9 Hz, 1H), 4.77 (dt, J = 8.8, 5.7 Hz, 1H), 4.47 (tt, J = 7.3, 3.0 Hz, 1H), 4.21 - 4.02 (m, 4H), 3.64 - 3.54 (m, 2H), 3.46 (ddd, J = 12.7, 10.3, 5.9 Hz, 1H), 3.17 (qd, J = 11.0, 4.2 Hz, 1H), 2.20 - 1.99 (m, 3H), 1.99 - 1.85 (m, 5H), 1.79 - 1.68 (m, 1H), 1.68 - 1.41 (m, 5H), 1.38 - 1.27 (m, 7H), 1.27 - 1.21 (m, 1H), 1.12 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.69 (d, J = 1.0 Hz, 3H).
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 163.87, 150.22, 136.74, 135.88, 135.18, 134.63, 129.41, 129.38, 129.16, 128.18, 128.09, 127.94, 127.92, 111.19, 88.94, 88.91, 88.75, 88.72, 83.78, 79.60, 79.50, 77.45, 77.13, 76.81, 72.39, 72.35, 68.28, 68.25, 61.63, 61.59, 61.57, 61.52, 46.88, 46.52, 39.05, 31.35, 29.61, 28.20, 27.33, 25.84, 25.81, 17.79, 16.58, 16.53, 16.51, 16.47, 16.45, 12.67.
LCMS: 화학식: C35H49N3O8P2Si; 분자량 계산치: 729.82; 분자량 실측치: 728.40 [M-H; 730.39 [M+H].
3'-L- DPSE -5'-(S)-Me- PO(OEt) 2 포스포네이트 -dT 아미다이트 (3'-L- DPSE -WV- NU -037A)의 제조:
Figure pct00741
뉴클레오시드 5'-(S)-Me-PO(OEt)2 Phosphonate-dT, WV- NU -037A (10.0 g)를 일반 절차에 따라 3'-L-DPSE-5'-(S)-Me-PO(OEt)2 포스포네이트-dT 아미다이트(3'-L-DPSE-WV-NU-037A)로 변환하여 백색 고체로서 14.0 g(72%)을 수득하였다.
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 148.87, 30.96.
1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.60 - 7.54 (m, 2H), 7.54 - 7.48 (m, 2H), 7.41 - 7.26 (m, 6H), 6.99 (t, J = 1.3 Hz, 1H), 6.09 (dd, J = 8.1, 5.9 Hz, 1H), 4.77 (dt, J = 8.8, 5.7 Hz, 1H), 4.47 (tt, J = 7.3, 3.0 Hz, 1H), 4.21 - 4.02 (m, 4H), 3.64 - 3.54 (m, 2H), 3.46 (ddd, J = 12.7, 10.3, 5.9 Hz, 1H), 3.17 (qd, J = 11.0, 4.2 Hz, 1H), 2.20 - 1.99 (m, 3H), 1.99 - 1.85 (m, 5H), 1.79 - 1.68 (m, 1H), 1.68 - 1.41 (m, 5H), 1.38 - 1.27 (m, 7H), 1.27 - 1.21 (m, 1H), 1.12 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.69 (d, J = 1.0 Hz, 3H).
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 163.87, 150.28, 136.68, 135.93, 135.27, 135.23, 134.59, 134.44, 134.35, 129.43, 129.39, 127.95, 127.93, 111.45, 89.22, 89.19, 89.06, 89.03, 84.07, 79.21, 79.11, 77.42, 77.11, 76.79, 73.45, 73.37, 68.17, 68.14, 61.71, 61.65, 61.41, 61.34, 47.02, 46.66, 38.86, 38.83, 32.45, 32.41, 29.16, 27.76, 27.24, 25.83, 25.80, 17.73, 17.70, 17.12, 17.10, 16.51, 16.50, 16.45, 16.43, 16.42, 12.45.
LCMS: 화학식: C35H49N3O8P2Si; 분자량 계산치: 729.82; 분자량 실측치: 728.40 [M-H; 730.39 [M+H].
L- DPSE -5'- ODMTr -5'-(R)-Me- 2'F - dU 아미다이트의 제조.
Figure pct00742
뉴클레오시드, 5'-ODMTr-5'-(R)-Me-2'F-dU(10 g)를 일반 절차에 따라 L-DPSE-5'-ODMTr-5'-(R)-Me-2'F-dU 아미다이트로 변환하여 백색 결정질 고체로서 14.0 g(87%)을 수득하였다.
31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ 151.48
1H NMR (600 MHz, 클로로포름-d) δ 7.57 - 7.45 (m, 6H), 7.41 - 7.24 (m, 12H), 7.23 - 7.18 (m, 1H), 7.16 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.86 - 6.80 (m, 4H), 5.79 (dd, J = 17.4, 3.2 Hz, 1H), 5.19 (dd, J = 8.0, 2.2 Hz, 1H), 4.97 - 4.86 (m, 2H), 4.13 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 3.78 (d, J = 6.0 Hz, 6H), 3.74 - 3.70 (m, 1H), 3.61 - 3.53 (m, 2H), 3.49 (ddt, J = 12.7, 10.4, 6.9 Hz, 1H), 3.10 (tdd, J = 10.9, 8.9, 4.4 Hz, 1H), 2.56 (qd, J = 7.2, 1.2 Hz, 1H), 2.05 (s, 1H), 1.93 - 1.84 (m, 1H), 1.76 - 1.69 (m, 1H), 1.66 (dd, J = 14.6, 8.2 Hz, 1H), 1.51 (dd, J = 14.6, 6.5 Hz, 1H), 1.43 (ddt, J = 12.3, 7.6, 4.5 Hz, 1H), 1.34 - 1.24 (m, 2H), 1.04 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 0.88 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.66 (s, 3H.
13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 171.20, 163.35, 163.32, 158.70, 158.60, 149.83, 149.82, 146.25, 141.18, 136.56, 136.31, 136.15, 135.99, 134.62, 134.40, 130.60, 130.40, 129.45, 129.43, 128.19, 127.95, 127.94, 127.86, 126.90, 113.21, 113.14, 102.48, 92.33, 91.05, 88.59, 88.37, 87.15, 85.36, 85.35, 79.63, 79.57, 77.34, 77.13, 76.91, 68.97, 68.61, 68.56, 68.51, 68.46, 68.01, 68.00, 60.44, 55.28, 55.25, 53.50, 46.74, 46.50, 45.96, 45.95, 27.27, 25.94, 25.92, 21.09, 17.97, 17.94, 17.14, 14.25, 11.33, 11.31, -3.34
19F NMR (565 MHz, CDCl3) δ -199.82.
LCMS: 화학식: C50H53FN3O8P2Si; 분자량 계산치: 902.04; 분자량 실측치: 901.03 [M-H]; 903.25 [M+H].
L- DPSE -5'- ODMTr -5'-(S)-Me- 2'F - dU 아미다이트의 제조.
Figure pct00743
뉴클레오시드, 5'-ODMTr-5'-(S)-Me-2'F-dU(8 g)을 일반 절차에 따라 L-DPSE-5'-ODMTr-5'-(R)-Me-2'F-dU 아미다이트로 변환하여 백색 결정질 고체로서 10.0 g(78%)을 수득하였다.
31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ 150.98.
1H NMR (600 MHz, 클로로포름-d) δ 7.55 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.42 (ddd, J = 13.2, 7.7, 1.7 Hz, 4H), 7.37 - 7.32 (m, 2H), 7.28 - 7.19 (m, 10H), 7.16 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.13 - 7.07 (m, 1H), 6.75 - 6.69 (m, 4H), 5.67 (dd, J = 17.6, 2.1 Hz, 1H), 5.55 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.74 - 4.67 (m, 1H), 4.41 (dtd, J = 16.2, 7.6, 4.9 Hz, 1H), 4.03 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 3.79 (dd, J = 7.3, 3.7 Hz, 1H), 3.67 (d, J = 5.1 Hz, 6H), 3.59 (qd, J = 6.3, 3.6 Hz, 1H), 3.39 (ddt, J = 14.5, 10.7, 7.5 Hz, 1H), 3.25 (ddd, J = 12.3, 8.1, 4.9 Hz, 1H), 2.93 (tdd, J = 10.8, 8.7, 4.5 Hz, 1H), 1.95 (s, 2H), 1.70 (dtt, J = 12.3, 8.0, 3.7 Hz, 1H), 1.60 - 1.45 (m, 2H), 1.33 (dd, J = 14.5, 6.5 Hz, 1H), 1.26 (dtd, J = 12.5, 6.5, 3.2 Hz, 1H), 1.17 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 1.12 (dt, J = 11.9, 8.0 Hz, 1H), 0.78 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 0.54 (s, 3H).
LCMS: 화학식: C50H53FN3O8P2Si; 분자량 계산치: 902.04; 분자량 실측치: 901.05 [M-H]; 903.15 [M+H].
3'-L- DPSE -5'-PO( OEt ) 2 - 비염기성 비닐 포스포네이트 (3'-L- DPSE -WV-RA- 009)의 제조
Figure pct00744
디에틸((E)-2-((2R,3S)-3-하이드록시테트라하이드로푸란-2-일)비닐)포스포네이트, (5'-PO(OEt)2-비염기성 비닐 포스포네이트, WV-RA-009(5.0 g)를 일반 절차에 따라 3'-L-DPSE-5'-PO(OEt)2-비염기성 비닐 포스포네이트(3'-L- DPSE -WV-RA- 009)로 변환하여 무색 반고체로서 8.6 g(72.8%)을 수득하였다.
31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ 152.94, 18.49.
1H NMR (600 MHz, 클로로포름-d) δ 7.47 (ddt, J = 14.2, 6.6, 1.7 Hz, 8H), 7.33 - 7.24 (m, 11H), 6.65 (ddd, J = 22.2, 17.0, 3.7 Hz, 2H), 5.85 (ddd, J = 20.9, 17.0, 1.9 Hz, 2H), 4.73 (dt, J = 8.5, 5.8 Hz, 2H), 4.26 (ddt, J = 8.3, 5.4, 2.7 Hz, 2H), 4.16 (tt, J = 3.6, 2.2 Hz, 2H), 4.08 - 3.94 (m, 8H), 3.91 - 3.81 (m, 4H), 3.47 (ddt, J = 14.9, 10.6, 7.6 Hz, 2H), 3.32 (ddt, J = 9.8, 7.6, 5.5 Hz, 2H), 3.14 - 3.05 (m, 2H), 1.82 - 1.78 (m, 1H), 1.75 (ddd, J = 9.3, 7.4, 4.4 Hz, 5H), 1.67 - 1.58 (m, 2H), 1.55 (dd, J = 14.7, 8.6 Hz, 2H), 1.41 - 1.34 (m, 3H), 1.34 - 1.30 (m, 1H), 1.28 - 1.19 (m, 11H), 1.19 - 1.12 (m, 2H), 0.60 (s, 5H).
LCMS: 화학식: C29H41NO6P2Si; 분자량 계산치: 589.68; 분자량 실측치: 588.63 [M-H]; 590.70 [M+H].
Figure pct00745
디에틸((R)-2-((2R,3S)-3-하이드록시테트라하이드로푸란-2-일)프로필)포스포네이트, (5'-(R)-Me-PO(OEt)2-비염기성 포스포네이트,WV -RA-010(5.0 g)을 일반 절차에 따라 3'-L-DPSE-5'-(R)-Me-PO(OEt)2-비염기성 포스포네이트(3'-L- DPSE -WV-RA-010)로 변환하고 무색 반고체로서 7.0 g(62%)을 수득하였다.
31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ 150.48, 31.86.
1H NMR (600 MHz, 클로로포름-d) δ 7.47 (ddt, J = 14.6, 6.1, 1.7 Hz, 5H), 7.34 - 7.25 (m, 7H), 4.73 (ddd, J = 8.1, 6.5, 5.3 Hz, 1H), 4.28 - 4.21 (m, 1H), 4.08 - 3.94 (m, 4H), 3.75 (td, J = 8.1, 2.7 Hz, 1H), 3.71 - 3.62 (m, 1H), 3.52 - 3.42 (m, 1H), 3.41 (dd, J = 5.9, 3.3 Hz, 1H), 3.35 - 3.26 (m, 1H), 3.08 (dddd, J = 11.7, 10.6, 8.8, 4.3 Hz, 1H), 2.01 - 1.89 (m, 2H), 1.89 - 1.82 (m, 1H), 1.82 - 1.73 (m, 1H), 1.73 - 1.63 (m, 2H), 1.63 - 1.59 (m, 2H), 1.59 - 1.53 (m, 1H), 1.46 - 1.28 (m, 4H), 1.23 (td, J = 7.1, 1.1 Hz, 6H), 1.22 - 1.11 (m, 2H), 0.97 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.60 (s, 3H).
LCMS: 화학식: C30H45NO6P2Si; 분자량 계산치: 605.72; 분자량 실측치:604.42 [M-H]; 606.53[M+H].
실시예 35. D- DPSE 아미다이트 합성을 위한 일반 절차
D- DPSE -Cl의 제조 절차:
Figure pct00746
D-DPSE 아미노 알코올((R)-2-(메틸디페닐실릴)-1-((R)-피롤리딘-2-일)에탄올, 8.82 g, 28.5mmol)을 35℃에서 무수 톨루엔(3x60 ml)과 함께 공비 증발로 3회 건조하고 고진공에서 밤새 추가로 건조하였다. 건조된 D-DPSE 아미노 알코올과 4-메틸모르폴린(5.82 g, 6.33 mL,57.5 mmole) 용액(무수 톨루엔(50 ml)에 용해됨)을 아르곤 하에서 -5℃에 냉각된 250 mL 3구 둥근 바닥 플라스크에 담긴 무수 톨루엔(25 ml) 중 PCl3(4.0 g, 2.5 mL,29.0 mmole)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 추가로 40분 동안 교반하였다. 이어서 중간 Frit, Airfree, Schlenk 튜브를 사용하여 아르곤 하에서 진공으로 침전된 백색 고체를 여과하였다. 욕 온도(25℃)에서 아르곤 하에 회전식 증발기로 용매를 제거하고 수득한 미정제 오일성 혼합물을 진공하에 밤새(약 15시간) 건조하고 다음 단계에 사용하였다.
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 178.72,
D- DPSE 아미다이트 합성을 위한 절차
적절한 크기의 3구 플라스크에 있는 뉴클레오시드(1.0 당량)를 무수 톨루엔(15 mL/g)으로 3회 공비시켜 고진공에서 24시간 동안 건조하였다. 플라스크에 아르곤 하에서 무수 THF(0.3 M)를 첨가하고 용액을 -10˚C까지 냉각시켰다. 반응 혼합물에 트리에틸아민(5.0 당량)을 첨가한 후 D-DPSE-Cl(무수 THF 중 0.9 M 용액, 1.7 당량)을 5~10분에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온까지 가온하고 반응 진행을 LCMS로 모니터링하였다. 출발 물질이 사라진 후, 반응 혼합물을 빙욕에서 냉각시키고 물(1.0 당량)을 첨가하여 ??칭하고 10분 동안 교반한 후 무수 Mg2SO4(1.0 당량)를 첨가하고 10분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 공기가 없는 프릿 유리관을 통해 여과하고 무수 THF(50 mL)로 세척하고 용매를 감압하에 제거하였다. 수득된 고체를 정제 전에 밤새 고진공하에 건조시켰다. 이어서, 건조된 미정제 생성물을 용매로서 5% TEA를 갖는 에틸 아세테이트/헥산 혼합물을 사용하는 실리카 컬럼(3 컬럼 부피의 에틸 아세테이트 및 5% TEA로 사전 비활성화됨)으로 정제하여 3'-D-DPSE 아미다이트를 흰색 고체로서 수득하였다.
3'-D- DPSE -5'- ODMTr -5'-(R)-Me-dT 아미다이트의 제조:
Figure pct00747
뉴클레오시드 5'-ODMTr-5'-(R)-Me-dT(10.0 g)를 일반 절차에 따라 미색 고체로서 3'-D-DPSE-5'-ODMTr-5'-(R)-Me-dT 아미다이트(12.8 g, 90% 수율)로 변환하였다.
31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ = 156.36
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.94 - 8.75 (m, 1H), 7.52 - 7.38 (m, 4H), 7.31 (dd, J = 13.6, 8.6 Hz, 4H), 7.27 - 7.21 (m, 4H), 7.21 - 7.15 (m, 2H), 7.14 - 7.07 (m, 1H), 6.86 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.74 (dd, J = 8.9, 3.8 Hz, 4H), 6.07 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 4.81 (ddt, J = 11.8, 9.0, 4.5 Hz, 2H), 3.69 (d, J = 3.0 Hz, 7H), 3.48 (ddd, J = 15.1, 7.5, 2.7 Hz, 1H), 3.36 (dq, J = 10.7, 3.8 Hz, 2H), 3.14 (dd, J = 9.6, 4.0 Hz, 1H), 1.96 (d, J = 1.2 Hz, 2H), 1.83 - 1.68 (m, 3H), 1.68 - 1.51 (m, 2H), 1.44 (dd, J = 14.7, 6.0 Hz, 1H), 1.36 (s, 4H), 1.27 - 1.09 (m, 3H), 0.83 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.63 (s, 3H).
LCMS: C51H56N3O8PSi (M-H): 897.16
3'-D- DPSE -5'- ODMTr -5'-(S)-Me-dT 아미다이트의 제조:
Figure pct00748
뉴클레오시드 5'-ODMTr-5'-(S)-Me-dT(8.0 g)를 일반 절차에 따라 미색 고체로서 3'-D-DPSE-5'-ODMTr-5'-(S)-Me-dT 아미다이트(10 g, 89% 수율)로 변환하였다.
31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ = 156.36
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.81 (s, 1H), 7.60 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.49 - 7.41 (m, 4H), 7.41 - 7.36 (m, 2H), 7.33 - 7.28 (m, 2H), 7.29 - 7.21 (m, 7H), 7.21 - 7.15 (m, 2H), 7.12 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.73 (dd, J = 8.9, 6.5 Hz, 4H), 6.11 - 6.03 (m, 1H), 4.68 (dt, J = 8.7, 5.8 Hz, 1H), 4.52 - 4.44 (m, 1H), 3.70 (d, J = 3.8 Hz, 6H), 3.65 (t, J = 3.4 Hz, 1H), 3.49 (qd, J = 6.5, 3.0 Hz, 1H), 3.34 (ddt, J = 15.1, 10.1, 7.7 Hz, 1H), 3.30 - 3.22 (m, 1H), 3.08 - 2.98 (m, 1H), 1.89 (dt, J = 14.1, 7.2 Hz, 1H), 1.81 (ddd, J = 13.8, 6.2, 3.7 Hz, 1H), 1.76 - 1.68 (m, 4H), 1.63 - 1.48 (m, 2H), 1.38 (dd, J = 14.7, 6.0 Hz, 1H), 1.31 (dtd, J = 12.1, 6.4, 2.6 Hz, 1H), 1.21 - 1.10 (m, 3H), 0.83 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 0.58 (d, J = 1.5 Hz, 3H).
LCMS: C51H56N3O8PSi (M-H): 897.16
3'-D- DPSE -5'- ODMTr -5'-(R)-Me- 2'F - dU 아미다이트의 제조:
Figure pct00749
뉴클레오시드 5'-ODMTr-5'-(R)-Me-2'F-dU(5.0 g)를 일반 절차에 따라 미색 고체로서 3'-D-DPSE-5'-ODMTr-5'-(R)-Me-2'F-dU 아미다이트(6.0 g, 75% 수율)로 변환하였다.
31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ = 156.86
19F NMR (565 MHz, CDCl3) δ + -198.88 - -199.16 (m).
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 9.23 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.51 - 7.43 (m, 4H), 7.43 - 7.36 (m, 2H), 7.35 - 7.29 (m, 2H), 7.30 - 7.20 (m, 7H), 7.17 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.11 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 5.81 (dd, J = 17.6, 2.2 Hz, 1H), 5.04 - 4.88 (m, 2H), 4.82 - 4.70 (m, 1H), 3.80 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 3.69 (d, J = 2.8 Hz, 6H), 3.54 (ddd, J = 13.7, 9.3, 6.9 Hz, 2H), 3.36 - 3.27 (m, 1H), 3.21 - 3.11 (m, 1H), 1.80 (dp, J = 12.5, 4.4 Hz, 1H), 1.62 (dd, J = 14.7, 7.8 Hz, 2H), 1.41 (dd, J = 14.7, 6.7 Hz, 1H), 1.30 (qd, J = 7.5, 2.6 Hz, 1H), 1.25 - 1.14 (m, 3H), 0.87 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.59 (s, 3H).
LCMS: C50H53FN3O8PSi (M-H): 901.14
3'-D- DPSE -5'- ODMTr -5'-(S)-Me- 2'F - dU 아미다이트의 제조:
Figure pct00750
뉴클레오시드 5'-ODMTr-5'-(S)-Me-2'F-dU(4.95 g)를 일반 절차에 따라 미색 고체로서 3'-D-DPSE-5'-ODMTr-5'-(S)-Me-2'F-dU 아미다이트(6.95 g, 87% 수율)로 변환하였다.
31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ = 156.92
19F NMR (565 MHz, CDCl3) δ = -198.87 - -199.13 (m).
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 9.65 - 9.28 (m, 1H), 7.90 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.44 (ddd, J = 12.3, 7.7, 1.9 Hz, 4H), 7.36 - 7.30 (m, 2H), 7.30 - 7.19 (m, 7H), 7.17 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 7.12 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.72 (t, J = 8.4 Hz, 4H), 5.87 (d, J = 17.1 Hz, 1H), 5.53 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 4.87 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 4.69 - 4.53 (m, 1H), 4.51 - 4.40 (m, 1H), 3.86 (dd, J = 8.6, 2.6 Hz, 1H), 3.69 (d, J = 4.4 Hz, 6H), 3.52 (qd, J = 6.4, 2.7 Hz, 1H), 3.36 (ddt, J = 15.2, 10.2, 7.7 Hz, 1H), 3.23 - 3.14 (m, 1H), 3.05 (td, J = 10.0, 3.8 Hz, 1H), 1.71 (dh, J = 12.5, 3.9 Hz, 1H), 1.65 - 1.57 (m, 1H), 1.52 (dq, J = 12.6, 8.2 Hz, 1H), 1.35 (dd, J = 14.6, 7.5 Hz, 1H), 1.24 - 1.14 (m, 3H), 1.08 (q, J = 10.2 Hz, 1H), 0.88 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.56 (s, 3H).
LCMS: C50H53FN3O8PSi (M-H): 901.14
3'-D- DPSE -5'-PO( OEt )2 비닐포스포네이트 -dT 아미다이트의 제조:
Figure pct00751
뉴클레오시드 5'-PO(OEt)2 VP-dT(10 g)를 일반 절차에 따라 미색 고체로서 3'-D-DPSE-5'-PO(OEt) 2 비닐포스포네이트 -dT 아미다이트(14.1 g, 73% 수율)로 변환하였다.
LCMS: C34H45N3O8P2Si (M-H-): 712.45
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 9.03 (s, 1H), 7.55 - 7.35 (m, 4H), 7.32 - 7.21 (m, 6H), 6.91 (s, 1H), 6.82 - 6.70 (m, 1H), 6.11 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 5.96 - 5.83 (m, 1H), 4.80 - 4.69 (m, 1H), 4.35 - 4.20 (m, 2H), 4.09 - 3.95 (m, 4H), 3.51 - 3.41 (m, 1H), 3.41 - 3.31 (m, 1H), 3.22 - 3.06 (m, 1H), 1.96 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 1.92 - 1.83 (m, 3H), 1.83 - 1.71 (m, 3H), 1.70 - 1.56 (m, 1H), 1.53 (dd, J = 14.3, 8.7 Hz, 1H), 1.46 - 1.31 (m, 2H), 1.31 - 1.11 (m, 8H), 0.59 (d, J = 6.9 Hz, 3H).
31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ = 156.66, 17.09
3'-D- DPSE -5'-(R)-Me-PO( OEt ) 2 -dT 아미다이트의 제조:
Figure pct00752
뉴클레오시드 5'-(R)-Me-PO(OEt)2-dT(4.0g)를 일반 절차에 따라 미색 고체로서 3'-D-DPSE-5'-(R)-Me-PO(OEt)2-dT 아미다이트(5.0 g, 69% 수율)로 변환하였다.
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 156.32, 30.68.
1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 8.87 (d, J = 56.9 Hz, 1H), 7.54 (ddt, J = 16.6, 5.9, 2.4 Hz, 5H), 7.35 (t, J = 3.4 Hz, 7H), 7.02 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 6.05 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 4.83 (dt, J = 9.0, 5.7 Hz, 1H), 4.31 (tt, J = 8.9, 4.6 Hz, 1H), 4.11 (tdt, J = 10.2, 7.1, 5.1 Hz, 5H), 3.66 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 3.55 (ddd, J = 15.2, 10.2, 7.5 Hz, 1H), 3.45 (ddt, J = 13.4, 10.5, 5.6 Hz, 1H), 3.22 (tdd, J = 11.1, 8.8, 4.2 Hz, 1H), 2.24 (dddt, J = 12.8, 9.7, 6.2, 3.6 Hz, 1H), 2.06 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 2.03 - 1.57 (m, 12H), 1.55 - 1.40 (m, 2H), 1.38 - 1.20 (m, 9H), 1.15 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.68 (d, J = 1.1 Hz, 3H).
213C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 163.50, 150.01, 136.71, 135.96, 135.17, 134.56, 134.37, 129.49, 129.38, 127.98, 127.91, 111.31, 88.34, 88.28, 88.16, 88.09, 83.29, 78.20, 78.12, 77.38, 77.06, 76.74, 72.22, 72.06, 67.71, 67.69, 61.64, 61.58, 61.56, 61.49, 60.38, 47.24, 46.90, 38.95, 30.84, 30.80, 30.16, 28.75, 27.10, 25.92, 25.89, 21.04, 17.27, 17.24, 16.51, 16.50, 16.46, 16.44, 15.99, 15.96, 14.20, 12.69,
LCMS: C35H49N3O8P2Si (M-H): 728.21
3'-D- DPSE -5'-(S)-Me-PO( OEt ) 2 -dT 아미다이트의 제조:
Figure pct00753
뉴클레오시드 5'-(S)-Me-PO(OEt)2-dT(3.9g)를 일반 절차에 따라 미색 고체로서 3'-D-DPSE-5'-Me-PO(OEt)2-dT 아미다이트(4.1 g, 56% 수율)로 변환하였다.
31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ = 155.76, 31.56
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 9.24 (s, 1H), 7.52 - 7.37 (m, 4H), 7.32 - 7.21 (m, 6H), 7.02 (s, 1H), 6.05 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 4.74 (dt, J = 10.1, 5.7 Hz, 1H), 4.28 - 4.20 (m, 1H), 4.10 - 3.95 (m, 4H), 3.52 - 3.40 (m, 2H), 3.40 - 3.31 (m, 1H), 3.19 - 3.07 (m, 1H), 2.14 - 2.04 (m, 1H), 2.03 - 1.95 (m, 1H), 1.91 (s, 3H), 1.83 - 1.67 (m, 3H), 1.68 - 1.59 (m, 1H), 1.53 (dd, J = 14.7, 9.0 Hz, 1H), 1.47 - 1.32 (m, 3H), 1.30 - 1.14 (m, 8H), 1.07 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.60 (s, 3H).
LCMS: C35H49N3O8P2Si (M-H): 728.82
실시예 36. 5-(( 2R,3S,4R,5S )-5- 아세트아미도 -3,4- 비스 ( 벤조일옥시 )-2-(( 벤조일옥시 )메틸)피페리딘-1-일)-5-옥소펜탄산의 합성
Figure pct00754
단계 1: 2개 배치 병행: DMF(2250 mL) 중 (2R,3R,4R)-2-(하이드록시메틸)-3,4-디하이드로-2H-피란-3,4-디올(75 g, 513.20 mmol, 1 당량)의 용액에 0℃에서 NaH(92.37 g, 2.31 mol, 60% 순도, 4.5 당량)를 첨가한 후, BnBr(307.21 g, 1.80 mol, 213.34 mL, 3.5 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 0~20℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 10:1, R f = 0.40)는 출발 물질이 소모되었고, 2개의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 포화 NH4Cl(1500 mL)을 0℃에서 ??칭하고, MTBE(1500 mL×3)로 추출하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 0:1)로 정제하여 (2R,3R,4R)-3,4-비스(벤질옥시)-2-((벤질옥시)메틸)-3,4-디하이드로-2H-피란(318 g)를 황색 고체로서 수득하였다. MS: 439.1 (M=Na)+; TLC (석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 10:1) R f = 0.40.
단계 2: 15개 배치 병행: DCM(1800 mL) 중 (2R,3R,4R)-3,4-비스(벤질옥시)-2-((벤질옥시)메틸)-3,4-디하이드로-2H-피란(30 g, 72.03 mmol, 1 당량)과 TMSN3(24.89 g, 216.08 mmol, 28.42 mL, 3 당량)의 혼합물에 PIFA(68.83 g, 144.05 mmol, 90% 순도, 2 당량), TEMPO(2.27 g, 14.41 mmol, 0.2 당량), Bu4NHSO(4.89 g, 14.41 mmol, 0.2 당량), 및 H2O(64.90 g, 3.60 mol, 64.90 mL, 50 당량)를 0~5℃에서 임의의 개재 시점 없이 순차적으로 첨가하였다. 혼합물을 0~5℃에서 40분 동안 교반하였다. TLC(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1:3, R f = 0.35)는 출발물질이 완전히 소모되었음을 보여주었다. 혼합물을 포화 수성 NaHCO3(1500 mL)로 ??칭하고 수성 상을 디클로로메탄(500 mL x 3)으로 추출하였다. 유기 상을 H2O(1000 mL x 3) 및 포화 수성 NaCl(1000 mL×3),로 세척하고 Na2SO4로 건조하였다. 15개의 배치를 감압하에 농축하여 용매를 제거하였다. 미정제 생성물을 MPLC(SiO2, 에틸 아세테이트/석유 에테르 = 0% 내지 20%)로 정제하여 (2R,3R,4R,5R,6R)-3-아지도-4,5-비스(벤질옥시)-6-((벤질옥시)메틸)테트라하이드로-2H-피란-2-올(280 g, 미정제)을 황색 오일로서 수득하였다. LCMS : M + Na+ = 498.1, 순도: 63.34%; TLC (석유 에테르/에틸 아세테이트 = 3:1) R f = 0.35.
단계 3: 2개 배치 병행: EtOH(2000 mL) 중 (2R,3R,4R,5R,6R)-3-아지도-4,5-비스(벤질옥시)-6-((벤질옥시)메틸)테트라하이드로-2H-피란-2-올(140 g, 294.41 mmol, 1 당량)의 용액에 NaBH4(16.64 g, 439.86 mmol, 1.49 당량)을 -5℃에서 첨가하고, 혼합물을 20~25℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 2:1, R f = 0.45) 및 LCMS는 출발 물질이 완전히 소모된 것으로 나타났다. 혼합물을 수성 NH4Cl(1500 mL)으로 ??칭하고 감압하에 농축하여 대부분의 용매를 제거한 후, 에틸 아세테이트(500 mL x 3)로 추출하였다. 2개의 배치를 합하고 유기 상을 무수 Na2SO4로 건조하고 감압하에 농축하여 용매를 제거하였다. 미정제 생성물을 MPLC(SiO2, 에틸 아세테이트/석유 에테르 = 20% 내지 50%)로 정제하여 2-아지도-3,4,6-트리스(벤질옥시)헥산-1,5-디올(219 g, 미정제)를 백색 고체로서 수득하였다. LCMS : M + Na+ = 500.1; TLC (석유 에테르:에틸 아세테이트 = 2:1) R f = 0.45.
단계 4. 3개 배치 병행: MeOH(2000 mL) 및 H2O(400 mL) 중 2-아지도-3,4,6-트리스(벤질옥시)헥산-1,5-디올(96 g, 201.03 mmol, 1 당량)의 용액에 Na2S·9H2O(241.41 g, 1.01 mol, 168.82 mL, 5 당량)를 첨가하고 70℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 2:1, R f = 0)는 출발 물질이 완전히 소모된 것으로 나타났다. 혼합물을 여과하고 감압하에 농축하여 대부분의 용매를 제거하였다. 미정제 생성물을 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. 2-아미노-3,4,6-트리스(벤질옥시)헥산-1,5-디올(272.32 g, 미정제)을 황색 고체로서 수득하였다.
단계 5. 3개 배치 병행: DCM(1000 mL) 중 2-아미노-3,4,6-트리스(벤질옥시)헥산-1,5-디올(90 g, 199.31 mmol, 1 당량)의 용액에 DIEA(51.52 g, 398.62 mmol, 69.43 mL, 2 당량)을 0~5℃에서 첨가하고, 이어서 Ac2O(26.45 g, 259.11 mmol, 24.27 mL, 1.3 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 5~10℃에서 3시간 동안 교반하였다. LCMS는 출발 물질이 완전히 소모된 것으로 나타났다. 혼합물을 여과하고 합한 후 감압하에 농축하여 용매를 제거하였다. TLC(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 0:1, R f = 0.35)는 목적하는 생성물을 나타내었다. 미정제 생성물을 MPLC(SiO2, 에틸 아세테이트/석유 에테르 = 0% 내지 50%)로 정제하여 N-(3,4,6-트리스(벤질옥시)-1,5-디하이드록시헥산-2-일)아세트아미드(176 g, 356.57 mmol, 59.63% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다. 1 H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ = 7.42 - 7.28 (m, 15H), 6.16 (br d, J=8.7 Hz, 1H), 4.75 (d, J=11.0 Hz, 1H), 4.66 - 4.43 (m, 5H), 4.43 - 4.36 (m, 1H), 4.08 - 4.00 (m, 1H), 3.89 (dd, J=1.6, 7.9 Hz, 1H), 3.75 - 3.65 (m, 2H), 3.63 - 3.48 (m, 3H), 2.50 (d, J=8.7 Hz, 1H), 2.41 (dd, J=5.1, 6.8 Hz, 1H), 1.95 (s, 3H); LCMS : M + H+ = 494.1.
단계 6: 3개 배치 병행: DCM(450 mL) 중 옥살릴 디클로라이드(67.12 g, 528.78 mmol, 46.29 mL, 4.5 당량)의 용액에 DCM(150 mL) 중 DMSO(55.08 g, 705.04 mmol, 55.08 mL, 6 당량)를 -78~68℃에서 15분 동안 적가하고 혼합물을 0.5시간 동안 교반하였다. DCM(300 mL) 중 N-(3,4,6-트리스(벤질옥시)-1,5-디하이드록시헥산-2-일)아세트아미드(58 g, 117.51 mmol, 1 당량)를 상기 혼합물에 적가하고 -78~68℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 TEA(166.47 g, 1.65 mol, 228.98 mL, 14 당량)로 -78~68℃에서 ??칭하고 혼합물을 0.5시간 동안 교반한 후 5~10℃(실온)까지 가온하였다. LCMS는 출발 물질이 완전히 소모된 것으로 나타났다. 혼합물을 H2O(500 mL) 및 수성 NaCl(500 mL×2)로 세척하였다. 유기 상을 무수 Na2SO4로 건조하고, 감압하에 농축하여 일부 용매를 제거하였다. 미정제 생성물을 정제 없이 다음 단계에 각각 사용하였다. N-(3,4,6-트리스(벤질옥시)-1,5-디옥소헥산-2-일)아세트아미드(172.58 g, 미정제)를 황색 액체(DCM 중)로서 수득하였다. LCMS : M + H+ = 490.1, 순도: 34.07%.
단계 7. 3개 배치 병행: DCM(900 mL) 중 N-(3,4,6-트리스(벤질옥시)-1,5-디옥소헥산-2-일)아세트아미드(57.53 g, 117.51 mmol, 1 당량)의 용액에 MeOH(900 mL) 중 페닐메탄아민(13.85 g, 129.27 mmol, 14.09 mL, 1.1 당량)을 첨가한 후 5~10℃에서 NaBH3CN(14.77 g, 235.03 mmol, 2 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 5~10℃에서 12시간 동안 교반하였다. LCMS는 출발 물질이 완전히 소모된 것으로 나타났다. 혼합물을 여과하고 감압하에 농축하여 대부분의 용매를 제거하였다. 잔류물을 합하였다. TLC(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1:1, R f = 0.35)는 목적하는 생성물이 형성된 것으로 나타났다. 생성물을 MPLC(SiO2, 에틸 아세테이트/석유 에테르 = 30% 내지 45%)로 정제하여 N-((3S,4R,5S,6R)-1-벤질-4,5-비스(벤질옥시)-6-((벤질옥시)메틸)피페리딘-3-일)아세트아미드(46 g, 75.33 mmol, 21.37% 수율, 92.477% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다. 1 H NMR (400MHz, METHANOL-d4) δ = 7.40 - 7.17 (m, 20H), 4.78 - 4.42 (m, 5H), 4.34 - 4.25 (m, 1H), 4.06 (br s, 1H), 3.95 - 3.87 (m, 1H), 3.82 - 3.64 (m, 3H), 3.49 (br d, J=6.8 Hz, 1H), 3.12 - 2.92 (m, 1H), 2.84 (dd, J=3.7, 12.3 Hz, 1H), 2.09 (br dd, J=7.5, 12.1 Hz, 1H), 1.90 - 1.84 (m, 3H); LCMS : M + H+ = 565.1, 순도: 92.47%.
단계 8: MeOH(500 mL) 중 N-((3S,4R,5S,6R)-1-벤질-4,5-비스(벤질옥시)-6-((벤질옥시)메틸)피페리딘-3-일)아세트아미드(20 g, 35.42 mmol, 당량)와 Pd/C(80 g, 10% 순도)를 진공에서 배기시키고 H2(50 Psi)로 3회 다시 채운 후 40~45℃에서 24시간 동안 교반하였다. LCMS는 출발 물질이 완전히 소모된 것으로 나타났다. 혼합물을 여과하고 감압하에 농축하여 대부분의 용매를 제거하였다. 미정제 생성물을 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. N-((3S,4R,5S,6R)-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)피페리딘-3-일)아세트아미드(8.02 g, 미정제)를 회색 고체로서 수득하였다.
단계 9: EtOH(120 mL) 중 N-((3S,4R,5S,6R)-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)피페리딘-3-일)아세트아미드(8.02 g, 35.40 mmol, 1 당량)에 Boc2O(8.50 g, 38.94 mmol, 8.95 mL, 1.1 당량)를 첨가하고 50℃에서 12시간 동안 교반하였다. LCMS는 출발 물질이 완전히 소모된 것으로 나타났다. 혼합물을 감압하에 농축하여 용매를 제거하였다. TLC(메탄올/디클로로메탄 = 10:1, R f = 0.30)는 목적하는 생성물이 형성된 것으로 나타났다. 미정제 생성물을 MPLC(SiO2, 메탄올/디클로로메탄 = 0% 내지 6%)로 정제하여 tert-부틸(2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-3,4-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)피페리딘-1-카복실레이트(9.27 g, 30.46 mmol, 86.04% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다. LCMS : M +Na+ = 327.1, 순도: 92.22%.
단계 10: 피리딘(100 mL) 중 tert-부틸 (2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-3,4-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)피페리딘-1-카복실레이트(10 g, 32.86 mmol, 1 당량)의 용액에 BzCl(15.24 g, 108.43 mmol, 12.60 mL, 3.3 당량)을 0~5℃에서 첨가하고 10~15℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC는 출발 물질이 거의 소모되었고, 목적하는 생성물이 형성된 것으로 나타났다. 혼합물을 에틸 아세테이트(500 mL)로 희석하고 수성 HCl(1 M, 500 mL x 3), 포화 수성 NaHCO3(500 mL×3), 및 포화 수성 NaCl(500 mL×3)로 세척하였다. 유기 상을 무수 Na2SO4로 건조하고, 감압하에 농축하여 용매를 제거하였다. TLC(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1:2, R f = 0.35)는 출발 물질이 완전히 소모된 것으로 나타났다. 미정제 생성물을 MPLC(SiO2, 에틸 아세테이트/석유 에테르 = 0% 내지 30%)로 정제하여 (2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-2-((벤조일옥시)메틸)-1-(tert-부톡시카보닐)피페리딘-3,4-디일 디벤조에이트(19.21 g, 31.15 mmol, 94.81% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다. LCMS : M - 100 + H+ = 517.0.
단계 11: EtOAc(200 mL) 중 (2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-2-((벤조일옥시)메틸)-1-(tert-부톡시카보닐)피페리딘-3,4-디일 디벤조에이트(19.2 g, 31.14 mmol, 1 당량)에 0~5℃에서 HCl/EtOAc(4 M, 200 mL, 25.69 당량)을 첨가하고 5~10℃에서 12시간 동안 교반하였다. LCMS는 출발 물질이 완전히 소모된 것으로 나타났다. 혼합물을 감압하에 농축하여 용매를 제거하였다. 미정제 생성물을 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. (2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-2-((벤조일옥시)메틸)-1-(tert-부톡시카보닐)피페리딘-3,4-디일 디벤조에이트(16.34 g, 28.94 mmol, 92.94% 수율, 97.937 % 순도, HCl)를 백색 고체로서 수득하였다. 1 H NMR (400MHz, METHANOL-d4) δ = 8.11 (br d, J=7.3 Hz, 2H), 7.96 (br d, J=7.5 Hz, 2H), 7.80 (br d, J=7.5 Hz, 2H), 7.65 - 7.49 (m, 3H), 7.43 (br t, J=7.5 Hz, 2H), 7.32 (q, J=7.3 Hz, 4H), 6.31 (br s, 1H), 5.68 - 5.55 (m, 1H), 5.00 - 4.88 (m, 1H), 4.78 - 4.64 (m, 2H), 4.52 (br s, 1H), 3.77 (br dd, J=4.5, 12.5 Hz, 1H), 3.52 (br t, J=12.5 Hz, 1H), 1.91 (s, 3H); LCMS : M + H+ = 517.0, 순도: 97.93%.
단계 12: DMF(70 mL) 중 (2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-2-((벤조일옥시)메틸)-1-(tert-부톡시카보닐)피페리딘-3,4-디일 디벤조에이트(8 g, 14.47 mmol, 1 당량, HCl)와 테트라하이드로피란-2,6-디온(4.13 g, 36.17 mmol, 2.5 당량)의 혼합물에 DIEA(9.35 g, 72.33 mmol, 12.60 mL, 5 당량)를 5~10℃에서 첨가하였다. 혼합물을 85℃에서 12시간 동안 교반하였다. LCMS는 출발 물질이 대부분 소모된 것으로 나타났다. 혼합물을 감압하에 농축하여 용매를 제거하였다. 미정제 생성물을 HPLC로 검출하였다. 미정제 생성물을 prep-HPLC(HCl, MeCN/H2O)로 정제하여 5-((2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-3,4-비스(벤조일옥시)-2-((벤조일옥시)메틸)피페리딘-1-일)-5-옥소펜탄산(5.31 g, 8.41 mmol, 58.13% 수율, 99.878% 순도)을 황색 고체로서 수득하였다. 1 H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 12.05 (br s, 1H), 8.57 (br d, J=7.7 Hz, 1H), 8.08 (br d, J=7.1 Hz, 2H), 7.94 - 7.80 (m, 4H), 7.76 - 7.69 (m, 1H), 7.67 - 7.55 (m, 4H), 7.47 (br d, J=7.3 Hz, 4H), 5.84 - 5.65 (m, 1H), 5.56 - 5.22 (m, 2H), 4.99 (br t, J=10.1 Hz, 1H), 4.60 (br d, J=8.4 Hz, 1H), 4.41 (br d, J=14.6 Hz, 1H), 4.29 (br s, 1H), 4.00 - 3.74 (m, 2H), 2.42 - 2.31 (m, 1H), 2.24 (br d, J=5.3 Hz, 2H), 1.92 (s, 3H), 1.71 (br d, J=6.4 Hz, 2H); 13 C NMR (101MHz, DMSO-d6) δ = 174.77, 172.47, 170.07, 166.04, 165.28, 164.96, 134.36, 134.24, 133.76, 129.65, 129.42, 129.60 (br dd, J=20.9, 45.8 Hz, 1C), 129.02, 70.30, 67.58, 60.59, 49.08, 47.87, 41.40, 33.32, 32.46, 22.92, 20.53; LCMS: M + H+ = 631.3, 순도: 99.87%.
실시예 37. 5-(( 2R,3S,4R,5S )-5- 아세트아미도 -3,4- 비스 ( 벤조일옥시 )-2-(( 벤조일옥시 )메틸)피페리딘-1-일)펜탄산의 합성
Figure pct00755
단계 1: DMF(60 mL) 중 (2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-2-((벤조일옥시)메틸)피페리딘-3,4-디일 디벤조에이트(6 g, 10.85 mmol, 1 당량, HCl)와 5-브로모펜탄산--벤질 5-브로모펜타노에이트(11.78 g, 32.55 mmol, 3 당량)의 혼합물에 KI(360.22 mg, 2.17 mmol, 0.2 당량) 및 DIEA(7.01 g, 54.25 mmol, 9.45 mL, 5 당량)를 5~10℃에서 첨가하였다. 혼합물을 100℃에서 24시간 동안 교반하였다. LCMS는 출발 물질이 대부분 소모되었고 목적하는 생성물이 검출된 것으로 나타났다. 혼합물을 감압하에 농축하여 용매를 제거하였다. 미정제 생성물을 HPLC로 검출하고 prep-HPLC(HCl, MeCN/H2O)로 정제하여 (2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-2-((벤조일옥시)메틸)-1-(5-(벤질옥시)-5-옥소펜틸)피페리딘-3,4-디일 디벤조에이트(7.5 g, 9.83 mmol, 90.62% 수율, 92.655% 순도)을 황색 고체로서 수득하였다. MS: 707.1 (M+H)+.
단계 2: EtOAc(80 mL) 중 (2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-2-((벤조일옥시)메틸)-1-(5-(벤질옥시)-5-옥소펜틸)피페리딘-3,4-디일 디벤조에이트(7.8 g, 11.04 mmol, 1 당량)와 Pd/C(8 g, 11.04 mmol, 10% 순도, 1.00 당량)의 혼합물을 진공에서 배기시키고 H2(15 Psi)로 3회 다시 채운 후 10~15℃에서 6시간 동안 교반하였다. LCMS는 출발 물질이 완전히 소모된 것으로 나타났다. 혼합물을 여과하고 여과액을 감압하에 농축하여 용매를 제거하였다. 미정제 생성물을 prep-HPLC로 정제하여(컬럼: Phenomenex luna C18 250*50mm*10 um; 이동상: [물(0.05% HCl)-ACN]; B%: 35%~55%, 20분) 5-((2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-3,4-비스(벤조일옥시)-2-((벤조일옥시)메틸)피페리딘-1-일)펜탄산(2.83 g, 4.59 mmol, 41.58% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다. 1 H NMR (400 MHz, METHANOL-d4) δ = 8.10 - 8.04 (m, 2H), 7.95 - 7.90 (m, 2H), 7.82 - 7.77 (m, 2H), 7.64 - 7.50 (m, 3H), 7.48 - 7.42 (m, 2H), 7.40 - 7.30 (m, 4H), 6.29 - 6.17 (m, 1H), 5.50 - 5.38 (m, 1H), 4.86 - 4.79 (m, 2H), 4.67 - 4.54 (m, 1H), 4.22 - 4.04 (m, 1H), 3.75 - 3.61 (m, 1H), 3.43 - 3.34 (m, 1H), 3.28 - 3.11 (m, 2H), 2.43 - 2.35 (m, 2H), 1.93 - 1.79 (m, 5H), 1.75 - 1.62 (m, 2H); 13 C NMR (101 MHz, METHANOL-d4) δ = 175.50, 172.28, 165.74, 165.61, 165.47, 133.61, 133.28, 129.77, 129.39, 129.22, 128.96, 128.78, 128.65, 128.35, 128.19, 128.16, 68.65, 60.99, 60.42, 53.18, 52.53, 44.62, 32.78, 21.79, 21.22; LCMS: M + H+ = 617.3, 순도: 98.62%.
실시예 38. 1-((2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-3,4-비스(벤조일옥시)-2-((벤조일옥시)메틸)피페리딘-1-일)-16,16-비스((3-((3-(5-((2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-3,4-비스(벤조일옥시)-2-((벤조일옥시)메틸)피페리딘-1-일)펜탄아미도)프로필)아미노)-3-옥소프로폭시)메틸)-5,11,18-트리옥소-14-옥사-6,10,17-트리아자노나코산-29-오익산의 합성
Figure pct00756
단계 1: DCM(2.4 mL) 중 벤질 15,15-비스(13,13-디메틸-5,11-디옥소-2,12-디옥사-6,10-디아자테트라데실)-2,2-디메틸-4,10,17-트리옥소-3,13-디옥사-5,9,16-트리아자옥타코산-28-오에이트(144 mg, 0.13 mmol)의 용액에 2,2,2-트리플루오로아세트산(0.48 mL, 6.25 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 감압하에 증발시키고 미정제 생성물을 톨루엔과 함께 동시 증발시키고 에테르로 적정하고 진공하에 밤새 건조하였다. 벤질 12-((1,19-디아미노-10-((3-((3-아미노프로필)아미노)-3-옥소프로폭시)메틸)-5,15-디옥소-8,12-디옥사-4,16-디아자노나데칸-10-일)아미노)-12-옥소도데카노에이트를 정제 없이 다음 단계에 직접 사용하였다. LCMS C41H73N7O9 [M+H]+에 대한 m/z 계산치 808.56, 실측치: 808.30.
단계 2: DCM(1.5 mL) 중 5-((2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-3,4-비스(벤조일옥시)-2-((벤조일옥시)메틸)피페리딘-1-일)펜탄산(320 mg, 0.52 mmol), HATU(209 mg, 0.55 mmol)에 DMF(0.25 mL) 중 DIPEA(269 mg, 2.09 mmol) 및 미정제 벤질 12-((1,19-디아미노-10-((3-((3-아미노프로필)아미노)-3-옥소프로폭시)메틸)-5,15-디옥소-8,12-디옥사-4,16-디아자노나데칸-10-일)아미노)-12-옥소도데카노에이트(0.13 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 용매를 감압하에 증발시켜 미정제 잔류물을 수득하고 이를 플래쉬 크로마토그래피(DCM 중 5% MeOH 내지 DCM 중 30% MeOH)로 정제하여 벤질 1-((2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-3,4-비스(벤조일옥시)-2-((벤조일옥시)메틸)피페리딘-1-일)-16,16-비스((3-((3-(5-((2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-3,4-비스(벤조일옥시)-2-((벤조일옥시)메틸)피페리딘-1-일)펜탄아미도)프로필)아미노)-3-옥소프로폭시)메틸)-5,11,18-트리옥소-14-옥사-6,10,17-트리아자노나코산-29-오에이트(212 mg, 63% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다.
단계 3: 메탄올: 에틸 아세테이트(1:1, 2 mL) 중 벤질 1-((2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-3,4-비스(벤조일옥시)-2-((벤조일옥시)메틸)피페리딘-1-일)-16,16-비스((3-((3-(5-((2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-3,4-비스(벤조일옥시)-2-((벤조일옥시)메틸)피페리딘-1-일)펜탄아미도)프로필)아미노)-3-옥소프로폭시)메틸)-5,11,18-트리옥소-14-옥사-6,10,17-트리아자노나코산-29-오에이트(106 mg, 0.0407 mmol)에 10% Pd(OH)2/C(2.9 mg, 0.0203 mmol) 및 Pd/C(2.6 mg, 0.0203 mmol)를 첨가하고 아르곤으로 퍼징하였다. 이어서 플라스크를 H2로 퍼징하고 H2 분위기 하에서 교반하였다. LCMS에 의해 확인된 출발 물질의 완전한 소모 후 반응을 중단하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하여 1-((2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-3,4-비스(벤조일옥시)-2-((벤조일옥시)메틸)피페리딘-1-일)-16,16-비스((3-((3-(5-((2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-3,4-비스(벤조일옥시)-2-((벤조일옥시)메틸)피페리딘-1-일)펜탄아미도)프로필)아미노)-3-옥소프로폭시)메틸)-5,11,18-트리옥소-14-옥사-6,10,17-트리아자노나코산-29-오익산(82 mg, 80% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다. LCMS C138H169N13O33 [M/2+H]+에 대한 m/z 계산치 1257.12, 실측치: 1257.77
실시예 39. 1-((2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-3,4-비스(벤조일옥시)-2-((벤조일옥시)메틸)피페리딘-1-일)-16,16-비스((3-((3-(5-((2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-3,4-비스(벤조일옥시)-2-((벤조일옥시)메틸)피페리딘-1-일)-5-옥소펜탄아미도)프로필)아미노)-3-옥소프로폭시)메틸)-1,5,11,18-테트라옥소-14-옥사-6,10,17-트리아자노나코산-29-오익산의 합성.
Figure pct00757
단계 1: DCM(1.5 mL) 중 5-((2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-3,4-비스(벤조일옥시)-2-((벤조일옥시)메틸)피페리딘-1-일)-5-옥소펜탄산(328 mg, 0.52 mmol), HATU(209 mg, 0.55 mmol)에 DMF(0.25 mL) 중 DIPEA(269 mg, 2.08 mmol) 및 벤질 12-((1,19-디아미노-10-((3-((3-아미노프로필)아미노)-3-옥소프로폭시)메틸)-5,15-디옥소-8,12-디옥사-4,16-디아자노나데칸-10-일)아미노)-12-옥소도데카노에이트(0.13 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 용매를 감압하에 증발시켜 미정제 잔류물을 수득하고 이를 플래쉬 크로마토그래피(DCM 중 5% MeOH 내지 DCM 중 30% MeOH)로 정제하여 벤질 1-((2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-3,4-비스(벤조일옥시)-2-((벤조일옥시)메틸)피페리딘-1-일)-16,16-비스((3-((3-(5-((2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-3,4-비스(벤조일옥시)-2-((벤조일옥시)메틸)피페리딘-1-일)-5-옥소펜타나미도)프로필)아미노)-3-옥소프로폭시)메틸)-1,5,11,18-테트라옥소-14-옥사-6,10,17-트리아자노나코산-29-오에이트(193 mg, 56 % 수율)를 백색 고체로서 수득하였다. LCMS C143H169N13O36 [M/3+H]+에 대한 m/z 계산치 882.40, 실측치: 882.21.
단계 2: 메탄올: 에틸 아세테이트(1:1, 2 mL) 중 벤질 1-((2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-3,4-비스(벤조일옥시)-2-((벤조일옥시)메틸)피페리딘-1-일)-16,16-비스((3-((3-(5-((2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-3,4-비스(벤조일옥시)-2-((벤조일옥시)메틸)피페리딘-1-일)-5-옥소펜탄아미도)프로필)아미노)-3-옥소프로폭시)메틸)-1,5,11,18-테트라옥소-14-옥사-6,10,17-트리아자노나코산-29-오에이트(193 mg, 0.0729 mmol)에 10% Pd(OH)2/C(5.2 mg, 0.03645 mmol) 및 Pd/C(3.9 mg, 0.03645 mmol)을 첨가하고 아르곤으로 퍼징하였다. 이어서 플라스크를 H2로 퍼징하고 H2 분위기 하에서 교반하였다. LCMS에 의해 확인된 출발 물질의 완전한 소모 후 반응을 중단하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고 플래쉬 크로마토그래피(DCM 중 5% MeOH 내지 DCM 중 30% MeOH)로 정제하여 1-((2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-3,4-비스(벤조일옥시)-2-((벤조일옥시)메틸)피페리딘-1-일)-16,16-비스((3-((3-(5-((2R,3S,4R,5S)-5-아세트아미도-3,4-비스(벤조일옥시)-2-((벤조일옥시)메틸)피페리딘-1-일)-5-옥소펜탄아미도)프로필)아미노)-3-옥소프로폭시)메틸)-1,5,11,18-테트라옥소-14-옥사-6,10,17-트리아자노나코산-29-오익산(124 mg, 67% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다. LCMS C136H163N13O36 [M/2+H]+에 대한 m/z 계산치 1278.07, 실측치: 1278.08.
다양한 구현예가 본원에서 설명되고 예시되었지만, 당업자는 기능을 수행하고/하거나 결과 및/또는 하나 이상의 장점(본 발명에 기재됨)을 얻기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 쉽게 구상할 것이며, 이러한 각각의 변화 및/또는 변형은 포함되는 것으로 간주된다. 더 일반적으로, 당업자는 본원에 설명된 모든 파라미터, 치수, 재료, 및 구성이 예시적인 것이며 실제 파라미터, 치수, 재료 및/또는 구성이 특정 응용 또는 본 발명의 교시가 사용되는 응용에 의존할 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 당업자는 단지 통상적인 실험을 사용하여, 본 발명의 구현예에 대한 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 전술한 구현예는 단지 예로서 제시되며, 첨부된 청구범위 및 이에 대한 균등의 범위 내에서, 청구된 기술이 구체적으로 설명되고 청구된 것과 다르게 실시될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 둘 이상의 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법의 임의의 조합은, 그러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법이 서로 모순되지 않는 경우, 본 발명의 범위 내에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> WAVE LIFE SCIENCES LTD. <120> DOUBLE STRANDED OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND METHODS RELATING THERETO <130> 088290.0109 <140> PCT/IB2021/000351 <141> 2021-05-24 <150> 63/029,060 <151> 2020-05-22 <160> 643 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1 uuaagacuug agaugauccu ggc 23 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2 caggaucauc ucaagucuua a 21 <210> 3 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 3 uuaagacuug agaugauccu ggc 23 <210> 4 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 4 uuaagacuug agaugauccu ggc 23 <210> 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ccaaattccg ctctca 16

Claims (41)

  1. 가이드 가닥 및 패신저 가닥을 포함하는 이중 가닥 RNAi(dsRNAi) 제제로서,
    a) 가이드 가닥은 표적 RNA 서열에 상보적이거나 실질적으로 상보적이고,
    i. 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심,
    ii. 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 +2 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이의 Rp, Sp, 또는 교호 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심,
    iii. 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심 상류의 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심,
    iv. 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 (+2) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이, 또한 (a) (+3) 뉴클레오티드와 (+4) 뉴클레오티드 사이 및 (b) (+5) 뉴클레오티드와 (+6) 뉴클레오티드 사이 중 하나 또는 둘 모두의 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심, 또는
    v. 가이드 가닥의, 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 두 번째(+2)와 세 번째(+3) 뉴클레오티드 사이에 나타나고 끝에서 두 번째 3' (N-1) 뉴클레오티드에 대해 나타나는 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결을 포함하고,
    b) 패신저 가닥은
    i. 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49), 및
    ii. Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심
    중 하나 또는 둘 모두를 포함하고,
    c) dsRNAi 제제의 각 가닥은 독립적으로 약 15 내지 약 49개 뉴클레오티드의 길이를 갖고,
    d) dsRNAi는 표적-특이적 RNA 간섭을 유도할 수 있는, 이중 가닥 RNAi(dsRNAi) 제제.
  2. 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키랄 제어 올리고뉴클레오티드 조성물로서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 가이드 가닥 및 패신저 가닥은 독립적으로
    a) 공통 염기 서열 및 길이,
    b) 공통 백본 연결 패턴, 및
    c) 공통 백본 키랄 중심 패턴을 특징으로 하고,
    상기 조성물은 동일한 공통 염기 서열 및 길이를 갖는 가이드 가닥의 실질적 라세미 제제에 비해 공통 키랄 중심 패턴을 갖는 올리고뉴클레오티드가 풍부하다는 점에서 키랄 제어되고,
    a) 가이드 가닥은 표적 RNA 서열에 상보적이거나 실질적으로 상보적이고,
    i. 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심,
    ii. 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 +2 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이의 Rp, Sp, 또는 교호 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심,
    iii. 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심 상류의 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심,
    iv. 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 (+2) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이, 또한 (a) (+3) 뉴클레오티드와 (+4) 뉴클레오티드 사이 및 (b) (+5) 뉴클레오티드와 (+6) 뉴클레오티드 사이 중 하나 또는 둘 모두의 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심, 또는
    v. 가이드 가닥의, 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 두 번째(+2)와 세 번째(+3) 뉴클레오티드 사이에 나타나고 끝에서 두 번째 3' (N-1) 뉴클레오티드에 대해 나타나는 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결을 포함하고,
    b) 패신저 가닥은
    i. 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49), 및
    ii. Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심
    중 하나 또는 둘 모두를 포함하고,
    c) 가이드 가닥 및 패신저 가닥은 약 15 내지 약 49개 뉴클레오티드의 길이를 갖고,
    d) 가이드 가닥 및 패신저 가닥은 표적-특이적 RNA 간섭을 유도할 수 있는, 키랄 제어 올리고뉴클레오티드 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 가이드 가닥은 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49)을 포함하는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 가이드 가닥은 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 +2 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이의 Rp, Sp, 또는 교호 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49)을 포함하는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 가이드 가닥은 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심 상류의 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49)을 포함하는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 가이드 가닥은 가이드 가닥의, 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 두 번째(+2)와 세 번째(+3) 뉴클레오티드 사이에 나타나고 끝에서 두 번째 3' (N-1) 뉴클레오티드에 대해 나타나는 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결을 포함하고, 패신저 가닥은 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49)을 포함하는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 가이드 가닥은 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함하는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 가이드 가닥은 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 +2 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이의 Rp, Sp, 또는 교호 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함하는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 가이드 가닥은 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심 상류의 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함하는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 가이드 가닥은 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 (+2) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이, 또한 (a) (+3) 뉴클레오티드와 (+4) 뉴클레오티드 사이 및 (b) (+5) 뉴클레오티드와 (+6) 뉴클레오티드 사이 중 하나 또는 둘 모두의 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 가이드 가닥은
    Figure pct00758

    Figure pct00759

    Figure pct00760

    Figure pct00761
    및
    Figure pct00762

    (염기: A, C, G, T, U, 비염기성, 및 변형 핵염기;
    R: H, OH, O-알킬, F, MOE, 4' 위치로의 LNA 가교체, 4' 위치로의 BNA 가교체)로부터 선택되는 5' 말단 변형을 포함하는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 가이드 가닥은 가이드 가닥의, 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 두 번째(+2)와 세 번째(+3) 뉴클레오티드 사이에 나타나고 끝에서 두 번째 3' (N-1) 뉴클레오티드에 대해 나타나는 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결을 포함하고, 패신저 가닥은 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함하는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 가이드 가닥은 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49) 및 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함하는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 가이드 가닥은 5' 말단(+1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+2) 뉴클레오티드 사이 및 +2 뉴클레오티드와 바로 다음의 하류(+3) 뉴클레오티드 사이의 Rp, Sp, 또는 교호 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49) 및 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함하는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 가이드 가닥은 3' 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드 사이 및 끝에서 두 번째(N-1) 뉴클레오티드와 바로 다음의 상류(N-2) 뉴클레오티드 사이의 Sp 배열의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심 상류의 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 포스포로티오에이트 키랄 중심을 포함하고, 패신저 가닥은 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49) 및 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함하는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 가이드 가닥은 가이드 가닥의, 5' 말단 뉴클레오티드에 대해, 두 번째(+2)와 세 번째(+3) 뉴클레오티드 사이에 나타나고 끝에서 두 번째 3' (N-1) 뉴클레오티드에 대해 나타나는 하나 이상의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결을 포함하고, 패신저 가닥은 0~n개의 음으로 하전되지 않은 뉴클레오티드간 연결(n은 약 1 내지 49) 및 Rp 또는 Sp 배열의 하나 이상의 백본 키랄 중심을 포함하는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 음으로 하전되지 않은 백본 뉴클레오티드간 연결은 중성 전하를 갖는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 중성 백본 뉴클레오티드간 연결은
    Figure pct00763
    인, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 가이드 가닥은 가이드 가닥의 세 번째(+3)와 네 번째(+4) 뉴클레오티드 사이, 가이드 가닥의 열 번째(+10)와 열한 번째(+11) 뉴클레오티드 사이, 또는 둘 모두에
    Figure pct00764
    구조를 갖는 연결을 포함하는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 패신저 가닥은 패신저 가닥의 중앙 뉴클레오티드에 대해 5', 패신저 가닥의 중앙 뉴클레오티드에 대해 3', 또는 둘 모두에
    Figure pct00765
    구조를 갖는 연결을 포함하는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  21. 제2항에 있어서, 공통 염기 서열, 공통 염기 변형 패턴, 공통 당 변형 패턴, 및/또는 공통 뉴클레오티드간 연결 패턴을 독립적으로 공유하는 조성물 내의 가이드 가닥 및 패신저 가닥은 조성물 내의 모든 가이드 가닥 및 패신저 가닥의 적어도 90%인, 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 임의로 링커를 통해 핵염기에서 연결된 탄수화물 모이어티를 포함하는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 임의로 링커를 통해 핵염기에서 이중 가닥 올리고뉴클레오티드에 연결된 지질 모이어티를 포함하는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 한 가닥 또는 양 가닥은 임의로 링커를 통해 핵염기에서 연결된 표적 모이어티를 포함하는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결의 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%는 독립적으로 키랄 뉴클레오티드간 연결인, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 단위의 적어도 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 97%는 독립적으로 2'-치환을 포함하는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 2'-치환은 2'-F인, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 2'-치환은 2'-OR1인, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 2'-치환은 -L-이고, L은 당 단위의 C2 및 C4를 연결하는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 단위의 적어도 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 97%는 2'-치환을 포함하지 않는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 가닥은 표적 서열에 완전히 상보적인 표적 결합 서열을 포함하고, 표적 결합 서열은 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 염기의 길이를 갖고, 각 염기는 임의로 치환된 아데닌, 시토신, 구아노신, 티민, 또는 우라실이고, 표적 서열은 하나 이상의 대립유전자 부위를 포함하고, 대립유전자 부위는 SNP 또는 돌연변이인, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 서열은 2개의 SNP를 포함하는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 서열은 대립유전자 부위를 포함하고, 표적-결합 서열은 질환-관련 대립유전자의 표적 서열에 완전히 상보적이나 질환과 덜 관련된 대립유전자의 표적 서열에는 상보적이지 않은, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 집단 내에 복수의 대립유전자가 존재하는 표적 핵산 서열의 전사체와 결합하는 가이드 가닥을 포함하고, 각각의 대립유전자는, 동일한 표적 핵산 서열의 다른 대립유전자에 대해 상대적으로 대립유전자를 규정하는 특정의 뉴클레오티드 특징적 서열 요소를 포함하고,
    가이드 가닥의 염기 서열은 특정 대립유전자를 규정하는 특징적 서열 요소에 상보적인 서열이거나 이를 포함하고,
    가이드 가닥은 표적 핵산 서열의 전사체를 포함하는 세포와 접촉할 때, 특정 대립유전자의 전사체 또는 이에 의해 암호화되는 단백질의 억제가 동일한 핵산 서열의 다른 대립유전자에 대해 관찰되는 억제 수준보다 더 큰 수준으로 나타나는 것을 특징으로 하는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물.
  35. 전사체 또는 이에 의해 암호화되는 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키는 방법으로서, 전사체를 발현하는 세포에 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하되, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물의 가이드 가닥은 전사체의 표적 서열에 완전히 상보적인 표적 결합 서열을 포함하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 세포는 면역세포, 혈액세포, 심장세포, 폐세포, 시신경세포, 근육세포, 간세포, 신장세포, 뇌세포, 중추 신경계 세포, 또는 말초 신경계 세포인, 방법.
  37. 집단 내에 복수의 대립유전자가 존재하는 핵산 서열로부터의 전사체의 대립유전자-특이적 억제를 위한 방법으로서, 각각의 대립유전자는, 동일한 표적 핵산 서열의 다른 대립유전자에 대해 상대적으로 대립유전자를 규정하는 특정의 뉴클레오티드 특징적 서열 요소를 포함하고,
    표적 핵산 서열의 전사체를 포함하는 샘플을 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하되,
    이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물의 가이드 가닥은 핵산 서열의 표적 서열과 동일하거나 완전히 상보적인 표적 결합 서열을 포함하고, 표적 서열은 특정 대립유전자를 규정하는 특징적 서열 요소를 포함하고,
    이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물의 가이드 가닥이 동일한 핵산 서열의 표적 대립유전자 및 다른 대립유전자 모두의 전사체를 포함하는 세포와 접촉하는 경우, 특정 대립유전자의 전사체는 동일한 핵산 서열의 다른 대립유전자에 대해 관찰되는 억제 수준보다 더 큰 수준으로 억제되는, 방법.
  38. 집단 내에 복수의 대립유전자가 존재하는 핵산 서열로부터의 전사체의 대립유전자-특이적 억제를 위한 방법으로서, 각각의 대립유전자는, 동일한 표적 핵산 서열의 다른 대립유전자에 대해 상대적으로 대립유전자를 규정하는 특정의 뉴클레오티드 특징적 서열 요소를 포함하고,
    표적 핵산 서열의 전사체를 포함하는 대상체에게 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하되,
    이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물의 가이드 가닥은 핵산 서열의 표적 서열과 동일하거나 완전히 상보적인 표적 결합 서열을 포함하고, 표적 서열은 특정 대립유전자를 규정하는 특징적 서열 요소를 포함하고,
    이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 조성물의 가이드 가닥이 동일한 핵산 서열의 표적 대립유전자 및 다른 대립유전자 모두의 전사체를 포함하는 세포와 접촉하는 경우, 특정 대립유전자의 전사체는 동일한 핵산 서열의 다른 대립유전자에 대해 관찰되는 억제 수준보다 더 큰 수준으로 억제되는, 방법.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 조성물의 올리고뉴클레오티드가 동일한 핵산 서열의 표적 대립유전자 및 다른 대립유전자 모두의 전사체를 포함하는 세포와 접촉하는 경우,
    a) 조성물이 없는 경우보다 더 큰 수준,
    b) 동일 핵산 서열의 다른 대립유전자에 대해 관찰되는 억제 수준보다 더 큰 수준, 또는
    c) 조성물이 없는 경우보다 더 큰 동시에 동일 핵산 서열의 다른 대립유전자에 대해 관찰되는 억제 수준보다 더 큰 수준
    으로 특정 대립 유전자의 전사체 억제를 나타내는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 세포는 면역세포, 혈액세포, 심장세포, 폐세포, 시신경세포, 근육세포, 간세포, 신장세포, 뇌세포, 중추 신경계 세포, 또는 말초 신경계 세포인, 방법.
  41. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 특정 대립유전자의 전사체 억제 수준은 조성물이 없는 경우보다 더 큰 동시에 동일 핵산 서열의 다른 대립유전자에 대해 관찰되는 억제 수준보다 더 큰 수준인, 방법.
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