CN112752844A

CN112752844A - 用于rna编辑的人工核酸

Info

Publication number: CN112752844A
Application number: CN201880096560.8A
Authority: CN
Inventors: J·维滕格尔; T·斯塔福德; P·瑞安特斯尼格; T·莫克利
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2021-05-04
Also published as: JP7347830B2; US20220073915A1; JP2021534732A; EP3814498A1; WO2020001793A1

Abstract

本发明涉及用于定点编辑目标RNA的人工核酸。具体地，本发明提供了能够通过利用内源性脱氨酶定点编辑内源性转录物的人工核酸。进一步，本发明提供了用于定点编辑目标RNA的人工核酸，其被化学修饰，具体是根据本文所述的修饰模式。本发明还包含编码所述人工核酸的载体和包含所述人工核酸的组合物。此外，本发明提供了人工核酸、组合物或载体用于定点编辑目标RNA或体外诊断的应用。另外，提供了本文所述的人工核酸、组合物或载体用作药物或用于诊断疾病或障碍。

Description

用于RNA编辑的人工核酸

技术领域

本发明涉及用于定点编辑目标RNA的人工核酸。具体地，本发明提供了能够通过利用内源性脱氨酶来定点编辑内源性转录物的人工核酸。进一步，本发明提供了用于定点编辑目标RNA的人工核酸，其被化学修饰，具体是根据本文所述的修饰模式进行化学修饰。本发明还包含编码所述人工核酸的载体和包含所述人工核酸的组合物。此外，本发明提供了人工核酸、组合物或载体用于定点编辑目标RNA或用于体外诊断的应用。另外，提供了本文所述的人工核酸、组合物或载体用作药物或用于诊断疾病或障碍。

背景技术

在常规基因治疗中，遗传信息通常在DNA水平上进行操作，从而永久改变基因组。根据应用，基因组的持续修饰可能是有利的，或可能意味着严重的风险。在这方面，靶向RNA而不是DNA代表了有吸引力的可选方法。当在RNA水平治疗对象时，基因表达的改变通常是可逆的、可调节的，并且通常还更有效。一方面，有限的作用持续时间还将限制与有害副作用有关的风险。另外，微调作用的可能性允许以时间和剂量依赖的方式连续调节治疗并控制副作用。此外，多种基因表达的操作在基因组水平上是不可行的或无效的，例如当基因缺失是致命的或容易被冗余的过程补偿时。例如，在RNA水平靶向信号传导网络似乎特别有吸引力。多种信号提示是必不可少的，或者其是非常冗余的，使得敲除(knockout)有时不导致清晰的表型，而敲低(knockdown)导致清晰的表型。

因此，对RNA靶向策略的工程化越来越感兴趣。一种这样的策略是RNA编辑。(A)腺苷到(I)肌苷RNA编辑是使转录组多样化的天然酶促机制。由于肌苷在生化上被解释为鸟苷，因此A-到-I编辑正式引入A-到-G突变，这可能导致氨基酸密码子、STAR和STOP密码子的重新编码，剪接的改变和miRNA活性的改变等等。将这种酶活性靶向选择转录物处的特定位点——称为定点RNA编辑的策略——对于疾病的治疗以及蛋白质和RNA功能的一般研究具有广阔的前景。研发了基于工程化脱氨酶的RNA编辑策略(参见，例如，Vogel，P.，Schneider，M.F.，Wettengel，J.，Stafforst，T.Improving Site-Directed RNA EditingIn Vitro and in Cell Culture by Chemical Modification of theGuideRNA.Angew.Chem.Int.Ed.53，6267-6271(2014)。然而，在治疗环境中，作用于RNA的广泛表达的内源性脱氨酶的利用将是最有吸引力的。通过仅给予寡核苷酸药物将允许将特定的突变引入转录组中，而无需异位表达任何(工程化)蛋白质。例如，Wettengel et al.(Wettengel，J.，Reautschnig，J.，Geisler，S.，Kahle，P.J.，Stafforst，T.Harnessinghuman ADAR2 for RNA repair-Recoding a PINK1 mutation rescuesmitophagy.Nucl.Acids Res.45，2797-2808(2017))报道了不需要人工蛋白质但采用细胞ADAR2的系统。此外，用于定点RNA编辑的寡核苷酸构建体描述于国际专利申请号WO 2016/097212和WO 2017/010556中。而且，德国专利DE 10 2015 012 522 B3描述了用于定点RNA编辑的引导RNA分子。

然而，本领域已知的策略遭受类似的问题：一方面，证明难以足够有效地募集脱氨酶，特别是内源性脱氨酶，以提供足够的RNA编辑。另一方面，有效的编辑通常伴随低特异性，例如整个转录组进行了大量脱目标编辑(脱靶编辑，off-target editings)。当应用已知的高活性突变体(hyperactive mutant)(Kuttan A，Bass BL：Mechanistic insightsinto editing-site specificity of ADARs.Proceedings of the National Academy ofSciences 2012，109：E3295-E3304)——本文称为E/Q以提高效率和密码子范围时，尤其如此。

因此，迫切需要允许高编辑产率和高特异性的RNA编辑策略。具体地，需要适合于募集内源性脱氨酶并且不导致脱目标编辑的化合物。

因此，本发明的目的是提供能够将脱氨酶，优选地内源性脱氨酶(例如腺苷脱氨酶)的化合物募集至要编辑的RNA目标。本发明的具体目的是提供适用于以高效和高特异性，具体是以降低的脱目标编辑率来编辑RNA目标的化合物。因此，应提供改进的RNA编辑方法，其允许在目标RNA中的特异性目标位点处进行高产率的RNA编辑，优选地在其它基因组位点处没有或具有减少的非特异性编辑。本发明的另一具体目的是提供优选地由上述优点表征的RNA编辑系统，其利用内源性脱氨酶。

所述目的的解决方案通过本文所述并且由权利要求限定的实施方式实现。

发明内容

用于定点RNA编辑的人工核酸

在第一方面，本发明涉及用于定点编辑目标RNA的新型人工核酸。具体地，本文提供了用于定点编辑目标RNA的人工核酸，该人工核酸包含：

a)靶向序列，其包含与目标RNA中的目标序列互补或部分互补的核酸序列，

和

b)用于募集脱氨酶的募集部分，

其中靶向序列包含至少一个核苷酸，其中核碱基被化学修饰，

和/或

其中靶向序列包含至少一个骨架修饰(backbone modification)。

发明人惊讶地发现，本文所述的人工核酸，具体是包含本文所定义的化学修饰的靶向序列的人工核酸能够将脱氨酶(具体是内源性脱氨酶)募集至RNA目标并且特异性地编辑在所述RNA中的目标位点处的核苷酸，优选腺苷或胞苷核苷酸。有利地，目标RNA由本文所述的人工核酸高效地编辑，因此提供了高产率的编辑的目标RNA。令人惊讶地，通过使用人工核酸实现增加的RNA编辑产率，但是仍可以避免不期望的脱目标编辑。因此，本文所述的人工核酸允许高效地以及高特异性地进行定点RNA编辑。发明人已发现，人工核酸适合于编辑多种转录物，例如持家基因的内源性mRNA以及疾病相关基因的内源性转录物(如STAT1或SERPINA1)。有利地，经证明根据本发明的系统适用于各种细胞，从永生细胞系和肿瘤细胞系至若干种原代人细胞。发明人进一步观察到，根据本发明的人工核酸还特别抗降解，例如在血清中。不希望被任何假设所束缚，相信本文所述的人工核酸的改善稳定性有助于上述有利作用。

如本文所用，短语“人工核酸(分子)”通常指代非天然存在的核酸。换言之，人工核酸分子可以是非天然核酸。这种人工核酸分子由于其单独的序列(其不是天然存在的)和/或由于其它修饰(例如核苷酸的结构修饰，其在此环境下不是天然存在的)而可以是非天然的。本文所用的人工核酸优选地与天然存在的核酸的区别在于至少一个核苷酸或至少一个核苷酸的修饰。人工核酸分子可以是DNA分子、RNA分子或包含DNA和RNA部分的杂化分子。在优选的实施方式中，人工核酸是RNA分子，其优选地包含一个或多个2’-脱氧核苷酸。具体地，本文所用的人工核酸可以包含(未修饰的或修饰的)核糖核苷酸和/或(未修饰的或修饰的)脱氧核苷酸。通常，可以通过基因工程方法设计和/或产生人工核酸，以相应于期望的人工核苷酸序列(异源序列)或具有本文所述的期望人工修饰模式的核酸序列。进一步，短语“人工核酸(分子)”不限于“一个单独的分子”，而是还可以指代相同分子的集合。因此，短语可以指代例如包含在样品中的多个相同分子。

在本发明的上下文中，短语“RNA编辑”指代通过脱氨反应将目标RNA中的核苷酸，优选腺苷或胞苷核苷酸转化为另一核苷酸的反应。此改变通常导致不同的基因产物，因为改变的核苷酸优选地导致密码子改变，从而导致例如将另一氨基酸掺入由RNA翻译的多肽或终止密码子的产生或缺失。具体地，目标RNA中的腺苷核苷酸通过脱氨作用(例如通过本文所述的腺苷脱氨酶)而转化为肌苷。在可选的实施方式中，目标RNA中的胞苷核苷酸转化为尿苷核苷酸。如本文所用，术语“目标RNA”通常指代经受编辑反应的RNA，其由本文所述的人工核酸支持。

通过本文所述的人工核酸实现的RNA编辑是进一步“定点的”，这意味着目标RNA中目标位点处的特定核苷酸被编辑，优选地不编辑或基本上不编辑其它核苷酸。通常，目标位点处的核苷酸被本文所述的人工核酸的靶向序列靶向，其中靶向序列优选地在生理条件下能够与目标序列进行特异性碱基配对。因此，在本发明的上下文中，通常关于核酸序列使用短语“目标序列”，其与人工核酸的靶向序列(至少部分)互补。目标序列包含目标位点，其中目标位点通常是要编辑的核苷酸，优选腺苷或胞苷核苷酸。在一些实施方式中，目标位点可以包含两个或更多个要编辑的核苷酸，其中这些核苷酸优选地彼此之间被至少一个，优选两个其它核苷酸隔开。如本文所用，术语“互补的”或“部分互补的”优选地指代核酸序列，由于其互补的核苷酸优选地在生理条件下能够进行特异性分子间碱基配对，优选沃森-克里克碱基配对。本文所用的术语“互补的”也可以指代反向互补序列。本文所述的人工核酸在本文中也可以被称为“反义寡核苷酸”或“ASO”，因为人工核酸通常在靶向序列中包含核酸序列，其代表目标RNA中的核酸序列的反义。因此，靶向序列优选地以序列特异性方式将募集部分和脱氨酶引导至目标RNA中的目标位点。在本发明的上下文中，还可以使用术语“引导RNA”以指代人工核酸，其优选地将脱氨酶功能引导至目标位点。

在本发明的上下文中，术语“募集部分”指代本文所述的人工核酸的部分，其募集脱氨酶并且通常与靶向序列共价连接。因此，“募集部分”将脱氨酶募集至目标RNA中的目标位点，其中目标RNA(和目标位点)优选地被靶向序列以序列特异性方式识别并结合。在某些实施方式中，募集部分包含至少一种能够募集脱氨酶的偶联剂或由其组成，其中脱氨酶包含与所述偶联剂结合的部分。募集脱氨酶的偶联剂通常与靶向序列共价连接。优选地，偶联剂与靶向序列的5’-末端或3’-末端连接。偶联剂还可以可选地与靶向序列的内部核苷酸(即不是5’-或3’-末端核苷酸)连接，例如通过与核苷酸变体或优选本文所述的修饰的核苷酸(如氨基胸苷)的连接。在进一步的实施方式中，募集部分包含能够与脱氨酶，优选与脱氨酶的双链(ds)RNA结合结构域特异性结合的核酸序列。所述募集部分的核酸序列通常与靶向序列的5’末端或3’末端，优选与靶向序列的5’末端共价连接。在某些实施方式中，本文所述的人工核酸包含本文所述的靶向序列和本文所述的至少两个募集部分。

在一些实施方式中，人工核酸包含增强人工核酸的细胞摄取的部分。优选地，增强细胞摄取的部分是三天线N-乙酰半乳糖胺(GalNAc3)，其优选地与人工核酸的3’末端或5’末端缀合。

根据本发明的人工核酸的长度不受限制，并且可以是例如寡核苷酸。如本文所用，术语“寡核苷酸”可以指代短核酸分子(例如6-mer或10-mer)以及更长的寡核苷酸(例如，包含100或甚至200个核苷酸的核酸分子)，其中寡核苷酸可以包含(未修饰的或修饰的)核糖核苷酸和/或(未修饰的或修饰的)脱氧核苷酸。根据优选的实施方式，人工核酸包含至少约15、优选地至少约20、更优选地至少约25、甚至更优选地至少约30、甚至更优选地至少约35、最优选地至少约40个核苷酸。可选地，人工核酸的长度在约10至约200个核苷酸、优选地约15至约100个核苷酸、更优选地约15至约70个核苷酸、最优选地约20至约70个核苷酸的范围内。

本文所述的人工核酸优选地是单链(ss)核酸分子。在优选的实施方式中，人工核酸是单链核酸，其在生理条件下包含双链(ds)区域。优选地，人工核酸是在募集部分内包含双链区域的单链核酸。

人工核酸的靶向序列通常包含与目标RNA中的核酸序列，优选地与目标位点处的核苷酸的紧邻5’的核酸序列和紧邻3’的核酸序列互补或至少部分互补的核酸序列。优选地，靶向序列包含与目标RNA中的核酸序列互补或至少60％、70％、80％、90％、95％或99％互补的核酸序列，其中目标RNA中的互补核酸序列包含目标位点，并且优选地包含至少10、至少12、至少15、至少18、至少20、至少22、至少25或至少30个核苷酸。优选地，具体在生理条件下，人工核酸的靶向序列作为基本上单链的核酸存在。

本文所述的人工核酸可以通过本领域已知的方法合成。优选地，优选如本文所述，化学合成或通过由合适的载体体外转录人工核酸。如果没有另外说明，本文提供的核酸序列从5’至3’印刷。换言之，本文印刷的核酸序列中的第一核苷酸残基——如果没有另外说明——是所述核酸序列的5’-末端。氨基酸序列——如果没有另外说明——从N-末端到C-末端印刷。

化学修饰

通常将根据本发明的人工核酸进行化学修饰。如本文所用，术语“化学修饰”优选地指代选自骨架修饰、糖修饰或碱基修饰(包括无碱基位点)的化学修饰。在本发明的上下文中，“化学修饰的核酸”可以指代包含至少一个化学修饰的核苷酸的核酸。

人工核酸优选地包含靶向序列，该靶向序列包含至少一个化学修饰的核苷酸。更优选地，靶向序列包含多个化学修饰的核苷酸，优选地产生本文所述的靶向序列的修饰模式。在可选的实施方式中，人工核酸包含募集部分，该募集部分包含能够特异性结合脱氨酶的核酸序列，其中募集部分包含至少一个化学修饰的核苷酸。在优选的实施方式中，募集部分中的核酸序列包含多个化学修饰的核苷酸，优选地产生本文所述的募集部分的核酸序列的修饰模式。根据特别优选的实施方式，人工核酸包含本文所述的化学修饰的靶向序列和募集部分，该募集部分包含本文所述的化学修饰的核酸序列。

总体上，本发明的人工核酸分子可以包含天然(＝天然存在的)核苷酸以及化学修饰的核苷酸。如本文所用，术语“核苷酸”总体上包含(未修饰的和修饰的)核糖核苷酸以及(未修饰的和修饰的)脱氧核苷酸。因此，术语“核苷酸”优选地指代腺苷、脱氧腺苷、鸟苷、脱氧鸟苷、5-甲氧基尿苷、胸苷、尿苷、脱氧尿苷、胞苷、脱氧胞苷或其变体。此外，在本文提及“核苷酸”的情况下，也优选地包含相应的核苷。

在此方面，核苷酸的“变体”通常是核苷酸的天然存在的或人工变体。因此，变体优选地是具有非天然存在的官能团的化学衍生的核苷酸，其优选地被添加至天然存在的核苷酸或从天然存在的核苷酸中缺失或替代核苷酸的天然存在的官能团。因此，在这种核苷酸变体中，可以修饰天然存在的核苷酸的每种组分，优选核糖核苷酸或脱氧核苷酸，即优选通过本文所述的修饰形成人工核酸的骨架的碱基组分、糖(核糖)组分和/或磷酸盐组分。因此。术语“(核苷酸、核糖核苷酸、脱氧核苷酸等的)变体”还包含优选如本文所述的化学修饰的核苷酸。

本文所用的化学修饰的核苷酸优选是鸟苷、尿苷、腺苷、胸苷和胞嘧啶的变体，包括但不限于已经例如通过乙酰化、甲基化、羟基化等化学改变的任何天然存在或非天然存在的鸟苷、尿苷、腺苷、胸苷或胞苷，包括1-甲基-腺苷、1-甲基-鸟苷、1-甲基-肌苷、2，2-二甲基-鸟苷、2，6-二氨基嘌呤、2′-氨基-2′-脱氧腺苷、2′-氨基-2′-脱氧胞苷、2′-氨基-2′-脱氧鸟苷、2′-氨基-2′-脱氧尿苷、2-氨基-6-氯嘌呤核苷、2-氨基嘌呤-核苷、2′-阿糖腺苷、2′-阿糖胞苷、2′-阿糖尿苷、2′-叠氮基-2′-脱氧腺苷、2′-叠氮基-2′-脱氧胞苷、2′-叠氮基-2′-脱氧鸟苷、2′-叠氮基-2′-脱氧尿苷、2-氯腺苷、2′-氟-2′-脱氧腺苷、2′-氟-2′-脱氧胞苷、2′-氟-2′-脱氧鸟苷、2′-氟-2′-脱氧尿苷、2′-氟胸苷、2-甲基-腺苷、2-甲基-鸟苷、2-甲基-硫-N6-异戊烯基-腺苷、2′-O-甲基-2-氨基腺苷、2′-O-甲基-2′-脱氧腺苷、2′-O-甲基-2′-脱氧胞苷、2′-O-甲基-2′-脱氧鸟苷、2′-O-甲基-2′-脱氧尿苷、2′-O-甲基-5-甲基尿苷、2′-O-甲基肌苷、2′-O-甲基假尿苷、2-硫胞苷、2-硫-胞苷、3-甲基-胞苷、4-乙酰基-胞苷、4-硫尿苷、5-(羧基羟甲基)-尿苷、5，6-二氢尿苷、5-氨基烯丙基胞苷、5-氨基烯丙基-脱氧尿苷、5-溴尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2-硫-尿嘧啶、5-羧甲基单甲基-尿嘧啶、5-氯-阿糖-胞嘧啶、5-氟-尿苷、5-碘尿苷、5-甲氧基羰基甲基-尿苷、5-甲氧基-尿苷、5-甲基-2-硫-尿苷、6-氮胞苷、6-氮尿苷、6-氯-7-脱氮-鸟苷、6-氯嘌呤核苷、6-巯基-鸟苷、6-甲基-巯基嘌呤-核苷、7-脱氮-2′-脱氧-鸟苷、7-脱氮腺苷、7-甲基-鸟苷、8-氮腺苷、8-溴-腺苷、8-溴-鸟苷、8-巯基-鸟苷、8-氧鸟苷、苯并咪唑-核苷、β-D-甘露糖基-辫苷(queosine)、二氢-尿苷、肌苷、N1-甲基腺苷、N6-([6-氨基己基]氨基甲酰基甲基)-腺苷、N6-异戊烯基-腺苷、N6-甲基-腺苷、N7-甲基-黄嘌呤核苷、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、嘌呤霉素、辫苷、尿嘧啶-5-氧乙酸、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、怀丁氧苷(wybutoxosine)、黄嘌呤核苷和木糖-腺苷(xylo-adenosine)。这种变体的制备是本领域技术人员已知的，例如美国专利US 4,373,071、US4,401,796、US 4,415,732、US 4,458,066、US 4,500,707、US 4,668,777、US 4,973,679、US5,047,524、US 5,132,418、US 5,153,319、US 5,262,530或5,700,642。

在一些实施方式中，本文所述的人工核酸包含至少一个化学修饰的核苷酸，选自2-氨基-6-氯嘌呤核苷-5′-三磷酸酯、2-氨基嘌呤-核苷-5′-三磷酸酯、2-氨基腺苷-5′-三磷酸酯、2′-氨基-2′-脱氧胞苷-三磷酸酯、2-硫胞苷-5′-三磷酸酯、2-硫尿苷-5′-三磷酸酯、2′-氟胸苷-5′-三磷酸酯、2′-O-甲基-肌苷-5′-三磷酸酯、4-硫尿苷-5′-三磷酸酯、5-氨基烯丙基胞苷-5′-三磷酸酯、5-氨基烯丙基尿苷-5′-三磷酸酯、5-溴胞苷-5′-三磷酸酯、5-溴尿苷-5′-三磷酸酯、5-溴-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸酯、5-溴-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸酯、5-碘胞苷-5′-三磷酸酯、5-碘-2′-脱氧胞苷-5’-三磷酸酯、5-碘尿苷-5′-三磷酸酯、5-碘-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸酯、5-甲基胞苷-5′-三磷酸酯、5-甲基尿苷-5′-三磷酸酯、5-丙炔基-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸酯、5-丙炔基-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸酯、6-氮胞苷-5′-三磷酸酯、6-氮尿苷-5′-三磷酸酯、6-氯嘌呤核苷-5′-三磷酸酯、7-脱氮腺苷-5′-三磷酸酯、7-脱氮鸟苷-5′-三磷酸酯、8-氮腺苷-5′-三磷酸酯、8-叠氮基腺苷-5′-三磷酸酯、苯并咪唑-核苷-5′-三磷酸酯、N1-甲基腺苷-5′-三磷酸酯、N1-甲基鸟苷-5′-三磷酸酯、N6-甲基腺苷-5′-三磷酸酯、O6-甲基鸟苷-5′-三磷酸酯、假尿苷-5′-三磷酸酯、嘌呤霉素-5′-三磷酸酯或黄嘌呤核苷-5′-三磷酸酯。

在一些实施方式中，本文所述的人工核酸包含至少一个化学修饰的核苷酸，选自吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮-尿苷、2-硫-5-氮-尿苷、2-硫尿苷、4-硫-假尿苷、2-硫-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫-1-甲基-假尿苷、2-硫-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫-二氢尿苷、2-硫-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、和4-甲氧基-2-硫-假尿苷。

在一些实施方式中，本文所述的人工核酸包含至少一个化学修饰的核苷酸，选自5-氮-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫-胞苷、2-硫-5-甲基-胞苷、4-硫-假异胞苷、4-硫-1-甲基-假异胞苷、4-硫-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉林(zebularine)、5-氮-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮-2-硫-泽布拉林、2-硫-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷和4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷。

在其它实施方式中，本文所述的人工核酸包含至少一个化学修饰的核苷酸，选自2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2，6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮-2，6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式羟基异戊烯基)腺苷、2-甲基硫-N6-(顺式羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰基氨基甲酰基腺苷、N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、2-甲基硫-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、N6，N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤。

在其它实施方式中，本文所述的人工核酸包含至少一个化学修饰的核苷酸，选自肌苷、1-甲基-肌苷、丫核苷、怀丁苷(wybutosine)、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮-鸟苷、6-硫-鸟苷、6-硫-7-脱氮-鸟苷、6-硫-7-脱氮-8-氮-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2，N2-二甲基鸟苷、8-氧-鸟苷、7-甲基-8-氧-鸟苷、1-甲基-6-硫-鸟苷、N2-甲基-6-硫-鸟苷和N2，N2-二甲基-6-硫-鸟苷。

在某些实施方式中，本文所述的人工核酸包含至少一个化学修饰的核苷酸，选自6-氮-胞苷、2-硫-胞苷、α-硫-胞苷、假-异-胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5，6-二氢尿苷、α-硫-尿苷、4-硫-尿苷、6-氮-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧-胸苷、5-甲基-尿苷、吡咯并-胞苷、肌苷、α-硫-鸟苷、6-甲基-鸟苷、5-甲基-胞嘧啶、8-氧-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、N1-甲基-腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-氨基-嘌呤、假-异-胞苷、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫-腺苷、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺苷。

根据优选的实施方式，人工核酸包含至少一个化学修饰的核苷酸，其在2’位置被化学修饰。优选地，化学修饰的核苷酸在2’碳原子上包含取代基，其中取代基选自卤素、烷氧基、氢、芳氧基、氨基和氨基烷氧基，优选地选自2’-氢(2’-脱氧)、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基和2’-氟。在人工核酸的情况下，具体是如果人工核酸是RNA或包含核糖核苷酸的分子，则2’-脱氧核苷酸(在2’碳原子上包含氢作为取代基)，如脱氧胞苷或其变体也可以被称为“化学修饰的核苷酸”。

包括本文所述的核苷酸的2’位置的另一种化学修饰是锁定核酸(LNA)核苷酸、乙烯桥连核酸(ENA)核苷酸和(S)-约束乙基cEt核苷酸。这些骨架修饰将修饰的核苷酸的糖锁定为优选的northern构象。相信在人工核酸的靶向序列中存在的修饰类型允许靶向序列与目标RNA较快和牢固地结合。

根据一些实施方式，人工核酸包含至少一个化学修饰的核苷酸，其中掺入人工核酸分子的磷酸酯骨架被修饰。骨架的磷酸酯基团可以例如通过用不同的取代基取代一个或多个氧原子来修饰。进一步，修饰的核苷酸可以包括用本文所述的修饰的磷酸酯完全取代未修饰的磷酸酯部分。修饰的磷酸酯基团的实例包括但不限于硫代磷酸酯、磷酸硒酸酯、硼烷磷酸酯(borano phosphate)、硼烷磷酸酯类(borano phosphate ester)、氢膦酸酯(hydrogen phosphonate)、氨基磷酸酯、烷基膦酸酯、芳基膦酸酯和磷酸三酯。也可以通过用氮(桥连氨基磷酸酯)、硫(桥连硫代磷酸酯)和碳(桥连亚甲基-膦酸酯)取代连接的氧来修饰磷酸酯接头。

根据进一步优选的实施方式，人工核酸包含无碱基位点。如本文所用，“无碱基位点”是缺乏有机碱基的核苷酸。在优选的实施方式中，无碱基核苷酸在核糖的2’位置进一步包含本文所述的化学修饰。优选地，核糖的2’C原子被选自以下的取代基取代：卤素、烷氧基、氢、芳氧基、氨基和氨基烷氧基，优选地选自2’-氢(2’-脱氧)、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基和2’-氟。优选的无碱基位点核苷酸的特征在于以下结构1A或1B：

因此，在本发明的上下文中，“化学修饰的核苷酸”也可以是无碱基位点。

根据另一实施方式，可以通过添加所谓的“5′帽”结构来修饰人工核酸分子。5′-帽是实体，通常是修饰的核苷酸实体，其通常对成熟mRNA的5’末端“加帽”。5′-帽通常可以由修饰的核苷酸，具体是由鸟嘌呤核苷酸的衍生物形成。优选地，5’-帽通过5′-5′-三磷酸酯键连接至人工核酸的5’-末端。5’-帽可以被甲基化，例如m7GpppN，其中N是携带5’-帽的核酸的末端5’核苷酸，通常为RNA的5’-末端。5’帽结构的进一步实例包括甘油基、反向脱氧无碱基残基(部分)、4’，5’亚甲基核苷酸、1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸(1-(beta-D-erythrofuranosyl)nucleotide)、4’-硫核苷酸、碳环核苷酸、1，5-无水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、修饰的碱基核苷酸、苏-戊呋喃糖基核苷酸(threo-pentofuranosylnucleotide)、无环3’，4’-seco核苷酸、无环3，4-二羟基丁基核苷酸、无环3，5二羟基戊基核苷酸、3’-3’-反向核苷酸部分、3’-3’-反向无碱基部分、3’-2’-反向核苷酸部分、3’-2’-反向无碱基部分、磷酸1，4-丁二醇酯、3’-氨基磷酸酯、磷酸己酯、磷酸氨基己酯、3’-磷酸酯、3’硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、或桥连或非桥连膦酸甲酯部分。特别优选的修饰的5’帽结构是CAP1(m7G的相邻核苷酸的核糖的甲基化)、CAP2(m7G下游第二个核苷酸的核糖的甲基化)、CAP3(m7G下游第三个核苷酸的核糖的甲基化)、CAP4(m7G下游第四个核苷酸的核糖的甲基化)、ARCA(抗反向CAP类似物、修饰的ARCA(例如硫代磷酸酯修饰的ARCA)、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2’-氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。

靶向序列

根据本发明的人工核酸包含靶向序列，该靶向序列包含与目标RNA中的目标序列互补的核酸序列，并且其中靶向序列包含至少一个核苷酸，其中核碱基被化学修饰和/或其中靶向序列包含至少一个骨架修饰。在本部分中，更详细地描述了靶向序列。然而，本文其它部分提供的描述，特别是关于人工核酸和关于募集部分的描述同样适用于靶向序列。具体地，本文提供的化学修饰的描述也涉及靶向序列。

根据优选的实施方式，靶向序列包含至少一个化学修饰的核苷酸，其在2’位置被化学修饰。优选的，化学修饰的核苷酸在2’碳原子上包含取代基，其中取代基选自卤素、烷氧基、氢、芳氧基、氨基和氨基烷氧基，优选地选自2’-氢(2’-脱氧)、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基和2’-氟；和/或其中化学修饰的核苷酸选自锁定核酸(LNA)核苷酸、乙烯桥连核酸(ENA)核苷酸和(S)-约束乙基cEt核苷酸。

优选地，人工核酸的靶向序列包含至少一个骨架修饰，其中核苷酸包含修饰的磷酸酯基团。修饰的磷酸酯基团优选地选自硫代磷酸酯、磷酸硒酸酯、硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯类、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基膦酸酯、芳基膦酸酯和磷酸三酯，最优选地硫代磷酸酯。

根据一些实施方式，靶向序列的核苷酸的至少约20％，优选至少约40％，更优选至少约60％，甚至更优选至少约80％，最优选至少约95％在2’位置被化学修饰，优选通过本文所述的修饰。

在相应于目标RNA中的目标位点(要编辑的核苷酸)的位置处，靶向序列包含胞苷核苷酸或胞苷核苷酸的变体，优选胞苷核糖核苷酸、脱氧胞苷核苷酸、修饰的胞苷核糖核苷酸、修饰的脱氧胞苷核苷酸或无碱基位点。在此上下文中，当优选地通过本文所述的特定碱基配对使目标序列与目标RNA对准时，“相应于目标位点的位置”或“相应于要编辑的核苷酸的位置”指代与所述目标位点相对的靶向序列中的核苷酸位置。在优选的实施方式中，靶向序列在相应于目标位点的位置处包含优选如本文所述的胞苷或其变体、脱氧胞苷或其变体或无碱基位点。

在一些实施方式中，目标RNA中的目标位点包含两个或更多个要编辑的核苷酸，其中这些核苷酸优选地被至少一个，优选两个其它核苷酸彼此隔开。在这些实施方式中，靶向序列可以在相应于要编辑的核苷酸的每个位置处包含优选如本文所述的上述核苷酸，优选胞苷或其变体、脱氧胞苷或其变体或无碱基位点(如例如根据SEQ ID NO：16的核苷酸序列所示例)。

在优选的实施方式中，位于相应于目标位点的位置的5’或3’，优选胞苷核苷酸或其变体、脱氧胞苷核苷酸或其变体或无碱基位点的5’或3’的两个核苷酸中的至少一个，优选两个在2’碳原子上被化学修饰，其中2’碳原子连接至选自下列的取代基：卤素、烷氧基、氢、芳氧基、氨基和氨基烷氧基，优选地选自2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基、2’-氢(2’-脱氧)和2’-氟；

和/或

其中位于相应于目标位点的位置的胞苷核苷酸或其变体、脱氧胞苷核苷酸或其变体或无碱基位点的5’或3’的两个核苷酸中的至少一个，优选两个包含修饰的磷酸酯基团，优选硫代磷酸酯基团。

令人惊讶地发现，降低围绕相应于目标位点的核苷酸(其优选为胞苷核苷酸或其变体、脱氧胞苷核苷酸或其变体或无碱基位点)的两个核苷酸中的至少一个，优选两个的化学修饰通过减少脱目标编辑而显著增加RNA编辑反应的特异性，并且还优选提高人工核酸的血清稳定性。在本发明之前，本领域中普遍认为，相应于要编辑的核苷酸的位置的核苷酸以及靶向序列中位于所述核苷酸侧翼的两个核苷酸不应被修饰。因此，当使用人工核酸时，发明人获得的优异结果更加令人意外，其中与目标位点相对的核苷酸三联体包含至少一个本文所述的修饰的核苷酸。

在此环境下，特别优选的是靶向序列包含核酸序列：

3’As*c C*5’，

其中

As为腺苷核苷酸或其变体，优选腺苷核糖核苷酸或脱氧腺苷核苷酸，其进一步包含硫代磷酸酯基团；

c是在相应于目标序列中要编辑的核苷酸，优选腺苷或胞苷，更优选腺苷的位置处的胞苷核苷酸或其变体、脱氧胞苷核苷酸或其变体或无碱基位点；

C是胞苷核苷酸或其变体；

其中星号(*)表示在2’碳原子上的前述核苷酸被2’-氢(2’-脱氧)、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基或2’-氟化学修饰。

在一些实施方式中，优选的是靶向序列包含核酸序列：

3’A c C 5’，

A是腺苷核苷酸或其变体，优选腺苷核糖核苷酸或脱氧腺苷核苷酸；

c是在相应于目标序列中要编辑的核苷酸，优选腺苷或胞苷，更优选腺苷的位置处的脱氧胞苷核苷酸或修饰的脱氧胞苷核苷酸；和

C是胞苷核苷酸或其变体，优选胞苷核糖核苷酸、修饰的胞苷核糖核苷酸、脱氧胞苷核苷酸或修饰的脱氧胞苷核苷酸，更优选脱氧胞苷核苷酸或修饰的脱氧胞苷核苷酸。

根据另一实施方式中，靶向序列包含核酸序列：

3’Us*c C*5’，

其中

Us是尿苷核苷酸或其变体，优选尿苷核糖核苷酸或脱氧尿苷核苷酸，进一步包含硫代磷酸酯基团；

c是在相应于目标序列中要编辑的核苷酸，优选腺苷或胞苷，更优选腺苷的位置处的胞苷核苷酸或其变体、脱氧胞苷核苷酸或其变体、或无碱基位点；

C是胞苷核苷酸或其变体；

其中星号(*)表示2’碳原子上的前述核苷酸被2’-氢(2’-脱氧)、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基或2’-氟化学修饰。

进一步优选的是，本文所述的人工核酸的靶向序列的3’末端的五个核苷酸中的至少两个包含修饰的磷酸酯基团，优选本文所定义的修饰的磷酸酯基团，更优选硫代磷酸酯基团。

在某些实施方式中，相应于目标序列中要编辑的核苷酸，优选腺苷或胞苷，更优选腺苷的位置处的核苷酸是无碱基位点，优选本文所述的无碱基位点。如果脱氨酶包含突变，其降低了脱氨酶相对于天然(生理)目标(如目标位点处的腺苷或胞苷核苷酸)的活性，则这种实施方式是特别优选的。这种突变的脱氨酶的实例包括ADAR2突变体E488Y、E488F或E488W。

可选地或除了上述修饰，靶向序列的3’末端的五个核苷酸中的至少两个优选为LNA核苷酸、ENA核苷酸或(S)-约束乙基cEt核苷酸，更优选LNA核苷酸。

在优选的实施方式中，人工核酸的靶向序列包含：

至少一个核苷酸，其包含修饰的磷酸酯基团，优选本文定义的修饰的磷酸酯基团，更优选硫代磷酸酯核苷酸；

至少一个LNA核苷酸；和

至少一个在2’碳原子上包含取代基的核苷酸，其中取代基选自卤素、烷氧基、氢(2’-脱氧)、芳氧基、氨基和氨基烷氧基，优选地选自2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基、2’-氢(2’-脱氧)和2’-氟。

在某些实施方式中，人工核酸的靶向序列的特征在于根据式(Ia)、(Ib)或(Ic)中任一项的修饰模式：

(Ia)3’N_aC N_b 5’

其中

N是核苷酸或其变体，优选核糖核苷酸或其变体、脱氧核苷酸或其变体，更优选本文所述的修饰的核糖核苷酸或修饰的脱氧核苷酸；

C是在相应于目标序列中要编辑的核苷酸的位置处的核苷酸，并且其中C是胞苷核苷酸或其变体、脱氧胞苷核苷酸或其变体、或无碱基位点；

a是1至40，优选6至10范围内的整数；

b是4至40范围内的整数；和

其中a+b在15至80的范围内；

(Ib)3’N_c Ns_d N_a C N_b Ns_e N_f 5’

其中

Ns是包含修饰的磷酸酯基团，优选硫代磷酸酯基团的核苷酸；

c是0至4范围内的整数；

d是1至10范围内的整数；

a是1至26范围内的整数；

b是4至40范围内的整数；

e是0至4范围内的整数；

f是0至4范围内的整数；

其中a+d+c在1至40的范围内；

其中b+e+f在4至40的范围内；和

其中a+d+c+b+e+f在15至80的范围内；

(Ic)3’N_c Nl_g N_h Nl_i N_a C N_b Nl_j N_k Nl_l N_m 5’

其中

Nl是LNA核苷酸或修饰的LNA核苷酸；

c是0至4，优选1至3范围内的整数；

g、i是1至5范围内的整数；

h是1至30，优选1至5范围内的整数；

a是1至15范围内的整数；

b是4至30范围内的整数；

j是0至5，优选1至3范围内的整数；

k是4至30范围内的整数；

l是0至5，优选1至3范围内的整数；

m是0至3范围内的整数；

其中c+g+h+i+a在1至40的范围内；

其中b+j+k+l+m在4至40的范围内；和

其中c+g+h+i+a+b+j+k+l+m在15至80的范围内。

根据进一步优选的实施方式，靶向序列的特征在于选自式II(a)至II(1)中任一项的化学修饰：

(a)3’Ns₄ N₆ C N_7-29 5’；

(b)3’Ns₄ N_6-10 C N_9-12 Ns₂ 5’；

(c)3’Ns₂ N_11-15 C N_9-12 Ns₂ 5’；

(d)3’Nls₂ Ns₂ NI N_6-10 C N_5-9 Nl₂ N Ns₂ 5’；

(e)3’Nls Ns Nls Ns N_6-10 C N_4-8 Nl N Nl N Ns₂ 5’；

(f)3’Ns Nls Ns Nls N_6-10 C N_3-7 Nl N Nl N₂ Ns₂ 5’；

(g)3’Ns₂ N Nl N Nl N_6-10 C N_4-8 Nl N Nl N Ns₂ 5’，

(h)3’Ns Nls Ns₂ Nl N₅ C N₅ Nl N_1-23 5’；

(i)3’Nls Ns Nls Ns N₈ C N₆ Nl N_1-23 5’

(j)3’Ns Nls Ns₂ Nl N₅ C N₅ Nl N₂₀ Nl₂ 5’；

(k)3’Nls Ns Nls Ns N₈ C N₆ Nl N₂₀ Nl₂ 5’；和

(l)3’Ns₄ N₆ C N₉ Ns₂ 5’，

其中

Nl是LNA核苷酸或修饰的LNA核苷酸；

Nls是LNA核苷酸或修饰的LNA核苷酸，其进一步包含修饰的磷酸酯基团，优选硫代磷酸酯基团；

C是在相应于目标序列中要编辑的核苷酸的位置处的核苷酸，并且其中C是胞苷核苷酸或其变体、脱氧胞苷核苷酸或其变体、或无碱基位点。

式(Ia)、(Ib)、(Ic)以及式II(a)-(l)描述了本文所述的人工核酸的靶向序列的修饰模式。本文所用的修饰模式指代在靶向序列中的某些位置上的式中所示的某些修饰的存在(或分别地，不存在)。对应的位置可以从所述式得到，具体是所述修饰关于目标RNA中要编辑的核苷酸，优选胞苷或其变体、脱氧胞苷或其变体或无碱基位点的位置的核苷酸的相对位置。上式限定了修饰模式，其应用于各种核酸序列，该核酸序列包含式中限定的核苷酸。用于编辑给定目标RNA的人工核酸的靶向序列的个体核酸序列总是取决于特定目标RNA和目标位点。然而，本文鉴定的修饰模式适用独立于特定核酸序列并限定修饰的数量和类型以及其相对位置。

在这种环境下，应注意，在所述式中使用的下标数字(和变量)表示靶向序列中存在的特定类型的核苷酸的数量。例如，“N_11-13”靶向序列(在此位置)包含由式定义的从11至13(即11、12或13)核苷酸。因此，此示例性修饰模式适用于在此位置包含类型11、12或13核苷酸的核酸序列。

根据一些实施方式，本文所述的人工核酸的靶向序列的特征在于修饰模式，其中，

除了相应于目标序列中要编辑的核苷酸的位置处的胞苷核苷酸或其变体、脱氧胞苷核苷酸或其变体，优选脱氧胞苷核苷酸，或无碱基位点之外，

除了LNA核苷酸之外，和

任选地，除了位于相应于目标序列中要编辑的核苷酸的位置处的核苷酸的5’或3’的两个核苷酸中的至少一个之外，

所有核苷酸均在2’碳原子上被化学修饰，所述2’碳原子连接至选自下列的取代基：卤素、烷氧基、氢、芳氧基、氨基和氨基烷氧基，优选地选自2’-氢(2’-脱氧)、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基和2’-氟。

在某些实施方式中，人工核酸的靶向序列包含选自下列的核酸序列或由选自下列的核酸序列组成：

5’U*U*C*A*C*U*UcA G*U*G*U*As*Us*Gs*Cs*C*3’ (SEQ ID NO：1)；

5’U*U*C*A*C*U*UcA G*U*G*U*As*Us*Gs*Cs*C*3’ (SEQ ID NO：2)；

5’A*C*C*U*C*C*AcU C*A*G*U*Gs*Us*Gs*As*U*3’ (SEQ ID NO：3)；

5’U*U*U*C*C*U*CcA C*U*G*U*Us*Gs*Cs*As*A*3’ (SEQ ID NO：4)；

5’U*G*U*G*U*A*UcU U*G*C*U*Gs*Us*Gs*As*G*3’ (SEQ ID NO：5)；

5’G*A*G*G*U*C*CcU G*G*G*G*Gs*Cs*Gs*Cs*U*3’ (SEQ ID NO：6)；

5’G*A*U*C*U*U*CcU G*A*U*G*Gs*Cs*Cs*As*C*3’ (SEQ ID NO：7)；

5’A*G*C*C*A*C*AcA C*U*C*C*Gs*Us*Cs*As*G*3’ (SEQ ID NO：8)；

5’G*A*U*U*U*U*CcU G*A*U*A*Gs*Cs*Us*As*C*3’ (SEQ ID NO：9)；

5’G*G*C*C*A*C*AcA U*U*C*U*Gs*Us*Cs*As*G*3’ (SEQ ID NO：10)；

5’G*A*U*C*U*U*CcU G*A*U*G*Gs*Cs*Cs*As*C*3’ (SEQ ID NO：11)；

5’G*G*C*C*A*C*AcA C*U*C*C*Gs*Us*Cs*As*G*3’ (SEQ ID NO：12)；

5’G*A*U*U*U*U*CcU G*A*U*A*Gs*Cs*As*As*C*3’ (SEQ ID NO：13)；

5’G*G*C*U*A*C*GcA C*U*C*U*Gs*Us*Cs*As*A*3’ (SEQ ID NO：14)；

5’A*G*G*C*C*G*CcG U*C*G*U*Gs*Gs*Cs*Gs*G*3’ (SEQ ID NO：15)；

5’C*C*G*C*U*C*CcU CcU C*A*G*C*Cs*Cs*Gs*Us*C*3’ (SEQ ID NO：16)；

5’A*C*G*C*C*A*CcA G*C*U*C*Cs*As*As*Cs*U*3’ (SEQ ID NO：17)；

5’G*U*C*U*C*A*CcAA*U*U*G*Cs*Us*Cs*Us*C*3’ (SEQ ID NO：18)；

5’G*A*A*A*U*A*CcA U*C*A*G*As*Us*Us*Us*G*3 (SEQ ID NO：19)；

5’A*A*U*U*A*G*CcU U*C*U*G*Gs*Cs*Cs*As*U*3’ (SEQ ID NO：20)；

5’G*A*U*C*A*G*CcU C*C*U*G*Gs*Cs*Cs*As*U*3’ (SEQ ID NO：21)；

5’G*A*U*C*A*G*CcU U*C*U*G*Gs*Cs*Cs*As*U*3’ (SEQ ID NO：22)；

5’G*A*U*C*A*G*CcU U*C*U*G*Gs*Cs*Cs*As*U*3’ (SEQ ID NO：23)；

5’C*A*C*U*G*C*CcA G*G*C*A*Us*Cs*As*Gs*C*3’ (SEQ ID NO：24)；

5’C*A*C*U*G*C*CcG G*G*C*A*Us*Cs*As*Gs*C*3’ (SEQ ID NO：25)；

5’U*C*C*G*C*C*CcG A*U*C*C*As*Cs*Gs*As*U*3’ (SEQ ID NO：26)；

5’C*C*U*U*U*C* UcG U*C*G*A*Us*Gs*Gs*Us*C*3’ (SEQ ID NO：27)；

5’C*C*U*U*U*C*U*cG U*C*G*A*Us*Gs*Gs*Us*C*3’ (SEQ ID NO：28)；

5’C*U*U*G*A*U*AcA U*C*C*A*Gs*Us*Us*Cs*C*3’ (SEQ ID NO：29)；

5’U*U*U*C*A*G*GcA U*U*U*C*Cs*Us*Cs*Cs*G*3’ (SEQ ID NO：30)；

5’C*U*U*C*A*G*GcA U*G*G*G*Gs*Cs*As*Gs*C*3’ (SEQ ID NO：31)；

5’A*G*G*A*A*C*AcAA*C*C*U*Us*Us*Gs*Us*C*3’ (SEQ ID NO：32)；

5’U*U*U*C*A*C*AcA U*C*C*A*Us*Cs*As*As*C*3’ (SEQ ID NO：33)；

5’C*U*U*C*A*C*GcA U*C*C*A*Us*Cs*As*As*C*3’ (SEQ ID NO：34)；

5’U*G*G*G*A*C*AcAA*C*C*C*Cs*Us*Gs*Cs*C*3’ (SEQ ID NO：35)；

5’C*G*A*C*U*C*CcU C*U*G*G*As*Us*Gs*Us*U*3’ (SEQ ID NO：36)；

5’C*G*A*C*U*C*UcU C*U*G*G*As*Us*Gs*Us*U*3’ (SEQ ID NO：37)；

或这些核酸序列中的任一个的片段或变体；

其中

A是腺苷核苷酸或其变体，优选腺苷核糖核苷酸、腺苷脱氧核苷酸、修饰的腺苷核糖核苷酸或修饰的腺苷脱氧核苷酸；

C是胞苷核苷酸或其变体，优选胞苷核糖核苷酸、胞苷脱氧核苷酸、修饰的胞苷核糖核苷酸或修饰的胞苷脱氧核苷酸；

G是鸟苷核苷酸或其变体，优选鸟苷核糖核苷酸、鸟苷脱氧核苷酸、修饰的鸟苷核糖核苷酸或修饰的鸟苷脱氧核苷酸；

U是尿苷核苷酸或其变体，优选尿苷核糖核苷酸、尿苷脱氧核苷酸、修饰的尿苷核糖核苷酸或修饰的尿苷脱氧核苷酸；

As、Cs、Gs和Us是核苷酸，优选以上限定的核糖核苷酸或脱氧核苷酸，其进一步包含硫代磷酸酯基团；

其中星号(*)表示2’碳原子上的前述核苷酸优选被2’-氢(2’-脱氧)、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基或2’-氟化学修饰；和

其中小写字母c表示相应于目标序列中要编辑的核苷酸，优选腺苷或胞苷，更优选腺苷的位置，并且其中c表示胞苷核苷酸或其变体、脱氧胞苷核苷酸或其变体、或无碱基位点。

在本发明的上下文中，核酸序列或氨基酸序列的“变体”与源自其的序列、变体至少40％，优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％相同。优选地，变体是功能性变体。

如本文所用，核酸序列或氨基酸序列的“片段”由相应于全长序列中的连续延伸的核苷酸或氨基酸残基的连续延伸的核苷酸或氨基酸残基组成，其表示全长序列、源自其的片段的至少5％、10％、20％，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％，甚至更优选至少80％和最优选至少90％。就本发明而言，这种片段优选为功能性片段。

根据一些实施方式，人工核酸的靶向序列在相应于目标序列中要编辑的核苷酸的位置处包含胞苷核苷酸或其变体、脱氧胞苷核苷酸或其变体、或无碱基位点，

其中位于相应于要编辑的核苷酸的位置的5’的核苷酸或其变体是嘧啶核苷酸，优选嘧啶核糖核苷酸或嘧啶脱氧核苷酸，并且其中所述嘧啶核苷酸包含核碱基，其优选地通过2’-氢(2’-脱氧)、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基或2’-氟在2’位置被化学修饰。

在可选的实施方式中，人工核酸的靶向序列在相应于目标序列中要编辑的核苷酸的位置处包含胞苷核苷酸或其变体、脱氧胞苷或其变体，优选脱氧胞苷核苷酸、或无碱基位点，

其中位于相应于要编辑的核苷酸的位置的5’或3’的两个核苷酸或其变体中的至少一个，优选两个在2’碳原子上被化学修饰，该2’碳原子连接至选自下列的取代基：卤素、烷氧基、氢、芳氧基、氨基和氨基烷氧基，优选地选自2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基、2’-氢和2’-氟；

和/或

其中位于相应于要编辑的核苷酸的位置的5’或3’的两个核苷酸或其变体中的至少一个，优选两个包含修饰的磷酸酯基团，优选本文所述的修饰的磷酸酯基团，更优选硫代磷酸酯基团。

具有偶联剂的募集部分

根据本发明的一些实施方式，人工核酸包含本文所述的靶向序列并且进一步包括包含至少一种偶联剂的募集部分。所述偶联剂能够募集脱氨酶，该脱氨酶包含结合所述偶联剂的部分。如上所述，募集部分包含偶联剂或由偶联剂组成，该偶联剂募集脱氨酶并且通常共价地连接至靶向序列。更具体地，募集部分由本文所述的偶联剂组成，该偶联剂连接，优选共价地连接靶向序列的5’-末端或3’-末端。可选地，偶联剂还可以连接，优选共价地连接靶向序列的内部核苷酸(即不是5’-或3’-末端核苷酸)，例如通过与优选本文所述的核苷酸变体或修饰的核苷酸(如氨基-胸苷)的连接。

募集脱氨酶的偶联剂通常与靶向序列共价地连接。优选地，偶联剂连接至靶向序列的5’-末端或3’-末端。可选地，偶联剂还可以连接至靶向序列的内部核苷酸(即不是5’-或3’-末端核苷酸)，例如通过与优选本文所述的核苷酸变体或修饰的核苷酸(如氨基-胸苷)的连接。

在优选的实施方式中，偶联剂选自O6-苄基腺嘌呤、O2-苄基胞嘧啶、氯代烷、1xBG、2xBG、4xBG以及这些中的任一种的变体。根据特别优选的实施方式，偶联剂是支链分子，如2xBG或4xBG，其每个优选地能够募集脱氨酶分子，因此优选地放大编辑反应。合适的支链偶联剂的示例性结构如下所示：

偶联剂优选能够特异性结合脱氨酶中的部分。所述脱氨酶中的部分优选是标签，其与本文所述的脱氨酶，优选本文所述的腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶连接。更优选地，所述标签选自SNAP-标签、CLIP-标签、HaloTag以及这些中的任一种的片段或变体。因此，由这些实施方式中的偶联剂界定的脱氨酶优选是内源性脱氨酶(优选本文所述的脱氨酶)的人工版本。优选地，脱氨酶选自优选如本文所述的SNAP-ADAR1、SNAP-ADAR2、Apobec1-SNAP、SNAPf-ADAR1、SNAPf-ADAR2、Apobec1-SNAPf、Halo-ADAR1、Halo-ADAR2、Apobec1-Halo、Clip-ADAR1、Clip-ADAR2、Clipf-ADAR1、Clipf-ADAR2、Apobec1-Clip和Apobec1-Clipf，或这些中的任一种的片段或变体，其中脱氨酶优选源自人或鼠。更优选地，脱氨酶选自SNAP-ADAR1、SNAP-ADAR2、SNAPf-ADAR1、SNAPf-ADAR2、Halo-ADAR1、Halo-ADAR2、Clip-ADAR1、Clip-ADAR2、Clipf-ADAR1和Clipf-ADAR2或这些中的任一种的片段或变体，其中脱氨酶源自人。根据另一实施方式，脱氨酶选自mApobec1-SNAP、mApobec1-SNAPf、mApobec1-Halo、mApobec1-Clip和mApobec1-Clipf或这些中的任一种的片段或变体，其中脱氨酶源自鼠。在特别优选的实施方式中，脱氨酶是本文所述的脱氨酶中的任一种的高活性突变体，优选高活性Q突变体，更优选ADAR1脱氨酶、ADAR2脱氨酶的高活性Q突变体(例如人ADAR1p150、E1008Q；人ADAR1p110、E713Q；人ADAR2、E488Q)或其标记版本，更优选如本文所述，或这些中的任一种的片段或变体。

标记的脱氨酶，优选如本文所述(例如SNAP-、SNAPf-、Clip-、Clipf-、Halo-标记的脱氨酶或其片段或变体)优选过表达以进行RNA编辑，例如通过用编码所述标记的脱氨酶的载体瞬时转染细胞或在转基因细胞、组织或有机体中稳定表达。

根据优选的实施方式，募集部分包含选自下列的偶联剂或由选自下列的偶联剂组成：O6-苄基鸟嘌呤、1xBG、2xBG、4xBG以及这些中的任一种的变体。在这种实施方式中，人工核酸在脱氨酶，优选更优选如本文所述的腺苷或胞苷脱氨酶的存在下进行，其中脱氨酶包含SNAP-标签或其变体。在可选的实施方式中，募集部分包含氯代烷或由氯代烷组成，并且更优选如本文所述的脱氨酶，优选腺苷或胞苷脱氨酶包含HaloTag或其变体。根据进一步的实施方式，募集部分包含O2-苄基胞嘧啶或其变体，并且更优选如本文所述的脱氨酶，优选腺苷或胞苷脱氨酶包含Clip-标签或其变体。

在某些实施方式中，本文所述的人工核酸包含本文所述的靶向序列和至少两个或更多个募集部分，其中每个募集部分包含本文所述的偶联剂或由其组成，并且其中每个募集部分优选募集脱氨酶分子，因此优选扩大编辑反应。这些募集部分中的每一个优选包含——独立于其它募集部分——选自下列的偶联剂：O6-苄基鸟嘌呤、O2-苄基胞嘧啶、氯代烷、1xBG、2xBG、4xBG以及这些中的任一种的变体。优选地，人工核酸包含至少两个募集部分，其中每个募集部分包含相同或不同的偶联剂。本文图11示例了包含多于一个募集部分和/或包含支链偶联剂的实施方式的示意性结构。

具有核酸募集基序的募集部分

在本发明的优选实施方式中，人工核酸包含本文所述的靶向序列和募集部分，该募集部分包含能够特异性结合脱氨酶，优选腺苷或胞苷脱氨酶的核酸序列或由其组成。优选地，能够特异性结合脱氨酶的核酸序列特异性结合优选本文所述的脱氨酶的双链(ds)RNA结合结构域。有利地，包含能够特异性结合脱氨酶的核酸序列或由其组成的募集部分还结合内源性脱氨酶。因此，根据本发明的人工核酸利用内源性(或异源表达的)脱氨酶促进定点RNA编辑。

优选地，募集部分包含能够特异性结合脱氨酶的核酸序列或由其组成，其中核酸序列优选共价地连接至靶向序列的5’末端或3’末端，更优选靶向序列的5’末端。在某些实施方式中，人工核酸包含本文所述的靶向序列和本文所述的至少两个募集部分。

在一些实施方式中，募集部分包含能够分子内碱基配对的核酸序列或由其组成。募集部分优选包含能够形成茎环结构的核酸序列或由其组成。在某些实施方式中，所述茎环结构包括包含至少两个错配的双螺旋茎或由其组成。在优选的实施方式中，茎环结构包含由3至8、优选4至6、更优选5个核苷酸组成的环。环优选包含核酸序列GCUAA或GCUCA或由其组成。

根据优选的实施方式中，人工核酸的募集部分包括包含本文所述的至少一个化学修饰的核酸序列或由其组成。具体地，人工核酸的募集部分优选包括包含至少一个核苷酸的核酸序列或由其组成，其中核碱基被化学稀释，和/或其中核酸序列包含至少一个骨架修饰。本文在相应部分和一般进一步关于人工核酸和靶向序列描述的化学修饰也适用于募集部分。

在一些实施方式中，至少一个化学修饰的核苷酸在2’位置被化学修饰。优选地，化学修饰的碱基在2’碳原子上包含取代基，其中取代基选自卤素、烷氧基、氢、芳氧基、氨基和氨基烷氧基，优选地选自2’-氢(2’-脱氧)、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基和2’-氟。根据可选的实施方式，化学修饰的核苷酸是锁定核酸(LNA)核苷酸、乙烯桥连核酸(ENA)核苷酸或(S)-约束乙基cEt核苷酸。

在优选的实施方式中，人工核酸包括包含本文所述的核酸序列的募集部分，其中募集部分包含至少一个化学修饰的核苷酸，其中化学修饰的核苷酸在2’碳原子上包含取代基，其中取代基选自卤素、烷氧基、氢、芳氧基、氨基和氨基烷氧基，优选地选自2’-氢、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基和2’-氟；和/或

其中化学修饰的核苷酸是锁定核酸(LNA)核苷酸、乙烯桥连核酸(ENA)核苷酸或(S)-约束乙基cEt核苷酸。

优选地，人工核酸的募集部分包含至少一个骨架修饰，其中核苷酸包含修饰的磷酸酯基团。修饰的磷酸酯基团优选地选自硫代磷酸酯、磷酸硒酸酯、硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯类、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基膦酸酯、芳基膦酸酯和磷酸三酯，最优选为硫代磷酸酯。

在一些实施方式中，募集部分的核酸序列的核苷酸中的至少约20％、优选至少约40％、更优选至少约60％、甚至更优选至少约80％、最优选至少约95％优选通过本文所述的修饰在2’位置被化学修饰。

优选地，募集部分包含核酸序列，其中核酸序列的5’末端的五个核苷酸中的至少两个包含硫代磷酸酯基团。

根据一些实施方式，募集部分包含核酸序列，其中核酸序列的5’末端的五个核苷酸中的至少两个是LNA核苷酸、ENA核苷酸或(S)-约束乙基cEt核苷酸。

在本发明的优选实施方式中，募集部分包含核酸序列，其中

至少一个核苷酸包含修饰的磷酸酯基团，优选硫代磷酸酯基团；

至少一个LNA核苷酸、ENA核苷酸或(S)-约束乙基cEt核苷酸；和

至少一个在2’碳原子上包含取代基的核苷酸，其中取代基选自卤素、烷氧基、氢、芳氧基、氨基和氨基烷氧基，优选地选自2’-氢(2’-脱氧)、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基或2’-氟。

根据特别优选的实施方式，募集部分包含选自下列的核酸序列或由其组成：

(a)5’GGUGUCGAG-N_a-AGA-N_c-GAGAACAAUAU-GCU A/C A-AUGUUGUUCUC-N_d-UCU-N_b-CUCGACACC 3’(SEQ ID NO：38)；

(b)5’GsGsUGUCGAG-N_a-AGA-N_c-GAGAACAAUAU-GCU A/C A-AUGUUGUUCUC-N_d-UCU-N_b-CUCGACACC 3’(SEQ ID NO：39)；和

(c)5’GslGslUGUCGAG-N_a-AGA-N_c-GAGAACAAUAU-GCU A/C A-AUGUUGUUCUC-N_d-UCU-N_b-CUCGACACC 3’(SEQ ID NO：40)；

或这些中的任一种的片段或变体；

其中

N_a和N_b形成错配，优选其中N_a是腺苷并且N_b是胞苷；

N_c和N_d形成错配，优选其中N_c和N_d是鸟苷；

Gs是包含硫代磷酸酯基团的鸟苷；和

Gsl是包含硫代磷酸酯基团的LNA鸟苷。

根据可选的实施方式，募集部分包含源自VA(病毒相关的)RNA I或其片段或变体的核酸序列或由其组成。VA RNA I是源自腺病毒的RNA，并且是技术人员已知的。在优选的实施方式中，人工核酸的募集部分包含核酸序列

GCACACCTGGGTTCGACACGCGGGCGGTAACCGCATGGATCACGGCGGACGGCCGGATTCGGGGTTCGAACCCCGGTCGTCCGCCATGATACCCTTGC(SEQ ID NO：41)，或其片段或变体。

在优选的实施方式中，募集部分包含根据SEQ ID NO：38至41中任一项的核酸序列，或这些序列中的任一种的片段或变体，其中至少一个核苷酸，优选至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的核苷酸在2’碳原子上包含取代基，其中取代基选自卤素、烷氧基、氢、芳氧基、氨基和氨基烷氧基，优选地选自2’-氢(2’-脱氧)、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基和2’-氟。

根据特别优选的实施方式，募集部分包含选自下列的核酸序列：

(a)5’G*G*U*GU*C*GAG-N_a-AGA-N_c-GAGAAC*AAU*AU*-GC*U*A/C A-AU*GU*U*GU*U*C*U*C*-N_d-U*C*U*-N_b*-C*U*C*GAC*AC*C*3’(SEQ ID NO：42)；

(b)5’Gs*Gs*U*GU*C*GAG-N_a-AGA-N_c-GAGAAC*AAU*AU*-GC*U*A/C A-AU*GU*U*GU*U*C*U*C*-N_d-U*C*U*-N_b*-C*U*C*GAC*AC*C*3’(SEQ ID NO：43)；和

(c)5’Gsl*Gsl*U*GU*C*GAG-N_a-AGA-N_c-GAGAAC*AAU*AU*-GC*U*A/C A-AU*GU*U*GU*U*C*U*C*-N_d-U*C*U*-N_b*-C*U*C*GAC*AC*C*3’(SEQ ID NO：44)；

或这些序列中的任一种的片段或变体；

其中

N_a和N_b形成错配，优选其中N_a是腺苷并且N_b是胞苷；

N_c和N_d形成错配，优选其中N_c和N_d是鸟苷；

Gs是包含硫代磷酸酯基团的鸟苷；

Gsl是包含硫代磷酸酯基团的LNA鸟苷；和

其中星号(*)表示2’碳原子上的核苷酸优选被2’-氢(2’-脱氧)、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基或2’-氟修饰。

在某些实施方式中，优选根据本文所述的人工核酸在5’至3’方向包含本文所述的募集部分和本文所述的靶向序列。

本发明的进一步方面涉及用于定点编辑目标RNA的人工核酸，该人工核酸包含：

a)靶向序列，其包含与目标RNA中的目标序列互补或部分互补的核酸序列或由其组成，

和

b)用于募集脱氨酶的募集部分，其中募集部分包含能够特异性结合脱氨酶，优选腺苷或胞苷脱氨酶的核酸序列或由其组成。

根据此方面，募集部分优选如本文“具有核酸募集基序的募集部分”部分中所定义。在本发明的此方面的优选实施方式中，靶向序列优选如本文所述被化学修饰。在此方面的某些实施方式中，靶向序列未被化学修饰。在特别优选的实施方式中，人工核酸在细胞，优选本文所述的细胞，更优选通过从载体，优选本文所述的载体转录而合成。根据本发明的此方面的特别优选的实施方式，人工核酸包含募集部分，该募集部分包含根据SEQ ID NO：38至41中任一项的核酸序列或其片段或变体或由其组成。

脱氨酶

人工核酸适合于通过脱氨酶定点编辑RNA，其中脱氨酶优选为腺苷脱氨酶或其片段或变体，优选为ADAR(作用于dsRNA的腺苷脱氨酶)酶或其片段或变体，更优选地选自ADAR1、ADAR2及其片段或变体，甚至更优选为包含腺苷脱氨酶结构域的肽或蛋白质；或

胞苷脱氨酶或其片段或变体，优选Apobec1或其片段或变体，更优选为包含胞苷脱氨酶结构域的肽或蛋白质。

本文所用的术语“脱氨酶”指代能够催化目标RNA中的核苷酸或其变体的脱氨，具体是腺苷或胞苷的脱氨的任何肽、蛋白质或蛋白结构域。因此，术语不仅指代全长和野生型脱氨酶，如ADAR1、ADAR2或Apobec1，而且还指代脱氨酶的片段或变体，优选功能性片段或功能性变体。具体地，术语还指代脱氨酶的突变体和变体，如优选如本文所述的ADAR1、ADAR2或Apobec1的突变体。此外，本文所用的术语脱氨酶还包含任何脱氨酶融合蛋白(例如基于Cas9和Cas13)。在本发明的上下文中，术语“脱氨酶”还指代脱氨酶，如选自优选本文所述的SNAP-ADAR1、SNAP-ADAR2、Apobec1-SNAP、SNAPf-ADAR1、SNAPf-ADAR2、Apobec1-SNAPf、Halo-ADAR1、Halo-ADAR2、Apobec1-Halo、Clip-ADAR1、Clip-ADAR2、Clipf-ADAR1、Clipf-ADAR2、Apobec1-Clip和Apobec1-Clipf的脱氨酶的标记变体，或这些中的任一种的片段或变体，其中脱氨酶优选源自人或鼠。

在优选的实施方式中，脱氨酶是腺苷脱氨酶(如ADAR1，优选ADAR1p150或ADAR1p110或ADAR2)，优选为真核腺苷脱氨酶，更优选为脊椎动物腺苷脱氨酶，甚至更优选为哺乳动物腺苷脱氨酶，最优选为人腺苷脱氨酶，如hADAR1或hADAR2或这些中的任一种的片段或变体。在特别优选的实施方式中，脱氨酶是优选如本文所述的标记的腺苷脱氨酶，或其片段或变体。更优选地，本文所用的脱氨酶选自SNAP-ADAR1、SNAP-ADAR2、SNAPf-ADAR1、SNAPf-ADAR2、Halo-ADAR1、Halo-ADAR2、Clip-ADAR1、Clip-ADAR2、Clipf-ADAR1和Clipf-ADAR2或这些中的任一种的片段或变体，其中脱氨酶源自人。

根据可选的实施方式，脱氨酶是胞苷脱氨酶(如Apobec1，优选为人Apobec1或鼠Apobec1(mApobec1))，优选为真核胞苷脱氨酶，更优选为脊椎动物胞苷脱氨酶，甚至更优选为哺乳动物胞苷脱氨酶，最优选为鼠或人胞苷脱氨酶或这些中的任一种的片段或变体。在特别优选的实施方式中，脱氨酶是优选如本文所述的标记的胞苷脱氨酶或其片段或变体。根据优选的实施方式，脱氨酶选自mApobec1-SNAP、mApobec1-SNAPf、mApobec1-Halo、mApobec1-Clip和mApobec1-Clipf或这些中的任一种的片段或变体，其中脱氨酶源自鼠。

在优选的实施方式中，脱氨酶是优选如本文所述的内源性脱氨酶或其片段或变体。包含具有核酸募集基序(参见本文的相应部分)的募集部分的人工核酸优选与内源性脱氨酶或其片段或变体结合使用。

在特别优选的实施方式中，脱氨酶是本文提及的脱氨酶中的任一种的高活性突变体，优选为高活性Q突变体，更优选为ADAR1脱氨酶、ADAR2脱氨酶的高活性Q突变体(例如人ADAR1p150、E1008Q；人ADAR1p110、E713Q；人ADAR2、E488Q)或其标记的版本，最优选如本文所述，或这些中的任一种的片段或变体。

优选如本文所述的标记的脱氨酶优选与根据本发明的人工核酸结合使用，其中募集部分包含能够募集脱氨酶的至少一种偶联剂，该脱氨酶包含结合所述偶联剂的部分(也参见“具有偶联剂的募集部分”部分)。

在下文中，作为实例描述了本文所用的特别优选的脱氨酶：

hADAR1p150：

核酸序列：

氨基酸序列：

根据优选的实施方式，氨基酸残基E1008在hADAR1p150中突变。特别优选的是突变型E1008Q，一种高活性突变体。进一步优选的突变体包括E1008Y、E1008F、E1008W、E1008H、E1008L、E1008M、E1008I和E1008V，其具有降低的活性，并且优选与在相应于要编辑的核苷酸的位置的靶向序列中具有无碱基位点的人工核酸结合使用。

hADAR1p110：

核酸序列：

氨基酸序列：

根据优选的实施方式，氨基酸残基E713在hADAR1p110中突变。特别优选的是突变型E713Q，一种高活性突变体。进一步优选的突变体包括E713Y、E713F、E713W、E713H、E713L、E713M、E713I和E713V，其具有降低的活性并且优选与在相应于要编辑的核苷酸的位置的靶向序列中具有无碱基位点的人工核酸结合使用。

hADAR2：

核酸序列：

氨基酸序列：

根据优选的实施方式，氨基酸残基E488在hADAR2中突变。特别优选的是突变型E488Q，一种高活性突变体。进一步优选的突变体包括E488Y、E488F、E488W、E488H、E488L、E488M、E488I和E488V，其具有降低的活性并且优选与在相应于要编辑的核苷酸的位置的靶向序列中具有无碱基位点的人工核酸结合使用。可以在hADAR2中突变的进一步优选的位点包括I456或T490，并且还进一步包括R348、R470、H471、R474、S495、R510、K594、R477或R481。

SNAPf-ADAR1：

核酸序列：

氨基酸序列：

根据优选的实施方式，氨基酸残基E406在SNAPf-ADAR1中突变。特别优选的是突变型E406Q，一种高活性突变体。进一步优选的突变体包括E406Y、E406F、E406W、E406H、E406L、E406M、E406I和E406V，其具有降低的活性并且优选地与在相应于要编辑的位置的靶向序列中具有无碱基位点的人工核酸结合使用。

SNAPf-ADAR2：

核酸序列：

氨基酸序列：

根据优选的实施方式，氨基酸残基E403在hADAR2中被突变。特别优选的是突变型E403Q，一种高活性突变体。进一步优选的突变体包括E403Y、E403F、E403W、E403H、E403L、E403M、E403I和E403V，其具有降低的活性并且优选地与在相应于要编辑的核苷酸的位置的靶向序列中具有无碱基位点的人工核酸结合使用。可以在hADAR2中突变的进一步优选的位点包括I371或T405，并且还进一步包括R263、R385、H386、R389、S410、R425、K509、R392或R484。

mAPOBEC1-SNAP(mA1-SNAP)，C-至-U脱氨酶：

核酸序列：

氨基酸序列：

Halo-ADAR1Q：

核酸序列：

氨基酸序列：

根据优选的实施方式，野生型氨基酸残基E521突变为Q，导致高活性脱氨酶突变体。进一步优选的突变体包括E521Y、E521F、E521W、E521H、E521L、E521M和E521V，其具有降低的活性并且优选地与在相应于要编辑的核苷酸的位置的靶向序列中具有无碱基位点的人工核酸结合使用。

Clipf-ADAR1Q：

核酸序列：

氨基酸序列：

根据优选的实施方式，野生型氨基酸残基E406在Clipf-ADAR1中突变为Q，导致高活性脱氨酶突变体。进一步优选的突变体包括E406Y、E406F、E406W、E406H、E406L、E406M和E406V，其具有降低的活性并且优选地与在相应于要编辑的核苷酸的位置的靶向序列中具有无碱基位点的人工核酸结合使用。

根据优选的实施方式，本文所述的包含具有核酸募集基序(参见本文的相应部分)的募集部分的人工核酸优选地在内源性脱氨酶的存在下用于定点编辑RNA，优选地选自hADAR1p110、hADAR1p150、hADAR2和Apobec1，优选由上文定义的序列限定，或这些脱氨酶中的任一种的片段或变体。

根据可选的实施方式，本文所述的包含具有偶联剂(参见本文的相应部分)的募集部分的人工核酸优选地在标记的脱氨酶的存在下用于定点编辑RNA，优选地选自SNAPf-ADAR1、SNAPf-ADAR2、mAPOBEC-SNAP、Halo-ADAR和Clipf-ADAR，优选由上文定义的序列，或这些脱氨酶中的任一种的片段或变体。

包含人工核酸的载体

一方面，本发明提供了包含本文所述的人工核酸的载体。

本文所用的术语“载体”通常指代核酸分子，优选人工核酸分子。本发明的上下文中的载体适合于掺入或包含期望的核酸序列，如人工核酸的核酸序列或其片段。这种载体可以是存储载体、表达载体、克隆载体、转移载体等。克隆载体可以是例如质粒载体或噬菌体载体。转移载体可以是适于将核酸分子转移至细胞或有机体中的载体，例如病毒载体。优选地，本申请的意义中的载体包括克隆位点、选择标志物，如抗生素抗性因子，和适合于载体复制的序列，如复制起点。

载体可以是RNA载体或DNA载体。优选地，载体是DNA载体。载体可以是技术人员已知的任何载体，如病毒载体或质粒载体。优选地，载体是质粒载体，优选为DNA质粒载体。在某些实施方式中，载体是病毒载体，其优选地选自慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒(AAV)载体和杂化载体。

优选地，根据本发明的载体适合于产生根据本发明的人工核酸分子，优选RNA。因此，优选地，载体包含转录所需的元件，如启动子，例如RNA聚合酶启动子。优选地，载体适合于使用真核、原核、病毒或噬菌体转录系统，如真核细胞、原核细胞或真核、原核、病毒或噬菌体体外转录系统进行转录。因此，例如，载体可以包含启动子序列，其被聚合酶，如RNA聚合酶，例如真核、原核、病毒或噬菌体RNA聚合酶识别。在优选的实施方式中，载体包含噬菌体RNA聚合酶启动子，如SP6、T3或T7，优选T7启动子。优选地，载体适合于使用基于噬菌体的体外转录系统，如基于T7 RNA聚合酶的体外转录系统进行体外转录。

在一些实施方式中，载体被设计用于在转染到真核细胞中时，优选在转染到哺乳动物细胞中时，或者在给予优选本文所述的对象时转录人工核酸。在优选的实施方式中，将载体设计用于通过真核RNA聚合酶，优选RNA聚合酶II或III，更优选RNA聚合酶III转录人工核酸。在某些实施方式中，载体可以包含U6 snRNA启动子或H1启动子，以及任选地选择标志物，例如报道基因(如GFP)或抗性基因(如嘌呤霉素或潮霉素抗性基因)。

包含人工核酸或载体的细胞

根据本发明的一个方面，提供了包含本文所述的人工核酸或载体的细胞。细胞可以是任何细胞，如细菌细胞或真核细胞，优选为昆虫细胞、植物细胞、脊椎动物细胞，如哺乳动物细胞(例如人细胞或鼠细胞)。细胞可以例如用于例如在细菌细胞中复制本发明的载体。此外，细胞，优选真核细胞可以用于合成根据本发明的人工核酸分子。

根据本发明的细胞例如可以通过标准核酸转移方法，如标准转染、转导或转化方法获得。本文所用的术语“转染”通常指代将核酸分子，如DNA或RNA(例如mRNA)分子引入细胞，优选地引入真核细胞。在本发明的上下文中，术语“转染”涵盖技术人员已知的用于将核酸引入细胞，优选引入真核细胞(例如哺乳动物细胞)的任何方法。这种方法包括例如，电穿孔、例如基于阳离子脂质和/或脂质体的脂转染、碳酸钙沉淀、基于纳米颗粒的转染、基于病毒的转染或基于阳离子聚合物(如DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺)的转染等。在本文中，本文所述的人工核酸或载体可以以瞬时方式引入细胞中，或者以在细胞中(例如稳定的细胞系中)稳定地维持人工核酸或载体。

优选地，细胞是哺乳动物细胞，如人对象、家畜、实验动物的细胞，如小鼠或大鼠细胞。优选地，细胞是人细胞。细胞可以是已建立的细胞系，如CHO、BHK、293T、COS-7、HELA、HEK、Jurkat细胞系等的细胞，或者细胞可以是原代细胞，如人皮肤成纤维(HDF)细胞等，优选从有机体分离的细胞。在优选的实施方式中，细胞是哺乳动物对象，优选人对象的分离的细胞。

包含人工核酸的组合物

在进一步的方面，本发明涉及组合物，其包含本文所述的人工核酸、载体或细胞，以及任选地另外的赋形剂，优选药学上可接受的赋形剂。本文所述的组合物优选是药物组合物。本文所述的组合物可以用于对象的治疗或预防，如基因疗法方法。可选地，组合物还可以用于诊断目的或实验室用途，例如体外实验。

优选地，组合物进一步包含一种或多种优选地药学上可接受的媒介、稀释剂和/或赋形剂。在本发明的上下文中，药学上可接受的媒介通常包括本文所述的组合物的液体或非液体基础。在一个实施方式中，以液体形式提供组合物。在本上下文中，优选地，媒介是基于水的，如无热原水、等渗盐水或缓冲(水性)溶液，例如磷酸盐、柠檬酸盐等缓冲溶液。相对于特定参考介质，缓冲液可以是高渗、等渗或低渗的，即相对于特定参考介质，缓冲液可以具有较高、相同或较低的盐含量，其中优选地可以使用上述盐的这种浓度，其不由于渗透或其它浓缩作用而导致哺乳动物细胞受损。参考介质是例如，体内方法产生的液体，如血液、淋巴液、细胞溶质液体，或其它体液，或例如可以用作体外方法中的参考介质的液体，如常用的缓冲液或液体。这种常用的缓冲液或液体是技术人员已知的。林格氏-乳酸溶液特别优选作为液体基础。

适用于给予对象的一种或多种相容性固体或液体填充剂或稀释剂或包封化合物也可以用于本发明的药物组合物。本文所用的术语“相容性”优选地意为(药物)组合物的这些组分能够与本文所定义的人工核酸、载体或细胞以不发生相互作用的方式混合，该相互作用将基本上降低在典型使用条件下的组合物的药效。

根据本发明的组合物可以任选地进一步包含一种或多种另外的药物活性组分。在本上下文中，药物活性组分是表现治愈、改善或预防特定适应症或疾病的治疗效果的化合物。这种化合物包括但不限于肽或蛋白质、核酸、(治疗活性)低分子量有机或无机化合物(分子量小于5000，优选小于1000)、糖、抗原或抗体或本领域已知的其它治疗剂。

此外，组合物可以包含用于人工核酸或载体的运载体(carrier)。这种运载体可以适合于介导在生理上可接受的液体中的溶解、药物活性人工核酸分子或载体的转运或细胞摄取。因此，这种运载体可以是适合于储存和递送本文所述的人工核酸分子或载体的组分。这种组分可以是例如可以用作转染或络合剂的阳离子或聚阳离子运载体或化合物。在本文中，特别优选的转染或络合剂是阳离子或聚阳离子化合物。

术语“阳离子化合物”通常指代带电荷的分子，其在通常为1至9的pH值下，优选在9或以下的pH值(例如5至9)下，或8以下(例如5至8)或7以下(例如5至7)，最优选地在生理pH(例如7.3至7.4)下带正电荷(阳离子)。因此，阳离子化合物可以是任何带正电荷的化合物或聚合物，优选地选自阳离子肽或蛋白质或阳离子脂质，其在生理条件下，特别是在体内生理条件下带正电荷。“阳离子肽或蛋白质”可以含有至少一个带正电荷的氨基酸，或多于一种带正电荷的氨基酸，例如选自Arg、His、Lys或Orn。因此，“聚阳离子化合物”也在给定条件下表现多于一个正电荷的范围内。

本文所述的组合物优选地包含裸露形式或复合形式的人工核酸或载体。在优选的实施方式中，组合物包含纳米颗粒，优选脂质纳米颗粒或脂质体形式的人工核酸或载体。

试剂盒

根据进一步的方面，本发明涉及试剂盒或多部分试剂盒(kit of parts)，其包含根据本发明的人工核酸分子、载体、细胞和/或(药物)组合物。

优选地，试剂盒另外包含使用说明书、用于转染的细胞、用于给予组合物的手段、用于溶解或稀释人工核酸分子、载体、细胞或组合物的(药学上可接受的)运载体或媒介和/或(药学上可接受的)溶液。在优选的实施方式中，试剂盒包含液体或固体(例如冻干)形式的本文所述的人工核酸或载体，以及用于给药的(药学上可接受的)媒介。例如，试剂盒可以包含在给予对象之前混合的人工核酸或载体和媒介(例如水、PBS、林格氏-乳酸或另外合适的缓冲液)。

人工核酸、载体、组合物或细胞的应用

在进一步的方面，本发明涉及本文所述的人工核酸、载体、组合物或细胞的应用。

具体地，本发明包含用于定点编辑目标RNA的人工核酸、载体、组合物或细胞的应用。其中，本文所述的人工核酸、载体、组合物或细胞优选用于促进目标RNA的位点特异性编辑，优选地通过经由靶向序列特异性结合目标RNA和通过将本文所述的脱氨酶募集至目标位点。反应可以在体外或体内发生。

在优选的实施方式中，将人工核酸、载体或组合物给予或引入包含要编辑的目标RNA的细胞中。所述包含目标RNA的细胞优选地进一步包含优选本文所述的脱氨酶。所述脱氨酶优选为内源性脱氨酶，更优选为腺苷或胞苷脱氨酶，或重组脱氨酶(如标记的脱氨酶或突变型脱氨酶，优选如本文所述)，其优选在人工核酸、载体或组合物之前或同时在所述细胞中稳定表达或引入所述细胞中。可选地，包含本文所述的人工核酸或载体的细胞通过与细胞和目标RNA接触或通过将目标RNA引入细胞中(例如通过转染，优选如本文所述)而用于定点编辑目标RNA。

在进一步优选的实施方式中，本发明提供了定点编辑目标RNA的方法，包括使目标RNA与人工核酸接触，并且基本上包括本文所述的关于定点编辑RNA的人工核酸、载体、组合物或细胞的应用的步骤。

编辑反应优选地通过目标RNA的序列分析来监测或控制。

本文所述的应用和方法可以进一步用于疾病或障碍的体外诊断。其中，疾病或障碍优选地选自传染性疾病、肿瘤疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、过敏症和神经系统疾病或障碍。

人工核酸、载体、组合物或细胞的医学应用

在进一步的方面，提供了本文所述的人工核酸、载体、组合物、细胞或试剂盒以用作药物，例如基因治疗。优选地，提供了本文所述的人工核酸、载体、组合物、细胞或试剂盒以用于治疗或预防选自传染性疾病、肿瘤疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、过敏症和神经系统疾病或障碍的疾病或障碍。根据优选的实施方式，提供了本文所述的人工核酸、载体、组合物、细胞或试剂盒以用作药物或用于治疗或预防优选如本文所述的疾病或障碍，其中用作药物或治疗或预防包括定点编辑目标RNA的步骤。

一方面，本发明进一步提供了用于治疗患有疾病或障碍的对象的方法，该方法包括将有效量的本文所述的人工核酸、载体、组合物或细胞给予对象，其中疾病或障碍优选地选自传染性疾病、肿瘤疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、过敏症和神经系统疾病或障碍。

本文所述的人工核酸、载体、细胞或(药物)组合物可以口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、经鼻、经颊、阴道、通过植入的储液器或通过喷射注射给予。本文所用的术语肠胃外包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病变内(intralesional)、颅内、经皮、皮内、肺内、腹膜内、心内、动脉内和舌下注射或输注技术。在优选的实施方式中，本文所述的人工核酸分子、载体、细胞或(药物)组合物通过无针注射(例如喷射注射)给予。

优选地，本文所述的人工核酸、载体、细胞或(药物)组合物是肠胃外给予的，例如通过肠胃外注射，更优选地通过皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病变内、颅内、经皮、皮内、肺内、腹膜内、心内、动脉内、舌下注射或通过输注技术。特别优选的是皮内和肌内注射。本发明的药物组合物的无菌注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可以根据本领域已知的技术，使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。

本文所述的人工核酸、载体、细胞或(药物)组合物也可以以任何口服可接受的剂型(包括但不限于胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液)口服给予。

本文所述的人工核酸、载体、细胞或(药物)组合物也可以局部给予，特别是当治疗的目标包括局部应用容易达到的区域或器官(例如包括皮肤或任何其它可及的上皮组织疾病)时。针对这些区域或器官中的每一个容易地制备合适的局部制剂。对于局部应用，可以将本文所述的人工核酸、载体、细胞或(药物)组合物配制成悬浮或溶解在一种或多种运载体中的合适的软膏剂。

在一个实施方式中，用作药物包括转染哺乳动物细胞的步骤，优选地体外或离体转染哺乳动物细胞，更优选地体外转染由药物治疗的对象的分离细胞。如果应用包括体外转染分离的细胞，则用作药物可以进一步包括将转染的细胞重新给予患者。人工核酸或载体作为药物的应用可以进一步包括选择成功转染的分离细胞的步骤。因此，如果载体进一步包含选择标志物，则可能是有益的。

根据本发明的另一方面，提供了本文所述的人工核酸、载体、细胞或(药物)组合物以用于诊断疾病或障碍，其优选地选自传染性疾病、肿瘤疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、过敏症和神经系统疾病或障碍。

附图说明

以下所示的附图仅是示例性的，并且应进一步描述本发明。这些附图不应被解释为将本发明限于此。

图1：在工程化表达ADAR的细胞系(293Flp-In T-Rex)中进行编辑。

A)若干ASO设计的序列和化学修饰模式。B)通过编辑萤光素酶报道分子，用质粒编码的引导RNA进行初始序列筛选。C)通过将相应的化学修饰的ASO转染到所示表达ADAR的细胞系中来进行两个内源性转录物(ACTB、GAPDH)的比较性编辑。转染了单个ASO(针对GAPDH或ACTB)或两个ASO(针对GAPDH和ACTB)。B)中的数据显示为平均值±SD，N＝2个独立实验。C)中的数据显示为平均值±SD，N＝3个独立实验。A1p110＝ADAR1p110；A1p150＝ADAR1p150。

图2：通过用各种ASO转染在各种细胞和细胞系中募集内源性ADAR来编辑内源性转录物(GAPDH、ACTB、3’-UTR中的每个5’-UAG三联体)。如所示的，在存在或不存在IFN-α的情况下进行实验。

A)比较三种不同的ASO在HeLa细胞中募集内源性ADAR。转染单个引导RNA(针对GAPDH或ACTB)或两个引导RNA(针对GAPDH和ACTB)。“无R/G”意为缺少ADAR募集结构域的ASO。B)在GAPDH上对引导RNA v9.4和v9.5进行比较性编辑。C)在HeLa细胞中同种型特异性ADAR敲除对GADPH编辑产率的影响。D)通过Western印迹法验证敲除效率。E)确定以96-孔格式在HeLa细胞中用于编辑GAPDH的ASO v9.5的有效剂量(ED50)。ED50＝0.2pmol/孔(有IFN-α)和0.4pmol/孔(无IFN-α)。F)在有和无IFN-α的HeLa细胞中GAPDH编辑产率的时间过程。G)在各种标准(癌症)细胞系中，GAPDH编辑产率为5pmol/96孔(对于SH-SY5Y为25pmol/24孔)ASO v9.5。H)在各种原代人细胞中，具有ASO v9.5的GAPDH编辑产率(25pmol/24孔，如果没有另外说明)。HUVEC＝人脐静脉内皮细胞；HAEC＝人主动脉内皮细胞；NHA＝正常人星形胶质细胞；RPE＝人视网膜色素上皮；NHBE＝正常人支气管上皮。A-H)数据显示为平均值±SD，N＝3个独立实验，肝细胞中的实验是每个供体的单一测定或指示供体的平均值(均值±SD)。A1p150＝ADAR1p150。

图3：在原代细胞和应用中进行ORF编辑。

A)在表达应用ASO v9.4的相应ADAR同种型的293-Flp-In细胞中的内源性GAPDH的ORF(位点#2)与3’-UTR中5’-UAG密码子的编辑。B)用于ORF编辑的ASO设计v25。C)在HeLa和原代细胞中用ASO v25编辑GAPDH ORF中的5’-UAG位点(#1)。D)在HeLa和原代细胞中编辑STAT1的Tyr701位点(5’-UAU密码子)。E)在表达ADAR1p150的293细胞和HeLa细胞中编辑PiZZ突变(SERPINA1中的E342K，5’-CAA密码子)。将SERPINA1 E342K cDNA共转染或遗传整合到HeLa细胞中。当转染野生型SERPINA1时，A1AT分泌被标准化为分泌。A、C-D：数据显示为平均值±SD，N＝3个独立实验；肝细胞实验是每个供体的单一测定；n.d.＝未检测到编辑。

图4：在具有ASO v25的HeLa细胞中，GAPDH的ORF中编辑5’-UAG的编辑产率，ASOv25含有化学未修饰的与修饰的ADAR募集结构域。

将具有化学未修饰的ADAR募集结构域(未修饰的R/G)的ASO v25与具有另外化学修饰的相同序列的ASO(ADAR募集结构域中的所有嘧啶核苷酸均被骨架2’-O-甲基化)进行比较。将ASO转染到HeLa细胞中。数据显示为平均值±SD，N＝3个独立实验。

图5：根据本发明的ASO的优选实施方式。

A)靶向序列和募集部分中的一般结构。显示了募集部分的不同序列变型和靶向序列的不同结构。B)分别是靶向序列和募集部分的示例性修饰模式。

图6：未修饰和修饰的ASO的血清稳定性。

A)靶向密码子5’-AAA的引导RNA的血清稳定性。将在反密码子的5’位置具有修饰的(2’-O-甲基或2’-氟)核苷酸的引导RNA与相应未修饰的引导RNA进行比较。图2A显示了将引导RNA培育5分钟至12小时后的尿素PAGE凝胶(参见实施例5)。B)靶向密码子对血清稳定性的影响。C)靶向反密码子(3’-ACC)的修饰模式对血清稳定性的影响。

图7：通过由短的、化学修饰的引导RNA驱动的SNAP-标记的ADAR进行定点RNA编辑。

a)hADAR的双链RNA结合结构域(dsRBD)已被SNAP-标签取代。后者能够与被苄基鸟嘌呤(BG)修饰的引导RNA形成共价键。当与SNAP-ADAR结合时，引导RNA将附着的SNAP-ADAR蛋白靶向目标RNA，并形成由脱氨酶结构域催化的A-至-I编辑的必要二级结构。b)靶向具有5’-CCA反密码子的UAG位点的典型BG-引导RNA。该引导RNA为22-nt长，并通过2’-甲氧基化和末端硫代磷酸酯键紧密地化学稳定。前三个5’-末端核苷酸不与目标RNA碱基配对，而是用作接头。该序列优选地包含未修饰的或部分修饰的核糖核苷酸间隙(5’-CCA)，其面对目标位点并含有与目标腺苷相对的中央错配胞嘧啶，以有效脱氨。C6-氨基-接头位于引导RNA的5’-末端，以将BG修饰引入全长寡核苷酸中。c)实验设置。将具有稳定整合的SNAP-ADAR(SA)的细胞接种到含有多西环素(dox)的培养基的24孔板中，以诱导SA表达。24h后，将细胞用引导RNA逆转染。24h后，裂解细胞以用于RNA分离以分析RNA编辑。

图8：四个SNAP-ADAR的编辑性能。a)用针对指示的内源性转录物中的5’-UAG三联体的单个gRNA或4个gRNA转染表达相应SA酶的工程化293细胞系。b)、c)GAPDH转录物中编辑的时间和剂量依赖性。d)各种转录物，5’-UTR与ORF和3’-UTR中的5’-UAG位点的编辑。e)内源性GAPDH转录物的ORF中所有16个三联体(5’-NAN)的比较性编辑。a)-e)数据显示为平均值±SD，N＝3个独立实验，黑点表示各个数据点。

图9：控制SAQ细胞中的脱目标编辑。

a)为了避免在目标位点对相邻腺苷的无意编辑，可以通过2’-甲氧基化(M)或2’-氟化(F)修饰引导RNA中的相对碱基。这是对三联体CAA的示例性显示。b)当特别使用SA2Q细胞时，在三联体CAA、AAA、AAC和UAA中检测到相邻腺苷的脱目标编辑。然而，当应用策略时，脱目标编辑显著降低。数据显示为平均值±SD，N＝3个独立实验，黑点表示各个数据点。

图10：化学修饰对编辑产率和血清稳定性的影响。

分别使靶向序列中的3’-ACC反密码子(A)和3’-UCC反密码子(B)稳定化的化学修饰的实例，例如2’-F、2’-O-甲基、2’-脱氧和硫代磷酸酯修饰。

图11：分支和多拷贝的偶联剂与引导RNA的缀合。显示了将1xBG、2xBG或4xBG偶联到ASO的一个末端或两个位点的方案。这些结构允许将多个脱氨酶募集至目标，从而明显提高其编辑性能，例如关于效力(参见图12)。

图12：分支/多个偶联剂的应用结果。

已经测试了具有图11所示结构的各种引导RNA，其用于在表达SNAP-ADAR1Q的293-Flp-In细胞中的内源性STAT1转录物中对Tyr701密码子进行编辑。具体地，我们应用了分别包含5’-氨基接头或5’-和3’-氨基接头并将其连接至一个(单个)或两个(双)偶联剂(1xBG、2xBG或4xBG)的引导RNA。

具体实施方式

实施例

以下显示的实施例仅是示例性的，并且应进一步描述本发明。这些实施例不应被解释为将本发明限制于此。

实施例1：

通过在37℃下过夜用T7 RNA聚合酶(Thermo Scientific，美国)从线性合成的DNA模板(购自Sigma-Aldrich，德国)进行体外转录来产生未修饰的RNA寡核苷酸。将所得的RNA在乙醇中沉淀，并通过尿素(7M)聚丙烯酰胺(15％)凝胶电泳(PAGE)纯化，萃取到水中，用乙醇沉淀，并重悬和保存在无核酸酶的水中。所有化学修饰的RNA寡核苷酸购自Biospring(德国)、Eurogentec(比利时)或Dharmacon(美国)。长序列通过连接由两部分组装。

作为第一步，应用质粒传代的方法以筛选合适的引导RNA序列。报道编辑测定法(reporter editing assay)(图1B)，导致鉴定序列变体9.4，其在ADAR募集结构域中的RNA螺旋的5’位点具有另外的5bp。

在报道编辑测定法中，萤火虫萤光素酶在来自pShuttle-CMV质粒的CMV启动子的控制下表达。W417X琥珀色突变通过重叠PCR引入。通过Sanger测序确定克隆产物的序列。R/G-引导RNA在U6启动子的控制下由类似于Wettengel et al.描述的修饰的pSilencer骨架表达(Wettengel，J.，Reautschnig，J.，Geisler，S.，Kahle，P.J.，Stafforst，T.Harnessinghuman ADAR2 for RNA repair-Recoding a PINK1 mutation rescuesmitophagy.Nucl.Acids Res.45，2797-2808(2017)。通过Sanger测序确定克隆产物的序列。表1提供了应用的R/G-引导RNA的序列。

表1：R/G引导RNA

表1的图例：(N)＝RNA碱基，[N]＝2’-OMe RNA碱基，*＝硫代磷酸酯键，{N}＝LNA碱基

如Wettengel et al.和Heep et al.所述，产生含有相应基因组整合ADAR版本的Flp-In 293 T-Rex细胞(R78007，Thermo Fisher scientific)(Heep，M.，Mach，P.，Reautschnig，P.，Wettengel，J.，Stafforst，T.Applying Human ADAR1p110 andADAR1p150 for Site-Directed RNA Editing-G/C Substitution Stabilizes GuideRNAsAgainst Editing.Genes 8，34(2017))。细胞培养在DMEM+10％FBS+100μg/ml潮霉素B+15μg/ml杀稻瘟素S中。进行编辑时，将2.5×10⁵细胞/孔(ADAR1p110、ADAR1p150)或3x10⁵细胞/孔(ADAR2)接种在500μl DMEM+10％FBS+10ng/ml多西环素的聚D-赖氨酸包被的24-孔板中。24小时后，使用比率为3∶1的Lipofectamine-2000与质粒，用萤光素酶报道质粒(300ng)和R/G-引导RNA(1300ng)进行转染。每24h更换培养基直至收获。如上所述，在转染后72h分离RNA并测序。

即使在募集ADAR2方面效果不佳(降低35％编辑产率)，序列变体9.4仍将ADAR1p110的编辑产率提高近两倍。

在下一步中，通过给予化学稳定的反义寡核苷酸(ASO)替代引导RNA的质粒传代表达。在第一轮中，对三种化学稳定的ASO设计(v1、v9、v9.4)进行测试，以编辑GAPDH和ACTB中的3’-UTR的相应5’-UAG位点。虽然ADAR募集结构域由天然寡核苷酸组成，但是ASO的17nt反义部分被设计为具有与编辑位点相对的三个天然核糖核苷间隙的Antagomir样修饰的gapmer10(整体2′-O甲基化、3’-末端硫代磷酸酯键，图1A)，类似于Vogel et al.中所述(Vogel，P.，Schneider，M.F.，Wettengel，J.，Stafforst，T.Improving Site-Directed RNAEditing In Vitro and in Cell Culture by Chemical Modification of theGuideRNA.Angew.Chem.Int.Ed.53，6267-6271(2014))，以用于SNAP-ADAR方法。我们在持家基因ACTB或GAPDH的3’-UTR中构建了靶向特异性5’-UAG位点的ASO。

为了评估此类ASO的单个ADAR偏好，我们将其脂转染到在CMV tet-on启动子的控制下表达特定ADAR同种型(ADAR2、ADAR1p110或ADAR1p150)11的工程化293Flp-In T-Rex细胞中。在ASO转染前48小时，将2×10⁵个相应ADAR-Flp-In 293 T-Rex细胞/孔接种在含有10ng/mL多西环素的DMEM+10％FBS的24孔板中，以诱导ADAR基因表达。48小时后，将细胞分离并在96孔板中逆转染。为此，分别在单独的试管中各自用OptiMEM将相应的ASO(5pmol/孔，除非另有说明)和Lipofectamine 2000(0.75μL/孔)稀释至10μL的体积。5分钟后，将两种溶液混合，并将DMEM+10％FBS+10ng/mL多西环素中的100μL细胞悬浮液(5×10⁴个细胞)添加至96孔内的转染混合物。24小时后，如上所述收获细胞以用于RNA分离和测序。

值得注意的是，在表达ADAR1p150的细胞中，两个目标均检测到极高的编辑产率(75-85％)(图1C)。ADAR1-同种型p110的编辑产率较低，范围为12-50％，然而，数据清楚显示，与初始形式1相比，新引导RNA序列9.4的编辑产率具有强大(2-3倍)的优势。使用ADAR2进行编辑的范围保持在与ADAR1p110相当的范围内(15-50％)，与旧形式1相比，新设计9.4的有效性再次降低。最后，我们通过两种ASO的共转染测试了两种转录物的并发编辑(concurrent editing)(图1C，右图)。编辑产率几乎保持不变，表明定点RNA编辑可以潜在地同时在若干位点或转录物上进行。

实施例2：

在另一系列实验中，通过对相应ASO进行简单的脂转染，利用内源性表达的ADAR来编辑HeLa细胞中两个持家基因GAPDH和ACTB的3’-UTR中的5’-UAG密码子。

为此，HeLa细胞(目录号：ATCC CCL-2)培养在DMEM+10％FBS+P/S(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)中。将100μL DMEM+10％FBS(+600单位IFN-α，Merck，目录号IF007，批号2937858)中的5×10⁴个细胞添加至96-孔形式的0.5μL Lipofectamine 2000和5pmol引导RNA/孔的转染混合物中。为了对两种不同ASO进行并发编辑，将2.5pmol的每种相应ASO共转染。24小时后，收获细胞以用于RNA分离和测序。

仅包含特异性结构域但缺乏ADAR募集结构域的对照ASO不引发任何编辑(图1A、2A)。使用初始序列v1和设计v4观察到一些编辑(图2A)。然而，新序列v9.4在两个转录物中均提供了明显更高的编辑产率，约为40％。考虑到ASO设计v9.4在ADARp150上效果特别好的情况，使用被IFN-α(已知诱导ADAR1p150表达)预处理的HeLa细胞重复实验。实际上，对于所有ASO设计(v1、v4、v9.4)，IFN-α处理几乎使编辑产率翻倍，并且两种转录物的编辑产率上至70％。结果证实序列v9.4在利用内源性表达的ADAR中具有优势。

同样在这一系列实验中，在同时共转染两个引导RNA后，进一步分析两个转录物的编辑。同样在此设置下，编辑产率在高水平下保持不变(图2A，右图)。为了评估化学修饰的影响，还使用未修饰的体外转录的相同序列的引导RNA测试Flp-In细胞中过表达的ADAR的募集，并且发现与化学稳定的ASO相比，其差得多。

下一步，将化学修饰扩展到ADAR募集结构域中。具体地，通过2′-O-甲基化和硫代磷酸酯键使5’-末端稳定，并且所有嘧啶被其2′-O-甲基化类似物取代。即使进行了重大修饰，此ASO设计v9.5在HeLa细胞中募集内源性ADAR方面也相当或甚至更好(图2B)，表明ADARs′dsRNA-结合结构域接受了广泛的化学修饰。

为了评估ASO v9.5在HeLa细胞中募集了哪些ADAR同种型，在Western印迹实验中确定ADAR的表达。

为了进行western印迹，在逆转染siRNA后72h，收集细胞并在尿素裂解缓冲液(8M尿素，100mM NaH₂PO₄，10mM Tris，pH 8，0)中裂解。使用23-规格注射器施加剪切力，并通过在4℃下以30.000g离心15min去除细胞碎片。然后使用Bradford测定标准化总蛋白质量，并将1x Laemmli缓冲液中的适量蛋白裂解物上样至SDS-PAGE(4％堆积，12％分离凝胶)。使用储罐印迹系统(tank-blotting-system)在30V下将蛋白质转移至PVDF膜上过夜。在室温下，将膜在5％脱脂奶粉TBST+50μg/ml抗生素蛋白中封闭2h，然后与一抗(5％脱脂奶粉TBST+1∶1000α-ADAR1，Santa Cruz，sc-73408或α-ADAR2，Santa Cruz，sc-73409+1∶40.000α-β-肌动蛋白，Sigma Aldrich，A5441)在4℃下一起培育过夜。将二抗(5％脱脂奶粉TBST+1∶10.000α-鼠-HRP+1∶50.000Precision Protein^TM StrepTactin-HRP缀合物，Bio-Rad，#1610381)在室温下培育1.5h。每次抗体培育后，将膜用TBST洗涤3x5min。使用1ml的Clarity WesternECL底物(Biorad)和Fusion SL Vilber Lourmat(Vilber)进行检测。

在Western印迹中，仅发现ADAR1p110表达良好，而ADAR1p150仅微弱表现，但可以明显被IFN-α诱导(图2D)。无法检测到ADAR2(数据未显示)。应用RNA干扰，以敲低特定的ADAR同种型。为此，用2.5pmol的siRNA以12孔格式逆转染HeLa细胞，以抗ADAR1(两种同种型，Dharmacon、SMARTpool：ON-TARGETplus ADAR(103)siRNA，L-008630-00-0005)、ADAR1p150(Ambion(LifeTechnologies)，正义链5’-GCCUCGCGGGCGCAAUGAAtt(SEQ ID NO：90)；反义链：5’-UUCAUUGCGCCCGCGAGGCat(SEQ ID NO：91))、ADAR2(Dharmacon，SMARTpool：ON-TARGETplus ADARB1(104)siRNA，L-009263-01-0005)或模拟物(mock)(Dharmacon，siGENOME Non-Targeting siRNA Pool#2，D-001206-14-05)。在添加800μl DMEM+含1.2×10⁵个HeLa细胞的10％FBS之前，将200μl含有2.5μl相应siRNA(1nM)和3μl HiPerFect(Qiagen，德国)和OptiMEM的转染混合物均匀分布在每个孔中。每24h更换一次培养基。对于RNA编辑实验，在siRNA转染后48小时分离细胞，并如上所述用相应的ASO逆转染。

当转染siRNA以分别抗ADAR2或模拟物时，根据IFN-α，编辑产率分别保持在35％和70％不变(图2C)。然而，长同种型ADAR1p150的特异性敲低导致编辑产率降低至10％和20％。两个ADAR1同种型的并发敲低消除了检测以下的编辑。这表明两个ADAR1同种型有助于编辑，然而，较弱表达的ADAR1的p150同种型对获得的编辑产率贡献最大。这与观察的IFN-α治疗的积极作用非常吻合(图2)，而且与ASO在表达ADAR1p150的293Flp-In细胞中的较好表现一致(图1C)。

当在20pmol和40fmol/96孔之间改变ASO v9.5的量时(图2E)，观察到编辑产率呈S形依存关系(sigmoidal dependency)，剂量为0.2pmol ASO/96孔(有IFN-α)和0.4pmol/孔(无IFN)时达到半最大产率。在≥2pmol/96孔时获得最大编辑产率。HeLa细胞中的效力似乎在与转染siRNA双链体以干扰RNA的效力相似的范围内。

在将5pmol/孔转染到快速分裂的HeLa细胞(10％FBS)后5天内，进一步分析编辑产率的时间轮廓(time profile)。为此目的，如上所述转染HeLa细胞。在转染前，将细胞用IFN-α处理24小时(如所指示的)。在所示的相应时间点收获细胞以用于RNA分离。对于转染后24小时后的时间点，在24小时后分离细胞并转移至24孔板中，以避免细胞过度生长。每24小时更换一次培养基(在指示时含有IFN-α)。通常在转染后12-48小时的时间窗口内观察到最大编辑产率，并且缓慢下降(图2F)。

为了评估在内源性ADAR募集有效的细胞系的范围，将ASO v9.5应用于一组10种永生化人标准(癌)细胞系(图2G)。所有细胞培养在DMEM+10％FBS+P/S中。5×10⁴个细胞/96孔的相应细胞系[HeLa细胞(目录号：ATCC CCL-2)、U2OS-Flp-In T-Rex(由Elmar Schiebel教授友好捐赠)、SK-N-BE(2)(目录号：ATCC CRL-2271)、SK-N-BE(2)(目录号：ATCC CRL-2271)、U87MG(目录号：ATCC HTB-14)、Huh7(CLS GmbH，Heidelberg，目录号：300156)、HepG2(DSMZ，Braunschweig，德国目录号：ACC180)、AKN-1(由Nüssler实验室友好捐赠)、空的HEK-Flp-In T-Rex(R78007，Thermo Fisher scientific，已用空的pcDNA5载体稳定转染)和A549(欧洲认证的细胞培养物收藏ECACC 86012804)]如上针对HeLa细胞所述用相应ASO逆转染，而无需进一步优化。仅SH-SY5Y(目录号：ATCC CRL-2266)细胞以24孔格式进行了不同的逆转染：向由2.5μL Lipofectamine2000和25pmol ASO的OptiMEM组成的100μL转染混合物中添加5×10⁵个细胞的500μL培养基(+3000U IFN-α)。在一些细胞系中，例如A549和Huh7，编辑产率与HeLa细胞相当，而其它的编辑产率则较低。在所有条件下，使用“空的”293Flp-In细胞系(整合了空的pcDNA5)获得最低的编辑水平，产率为＜11％。在IFN-α处理之前，实现4％-34％(平均18.5％)的编辑产率。如前所述，在IFN-α处理后，产率提高2-3倍，范围为11％-73％(平均46.8％)。

为了更好地评估募集ADAR的ASO的潜在治疗范围，测试了一组来自不同组织的七个原代细胞，包括成纤维细胞(来自帕金森患者)和可商业获得的星形胶质细胞、肝细胞(若干供体)、来自视网膜和支气管的上皮细胞和来自动脉和静脉血管的内皮细胞(图2H)。除原代成纤维细胞外，所有原代细胞均购自Lonza，这是Valente实验室的善意礼物。原代成纤维细胞培养在DMEM+20％FBS中。如所示的，其它细胞系培养在其相应的商业培养基中：人脐静脉内皮细胞(HUVEC，Lonza目录号：CC-2517)和人主动脉内皮细胞(HAEC，Lonza目录号：CC-2535)培养在具有低血清生长补充剂(LSGS Thermo Fisher Scientific目录号：S00310)的培养基200PRF(Thermo Fisher Scientific目录号：M200PRF500)中、正常人星形胶质细胞(NHA，Lonza目录号：CC-2565)培养在具有AGM SingleQuot试剂盒补充&生长因子(Lonza目录号：CC-4123)的ABM基础培养基(Lonza目录号：CC-3187)中、人视网膜色素上皮细胞(H-RPE，Lonza目录号：194987)培养在具有人角膜生长补充剂(Thermo Fisher Scientific目录号：S0095)的EpiLife培养基(Thermo Fisher Scientific目录号：MEPI500CA)中、正常人支气管上皮细胞(NHBE，Lonza目录号：CC-2540)培养在具有支气管上皮细胞生长试剂盒(LGC标准目录号：ATCC-PCS-300-040)的气道上皮细胞基础培养基(LGC标准目录号：ATCC-PCS-300-030)中，和原代人肝细胞(PHH，Lonza目录号：HUCPI)在Cryo HH解冻培养基(Lonza目录号：MCHT50)中冷冻，接种在带有补充剂的肝细胞电镀培养基(Hepatocyte PlatingMedium)(Lonza目录号：MP100)中，并在接种后6小时培养在带有补充剂的肝细胞维持培养基(Lonza目录号：MM250)中。在以24孔格式转染ASO之前24小时，接种3.5×10⁴HUVEC和HAEC、1×10⁵NHA、H-RPE和NHBE和4.5×10⁵PHH。对于PHH，使用鼠胶原蛋白I-包被的24-孔板(GreinerBioOne)。转染前不久，更换培养基(如果指示，在500μL培养基/孔中加上3000UIFN-α)。对于每个孔，分别以总体积50μL OptiMEM单独稀释1.5μL Lipofectamine RNAiMAX(Thermo Fisher Scientific)和25pmol ASO。培育后5分钟，将两种溶液合并，在培育另外20min后，将100μL转染混合物均匀分布在一个孔中。24h后，收获细胞用于RNA分离和测序。出乎意料的是，与永生化细胞相比，在原代细胞中检测到更高的编辑水平，获得10％-63％(平均31.5％)的编辑水平。值得注意的是，在原代肝细胞样品和患者成纤维细胞中，编辑水平高于HeLa细胞。再次，在IFN-α处理后，所有细胞中的编辑产率均增加，范围为35％-77％(平均62.6％)。将一系列ASO稀释液(25-0.2pmol ASO v9.5/24孔，无IFN处理)转染到供体#1和#2的肝细胞中，表明存在明显的剂量依赖性(图2H)。

实施例3：

在表征ASO设计9.4以在3’-UTR中编辑5’-UAG三联体后，使用基于ASO的v9.4测试表达ADAR的293细胞系中GAPDH的ORF中5’-UAG三联体的编辑(也参见实施例1)。比较使用三种ADAR获得的编辑产率，显示ORF中的编辑产率遵循与之前3’-UTR相同的趋势(ADAR1p150＞ADAR1p110≈ADAR2)，尽管编辑产率通常较低(11％-55％，参见图3A)。

通过增加特异性结构域的长度和包括LNA修饰进一步优化ASO结构，以改善目标结合动力学。我们确定了ASO设计v25，其由未改变的ADAR募集结构域组成，但含有40nt特异性结构域，其被2′-O-甲基化、硫代磷酸酯键部分甲基化，并含有三个LNA修饰(图3B)。转染到HeLa细胞中后，ASO v25在没有IFN-α的情况下实现26±3％的编辑产率，在有IFN-α的情况下实现42.7±1.5％的编辑产率。值得注意的是，ADAR募集结构域的化学修饰是重要的。在没有化学修饰的情况下，v25在不存在IFN-α的情况下不进行编辑，而仅在有IFN-α的情况下进行中度编辑(13.7±3.5％，图4)。新设计v25也在若干原代细胞中进行了测试，以在GAPDH的ORF中编辑5’-UAG位点。在进行IFN-α处理之前，获得12.7±2.1％(成纤维细胞)、9.3±0.6％(RPE)和38％(肝细胞，一个供体)的编辑水平。如前所述，IFN-α处理将编辑水平提高至22.7±0.6％(成纤维细胞)、32.3±4.5％(RPE)和45％(肝细胞，一个供体)。

实施例4：

为了评估这种ASO的治疗潜力，测试了两个治疗相关的脱氨位点的编辑。首先，靶向内源性STAT1(Tyr701)中的磷酸化位点，其脱氨，从而切换蛋白质作为转录因子。编辑后，相应5′-UIU密码子编码Cys，该氨基酸无法模拟磷酸化的Tyr。在这些实验中使用上述基于ASO的v25设计。在IFN-α处理之前，在原代成纤维细胞中实现21.0±6.2％的编辑产率，在RPE中实现上至7％的编辑产率(图3D)。在存在IFN-α的情况下，产率增加至32±7％(成纤维细胞)和19.7±2.5％(RPE)。在HeLa细胞中获得相似的值。总体上，在原代细胞系中通过募集内源性ADAR来编辑内源性STAT1转录物可能产生中等产率。

作为第二个位点，测试了SERPINA1转录物中PiZZ突变(E342K)的编辑，这是α1-抗胰蛋白酶缺乏症(A1AD)的最常见原因。调节中性粒细胞弹性蛋白酶活性的抗胰蛋白酶的缺失导致严重的肺部损伤。此外，突变的抗胰蛋白酶在肝中积累并导致严重的肝损伤。首先，在施加基于v9.4设计的ASO的表达ADAR1p150的293细胞中过表达突变SERPINA1 cDNA后，测试E342K突变(5’-CAA三联体)的编辑。为了获得SERPINA1 cDNA以用于克隆，从HepG2细胞中分离总RNA，并进行逆转录。通过PCR将E342K突变插入到cDNA中，并使用HindIII和ApaI限制，在CMV启动子的控制下，将SERPINA1野生型和E342K突变体各自克隆到pcDNA3.1载体上。为了使用piggyBac转座子系统进行SERPINA1的基因组整合，使用与上述相同的限制性位点将野生型和突变型cDNA克隆到PB-CA载体上。转染前24小时，将1x10⁶个HeLa细胞接种到6孔板中。根据制造商的方案，使用10.5μL FuGENE6(Promega)共转染1μg的piggyBae转座酶载体(Transposagen Biopharmaceuticals)和2.5μg的SERPINA1 PB-CA载体。24小时后，在含有10μg/mL嘌呤霉素的DMEM+10％FBS培养基中选择细胞2周。为了进行编辑，将稳定转染或质粒转染(对于Hela为300ng质粒/0.9μL FuGENE6，对于Flp-ADAR1p150细胞为100ng质粒/0.3μL Lipofectamine2000)的细胞用上述相应的ASO逆转染。24小时后，收集细胞上清液以用于A1AT-ELISA，并收获细胞以用于RNA分离和测序。A1AT-ELISA用商业试剂盒(目录号：ab108799，Abcam)根据制造商的方案进行。来自三个生物学重复的样品以技术重复进行测量。使用线性回归由标准曲线计算A1AT蛋白量。

仅在存在ASO的情况下，在目标位点确定29±2％的编辑产率(图3E)。通过ELISA测定法测量α1-抗胰蛋白酶(A1AT)的分泌，并对用野生型SERPINA cDNA转染的细胞的分泌进行标准化。分泌水平从修复前的14±1.8％提高到修复后的27±4.3％。除了5’-UAG三联体之外，5’-CAA三联体含有最接近目标A的可编辑的腺苷。的确，在近端位点检测到一些小的编辑，此问题可以通过目标核苷酸周围的ASO的进一步化学修饰来解决。为了测试内源性ADAR对导致A1AD突变的修复，使用piggyBac系统或通过质粒传代的SERPINA1 eDNA的过表达创建稳定表达突变SERPINA1的HeLa细胞系。通过应用基于v25设计的ASO，通过募集内源性ADAR获得19±2％(整合的cDNA，有IFN-α)和21±4％(cDNA的瞬时表达，有IFN-α)的编辑水平。

实施例5：

为了测试引导RNA的稳定性，已将引导RNA在含有10％FBS的PBS缓冲液中培育限定量的时间(0min、5min、10min、1h、3h、6h、12h或24h)。培育后，将引导RNA在15％尿素(7M)-PAGE上分离，用SYBR Gold染色，并用Typhoon FLA生物分子成像仪拍照和定量。具有未修饰的3nt反密码子的引导RNA在血清中的半衰期通常很短(分钟)。具有靶向5’-AAA密码子的3’-UCU反密码子的引导RNA(例如图6A)由于降解，在第一培育时间点(5min)基本上无法检测。然而，已经用2’-F或2’-O-甲基进行的单个骨架修饰提高了稳定性(图6A和B)。例如，对于反密码子3’-ACC，显示半衰期通过若干修饰模式得到显著改善，从5min以下提高至24h左右(约300倍的提高)，每个修饰模式均修饰了反密码子中的所有核苷酸。进一步，与在3nt反密码子中未修饰的引导RNA(BG-85)相比，通过这些修饰也提高了编辑产率(参见，例如，BG-150/BG-151，图6C)。

实施例6：

在平行方法中，将与偶联剂缀合的引导RNA用于编辑带有标记ADAR的内源性转录物。例如，BG-缀合的引导RNA与SNAP-标记的ADAR结合使用(参见图7)。如Hanswillemenkeet al.所述，从商业上获得的含有5’-氨基-C6接头的寡核苷酸(BioSpring，德国)合成并PAGE纯化BG-缀合的gRNA(J.Am.Chem.Soc.2015，137，15875-15881)。表2中提供了所有引导RNA的序列和化学修饰。

表2：与标记的ADAR一起使用的引导RNA

表2的图例：以粗体突出显示的核苷酸未修饰，并与三联体相对，其中目标腺苷位于中间。以斜体突出显示的核苷酸通过2’-O-甲基化修饰，2’-氟化核苷酸变灰。骨架含有如“s”所示的末端硫代磷酸酯键。5’末端的前三个核苷酸与mRNA底物不互补，但是充当gRNA与SNAP-标签之间的接头序列。

对于此研究，所有NH₂-引导RNA均作为具有5’-C6氨基接头的HPLC-纯化ssRNA购自Biospring(德国)。作为商业BG衍生物的替代，我们的方案可以用于引入BG部分。通过与EDCI·HCl(12μl，17.4mg/ml的DMSO)和NHS(12μl，17.8mg/ml的DMSO)在30℃下培育1h，将与羧酸接头2，3(12μl，60mM的DMSO)连接的苄基鸟嘌呤原位活化为OSu-酯。然后，将NH₂-引导RNA(25μl，6μg/μl)和DIPEA(12μl，1∶20的DMSO)添加至预激活的混合物中并培育(90min，30℃)。20 19粗制的BG-引导RNA通过20％尿素PAGE从未反应的NH₂-引导RNA纯化，然后用H2O(700μl，在4℃下过夜)萃取。用乙酸钠(0.1体积，3.0M)和乙醇(3体积，100％，在-80℃下过夜)完成RNA沉淀。用乙醇(75％)洗涤BG-引导RNA，并溶解于水(60μl)中。

产生稳定表达SNAP-ADAR1(SA1)、SNAP-ADAR2(SA2)，2的细胞系及其高活性E Q变体10SA1Q和SA2Q。每种相应的酶(SA1(wt&Q)和SA2(wt和Q))在前述293Flip-In细胞(R78007，Thermo Fisher scientific)的基因组中的FRT位点处在dox诱导型CMV启动子的控制下整合为单个拷贝(参见Wettengel，J.，Reautschnig，J.，Geisler，S.，Kahle，P.J.，Stafforst，T.Harnessing human ADAR2 for RNA repair -Recoding a PINK1 mutationrescues mitophagy.Nucl.Acids Res.45，2797-2808(2017)；或Cox，D.B.T.，Gootenberg，J.S.，Abudayyeh，O.O.，Franklin，B.，Kellner，M.J.，Joung，J.，Zhang，F.RNA editingwith CRISPR-Cas13，Science，10.1126/science.aaq0180(2017)。由多西环素(10ng/ml)将所有四种酶的酶表达诱导至基本相当的水平，如Western印迹和荧光显微镜所证实(数据未显示)。同样在RNA水平，SA1(wt&Q)和SA2(wt和Q)的表达水平分别与平均FPKM值基本相当，对SA1(Q)和SA2(Q)分别为679和814。E Q突变并没有改变蛋白质定位。SA1(Q)定位于胞质和核质中；SA2(Q)主要定位于胞质中。为了确定不同SNAP-ADAR蛋白质的位置，以24孔格式在聚D-赖氨酸包被的盖玻片上将1×10³个细胞接种在500μl有或无多西环素(10ng/ml)的选择培养基中。一天后，完成SNAP标签的BG-FITC标记和核染色。为了验证SNAP-ADAR蛋白的量，使用Western印迹分析。为此，将3×10⁵个细胞以24孔格式接种在500μl有或无多西环素(10ng/ml)的选择培养基中一天。然后，用尿素缓冲液(8M尿素的10mM Tris，100mM NaH₂PO₄，pH 8.0)裂解细胞。通过SDS-PAGE分离蛋白裂解物(5μg)，并转移到PVDF膜(Bio-Rad实验室，美国)，用一抗进行免疫印迹，以抗SNAP标签(1∶1000，P9310S，New England生物实验室，美国)和β-肌动蛋白(1∶40000，A5441，Sigma Aldrich，美国)。然后，将印迹与针对兔(1∶10000，111-035-003，Jackson Immuno Research实验室，美国)和鼠(1∶10000，115-035-003，Jackson Immuno Research实验室，美国)的HRP-缀合的二抗一起培育，并通过增强的化学发光作用进行可视化。

通过短的、化学稳定的BG-引导RNA的转染启动编辑，并分析四种靶向内源性mRNA：ACTB、GAPDH、GUSB和SA1/2的3′-UTR中特异性5′-UAG三联体中cDNA中的正式A-至-G转化。对于两种野生型酶(SA1/2)，根据目标实现40-80％的编辑产率(图8a)。应用高活性突变体(SA1Q/SA2Q)使产率提高至65-90％。转染后约3h获得最大编辑产率(80-90％(图1b)，保持恒定3天，然后缓慢下降，这可能由于细胞分裂稀释了引导RNA酶缀合物。与野生型酶(SA1&SA2)相比，活化的酶(SA1Q&SA2Q)的效力提高上至12倍，与1-2pmol/孔相比，实现0.15pmol/孔的半最大编辑产率(图1c)。通过共转染四个引导RNA来测试所有四种转录物的并发编辑。值得注意的是，产率保持不变(图1a)。与ORF和5′-UTR相比，3′-UTR的编辑产率更高(图1d)，这可能由于翻译的干扰。更快的酶(SA1Q&SA2Q)将5′-UTR的产率从25-50％提高至60-75％，并将ORF的产率从15-60％提高至50-85％(图1d)。此外，嘌呤霉素的翻译抑制使SA1/2细胞中的ORF编辑增加至3′-UTR编辑的水平(数据未显示)，为了评估密码子范围，测试了内源性GAPDH的ORF中所有16种可能的5′-NAN三联体的SA1Q和SA2Q。获得了从极少至几乎定量的产率，这反映了ADAR的已知偏好(图1e)。尽管通常对于5′-GAN三联体的编辑难(＜30％)，但是对于10/16三联体实现了显著的产率(＞50％)。对于7/16三联体，至少一种酶获得了出色的编辑产率(＞70％)。

实施例7：

RNA编辑的主要目的是抑制异位编辑(参见图9a)。因此测试了是否可以通过使用本文所述的引导RNA的化学修饰形式来避免异位编辑。仅对于富含腺苷的三联体(AAC、AAA、UAA、CAA)，检测了一些脱目标编辑，主要是SA2Q(5-75％)，以及主要是CAA三联体(图9b，右图，“r”)。如果在与目标腺苷相对的引导RNA中存在三个天然核苷酸，则脱目标编辑较高(图9b，具体是右图，“r”)。仔细包含进一步的化学修饰(2′-甲氧基、2′-氟)将CAA三联体处的脱目标编辑限制为20％，并将所有其它位点的脱目标编辑限制为＜10％，而不降低目标编辑(图9b，“M”、“F”)。值得注意的是，至少对于AAA而言，另外的修饰甚至将目标产率从40％提高至50％。

实施例8：

关于其对RNA编辑的作用，测试了分支接头和BG衍生的募集部分的多个拷贝。为此，在表达SNAP-ADAR1Q的293-Flp-In细胞中，针对内源性STAT1转录物中的Tyr701密码子，对各种引导RNA进行并排测试(在引导RNA转染之前，用10ng/ml多西环素诱导24h，在引导RNA转染后24h进行编辑分析)。具体地，应用包含5’-氨基接头或5’-和3’-氨基接头，并分别偶联至一个或两个募集部分的引导RNA。所得的引导RNA可能潜在地募集1至8个SNAP-ADAR1Q脱氨酶，如图11所示例。在存在饱和量的引导RNA(1pmol/孔或以上)的情况下，几乎所有的引导RNA均达到相同的编辑产率(70-80％)。仅单个1xBG引导RNA未达到最大产率，但以约60％的产率停止。允许募集多于一个的SNAP-ADAR1Q的引导RNA显示出效力增加，表明当降低引导RNA的量时，其保持高的编辑产率。例如，在单个1xBG的情况下，当引导RNA的量减少至0.1pmol/孔和0.01pmol/孔时，编辑产率下降至22％并低于检测。相比之下，对于双2xBG和双4xBG引导RNA，编辑产率在0.1pmol/孔时分别保持为58％和65％，而在0.01pmol/孔时降至仅17％和10％，因此明显提高了引导RNA的效力。

Claims

1.用于定点编辑目标RNA的人工核酸，所述人工核酸包含：

a)靶向序列，其包含与所述目标RNA中的目标序列互补的核酸序列，和

b)用于募集脱氨酶的募集部分，

其中所述靶向序列包含至少一个核苷酸，其中核碱基被化学修饰，和/或

其中所述靶向序列包含至少一个骨架修饰。

2.根据权利要求1所述的人工核酸，其中所述靶向序列包含至少一个化学修饰的核苷酸，其在2’位置被化学修饰。

3.根据权利要求2所述的人工核酸，其中

所述化学修饰的核苷酸在2’碳原子上包含取代基，其中所述取代基选自卤素、烷氧基、氢、芳氧基、氨基和氨基烷氧基，优选地选自2’-氢、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基和2’-氟；和/或

其中所述化学修饰的核苷酸选自锁定核酸(LNA)核苷酸、乙烯桥连核酸(ENA)核苷酸和(S)-约束乙基cEt核苷酸。

4.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，其中所述靶向序列包含至少一个骨架修饰，并且其中核苷酸包含修饰的磷酸酯基团，优选地选自硫代磷酸酯、磷酸硒酸酯、硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯类、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基膦酸酯、芳基膦酸酯和磷酸三酯。

5.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，其中所述靶向序列的至少40％的核苷酸在所述2’位置被化学修饰。

6.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，其中所述靶向序列在相应于所述目标序列中要编辑的核苷酸，优选要编辑的腺苷或胞苷核苷酸的位置处包含胞苷核苷酸或其变体、脱氧胞苷核苷酸或其变体、或无碱基位点。

7.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，

其中位于相应于所述目标序列中要编辑的核苷酸的位置的5’或3’的两个核苷酸或其变体中的至少一个，优选两个在所述2’碳原子上被化学修饰，其中所述2’碳原子连接至选自下列的取代基：卤素、烷氧基、氢、芳氧基、氨基和氨基烷氧基，优选地选自2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基、2’-氢和2’-氟；

和/或

其中位于相应于所述目标序列中要编辑的核苷酸的位置的5’或3’的两个核苷酸或其变体中的至少一个，优选两个包含修饰的磷酸酯基团，优选硫代磷酸酯基团。

8.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，其中所述靶向序列在相应于所述目标序列中要编辑的核苷酸的位置处包含胞苷核苷酸或其变体、脱氧胞苷核苷酸或其变体、或无碱基位点，和

其中位于相应于要编辑的核苷酸的位置的5’的核苷酸是嘧啶核苷酸，优选嘧啶核糖核苷酸或嘧啶脱氧核苷酸，并且其中所述嘧啶核苷酸包含核碱基，所述核碱基优选地通过2’-氢、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基或2’-O-氟在所述2’位置被化学修饰。

9.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，

其中所述靶向序列包含核酸序列：

3’A c C 5’，

其中

c是在相应于所述目标序列中要编辑的核苷酸，优选腺苷或胞苷，更优选腺苷的位置处的胞苷核苷酸或其变体、脱氧胞苷核苷酸或其变体、或无碱基位点；和

10.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，

其中所述靶向序列包含核酸序列：

3’As*c C* 5’，

其中

C是胞苷核苷酸或其变体；

其中星号(*)表示所述2’碳原子上的前述核苷酸被2’-氢(2’-脱氧)、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基或2’-氟化学修饰。

11.根据权利要求1至8中任一项所述的人工核酸，

其中所述靶向序列包含核酸序列：

3’Us*c C*5’，

其中

Us是尿苷核苷酸或其变体，优选尿苷核糖核苷酸或脱氧尿苷核苷酸，其进一步包含硫代磷酸酯基团；

C是胞苷核苷酸或其变体；

12.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，其中所述靶向序列的3’末端处的五个核苷酸中的至少两个包含修饰的磷酸酯基团，优选硫代磷酸酯基团。

13.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，其中所述靶向序列的3’末端处的五个核苷酸中的至少两个是LNA核苷酸、ENA核苷酸或(S)-约束乙基cEt核苷酸。

14.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，其中所述靶向序列包含：

至少一个包含修饰的磷酸酯基团的核苷酸，优选硫代磷酸酯核苷酸；

至少一个选自下列的核苷酸：LNA核苷酸、ENA核苷酸和(S)-约束乙基cEt核苷酸，优选LNA核苷酸；和

至少一个在所述2’碳原子上包含取代基的核苷酸，其中所述取代基选自卤素、烷氧基、氢、芳氧基、氨基和氨基烷氧基，优选地选自2’-氢、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基和2’-氟。

15.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，其中所述靶向序列的特征在于根据式(Ia)、(Ib)或(Ic)中的任一个的修饰模式：

(Ia)3’N_a C N_b 5’

其中

N是核苷酸或其变体，优选核糖核苷酸或其变体、脱氧核苷酸或其变体，更优选修饰的核糖核苷酸或修饰的脱氧核苷酸；

C是在相应于所述目标序列中要编辑的核苷酸的位置处的核苷酸，并且其中C是胞苷核苷酸或其变体、脱氧胞苷核苷酸或其变体、或无碱基位点；

a是1至40，优选6至10范围内的整数；

b是4至40范围内的整数；和

其中a+b在15至80的范围内；

(Ib)3’N_c Ns_d N_a C N_b Ns_e N_f 5’

其中

c是0至4范围内的整数；

d是1至10范围内的整数；

a是1至26范围内的整数；

b是4至40范围内的整数；

e是0至4范围内的整数；

f是0至4范围内的整数；

其中a+d+c在1至40的范围内；

其中b+e+f在4至40的范围内；和

其中a+d+c+b+e+f在15至80的范围内；

(Ic)3’N_c Nl_g N_h Nl_i N_a C N_b Nl_j N_k Nl₁ N_m 5’

其中

Nl是LNA核苷酸或修饰的LNA核苷酸；

C是0至4，优选1至3范围内的整数；

g、i是1至5范围内的整数；

h是1至30，优选1至5范围内的整数；

a是1至15范围内的整数；

b是4至30范围内的整数；

j是0至5，优选1至3范围内的整数；

k是4至30范围内的整数；

1是0至5，优选1至3范围内的整数；

m是0至3范围内的整数；

其中c+g+h+i+a在1至40的范围内；

其中b+j+k+l+m在4至40的范围内；和

其中c+g+h+i+a+b+j+k+l+m在15至80的范围内。

16.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，其中所述靶向序列的特征在于选自式II(a)至II(1)中的任一个的修饰模式：

(a)3’Ns₄ N₆ C N_7-29 5’；

(b)3’Ns₄ N_6-10 C N_9-12 Ns₂ 5’；

(c)3’Ns₂ N_11-15 C N_9-12 Ns₂ 5’；

(d)3’Nls₂ Ns₂ Nl N_6-10 C N_5-9 Nl₂ N Ns₂ 5’；

(e)3’Nls Ns Nls Ns N_6-10C N_4-sNl N Nl N Ns₂ 5’；

(f)3’Ns Nls Ns Nls N_6-10 C N_3-7Nl N Nl N₂ Ns₂ 5’；

(g)3’Ns₂ N Nl N Nl N_6-10 C N_4-8 Nl N Nl N Ns₂ 5’，

(h)3’Ns Nls Ns₂ Nl N₅ C N₅ Nl N_1-23 5’；

(i)3’Nls Ns Nls Ns N₈ C N₆ NlN_1-23 5’

(j)3’Ns Nls Ns₂ Nl N₅ C N₅Nl N₂₀Nl₂ 5’；

(k)3’Nls Ns Nls Ns N₈ C N₆ Nl N₂₀ Nl₂ 5’；和

(1)3’Ns₄ N₆ C N₉ Ns₂ 5’，

其中

Nl是LNA核苷酸或修饰的LNA核苷酸；

C是在相应于所述目标序列中要修饰的核苷酸的位置处的核苷酸，并且其中C是胞苷核苷酸或其变体、脱氧胞苷或其变体，优选脱氧胞苷核苷酸、或无碱基位点。

17.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，其中所述靶向序列包含核酸序列，其中，

除了相应于所述目标序列中要编辑的核苷酸的位置处的胞苷核苷酸或其变体、脱氧胞苷核苷酸或其变体、或无碱基位点之外，

除了LNA核苷酸之外，和

任选地，除了位于相应于所述目标序列中要编辑的核苷酸的位置处的所述核苷酸的5’或3’的两个核苷酸中的至少一个之外，

所有核苷酸均在所述2’碳原子上被化学修饰，所述2’碳原子连接至选自下列的取代基：卤素、烷氧基、氢、芳氧基、氨基和氨基烷氧基，优选地选自2’-氢、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基和2’-氟。

18.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，其中所述靶向序列包含选自下列的核酸序列：

5’U*U*C*A*C*U*UcA G*U*G*U*As*Us*Gs*Cs*C*3’ (SEQ ID NO：1)；

5’U*U*C*A*C*U*UcA G*U*G*U*As*Us*Gs*Cs*C*3’ (SEQ ID NO：2)；

5’A*C*C*U*C*C*AcU C*A*G*U*Gs*Us*Gs*As*U*3’ (SEQ ID NO：3)；

5’U*U*U*C*C*U*CcA C*U*G*U*Us*Gs*Cs*As*A*3’ (SEQ ID NO：4)；

5’U*G*U*G*U*A*UcU U*G*C*U*Gs*Us*Gs*As*G*3’ (SEQ ID NO：5)；

5’G*A*G*G*U*C*CcU G*G*G*G*Gs*Cs*Gs*Cs*U*3’ (SEQ ID NO：6)；

5’G*A*U*C*U*U*CcU G*A*U*G*Gs*Cs*Cs*As*C*3’ (SEQ ID NO：7)；

5’A*G*C*C*A*C*AcA C*U*C*C*Gs*Us*Cs*As*G*3’ (SEQ ID NO：8)；

5’G*A*U*U*U*U*CcU G*A*U*A*Gs*Cs*Us*As*C*3’ (SEQ ID NO：9)；

5’G*G*C*C*A*C*AcA U*U*C*U*Gs*Us*Cs*As*G*3’ (SEQ ID NO：10)；

5’G*A*U*C*U*U*CcU G*A*U*G*Gs*Cs*Cs*As*C*3’ (SEQ ID NO：11)；

5’G*G*C*C*A*C*AcA C*U*C*C*Gs*Us*Cs*As*G*3’ (SEQ ID NO：12)；

5’G*A*U*U*U*U*CcU G*A*U*A*Gs*Cs*As*As*C*3’ (SEQ ID NO：13)；

5’G*G*C*U*A*C*GcA C*U*C*U*Gs*Us*Cs*As*A*3’ (SEQ ID NO：14)；

5’A*G*G*C*C*G*CcG U*C*G*U*Gs*Gs*Cs*Gs*G*3’ (SEQ ID NO：15)；

5’C*C*G*C*U*C*CcU CcU C*A*G*C*Cs*Cs*Gs*Us*C*3’ (SEQ ID NO：16)；

5’A*C*G*C*C*A*CcA G*C*U*C*Cs*As*As*Cs*U*3’ (SEQ ID NO：17)；

5’G*U*C*U*C*A*CcA A*U*U*G*Cs*Us*Cs*Us*C*3’ (SEQ ID NO：18)；

5’G*A*A*A*U*A*CcA U*C*A*G*As*Us*Us*Us*G*3 (SEQ ID NO：19)；

5’A*A*U*U*A*G*CcU U*C*U*G*Gs*Cs*Cs*As*U*3’ (SEQ ID NO：20)；

5’G*A*U*C*A*G*CcU C*C*U*G*Gs*Cs*Cs*As*U*3’ (SEQ ID NO：21)；

5’G*A*U*C*A*G*CcU U*C*U*G*Gs*Cs*Cs*As*U*3’ (SEQ ID NO：22)；

5’G*A*U*C*A*G*CcU U*C*U*G*Gs*Cs*Cs*As*U*3’ (SEQ ID NO：23)；

5’C*A*C*U*G*C*CcA G*G*C*A*Us*Cs*As*Gs*C*3’ (SEQ ID NO：24)；

5’C*A*C*U*G*C*CcG G*G*C*A*Us*Cs*As*Gs*C*3’ (SEQ ID NO：25)；

5’U*C*C*G*C*C*CcG A*U*C*C*As*Cs*Gs*As*U*3’ (SEQ ID NO：26)；

5’C*C*U*U*U*C*UcG U*C*G*A*Us*Gs*Gs*Us*C*3’ (SEQ ID NO：27)；

5’C*C*U*U*U*C*U*cG U*C*G*A*Us*Gs*Gs*Us*C*3’ (SEQ ID NO：28)；

5’C*U*U*G*A*U*AcA U*C*C*A*Gs*Us*Us*Cs*C*3’ (SEQ ID NO：29)；

5’U*U*U*C*A*G*GcA U*U*U*C*Cs*Us*Cs*Cs*G*3’ (SEQ ID NO：30)；

5’C*U*U*C*A*G*GcA U*G*G*G*Gs*Cs*As*Gs*C*3’ (SEQ ID NO：31)；

5’A*G*G*A*A*C*AcA A*C*C*U*Us*Us*Gs*Us*C*3’ (SEQ ID NO：32)；

5’U*U*U*C*A*C*AcA U*C*C*A*Us*Cs*As*As*C*3’ (SEQ ID NO：33)；

5’C*U*U*C*A*C*GcA U*C*C*A*Us*Cs*As*As*C*3’ (SEQ ID NO：34)；

5’U*G*G*G*A*C*AcA A*C*C*C*Cs*Us*Gs*Cs*C*3’ (SEQ ID NO：35)；

5’C*G*A*C*U*C*CcU C*U*G*G*As*Us*Gs*Us*U*3’ (SEQ ID NO：36)；

5’C*G*A*C*U*C*UcU C*U*G*G*As*Us*Gs*Us*U*3’ (SEQ ID NO：37)；

或这些核酸序列中的任一个的片段或变体；

其中

As、Cs、Gs和Us是核苷酸或其变体，优选以上限定的核糖核苷酸或脱氧核苷酸，其进一步包含硫代磷酸酯基团；

其中星号(*)表示2’碳原子上的前述核苷酸优选被2’-氢、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基或2’-氟化学修饰；和

其中小写字母c表示相应于所述目标序列中要编辑的核苷酸或其变体，优选腺苷或胞苷，更优选腺苷的位置，并且其中c表示胞苷核苷酸或其变体、脱氧胞苷核苷酸或其变体、或无碱基位点。

19.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，其中所述靶向序列在对应于所述目标序列中要编辑的核苷酸的位置处包含胞苷核苷酸或其变体、脱氧胞苷核苷酸或其变体、或无碱基位点，和

其中位于相应于所述目标序列中要编辑的核苷酸的位置的5’或3’的两个核苷酸或其变体中的至少一个，优选两个在2’碳原子上被化学修饰，其中所述2’碳原子连接至选自下列的取代基：卤素、烷氧基、氢、芳氧基、氨基和氨基烷氧基，优选地选自2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基、2’-氢和2’-氟；

和/或

20.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，其中所述靶向序列在相应于所述目标序列中要编辑的核苷酸的位置处包含胞苷核苷酸或其变体、脱氧胞苷核苷酸或其变体、或无碱基位点，和

21.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，其中所述靶向序列包含权利要求9至11中任一项限定的核酸序列。

22.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，其中所述募集部分包含至少一种能够募集脱氨酶的偶联剂，所述脱氨酶包含与所述偶联剂结合的部分，其中所述偶联剂优选地共价连接至所述靶向序列的5’-末端或3’-末端或所述靶向序列内的内部核苷酸。

23.根据权利要求22所述的人工核酸，其中所述偶联剂选自O6-苄基鸟嘌呤、O2-苄基胞嘧啶、氯代烷、1xBG、2xBG、4xBG以及这些中的任一种的变体。

24.根据权利要求22或23所述的人工核酸，其中与所述偶联剂结合的部分选自SNAP-标签、CLIP-标签、HaloTag以及这些中的任一种的片段或变体。

25.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，其中

所述募集部分包含O6-苄基鸟嘌呤、1xBG、2xBG、4xBG或这些中的任一种的变体，并且所述脱氨酶，优选腺苷脱氨酶包含SNAP-标签或其片段或变体；

所述募集部分包含氯代烷，并且所述脱氨酶，优选腺苷脱氨酶包含HaloTag或其片段或变体；或

所述募集部分包含O2-苄基胞嘧啶或其变体，并且所述脱氨酶，优选腺苷脱氨酶包含Clip-标签或其片段或变体。

26.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，其中

所述募集部分包含能够募集多于一个脱氨酶分子的偶联剂，其中所述偶联剂优选地选自2xBG、4xBG和这些中的任一种的变体；

和/或

所述募集部分包含偶联剂的至少两个部分，其中所述至少两个部分表示相同的偶联剂或不同的偶联剂。

27.根据权利要求1至21中任一项所述的人工核酸，其中所述募集部分包含能够特异性结合所述脱氨酶，优选腺苷或胞苷脱氨酶的核酸序列。

28.根据权利要求27所述的人工核酸，其中所述募集部分包含能够特异性结合所述脱氨酶，优选腺苷或胞苷脱氨酶的dsRNA结合结构域的核酸序列。

29.根据权利要求1至21、27和28中任一项所述的人工核酸，其中所述募集部分包含能够分子内碱基配对，优选能够形成茎-环结构的核酸序列。

30.根据权利要求29所述的人工核酸，其中所述茎-环结构包括包含至少两个错配的双螺旋茎。

31.根据权利要求29或30所述的人工核酸，其中所述茎-环结构包含由3至8个，优选4至6个，更优选5个核苷酸组成的环，其中所述环优选地包含核酸序列GCUAA或GCUCA。

32.根据权利要求1至21和27至31中任一项所述的人工核酸，其中所述募集部分包括包含至少一个核苷酸的核酸序列，其中所述核碱基被化学修饰，和/或

其中所述核酸序列包含至少一个骨架修饰。

33.根据权利要求32所述的人工核酸，其中所述募集部分包含核酸序列，所述核酸序列包含至少一个在2’位置处被化学修饰的化学修饰的核苷酸。

34.根据权利要求33所述的人工核酸，其中

其中所述化学修饰的核苷酸是锁定核酸(LNA)核苷酸、乙烯桥连核酸(ENA)核苷酸或(S)-约束乙基cEt核苷酸。

35.根据权利要求32至34中任一项所述的人工核酸，其中所述募集包括包含至少一个骨架修饰的核酸序列，并且其中连接两个相邻核苷酸的糖的磷酸酯基团是修饰的磷酸酯基团，优选地选自硫代磷酸酯、磷酸硒酸酯、硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯类、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基膦酸酯、芳基膦酸酯和磷酸三酯。

36.根据权利要求32至35中任一项所述的人工核酸，其中所述募集部分包含核酸序列，其中至少40％的核苷酸在2’位置处被化学修饰。

37.根据权利要求32至36中任一项所述的人工核酸，其中所述募集部分包含核酸序列，其中所述核酸序列的5’末端处的五个核苷酸中的至少两个包含硫代磷酸酯基团。

38.根据权利要求32至37中任一项所述的人工核酸，其中所述募集部分包含核酸序列，其中所述核酸序列的5’末端处的五个核苷酸中的至少两个是LNA核苷酸、ENA核苷酸或(S)-约束乙基cEt核苷酸。

39.根据权利要求32至38中任一项所述的人工核酸，其中所述募集部分包含核酸序列，所述核酸序列包含：

至少一个包含修饰的磷酸酯基团，优选硫代磷酸酯基团的核苷酸；

至少一个LNA核苷酸、ENA核苷酸或(S)-约束乙基cEt核苷酸；和

至少一个在2’碳原子上包含取代基的核苷酸，其中所述取代基选自卤素、烷氧基、氢、芳氧基、氨基和氨基烷氧基，优选地选自2’-氢、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基和2’-氟。

40.根据权利要求1至21和27至39中任一项所述的人工核酸，其中所述募集部分包含选自下列的核酸序列：

或这些核酸序列中的任一个的片段或变体；

其中

N_a和N_b形成错配，优选地其中N_a是腺苷，并且N_b是胞苷；

N_c和N_d形成错配，优选地其中N_c和N_d是鸟苷；

Gs是包含硫代磷酸酯基团的鸟苷；和

Gsl是包含硫代磷酸酯基团的LNA鸟苷。

41.根据权利要求1至21和27至39中任一项所述的人工核酸，其中所述募集部分包含源自VA RNAI的核酸序列或其片段或变体。

42.根据权利要求1至21、27至39和41中任一项所述的人工核酸，其中所述募集部分包含核酸序列

GCACACCTGGGTTCGACACGCGGGCGGTAACCGCATGGATCACGGCGGACGGCCGGATTCGGGGTTCGAACCCCGGTCGTCCGCCATGATACCCTTGC(SEQ ID NO：41)或其片段或变体。

43.根据权利要求40至42中任一项所述的人工核酸，其中所述募集部分包含所述权利要求中限定的核酸序列，其中至少一个核苷酸，优选至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的核苷酸在2’碳原子上包含取代基，其中所述取代基选自卤素、烷氧基、氢、芳氧基、氨基和氨基烷氧基，优选地选自2’-氢、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基和2’-氟。

44.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，其中所述募集部分包含选自下列的核酸序列：

或这些序列中的任一个的片段或变体；

其中

N_a和N_b形成错配，优选地其中N_a是腺苷，并且N_b是胞苷；

N_c和N_d形成错配，优选地其中N_c和N_d是鸟苷；

Gs是包含硫代磷酸酯基团的鸟苷；

Gsl是包含硫代磷酸酯基团的LNA鸟苷；和

其中星号(*)表示2’碳原子上的核苷酸优选地被2’-氢、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基或2’-氟修饰。

45.用于定点编辑目标RNA的人工核酸，所述人工核酸包含：

a)靶向序列，其包含与所述目标RNA中的目标序列互补或部分互补的核酸序列或由与所述目标RNA中的目标序列互补或部分互补的核酸序列组成，

和

b)用于募集脱氨酶的募集部分，其中所述募集部分包含能够特异性结合所述脱氨酶，优选腺苷或胞苷脱氨酶的核酸序列，

其中所述募集部分的特征在于权利要求27至44中限定的特征中的任一个。

46.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，其进一步包含增强对所述人工核酸的细胞摄取的部分。

47.根据权利要求46所述的人工核酸，其中所述增强细胞摄取的部分是三天线N-乙酰半乳糖胺(GalNAc3)，所述三天线N-乙酰半乳糖胺优选地与所述人工核酸的3’末端或所述5’末端缀合。

48.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，其在沿5’至3’方向上包含前述权利要求中限定的所述募集部分和所述靶向序列。

49.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，其是RNA。

50.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，其中所述脱氨酶是：

腺苷脱氨酶或其片段或变体，优选地选自ADARl、ADAR2及其片段或变体，更优选为包含腺苷脱氨酶结构域的肽或蛋白质；或

胞苷脱氨酶或其片段或变体，优选Apobecl或其片段或变体，更优选为包含胞苷脱氨酶结构域的肽或蛋白质。

51.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，其中所述脱氨酶是腺苷脱氨酶，优选为真核腺苷脱氨酶，更优选为脊椎动物腺苷脱氨酶，甚至更优选为哺乳动物腺苷脱氨酶，最优选为人腺苷脱氨酶；或

胞苷脱氨酶，优选为真核胞苷脱氨酶，更优选为脊椎动物胞苷脱氨酶，甚至更优选为哺乳动物胞苷脱氨酶，甚至更优选为鼠或人胞苷脱氨酶，最优选为mApobecl。

52.根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸，其中所述定点编辑包含所述目标序列中腺苷或胞苷的脱氨化。

53.载体，编码根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸。

54.细胞，包含根据权利要求1至52中任一项所述的人工核酸或根据权利要求53所述的载体。

55.组合物，包含根据权利要求1至52中任一项所述的人工核酸、根据权利要求53所述的载体或根据权利要求54所述的细胞、和另外的赋形剂，优选药学上可接受的赋形剂。

56.根据权利要求55所述的组合物，其包含纳米颗粒，优选脂质纳米颗粒或脂质体形式的所述人工核酸或所述载体。

57.根据权利要求55或56所述的组合物，其中所述人工核酸或所述载体被阳离子化合物络合。

58.根据权利要求57所述的组合物，其中所述阳离子化合物是阳离子脂质。

59.试剂盒，包含根据权利要求1至52中任一项所述的人工核酸、根据权利要求53所述的载体、根据权利要求54所述的细胞、或根据权利要求55至58中任一项所述的组合物。

60.根据权利要求1至52中任一项所述的人工核酸、根据权利要求53所述的载体、根据权利要求54所述的细胞、根据权利要求55至58中任一项所述的组合物、或根据权利要求59所述的试剂盒用于定点编辑目标RNA的应用。

61.根据权利要求1至52中任一项所述的人工核酸、根据权利要求53所述的载体、根据权利要求54所述的细胞、根据权利要求55至58中任一项所述的组合物、或根据权利要求59所述的试剂盒用于体外诊断疾病或障碍的应用。

62.定点编辑目标RNA的方法，所述方法包括使目标RNA与根据权利要求1至52中任一项所述的人工核酸接触。

63.根据权利要求1至52中任一项所述的人工核酸、根据权利要求53所述的载体、根据权利要求54所述的细胞、根据权利要求55至58中任一项所述的组合物、或根据权利要求59所述的试剂盒，其用作药物。

64.根据权利要求1至52中任一项所述的人工核酸、根据权利要求53所述的载体、根据权利要求54所述的细胞、根据权利要求55至58中任一项所述的组合物、或根据权利要求59所述的试剂盒，其用于治疗或预防疾病或障碍，所述疾病或障碍选自传染性疾病、肿瘤疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、过敏症和神经系统疾病或障碍。

65.根据权利要求1至52中任一项所述的人工核酸、根据权利要求53所述的载体、根据权利要求54所述的细胞、根据权利要求55至58中任一项所述的组合物、或根据权利要求59所述的试剂盒，其用于治疗或预防疾病或障碍，其中所述治疗或预防包括定点编辑目标RNA的步骤。

66.根据权利要求1至52中任一项所述的人工核酸、根据权利要求53所述的载体、根据权利要求54所述的细胞、根据权利要求55至58中任一项所述的组合物、或根据权利要求59所述的试剂盒，其用于诊断疾病或障碍，所述疾病或障碍优选地选自传染性疾病、肿瘤疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、过敏症和神经系统疾病或障碍。

67.用于治疗患有疾病或障碍的对象的方法，所述方法包括向所述对象给予有效量的根据权利要求1至52中任一项所述的人工核酸、根据权利要求53所述的载体、根据权利要求54所述的细胞、或根据权利要求55至58中任一项所述的组合物。

68.根据权利要求67所述的方法，其中所述疾病或障碍选自传染性疾病、肿瘤疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、过敏症和神经系统疾病或障碍。