JP3194969B2 - ポリヌクレオチド検出用プローブ及び検出方法 - Google Patents
ポリヌクレオチド検出用プローブ及び検出方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、特定のポリヌクレオチド塩基配列を有する
被検体（DNAやRNAなど）を含む検体試料に蛍光色素で標
識された検出用プローブを混入して、その検体試料から
発せられる蛍光を測定することにより、検体試料中の検
出用プローブが結合した被検体を検出するための、検出
用プローブおよび検出方法の技術に関するものである。
被検体（DNAやRNAなど）を含む検体試料に蛍光色素で標
識された検出用プローブを混入して、その検体試料から
発せられる蛍光を測定することにより、検体試料中の検
出用プローブが結合した被検体を検出するための、検出
用プローブおよび検出方法の技術に関するものである。
背景技術 試料中に存在する特定の塩基配列をもつDNAやRNAを検
出・定量する方法として、検出対象となるDNAやRNAと特
異的にハイブリダイズする「検出用プローブ」を利用す
る方法が広く使用されている。検出用プローブとして
は、検出対象であるDNAやRNA（ターゲット核酸）の塩基
配列の一部と相補的な塩基配列をもつオリゴヌクレオチ
ド核酸を用いることが多い。
出・定量する方法として、検出対象となるDNAやRNAと特
異的にハイブリダイズする「検出用プローブ」を利用す
る方法が広く使用されている。検出用プローブとして
は、検出対象であるDNAやRNA（ターゲット核酸）の塩基
配列の一部と相補的な塩基配列をもつオリゴヌクレオチ
ド核酸を用いることが多い。
これらの方法においては、検出用プローブとターゲッ
ト核酸とのハイブリッド体を形成させた後、ハイブリッ
ド体形成にともなう変化を検出することにより、試料中
に検出対象とするターゲット核酸が含まれていることを
確認したり、その存在量を定量する。たとえば、検出用
プローブを蛍光色素で標識しておく。この蛍光標識検出
用プローブ（蛍光標識オリゴヌクレオチド核酸）を試料
中に加える。試料中にターゲット核酸が存在すれば、蛍
光標識検出用プローブはターゲット核酸に結合しハイブ
リッド体を形成する。その後、試料中のターゲット核酸
とハイブリダイズした蛍光標識検出用プローブと、未結
合の蛍光標識検出用プローブを分離する操作を行うこと
により、未結合の蛍光標識検出用プローブを試料中より
除去する。ここで、試料の蛍光強度を測定すれば、試料
中のターゲット核酸の量を定量することが可能である。
ト核酸とのハイブリッド体を形成させた後、ハイブリッ
ド体形成にともなう変化を検出することにより、試料中
に検出対象とするターゲット核酸が含まれていることを
確認したり、その存在量を定量する。たとえば、検出用
プローブを蛍光色素で標識しておく。この蛍光標識検出
用プローブ（蛍光標識オリゴヌクレオチド核酸）を試料
中に加える。試料中にターゲット核酸が存在すれば、蛍
光標識検出用プローブはターゲット核酸に結合しハイブ
リッド体を形成する。その後、試料中のターゲット核酸
とハイブリダイズした蛍光標識検出用プローブと、未結
合の蛍光標識検出用プローブを分離する操作を行うこと
により、未結合の蛍光標識検出用プローブを試料中より
除去する。ここで、試料の蛍光強度を測定すれば、試料
中のターゲット核酸の量を定量することが可能である。
上で述べた方法では、検出用プローブを試料に添加し
た後に、未結合の検出用プローブを取り除く操作が必要
であった。このような分離操作は実際上は繁雑であるた
め、プローブ添加後の、結合したプローブと未結合のプ
ローブとの分離操作が不要であるアッセイ法（ホモジニ
アスアッセイ法）が、種々、試みられている。
た後に、未結合の検出用プローブを取り除く操作が必要
であった。このような分離操作は実際上は繁雑であるた
め、プローブ添加後の、結合したプローブと未結合のプ
ローブとの分離操作が不要であるアッセイ法（ホモジニ
アスアッセイ法）が、種々、試みられている。
ホモジニアスアッセイ法のひとつとして、２種類の蛍
光分子間で生じる共鳴エネルギー移動を利用する方法が
ある。一般に、２種類の蛍光分子が約70−80オングスト
ローム以内の距離にあると、蛍光分子間に相互作用が生
じ（共鳴エネルギー移動）、蛍光スペクトルや蛍光減衰
カーブが変化する。蛍光スペクトル上では、ドナー（一
般に、２種類の蛍光分子のうち、吸収スペクトルが短波
長側にあるもの）の蛍光強度が減少し、アクセプター
（２種類の蛍光分子のうち、吸収スペクトルが長波長側
にあるもの）の蛍光強度は増大する。また、パルス励起
後の蛍光減衰カーブの変化としては、ドナーの減衰は速
くなり、アクセプターの減衰は遅くなる。
光分子間で生じる共鳴エネルギー移動を利用する方法が
ある。一般に、２種類の蛍光分子が約70−80オングスト
ローム以内の距離にあると、蛍光分子間に相互作用が生
じ（共鳴エネルギー移動）、蛍光スペクトルや蛍光減衰
カーブが変化する。蛍光スペクトル上では、ドナー（一
般に、２種類の蛍光分子のうち、吸収スペクトルが短波
長側にあるもの）の蛍光強度が減少し、アクセプター
（２種類の蛍光分子のうち、吸収スペクトルが長波長側
にあるもの）の蛍光強度は増大する。また、パルス励起
後の蛍光減衰カーブの変化としては、ドナーの減衰は速
くなり、アクセプターの減衰は遅くなる。
この蛍光分子間の共鳴エネルギー移動を、核酸のホモ
ジニアスアッセイに利用することが試みられている。す
なわち、２種類の蛍光標識検出用プローブ（それぞれ異
なる種類の蛍光色素分子で標識されている）を用意し、
これらをターゲット核酸に互いに隣接してハイブリダイ
ズさせる。ハイブリッド体においては、２種類の蛍光色
素は近い距離にあるため、エネルギー移動がおこり蛍光
スペクトルが変化する。すなわち、２種類の蛍光標識検
出用プローブとターゲット核酸とからなるハイブリッド
体形成にともない蛍光スペクトルが変化するため、蛍光
スペクトル変化を測定することによって、ターゲット核
酸の検出が可能となる（Cardullo,R.A.,et al.（1988）
Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85 8790−8794,EP0070685）。
USP 4996143には、蛍光スペクトル変化を測定すること
によってターゲット核酸を検出する方法に適した蛍光標
識オルゴヌクレオチドプローブが示されている。
ジニアスアッセイに利用することが試みられている。す
なわち、２種類の蛍光標識検出用プローブ（それぞれ異
なる種類の蛍光色素分子で標識されている）を用意し、
これらをターゲット核酸に互いに隣接してハイブリダイ
ズさせる。ハイブリッド体においては、２種類の蛍光色
素は近い距離にあるため、エネルギー移動がおこり蛍光
スペクトルが変化する。すなわち、２種類の蛍光標識検
出用プローブとターゲット核酸とからなるハイブリッド
体形成にともない蛍光スペクトルが変化するため、蛍光
スペクトル変化を測定することによって、ターゲット核
酸の検出が可能となる（Cardullo,R.A.,et al.（1988）
Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85 8790−8794,EP0070685）。
USP 4996143には、蛍光スペクトル変化を測定すること
によってターゲット核酸を検出する方法に適した蛍光標
識オルゴヌクレオチドプローブが示されている。
このように、エネルギー移動による蛍光スペクトル変
化を測定する方法は、核酸のホモジニアスアッセイに有
効である。しかしながら、試料中の検出用プローブの量
（分子数）がターゲット核酸の量（分子数）よりも過剰
になると、上述した蛍光スペクトル変化によりターゲッ
ト核酸を検出する方法を使用することは、実際上、非常
に困難となる。すなわち、測定される蛍光スペクトル
は、少数のエネルギー移動をおこしている蛍光色素分子
からの蛍光スペクトルと多数のエネルギー移動をおこし
ていない蛍光色素分子（ターゲット核酸に未結合の蛍光
標識検出用プローブ）からの蛍光スペクトルの和となる
ため、少数のエネルギー移動をおこしている蛍光色素分
子からの蛍光スペクトルは多数のエネルギー移動をおこ
していない蛍光色素分子からの蛍光スペクトルに埋没し
てしまい、エネルギー移動にともなう蛍光スペクトル変
化を検出することは、実際上、不可能となる。
化を測定する方法は、核酸のホモジニアスアッセイに有
効である。しかしながら、試料中の検出用プローブの量
（分子数）がターゲット核酸の量（分子数）よりも過剰
になると、上述した蛍光スペクトル変化によりターゲッ
ト核酸を検出する方法を使用することは、実際上、非常
に困難となる。すなわち、測定される蛍光スペクトル
は、少数のエネルギー移動をおこしている蛍光色素分子
からの蛍光スペクトルと多数のエネルギー移動をおこし
ていない蛍光色素分子（ターゲット核酸に未結合の蛍光
標識検出用プローブ）からの蛍光スペクトルの和となる
ため、少数のエネルギー移動をおこしている蛍光色素分
子からの蛍光スペクトルは多数のエネルギー移動をおこ
していない蛍光色素分子からの蛍光スペクトルに埋没し
てしまい、エネルギー移動にともなう蛍光スペクトル変
化を検出することは、実際上、不可能となる。
生物試料での実際の測定においては、「検出用プロー
ブの量が検出対象の核酸（ターゲット核酸）の量に対し
て過剰になること」は頻繁に生じる。例えば、試料中の
ターゲット核酸の量が未知のときである。また、測定感
度は試料の蛍光強度に依存するため、試料中の蛍光標識
検出用プローブの濃度は一定濃度以下には下げられな
い。したがって、ターゲット核酸の量が微量であるとき
（低濃度）は、検出用プローブの量がターゲット核酸に
対して過剰になる。
ブの量が検出対象の核酸（ターゲット核酸）の量に対し
て過剰になること」は頻繁に生じる。例えば、試料中の
ターゲット核酸の量が未知のときである。また、測定感
度は試料の蛍光強度に依存するため、試料中の蛍光標識
検出用プローブの濃度は一定濃度以下には下げられな
い。したがって、ターゲット核酸の量が微量であるとき
（低濃度）は、検出用プローブの量がターゲット核酸に
対して過剰になる。
したがって、検出用プローブが検出対象の核酸に対し
て過剰に存在する条件においても、検出対象核酸を精度
よく検出することを可能とする方法が求められている。
て過剰に存在する条件においても、検出対象核酸を精度
よく検出することを可能とする方法が求められている。
一般に、蛍光分子間のエネルギー移動を検出・測定す
る方法としては、蛍光スペクトル変化を測定する方法と
パルス励起後の蛍光強度の減衰カーブの変化を測定する
方法（時間分解法）がある。エネルギー移動をおこして
いる蛍光分子とエネルギー移動をおこしていない同種の
蛍光分子が共存しているときに、エネルギー移動を検出
する方法としては、蛍光スペクトルの変化を測定するよ
りも、蛍光減衰カーブを測定する（時間分解測定法）方
法が有利となることがある（Morrison,L.E.（1980）Ana
ly.Chem.174 101−120、特開平７−229835）。エネルギ
ー移動によりアクセプターの蛍光減衰は遅くなるが、Mo
rrisonは、減衰の遅れが十分大きいときには、直接励起
のアクセプターの蛍光減衰が実質的に終了した後の時間
域において蛍光強度を測定することによって、エネルギ
ー移動由来のアクセプターからの蛍光を選択的に測定す
ることが可能であることを示した。特開平７−229835
は、アクセプター蛍光波長域の蛍光減衰に加えてドナー
の蛍光波長域における蛍光減衰も測定することにより、
アクセプター蛍光波長域へのドナー由来の蛍光の混入に
より生じる検出のゆがみ（誤差）を補正する方法を提供
している。
る方法としては、蛍光スペクトル変化を測定する方法と
パルス励起後の蛍光強度の減衰カーブの変化を測定する
方法（時間分解法）がある。エネルギー移動をおこして
いる蛍光分子とエネルギー移動をおこしていない同種の
蛍光分子が共存しているときに、エネルギー移動を検出
する方法としては、蛍光スペクトルの変化を測定するよ
りも、蛍光減衰カーブを測定する（時間分解測定法）方
法が有利となることがある（Morrison,L.E.（1980）Ana
ly.Chem.174 101−120、特開平７−229835）。エネルギ
ー移動によりアクセプターの蛍光減衰は遅くなるが、Mo
rrisonは、減衰の遅れが十分大きいときには、直接励起
のアクセプターの蛍光減衰が実質的に終了した後の時間
域において蛍光強度を測定することによって、エネルギ
ー移動由来のアクセプターからの蛍光を選択的に測定す
ることが可能であることを示した。特開平７−229835
は、アクセプター蛍光波長域の蛍光減衰に加えてドナー
の蛍光波長域における蛍光減衰も測定することにより、
アクセプター蛍光波長域へのドナー由来の蛍光の混入に
より生じる検出のゆがみ（誤差）を補正する方法を提供
している。
さらに、特開平７−229835には、特開平７−229835の
方法（蛍光分子間のエネルギー移動を時間分解測定法に
より検出する一方法）を核酸のホモジニアスアッセイに
適用すれば、検出用プローブがターゲット核酸に対して
過剰に存在する条件においてもターゲット核酸が検出可
能であることが述べられている。しかしながら、同方法
に使用する検出用プローブが満たすべき必要条件は述べ
られていない。
方法（蛍光分子間のエネルギー移動を時間分解測定法に
より検出する一方法）を核酸のホモジニアスアッセイに
適用すれば、検出用プローブがターゲット核酸に対して
過剰に存在する条件においてもターゲット核酸が検出可
能であることが述べられている。しかしながら、同方法
に使用する検出用プローブが満たすべき必要条件は述べ
られていない。
発明の開示 本発明は、蛍光色素で標識された２種類の検出用プロ
ーブが同一の被検体（ターゲット核酸）に互いに隣接し
てハイブリダイズしてハイブリッド体を形成し、２種類
の蛍光色素分子間にエネルギー移動が生じたときに、ア
クセプターとしての蛍光色素の蛍光減衰が十分に遅くな
るような蛍光標識検出用プローブを見い出したものであ
る。
ーブが同一の被検体（ターゲット核酸）に互いに隣接し
てハイブリダイズしてハイブリッド体を形成し、２種類
の蛍光色素分子間にエネルギー移動が生じたときに、ア
クセプターとしての蛍光色素の蛍光減衰が十分に遅くな
るような蛍光標識検出用プローブを見い出したものであ
る。
また、当該プローブを用いて、ターゲット核酸を高感
度に検出する方法を提供する。これにより、検出用プロ
ーブがターゲット核酸に対して過剰に存在する条件にお
いて、ターゲット核酸を高感度、高精度で検出すること
が可能となった。
度に検出する方法を提供する。これにより、検出用プロ
ーブがターゲット核酸に対して過剰に存在する条件にお
いて、ターゲット核酸を高感度、高精度で検出すること
が可能となった。
エネルギー移動を利用して、検出用プローブがターゲ
ット核酸に対して過剰に存在する条件において高感度で
ターゲット核酸を検出可能とするためには、２種類の蛍
光標識検出用プローブとターゲット核酸とから形成され
るハイブリッド体において、エネルギー移動励起のアク
セプターの蛍光減衰が、直接励起のアクセプターの蛍光
減衰よりも大きく遅れることが必要であると考えた。
ット核酸に対して過剰に存在する条件において高感度で
ターゲット核酸を検出可能とするためには、２種類の蛍
光標識検出用プローブとターゲット核酸とから形成され
るハイブリッド体において、エネルギー移動励起のアク
セプターの蛍光減衰が、直接励起のアクセプターの蛍光
減衰よりも大きく遅れることが必要であると考えた。
２種類の蛍光標識検出用プローブとターゲット核酸と
から形成されるハイブリッド体において、エネルギー移
動励起のアクセプターの蛍光減衰カーブの遅れの大きさ
は、（１）蛍光色素分子が結合している２つのヌクレオ
チド間の塩基数（２つの蛍光色素分子間の平均距離を規
定する）、（２）蛍光色素分子が結合している２つのヌ
クレオチド間のハイブリッド体の構造（二本鎖または一
本鎖）、（３）蛍光色素分子が導入されるヌクレオチド
の検出用プローブ上での位置、および（４）蛍光色素分
子の種類、に大きく依存することを見い出した。これら
の知見にもとづいて、検出用プローブとして、適切な蛍
光色素の組み合わせを選択し、かつ、ハイブリッド体形
成時において２種類の蛍光色素分子間の距離が適切にな
るように塩基間数を選択し、かつ、ハイブリッド体の蛍
光色素分子間の構造が適切な設定になるようにすること
によって、検出用プローブがターゲット核酸に対して過
剰に存在する試料において、高感度でターゲット核酸を
検出可能とする方法および検出用プローブを見い出すこ
とに成功した。
から形成されるハイブリッド体において、エネルギー移
動励起のアクセプターの蛍光減衰カーブの遅れの大きさ
は、（１）蛍光色素分子が結合している２つのヌクレオ
チド間の塩基数（２つの蛍光色素分子間の平均距離を規
定する）、（２）蛍光色素分子が結合している２つのヌ
クレオチド間のハイブリッド体の構造（二本鎖または一
本鎖）、（３）蛍光色素分子が導入されるヌクレオチド
の検出用プローブ上での位置、および（４）蛍光色素分
子の種類、に大きく依存することを見い出した。これら
の知見にもとづいて、検出用プローブとして、適切な蛍
光色素の組み合わせを選択し、かつ、ハイブリッド体形
成時において２種類の蛍光色素分子間の距離が適切にな
るように塩基間数を選択し、かつ、ハイブリッド体の蛍
光色素分子間の構造が適切な設定になるようにすること
によって、検出用プローブがターゲット核酸に対して過
剰に存在する試料において、高感度でターゲット核酸を
検出可能とする方法および検出用プローブを見い出すこ
とに成功した。
蛍光スペクトル変化を測定することによりエネルギー
移動を検出するときに使用する検出用プローブの必要条
件（USP 4996143で開示されている）と、蛍光減衰カー
ブの変化を測定することによりエネルギー移動を検出す
るときに使用する検出用プローブに求められる条件（本
発明）は大きく異なる。
移動を検出するときに使用する検出用プローブの必要条
件（USP 4996143で開示されている）と、蛍光減衰カー
ブの変化を測定することによりエネルギー移動を検出す
るときに使用する検出用プローブに求められる条件（本
発明）は大きく異なる。
蛍光スペクトルの変化量（ドナーの蛍光強度の減少量
およびアクセプター蛍光強度の増大量）はエネルギー移
動効率が大きいほど大きくなる。エネルギー移動効率
は、ドナーとアクセプター間の距離の６乗に反比例する
ため、蛍光スペクトル変化によりエネルギー移動を精度
よく検出するためには、実試料において、ドナー−アク
セプター間の距離を可能なかぎり近づけることが望まし
い。USP 4996143では、核酸のハイブリッド体において
実質的にエネルギー移動の検出が可能となるドナー色素
−アクセプター色素間の距離（塩基数）は「２−７塩
基」であり、さらに塩基間数が少ないほどよいとしてい
る。一方、アクセプターの蛍光減衰カーブの遅れを測定
することによりエネルギー移動を検出するときには、エ
ネルギー移動効率は中程度（50％程度）が最も望ましい
ことがわかった。エネルギー移動効率が高くなるほど、
アクセプターの蛍光量はより増大するが、蛍光減衰の遅
れはより小さくなる。蛍光量の増大は減衰カーブの変化
の検出を容易にするが、一方、減衰の遅れが小さくなる
ことは変化の検出を困難にする。この相反する２つの要
素から、被検体の検出のためには、エネルギー移動効率
が高すぎても低すぎても不適となる。すなわち、被検体
の検出のためには、ハイブリッド体を形成したときのド
ナー色素とアクセプター色素間の距離は、エネルギー移
動効率が中程度となる距離（塩基間数）が最も望ましい
こととなる（後述、図２）。例えば、蛍光色素としてBo
dipy 493/503（ドナー）とCy5（アクセプター）の組み
合わせを使用したときには、この距離は、ハイブリッド
体における塩基間数として「10−12塩基」となる（ハイ
ブリッド体において、色素が結合している２つのヌクレ
オチド間が２本鎖構造をとるとき。後述）。
およびアクセプター蛍光強度の増大量）はエネルギー移
動効率が大きいほど大きくなる。エネルギー移動効率
は、ドナーとアクセプター間の距離の６乗に反比例する
ため、蛍光スペクトル変化によりエネルギー移動を精度
よく検出するためには、実試料において、ドナー−アク
セプター間の距離を可能なかぎり近づけることが望まし
い。USP 4996143では、核酸のハイブリッド体において
実質的にエネルギー移動の検出が可能となるドナー色素
−アクセプター色素間の距離（塩基数）は「２−７塩
基」であり、さらに塩基間数が少ないほどよいとしてい
る。一方、アクセプターの蛍光減衰カーブの遅れを測定
することによりエネルギー移動を検出するときには、エ
ネルギー移動効率は中程度（50％程度）が最も望ましい
ことがわかった。エネルギー移動効率が高くなるほど、
アクセプターの蛍光量はより増大するが、蛍光減衰の遅
れはより小さくなる。蛍光量の増大は減衰カーブの変化
の検出を容易にするが、一方、減衰の遅れが小さくなる
ことは変化の検出を困難にする。この相反する２つの要
素から、被検体の検出のためには、エネルギー移動効率
が高すぎても低すぎても不適となる。すなわち、被検体
の検出のためには、ハイブリッド体を形成したときのド
ナー色素とアクセプター色素間の距離は、エネルギー移
動効率が中程度となる距離（塩基間数）が最も望ましい
こととなる（後述、図２）。例えば、蛍光色素としてBo
dipy 493/503（ドナー）とCy5（アクセプター）の組み
合わせを使用したときには、この距離は、ハイブリッド
体における塩基間数として「10−12塩基」となる（ハイ
ブリッド体において、色素が結合している２つのヌクレ
オチド間が２本鎖構造をとるとき。後述）。
また、実試料においては、ドナー色素とアクセプター
色素間の距離が固定されていることは少なく、時間とと
もに揺らいでいることが多い。このようなドナー色素−
アクセプター色素間の距離の揺らぎは、色素分子の運動
などによりもたらされるものであり、その揺らぎの大き
さや速さは、ハイブリッド体の構造により大きく異な
る。蛍光スペクトルの変化量は、ドナーとアクセプター
間の平均距離（平均エネルギー移動効率）により決定さ
れるため、これまでに検出用プローブの性質が検討され
たときには、形成されるハイブリッド体における色素間
の距離の揺らぎの大きさを考慮に入れる必要性は低かっ
た。一方、蛍光減衰カーブは、一般に、２つの色素間の
距離の揺らぎや分布に依存する。実際、ハイブリッド体
を形成した検出用プローブの蛍光色素分子の蛍光減衰カ
ーブは、ハイブリッド体の構造により規定される色素分
子の運動の範囲に大きく依存することがわかった。その
結果、ハイブリッド体において蛍光色素が結合している
２つのヌクレオチド間がすべて２本鎖構造をとるように
検出用プローブを設計すること、そのとき、一方の蛍光
色素の標識位置はオリゴヌクレオチドの末端とすること
が、被検体の検出のためには最も望ましいことが明らか
となった。
色素間の距離が固定されていることは少なく、時間とと
もに揺らいでいることが多い。このようなドナー色素−
アクセプター色素間の距離の揺らぎは、色素分子の運動
などによりもたらされるものであり、その揺らぎの大き
さや速さは、ハイブリッド体の構造により大きく異な
る。蛍光スペクトルの変化量は、ドナーとアクセプター
間の平均距離（平均エネルギー移動効率）により決定さ
れるため、これまでに検出用プローブの性質が検討され
たときには、形成されるハイブリッド体における色素間
の距離の揺らぎの大きさを考慮に入れる必要性は低かっ
た。一方、蛍光減衰カーブは、一般に、２つの色素間の
距離の揺らぎや分布に依存する。実際、ハイブリッド体
を形成した検出用プローブの蛍光色素分子の蛍光減衰カ
ーブは、ハイブリッド体の構造により規定される色素分
子の運動の範囲に大きく依存することがわかった。その
結果、ハイブリッド体において蛍光色素が結合している
２つのヌクレオチド間がすべて２本鎖構造をとるように
検出用プローブを設計すること、そのとき、一方の蛍光
色素の標識位置はオリゴヌクレオチドの末端とすること
が、被検体の検出のためには最も望ましいことが明らか
となった。
本発明は、検出用プローブが被検体において大過剰で
ある条件において被検体を精度よく検出することを可能
とするために、エネルギー移動の時間分解測定法（蛍光
減衰カーブの変化を測定する方法）による被検体の検出
に適した検出用プローブを見い出したものである。
ある条件において被検体を精度よく検出することを可能
とするために、エネルギー移動の時間分解測定法（蛍光
減衰カーブの変化を測定する方法）による被検体の検出
に適した検出用プローブを見い出したものである。
すなわち、本発明は、特定のポリヌクレオチド塩基配
列を有する被検体を検出するための１組の検出用プロー
ブであって、 第１の蛍光色素分子が結合し、前記ポリヌクレオチド塩
基配列の一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配
列を有するドナープローブと、 第２の蛍光色素分子が結合し、前記ポリヌクレオチド塩
基配列の一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配
列を有するアクセプタープローブとからなり、 前記第１の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと前記
第２の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の塩基数
が４〜20であり、 前記ドナープローブの蛍光寿命が前記アクセプタープロ
ーブの蛍光寿命の７倍以上であり、 前記ドナープローブの蛍光スペクトルの極大波長と前記
アクセプタープローブの蛍光スペクトルの極大波長との
差が150nm以上であり、 前記ドナープローブと前記アクセプタープローブに基づ
く蛍光の減衰カーブが、前記ドナープローブと前記アク
セプタープローブと前記被検体とのハイブリッド体を形
成する際に有意に変化する検出用プローブを提供するも
のである。
列を有する被検体を検出するための１組の検出用プロー
ブであって、 第１の蛍光色素分子が結合し、前記ポリヌクレオチド塩
基配列の一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配
列を有するドナープローブと、 第２の蛍光色素分子が結合し、前記ポリヌクレオチド塩
基配列の一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配
列を有するアクセプタープローブとからなり、 前記第１の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと前記
第２の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の塩基数
が４〜20であり、 前記ドナープローブの蛍光寿命が前記アクセプタープロ
ーブの蛍光寿命の７倍以上であり、 前記ドナープローブの蛍光スペクトルの極大波長と前記
アクセプタープローブの蛍光スペクトルの極大波長との
差が150nm以上であり、 前記ドナープローブと前記アクセプタープローブに基づ
く蛍光の減衰カーブが、前記ドナープローブと前記アク
セプタープローブと前記被検体とのハイブリッド体を形
成する際に有意に変化する検出用プローブを提供するも
のである。
ここで、前記第１の蛍光色素分子が4,4−ジフルオロ
−４−ボロ−3a、4a−ジアザ−ｓ−インダセン系蛍光団
またはフルオロセイン系蛍光団のいずれかであり、か
つ、前記第２の蛍光色素分子がインドシアニン系蛍光団
またはローダミン系蛍光団のいずれかであることが好ま
しい。
−４−ボロ−3a、4a−ジアザ−ｓ−インダセン系蛍光団
またはフルオロセイン系蛍光団のいずれかであり、か
つ、前記第２の蛍光色素分子がインドシアニン系蛍光団
またはローダミン系蛍光団のいずれかであることが好ま
しい。
また、本発明は、特定のポリヌクレオチド塩基配列を
有する被検体を検出するための１組の検出用プローブで
あって、 4,4−ジフルオロ−４−ボロ−3a、4a−ジアザ−ｓ−イ
ンダセン系蛍光団またはフルオロセイン系蛍光団のいず
れかである第１の蛍光色素分子が結合し、前記のポリヌ
クレオチド塩基配列の一部にハイブリダイズすることが
可能な塩基配列を有するドナープローブと、インドシア
ニン系蛍光団またはローダミン系蛍光団のいずれかであ
る第２の蛍光色素分子が結合し、前記ポリヌクレオチド
塩基配列の一部にハイブリダイズすることが可能な塩基
配列を有するアクセプタープローブとからなり、 前記第１の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと前記
第２の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の塩基数
が４〜20であり、 前記ドナープローブと前記アクセプタープローブに基づ
く蛍光の減衰カーブが、前記ドナープローブと前記アク
セプタープローブと前記被検体とのハイブリッド体を形
成する際に有意に変化する検出用プローブを提供する。
有する被検体を検出するための１組の検出用プローブで
あって、 4,4−ジフルオロ−４−ボロ−3a、4a−ジアザ−ｓ−イ
ンダセン系蛍光団またはフルオロセイン系蛍光団のいず
れかである第１の蛍光色素分子が結合し、前記のポリヌ
クレオチド塩基配列の一部にハイブリダイズすることが
可能な塩基配列を有するドナープローブと、インドシア
ニン系蛍光団またはローダミン系蛍光団のいずれかであ
る第２の蛍光色素分子が結合し、前記ポリヌクレオチド
塩基配列の一部にハイブリダイズすることが可能な塩基
配列を有するアクセプタープローブとからなり、 前記第１の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと前記
第２の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の塩基数
が４〜20であり、 前記ドナープローブと前記アクセプタープローブに基づ
く蛍光の減衰カーブが、前記ドナープローブと前記アク
セプタープローブと前記被検体とのハイブリッド体を形
成する際に有意に変化する検出用プローブを提供する。
ここで、前記第１の蛍光色素分子が4,4−ジフルオロ
−４−ボロ−3a、4a−ジアザ−ｓ−インダセン系蛍光団
であり、かつ、前記第２の蛍光色素分子がインドシアニ
ン系蛍光団であることが好ましい。
−４−ボロ−3a、4a−ジアザ−ｓ−インダセン系蛍光団
であり、かつ、前記第２の蛍光色素分子がインドシアニ
ン系蛍光団であることが好ましい。
また、前記第１の蛍光色素分子がBodipy493/503であ
り、かつ、前記第２の蛍光色素分子がCy5であることが
好ましい。
り、かつ、前記第２の蛍光色素分子がCy5であることが
好ましい。
また、前記第１の蛍光色素分子がBodipy−TMRであ
り、かつ、前記第２の蛍光色素分子がCy5.5であること
が好ましい。
り、かつ、前記第２の蛍光色素分子がCy5.5であること
が好ましい。
また、前記第１の蛍光色素分子がBodipy−TRであり、
かつ、前記第２の蛍光色素分子がCy7であることが好ま
しい。
かつ、前記第２の蛍光色素分子がCy7であることが好ま
しい。
また、前記ハイブリッド体において、前記ドナープロ
ーブの前記第１の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド
と、前記アクセプタープローブの前記第２の蛍光色素分
子が結合するヌクレオチド間が２本鎖構造であることが
好ましい。
ーブの前記第１の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド
と、前記アクセプタープローブの前記第２の蛍光色素分
子が結合するヌクレオチド間が２本鎖構造であることが
好ましい。
さらに、前記１組の検出用プローブと被検体から形成
されるハイブリッド体において、ドナープローブとアク
セプタープローブが被検体にハイブリダイズして、前記
第１の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと前記第２
の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の一部が２本
鎖構造をとることが好ましい。
されるハイブリッド体において、ドナープローブとアク
セプタープローブが被検体にハイブリダイズして、前記
第１の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと前記第２
の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の一部が２本
鎖構造をとることが好ましい。
また、前記ハイブリッド体において、前記第１の蛍光
色素分子が結合するヌクレオチドと前記第２の蛍光色素
分子が結合するヌクレオチド間の塩基数が８〜16である
ことが好ましい。
色素分子が結合するヌクレオチドと前記第２の蛍光色素
分子が結合するヌクレオチド間の塩基数が８〜16である
ことが好ましい。
また、本発明は、特定のポリヌクレオチド塩基配列を
有する被検体を検出する方法であって、 （１）第１の蛍光色素分子が結合し、前記のポリヌクレ
オチド塩基配列の一部にハイブリダイズすることが可能
な塩基配列を有するドナープローブと、第２の蛍光色素
分子が結合し、前記ポリヌクレオチド塩基配列の一部に
ハイブリダイズすることが可能な塩基配列を有するアク
セプタープローブとからなり、 前記第１の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと前記
第２の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の塩基数
が４〜20であり、 前記ドナープローブの蛍光寿命が前記アクセプタープロ
ーブの蛍光寿命の７倍以上であり、 前記ドナープローブの蛍光スペクトルの極大波長と前記
アクセプタープローブの蛍光スペクトルの極大波長との
差が150nm以上であることを特徴とする１組の検出用プ
ローブと、前記被検体からハイブリッド体を形成する第
１のステップと、 （２）前記ハイブリッド体の前記第２の蛍光色素に基づ
く蛍光波長域の蛍光強度の減衰カーブを測定する第２の
ステップと、 （３）前記１組の検出用プローブの前記第２の蛍光色素
に基づく蛍光波長域の蛍光強度の減衰カーブを測定する
第３のステップと、 （４）前記第２および第３のステップで得られる蛍光減
衰カーブの比較により前記ポリヌクレオチド塩基配列の
存在を検出する第４のステップと、 からなる方法を提供する。
有する被検体を検出する方法であって、 （１）第１の蛍光色素分子が結合し、前記のポリヌクレ
オチド塩基配列の一部にハイブリダイズすることが可能
な塩基配列を有するドナープローブと、第２の蛍光色素
分子が結合し、前記ポリヌクレオチド塩基配列の一部に
ハイブリダイズすることが可能な塩基配列を有するアク
セプタープローブとからなり、 前記第１の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと前記
第２の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の塩基数
が４〜20であり、 前記ドナープローブの蛍光寿命が前記アクセプタープロ
ーブの蛍光寿命の７倍以上であり、 前記ドナープローブの蛍光スペクトルの極大波長と前記
アクセプタープローブの蛍光スペクトルの極大波長との
差が150nm以上であることを特徴とする１組の検出用プ
ローブと、前記被検体からハイブリッド体を形成する第
１のステップと、 （２）前記ハイブリッド体の前記第２の蛍光色素に基づ
く蛍光波長域の蛍光強度の減衰カーブを測定する第２の
ステップと、 （３）前記１組の検出用プローブの前記第２の蛍光色素
に基づく蛍光波長域の蛍光強度の減衰カーブを測定する
第３のステップと、 （４）前記第２および第３のステップで得られる蛍光減
衰カーブの比較により前記ポリヌクレオチド塩基配列の
存在を検出する第４のステップと、 からなる方法を提供する。
ここで、前記第１の蛍光色素分子が4,4−ジフルオロ
−４−ボロ−3a、4a−ジアザ−ｓ−インダセン系蛍光団
またはフルオロセイン系蛍光団のいずれかであり、か
つ、前記第２の蛍光分子がインドシアニン系蛍光団また
はローダミン系蛍光団であることが好ましい。
−４−ボロ−3a、4a−ジアザ−ｓ−インダセン系蛍光団
またはフルオロセイン系蛍光団のいずれかであり、か
つ、前記第２の蛍光分子がインドシアニン系蛍光団また
はローダミン系蛍光団であることが好ましい。
また、本発明は、特定のポリヌクレオチド塩基配列を
有する被検体を検出する方法であって、 （１）4,4−ジフルオロ−４−ボロ−3a、4a−ジアザ−
ｓ−インダセン系蛍光団またはフルオロセイン系蛍光団
のいずれかである第１の蛍光色素分子が結合し、前記の
ポリヌクレオチド塩基配列の一部にハイブリダイズする
ことが可能な塩基配列を有するドナープローブと、イン
ドシアニン系蛍光団またはローダミン系蛍光団のいずれ
かである第２の蛍光色素分子が結合し、前記ポリヌクレ
オチド塩基配列の一部にハイブリダイズすることが可能
な塩基配列を有するアクセプタープローブとからなり、
且つ、前記第１の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド
と前記第２の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の
塩基数が４〜20である１組の検出用プローブと、前記被
検体からハイブリッド体を形成する第１のステップと、 （２）前記ハイブリッド体の前記第２の蛍光色素に基づ
く蛍光波長域の蛍光強度の減衰カーブを測定する第２の
ステップと、 （３）前記１組の検出用プローブの前記第２の蛍光色素
に基づく蛍光波長域の蛍光強度の減衰カーブを測定する
第３のステップと、 （４）前記第２および第３のステップで得られる蛍光減
衰カーブの比較により前記ポリヌクレオチド塩基配列の
存在を検出する第４のステップとからなる方法を提供す
る。
有する被検体を検出する方法であって、 （１）4,4−ジフルオロ−４−ボロ−3a、4a−ジアザ−
ｓ−インダセン系蛍光団またはフルオロセイン系蛍光団
のいずれかである第１の蛍光色素分子が結合し、前記の
ポリヌクレオチド塩基配列の一部にハイブリダイズする
ことが可能な塩基配列を有するドナープローブと、イン
ドシアニン系蛍光団またはローダミン系蛍光団のいずれ
かである第２の蛍光色素分子が結合し、前記ポリヌクレ
オチド塩基配列の一部にハイブリダイズすることが可能
な塩基配列を有するアクセプタープローブとからなり、
且つ、前記第１の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド
と前記第２の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の
塩基数が４〜20である１組の検出用プローブと、前記被
検体からハイブリッド体を形成する第１のステップと、 （２）前記ハイブリッド体の前記第２の蛍光色素に基づ
く蛍光波長域の蛍光強度の減衰カーブを測定する第２の
ステップと、 （３）前記１組の検出用プローブの前記第２の蛍光色素
に基づく蛍光波長域の蛍光強度の減衰カーブを測定する
第３のステップと、 （４）前記第２および第３のステップで得られる蛍光減
衰カーブの比較により前記ポリヌクレオチド塩基配列の
存在を検出する第４のステップとからなる方法を提供す
る。
ここで、前記第１の蛍光色素分子が4,4−ジフルオロ
−４−ボロ−3a、4a−ジアザ−ｓ−インダセン系蛍光団
であり、かつ、前記第２の蛍光色素分子がインドシアニ
ン系蛍光団であることが好ましい。
−４−ボロ−3a、4a−ジアザ−ｓ−インダセン系蛍光団
であり、かつ、前記第２の蛍光色素分子がインドシアニ
ン系蛍光団であることが好ましい。
さらに、前記第１の蛍光色素分子がBodipy493/503で
あり、かつ、前記第２の蛍光色素分子がCy5であること
が好ましい。
あり、かつ、前記第２の蛍光色素分子がCy5であること
が好ましい。
また、前記第１の蛍光色素分子がBodipy−TMRであ
り、かつ、前記第２の蛍光色素分子がCy5.5であること
が好ましい。
り、かつ、前記第２の蛍光色素分子がCy5.5であること
が好ましい。
また、前記第１の蛍光色素分子がBodipy−TRであり、
かつ、前記第２の蛍光色素分子がCy7であることが好ま
しい。
かつ、前記第２の蛍光色素分子がCy7であることが好ま
しい。
また、前記ハイブリッド体において、前記ドナープロ
ーブの前記第１の蛍光分子が結合するヌクレオチドと、
前記アクセプタープローブの前記第２の蛍光分子が結合
するヌクレオチド間が２本鎖構造であることが好まし
い。
ーブの前記第１の蛍光分子が結合するヌクレオチドと、
前記アクセプタープローブの前記第２の蛍光分子が結合
するヌクレオチド間が２本鎖構造であることが好まし
い。
さらに、前記１組の検出用プローブと被検体から形成
されるハイブリッド体において、ドナープローブとアク
セプタープローブが被検体にハイブリダイズして、前記
第１の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと前記第２
の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の一部が２本
鎖構造をとることが好ましい。
されるハイブリッド体において、ドナープローブとアク
セプタープローブが被検体にハイブリダイズして、前記
第１の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと前記第２
の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の一部が２本
鎖構造をとることが好ましい。
また、前記ハイブリッド体において、前記第１の蛍光
色素分子が結合するヌクレオチドと前記第２の蛍光色素
分子が結合するヌクレオチド間の塩基数が８〜16である
ことが好ましい。
色素分子が結合するヌクレオチドと前記第２の蛍光色素
分子が結合するヌクレオチド間の塩基数が８〜16である
ことが好ましい。
図面の簡単な説明 図1Aは、本発明に係わる検出用プローブのいくつかの
形態の１例を示すものであり、ハイブリッド体におい
て、蛍光色素分子が結合している２つのヌクレオチド間
が２本鎖構造をとり、また、蛍光色素分子の一方は他の
プローブとの隣接部に面する末端部に標識（結合）され
ているものを示す。図で、ドナー色素とアクセプター色
素の位置は相互に交換可能である。
形態の１例を示すものであり、ハイブリッド体におい
て、蛍光色素分子が結合している２つのヌクレオチド間
が２本鎖構造をとり、また、蛍光色素分子の一方は他の
プローブとの隣接部に面する末端部に標識（結合）され
ているものを示す。図で、ドナー色素とアクセプター色
素の位置は相互に交換可能である。
図1Bは、本発明に係わる検出用プローブのいくつかの
形態の１例を示すものであり、ハイブリッド体におい
て、蛍光色素分子が結合している２つのヌクレオチド間
が２本鎖構造をとり、また、蛍光色素分子は両者ともに
各プローブの中間部に標識（結合）されているものを示
す。図で、ドナー色素とアクセプター色素の位置は相互
に交換可能である。
形態の１例を示すものであり、ハイブリッド体におい
て、蛍光色素分子が結合している２つのヌクレオチド間
が２本鎖構造をとり、また、蛍光色素分子は両者ともに
各プローブの中間部に標識（結合）されているものを示
す。図で、ドナー色素とアクセプター色素の位置は相互
に交換可能である。
図1Cは、本発明に係わる検出用プローブのいくつかの
形態の１例を示すものであり、ハイブリッド体におい
て、蛍光色素分子が結合している２つのヌクレオチド間
が部分的に２本鎖構造であり、また、蛍光色素分子の一
方は他のプローブとの隣接部位に面する末端部に標識さ
れており、他方の蛍光色素分子は当該プローブの中間部
に標識されているものを示す。図で、ドナー色素とアク
セプター色素の位置は相互に交換可能である。
形態の１例を示すものであり、ハイブリッド体におい
て、蛍光色素分子が結合している２つのヌクレオチド間
が部分的に２本鎖構造であり、また、蛍光色素分子の一
方は他のプローブとの隣接部位に面する末端部に標識さ
れており、他方の蛍光色素分子は当該プローブの中間部
に標識されているものを示す。図で、ドナー色素とアク
セプター色素の位置は相互に交換可能である。
図1Dは、本発明に係わる検出用プローブのいくつかの
形態の１例を示すものであり、ハイブリッド体におい
て、蛍光色素分子が結合している２つのヌクレオチド間
が部分的に２本鎖構造であり、また、蛍光色素分子は両
者ともに各プローブの中間部に標識されているものを示
す。図で、ドナー色素とアクセプター色素の位置は相互
に交換可能である。
形態の１例を示すものであり、ハイブリッド体におい
て、蛍光色素分子が結合している２つのヌクレオチド間
が部分的に２本鎖構造であり、また、蛍光色素分子は両
者ともに各プローブの中間部に標識されているものを示
す。図で、ドナー色素とアクセプター色素の位置は相互
に交換可能である。
図1Eは、本発明に係わる検出用プローブのいくつかの
形態の１例を示すものであり、ハイブリッド体におい
て、蛍光色素分子が結合している２つのヌクレオチド間
が１本鎖構造であり、また、蛍光色素分子は両者ともに
他のプローブとの隣接部に面する末端部に標識されてい
るものを示す。図で、ドナー色素とアクセプター色素の
位置は相互に交換可能である。
形態の１例を示すものであり、ハイブリッド体におい
て、蛍光色素分子が結合している２つのヌクレオチド間
が１本鎖構造であり、また、蛍光色素分子は両者ともに
他のプローブとの隣接部に面する末端部に標識されてい
るものを示す。図で、ドナー色素とアクセプター色素の
位置は相互に交換可能である。
図1Fは、本発明に係わる検出用プローブのいくつかの
形態の１例を示すものであり、ハイブリッド体におい
て、蛍光色素分子が結合している２つのヌクレオチド間
が二本鎖構造となるように、第３のプローブ（蛍光非標
識）を導入するものを示す。図で、ドナー色素とアクセ
プター色素の位置は相互に交換可能である。図２は、本
発明に係わる種々の検出用プローブの、被検体（ターゲ
ットDNA）の検出の精度の比較を示した図である。検出
用プローブとして、（１）蛍光色素分子の組み合わせの
種類、（２）ハイブリッド体における蛍光色素分子が結
合している２つのヌクレオチド間を一本鎖にしたときお
よび二本鎖にしたとき、（３）ハイブリッド体における
蛍光色素分子が結合している２つのヌクレオチド間の塩
基数（図の横軸）、を変えた。これらの検出用プローブ
を使用して、被検体とのハイブリッド体形成によるアク
セプター波長域の蛍光減衰カーブの変化を測定した。図
の縦軸（Δτ／σΔτ）は、被検体が存在しているとき
の蛍光減衰カーブと被検体が存在していないときの蛍光
減衰カーブとの識別のS/Nを相対的にあらわしたパラメ
ータである。
形態の１例を示すものであり、ハイブリッド体におい
て、蛍光色素分子が結合している２つのヌクレオチド間
が二本鎖構造となるように、第３のプローブ（蛍光非標
識）を導入するものを示す。図で、ドナー色素とアクセ
プター色素の位置は相互に交換可能である。図２は、本
発明に係わる種々の検出用プローブの、被検体（ターゲ
ットDNA）の検出の精度の比較を示した図である。検出
用プローブとして、（１）蛍光色素分子の組み合わせの
種類、（２）ハイブリッド体における蛍光色素分子が結
合している２つのヌクレオチド間を一本鎖にしたときお
よび二本鎖にしたとき、（３）ハイブリッド体における
蛍光色素分子が結合している２つのヌクレオチド間の塩
基数（図の横軸）、を変えた。これらの検出用プローブ
を使用して、被検体とのハイブリッド体形成によるアク
セプター波長域の蛍光減衰カーブの変化を測定した。図
の縦軸（Δτ／σΔτ）は、被検体が存在しているとき
の蛍光減衰カーブと被検体が存在していないときの蛍光
減衰カーブとの識別のS/Nを相対的にあらわしたパラメ
ータである。
図３は、本発明に係わる検出用プローブおよび検出方
法を使用して、被検体の存在を検出する概念図である。
法を使用して、被検体の存在を検出する概念図である。
図４は、一組の検出用プローブ（蛍光色素分子で標識
されたオリゴDNA）と被検体であるターゲットDNAとを、
プローブが過剰になるような種々の比率で混合したとき
のアクセプター波長域の蛍光減衰カーブをあらわしたも
のである。検出用プローブは、ドナー蛍光色素はBodipy
493/503、アクセプター蛍光色素はCy5、ハイブリッド体
形成時におけるドナー蛍光色素が結合しているヌクレオ
チドとアクセプター蛍光色素が結合しているヌクレオチ
ド間は12塩基離れ、その間は二本鎖になるものを使用し
ている。ターゲットDNAとプローブの比率は、０％、
１％、３％、５％、20％（ターゲットDNA/プロ
ーブ、モル比）である。
されたオリゴDNA）と被検体であるターゲットDNAとを、
プローブが過剰になるような種々の比率で混合したとき
のアクセプター波長域の蛍光減衰カーブをあらわしたも
のである。検出用プローブは、ドナー蛍光色素はBodipy
493/503、アクセプター蛍光色素はCy5、ハイブリッド体
形成時におけるドナー蛍光色素が結合しているヌクレオ
チドとアクセプター蛍光色素が結合しているヌクレオチ
ド間は12塩基離れ、その間は二本鎖になるものを使用し
ている。ターゲットDNAとプローブの比率は、０％、
１％、３％、５％、20％（ターゲットDNA/プロ
ーブ、モル比）である。
図５は、図４に示された試料（一組の検出用プローブ
と被検体であるターゲットDNAとを、プローブが過剰に
なるような種々の比率で混合したもの）における蛍光ス
ペクトルを示したものである。検出用プローブは、ドナ
ー蛍光色素はBodipy493/503、アクセプター蛍光色素はC
y5、ハイブリッド体形成時におけるドナー蛍光色素が結
合しているヌクレオチドとアクセプター蛍光色素が結合
しているヌクレオチド間は12塩基離れ、その間は二本鎖
になるものを使用している。ターゲットDNAとプローブ
の比率は、０％、１％、３％、５％、20％
（ターゲットDNA/プローブ、モル比）である。
と被検体であるターゲットDNAとを、プローブが過剰に
なるような種々の比率で混合したもの）における蛍光ス
ペクトルを示したものである。検出用プローブは、ドナ
ー蛍光色素はBodipy493/503、アクセプター蛍光色素はC
y5、ハイブリッド体形成時におけるドナー蛍光色素が結
合しているヌクレオチドとアクセプター蛍光色素が結合
しているヌクレオチド間は12塩基離れ、その間は二本鎖
になるものを使用している。ターゲットDNAとプローブ
の比率は、０％、１％、３％、５％、20％
（ターゲットDNA/プローブ、モル比）である。
図6Aは、本発明に係わる検出用プローブおよび同プロ
ーブを用いた検出方法の応用例の一例を示した概念図で
あり、核酸の一次構造の変化のなかで、DNAの特定部位
に他のDNA断片が組み込まれる変化を検出することに使
用可能であることを示すものである。
ーブを用いた検出方法の応用例の一例を示した概念図で
あり、核酸の一次構造の変化のなかで、DNAの特定部位
に他のDNA断片が組み込まれる変化を検出することに使
用可能であることを示すものである。
図6Bは、本発明に係わる検出用プローブおよび同プロ
ーブを用いた検出方法の応用例の一例を示した概念図で
あり、核酸の一次構造の変化のなかで、DNAの特定部位
に他のDNA断片が組み込まれる変化を検出することに使
用可能であることを示すものである。
ーブを用いた検出方法の応用例の一例を示した概念図で
あり、核酸の一次構造の変化のなかで、DNAの特定部位
に他のDNA断片が組み込まれる変化を検出することに使
用可能であることを示すものである。
図７は、本発明に係わる検出用プローブおよび同プロ
ーブを用いた検出方法の応用例の一例を示した概念図で
ある。核酸の一次構造の変化のなかで、DNAの特定部位
の方向が逆転する変化（逆位）を検出することに使用可
能であることを示す。
ーブを用いた検出方法の応用例の一例を示した概念図で
ある。核酸の一次構造の変化のなかで、DNAの特定部位
の方向が逆転する変化（逆位）を検出することに使用可
能であることを示す。
図８は、本発明に係わる検出用プローブおよび同プロ
ーブを用いた検出方法の応用例の一例を示した概念図で
ある。核酸の一次構造の変化のなかで、DNAの特定部位
が欠失する変化を検出することに使用可能であることを
示す。
ーブを用いた検出方法の応用例の一例を示した概念図で
ある。核酸の一次構造の変化のなかで、DNAの特定部位
が欠失する変化を検出することに使用可能であることを
示す。
図９は、検出用プローブとして以下の一組を使用した
ときの蛍光減衰カーブを示す。すなわち、ドナー蛍光色
素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素としてC
y5を使用し、かつBodipy493/503はドナープローブの
５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの中間
部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド体に
おける蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間は
二本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光色素
が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間数が４塩
基（ｎ＝４）になる検出用プローブを使用したときの蛍
光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルスをあらわ
す。
ときの蛍光減衰カーブを示す。すなわち、ドナー蛍光色
素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素としてC
y5を使用し、かつBodipy493/503はドナープローブの
５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの中間
部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド体に
おける蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間は
二本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光色素
が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間数が４塩
基（ｎ＝４）になる検出用プローブを使用したときの蛍
光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルスをあらわ
す。
図10は、検出用プローブとして以下の一組を使用した
ときの蛍光減衰カーブを示す。すなわち、ドナー蛍光色
素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素としてC
y5を使用し、かつBodipy493/503はドナープローブの
５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの中間
部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド体に
おける蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間は
二本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光色素
が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間数が８塩
基（ｎ＝８）になる検出用プローブを使用したときの蛍
光減衰カーブ（●）である。▲は励起パルスをあらわ
す。
ときの蛍光減衰カーブを示す。すなわち、ドナー蛍光色
素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素としてC
y5を使用し、かつBodipy493/503はドナープローブの
５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの中間
部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド体に
おける蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間は
二本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光色素
が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間数が８塩
基（ｎ＝８）になる検出用プローブを使用したときの蛍
光減衰カーブ（●）である。▲は励起パルスをあらわ
す。
図11は、検出用プローブとして以下の一組を使用した
ときの蛍光減衰カーブを示す。すなわち、ドナー蛍光色
素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素としてC
y5を使用し、かつBodipy493/503はドナープローブの
５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの中間
部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド体に
おける蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間は
二本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光色素
が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間数が10塩
基（ｎ＝10）になる検出用プローブを使用したときの蛍
光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルスをあらわ
す。
ときの蛍光減衰カーブを示す。すなわち、ドナー蛍光色
素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素としてC
y5を使用し、かつBodipy493/503はドナープローブの
５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの中間
部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド体に
おける蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間は
二本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光色素
が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間数が10塩
基（ｎ＝10）になる検出用プローブを使用したときの蛍
光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルスをあらわ
す。
図12は、検出用プローブとして以下の一組を使用した
ときの蛍光減衰カーブを示す。すなわち、ドナー蛍光色
素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素としてC
y5を使用し、かつBodipy493/503はドナープローブの
５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの中間
部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド体に
おける蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間は
二本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光色素
が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間数が12塩
基（ｎ＝12）になる検出用プローブを使用したときの蛍
光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルスをあらわ
す。
ときの蛍光減衰カーブを示す。すなわち、ドナー蛍光色
素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素としてC
y5を使用し、かつBodipy493/503はドナープローブの
５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの中間
部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド体に
おける蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間は
二本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光色素
が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間数が12塩
基（ｎ＝12）になる検出用プローブを使用したときの蛍
光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルスをあらわ
す。
図13は、検出用プローブとして以下の一組を使用した
ときの蛍光減衰カーブを示す。すなわち、ドナー蛍光色
素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素としてC
y5を使用し、かつBodipy493/503はドナープローブの
５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの中間
部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド体に
おける蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間は
二本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光色素
が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間数が14塩
基（ｎ＝14）になる検出用プローブを使用したときの蛍
光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルスをあらわ
す。
ときの蛍光減衰カーブを示す。すなわち、ドナー蛍光色
素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素としてC
y5を使用し、かつBodipy493/503はドナープローブの
５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの中間
部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド体に
おける蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間は
二本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光色素
が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間数が14塩
基（ｎ＝14）になる検出用プローブを使用したときの蛍
光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルスをあらわ
す。
図14は、図９−図13に対するコントロールの蛍光減衰
カーブ（●）であり、検出用プローブの蛍光減衰カーブ
を示す（被検体たるDNAは含まれていない）。▲は励起
光パルスをあらわす。
カーブ（●）であり、検出用プローブの蛍光減衰カーブ
を示す（被検体たるDNAは含まれていない）。▲は励起
光パルスをあらわす。
図15は、検出用プローブとして以下の一組を使用した
ときの蛍光減衰カーブ（●）を示す。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素
としてCy5を使用し、かつBodipy493/503はドナープロー
ブの５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの
中間部のヌクレオチドに標識した。ハイブリッド体にお
いて、蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間は
10塩基離れている（ｎ＝10）。ハイブリッド体におい
て、蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間が、
すべて二本鎖になる検出用プローブを使用したときの蛍
光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルスをあらわ
す。
ときの蛍光減衰カーブ（●）を示す。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素
としてCy5を使用し、かつBodipy493/503はドナープロー
ブの５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの
中間部のヌクレオチドに標識した。ハイブリッド体にお
いて、蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間は
10塩基離れている（ｎ＝10）。ハイブリッド体におい
て、蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間が、
すべて二本鎖になる検出用プローブを使用したときの蛍
光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルスをあらわ
す。
図16は、検出用プローブとして以下の一組を使用した
ときの蛍光減衰カーブ（●）を示す。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素
としてCy5を使用し、かつBodipy493/503はドナープロー
ブの５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの
中間部のヌクレオチドに標識した。ハイブリッド体にお
いて、蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間は
10塩基離れている（ｎ＝10）。ハイブリッド体におい
て、蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間が、
一本鎖となる部分が２塩基であり二本鎖となる部分が８
塩基になる検出用プローブを使用したときの蛍光減衰カ
ーブ（●）である。▲は励起光パルスをあらわす。
ときの蛍光減衰カーブ（●）を示す。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素
としてCy5を使用し、かつBodipy493/503はドナープロー
ブの５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの
中間部のヌクレオチドに標識した。ハイブリッド体にお
いて、蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間は
10塩基離れている（ｎ＝10）。ハイブリッド体におい
て、蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間が、
一本鎖となる部分が２塩基であり二本鎖となる部分が８
塩基になる検出用プローブを使用したときの蛍光減衰カ
ーブ（●）である。▲は励起光パルスをあらわす。
図17は、検出用プローブとして以下の一組を使用した
ときの蛍光減衰カーブ（●）を示す。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素
としてCy5を使用し、かつBodipy493/503はドナープロー
ブの５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの
中間部のヌクレオチドに標識した。ハイブリッド体にお
いて、蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間は
10塩基離れている（ｎ＝10）。ハイブリッド体におい
て、蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間が、
一本鎖となる部分が４塩基であり二本鎖となる部分が６
塩基になる検出用プローブを使用したときの蛍光減衰カ
ーブ（●）である。▲は励起光パルスをあらわす。
ときの蛍光減衰カーブ（●）を示す。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素
としてCy5を使用し、かつBodipy493/503はドナープロー
ブの５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの
中間部のヌクレオチドに標識した。ハイブリッド体にお
いて、蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間は
10塩基離れている（ｎ＝10）。ハイブリッド体におい
て、蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間が、
一本鎖となる部分が４塩基であり二本鎖となる部分が６
塩基になる検出用プローブを使用したときの蛍光減衰カ
ーブ（●）である。▲は励起光パルスをあらわす。
図18は、検出用プローブとして以下の一組を使用した
ときの蛍光減衰カーブ（●）を示す。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、ドナー蛍光色素としてC
y5を使用し、かつBodipy493/503はアクセプタープロー
ブの５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの
中間部のヌクレオチドに標識した。ハイブリッド体にお
いて、蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間は
10塩基離れている（ｎ＝10）。ハイブリッド体におい
て、蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間が、
一本鎖となる部分が６塩基であり二本鎖となる部分が４
塩基になる検出用プローブを使用したときの蛍光減衰カ
ーブ（●）である。▲は励起光パルスをあらわす。
ときの蛍光減衰カーブ（●）を示す。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、ドナー蛍光色素としてC
y5を使用し、かつBodipy493/503はアクセプタープロー
ブの５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの
中間部のヌクレオチドに標識した。ハイブリッド体にお
いて、蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間は
10塩基離れている（ｎ＝10）。ハイブリッド体におい
て、蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間が、
一本鎖となる部分が６塩基であり二本鎖となる部分が４
塩基になる検出用プローブを使用したときの蛍光減衰カ
ーブ（●）である。▲は励起光パルスをあらわす。
図19は、図15−図18に対するコントロールの蛍光減衰
カーブであり、検出用プローブの蛍光減衰カーブ（●）
をあらわす（被検体たるDNAは含まれていない）。▲は
励起光パルスをあらわす。
カーブであり、検出用プローブの蛍光減衰カーブ（●）
をあらわす（被検体たるDNAは含まれていない）。▲は
励起光パルスをあらわす。
図20は、検出用プローブとして以下の一組を使用した
ときの蛍光減衰カーブ（●）を示す。ドナー蛍光色素と
してBodipy493/503、アクセプター蛍光色素としてCy5を
使用した。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合し
ている２つのヌクレオチド間は10塩基離れており（ｎ＝
10）、その間は二本鎖を形成している。ドナープローブ
におけるBodipy493/503の標識位置を５′末端とした検
出用プローブ（ハイブリッド体において２つのプローブ
が隣接するヌクレオチドにBodipy493/503が結合してい
る）を使用したときの、蛍光減衰カーブ（●）である。
アクセプタープローブにおけるCy5の標識位置はｎ＝10
となる位置である（中間標識）。▲は励起光パルスをあ
らわす。
ときの蛍光減衰カーブ（●）を示す。ドナー蛍光色素と
してBodipy493/503、アクセプター蛍光色素としてCy5を
使用した。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合し
ている２つのヌクレオチド間は10塩基離れており（ｎ＝
10）、その間は二本鎖を形成している。ドナープローブ
におけるBodipy493/503の標識位置を５′末端とした検
出用プローブ（ハイブリッド体において２つのプローブ
が隣接するヌクレオチドにBodipy493/503が結合してい
る）を使用したときの、蛍光減衰カーブ（●）である。
アクセプタープローブにおけるCy5の標識位置はｎ＝10
となる位置である（中間標識）。▲は励起光パルスをあ
らわす。
図21は、検出用プローブとして以下の一組を使用した
ときの蛍光減衰カーブ（●）を示す。ドナー蛍光色素と
してBodipy493/503、アクセプター蛍光色素としてCy5を
使用した。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合し
ている２つのヌクレオチド間は10塩基離れており（ｎ＝
10）、その間は二本鎖を形成している。ドナープローブ
におけるBodipy493/503の標識位置を、ハイブリッド体
における２つのプローブの切れ目の位置（アクセプター
プローブと隣接する位置、ドナープローブの５′末端）
から内側に１塩基ずれた位置とした検出用プローブを使
用したときの、蛍光減衰カーブ（●）である。アクセプ
タープローブにおけるCy5の標識位置はｎ＝10となる位
置である（中間標識）。▲は励起光パルスをあらわす。
ときの蛍光減衰カーブ（●）を示す。ドナー蛍光色素と
してBodipy493/503、アクセプター蛍光色素としてCy5を
使用した。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合し
ている２つのヌクレオチド間は10塩基離れており（ｎ＝
10）、その間は二本鎖を形成している。ドナープローブ
におけるBodipy493/503の標識位置を、ハイブリッド体
における２つのプローブの切れ目の位置（アクセプター
プローブと隣接する位置、ドナープローブの５′末端）
から内側に１塩基ずれた位置とした検出用プローブを使
用したときの、蛍光減衰カーブ（●）である。アクセプ
タープローブにおけるCy5の標識位置はｎ＝10となる位
置である（中間標識）。▲は励起光パルスをあらわす。
図22は、検出用プローブとして以下の一組を使用した
ときの蛍光減衰カーブ（●）を示す。ドナー蛍光色素と
してBodipy493/503、アクセプター蛍光色素としてCy5を
使用した。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合し
ている２つのヌクレオチド間は10塩基離れており（ｎ＝
10）、その間は二本鎖を形成している。ドナープローブ
におけるBodipy493/503の標識位置を、ハイブリッド体
における２つのプローブの切れ目の位置（アクセプター
プローブと隣接する位置、ドナープローブの５′末端）
から内側に２塩基ずれた位置とした検出用プローブを使
用したときの、蛍光減衰カーブ（●）である。アクセプ
タープローブにおけるCy5の標識位置はｎ＝10となる位
置である（中間標識）。▲は励起光パルスをあらわす。
ときの蛍光減衰カーブ（●）を示す。ドナー蛍光色素と
してBodipy493/503、アクセプター蛍光色素としてCy5を
使用した。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合し
ている２つのヌクレオチド間は10塩基離れており（ｎ＝
10）、その間は二本鎖を形成している。ドナープローブ
におけるBodipy493/503の標識位置を、ハイブリッド体
における２つのプローブの切れ目の位置（アクセプター
プローブと隣接する位置、ドナープローブの５′末端）
から内側に２塩基ずれた位置とした検出用プローブを使
用したときの、蛍光減衰カーブ（●）である。アクセプ
タープローブにおけるCy5の標識位置はｎ＝10となる位
置である（中間標識）。▲は励起光パルスをあらわす。
図23は、検出用プローブとして以下の一組を使用した
ときの蛍光減衰カーブ（●）を示す。ドナー蛍光色素と
してBodipy493/503、アクセプター蛍光色素としてCy5を
使用した。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合し
ている２つのヌクレオチド間は10塩基離れており（ｎ＝
10）、その間は二本鎖を形成している。ドナープローブ
におけるBodipy493/503の標識位置を、ハイブリッド体
における２つのプローブの切れ目の位置（アクセプター
プローブと隣接する位置、ドナープローブの５′末端）
から内側に４塩基ずれた位置として検出用プローブを使
用したときの、蛍光減衰カーブ（●）である。アクセプ
タープローブにおけるCy5の標識位置はｎ＝10となる位
置である（中間標識）。▲は励起光パルスをあらわす。
ときの蛍光減衰カーブ（●）を示す。ドナー蛍光色素と
してBodipy493/503、アクセプター蛍光色素としてCy5を
使用した。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合し
ている２つのヌクレオチド間は10塩基離れており（ｎ＝
10）、その間は二本鎖を形成している。ドナープローブ
におけるBodipy493/503の標識位置を、ハイブリッド体
における２つのプローブの切れ目の位置（アクセプター
プローブと隣接する位置、ドナープローブの５′末端）
から内側に４塩基ずれた位置として検出用プローブを使
用したときの、蛍光減衰カーブ（●）である。アクセプ
タープローブにおけるCy5の標識位置はｎ＝10となる位
置である（中間標識）。▲は励起光パルスをあらわす。
図24は、図20−図23に対するコントロールの蛍光減衰
カーブであり、検出用プローブの蛍光減衰カーブ（●）
をあらわす（被検体たるDNAは含まれていない）。▲は
励起光パルスをあらわす。
カーブであり、検出用プローブの蛍光減衰カーブ（●）
をあらわす（被検体たるDNAは含まれていない）。▲は
励起光パルスをあらわす。
図25は、検出用プローブとして以下の一組を使用した
ときの蛍光減衰カーブ（●）である。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素
としてCy5を使用し、かつBodipy493/503はドナープロー
ブの５′末端に標識し、Cy3.5はアクセプタープローブ
の中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッ
ド体における蛍光色素が結合している２つのヌクレオチ
ド間は二本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍
光色素が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間数
が８塩基（ｎ＝８）になる検出用プローブを使用したと
きの蛍光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルスを
あらわす。
ときの蛍光減衰カーブ（●）である。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素
としてCy5を使用し、かつBodipy493/503はドナープロー
ブの５′末端に標識し、Cy3.5はアクセプタープローブ
の中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッ
ド体における蛍光色素が結合している２つのヌクレオチ
ド間は二本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍
光色素が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間数
が８塩基（ｎ＝８）になる検出用プローブを使用したと
きの蛍光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルスを
あらわす。
図26は、検出用プローブとして以下の一組を使用した
ときの蛍光減衰カーブ（●）である。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素
としてCy3.5を使用し、かつBodipy493/503はドナープロ
ーブの５′末端に標識し、Cy3.5はアクセプタープロー
ブの中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリ
ッド体における蛍光色素が結合している２つのヌクレオ
チド間は二本鎖を形成する。ハイブリッド体において、
蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間
数が12塩基（ｎ＝12）になる検出用プローブを使用した
ときの蛍光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルス
をあらわす。
ときの蛍光減衰カーブ（●）である。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素
としてCy3.5を使用し、かつBodipy493/503はドナープロ
ーブの５′末端に標識し、Cy3.5はアクセプタープロー
ブの中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリ
ッド体における蛍光色素が結合している２つのヌクレオ
チド間は二本鎖を形成する。ハイブリッド体において、
蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間
数が12塩基（ｎ＝12）になる検出用プローブを使用した
ときの蛍光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルス
をあらわす。
図27は、検出用プローブとして以下の一組を使用した
ときの蛍光減衰カーブ（●）である。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素
としてCy3.5を使用し、かつBodipy493/503はドナープロ
ーブの５′末端に標識し、Cy3.5はアクセプタープロー
ブの中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリ
ッド体における蛍光色素が結合している２つのヌクレオ
チド間は二本鎖を形成する。ハイブリッド体において、
蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間
数が16塩基（ｎ＝16）になる検出用プローブを使用した
ときの蛍光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルス
をあらわす。
ときの蛍光減衰カーブ（●）である。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素
としてCy3.5を使用し、かつBodipy493/503はドナープロ
ーブの５′末端に標識し、Cy3.5はアクセプタープロー
ブの中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリ
ッド体における蛍光色素が結合している２つのヌクレオ
チド間は二本鎖を形成する。ハイブリッド体において、
蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間
数が16塩基（ｎ＝16）になる検出用プローブを使用した
ときの蛍光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルス
をあらわす。
図28は、図25−図27に対するコントロールの蛍光減衰
カーブであり、検出用プローブの蛍光減衰カーブ（●）
をあらわす（被検体たるDNAは含まれていない）。▲は
励起光パルスをあわらす。
カーブであり、検出用プローブの蛍光減衰カーブ（●）
をあらわす（被検体たるDNAは含まれていない）。▲は
励起光パルスをあわらす。
図29は、検出用プローブとして以下の一組を使用した
ときの蛍光減衰カーブ（●）である。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素
としてCy5を使用し、かつBodipy493/503はドナープロー
ブの５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの
中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド
体における蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド
間は一本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光
色素が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間数が
４塩基（ｎ＝４）になる検出用プローブを使用したとき
の蛍光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルスをあ
らわす。
ときの蛍光減衰カーブ（●）である。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素
としてCy5を使用し、かつBodipy493/503はドナープロー
ブの５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの
中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド
体における蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド
間は一本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光
色素が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間数が
４塩基（ｎ＝４）になる検出用プローブを使用したとき
の蛍光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルスをあ
らわす。
図30は、検出用プローブとして以下の一組を使用した
ときの蛍光減衰カーブ（●）である。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素
としてCy5を使用し、かつBodipy493/503はドナープロー
ブの５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの
中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド
体における蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド
間は一本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光
色素が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間数が
８塩基（ｎ＝８）になる検出用プローブを使用したとき
の蛍光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルスをあ
らわす。
ときの蛍光減衰カーブ（●）である。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素
としてCy5を使用し、かつBodipy493/503はドナープロー
ブの５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの
中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド
体における蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド
間は一本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光
色素が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間数が
８塩基（ｎ＝８）になる検出用プローブを使用したとき
の蛍光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルスをあ
らわす。
図31は、検出用プローブとして以下の一組を使用した
ときの蛍光減衰カーブ（●）である。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素
としてCy5を使用し、かつBodipy493/503はドナープロー
ブの５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの
中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド
体における蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド
間は一本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光
色素が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間数が
10塩基（ｎ＝10）になる検出用プローブを使用したとき
の蛍光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルスをあ
らわす。
ときの蛍光減衰カーブ（●）である。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素
としてCy5を使用し、かつBodipy493/503はドナープロー
ブの５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの
中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド
体における蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド
間は一本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光
色素が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間数が
10塩基（ｎ＝10）になる検出用プローブを使用したとき
の蛍光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルスをあ
らわす。
図32は、検出用プローブとして以下の一組を使用した
ときの蛍光減衰カーブ（●）である。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素
としてCy5を使用し、かつBodipy493/503はドナープロー
ブの５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの
中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド
体における蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド
間は一本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光
色素が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間数が
12塩基（ｎ＝12）になる検出用プローブを使用したとき
の蛍光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルスをあ
らわす。
ときの蛍光減衰カーブ（●）である。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素
としてCy5を使用し、かつBodipy493/503はドナープロー
ブの５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの
中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド
体における蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド
間は一本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光
色素が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間数が
12塩基（ｎ＝12）になる検出用プローブを使用したとき
の蛍光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルスをあ
らわす。
図33は、検出用プローブとして以下の一組を使用した
ときの蛍光減衰カーブ（●）である。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素
としてCy5を使用し、かつBodipy493/503はドナープロー
ブの５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの
中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド
体における蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド
間は一本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光
色素が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間数が
15塩基（ｎ＝15）になる検出用プローブを使用したとき
の蛍光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルスをあ
らわす。
ときの蛍光減衰カーブ（●）である。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素
としてCy5を使用し、かつBodipy493/503はドナープロー
ブの５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの
中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド
体における蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド
間は一本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光
色素が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間数が
15塩基（ｎ＝15）になる検出用プローブを使用したとき
の蛍光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルスをあ
らわす。
図34は、検出用プローブとして以下の一組を使用した
ときの蛍光減衰カーブ（●）である。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素
としてCy5を使用し、かつBodipy493/503はドナープロー
ブの５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの
中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド
体における蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド
間は一本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光
色素が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間数が
20塩基（ｎ＝20）になる検出用プローブを使用したとき
の蛍光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルスをあ
らわす。
ときの蛍光減衰カーブ（●）である。すなわち、ドナー
蛍光色素としてBodipy493/503、アクセプター蛍光色素
としてCy5を使用し、かつBodipy493/503はドナープロー
ブの５′末端に標識し、Cy5はアクセプタープローブの
中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド
体における蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド
間は一本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光
色素が結合している２つのヌクレオチド間の塩基間数が
20塩基（ｎ＝20）になる検出用プローブを使用したとき
の蛍光減衰カーブ（●）である。▲は励起光パルスをあ
らわす。
図35は、図29−図34に対するコントロールの蛍光減衰
カーブであり、検出用プローブの蛍光減衰カーブ（●）
をあらわす（被検体たるDNAは含まれていない）。▲は
励起光パルスをあらわす。
カーブであり、検出用プローブの蛍光減衰カーブ（●）
をあらわす（被検体たるDNAは含まれていない）。▲は
励起光パルスをあらわす。
図36は、一組の検出用プローブ（蛍光色素分子で標識
されたオリゴDNA）と被検体であるターゲットRNAとを、
プローブが過剰になるような種々の比率で混合したとき
のアクセプター波長域の蛍光減衰カーブをあらわしたも
のである。検出用プローブは、ドナー蛍光色素はBodipy
493/503、アクセプター蛍光色素はCy5、ハイブリッド体
形成時におけるドナー蛍光色素が結合しているヌクレオ
チドとアクセプター蛍光色素が結合しているヌクレオチ
ド間は二本鎖、塩基間数は12（ｎ＝12）になるものを使
用している。ターゲットRNAとプローブの比率は、０
％、2.5％、５％、20％（ターゲットRNA/プロー
ブ、モル比）である。
されたオリゴDNA）と被検体であるターゲットRNAとを、
プローブが過剰になるような種々の比率で混合したとき
のアクセプター波長域の蛍光減衰カーブをあらわしたも
のである。検出用プローブは、ドナー蛍光色素はBodipy
493/503、アクセプター蛍光色素はCy5、ハイブリッド体
形成時におけるドナー蛍光色素が結合しているヌクレオ
チドとアクセプター蛍光色素が結合しているヌクレオチ
ド間は二本鎖、塩基間数は12（ｎ＝12）になるものを使
用している。ターゲットRNAとプローブの比率は、０
％、2.5％、５％、20％（ターゲットRNA/プロー
ブ、モル比）である。
図37は、図36に示された試料（一組の検出用プローブ
と被検体であるターゲットRNAとを、プローブが過剰に
なるような種々の比率で混合したもの）における蛍光ス
ペクトルを示したものである。検出用プローブは、ドナ
ー蛍光色素はBodipy493/503、アクセプター蛍光色素はC
y5、ハイブリッド体形成時におけるドナー蛍光色素が結
合しているヌクレオチドとアクセプター蛍光色素が結合
しているヌクレオチド間は二本鎖、塩基間数は12（ｎ＝
12）になるものを使用している。ターゲットRNAとプロ
ーブの比率は、０％、2.5％、５％、20％（タ
ーゲットRNA/プローブ、モル比）である。
と被検体であるターゲットRNAとを、プローブが過剰に
なるような種々の比率で混合したもの）における蛍光ス
ペクトルを示したものである。検出用プローブは、ドナ
ー蛍光色素はBodipy493/503、アクセプター蛍光色素はC
y5、ハイブリッド体形成時におけるドナー蛍光色素が結
合しているヌクレオチドとアクセプター蛍光色素が結合
しているヌクレオチド間は二本鎖、塩基間数は12（ｎ＝
12）になるものを使用している。ターゲットRNAとプロ
ーブの比率は、０％、2.5％、５％、20％（タ
ーゲットRNA/プローブ、モル比）である。
図38は、一組の検出用プローブ（蛍光色素分子が標識
されたＳ−オリゴ）と被検体であるターゲットRNAと
を、プローブが過剰になるような種々の比率で混合した
ときのアクセプター波長域の蛍光減衰カーブをあらわし
たものである。検出用プローブは、ドナー蛍光色素はBo
dypy493/503、アクセプター蛍光色素はCy5、ハイブリッ
ド体形成時におけるドナー蛍光色素が結合しているヌク
レオチドとアクセプター蛍光色素が結合しているヌクレ
オチド間は二本鎖、塩基間数は10（ｎ＝10）になるもの
を使用している。ターゲットRNAとプローブの比率は、
０％、2.5％、５％、20％（ターゲットRNA/プ
ローブ、モル比）である。
されたＳ−オリゴ）と被検体であるターゲットRNAと
を、プローブが過剰になるような種々の比率で混合した
ときのアクセプター波長域の蛍光減衰カーブをあらわし
たものである。検出用プローブは、ドナー蛍光色素はBo
dypy493/503、アクセプター蛍光色素はCy5、ハイブリッ
ド体形成時におけるドナー蛍光色素が結合しているヌク
レオチドとアクセプター蛍光色素が結合しているヌクレ
オチド間は二本鎖、塩基間数は10（ｎ＝10）になるもの
を使用している。ターゲットRNAとプローブの比率は、
０％、2.5％、５％、20％（ターゲットRNA/プ
ローブ、モル比）である。
発明を実施するための最良の形態 被検体 本発明に係わる検出用プローブおよび検出方法を用い
て検出する被検体は、その種類、構造、長さ等において
特に制限はなく、通常の核酸および核酸類似体を含む。
例えば、DNA、RNA、合成オリゴヌクレオチド、合成ポリ
ヌクレオチド等があげられる。また、被検体は、本発明
に係わる検出用プローブが実質的に特異的に結合する特
定の塩基配列をもつ構造を被検体の一部として有するも
のを含む。このとき、被検体は、そのすべてが核酸構造
を有する必要はない。したがって、本発明に係わる検出
方法の使用においては、被検体の核酸および核酸類似体
のすべての塩基配列が知られている必要はなく、本発明
に係わる検出用プローブを特異的に結合させる特定の部
分の塩基配列が知られていればよい。
て検出する被検体は、その種類、構造、長さ等において
特に制限はなく、通常の核酸および核酸類似体を含む。
例えば、DNA、RNA、合成オリゴヌクレオチド、合成ポリ
ヌクレオチド等があげられる。また、被検体は、本発明
に係わる検出用プローブが実質的に特異的に結合する特
定の塩基配列をもつ構造を被検体の一部として有するも
のを含む。このとき、被検体は、そのすべてが核酸構造
を有する必要はない。したがって、本発明に係わる検出
方法の使用においては、被検体の核酸および核酸類似体
のすべての塩基配列が知られている必要はなく、本発明
に係わる検出用プローブを特異的に結合させる特定の部
分の塩基配列が知られていればよい。
被検体における上記特定部分の塩基配列を知るために
は、公知の塩基配列決定方法を使用すればよい。
は、公知の塩基配列決定方法を使用すればよい。
検出用プローブ 本発明に係わる検出用プローブは、異なる種類の蛍光
色素分子で標識された２つの蛍光標識オリゴヌクレオチ
ドを一組として使用するものである。
色素分子で標識された２つの蛍光標識オリゴヌクレオチ
ドを一組として使用するものである。
検出用プローブの骨格をなす核酸の部分については、
DNAやRNAに制限されるものではなく、一般に使用されて
いる種々の核酸類似体でもよい。たとえば、りん酸エス
テル部をホスホロチオエートにしたもの（Ｓ−オリゴ）
やメチルホスホネートにしたもの（Ｍ−オリゴ）、メチ
ルホスホロチオエートにしたものなどがある。また、ホ
スホジエステル結合をアミド、スルホアミド、エチレン
グリコール、チオフォーマルに置き換えたものなどがあ
る。また、糖への修飾をしたものでもよい。たとえば、
リボースの２′位を、２′−Ｏ−アルキル、２′−Ｏ−
アリル、２′−ハロゲン、２′−アミノ体に修飾したも
のなどである。また、ポリアミド核酸（PNA）でもよ
い。
DNAやRNAに制限されるものではなく、一般に使用されて
いる種々の核酸類似体でもよい。たとえば、りん酸エス
テル部をホスホロチオエートにしたもの（Ｓ−オリゴ）
やメチルホスホネートにしたもの（Ｍ−オリゴ）、メチ
ルホスホロチオエートにしたものなどがある。また、ホ
スホジエステル結合をアミド、スルホアミド、エチレン
グリコール、チオフォーマルに置き換えたものなどがあ
る。また、糖への修飾をしたものでもよい。たとえば、
リボースの２′位を、２′−Ｏ−アルキル、２′−Ｏ−
アリル、２′−ハロゲン、２′−アミノ体に修飾したも
のなどである。また、ポリアミド核酸（PNA）でもよ
い。
各プローブの塩基数には特に制限はない。被検体であ
るターゲット核酸と安定したハイブリッド体を形成する
こと、被検体以外の核酸との誤認識によるハイブリッド
体形成の確率が低いこと、の条件を満足すればよい。こ
の目的のためには、通常は10塩基以上あればよく、好ま
しくは15塩基以上である。また、２つのプローブの合計
塩基数も特に制限はない。被検体のターゲット核酸の特
定の塩基配列部位に２つのプローブがともにハイブリダ
イズすることが可能であればよい。通常、20塩基以上、
好ましくは30塩基以上である。
るターゲット核酸と安定したハイブリッド体を形成する
こと、被検体以外の核酸との誤認識によるハイブリッド
体形成の確率が低いこと、の条件を満足すればよい。こ
の目的のためには、通常は10塩基以上あればよく、好ま
しくは15塩基以上である。また、２つのプローブの合計
塩基数も特に制限はない。被検体のターゲット核酸の特
定の塩基配列部位に２つのプローブがともにハイブリダ
イズすることが可能であればよい。通常、20塩基以上、
好ましくは30塩基以上である。
本発明に係わるプローブの塩基配列は、被検体に検出
用プローブが結合（ハイブリダイズ）する被検体中の特
定部位の塩基配列と相補的なものとすればよい。このと
き、検出用プローブが被検体中の上記特定部位に実質的
にハイブリダイズするのであれば、検出用プローブの塩
基配列の一部は被検体中の上記特定部位の塩基配列と相
補性をもたなくともよい。
用プローブが結合（ハイブリダイズ）する被検体中の特
定部位の塩基配列と相補的なものとすればよい。このと
き、検出用プローブが被検体中の上記特定部位に実質的
にハイブリダイズするのであれば、検出用プローブの塩
基配列の一部は被検体中の上記特定部位の塩基配列と相
補性をもたなくともよい。
本発明に係わるプローブは、被検体であるターゲット
核酸とハイブリッド体を形成したときに、アクセプター
蛍光色素の蛍光減衰が大きく遅れるものである。本発明
に係わるプローブは、そのために、蛍光色素の組み合わ
せ、ハイブリッド体における蛍光色素分子が結合してい
るヌクレオチド間の塩基数、ハイブリッド体における蛍
光色素分子が結合しているヌクレオチド間を一本鎖とす
るか二本鎖とするか、ハイブリッド体における蛍光色素
分子の位置、を適切に設定したものである。
核酸とハイブリッド体を形成したときに、アクセプター
蛍光色素の蛍光減衰が大きく遅れるものである。本発明
に係わるプローブは、そのために、蛍光色素の組み合わ
せ、ハイブリッド体における蛍光色素分子が結合してい
るヌクレオチド間の塩基数、ハイブリッド体における蛍
光色素分子が結合しているヌクレオチド間を一本鎖とす
るか二本鎖とするか、ハイブリッド体における蛍光色素
分子の位置、を適切に設定したものである。
一般に、ドナー色素、アクセプター色素がそれぞれ単
独で存在しているとき、パルス励起したときのそれぞれ
の蛍光強度の減衰は、それぞれの分子に固有の時定数
（蛍光寿命）で減衰する単一指数関数であらわされる
（式（１）および（２））。
独で存在しているとき、パルス励起したときのそれぞれ
の蛍光強度の減衰は、それぞれの分子に固有の時定数
（蛍光寿命）で減衰する単一指数関数であらわされる
（式（１）および（２））。
ドナーが単独で存在しているとき（ドナー−アクセプ
ター間にエネルギー移動がおきていないとき）のドナー
の蛍光減衰カーブ Id（ｔ）＝exp（−t/τｄ） τd:ドナーの蛍光寿命
（式１） アクセプター単独で存在しているとき（ドナー−アクセ
プター間にエネルギー移動がおきていないとき）のアク
セプターの蛍光減衰カーブ Ia（ｔ）＝exp（−t/τａ） τa:アクセプターの蛍
光寿命 （式２） ドナーとアクセプターとの間で共鳴エネルギー移動がお
こると、ドナーの蛍光減衰は速くなり、アクセプターの
蛍光減衰は遅くなる。ドナー分子とアクセプター分子の
間の距離が固定されているとしたときのドナーの蛍光減
衰カーブは式（３）であらわされる。ここで、蛍光寿命
τdaはエネルギー移動の効率Ｅにより規定される。すな
わち、エネルギー移動の効率が高くなるほど、ドナーの
蛍光減衰は速くなる。
ター間にエネルギー移動がおきていないとき）のドナー
の蛍光減衰カーブ Id（ｔ）＝exp（−t/τｄ） τd:ドナーの蛍光寿命
（式１） アクセプター単独で存在しているとき（ドナー−アクセ
プター間にエネルギー移動がおきていないとき）のアク
セプターの蛍光減衰カーブ Ia（ｔ）＝exp（−t/τａ） τa:アクセプターの蛍
光寿命 （式２） ドナーとアクセプターとの間で共鳴エネルギー移動がお
こると、ドナーの蛍光減衰は速くなり、アクセプターの
蛍光減衰は遅くなる。ドナー分子とアクセプター分子の
間の距離が固定されているとしたときのドナーの蛍光減
衰カーブは式（３）であらわされる。ここで、蛍光寿命
τdaはエネルギー移動の効率Ｅにより規定される。すな
わち、エネルギー移動の効率が高くなるほど、ドナーの
蛍光減衰は速くなる。
エネルギー移動をおこしているドナーの蛍光減衰カーブ Ｉ′ｄ（ｔ）＝exp（−t/τda） （式３） τda＝τｄ（１−Ｅ） 一方、アクセプターの蛍光減衰カーブは式（４）であ
らわされる。この減衰カーブは単一指数係数ではない。
らわされる。この減衰カーブは単一指数係数ではない。
エネルギー移動励起のアクセプターの蛍光減衰カーブ 上述したように、式（３）および式（４）は、ドナー
分子とアクセプター分子の間の距離が固定されていると
したときの減衰カーブである。ドナーアクセプター間の
距離が固定されておらず揺らいでいるときには、式
（３）（４）の（エネルギー移動時のドナーの蛍光寿
命）は定数ではなく、揺らぎにともなうドナーアクセプ
ター間の距離の分布をあらわす関数が組み込まれる。
分子とアクセプター分子の間の距離が固定されていると
したときの減衰カーブである。ドナーアクセプター間の
距離が固定されておらず揺らいでいるときには、式
（３）（４）の（エネルギー移動時のドナーの蛍光寿
命）は定数ではなく、揺らぎにともなうドナーアクセプ
ター間の距離の分布をあらわす関数が組み込まれる。
２つの蛍光色素分子間のエネルギー移動を時間分解法
で測定することにより検出用プローブがターゲット核酸
に対して過剰に存在する条件においてターゲット核酸を
高感度で検出するためには、式（４）であらわされる蛍
光減衰カーブと式（２）であらわされる蛍光減衰カーブ
の差を大きくすることが必要である。式（４）の蛍光減
衰カーブは、ドナーの蛍光寿命、アクセプターの蛍光寿
命、エネルギー移動効率、ドナー−アクセプター間の距
離の揺らぎの大きさ、により、式（２）はアクセプター
の蛍光寿命により規定されている。
で測定することにより検出用プローブがターゲット核酸
に対して過剰に存在する条件においてターゲット核酸を
高感度で検出するためには、式（４）であらわされる蛍
光減衰カーブと式（２）であらわされる蛍光減衰カーブ
の差を大きくすることが必要である。式（４）の蛍光減
衰カーブは、ドナーの蛍光寿命、アクセプターの蛍光寿
命、エネルギー移動効率、ドナー−アクセプター間の距
離の揺らぎの大きさ、により、式（２）はアクセプター
の蛍光寿命により規定されている。
したがって、蛍光色素の組み合わせ、ハイブリッド体
における２つの蛍光色素分子間の平均距離（エネルギー
移動効率を主に規定する）、およびその揺らぎの大きさ
を相互に適切に設定すればよい。
における２つの蛍光色素分子間の平均距離（エネルギー
移動効率を主に規定する）、およびその揺らぎの大きさ
を相互に適切に設定すればよい。
なお、蛍光色素の組み合わせは、次の条件を満たすも
のが好ましい。
のが好ましい。
1.ドナーの蛍光寿命がアクセプターの蛍光寿命よりも長
く、その差が大きい。
く、その差が大きい。
2.ドナーの励起波長において、アクセプターが励起され
る確率が低い。（ドナーの吸収極大での分子吸光係数＞
＞ドナーの吸収極大でのアクセプターの分子吸光係数） 3.ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの蛍光スペク
トルの重なりが小さい。（アクセプターの蛍光波長域へ
のドナーの蛍光の混入が少ない） 上記の条件を満たす蛍光色素の組み合わせとしては、
例えば、ドナー色素としてBodipy（4,4−difluoro−４
−bora−3a,4a−diaza−ｓ−indance）系色素またはフ
ルオレッセン系色素を使用し、これらにアクセプター色
素としてインドシアニン系色素またはローダミン系色素
を組み合わせたものがある。
る確率が低い。（ドナーの吸収極大での分子吸光係数＞
＞ドナーの吸収極大でのアクセプターの分子吸光係数） 3.ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの蛍光スペク
トルの重なりが小さい。（アクセプターの蛍光波長域へ
のドナーの蛍光の混入が少ない） 上記の条件を満たす蛍光色素の組み合わせとしては、
例えば、ドナー色素としてBodipy（4,4−difluoro−４
−bora−3a,4a−diaza−ｓ−indance）系色素またはフ
ルオレッセン系色素を使用し、これらにアクセプター色
素としてインドシアニン系色素またはローダミン系色素
を組み合わせたものがある。
ハイブリッド体における２つの蛍光色素分子間の平均
距離は、ハイブリッド体における２つの蛍光色素分子間
が結合しているヌクレオチド間の塩基数により決まる。
また、蛍光色素分子間の距離の揺らぎの大きさは、ハイ
ブリッド体において２つの蛍光色素分子が結合している
ヌクレオチド間が一本鎖構造であるか二本鎖構造（図１
を参照）であるか、ハイブリッド体における蛍光色素分
子の位置、および蛍光色素分子とオルゴヌクレオチドと
のリンカーの構造と長さなどにより決定されると予想さ
れる。
距離は、ハイブリッド体における２つの蛍光色素分子間
が結合しているヌクレオチド間の塩基数により決まる。
また、蛍光色素分子間の距離の揺らぎの大きさは、ハイ
ブリッド体において２つの蛍光色素分子が結合している
ヌクレオチド間が一本鎖構造であるか二本鎖構造（図１
を参照）であるか、ハイブリッド体における蛍光色素分
子の位置、および蛍光色素分子とオルゴヌクレオチドと
のリンカーの構造と長さなどにより決定されると予想さ
れる。
表１は、実施例に基づき、種々の蛍光標識プローブと
ターゲットDNAとのハイブリッド体において、アクセプ
ター波長域の蛍光減衰カーブの遅れが観測された例をま
とめたものである。種々の蛍光標識プローブを作製し、
各一組のプローブとターゲットDNAを混合してハイブリ
ッド体を形成させた。ハイブリッド体を高速液体クロマ
トグラフィーを用いて分離し、蛍光スペクトルおよび蛍
光減衰カーブを測定した。また、各一組のプローブにつ
いて、ターゲットDNAを含まない試料において蛍光スペ
クトルおよび蛍光減衰カーブを測定し、ハイブリッド体
形成にともなう蛍光スペクトルの変化および蛍光減衰カ
ーブの変化（遅れ）を観察した（詳細は実施例の項参
照）。
ターゲットDNAとのハイブリッド体において、アクセプ
ター波長域の蛍光減衰カーブの遅れが観測された例をま
とめたものである。種々の蛍光標識プローブを作製し、
各一組のプローブとターゲットDNAを混合してハイブリ
ッド体を形成させた。ハイブリッド体を高速液体クロマ
トグラフィーを用いて分離し、蛍光スペクトルおよび蛍
光減衰カーブを測定した。また、各一組のプローブにつ
いて、ターゲットDNAを含まない試料において蛍光スペ
クトルおよび蛍光減衰カーブを測定し、ハイブリッド体
形成にともなう蛍光スペクトルの変化および蛍光減衰カ
ーブの変化（遅れ）を観察した（詳細は実施例の項参
照）。
「Bodipy」はモレキュラープローブス社（Molecular
Probes Inc.Eugene,OR,USA）の商標である。また、特に
ことわりのない限り、実施例の「Bodipy」は「Bodipy 4
93/503」である。また、Cy3、Cy3.5、Cy5はアマーシャ
ム社（Amersham）の商標である。
Probes Inc.Eugene,OR,USA）の商標である。また、特に
ことわりのない限り、実施例の「Bodipy」は「Bodipy 4
93/503」である。また、Cy3、Cy3.5、Cy5はアマーシャ
ム社（Amersham）の商標である。
使用したすべての種類の検出用プローブにおいて、ハ
イブリッド体形成による蛍光スペクトル変化が観測され
た。これは、ハイブリッド体形成により、エネルギー移
動がおきることを示している。アクセプター波長域の蛍
光減衰カーブの遅れの大きさは、検出用プローブの種類
により大きな差が認められた。表１の「アクセプター波
長域の蛍光減衰の遅れ」の項で、＋＋＋＋は蛍光減衰に
極めて大きな遅れが生じることをあらわし、＋＋＋は蛍
光減衰に大きな遅れが生じることを、＋＋は蛍光減衰に
遅れが生じることを、＋は蛍光減衰に遅れが認められる
ことをあらわす。−は蛍光減衰に遅れが認められないこ
とをあらわす。
イブリッド体形成による蛍光スペクトル変化が観測され
た。これは、ハイブリッド体形成により、エネルギー移
動がおきることを示している。アクセプター波長域の蛍
光減衰カーブの遅れの大きさは、検出用プローブの種類
により大きな差が認められた。表１の「アクセプター波
長域の蛍光減衰の遅れ」の項で、＋＋＋＋は蛍光減衰に
極めて大きな遅れが生じることをあらわし、＋＋＋は蛍
光減衰に大きな遅れが生じることを、＋＋は蛍光減衰に
遅れが生じることを、＋は蛍光減衰に遅れが認められる
ことをあらわす。−は蛍光減衰に遅れが認められないこ
とをあらわす。
蛍光色素の組み合わせとしては、Bodipy/Cy5が最も好
ましく、次いで、Bodipy/Cy3.5、FITC/Cy5の順となる。
FITC/Cy3、FITC/ローダミンの組み合わせは、ハイブリ
ッド体において蛍光色素間を二本鎖構造とするときには
使用可能である。ドナー色素として、BodipyがFITCより
も優れているのは、主に、Bodipyの蛍光寿命（約７ナノ
秒）がFITCの蛍光寿命（約４ナノ秒）よりも長いため、
アクセプター色素の蛍光寿命（Cy5は約１ナノ秒、ロー
ダミンは約３ナノ秒）との差が大きくなることに起因す
ると考えられる。また、FITC/Cy3、FITC/ローダミンの
ように、ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの蛍光
スペクトルの分離がよくない組み合わせを用いたときに
は、ハイブリッド体における蛍光色素間を二本鎖構造と
したときには蛍光減衰の遅れが生じたが、一本鎖構造と
したときには蛍光減衰の遅れは認められなかった。
ましく、次いで、Bodipy/Cy3.5、FITC/Cy5の順となる。
FITC/Cy3、FITC/ローダミンの組み合わせは、ハイブリ
ッド体において蛍光色素間を二本鎖構造とするときには
使用可能である。ドナー色素として、BodipyがFITCより
も優れているのは、主に、Bodipyの蛍光寿命（約７ナノ
秒）がFITCの蛍光寿命（約４ナノ秒）よりも長いため、
アクセプター色素の蛍光寿命（Cy5は約１ナノ秒、ロー
ダミンは約３ナノ秒）との差が大きくなることに起因す
ると考えられる。また、FITC/Cy3、FITC/ローダミンの
ように、ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの蛍光
スペクトルの分離がよくない組み合わせを用いたときに
は、ハイブリッド体における蛍光色素間を二本鎖構造と
したときには蛍光減衰の遅れが生じたが、一本鎖構造と
したときには蛍光減衰の遅れは認められなかった。
表１から明らかなように、ハイブリッド体における蛍
光色素間の構造を二本鎖とする方が一本鎖とするより
も、蛍光減衰に大きな遅れが生じることがわかる。ハイ
ブリッド体において、２つの蛍光色素が結合しているヌ
クレオド間が一本鎖構造のときには、一本鎖となってい
る部分の分子運動の自由度は大きいため、ドナー色素と
アクセプター色素の相対的な空間位置は大きく揺らぐと
考えられる。すなわち、２つの色素間の距離は、時間に
より大きく揺らいでいる。一方、二本鎖構造の場合は、
その部分の分子運動の自由度は一本鎖のときよりもはる
かに制限されるため、ドナー色素とアクセプター色素間
の距離の揺らぎや分布は小さくなる。実施例の結果は、
ドナー色素とアクセプター色素間の距離の揺らぎが小さ
い方が、すなわち、ハイブリッド体における２つの蛍光
色素間の構造を二本鎖とする方が、蛍光減衰に大きな遅
れが生じることを示している。
光色素間の構造を二本鎖とする方が一本鎖とするより
も、蛍光減衰に大きな遅れが生じることがわかる。ハイ
ブリッド体において、２つの蛍光色素が結合しているヌ
クレオド間が一本鎖構造のときには、一本鎖となってい
る部分の分子運動の自由度は大きいため、ドナー色素と
アクセプター色素の相対的な空間位置は大きく揺らぐと
考えられる。すなわち、２つの色素間の距離は、時間に
より大きく揺らいでいる。一方、二本鎖構造の場合は、
その部分の分子運動の自由度は一本鎖のときよりもはる
かに制限されるため、ドナー色素とアクセプター色素間
の距離の揺らぎや分布は小さくなる。実施例の結果は、
ドナー色素とアクセプター色素間の距離の揺らぎが小さ
い方が、すなわち、ハイブリッド体における２つの蛍光
色素間の構造を二本鎖とする方が、蛍光減衰に大きな遅
れが生じることを示している。
上記および実施例に示したように、ターゲット核酸と
のハイブリッド体形成にともない大きな蛍光減衰の遅れ
を生ずる種々の一組の蛍光標識プローブが存在する。こ
れらのプローブを用いたときの、ハイブリッド体形成に
ともなう蛍光減衰カーブの変化の検出の精度を定量的に
比較するために以下の解析をおこなった。
のハイブリッド体形成にともない大きな蛍光減衰の遅れ
を生ずる種々の一組の蛍光標識プローブが存在する。こ
れらのプローブを用いたときの、ハイブリッド体形成に
ともなう蛍光減衰カーブの変化の検出の精度を定量的に
比較するために以下の解析をおこなった。
ハイブリッド体形成にともない（エネルギー移動によ
り）、アクセプターの蛍光は増加するが、その増加量は
各プローブごとに異なる（エネルギー移動効率に依存す
るため）。したがって、ハイブリッド体形成にともなう
蛍光減衰カーブの変化を識別する精度は、減衰カーブの
変化の大きさと蛍光の光量の変化量により決まる。
り）、アクセプターの蛍光は増加するが、その増加量は
各プローブごとに異なる（エネルギー移動効率に依存す
るため）。したがって、ハイブリッド体形成にともなう
蛍光減衰カーブの変化を識別する精度は、減衰カーブの
変化の大きさと蛍光の光量の変化量により決まる。
各一組のプローブの評価は、ハイブリッド体を形成し
たプローブの蛍光減衰カーブとハイブリッド体を形成し
ていないときのプローブの蛍光減衰カーブの識別のS/N
（シグナル／ノイズ比）を指標として行った。
たプローブの蛍光減衰カーブとハイブリッド体を形成し
ていないときのプローブの蛍光減衰カーブの識別のS/N
（シグナル／ノイズ比）を指標として行った。
２つの蛍光減衰カーブの識別のS/Nは、以下の手順で
求めた（S.A.Soper,B.L.Legender,＆ D.C.Williams,（1
995）Analy.Chem.67 4358−4365を参考にした）。
求めた（S.A.Soper,B.L.Legender,＆ D.C.Williams,（1
995）Analy.Chem.67 4358−4365を参考にした）。
まず、ハイブリッド体を形成しているプローブの蛍光
減衰カーブ、およびハイブリッド体を形成していないと
きのプローブ（ターゲット核酸が含まれていない試料）
の蛍光減衰カーブそれぞれについて、パルス励起光照射
後３ナノ秒から７ナノ秒の時間域を用いて、減衰の速さ
（蛍光寿命τ）を τ＝−Δt/（ln（D1/D0）） D0:3−５ナノ秒の時間域における蛍光量 D1:5−７ナノ秒の時間域における蛍光量 Δｔ＝2ns の式により求めた。また、このときの測定値のバラツキ
の大きさσを σ＝τｘ（−ln（D1/D0））／（1/D0＋1/D1）1/2 により求めた。σは測定を同一条件で多数回行ったとき
の測定値の分布の標識偏差であり、蛍光量が増えるほど
小さな値をとる（蛍光量が増えると、測定値のバラツキ
は小さくなる）。
減衰カーブ、およびハイブリッド体を形成していないと
きのプローブ（ターゲット核酸が含まれていない試料）
の蛍光減衰カーブそれぞれについて、パルス励起光照射
後３ナノ秒から７ナノ秒の時間域を用いて、減衰の速さ
（蛍光寿命τ）を τ＝−Δt/（ln（D1/D0）） D0:3−５ナノ秒の時間域における蛍光量 D1:5−７ナノ秒の時間域における蛍光量 Δｔ＝2ns の式により求めた。また、このときの測定値のバラツキ
の大きさσを σ＝τｘ（−ln（D1/D0））／（1/D0＋1/D1）1/2 により求めた。σは測定を同一条件で多数回行ったとき
の測定値の分布の標識偏差であり、蛍光量が増えるほど
小さな値をとる（蛍光量が増えると、測定値のバラツキ
は小さくなる）。
ハイブリッド体を形成しているプローブの蛍光減衰カ
ーブとハイブリッド体を形成していないときのプローブ
の蛍光減衰カーブの識別のS/N（シグナル／ノイズ比）
は、蛍光寿命の差（Δτ）を測定値のバラツキの和（σ
Δτ）で減じたΔτ／σΔτであらわされる。
ーブとハイブリッド体を形成していないときのプローブ
の蛍光減衰カーブの識別のS/N（シグナル／ノイズ比）
は、蛍光寿命の差（Δτ）を測定値のバラツキの和（σ
Δτ）で減じたΔτ／σΔτであらわされる。
ここで、Δτ＝τ（ハイブリッド体）−τ（プロー
ブ） σΔτ＝（σ（ハイブリッド体）２＋σ（プ
ローブ）２）1/2 表２および図３は結果を示したものである（表２およ
び図３のΔτ／σΔτの値は相対値である）。
ブ） σΔτ＝（σ（ハイブリッド体）２＋σ（プ
ローブ）２）1/2 表２および図３は結果を示したものである（表２およ
び図３のΔτ／σΔτの値は相対値である）。
表２および図３は、Bodipy/Cy5、Bodipy/Cy3.5、FITC
/CY5の蛍光色素の組み合わせに対して、ハイブリッド体
において色素が結合している２つのヌクレオチド間の塩
基数を変えたときの、蛍光減衰カーブの変化の識別のS/
Nを示している。また、表には、蛍光色素が結合してい
る２つのヌクレオチド間の構造の違い（一本鎖または二
本鎖）による識別のS/Nへの影響をみるために、Bodipy/
Cy5の色素の組み合わせにおいて塩基間数を10に固定
し、その間を一本鎖と二本鎖の混合構造として、一本鎖
と二本鎖の比率を変えたときのS/Nの変化を示した。ま
た、ハイブリッド体における蛍光色素の標識位置の影響
をみるために、Bodipy/Cy5の色素の組み合わせにおいて
塩基間数を10に固定し、Bodipy標識プローブ（ドナープ
ローブ）のBodipyの標識位置を５′末端（切れ目の位置
＝０）から中間部へずらしたときのS/Nの変化を示し
た。
/CY5の蛍光色素の組み合わせに対して、ハイブリッド体
において色素が結合している２つのヌクレオチド間の塩
基数を変えたときの、蛍光減衰カーブの変化の識別のS/
Nを示している。また、表には、蛍光色素が結合してい
る２つのヌクレオチド間の構造の違い（一本鎖または二
本鎖）による識別のS/Nへの影響をみるために、Bodipy/
Cy5の色素の組み合わせにおいて塩基間数を10に固定
し、その間を一本鎖と二本鎖の混合構造として、一本鎖
と二本鎖の比率を変えたときのS/Nの変化を示した。ま
た、ハイブリッド体における蛍光色素の標識位置の影響
をみるために、Bodipy/Cy5の色素の組み合わせにおいて
塩基間数を10に固定し、Bodipy標識プローブ（ドナープ
ローブ）のBodipyの標識位置を５′末端（切れ目の位置
＝０）から中間部へずらしたときのS/Nの変化を示し
た。
以上の結果から、以下のことが明らかである。
（１）Bodipy/Cy5の蛍光色素の組み合わせにおいて、２
つの蛍光色素が結合しているヌクレオチド間がハイブリ
ッド体において二本鎖構造をとる場合は、２つの蛍光色
素の間の塩基数は10−12が最もよい。
つの蛍光色素が結合しているヌクレオチド間がハイブリ
ッド体において二本鎖構造をとる場合は、２つの蛍光色
素の間の塩基数は10−12が最もよい。
（２）Bodipy/Cy5の蛍光色素の組み合わせにおいて、２
つの蛍光色素が結合しているヌクレオチド間がハイブリ
ッド体において一本鎖構造をとる場合は、識別のS/Nは
２つの蛍光色素の間の塩基数が増大するほどよくなる
（４＜ｎ＜20において）。ｎ＝20における識別のS/N
は、二本鎖構造のときと比較すると低い。
つの蛍光色素が結合しているヌクレオチド間がハイブリ
ッド体において一本鎖構造をとる場合は、識別のS/Nは
２つの蛍光色素の間の塩基数が増大するほどよくなる
（４＜ｎ＜20において）。ｎ＝20における識別のS/N
は、二本鎖構造のときと比較すると低い。
（３）Bodipy/Cy3.5の蛍光色素の組み合わせにおいて、
２つの蛍光色素が結合しているヌクレオチド間がハイブ
リッド体において二本鎖構造をとる場合は、２つの蛍光
色素の間の塩基数に対するS/Nの依存性は、Bodipy/Cy5
の組み合わせのときと同様の傾向を示す。しかしなが
ら、S/Nの値はBodipy/Cy5よりも低い。
２つの蛍光色素が結合しているヌクレオチド間がハイブ
リッド体において二本鎖構造をとる場合は、２つの蛍光
色素の間の塩基数に対するS/Nの依存性は、Bodipy/Cy5
の組み合わせのときと同様の傾向を示す。しかしなが
ら、S/Nの値はBodipy/Cy5よりも低い。
（４）FITC/Cy5の蛍光色素の組み合わせにおいて、２つ
の蛍光色素が結合しているヌクレオチド間がハイブリッ
ド体において二本鎖構造をとる場合は、S/NはBodipy/Cy
5よりも低い値をとる。
の蛍光色素が結合しているヌクレオチド間がハイブリッ
ド体において二本鎖構造をとる場合は、S/NはBodipy/Cy
5よりも低い値をとる。
（５）Bodipy/Cy5の蛍光色素の組み合わせ（ハイブリッ
ド体における２つの蛍光色素が結合しているヌクレオチ
ド間の塩基数、ｎ＝10）において、２つの蛍光色素が結
合しているヌクレオチド間の構造を一本鎖と二本鎖の混
合構造としたときには、すべて二本鎖の場合が、最もよ
い識別のS/Nを与える。
ド体における２つの蛍光色素が結合しているヌクレオチ
ド間の塩基数、ｎ＝10）において、２つの蛍光色素が結
合しているヌクレオチド間の構造を一本鎖と二本鎖の混
合構造としたときには、すべて二本鎖の場合が、最もよ
い識別のS/Nを与える。
（６）Bodipy/Cy5の蛍光色素の組み合わせ（ハイブリッ
ド体における２つの蛍光色素が結合しているヌクレオチ
ド間の塩基数、ｎ＝10）において、Bodipy標識プローブ
（ドナープローブ）のBodipyの標識位置は５′末端が最
もよい。標識位置がプローブの中央部へと移行するにつ
れて、S/Nは低下する。
ド体における２つの蛍光色素が結合しているヌクレオチ
ド間の塩基数、ｎ＝10）において、Bodipy標識プローブ
（ドナープローブ）のBodipyの標識位置は５′末端が最
もよい。標識位置がプローブの中央部へと移行するにつ
れて、S/Nは低下する。
ここで（６）の結果は以下のように解釈される。２つ
のプローブとターゲット核酸とからなるハイブリッド体
において、２つのプローブが隣り合っているヌクレオチ
ドのところでは、プローブ側の鎖に切れ目が生じてい
る。そのため、ターゲット核酸側の対応するホスホジエ
ステル結合は運動の自由度が大きくなる。したがって、
ハイブリッド体の水溶液中での運動にともなう２つの蛍
光色素間の距離の揺らぎの大きさは、蛍光色素がハイブ
リッド体の切れ目の位置に近いほど小さいと予想され
る。（６）の結果は、ドナープローブまたはアクセプタ
ープローブのどちらか一方を、ハイブリッド体において
他のプローブと向き合う側の末端に標識することが、識
別のS/Nを最も増大させることを示している。
のプローブとターゲット核酸とからなるハイブリッド体
において、２つのプローブが隣り合っているヌクレオチ
ドのところでは、プローブ側の鎖に切れ目が生じてい
る。そのため、ターゲット核酸側の対応するホスホジエ
ステル結合は運動の自由度が大きくなる。したがって、
ハイブリッド体の水溶液中での運動にともなう２つの蛍
光色素間の距離の揺らぎの大きさは、蛍光色素がハイブ
リッド体の切れ目の位置に近いほど小さいと予想され
る。（６）の結果は、ドナープローブまたはアクセプタ
ープローブのどちらか一方を、ハイブリッド体において
他のプローブと向き合う側の末端に標識することが、識
別のS/Nを最も増大させることを示している。
これらの結果から、本発明の実施例で使用する検出用
プローブのなかで最適のものは、Bodipy/Cy5を蛍光色素
の組み合わせとして用いたもので、被検体とのハイブリ
ッド体においてBodipyとCy5が結合しているヌクレオチ
ド間が二本鎖構造を形成し、塩基間数が10−12となる一
組のものであることがわかる。このとき、Bodipy、Cy5
のいずれかの色素はそれぞれの検出用プローブの末端に
標識されている。
プローブのなかで最適のものは、Bodipy/Cy5を蛍光色素
の組み合わせとして用いたもので、被検体とのハイブリ
ッド体においてBodipyとCy5が結合しているヌクレオチ
ド間が二本鎖構造を形成し、塩基間数が10−12となる一
組のものであることがわかる。このとき、Bodipy、Cy5
のいずれかの色素はそれぞれの検出用プローブの末端に
標識されている。
本発明に係わる検出用プローブにおいては、蛍光色素
分子のオリゴヌクレオチドへの結合基については特に限
定されないが、適当なリンカーを介して結合することが
望ましい。このとき、リンカーがあまりに短い場合は、
蛍光色素分子と核酸の骨格部や塩基部との相互作用が強
くなり、その結果として、望まれる２つの蛍光色素分子
間での共鳴エネルギー移動が十分におこらなくなる可能
性がある。また、リンカーがあまりに長い場合には、２
つの蛍光色素分子が自由に運動して、２つの蛍光色素分
子間の距離の揺らぎが大きくなりすぎる可能性が強いた
め好ましくない。本発明に係わる検出用プローブの好ま
しいリンカーの長さとしては、テトラメチレン鎖−デカ
メチレン鎖である。蛍光色素分子との結合は、公知の共
有結合生成反応を用いることができる。例えば、アミ
ド、エステル、エーテル結合等であるが、特にアミド結
合が好ましい。本実施例で使用した検出用プローブは、
リンカーとしてテトラメチレン鎖を使用したものであ
る。
分子のオリゴヌクレオチドへの結合基については特に限
定されないが、適当なリンカーを介して結合することが
望ましい。このとき、リンカーがあまりに短い場合は、
蛍光色素分子と核酸の骨格部や塩基部との相互作用が強
くなり、その結果として、望まれる２つの蛍光色素分子
間での共鳴エネルギー移動が十分におこらなくなる可能
性がある。また、リンカーがあまりに長い場合には、２
つの蛍光色素分子が自由に運動して、２つの蛍光色素分
子間の距離の揺らぎが大きくなりすぎる可能性が強いた
め好ましくない。本発明に係わる検出用プローブの好ま
しいリンカーの長さとしては、テトラメチレン鎖−デカ
メチレン鎖である。蛍光色素分子との結合は、公知の共
有結合生成反応を用いることができる。例えば、アミ
ド、エステル、エーテル結合等であるが、特にアミド結
合が好ましい。本実施例で使用した検出用プローブは、
リンカーとしてテトラメチレン鎖を使用したものであ
る。
本発明に係わる検出用プローブに用いる蛍光色素の組
み合わせのなかで、ドナー色素として「4,4−ジフルオ
ロ−４−ボロ−3a、4a−ジアザ−ｓ−インダセン系蛍光
団（Bodipy）」を有するものを使用し、これにアクセプ
ター色素としてインドシアニン系蛍光団を有するものを
組み合わせる例として、Bodipy 493/503とCy3、Cy3.5、
Cy5を組み合わせた例を示した。波長特性の異なる他の
種類のBodipy（Molecular Probes Inc.）およびCy5.5、
Cy7（Amersham）も使用可能である。例えば、「Bodipy
−TMR,Cy5.5」や「Bodipy−TR,Cy7」の組み合わせがあ
る。これらの組み合わせは、「Bodipy 493/503,Cy5」の
組み合わせと同じく、ドナーとアクセプターとの蛍光寿
命の差が約７倍であり、ドナーの蛍光スペクトルの極大
波長とアクセプターの蛍光スペクトルの極大波長が約15
0nm離れている、という特徴を有している。「Bodipy−T
MR,Cy5.5」「Bodipy−TR,Cy7」の組み合わせは、「Bodi
py 493/503,Cy5」よりも波長が全体として、それぞれ、
約50nm、約100nm長波長側にシフトしたものである。一
般に、生体試料は、発光する物質を含有していることが
多いが、これらの発光は測定に対してバックグラウンド
光となり、測定のS/Nを低下させる。これらのバックグ
ラウンド光は、一般に、長波長域になるほど発光量が減
少するため、生体試料の高感度測定を行うときには、長
波長域を使用する方が有利である。
み合わせのなかで、ドナー色素として「4,4−ジフルオ
ロ−４−ボロ−3a、4a−ジアザ−ｓ−インダセン系蛍光
団（Bodipy）」を有するものを使用し、これにアクセプ
ター色素としてインドシアニン系蛍光団を有するものを
組み合わせる例として、Bodipy 493/503とCy3、Cy3.5、
Cy5を組み合わせた例を示した。波長特性の異なる他の
種類のBodipy（Molecular Probes Inc.）およびCy5.5、
Cy7（Amersham）も使用可能である。例えば、「Bodipy
−TMR,Cy5.5」や「Bodipy−TR,Cy7」の組み合わせがあ
る。これらの組み合わせは、「Bodipy 493/503,Cy5」の
組み合わせと同じく、ドナーとアクセプターとの蛍光寿
命の差が約７倍であり、ドナーの蛍光スペクトルの極大
波長とアクセプターの蛍光スペクトルの極大波長が約15
0nm離れている、という特徴を有している。「Bodipy−T
MR,Cy5.5」「Bodipy−TR,Cy7」の組み合わせは、「Bodi
py 493/503,Cy5」よりも波長が全体として、それぞれ、
約50nm、約100nm長波長側にシフトしたものである。一
般に、生体試料は、発光する物質を含有していることが
多いが、これらの発光は測定に対してバックグラウンド
光となり、測定のS/Nを低下させる。これらのバックグ
ラウンド光は、一般に、長波長域になるほど発光量が減
少するため、生体試料の高感度測定を行うときには、長
波長域を使用する方が有利である。
被検体の検出方法 本発明に係わる検出用プローブを用いた被検体の検出
は、例えば次のように行うことが可能である（図３参
照）。
は、例えば次のように行うことが可能である（図３参
照）。
（１）検出用プローブを作製する。
（２）試料に検出用プローブを適当量加える。試料中に
被検体が含まれていれば、検出用プローブの一部は被検
体とハイブリッド体を形成する。
被検体が含まれていれば、検出用プローブの一部は被検
体とハイブリッド体を形成する。
（３）蛍光時間分解測定が可能な測定装置を用いて、ア
クセプター波長域の蛍光減衰カーブを測定する。アクセ
プター波長域の蛍光には、ハイブリッド体形成にもとづ
くエネルギー移動励起の蛍光が含まれている。
クセプター波長域の蛍光減衰カーブを測定する。アクセ
プター波長域の蛍光には、ハイブリッド体形成にもとづ
くエネルギー移動励起の蛍光が含まれている。
（４）検出用プローブのアクセプター波長域の蛍光減衰
カーブを測定する。
カーブを測定する。
（５）（３）で測定した蛍光減衰カーブと（４）で測定
した蛍光減衰カーブを比較検定する。試料中に被検体が
存在していれば蛍光減衰カーブは変化する。試料中に被
検体が存在しない場合においては、２つの蛍光減衰カー
ブに有意の差はみられない。
した蛍光減衰カーブを比較検定する。試料中に被検体が
存在していれば蛍光減衰カーブは変化する。試料中に被
検体が存在しない場合においては、２つの蛍光減衰カー
ブに有意の差はみられない。
プローブ過剰条件における被検体の検出の検定 本発明に係わる検出用プローブおよび検出方法は、プ
ローブが被検体に対して大過剰である条件においても、
被検体の存在を高精度で検出可能とするものである。図
４に、検出用プローブとして、Bodipy/Cy5の蛍光色素の
組み合わせを用い、ハイブリッド体における蛍光色素が
結合している２つのヌクレオチド間が二本鎖構造をと
り、その間の塩基数が12であるものを使用したときの結
果を示す。これは、検出用プローブとターゲットDNAと
の濃度比を変化させたときの蛍光減衰カーブの変化を示
したものである。検出用プローブの濃度を一定にし、タ
ーゲットDNAをモル比で０％（ターゲットDNAを加えない
もの）,1％,3％,5％,20％となるように加えた。図４か
ら明らかなように、検出用プローブがターゲット核酸に
対し100倍量過剰であっても、十分に有意の差を示す蛍
光減衰カーブが得られる。
ローブが被検体に対して大過剰である条件においても、
被検体の存在を高精度で検出可能とするものである。図
４に、検出用プローブとして、Bodipy/Cy5の蛍光色素の
組み合わせを用い、ハイブリッド体における蛍光色素が
結合している２つのヌクレオチド間が二本鎖構造をと
り、その間の塩基数が12であるものを使用したときの結
果を示す。これは、検出用プローブとターゲットDNAと
の濃度比を変化させたときの蛍光減衰カーブの変化を示
したものである。検出用プローブの濃度を一定にし、タ
ーゲットDNAをモル比で０％（ターゲットDNAを加えない
もの）,1％,3％,5％,20％となるように加えた。図４か
ら明らかなように、検出用プローブがターゲット核酸に
対し100倍量過剰であっても、十分に有意の差を示す蛍
光減衰カーブが得られる。
図４であらわされた蛍光減衰カーブの変化の検定を定
量的に行う方法の一例を以下に示す（表３）。蛍光減衰
カーブにおいて、パルス励起光照射後１−９ナノ秒の時
間域の蛍光強度の値を用いて、蛍光寿命τを求める。ま
た、そのときの測定のバラツキの大きさ（測定を同一条
件で多数回行ったときの測定値の分布の標準偏差）を求
める。
量的に行う方法の一例を以下に示す（表３）。蛍光減衰
カーブにおいて、パルス励起光照射後１−９ナノ秒の時
間域の蛍光強度の値を用いて、蛍光寿命τを求める。ま
た、そのときの測定のバラツキの大きさ（測定を同一条
件で多数回行ったときの測定値の分布の標準偏差）を求
める。
τ＝−Δt/（ln（D1/D0）） D0:1−５ナノ秒の時間域における蛍光量 D1:5−９ナノ秒の時間域における蛍光量 Δｔ＝4ns σ＝τｘ（−ln（D1/D0））／（1/D0＋1/D1）1/2 ２つの蛍光減衰カーブの差（ここでは、ターゲット核
酸が含まれていない試料（コントロール）の減衰カーブ
との差）の検定は、Δτ／σΔτをパラメータとして行
う。
酸が含まれていない試料（コントロール）の減衰カーブ
との差）の検定は、Δτ／σΔτをパラメータとして行
う。
ここで、 Δτ（蛍光寿命の差）＝τ（ターゲットDNAを含む試料）−τ（コントロール） σΔτ＝（σ（ターゲットDNAを含む試料）２＋σ（コントロール）２）1/2 Δτ／σΔτは２つの蛍光減衰カーブの差の識別のS/N
をあらわしており、その値が大きいほど高精度でターゲ
ットDNAの存在の検定が可能であることを意味してい
る。
をあらわしており、その値が大きいほど高精度でターゲ
ットDNAの存在の検定が可能であることを意味してい
る。
蛍光スペクトル測定による被検体の検出法との比較 蛍光減衰カーブの測定にもとづく本方法は、従来の蛍
光スペクトル変化の測定にもとづく方法と比較して、検
出用プローブ過剰の条件での被検体の検出において、数
十倍以上の高い検定精度をもつ。図５は、図４と同じ試
料の蛍光スペクトル変化を示したものである。
光スペクトル変化の測定にもとづく方法と比較して、検
出用プローブ過剰の条件での被検体の検出において、数
十倍以上の高い検定精度をもつ。図５は、図４と同じ試
料の蛍光スペクトル変化を示したものである。
蛍光スペクトルの変化の大きさは、Bodipy 493/503の
蛍光の極大波長（517nm）での蛍光強度（Id）とCy5の蛍
光の極大波長（667nm）での蛍光強度（Ia）との比率Ia/
Id、またはBodipyの蛍光の波長域（例えば510−560nm）
での蛍光強度とCy5の蛍光強度の波長域（例えば650−70
0nm）での蛍光強度の比率、によりあらわすことができ
る。このとき、２つの蛍光スペクトルの差の識別のS/N
はΔI/σΔＩであらわされる。
蛍光の極大波長（517nm）での蛍光強度（Id）とCy5の蛍
光の極大波長（667nm）での蛍光強度（Ia）との比率Ia/
Id、またはBodipyの蛍光の波長域（例えば510−560nm）
での蛍光強度とCy5の蛍光強度の波長域（例えば650−70
0nm）での蛍光強度の比率、によりあらわすことができ
る。このとき、２つの蛍光スペクトルの差の識別のS/N
はΔI/σΔＩであらわされる。
ΔＩ＝Ia/Ib（ターゲットDNAを含む試料） −Ia/Ib（コントロール） σΔＩ＝（σ（ターゲットDNAを含む試料）２ ＋σ（コントロール）２）1/2 σ＝（Ia/Ib）ｘ（1/Id＋1/Ia）1/2 表３と表４の数値の比較から、蛍光減衰カーブを利用
する検出方法（時間分解法）が、蛍光スペクトルを用い
る方法と比べて、検出用プローブが被検体に対して過剰
に存在する試料においては大きな優位性をもつことがわ
かる。特に、被検体に対して検出用プローブがより過剰
になるにしたがって、時間分解法の優位性がより大きく
なることがわかる。
する検出方法（時間分解法）が、蛍光スペクトルを用い
る方法と比べて、検出用プローブが被検体に対して過剰
に存在する試料においては大きな優位性をもつことがわ
かる。特に、被検体に対して検出用プローブがより過剰
になるにしたがって、時間分解法の優位性がより大きく
なることがわかる。
図36は、本発明に係わる種々の検出用プローブおよび
検出方法を用いてRNAを検出した一例である。被検体がD
NAである図４の結果と同様に、検出用プローブが被検体
であるRNAに対して過剰に存在している試料において
も、RNAの存在量に対応して蛍光減衰カーブが遅くなっ
ていることがわかる（詳細は実施例の項参照）。
検出方法を用いてRNAを検出した一例である。被検体がD
NAである図４の結果と同様に、検出用プローブが被検体
であるRNAに対して過剰に存在している試料において
も、RNAの存在量に対応して蛍光減衰カーブが遅くなっ
ていることがわかる（詳細は実施例の項参照）。
検出用プローブのオリゴヌクレオチド部がホスホロチ
オエート型オリゴヌクレオチドである場合にも本検出用
プローブおよび本検出方法は有効である。
オエート型オリゴヌクレオチドである場合にも本検出用
プローブおよび本検出方法は有効である。
図38は、ホスホロチオエート型オリオヌクレオチド
（Ｓ−オリゴ）を検出用プローブとして用い、RNAを検
出した一例を示す。図４、図36の結果と同様に、検出用
プローブが被検体であるRNAに対して過剰に存在してい
る試料においても、RNAの存在量に対応して蛍光減衰カ
ーブが遅くなっていくことがわかる（詳細は実施例の項
参照）。
（Ｓ−オリゴ）を検出用プローブとして用い、RNAを検
出した一例を示す。図４、図36の結果と同様に、検出用
プローブが被検体であるRNAに対して過剰に存在してい
る試料においても、RNAの存在量に対応して蛍光減衰カ
ーブが遅くなっていくことがわかる（詳細は実施例の項
参照）。
本発明に係わるプローブの応用 本発明に係わる検出用プローブおよびこれを用いた検
出方法が検出可能とするものは、被検体たる核酸の検出
に限定されるものではない。例えば、核酸の一次構造上
の変化（核酸の組込み、逆位、欠失など）を高感度で精
度よく検出することも可能である。
出方法が検出可能とするものは、被検体たる核酸の検出
に限定されるものではない。例えば、核酸の一次構造上
の変化（核酸の組込み、逆位、欠失など）を高感度で精
度よく検出することも可能である。
例えば、DNAの特定部位への他のDNA断片の組み込みを
検出するときには、図6Aに示されるように、DNA上で２
つのプローブがハイブリダイズする位置を、DNA断片が
組み込まれる部位の両側とする。DNA断片が組み込まれ
ていないときには、２つのプローブは隣接してハイブリ
ダイズしているためエネルギー移動がおきるが、組み込
みがおこると２つのプローブは離れた部位にハイブリダ
イズすることになるためエネルギー移動効率が低下し、
蛍光減衰カーブが変化する。また、図6Bに示されるよう
に、一方のプローブとして、組み込まれるDNA断片にハ
イブリダイズするものを使用すると、組み込みがおきる
と２つのプローブが隣接してハイブリダイズし、エネル
ギー移動がおきる。DNAの特定部位への他のDNA断片の組
み込みは、遺伝子のクローニングの操作において、ベク
ターに目的のDNA断片を組み込むときなどに利用される
が、本発明に係わる検出用プローブおよび検出方法を使
用すれば、試料に検出用プローブを加えた後に、未結合
プローブの分離や洗浄の操作を必要としないで、組み込
みがおこなわれていることを簡便に検出することが可能
である。
検出するときには、図6Aに示されるように、DNA上で２
つのプローブがハイブリダイズする位置を、DNA断片が
組み込まれる部位の両側とする。DNA断片が組み込まれ
ていないときには、２つのプローブは隣接してハイブリ
ダイズしているためエネルギー移動がおきるが、組み込
みがおこると２つのプローブは離れた部位にハイブリダ
イズすることになるためエネルギー移動効率が低下し、
蛍光減衰カーブが変化する。また、図6Bに示されるよう
に、一方のプローブとして、組み込まれるDNA断片にハ
イブリダイズするものを使用すると、組み込みがおきる
と２つのプローブが隣接してハイブリダイズし、エネル
ギー移動がおきる。DNAの特定部位への他のDNA断片の組
み込みは、遺伝子のクローニングの操作において、ベク
ターに目的のDNA断片を組み込むときなどに利用される
が、本発明に係わる検出用プローブおよび検出方法を使
用すれば、試料に検出用プローブを加えた後に、未結合
プローブの分離や洗浄の操作を必要としないで、組み込
みがおこなわれていることを簡便に検出することが可能
である。
また、外来遺伝子をベクターに組み込むときに、その
方向性が問題となることがある。図７に示されるよう
に、組み込むDNA断片の一方の端に一方のプローブがハ
イブリダイズするように設定すると、ある方向に組み込
まれたとき（図７上、順方向とする）にはエネルギー移
動がおこり、逆の方向に組み込まれたとき（図７下、逆
方向）にはエネルギー移動がおこらない。
方向性が問題となることがある。図７に示されるよう
に、組み込むDNA断片の一方の端に一方のプローブがハ
イブリダイズするように設定すると、ある方向に組み込
まれたとき（図７上、順方向とする）にはエネルギー移
動がおこり、逆の方向に組み込まれたとき（図７下、逆
方向）にはエネルギー移動がおこらない。
また、ある大きさのDNA断片が取り除かれることがあ
る（欠失）。ある種の遺伝子疾患では、特定の部位のDN
A断片の欠失が遺伝子病の原因となっている。また、細
胞の核のなかにおいて、スプライシング反応によりメッ
センジャーRNAがつくられるときには、特定部位のRNA断
片（イントロン）が取り除かれている。図８に示される
ように、取り除かれる核酸の断片に一方のプローブがハ
イブリダイズするように設定すれば、これらの反応を検
出することが可能である。
る（欠失）。ある種の遺伝子疾患では、特定の部位のDN
A断片の欠失が遺伝子病の原因となっている。また、細
胞の核のなかにおいて、スプライシング反応によりメッ
センジャーRNAがつくられるときには、特定部位のRNA断
片（イントロン）が取り除かれている。図８に示される
ように、取り除かれる核酸の断片に一方のプローブがハ
イブリダイズするように設定すれば、これらの反応を検
出することが可能である。
実施例１ 1.検出用プローブ 種々の蛍光色素で標識された種々のオリゴDNAを合成
し、これらを被検体であるDNAにハイブリダイズさせ
た。ハイブリッド体を分離精製した後、蛍光スペクトル
および蛍光減衰カーブを測定した。
し、これらを被検体であるDNAにハイブリダイズさせ
た。ハイブリッド体を分離精製した後、蛍光スペクトル
および蛍光減衰カーブを測定した。
（１）プローブの合成 以下の塩基配列をもつオリゴDNAを、DNA/RNAシンセサ
イザー（Perk in Elmer:Model 394またはPerseptive:Mo
del 18909）を用いて、βシアノエチルアミダイト法に
より合成した。
イザー（Perk in Elmer:Model 394またはPerseptive:Mo
del 18909）を用いて、βシアノエチルアミダイト法に
より合成した。
上記プローブN1−N7で、ＸはUni−Link AminoModifie
r（CLONTECH Laboratories Inc.Code No.CL5190−１）
を示す。
r（CLONTECH Laboratories Inc.Code No.CL5190−１）
を示す。
上記プローブN8−N10で、ＸはUni−Link AminoModifi
erを示す。
erを示す。
N11:5′−XAGCGCGCAATTAACCC−３′ 上記プローブN11で、Ｘは、６−（トリフルオロアセ
チルアミノ）ヘキシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ、
Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホロアミダイト（TFAcヘキ
サノールアミンリンカー、パーキンエルマージャパン:C
at No.400808）を示す。
チルアミノ）ヘキシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ、
Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホロアミダイト（TFAcヘキ
サノールアミンリンカー、パーキンエルマージャパン:C
at No.400808）を示す。
上記プローブN12−N17で、Ｘは、TFAcヘキサノールア
ミンリンカーを示す。
ミンリンカーを示す。
それぞれ得られた反応物を、イオン交換高速液体クロ
マトグラフで分離し、主ピークを分取した。イオン交換
高速液体クロマトグラフに用いた条件は、東ソー社製カ
ラム、TSK−GEL DEAE−2WS（4.6mm内径2x50mm全長）を
使用し、流速0.8ml/分、温度40度、移動相はHCOOHNH4勾
配−20％CH3CNであり、260nmの吸収で検出した。HCOOHN
H4勾配は、Ａ液:0.2M HCOOHNH4、Ｂ液:1M HCOOHNH4の２
つの溶液の混合比を変えることで作成した。Ｂ液の比
率:35％−85％/20分の勾配を使用した。
マトグラフで分離し、主ピークを分取した。イオン交換
高速液体クロマトグラフに用いた条件は、東ソー社製カ
ラム、TSK−GEL DEAE−2WS（4.6mm内径2x50mm全長）を
使用し、流速0.8ml/分、温度40度、移動相はHCOOHNH4勾
配−20％CH3CNであり、260nmの吸収で検出した。HCOOHN
H4勾配は、Ａ液:0.2M HCOOHNH4、Ｂ液:1M HCOOHNH4の２
つの溶液の混合比を変えることで作成した。Ｂ液の比
率:35％−85％/20分の勾配を使用した。
分取した液を脱塩した後、凍結乾燥した。
（オリゴDNAのBodipy 493/503標識） オリゴDNA（N8、N9、N10、N11）をBodipy 493/503色
素で標識した。
素で標識した。
NHSS（Ｎ−Hydroxysulfosuccinimide,Sodium Salt）
2.5mgを30μｌの滅菌水に、EDAC（１−Ethyl−３−（３
−dimethylaminopropyl）carbodiimide）5mgを50μｌの
滅菌水にそれぞれ溶解した。これらと、Bodipy 493/503
プロピオン酸1mgを50μlDMFに溶解したものを混合し、
室温で30分間反応させた。得られた溶液を、乾固したオ
リゴDNAを0.5M Na2CO3/NaHCO3緩衝液（pH9.3）300μｌ
に溶解したものと混合し、遮光して一晩反応させた。反
応液をゲル濾過して未反応の色素を除去した後、逆相高
速液体クロマトグラフにより反応物を精製した。逆相高
速液体クロマトグラフに用いた条件は、資生堂社製カラ
ム、CAPCELL PAKC18（6mm内径x250mm全長）を使用し、
流速1ml/分、温度40度、移動相はCH3CN勾配−5mMTEAA、
であり、260nmの吸収で検出した。CH3CN勾配は、Ａ液:5
％CH3CN、Ｂ液:40％CH3CNの２つの溶液の混合比を変え
ることで作成した。Ｂ液の比率:30％−80％/20分の勾配
を使用した。分取したピークの吸収スペクトルを測定
し、260nmの吸収と蛍光色素の吸収（493nm）を確認し
た。これらを凍結乾燥して保存した。
2.5mgを30μｌの滅菌水に、EDAC（１−Ethyl−３−（３
−dimethylaminopropyl）carbodiimide）5mgを50μｌの
滅菌水にそれぞれ溶解した。これらと、Bodipy 493/503
プロピオン酸1mgを50μlDMFに溶解したものを混合し、
室温で30分間反応させた。得られた溶液を、乾固したオ
リゴDNAを0.5M Na2CO3/NaHCO3緩衝液（pH9.3）300μｌ
に溶解したものと混合し、遮光して一晩反応させた。反
応液をゲル濾過して未反応の色素を除去した後、逆相高
速液体クロマトグラフにより反応物を精製した。逆相高
速液体クロマトグラフに用いた条件は、資生堂社製カラ
ム、CAPCELL PAKC18（6mm内径x250mm全長）を使用し、
流速1ml/分、温度40度、移動相はCH3CN勾配−5mMTEAA、
であり、260nmの吸収で検出した。CH3CN勾配は、Ａ液:5
％CH3CN、Ｂ液:40％CH3CNの２つの溶液の混合比を変え
ることで作成した。Ｂ液の比率:30％−80％/20分の勾配
を使用した。分取したピークの吸収スペクトルを測定
し、260nmの吸収と蛍光色素の吸収（493nm）を確認し
た。これらを凍結乾燥して保存した。
（オリゴDNAのFITC標識） オリゴDNA（N11、N12、N13、N14、N15、N17）をFITC
（fluorescein isothiocyanate）（Molecular Probes）
色素で標識した。
（fluorescein isothiocyanate）（Molecular Probes）
色素で標識した。
FITC1.5mgをDMF150μｌに溶解した。これを、乾固し
たオリゴDNAを0.5M Na2CO3/NaHCO3緩衝液（pH9.3）300
μｌに溶解した溶液と混合し、遮光して一晩反応させ
た。反応液をゲル濾過して未反応の色素を除去した後、
逆相高速液体クロマトグラフにより反応物を精製した。
逆相高速液体クロマトグラフに用いた条件は、資生堂社
製カラム、CAPCELL PAKC18（6mm内径x250mm全長）を使
用し、流速1ml/分、温度40度、移動相はCH3CN勾配−5mM
TEAA、であり、260nmの吸収で検出した。CH3CN勾配は、
Ａ液:5％CH3CN、Ｂ液:40％CH3CNの２つの溶液の混合比
を変えることで作成した。Ｂ液の比率:15％−65％/20分
の勾配を使用した。分取したピークの吸収スペクトルを
測定し、260nmの吸収と蛍光色素の吸収（495nm）を確認
した。これらを凍結乾燥して保存した。
たオリゴDNAを0.5M Na2CO3/NaHCO3緩衝液（pH9.3）300
μｌに溶解した溶液と混合し、遮光して一晩反応させ
た。反応液をゲル濾過して未反応の色素を除去した後、
逆相高速液体クロマトグラフにより反応物を精製した。
逆相高速液体クロマトグラフに用いた条件は、資生堂社
製カラム、CAPCELL PAKC18（6mm内径x250mm全長）を使
用し、流速1ml/分、温度40度、移動相はCH3CN勾配−5mM
TEAA、であり、260nmの吸収で検出した。CH3CN勾配は、
Ａ液:5％CH3CN、Ｂ液:40％CH3CNの２つの溶液の混合比
を変えることで作成した。Ｂ液の比率:15％−65％/20分
の勾配を使用した。分取したピークの吸収スペクトルを
測定し、260nmの吸収と蛍光色素の吸収（495nm）を確認
した。これらを凍結乾燥して保存した。
上記でＸは、リンカーを介してFITCが結合したもので
ある。
ある。
（オリゴDNAのXRITC標識） オリゴDNA（N11）をXRITC（rhodamine X isothiocyan
ate）（Molecular Probes）色素で標識した。
ate）（Molecular Probes）色素で標識した。
XRITC1.5mgをDMF150μｌに溶解した。これを、乾固し
たオリゴDNAを0.5M Na2CO3/NaHCO3緩衝液（pH9.3）300
μｌに溶解した溶液と混合し、遮光して一晩反応させ
た。反応液をゲル濾過して未反応の色素を除去した後、
逆相高速液体クロマトグラフにより反応物を精製した。
逆相高速液体クロマトグラフに用いた条件は、資生堂社
製カラム、CAPCELL PAKC18（6mm内径x250mm全長）を使
用し、流速1ml/分、温度40度、移動相はCH3CN勾配−5mM
TEAA、であり、260nmの吸収で検出した。CH3CN勾配は、
Ａ液:5％CH3CN、Ｂ液:40％CH3CNの２つの溶液の混合比
を変えることで作成した。Ｂ液の比率:30％−80％/20分
の勾配を使用した。分取したピークの吸収スペクトルを
測定し、260nmの吸収と蛍光色素の吸収（570nm）を確認
した。これらを凍結乾燥して保存した。
たオリゴDNAを0.5M Na2CO3/NaHCO3緩衝液（pH9.3）300
μｌに溶解した溶液と混合し、遮光して一晩反応させ
た。反応液をゲル濾過して未反応の色素を除去した後、
逆相高速液体クロマトグラフにより反応物を精製した。
逆相高速液体クロマトグラフに用いた条件は、資生堂社
製カラム、CAPCELL PAKC18（6mm内径x250mm全長）を使
用し、流速1ml/分、温度40度、移動相はCH3CN勾配−5mM
TEAA、であり、260nmの吸収で検出した。CH3CN勾配は、
Ａ液:5％CH3CN、Ｂ液:40％CH3CNの２つの溶液の混合比
を変えることで作成した。Ｂ液の比率:30％−80％/20分
の勾配を使用した。分取したピークの吸収スペクトルを
測定し、260nmの吸収と蛍光色素の吸収（570nm）を確認
した。これらを凍結乾燥して保存した。
上記でＸは、リンカーを介してXRITCが結合したもの
である。
である。
（オリゴDNAのCy3標識） オリゴDNA（N11）をCy3色素で標識した。
１チューブのCy3色素（Amersham、FluoroLink Cat.N
o.PA23001）を100μｌの滅菌水に溶解した。これを、乾
固したオリゴDNAを0.5M Na2CO3/NaHCO3緩衝液（pH9.3）
200μｌに溶解した溶液と混合し、遮光して一晩反応さ
せた。反応液をゲル濾過して未反応の色素を除去した
後、逆相高速液体クロマトグラフにより反応物を精製し
た。逆相高速液体クロマトグラフに用いた条件は、資生
堂社製カラム、CAPCELL PAKC18（6mm内径x250mm全長）
を使用し、流速1ml/分、温度40度、移動相はCH3CN勾配
−5mMTEAA、であり、260nmの吸収で検出した。CH3CN勾
配は、Ａ液:5％CH3CN、Ｂ液:40％CH3CNの２つの溶液の
混合比を変えることで作成した。Ｂ液の比率:15％−60
％/20分の勾配を使用した。分取したピークの吸収スペ
クトルを測定し、260nmの吸収と蛍光色素の吸収（550n
m）を確認した。これらを凍結乾燥して保存した。
o.PA23001）を100μｌの滅菌水に溶解した。これを、乾
固したオリゴDNAを0.5M Na2CO3/NaHCO3緩衝液（pH9.3）
200μｌに溶解した溶液と混合し、遮光して一晩反応さ
せた。反応液をゲル濾過して未反応の色素を除去した
後、逆相高速液体クロマトグラフにより反応物を精製し
た。逆相高速液体クロマトグラフに用いた条件は、資生
堂社製カラム、CAPCELL PAKC18（6mm内径x250mm全長）
を使用し、流速1ml/分、温度40度、移動相はCH3CN勾配
−5mMTEAA、であり、260nmの吸収で検出した。CH3CN勾
配は、Ａ液:5％CH3CN、Ｂ液:40％CH3CNの２つの溶液の
混合比を変えることで作成した。Ｂ液の比率:15％−60
％/20分の勾配を使用した。分取したピークの吸収スペ
クトルを測定し、260nmの吸収と蛍光色素の吸収（550n
m）を確認した。これらを凍結乾燥して保存した。
上記でＸは、リンカーを介してCy3が結合したもので
ある。
ある。
（オリゴDNAのCy3.5標識） オリゴDNA（N3、N6、N16）をCy3.5色素で標識した。
１チューブのCy3.5色素（Amersham、FluoroLink Cat.
No.PA23501）を100μｌの滅菌水に溶解した。これを、
乾固したオリゴDNAを0.5M Na2CO3/NaHCO3緩衝液（pH9.
3）200μｌに溶解した溶液と混合し、遮光して一晩反応
させた。反応液をゲル濾過して未反応の色素を除去した
後、逆相高速液体クロマトグラフにより反応物を精製し
た。逆相高速液体クロマトグラフに用いた条件は、資生
堂社製カラム、CAPCELL PAKC18（6mm内径x250mm全長）
を使用し、流速1ml/分、温度40度、移動相はCH3CN勾配
−5mMTEAA、であり、260nmの吸収で検出した。CH3CN勾
配は、Ａ液:5％CH3CN、Ｂ液:40％CH3CNの２つの溶液の
混合比を変えることで作成した。Ｂ液の比率:15％−60
％/20分の勾配を使用した。分取したピークの吸収スペ
クトルを測定し、260nmの吸収と蛍光色素の吸収（581n
m）を確認した。これらを凍結乾燥して保存した。
No.PA23501）を100μｌの滅菌水に溶解した。これを、
乾固したオリゴDNAを0.5M Na2CO3/NaHCO3緩衝液（pH9.
3）200μｌに溶解した溶液と混合し、遮光して一晩反応
させた。反応液をゲル濾過して未反応の色素を除去した
後、逆相高速液体クロマトグラフにより反応物を精製し
た。逆相高速液体クロマトグラフに用いた条件は、資生
堂社製カラム、CAPCELL PAKC18（6mm内径x250mm全長）
を使用し、流速1ml/分、温度40度、移動相はCH3CN勾配
−5mMTEAA、であり、260nmの吸収で検出した。CH3CN勾
配は、Ａ液:5％CH3CN、Ｂ液:40％CH3CNの２つの溶液の
混合比を変えることで作成した。Ｂ液の比率:15％−60
％/20分の勾配を使用した。分取したピークの吸収スペ
クトルを測定し、260nmの吸収と蛍光色素の吸収（581n
m）を確認した。これらを凍結乾燥して保存した。
上記でＸは、リンカーを介してCy3.5が結合したもの
である。
である。
（オリゴDNAのCy5標識） オリゴDNA（N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N11、N1
7）をCy5色素で標識した。
7）をCy5色素で標識した。
１チューブのCy5色素（Amersham、FluoroLink Cat.N
o.PA25001）を100μｌの滅菌水に溶解した。これを、乾
固したオリゴDNAを0.5M Na2CO3/NaHCO3緩衝液（pH9.3）
200μｌに溶解した溶液と混合し、遮光して一晩反応さ
せた。反応液をゲル濾過して未反応の色素を除去した
後、逆相高速液体クロマトグラフにより反応物を精製し
た。逆相高速液体クロマトグラフに用いた条件は、資生
堂社製カラム、CAPCELL PAKC18（6mm内径x250mm全長）
を使用し、流速1ml/分、温度40度、移動相はCH3CN勾配
−5mMTEAA、であり、260nmの吸収で検出した。CH3CN勾
配は、Ａ液:5％CH3CN、Ｂ液:40％CH3CNの２つの溶液の
混合比を変えることで作成した。Ｂ液の比率:15％−60
％/20分の勾配を使用した。分取したピークの吸収スペ
クトルを測定し、260nmの吸収と蛍光色素の吸収（649n
m）を確認した。これらを凍結乾燥して保存した。
o.PA25001）を100μｌの滅菌水に溶解した。これを、乾
固したオリゴDNAを0.5M Na2CO3/NaHCO3緩衝液（pH9.3）
200μｌに溶解した溶液と混合し、遮光して一晩反応さ
せた。反応液をゲル濾過して未反応の色素を除去した
後、逆相高速液体クロマトグラフにより反応物を精製し
た。逆相高速液体クロマトグラフに用いた条件は、資生
堂社製カラム、CAPCELL PAKC18（6mm内径x250mm全長）
を使用し、流速1ml/分、温度40度、移動相はCH3CN勾配
−5mMTEAA、であり、260nmの吸収で検出した。CH3CN勾
配は、Ａ液:5％CH3CN、Ｂ液:40％CH3CNの２つの溶液の
混合比を変えることで作成した。Ｂ液の比率:15％−60
％/20分の勾配を使用した。分取したピークの吸収スペ
クトルを測定し、260nmの吸収と蛍光色素の吸収（649n
m）を確認した。これらを凍結乾燥して保存した。
上記でＸは、リンカーを介してCy5が結合したもので
ある。
ある。
（２）被検体DNAの合成 以下の塩基配列をもつオリゴDNAを、DNA/RNAシンセサ
イザー（Perk in Elmer:Model 394またはPerseptive:Mo
del 18909）を用いて、βシアノエチルアミダイト法に
より合成した。
イザー（Perk in Elmer:Model 394またはPerseptive:Mo
del 18909）を用いて、βシアノエチルアミダイト法に
より合成した。
それぞれ得られた反応物を、イオン交換高速液体クロ
マトグラフで分離し、主ピークを分取した。イオン交換
高速液体クロマトグラフに用いた条件は、東ソー社製カ
ラム、TSK−GEL DEAE−2WS（4.6mm内径x250mm全長）を
使用し、流速0.8ml/分、温度40度、移動相はHCOOHNH4勾
配−20％CH3CNであり、260nmの吸収で検出した。HCOOHN
H4勾配は、Ａ液:0.2M HCOOHNH4、Ｂ液:1M HCOOHNH4の２
つの溶液の混合比を変えることで作成した。Ｂ液の比
率:35％−85％/20分の勾配を使用した。
マトグラフで分離し、主ピークを分取した。イオン交換
高速液体クロマトグラフに用いた条件は、東ソー社製カ
ラム、TSK−GEL DEAE−2WS（4.6mm内径x250mm全長）を
使用し、流速0.8ml/分、温度40度、移動相はHCOOHNH4勾
配−20％CH3CNであり、260nmの吸収で検出した。HCOOHN
H4勾配は、Ａ液:0.2M HCOOHNH4、Ｂ液:1M HCOOHNH4の２
つの溶液の混合比を変えることで作成した。Ｂ液の比
率:35％−85％/20分の勾配を使用した。
分取した液を脱塩した後、凍結乾燥して保存した。
（３）検出用プローブと被検体DNAとのハイブリッド体
の形成、および高速液体クロマトグラフによるハイブリ
ッド体の分離 ドナープローブとアクセプタープローブからなる一組
の検出用プローブ40pmol（ドナープローブ、アクセプタ
ープローブ各々40pmol）と被検体DNA40pmolとを、10mM
Tris−HCl pH7.4,140mM NaCl 10μｌ中で室温で５分間
混合して、ハイブリダイゼーションさせた。その後、イ
オン交換高速液体クロマトグラフ（イオン交換HPLC）に
より、ハイブリッド体を分離した。イオン交換高速液体
クロマトグラフに用いた条件は、東ソー社製カラム、TS
K−GEL DEAE−NPRを使用し、流速1ml/分、室温、移動
相はNaCl勾配−20mM Tris−HCl（pH9.5）であり、260nm
の吸収および蛍光強度（励起波長：ドナー色素の吸収極
大の波長、蛍光検出の波長：アクセプター色素の蛍光の
極大波長）で検出した。NaCl勾配は、Ａ液:20mM Tris−
HCl（pH9.5）、Ｂ液:20mM Tris−HCl（pH9.5）、1M NaC
lの２つの溶液の混合比を変えることで作成し、以下に
示す条件を使用した。
の形成、および高速液体クロマトグラフによるハイブリ
ッド体の分離 ドナープローブとアクセプタープローブからなる一組
の検出用プローブ40pmol（ドナープローブ、アクセプタ
ープローブ各々40pmol）と被検体DNA40pmolとを、10mM
Tris−HCl pH7.4,140mM NaCl 10μｌ中で室温で５分間
混合して、ハイブリダイゼーションさせた。その後、イ
オン交換高速液体クロマトグラフ（イオン交換HPLC）に
より、ハイブリッド体を分離した。イオン交換高速液体
クロマトグラフに用いた条件は、東ソー社製カラム、TS
K−GEL DEAE−NPRを使用し、流速1ml/分、室温、移動
相はNaCl勾配−20mM Tris−HCl（pH9.5）であり、260nm
の吸収および蛍光強度（励起波長：ドナー色素の吸収極
大の波長、蛍光検出の波長：アクセプター色素の蛍光の
極大波長）で検出した。NaCl勾配は、Ａ液:20mM Tris−
HCl（pH9.5）、Ｂ液:20mM Tris−HCl（pH9.5）、1M NaC
lの２つの溶液の混合比を変えることで作成し、以下に
示す条件を使用した。
0− 2分 Ｂ液の比率 25％−45％のグラジエント 2−12分 Ｂ液の比率 45％−55％のグラジエント 12−13分 Ｂ液の比率 55％−100％のグラジエント クロマトグラフにおいて、強い蛍光があらわれるピー
クをハイブリッド体のピークと同定した（エネルギー移
動がおきたときにのみ強い蛍光が観測される）。強い蛍
光をもつピークは、個々のプローブの流出位置よりも、
クロマトグラフ上で長い保持時間をもつ位置に流出し
た。
クをハイブリッド体のピークと同定した（エネルギー移
動がおきたときにのみ強い蛍光が観測される）。強い蛍
光をもつピークは、個々のプローブの流出位置よりも、
クロマトグラフ上で長い保持時間をもつ位置に流出し
た。
取得したHPLC分画の蛍光スペクトルを測定し（蛍光分
光光度計：日立製作所、Ｆ−4500）、エネルギー移動が
おきていることを確認した。
光光度計：日立製作所、Ｆ−4500）、エネルギー移動が
おきていることを確認した。
（４）ハイブリッド体の蛍光減衰カーブの測定 高速液体クロマトグラフで分離精製したハイブリッド
体の蛍光減衰カーブを測定した。
体の蛍光減衰カーブを測定した。
ピコ秒蛍光寿命測定装置 C4780（浜松ホトニクス） 励起光源 １ アルゴンレーザー励起チタンサファイアレーザー
（スペクトラフィジックス） アルゴンイオンレーザー モデル2080 モードロックチタンサファイアレーザー TSUNAMI フリークエンシーダブラー／パルスセレクター モ
デル3980 ２ 窒素−色素レーザー（レーザーホトニスク） 窒素レーザー モデルLN1200 色素 COUMARIN307 （ａ）ドナー蛍光色素をBodipy 493/503、アクセプター
蛍光色素をCy5とし、ハイブリッド体における蛍光色素
が結合している２つのヌクレオチド間の構造を二本鎖と
し、ハイブリッド体における蛍光色素間の塩基数（ｎ）
をｎ＝４、８、10、12、14、としたときの、アクセプタ
ーの蛍光波長域（650−700nm）の蛍光減衰カーブ。
（スペクトラフィジックス） アルゴンイオンレーザー モデル2080 モードロックチタンサファイアレーザー TSUNAMI フリークエンシーダブラー／パルスセレクター モ
デル3980 ２ 窒素−色素レーザー（レーザーホトニスク） 窒素レーザー モデルLN1200 色素 COUMARIN307 （ａ）ドナー蛍光色素をBodipy 493/503、アクセプター
蛍光色素をCy5とし、ハイブリッド体における蛍光色素
が結合している２つのヌクレオチド間の構造を二本鎖と
し、ハイブリッド体における蛍光色素間の塩基数（ｎ）
をｎ＝４、８、10、12、14、としたときの、アクセプタ
ーの蛍光波長域（650−700nm）の蛍光減衰カーブ。
Bodipy 493/503はドナープローブにおいて５′末端の
位置に、Cy5はアクセプタープローブにおいて中間部に
標識されている。
位置に、Cy5はアクセプタープローブにおいて中間部に
標識されている。
励起光：チタンファイアレーザー 480nm（図９−図1
3） 窒素−色素レーザー 490nm（図14） 蛍光の測定波長域:650−700nm 「BP0/Cy510」は、BP0 40pmolとCy510 40pmolを、20m
M Tris−HCl pH7.4、0.5M NaCl、200μｌに溶かした試
料である。
3） 窒素−色素レーザー 490nm（図14） 蛍光の測定波長域:650−700nm 「BP0/Cy510」は、BP0 40pmolとCy510 40pmolを、20m
M Tris−HCl pH7.4、0.5M NaCl、200μｌに溶かした試
料である。
（ｂ）ドナー蛍光色素をBodipy 493/503、アクセプター
蛍光色素をCy5とし、ハイブリッド体における蛍光色素
間の塩基数（ｎ）をｎ＝10とし、ハイブリッド体におけ
る蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間の構造
を二本鎖と一本鎖の混合としたときの、アクセプターの
蛍光波長域（650−700nm）の蛍光減衰カーブ。Bodipy 4
93/503はドナープローブにおいて５′末端の位置に、Cy
5はアクセプタープローブにおいて中間部に標識されて
いる。
蛍光色素をCy5とし、ハイブリッド体における蛍光色素
間の塩基数（ｎ）をｎ＝10とし、ハイブリッド体におけ
る蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間の構造
を二本鎖と一本鎖の混合としたときの、アクセプターの
蛍光波長域（650−700nm）の蛍光減衰カーブ。Bodipy 4
93/503はドナープローブにおいて５′末端の位置に、Cy
5はアクセプタープローブにおいて中間部に標識されて
いる。
励起光：チタンサファイアレーザー 480nm（図19） 窒素−色素レーザー 490nm（図15−図18） 蛍光の測定波長域:650−700nm 「BP0/Cy510」は、BP0 40pmolとCy510 40pmolを、20m
M Tris−HCl pH9.5、0.5M NaCl、200μｌに溶かした試
料である。
M Tris−HCl pH9.5、0.5M NaCl、200μｌに溶かした試
料である。
（ｃ）ドナー蛍光色素をBodipy 493/503、アクセプター
蛍光色素をCy5とし、ハイブリッド体における蛍光色素
間の塩基数（ｎ）をｎ＝10とし、ハイブリッド体におけ
る蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間の構造
を二本鎖とし、ハイブリッド体において一方の蛍光色素
（ここではBodipy 493/503）の標識位置がハイブリッド
体における「切れ目（２つのプローブが隣り合う部
位）」の位置に対して、０（プローブの末端部位）、
１、２、４塩基離れた位置になるときのアクセプターの
蛍光波長域（650−700nm）の蛍光減衰カーブ。Bodipy 4
93/503はドナープローブにおいて５′末端の位置（BP
0）または中間部（BP1、BP2、BP4）に、Cy5はアクセプ
タープローブにおいて中間部に標識されている。
蛍光色素をCy5とし、ハイブリッド体における蛍光色素
間の塩基数（ｎ）をｎ＝10とし、ハイブリッド体におけ
る蛍光色素が結合している２つのヌクレオチド間の構造
を二本鎖とし、ハイブリッド体において一方の蛍光色素
（ここではBodipy 493/503）の標識位置がハイブリッド
体における「切れ目（２つのプローブが隣り合う部
位）」の位置に対して、０（プローブの末端部位）、
１、２、４塩基離れた位置になるときのアクセプターの
蛍光波長域（650−700nm）の蛍光減衰カーブ。Bodipy 4
93/503はドナープローブにおいて５′末端の位置（BP
0）または中間部（BP1、BP2、BP4）に、Cy5はアクセプ
タープローブにおいて中間部に標識されている。
励起光：チタンサファイアレーザー 480nm（図24） 窒素−色素レーザー 490nm（図20−図23） 蛍光の測定波長域:650−700nm BP0/Cy510」は、BP0 40pmolとCy510 40pmolを、20mM
Tris−HCl pH9.5、0.5M NaCl、200μｌに溶かした試料
である。
Tris−HCl pH9.5、0.5M NaCl、200μｌに溶かした試料
である。
（ｄ）ドナー蛍光色素をBodipy 493/503、アクセプター
蛍光色素をCy3.5とし、ハイブリッド体における蛍光色
素が結合している２つのヌクレオチド間の構造を二本鎖
とし、ハイブリッド体における蛍光色素間の塩基数
（ｎ）をｎ＝８、12、16、としたときの、アクセプター
の蛍光波長域（600−650nm）の蛍光減衰カーブ。
蛍光色素をCy3.5とし、ハイブリッド体における蛍光色
素が結合している２つのヌクレオチド間の構造を二本鎖
とし、ハイブリッド体における蛍光色素間の塩基数
（ｎ）をｎ＝８、12、16、としたときの、アクセプター
の蛍光波長域（600−650nm）の蛍光減衰カーブ。
励起光：チタンサファイアレーザー 480nm 蛍光の測定波長域:600−650nm 「BP0/Cy3512」は、BP0 40pmolとCy3512 40pmolを、2
0mM Tris−HCl pH9.5、0.5M NaCl、200μｌに溶かした
試料である。
0mM Tris−HCl pH9.5、0.5M NaCl、200μｌに溶かした
試料である。
（ｅ）ドナー蛍光色素をFITC、アクセプター蛍光色素を
Cy5とし、ハイブリッド体における蛍光色素が結合して
いる２つのヌクレオチド間の構造を二本鎖とし、ハイブ
リッド体における蛍光色素間の塩基数（ｎ）をｎ＝10、
12としたときの、アクセプターの蛍光波長域（650−700
nm）の蛍光減衰カーブ。
Cy5とし、ハイブリッド体における蛍光色素が結合して
いる２つのヌクレオチド間の構造を二本鎖とし、ハイブ
リッド体における蛍光色素間の塩基数（ｎ）をｎ＝10、
12としたときの、アクセプターの蛍光波長域（650−700
nm）の蛍光減衰カーブ。
ハイブリッド体の蛍光減衰カーブ ハイブリッド体、5F10/5Cy5/T0、5F12/5Cy5/T0の蛍光
減衰カーブを測定した。また、コントロールとして「5F
10 40pmolと5Cy5 40pmolを、20mM Tris−HCl pH9.5、0.
5M NaCl、200μｌに溶かした試料」の蛍光減衰カーブを
測定した。ハイブリッド体形成にともなう蛍光減衰カー
ブの遅れは認められるが顕著ではない（図示はされてい
ない）。
減衰カーブを測定した。また、コントロールとして「5F
10 40pmolと5Cy5 40pmolを、20mM Tris−HCl pH9.5、0.
5M NaCl、200μｌに溶かした試料」の蛍光減衰カーブを
測定した。ハイブリッド体形成にともなう蛍光減衰カー
ブの遅れは認められるが顕著ではない（図示はされてい
ない）。
励起光：窒素−色素レーザー 490nm 蛍光の測定波長域:650−700nm （ｆ）ドナー蛍光色素をFITC、アクセプター蛍光色素を
Cy5とし、ハイブリッド体における蛍光色素が結合して
いる２つのヌクレオチド間の構造を一本鎖とし、ハイブ
リッド体における蛍光色素間の塩基数（ｎ）をｎ＝12、
15、20としたときの、アクセプターの蛍光波長域（650
−700nm）の蛍光減衰カーブ。
Cy5とし、ハイブリッド体における蛍光色素が結合して
いる２つのヌクレオチド間の構造を一本鎖とし、ハイブ
リッド体における蛍光色素間の塩基数（ｎ）をｎ＝12、
15、20としたときの、アクセプターの蛍光波長域（650
−700nm）の蛍光減衰カーブ。
ハイブリッド体の蛍光減衰カーブ ハイブリッド体、5F/3Cy5/T12、5F/3Cy5/T15、5F/3Cy
5/T20、の蛍光減衰カーブを測定した。また、コントロ
ールとして「5F 40pmolと3Cy5 40pmolを、20mM Tris−H
Cl pH9.5、0.5M NaCl、200μｌに溶かした試料」の蛍光
減衰カーブを測定した。ハイブリッド体形成にともなう
蛍光減衰カーブの遅れはあまり認められなかった（図示
はされていない）。
5/T20、の蛍光減衰カーブを測定した。また、コントロ
ールとして「5F 40pmolと3Cy5 40pmolを、20mM Tris−H
Cl pH9.5、0.5M NaCl、200μｌに溶かした試料」の蛍光
減衰カーブを測定した。ハイブリッド体形成にともなう
蛍光減衰カーブの遅れはあまり認められなかった（図示
はされていない）。
励起光：チタンサファイアレーザー 480nm 蛍光の測定波長域:650−700nm （ｇ）ドナー蛍光色素をFITC、アクセプター蛍光色素を
Cy3とし、ハイブリッド体における蛍光色素が結合して
いる２つのヌクレオチド間の構造を一本鎖とし、ハイブ
リッド体における蛍光色素間の塩基数（ｎ）をｎ＝12、
15、20としたときの、アクセプターの蛍光波長域（580
−630nm）の蛍光減衰カーブ。
Cy3とし、ハイブリッド体における蛍光色素が結合して
いる２つのヌクレオチド間の構造を一本鎖とし、ハイブ
リッド体における蛍光色素間の塩基数（ｎ）をｎ＝12、
15、20としたときの、アクセプターの蛍光波長域（580
−630nm）の蛍光減衰カーブ。
ハイブリッド体の蛍光減衰カーブ ハイブリッド体、3F/5Cy3/T12、3F/5Cy3/T15、3F/5Cy
3/T20、の蛍光減衰カーブを測定した。また、コントロ
ールとして「3F 40pmolと5Cy3 40pmolを、20mM Tris−H
Cl pH9.5、0.5M NaCl、200μｌに溶かした試料」の蛍光
減衰カーブを測定した。ハイブリッド体形成にともなう
蛍光減衰カーブの遅れはあまり認められなかった（図示
はされていない）。
3/T20、の蛍光減衰カーブを測定した。また、コントロ
ールとして「3F 40pmolと5Cy3 40pmolを、20mM Tris−H
Cl pH9.5、0.5M NaCl、200μｌに溶かした試料」の蛍光
減衰カーブを測定した。ハイブリッド体形成にともなう
蛍光減衰カーブの遅れはあまり認められなかった（図示
はされていない）。
励起光：チタンサファイアレーザー 480nm 蛍光の測定波長域:580−630nm （ｈ）ドナー蛍光色素をFITC、アクセプター蛍光色素を
Cy3とし、ハイブリッド体における蛍光色素が結合して
いる２つのヌクレオチド間の構造を二本鎖とし、ハイブ
リッド体における蛍光色素間の塩基数（ｎ）をｎ＝10、
13、15、としたときの、アクセプターの蛍光波長域（58
0−630nm）の蛍光減衰カーブ。
Cy3とし、ハイブリッド体における蛍光色素が結合して
いる２つのヌクレオチド間の構造を二本鎖とし、ハイブ
リッド体における蛍光色素間の塩基数（ｎ）をｎ＝10、
13、15、としたときの、アクセプターの蛍光波長域（58
0−630nm）の蛍光減衰カーブ。
ハイブリッド体の蛍光減衰カーブ ハイブリッド体、5F10/5Cy3/T0、5F/5Cy3/T0、5F15/5
Cy3/T0、の蛍光減衰カーブを測定した。また、コントロ
ールとして「5F10 40pmolと5Cy3 40pmolを、20mM Tris
−HCl pH9.5、0.5M NaCl、200μｌに溶かした試料」の
蛍光減衰カーブを測定した。ハイブリッド体形成にとも
なう蛍光減衰カーブの遅れはあまり認められなかった
（図示はされていない）。
Cy3/T0、の蛍光減衰カーブを測定した。また、コントロ
ールとして「5F10 40pmolと5Cy3 40pmolを、20mM Tris
−HCl pH9.5、0.5M NaCl、200μｌに溶かした試料」の
蛍光減衰カーブを測定した。ハイブリッド体形成にとも
なう蛍光減衰カーブの遅れはあまり認められなかった
（図示はされていない）。
励起光：チタンサファイアレーザー 480nm 蛍光の測定波長域:580−630nm （ｉ）ドナー蛍光色素をFITC、アクセプター蛍光色素を
XRITCとし、ハイブリッド体における蛍光色素が結合し
ている２つのヌクレオチド間の構造を二本鎖とし、ハイ
ブリッド体における蛍光色素間の塩基数（ｎ）をｎ＝15
としたときの、アクセプターの蛍光波長域（600−650n
m）の蛍光減衰カーブ。
XRITCとし、ハイブリッド体における蛍光色素が結合し
ている２つのヌクレオチド間の構造を二本鎖とし、ハイ
ブリッド体における蛍光色素間の塩基数（ｎ）をｎ＝15
としたときの、アクセプターの蛍光波長域（600−650n
m）の蛍光減衰カーブ。
ハイブリッド体の蛍光減衰カーブ ハイブリッド体、
5F15/5R16/T0の蛍光減衰カーブを測定した。また、コン
トロールとして「5F15 40pmolと5R16 40pmolを、20mM T
ris−HCl pH9.5、0.5M NaCl、200μｌに溶かした試料」
の蛍光減衰カーブを測定した。ハイブリッド体形成にと
もなう蛍光減衰カーブの遅れはあまり認められなかった
（図示はされていない）。
5F15/5R16/T0の蛍光減衰カーブを測定した。また、コン
トロールとして「5F15 40pmolと5R16 40pmolを、20mM T
ris−HCl pH9.5、0.5M NaCl、200μｌに溶かした試料」
の蛍光減衰カーブを測定した。ハイブリッド体形成にと
もなう蛍光減衰カーブの遅れはあまり認められなかった
（図示はされていない）。
励起光：チタンサファイアレーザー 480nm 蛍光の測定波長域:600−650nm （ｊ）ドナー蛍光色素をFITC、アクセプター蛍光色素を
XRITCとし、ハイブリッド体における蛍光色素が結合し
ている２つのヌクレオチド間の構造を一本鎖とし、ハイ
ブリッド体における蛍光色素間の塩基数（ｎ）をｎ＝
４、８、12、15、20、としたときの、アクセプターの蛍
光波長域（600−650nm）の蛍光減衰カーブ。
XRITCとし、ハイブリッド体における蛍光色素が結合し
ている２つのヌクレオチド間の構造を一本鎖とし、ハイ
ブリッド体における蛍光色素間の塩基数（ｎ）をｎ＝
４、８、12、15、20、としたときの、アクセプターの蛍
光波長域（600−650nm）の蛍光減衰カーブ。
この試料については、高速液体クロマトグラフで分離
することなく、プローブと被検体DNAを混合した試料に
おいて、蛍光減衰カーブを測定した。また、コントロー
ルとして「3F 40pmolと5R16 40pmolを、20mM Tris−HCl
pH9.5、0.5M NaCl、200μｌに溶かした試料」の蛍光減
衰カーブを測定した。ハイブリッド体形成にともなう蛍
光減衰カーブの遅れはあまり認められなかった（図示は
されていない）。
することなく、プローブと被検体DNAを混合した試料に
おいて、蛍光減衰カーブを測定した。また、コントロー
ルとして「3F 40pmolと5R16 40pmolを、20mM Tris−HCl
pH9.5、0.5M NaCl、200μｌに溶かした試料」の蛍光減
衰カーブを測定した。ハイブリッド体形成にともなう蛍
光減衰カーブの遅れはあまり認められなかった（図示は
されていない）。
励起光：チタンサファイアレーザー 480nm 蛍光の測定波長域:600−650nm ドナープローブ アクセプタープローブ 被検体DNA 3F 5R16 T4 3F 5R16 T8 3F 5R16 T12 3F 5R16 T15 3F 5R16 T20 （ｋ）ドナー蛍光色素をBodipy 493/503、アクセプター
蛍光色素をCy5とし、ハイブリッド体における蛍光色素
が結合している２つのヌクレオチド間の構造を一本鎖と
し、ハイブリッド体における蛍光色素間の塩基数（ｎ）
をｎ＝４、８、10、12、15、20、としたときの、アクセ
プターの蛍光波長域（650−700nm）の蛍光減衰カーブ。
蛍光色素をCy5とし、ハイブリッド体における蛍光色素
が結合している２つのヌクレオチド間の構造を一本鎖と
し、ハイブリッド体における蛍光色素間の塩基数（ｎ）
をｎ＝４、８、10、12、15、20、としたときの、アクセ
プターの蛍光波長域（650−700nm）の蛍光減衰カーブ。
Bodipy 493/503はドナープローブにおいて５′末端の
位置に、Cy5はアクセプタープローブにおいて３′末端
に標識されている。
位置に、Cy5はアクセプタープローブにおいて３′末端
に標識されている。
（図35は、BP0 40pmolとCy510 40pmolを、20mM Tris−H
Cl pH9.5、0.5M NaCl、200μｌに溶かした試料の蛍光減
衰カーブである。） 励起光：チタンサファイアレーザー 480nm（図29−
図34） 窒素−色素レーザー 490nm（図35） 蛍光の測定波長域:650−700nm 2.検出用プローブが被検体に対して過剰に存在する試料
における被検体の検出 （１）プローブの合成 以下の塩基配列をもつ蛍光標識オリゴDNAおよび蛍光
標識ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチド（Ｓ−オ
リゴ）を、前記「1.検出用プローブ、（１）検出用プロ
ーブの合成」の項で示された手順にしたがって合成し
た。
Cl pH9.5、0.5M NaCl、200μｌに溶かした試料の蛍光減
衰カーブである。） 励起光：チタンサファイアレーザー 480nm（図29−
図34） 窒素−色素レーザー 490nm（図35） 蛍光の測定波長域:650−700nm 2.検出用プローブが被検体に対して過剰に存在する試料
における被検体の検出 （１）プローブの合成 以下の塩基配列をもつ蛍光標識オリゴDNAおよび蛍光
標識ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチド（Ｓ−オ
リゴ）を、前記「1.検出用プローブ、（１）検出用プロ
ーブの合成」の項で示された手順にしたがって合成し
た。
Bodipy493/503標識オリゴDNA 上記BP0およびD1で、ＸはBodipy493/503が結合してい
る位置をあらわす。
る位置をあらわす。
Bodipy493/503標識Ｓ−オリゴ 上記D2で、Ｘは、Bodipy493/503が結合している位置
をあらわす。
をあらわす。
Cy5標識オリゴDNA 上記Cy512およびA1で、ＸはCy5が結合している位置を
あらわす。
あらわす。
Cy5標識Ｓ−オリゴ 上記A2で、ＸはCy5の結合位置をあらわす。
（２）被検体DNA、被検体RNAの合成 以下の塩基配列をもつ被検体DNAおよび被検体RNAを、
前記「1.検出用プローブ、（２）被検体DNAの合成」の
項で示された手順に準じて合成した。
前記「1.検出用プローブ、（２）被検体DNAの合成」の
項で示された手順に準じて合成した。
被検体DNA（T0） 被検体RNA（RT1） （３）測定用試料の作製および蛍光スペクトル、蛍光減
衰カーブの測定 ドナープローブとアクセプタープローブからなる一組
の検出用プローブ（ドナープローブ、アクセプタープロ
ーブ各々200pmol）と種々の量の被検体とを、200μｌの
1xSSC緩衝液（15mM Na3citrate pH7.0、150mM NaCl）中
で混合して、室温で10分間反応させた。その後、蛍光ス
ペクトルおよび蛍光減衰カーブを測定した。
衰カーブの測定 ドナープローブとアクセプタープローブからなる一組
の検出用プローブ（ドナープローブ、アクセプタープロ
ーブ各々200pmol）と種々の量の被検体とを、200μｌの
1xSSC緩衝液（15mM Na3citrate pH7.0、150mM NaCl）中
で混合して、室温で10分間反応させた。その後、蛍光ス
ペクトルおよび蛍光減衰カーブを測定した。
蛍光スペクトルの測定 蛍光分光光度計：日立製作所 Ｆ−4500 励起波長:490nm 蛍光スペクトルの測定波長:500−750nm 蛍光減衰カーブの測定 ピコ秒蛍光寿命測定装置 C4780（浜松ホトニクス） 励起光源 １ アルゴンレーザー励起チタンサファイアレーザー
（スペクトラフィジックス） アルゴンイオンレーザー モデル2080 モードロックチタンサファイアレーザー TSUNAMI フリークエンシーダブラー／パルスセレクター モ
デル3980 ２ 窒素−色素レーザー（レーザーホトニクス） 窒素レーザー モデルLN1200 色素 COUMARIN307 蛍光を測定する波長域:650−700nm （ａ）検出用プローブとして、「Bodipy 493/503をドナ
ー蛍光色素とし、Cy5をアクセプター蛍光色素として、
ハイブリッド体を形成したときの蛍光色素が結合してい
る２つのヌクレオチド間が二本鎖構造をとり、塩基間数
が12（ｎ＝12）であり、Bodipy493/503がハイブリッド
体の切れ目の位置にあるヌクレオチドに結合している」
一組のオリゴDNAを使用し、被検体としてDNAを検出す
る。
（スペクトラフィジックス） アルゴンイオンレーザー モデル2080 モードロックチタンサファイアレーザー TSUNAMI フリークエンシーダブラー／パルスセレクター モ
デル3980 ２ 窒素−色素レーザー（レーザーホトニクス） 窒素レーザー モデルLN1200 色素 COUMARIN307 蛍光を測定する波長域:650−700nm （ａ）検出用プローブとして、「Bodipy 493/503をドナ
ー蛍光色素とし、Cy5をアクセプター蛍光色素として、
ハイブリッド体を形成したときの蛍光色素が結合してい
る２つのヌクレオチド間が二本鎖構造をとり、塩基間数
が12（ｎ＝12）であり、Bodipy493/503がハイブリッド
体の切れ目の位置にあるヌクレオチドに結合している」
一組のオリゴDNAを使用し、被検体としてDNAを検出す
る。
図４から明らかなように、被検体DNAの量が増えるに
つれて、減衰カーブは遅くなっていく。図中で１の減衰
カーブ（被検体が含まれていない試料）と２の減衰カー
ブ（被検体DNAが含まれており、その存在量がプローブ
に対して１％（モル比）である試料）は明瞭に識別可能
であり、検出用プローブが被検体の100倍量過剰に存在
していても、被検体の検出が可能である。
つれて、減衰カーブは遅くなっていく。図中で１の減衰
カーブ（被検体が含まれていない試料）と２の減衰カー
ブ（被検体DNAが含まれており、その存在量がプローブ
に対して１％（モル比）である試料）は明瞭に識別可能
であり、検出用プローブが被検体の100倍量過剰に存在
していても、被検体の検出が可能である。
蛍光スペクトルでは１−３のスペクトルは実質的に識
別不能であり、１と４のスペクトルの変化を識別するこ
とも困難である。
別不能であり、１と４のスペクトルの変化を識別するこ
とも困難である。
（ｂ）検出用プローブとして、「Bodipy 493/503をドナ
ー蛍光色素とし、Cy5をアクセプター蛍光色素として、
ハイブリッド体を形成したときの蛍光色素が結合してい
る２つのヌクレオチド間が二本鎖構造をとり、Bodipy 4
93/503がハイブリッド体の切れ目の位置にあるヌクレオ
チドに結合している」一組のオリゴDNAを使用し、被検
体としてRNAを検出する。
ー蛍光色素とし、Cy5をアクセプター蛍光色素として、
ハイブリッド体を形成したときの蛍光色素が結合してい
る２つのヌクレオチド間が二本鎖構造をとり、Bodipy 4
93/503がハイブリッド体の切れ目の位置にあるヌクレオ
チドに結合している」一組のオリゴDNAを使用し、被検
体としてRNAを検出する。
図36に示されているように、被検体RNAの量が増える
につれて、減衰カーブはより遅くなる。図から、検出用
プローブが被検体RNAよりも大過剰に存在している条件
において、被検体RNAの検出が可能であることが明らか
である。
につれて、減衰カーブはより遅くなる。図から、検出用
プローブが被検体RNAよりも大過剰に存在している条件
において、被検体RNAの検出が可能であることが明らか
である。
（ｃ）検出用プローブとして、「Bodipy 493/503をドナ
ー蛍光色素とし、Cy5をアクセプター蛍光色素として、
ハイブリッド体を形成したときの蛍光色素が結合してい
る２つのヌクレオチド間が二本鎖構造をとり、Bodipy 4
93/503がハイブリッド体の切れ目の位置にあるヌクレオ
チドに結合している」一組のホスホロチオエート型オリ
ゴヌクレオチド使用し、被検体としてRNAを検出する。
ー蛍光色素とし、Cy5をアクセプター蛍光色素として、
ハイブリッド体を形成したときの蛍光色素が結合してい
る２つのヌクレオチド間が二本鎖構造をとり、Bodipy 4
93/503がハイブリッド体の切れ目の位置にあるヌクレオ
チドに結合している」一組のホスホロチオエート型オリ
ゴヌクレオチド使用し、被検体としてRNAを検出する。
図38に示されているように、被検体RNAの量が増える
につれて、減衰カーブはより遅くなる。図から、検出用
プローブが被検体RNAよりも大過剰に存在している条件
において、被検体RNAの検出が可能であることが明らか
である。
につれて、減衰カーブはより遅くなる。図から、検出用
プローブが被検体RNAよりも大過剰に存在している条件
において、被検体RNAの検出が可能であることが明らか
である。
産業上の利用可能性 本発明は、検体試料中に含まれる特定の塩基配列をも
つDNAやRNAを、極めて簡便に、高精度・高感度に検出す
ることを可能とする検出用プローブおよび検出方法を開
発したものである。本発明の検出用プローブならびに検
出方法が、遺伝子診断、細胞診断などに適用されると、
大きな威力を発揮すると予想される。また、本発明の検
出用プローブならびに検出方法を遺伝子のクローニング
など遺伝子工学分野の実験手法に適用することにより、
当該分野の実験技術を大きく発展させることが期待され
る。
つDNAやRNAを、極めて簡便に、高精度・高感度に検出す
ることを可能とする検出用プローブおよび検出方法を開
発したものである。本発明の検出用プローブならびに検
出方法が、遺伝子診断、細胞診断などに適用されると、
大きな威力を発揮すると予想される。また、本発明の検
出用プローブならびに検出方法を遺伝子のクローニング
など遺伝子工学分野の実験手法に適用することにより、
当該分野の実験技術を大きく発展させることが期待され
る。
配列表 配列番号:1 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:2 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:3 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:4 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:5 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:6 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:7 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:8 配列の長さ:16 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:9 配列の長さ:16 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:10 配列の長さ:16 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:11 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:12 配列の長さ:11 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:13 配列の長さ:13 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:14 配列の長さ:14 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:15 配列の長さ:16 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:16 配列の長さ:18 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:17 配列の長さ:18 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:18 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:19 配列の長さ:16 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:20 配列の長さ:16 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:21 配列の長さ:16 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:22 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:23 配列の長さ:11 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:24 配列の長さ:13 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:25 配列の長さ:14 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:26 配列の長さ:16 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:27 配列の長さ:18 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:28 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:29 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:30 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:31 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:32 配列の長さ:18 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:33 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:34 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:35 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:36 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:37 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:38 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:39 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:40 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:41 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:42 配列の長さ:33 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:43 配列の長さ:35 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:44 配列の長さ:37 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:45 配列の長さ:39 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:46 配列の長さ:41 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:47 配列の長さ:43 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:48 配列の長さ:45 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:49 配列の長さ:47 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:50 配列の長さ:51 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:51 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:52 配列の長さ:16 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:53 配列の長さ:16 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチド（Ｓ−オリ
ゴ） 配列 配列番号:54 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:55 配列の長さ:16 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:56 配列の長さ:16 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチド（Ｓ−オリ
ゴ） 配列 配列番号:57 配列の長さ:33 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:58 配列の長さ:30 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列
ゴ） 配列 配列番号:54 配列の長さ:17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:55 配列の長さ:16 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:56 配列の長さ:16 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチド（Ｓ−オリ
ゴ） 配列 配列番号:57 配列の長さ:33 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列 配列番号:58 配列の長さ:30 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA 配列
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平３−17480（ＪＰ，Ａ) 国際公開96／25518（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/09 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (20)
- 【請求項１】特定のポリヌクレオチド塩基配列を有する
被検体を検出するための１組の検出用プローブであっ
て、 第１の蛍光色素分子が結合し、前記ポリヌクレオチド塩
基配列の一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配
列を有するドナープローブと、 第２の蛍光色素分子が結合し、前記ポリヌクレオチド塩
基配列の一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配
列を有するアクセプタープローブとからなり、 前記第１の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと前記
第２の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の塩基数
が４〜20であり、 前記ドナープローブの蛍光寿命が前記アクセプタープロ
ーブの蛍光寿命の７倍以上であり、 前記ドナープローブの蛍光スペクトルの極大波長と前記
アクセプタープローブの蛍光スペクトルの極大波長との
差が150nm以上であり、 前記ドナープローブと前記アクセプタープローブに基づ
く蛍光の減衰カーブが、前記ドナープローブと前記アク
セプタープローブと前記被検体とのハイブリッド体を形
成する際に有意に変化する検出用プローブ。 - 【請求項２】請求項１に記載の検出用プローブであっ
て、 前記第１の蛍光色素分子が4,4−ジフルオロ−４−ボロ
−3a、4a−ジアザ−ｓ−インダセン系蛍光団またはフル
オロセイン系蛍光団のいずれかであり、 かつ、前記第２の蛍光色素分子がインドシアニン系蛍光
団またはローダミン系蛍光団のいずれかである、前記検
出用プローブ。 - 【請求項３】特定のポリヌクレオチド塩基配列を有する
被検体を検出するための１組の検出用プローブであっ
て、 4,4−ジフルオロ−４−ボロ−3a、4a−ジアザ−ｓ−イ
ンダセン系蛍光団またはフルオロセイン系蛍光団のいず
れかである第１の蛍光色素分子が結合し、前記のポリヌ
クレオチド塩基配列の一部にハイブリダイズすることが
可能な塩基配列を有するドナープローブと、インドシア
ニン系蛍光団またはローダミン系蛍光団のいずれかであ
る第２の蛍光色素分子が結合し、前記ポリヌクレオチド
塩基配列の一部にハイブリダイズすることが可能な塩基
配列を有するアクセプタープローブとからなり、 前記第１の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと前記
第２の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の塩基数
が４〜20であり、 前記ドナープローブと前記アクセプタープローブに基づ
く蛍光の減衰カーブが、前記ドナープローブと前記アク
セプタープローブと前記被検体とのハイブリッド体を形
成する際に有意に変化する検出用プローブ。 - 【請求項４】請求項１または３のいずれかに記載の検出
用プローブであって、 前記第１の蛍光色素分子が4,4−ジフルオロ−４−ボロ
−3a、4a−ジアザ−ｓ−インダセン系蛍光団であり、か
つ、前記第２の蛍光色素分子がインドシアニン系蛍光団
である、前記検出用プローブ。 - 【請求項５】請求項１または３のいずれかに記載の検出
用プローブであって、 前記第１の蛍光色素分子がBodipy493/503であり、か
つ、前記第２の蛍光色素分子がCy5である、前記検出用
プローブ。 - 【請求項６】請求項１または３のいずれかに記載の検出
用プローブであって、 前記第１の蛍光色素分子がBodipy−TMRであり、かつ、
前記第２の蛍光色素分子がCy5.5である、前記検出用プ
ローブ。 - 【請求項７】請求項１または３のいずれかに記載の検出
用プローブであって、 前記第１の蛍光色素分子がBodipy−TRであり、かつ、前
記第２の蛍光色素分子がCy7である、前記検出用プロー
ブ。 - 【請求項８】請求項１〜７のいずれか１項に記載の検出
用プローブであって、 前記ハイブリッド体において、前記ドナープローブの前
記第１の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと、前記
アクセプタープローブの前記第２の蛍光色素分子が結合
するヌクレオチド間が２本鎖構造である、前記検出用プ
ローブ。 - 【請求項９】請求項１〜７のいずれか１項に記載の検出
用プローブであって、 前記１組の検出用プローブと被検体から形成されるハイ
ブリッド体において、ドナープローブとアクセプタープ
ローブが被検体にハイブリダイズして、前記第１の蛍光
色素分子が結合するヌクレオチドと前記第２の蛍光色素
分子が結合するヌクレオチド間の一部が２本鎖構造をと
ることを特徴とする前記検出用プローブ。 - 【請求項１０】請求項１〜７のいずれか１項に記載の検
出用プローブであって、 前記ハイブリッド体において、前記第１の蛍光色素分子
が結合するヌクレオチドと前記第２の蛍光色素分子が結
合するヌクレオチド間の塩基数が８〜16である、前記検
出用プローブ。 - 【請求項１１】特定のポリヌクレオチド塩基配列を有す
る被検体を検出する方法であって、 （１）第１の蛍光色素分子が結合し、前記のポリヌクレ
オチド塩基配列の一部にハイブリダイズすることが可能
な塩基配列を有するドナープローブと、第２の蛍光色素
分子が結合し、前記ポリヌクレオチド塩基配列の一部に
ハイブリダイズすることが可能な塩基配列を有するアク
セプタープローブとからなり、 前記第１の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと前記
第２の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の塩基数
が４〜20であり、 前記ドナープローブの蛍光寿命が前記アクセプタープロ
ーブの蛍光寿命の７倍以上であり、 前記ドナープローブの蛍光スペクトルの極大波長と前記
アクセプタープローブの蛍光スペクトルの極大波長との
差が150nm以上であることを特徴とする１組の検出用プ
ローブと、前記被検体からハイブリッド体を形成する第
１のステップと、 （２）前記ハイブリッド体の前記第２の蛍光色素に基づ
く蛍光波長域の蛍光強度の減衰カーブを測定する第２の
ステップと、 （３）前記１組の検出用プローブの前記第２の蛍光色素
に基づく蛍光波長域の蛍光強度の減衰カーブを測定する
第３のステップと、 （４）前記第２および第３のステップで得られる蛍光減
衰カーブの比較により前記ポリヌクレオチド塩基配列の
存在を検出する第４のステップと、 からなる方法。 - 【請求項１２】請求項11に記載の特定のポリヌクレオチ
ド塩基配列を有する被検体を検出する方法であって、 前記第１の蛍光色素分子が4,4−ジフルオロ−４−ボロ
−3a、4a−ジアザ−ｓ−インダセン系蛍光団またはフル
オロセイン系蛍光団のいずれかであり、かつ、前記第２
の蛍光分子がインドシアニン系蛍光団またはローダミン
系蛍光団である、前記方法。 - 【請求項１３】特定のポリヌクレオチド塩基配列を有す
る被検体を検出する方法であって、 （１）4,4−ジフルオロ−４−ボロ−3a、4a−ジアザ−
ｓ−インダセン系蛍光団またはフルオロセイン系蛍光団
のいずれかである第１の蛍光色素分子が結合し、前記の
ポリヌクレオチド塩基配列の一部にハイブリダイズする
ことが可能な塩基配列を有するドナープローブと、イン
ドシアニン系蛍光団またはローダミン系蛍光団のいずれ
かである第２の蛍光色素分子が結合し、前記ポリヌクレ
オチド塩基配列の一部にハイブリダイズすることが可能
な塩基配列を有するアクセプタープローブとからなり、
且つ、前記第１の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド
と前記第２の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の
塩基数が４〜20である１組の検出用プローブと、前記被
検体からハイブリッド体を形成する第１のステップと、 （２）前記ハイブリッド体の前記第２の蛍光色素に基づ
く蛍光波長域の蛍光強度の減衰カーブを測定する第２の
ステップと、 （３）前記１組の検出用プローブの前記第２の蛍光色素
に基づく蛍光波長域の蛍光強度の減衰カーブを測定する
第３のステップと、 （４）前記第２および第３のステップで得られる蛍光減
衰カーブの比較により前記ポリヌクレオチド塩基配列の
存在を検出する第４のステップとからなる方法。 - 【請求項１４】請求項11または13のいずれかに記載の方
法であって、 前記第１の蛍光色素分子が4,4−ジフルオロ−４−ボロ
−3a、4a−ジアザ−ｓ−インダセン系蛍光団であり、か
つ、前記第２の蛍光色素分子がインドシアニン系蛍光団
である、前記方法。 - 【請求項１５】請求項11または13のいずれかに記載の方
法であって、 前記第１の蛍光色素分子がBodipy493/503であり、か
つ、前記第２の蛍光色素分子がCy5である、前記方法。 - 【請求項１６】請求項11または13のいずれかに記載の方
法であって、 前記第１の蛍光色素分子がBodipy−TMRであり、かつ、
前記第２の蛍光色素分子がCy5.5である、前記方法。 - 【請求項１７】請求項11または13のいずれかに記載の方
法であって、 前記第１の蛍光色素分子がBodipy−TRであり、かつ、前
記第２の蛍光色素分子がCy7である、前記方法。 - 【請求項１８】請求項11〜17のいずれか１項に記載の方
法であって、 前記ハイブリッド体において、前記ドナープローブの前
記第１の蛍光分子が結合するヌクレオチドと、前記アク
セプタープローブの前記第２の蛍光分子が結合するヌク
レオチド間が２本鎖構造である、前記方法。 - 【請求項１９】請求項11〜17のいずれか１項に記載の方
法であって、 前記１組の検出用プローブと被検体から形成されるハイ
ブリッド体において、ドナープローブとアクセプタープ
ローブが被検体にハイブリダイズして、前記第１の蛍光
色素分子が結合するヌクレオチドと前記第２の蛍光色素
分子が結合するヌクレオチド間の一部が２本鎖構造をと
る、前記方法。 - 【請求項２０】請求項11〜17のいずれか１項に記載の方
法であって、 前記ハイブリッド体において、前記第１の蛍光色素分子
が結合するヌクレオチドと前記第２の蛍光色素分子が結
合するヌクレオチド間の塩基数が８〜16である、前記方
法。
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