JP2020078314A

JP2020078314A - 線維症予防又は治療剤

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Publication number: JP2020078314A
Application number: JP2020011342A
Authority: JP
Inventors: エステバンシーガバザ; C Gabazza Esteban; 小林　哲; Satoru Kobayashi; 哲小林; 秀一豊福; Shuichi Toyofuku; 綾子福田; Ayako Fukuda; 哲也長谷川; Tetsuya Hasegawa
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd; Mie University NUC
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd; Mie University NUC
Priority date: 2010-10-14
Filing date: 2020-01-28
Publication date: 2020-05-28
Also published as: HRP20190722T1; TR201905060T4; MX2013003698A; KR102167225B1; JP6022940B2; PL2628798T3; TWI679023B; EP2628798B1; US20130217754A1; HUE043891T2; DK2628798T3; WO2012050181A1; US10125366B2; CN106086022A; CN103119166B; EP3517614A1; IL245995B; KR20140020820A; MX348555B; CA2813163A1

Abstract

【課題】線維症を治療するために有効なｓｉＲＮＡ及びこれを用いた医薬の提供。【解決手段】特定の塩基番号の塩基よりなる群から選ばれる連続する１７〜２３塩基を標的配列とし、全長が３０ヌクレオチド以下であるｓｉＲＮＡ。ＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇＧｒｏｗｔｈＦａｔｏｒ（ＴＧＦ）−β１をコードする遺伝子を標的とするＳｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）。【選択図】図１

Description

本発明は、線維症治療剤に関する。具体的には、Transforming Growth Factor（ＴＧＦ
）−β１をコードする遺伝子を標的とするsmall interfering RNA（ｓｉＲＮＡ）及びそ
れを用いた医薬に関する。

肺線維症とは、過剰なコラーゲンと他の細胞外マトリックスの蓄積により肺組織が線維
化した症状をいう。肺線維症の中でも、特発性肺線維症は、中間生存期間平均３年で、５
年生存率が２０〜４０％の予後不良の慢性難治性疾患である。肺線維症の治療としては、
ステロイド剤や免疫抑制剤が用いられているが、予後を改善するような効果的な治療法は
無いのが現状であり、新たな治療薬の開発が望まれている。

近年、多くの疾患が遺伝子を原因として発症することが明らかにされているが、肺線維
症についても、多くの遺伝子の関与が報告されている（特許文献１−４，非特許文献１−
６）。肺線維症に関与する主要な因子として、ＴＧＦ−β１（特許文献１−２，非特許文
献２−６）、Ｓｍａｄ３（非特許文献１）、ＭＣＰ−１（特許文献３）等が報告されてい
る。

一方、核酸、特にｓｉＲＮＡは、細胞に存在する特定の配列と同一あるいはほぼ同一な
遺伝子のｍＲＮＡの分解を惹起し、標的遺伝子の発現を阻害する（ＲＮＡ干渉）。従って
、ＲＮＡ干渉による標的遺伝子の発現阻害機能は、特定の遺伝子あるいは遺伝子群の異常
な発現により惹起される疾患症状を軽減あるいは治療する上で有用である。肺線維症関連
遺伝子についても、ｓｉＲＮＡを用いて当該遺伝子の発現抑制を試みた報告がなされてい
る（特許文献１−４、非特許文献１−６）。

しかしながら、これまでに報告されている技術は、実験動物（マウスやラット）の疾患
関連遺伝子に対するｓｉＲＮＡ配列の抑制効果を示したのみで、ヒト遺伝子に特異的な効
果を十分に示したものではない。また、ｓｉＲＮＡの抑制効果についても、２００ｎＭ（
非特許文献１），２０−５００ｎＭ（非特許文献５）における効果を示しているが、効率
よく低濃度において肺線維症関連遺伝子の発現を抑制しうる核酸分子については示されて
いない。

ＴＧＦ−β１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡについては、これまでに数十種のｓｉＲＮ
Ａが報告されているが（特許文献１、５−７）、ＴＧＦ−β１の遺伝子の全長は２３４６
塩基（GenBank Accession No. NM_000660.3）であり、当該遺伝子の全長から約２０ｍｅ
ｒ程度の配列を選び出す組み合わせは無数に存在することから、その中から当該遺伝子の
発現をより効率的に抑制できるｄｓＲＮＡやｓｉＲＮＡ分子を設計することは、容易なこ
とではない。

国際公開第２００７／１０９０９７号パンフレット国際公開第２００３／０３５０８３号パンフレット特開２００７−１１９３９６号公報特表２００９−５１６５１７号公報国際公開第２００９／０６１４１７号パンフレット国際公開第２００８／１０９５４８号パンフレット国際公開第２００７／７９２２４号パンフレット

Wang Z, Gao Z, Shi Y, Sun Y, Lin Z, Jiang H, Hou T, Wang Q, Yuan X, Zhu X, Wu H, Jin Y, J Plast Reconstr Aesthet Surg, 1193-1199, 60, 2007 Hwang M, Kim HJ, Noh HJ, Chang YC, Chae YM, Kim KH, Jeon JP, Lee TS, Oh HK, Lee YS, Park KK, Exp Mol Pathol, 48-54, 81, 2006 Takabatake Y, Isaka Y, Mizui M, Kawachi H, Shimizu F, Ito T, Hori M, Imai E, Gene Ther, 965-973, 12, 2005 Xu W, Wang LW, Shi JZ, Gong ZJ, Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 300-308, 8, 2009 Liu XJ, Ruan CM, Gong XF, Li XZ, Wang HL, Wang MW, Yin JQ, Biotechnol Lett, 1609-1615, 27, 2005 福元重太郎, 末次彩子, 原田知佳, 河口知允, 濱田直樹, 前山隆茂, 桑野和善, 中西洋一, 日本呼吸器学会雑誌, 185, 46, 2008

本発明は、線維症を治療するために有効なｓｉＲＮＡ及びこれを用いた医薬を提供する
ことに関する。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ヒトＴＧＦ−β１遺
伝子を標的とする特定のｓｉＲＮＡが、ヒト細胞においてＴＧＦ−β１の発現を効果的に
抑制でき、さらに肺線維症モデルマウスの肺において、インターフェロン反応が誘導され
ることなく、肺線維症の症状を改善できることを見出した。

すなわち、本発明は、以下の１）〜１９）に係るものである。
１）配列番号１の塩基番号１２８５〜１３１８番の塩基、１３９８〜１４１８番の塩基
、１４３４〜１４６３番の塩基、１５４８〜１５７９番の塩基、１６０８〜１６２８番の
塩基、１７００〜１７２６番の塩基、１７７８〜１７９８番の塩基、１８０６〜１８２６
番の塩基及び１８８７〜１９０７番の塩基よりなる群から選ばれる連続する１７〜２３塩
基を標的配列とし、全長が３０ヌクレオチド以下であるｓｉＲＮＡ。
２）ｓｉＲＮＡが、以下の（ａ）〜（ｓ）から選ばれる上記１）のｓｉＲＮＡ。
（ａ）配列番号２に示されるセンス配列と配列番号３に示されるアンチセンス配列とか
ら形成されるｓｉＲＮＡ
（ｂ）配列番号４に示されるセンス配列と配列番号５に示されるアンチセンス配列とか
ら形成されるｓｉＲＮＡ
（ｃ）配列番号６に示されるセンス配列と配列番号７に示されるアンチセンス配列とか
ら形成されるｓｉＲＮＡ
（ｄ）配列番号８に示されるセンス配列と配列番号９に示されるアンチセンス配列とか
ら形成されるｓｉＲＮＡ
（ｅ）配列番号１０に示されるセンス配列と配列番号１１に示されるアンチセンス配列
とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｆ）配列番号１２に示されるセンス配列と配列番号１３に示されるアンチセンス配列
とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｇ）配列番号１４に示されるセンス配列と配列番号１５に示されるアンチセンス配列
とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｈ）配列番号１６に示されるセンス配列と配列番号１７に示されるアンチセンス配列
とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｉ）配列番号１８に示されるセンス配列と配列番号１９に示されるアンチセンス配列
とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｊ）配列番号２０に示されるセンス配列と配列番号２１に示されるアンチセンス配列
とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｋ）配列番号２２に示されるセンス配列と配列番号２３に示されるアンチセンス配列
とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｌ）配列番号２４に示されるセンス配列と配列番号２５に示されるアンチセンス配列
とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｍ）配列番号２６に示されるセンス配列と配列番号２７に示されるアンチセンス配列
とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｎ）配列番号２８に示されるセンス配列と配列番号２９に示されるアンチセンス配列
とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｏ）配列番号３０に示されるセンス配列と配列番号３１に示されるアンチセンス配列
とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｐ）配列番号３２に示されるセンス配列と配列番号３３に示されるアンチセンス配列
とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｑ）配列番号３４に示されるセンス配列と配列番号３５に示されるアンチセンス配列
とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｒ）配列番号３６に示されるセンス配列と配列番号３７に示されるアンチセンス配列
とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｓ）配列番号５４に示されるセンス配列と配列番号５５に示されるアンチセンス配列
とから形成されるｓｉＲＮＡ
３）前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端の末端側からオーバーハングヌクレオチドを
除いた連続する１〜１０ヌクレオチドがＤＮＡに変換された上記１）又は２）のｓｉＲＮ
Ａ。
４）前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端の末端側から連続する１〜１０ヌクレ
オチドがＤＮＡに変換された上記１）−３）のｓｉＲＮＡ。
５）前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端の末端側からオーバーハングヌクレオチドを
除いた連続する１〜１０ヌクレオチドがＤＮＡに変換され、且つアンチセンス鎖の５’末
端の末端側から連続する１〜１０ヌクレオチドがＤＮＡに変換された上記１）−４）のｓ
ｉＲＮＡ。
６）アンチセンス鎖の５’末端がモノリン酸化又はモノチオリン酸化された上記１）〜
５）のｓｉＲＮＡ。
７）上記１）〜６）のいずれかのｓｉＲＮＡを含有する医薬組成物。
８）上記１）〜６）のいずれかのｓｉＲＮＡを有効成分として含有するＴＧＦ−β１遺
伝子発現抑制剤。
９）上記１）〜６）のいずれかのｓｉＲＮＡを有効成分として含有する線維症予防又は
治療剤。
１０）上記１）〜６）のいずれかのｓｉＲＮＡを有効成分として含有する肺線維症若し
くは肺がんの予防又は治療剤。
１１）ＴＧＦ−β１遺伝子発現抑制剤の製造のための、上記１）〜６）のｓｉＲＮＡの
使用。
１２）線維症予防又は治療剤の製造のための、上記１）〜６）のｓｉＲＮＡの使用。
１３）肺線維症若しくは肺がんの予防又は治療剤の製造のための、上記１）〜６）のｓ
ｉＲＮＡの使用。
１４）ＴＧＦ−β１遺伝子発現抑制のための、上記１）〜６）のｓｉＲＮＡ。
１５）線維症予防又は治療のための、上記１）〜６）のｓｉＲＮＡ。
１６）肺線維症若しくは肺がんの予防又は治療のための、上記１）〜６）のｓｉＲＮＡ
。
１７）上記１）〜６）のｓｉＲＮＡをヒト又は動物に投与することを特徴とする、ＴＧ
Ｆ−β１遺伝子発現抑制方法。
１８）上記１）〜６）のｓｉＲＮＡをヒト又は動物に投与することを特徴とする、線維
症予防又は治療方法。
１９）上記１）〜６）のｓｉＲＮＡをヒト又は動物に投与することを特徴とする、肺線
維症若しくは肺がんの予防又は治療方法。

本発明のｓｉＲＮＡは、ＴＧＦ−β１の発現を低濃度で効率よく抑制又は阻害すること
ができるので、線維症の予防又は治療のための医薬として有用である。

ｓｉＲＮＡによるＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現抑制率を示すグラフ。キメラ型ｓｉＲＮＡによるＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現抑制率を示すグラフ。リン酸又はチオリン酸結合キメラ型ｓｉＲＮＡによるＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現抑制率を示すグラフ。肺線維症モデルにおけるＴＧＦ−β１の発現抑制率を示すグラフ。肺組織切片（H.E.染色およびマッソントリクローム染色）の光学顕微鏡写真（倍率：5倍）。

本発明のｓｉＲＮＡが標的とする配列は、配列番号１の塩基番号１２８５〜１３１８番
の塩基、１３９８〜１４１８番の塩基、１４３４〜１４６３番の塩基、１５４８〜１５７
９番の塩基、１６０８〜１６２８番の塩基、１７００〜１７２６番の塩基、１７７８〜１
７９８番の塩基、１８０６〜１８２６番の塩基及び１８８７〜１９０７番の塩基よりなる
群から選ばれる連続する１７〜２３塩基であるが、ここで、各群から選ばれる連続する１
７〜２３塩基としては、好ましくは１９〜２３塩基であり、より好ましくは２１塩基であ
る。
配列番号１で示される塩基配列は、ＴＧＦ−β１のｍＲＮＡの塩基配列であり、当該配
列情報はＧｅｎＢａｎｋに、GenBank Accession No. NM_000660.3として登録されている
。

本発明のｓｉＲＮＡは、ＴＧＦ−β１のｍＲＮＡの上記標的配列に相補的な配列である
アンチセンス鎖と当該アンチセンス鎖に相補的な配列であるセンス鎖がハイブリダイズし
てなるものであり、当該ＴＧＦ−β１のｍＲＮＡを切断する活性（ＲＮＡ干渉作用）を有
し、当該ｍＲＮＡの翻訳を阻止する能力、すなわち当該ＴＧＦ−β１遺伝子の発現を阻害
する能力を有する。

本発明のｓｉＲＮＡのヌクレオチド長は、センス鎖、アンチセンス鎖が同一のヌクレオ
チド長であっても異なっていてもよく、その全長は３０ヌクレオチド以下であり、好まし
くは２５ヌクレオチド以下、より好ましくは２３ヌクレオチド以下、或いは２１ヌクレオ
チドである。
また、センス鎖及びアンチセンス鎖の両端は、平滑末端でもよいし、それぞれの鎖の３
’側がオーバーハング（突出末端）であっても良い。ここで、「平滑末端」とは、２本鎖
ＲＮＡの末端部分において、センス鎖の末端領域とそれに対合するアンチセンス鎖の末端
領域が、１本鎖部分を形成することなく対合している構造を意味する。また、「オーバー
ハング」は、ダングリングエンドとも称され、２本鎖ＲＮＡの末端部分のセンス鎖の末端
領域又はそれに対合するアンチセンス鎖の末端領域において、対合する塩基が存在しない
ために２本鎖を形成できず、１本鎖部分（突出末端）が存在している構造を意味する。
突出末端部分の塩基数は１〜１０ヌクレオチドであり、好ましくは１〜４ヌクレオチド
であり、さらに好ましくは１〜２ヌクレオチドである。尚、突出末端の長さは二つの鎖の
間で無関係であり、互いに異なる長さであっても良い。突出末端部分のヌクレオチドはＲ
ＮＡでも、ＤＮＡでもよく、標的であるＴＧＦ−β１のｍＲＮＡに相補的な塩基が好まし
いが、上記ＲＮＡ干渉能を保持する限り相補的でない塩基であってもよい。

本発明のｓｉＲＮＡは、２つの別個の鎖から構成される１つの二本鎖ＲＮＡである他、
１本の鎖がステムループ構造をとることにより形成される二本鎖ＲＮＡであってもよい。
すなわち、本発明のｓｉＲＮＡには、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の３’末端に
２〜４ヌクレオチドからなるループを形成したＲＮＡ、センス鎖の３’末端とアンチセン
ス鎖の５’末端に２〜４ヌクレオチドからなるループを形成したＲＮＡも含まれる。さら
には、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の３’末端及びセンス鎖の３’末端とアンチ
センス鎖の５’末端の両端に２〜４ヌクレオチドからなるループを形成したＲＮＡも含ま
れる。

本発明のｓｉＲＮＡと標的配列は、同一であることが望ましいが、上記ＲＮＡ干渉を誘
導できる範囲において、実質的に同一、すなわち相同な配列であってもよい。具体的には
、本発明のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖配列と標的配列がハイブリダイズする限り、１又
は数個（例えば、２、３、４個）のミスマッチがあってもよい。すなわち、本発明のｓｉ
ＲＮＡには、標的配列に対して１又は数個の塩基が置換、付加若しくは欠失したものであ
ってＲＮＡ干渉を誘導できるもの、或いは標的配列と８５％以上、好ましくは９０％以上
、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有し、且つＲＮＡ
干渉を誘導できるものが包含される。
尚、この場合のハイブリダイズ条件は、本発明のｓｉＲＮＡを生体内に投与して医薬と
して用いる場合は、生体内の条件であり、本発明のｓｉＲＮＡを試薬としてｉｎｖｉｔ
ｒｏで用いる場合は、中度のストリンジェントな条件又は高度なストリンジェントな条件
であり、このような条件として、例えば、400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、1mM EDTA、50
℃〜70℃で12〜160時間でのハイブリゼーション条件が挙げられる。これらの条件につい
ては、当業者に周知であり、Sambrook et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual
second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 1989)に記載
されている。
また、配列同一性は、リップマン−パーソン法（Lipman-Pearson法；Science, 227, 14
35, (1985))等によって計算すればよく、例えば、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win
（Ver.5.1.1；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用
いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行なうことにより算出される。

また、本発明のｓｉＲＮＡには、上記ＲＮＡ干渉を誘導できる限り、センス鎖又はアン
チセンス鎖の何れか一方のヌクレオチドを全てＤＮＡに変換したもの（ハイブリッド型）
や、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の一部のヌクレオチドをＤＮＡに変換したもの（
キメラ型）が包含される。
ここで、ＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡへの変換とは、ＡＭＰをｄＡＭＰへ、ＧＭＰをｄ
ＧＭＰへ、ＣＭＰをｄＣＭＰへ、ＵＭＰをｄＴＭＰへ変換することを意味する。
ハイブリッド型としては、センス鎖のヌクレオチドをＤＮＡに変換したものが好ましい
。キメラ型としては、下流側（センス鎖の３’末端側、アンチセンス鎖の５’末端側）の
一部のヌクレオチドをＤＮＡに変換したものが挙げられる。具体的には、センス鎖の３’
末端側及びアンチセンス鎖の５’末端側のヌクレオチドを共にＤＮＡに変換したもの、セ
ンス鎖の３’末端側又はアンチセンス鎖の５’末端側の何れかのヌクレオチドをＤＮＡに
変換したものが挙げられる。また、変換するヌクレオチド長は、ＲＮＡ分子の１／２に相
当するヌクレオチドまでの任意長とするのが好ましく、例えば末端から１〜１３ヌクレオ
チド、好ましくは１〜１０ヌクレオチドが挙げられる。ＲＮＡ干渉効果、ＲＮＡ分子の安
定性、安全性等の点から、好適なキメラ型ｓｉＲＮＡとしては、例えばヌクレオチド長が
それぞれ１９〜２３であり、センス鎖の３’末端側からオーバーハングヌクレオチドを除
いた１〜１０、好ましくは１〜８、より好ましくは１〜６のヌクレオチド及びアンチセン
ス鎖の５’末端側から１〜１０、好ましくは１〜８、より好ましくは１〜６のヌクレオチ
ドを任意数、連続してＤＮＡに変換したものが挙げられる（後記〔表２〕参照）。また、
この場合、センス鎖（オーバーハングヌクレオチドを除く）とアンチセンス鎖のＤＮＡ変
換数は同一であるのがより好ましい。

また、本発明のｓｉＲＮＡは、上記ＲＮＡ干渉を誘導できる限り、そのヌクレオチド（
リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド）が、糖、塩基及び／又はリン酸塩が化学
修飾されたヌクレオチド類似体であっても良い。塩基が修飾されたヌクレオチド類似体と
しては、例えば、５位修飾ウリジン又はシチジン（例えば、５−プロピニルウリジン、５
−プロピニルシチジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、５−（２−アミノ）
プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、５−メチルオキシウリジン等
）；８位修飾アデノシン又はグアノシン（例えば、８−ブロモグアノシン等）；デアザヌ
クレオチド（例えば７−デアザ−アデノシン等）；Ｏ−及びＮ−アルキル化ヌクレオチド
（例えば、Ｎ６−メチルアデノシン等）等が挙げられる。
また、糖が修飾されたヌクレオチド類似体としては、例えば、リボヌクレオチドの２’
−ＯＨが、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロゲン原子、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ₂、ＮＨＲ、ＮＲ₂、もしくは
ＣＮ（ここで、Ｒは炭素数１−６のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基を示す）
等によって置換された２’位糖置換体、５’末端の−ＯＨがモノリン酸化又はモノチオリ
ン酸化された５’末端リン酸化体、５’末端モノチオリン酸化体が挙げられる。
リン酸塩が修飾されたヌクレオチド類似体としては、隣接するリボヌクレオチドを結合
するホスホエステル基を、ホスホチオエート基で置換したものが挙げられる。

また、本発明のｓｉＲＮＡは、上記ヌクレオチド類似体とは別に、センス鎖の５’末端
側又は３’末端側から１〜６番目のヌクレオチド（５’末端、３’末端、又は末端以外の
内部の塩基、糖）の少なくとも１つに特定の置換基又は機能性分子が直接又はリンカーを
介して結合していてもよく、センス鎖の５’末端側から１〜６番目、好ましくは１〜４番
目のヌクレオチドの少なくとも１つに当該置換基又は機能性分子が結合しているのが好ま
しい。
ここで、置換基としては、一例として、アミノ基；メルカプト基；ニトロ基；炭素数１
〜４０（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のアルキル基；炭素数１〜４０
（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のアミノアルキル基；炭素数１〜４０
（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のチオアルキル基；炭素数１〜４０（
好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のアルコキシル基；炭素数１〜４０（好
ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のアミノアルコキシル基；炭素数１〜４０
（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のチオアルコキシル基；炭素数１〜４
０（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のモノ若しくはジアルキルアミノ基
；炭素数１〜４０（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のアルキルチオ基；
炭素数２〜４０（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のポリエチレンオキサ
イド基；炭素数３〜３９（好ましくは３〜２１、更に好ましくは３〜１２）のポリプロピ
レンオキサイド基等を挙げることができる。これらの置換基を結合させることによって、
ＲＮＡ干渉効果を顕著に増強させることが可能になる。

機能性分子としては、糖、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ（ｔＲＮ
Ａを含む）、アプタマー、修飾ヌクレオチド、低分子有機・無機材料、コレステロール、
デンドリマー、脂質、高分子材料等が例示される。機能性分子を付加することにより、優
れたＲＮＡ干渉効果と当該機能性分子に基づく有用効果を兼ね備えさせることができる。

上記糖としては、例えば、グルコース、ガラクトース、グルコサミン、ガラクトサミン
等の単糖、これらを任意に組み合わせたオリゴ糖又は多糖等が挙げられる。

上記タンパク質としては、生体内に存在するタンパク質、薬理作用を有するタンパク質
、分子認識作用を有するタンパク質等を使用でき、該タンパク質の一例として、インポー
チンbタンパク質、アビジン、抗体等を挙げることができる。

上記ＤＮＡとしては、具体的には、塩基長が５〜５０のＤＮＡ、好ましくは塩基長が５
〜２５のＤＮＡが例示される。

上記ペプチドとしては、例えば、オクタアルギニンペプチドＲ８、核局在化シグナル
ペプチド配列（ＨＩＶ−１ＴａｔやＳＶ４０Ｔ抗原等）、核外移行性シグナルペプチド
（ＨＩＶ−１ＲｅｖやＭＡＰＫＫ等）、細胞膜融合ペプチド等が挙げられる。上記修飾
ヌクレオチドとしては、例えば、ホスホロチオエート型、ボラノフォスフェート型ＤＮＡ
／ＲＮＡ等のリン酸骨格を修飾したもの；２’−ＯＭｅ修飾ＲＮＡ、２’−Ｆ修飾ＲＮＡ
等の２’修飾ヌクレオチド；ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）やＥＮＡ（2'-O,4'-C-Ethyl
ene-bridged nucleic acids）等のヌクレオチドの糖分子を架橋した修飾ヌクレオチド；
ＰＮＡ（ペプチド核酸）、モルフォリノヌクレオチド等の基本骨格が異なる修飾ヌクレオ
チドなどが挙げられる（国際公開第２００８／１４０１２６号パンフレット、国際公開第
２００９／１２３１８５号パンフレット参照）。

上記低分子有機・無機材料としては、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５等の蛍光物質；ビオチン
；量子ドット；金微粒子等が挙げられる。上記デンドリマーとしては、例えば、ポリアミ
ドアミンデンドリマー等が挙げられる。上記脂質としては、例えば、リノール酸、ＤＯＰ
Ｅ（1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine）等の他、国際公開第２００９／
１２３１８５号パンフレットに記載の２つの疎水基を有する２本鎖脂質が挙げられる。上
記高分子材料としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン等が挙げ
られる。

ここで、機能性分子を有する基としては、機能性分子の残基そのものであってもよく、
また、機能性分子の残基に二官能性リンカーの一方の官能基が結合した基であってもよい
。つまり、前者の場合、機能性分子が、上記センス鎖ＲＮＡの所定の部位に直接結合して
おり、後者の場合、機能性分子が二官能性リンカーを介して上記センス鎖ＲＮＡの所定の
部位に結合している。ここで、二官能性リンカーとしては、官能基を２つ含むリンカーで
あれば特に制限されないが、例えば、N-スクシニミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオ
ネート、N-4-マレイミド酪酸、S-(2-ピリジルジチオ)システアミン、ヨードアセトキシス
クシンイミド、N-(4-マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド、N-[5-(3’-マレイミド
プロピルアミド)−１−カルボキシペンチル]イミノジアセティクアシッド、N-(5-アミノ
ペンチル)-イミノジアセテックアシッド等を使用できる。
上記センス鎖ＲＮＡにおける、置換基若しくは機能性分子又はこれらを連結するリンカ
ーの結合部位については、特に限定されるものではないが、これらがセンス鎖ＲＮＡの所
定のヌクレオチドのリン酸部分の水酸基を構成する水素原子と置換されて結合しているこ
とが好ましい。

本発明のｓｉＲＮＡは、具体的には、例えば以下の（ａ）〜（ｓ）に示すセンス配列と
アンチセンス配列とから形成される二本鎖ＲＮＡ分子が例示できる。

また、キメラ型としては、センス鎖の３’末端側から１〜８のヌクレオチド及びアンチ
センス鎖の５’末端側から１〜６のヌクレオチドを任意数、連続してＤＮＡに変換したも
のが好適に挙げられ、例えば上記の（ｌ）の場合を用いて例示すれば以下のとおりである
。

本発明のｓｉＲＮＡの製造方法は、特に限定されないが、公知の製造方法、例えば、in
vitroで化学的に合成すること、又はプロモーター及びＲＮＡポリメラーゼを用いた転写
系により合成することができる。
化学的合成は、ｓｉＲＮＡ構成要素である核酸分子を含むアミダイド樹脂を原料として
、核酸合成装置により合成することが可能である。
転写系による合成は、ヘアピン型ＲＮＡをトリミングする試験管内転写法により２本鎖
ＲＮＡを合成することが可能である。

斯くして得られる本発明のｓｉＲＮＡは、後記実施例に示すように、ヒト肺胞上皮由来
細胞においてＴＧＦ−β１の発現をｍＲＮＡレベルで効果的に抑制することができ、さら
に肺線維症モデルマウスの肺においてインターフェロン反応が誘導されることなく、肺線
維症の症状改善効果を発揮する。
従って、本発明のｓｉＲＮＡ及び当該ｓｉＲＮＡを投与対象内で発現可能な発現ベクタ
ーは、ヒト又は動物に投与するための医薬（医薬組成物）として有用である。具体的には
、ＴＧＦ−β１遺伝子発現抑制のための医薬、ＴＧＦ−β１の過剰発現に起因する疾患、
例えば線維症の予防・治療のための医薬、すなわち線維症の予防又は治療剤として有用で
ある。
ここで、肺の線維化を来たす疾患としては、間質性肺炎、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺
疾患（COPD: Chronic obstructive pulmonary disease）、急性呼吸促迫症候群 (ARDS: A
cute respiratory distress syndrome）、炎症性肺疾患、肺感染症、放射性肺臓炎、薬剤
性間質性肺炎、膠原病に伴う間質性肺炎など多岐にわたるが、原因が特定できない間質性
肺炎である特発性間質性肺炎(IIPs)のうち特発性肺線維症(IPF)が特に好ましい。特発性
間質性肺炎（IIPs）には臨床病理学的疾患として、特発性肺線維症（IPF）、非特異的間
質性肺炎(NSIP)、特発性器質化肺炎(COP/BOOP)、急性間質性肺炎(AIP)、剥離性間質性肺
炎(DIP)、呼吸細気管支炎に伴う間質性肺疾患(RB-ILD)、リンパ球性間質性肺炎(LIP)等が
包含される。
また、TGF-β1は、がん、特に肺腺がんの浸潤や転移を促進すること（Mol Cell Bioche
m (2011) 355:309.314、Cancer Genomics Proteomics 2010, 7, 217）、TGF-β1が、がん
治療後の正常組織の損傷部位で過剰発現し、TGF-β1経路を標的とすることで当該正常組
織の損傷を抑制できること（The Oncologist 2010;15:350.359）等が報告されていること
から、本発明のｓｉＲＮＡ及び当該ｓｉＲＮＡを投与対象内で発現可能な発現ベクターは
、がん、特に肺がんの予防又は治療剤としても有用である。

本発明のｓｉＲＮＡを医薬として使用する場合、そのままでも使用することができるが
、高度分岐環状デキストリン又はシクロアミロースと複合体を形成させてもよい。ここで
、高度分岐環状デキストリンとは、枝作り酵素をアミロペクチンに作用させて生産される
ものであり、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する重合度５０〜５０００のグ
ルカンをいう。ここで、内分岐環状構造部分とはα−１，４−グルコシド結合とα−１，
６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは該内
分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である。高度分岐環状デキストリンの好適な
形態として、上記グルカンの内分岐環状構造部分の重合度が１０〜１００であるもの、上
記グルカンの外分岐構造部分の重合度が４０以上であるもの、上記外分岐構造部分の各単
位鎖の重合度が平均で１０から２０であるものが例示される。また、高度分岐環状デキス
トリンは市販されており、本発明では市販品を使用することもできる。
シクロアミロースは、グルコースがα−１，４結合により結合した環状α−１，４−グ
ルカンであり、へリックス構造の内側に立体的で奥行きのある空洞部分を有している。本
発明に使用されるシクロアミロースにおけるグルコースの重合度としては、特に制限され
るものではないが、例えば１０〜５００、好ましくは１０〜１００、更に好ましくは２２
〜５０が例示される。シクロアミロースは、アミロマルターゼ等の酵素を利用して、グル
コースから調製することができる。また、シクロアミロースは市販されており、本発明で
は市販品を使用することもできる（国際公開第２００９／６１００３号パンフレット参照
）。

本発明のｓｉＲＮＡは、１以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤を用いて常法によ
り、医薬組成物として製剤化することができる。当該医薬組成物は、経肺投与、経鼻投与
、経口投与、直腸投与、注射等の何れの投与形態の組成物であってもよく、投与は全身性
又は局所的のいずれでもよい。その剤形は、その投与経路に応じて、液剤、懸濁剤、乳剤
、錠剤、丸薬、ペレット、カプセル剤、散剤、徐放性製剤、坐剤、エアロゾル、スプレー
など、使用に適したいかなるものでもよい。

例えば、経鼻投与では、有効成分を、適当な溶媒（生理食塩水、アルコールなど）に溶
解し、その溶液を鼻に注入又は点鼻することによって送達することができる。あるいは、
経肺投与又は経鼻投与では、有効成分を、適切な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタ
ン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又はその
他の適切な気体を用いて、加圧パック又はネブライザからエアロゾルスプレーを噴出させ
る形で都合良く送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量分が送
達されるように弁を設けることにより決定することができる。更に粉末吸入剤としての投
与も可能である。

注射の場合、有効成分は、例えばボーラス注射又は連続注入による非経口投与（すなわ
ち静脈内又は筋肉内投与）用に溶剤として処方することができ、好ましくはハンクス液や
リンガー液、生理食塩水などの、生理学的に適合性のある緩衝液として処方することがで
きる。この溶剤は、懸濁剤や安定剤、及び／又は分散剤などの、処方可能な薬剤を含有し
てよい。あるいは有効成分は、使用前に、例えば滅菌した発熱性物質を含まない水などの
適切な賦形剤と共に再構成するために、粉末形態にすることができる。注射用製剤は、保
存剤を添加して、例えばアンプル又は複数回投与容器中の単位投与剤形として提供するこ
とができる。

経口投与する場合には、本発明の治療剤は、例えば錠剤、顆粒、散剤、乳剤、カプセル
、シロップ、水性又は油性懸濁液、又はエリキシルの形態であり得る。錠剤又は丸薬形態
の場合は、胃腸管内での分散及び吸収を遅延させ、それにより長時間持続した作用をもた
らすために、組成物をコーティングすることができる。

薬学的に許容される担体又は賦形剤としては、限定されるものではないが、液体（例え
ば水、油、生理食塩水、デキストロース水溶液、エタノールなど）、固体（例えばアカシ
アガム、ゼラチン、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、タルク、ステアリ
ン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、ケラチン、コロイド状シリカ、乾燥脱
脂乳、グリセロールなど）が挙げられる。また、本発明の治療剤は、通常の医薬組成物に
配合される補助剤、防腐剤、安定化剤、濃化剤、潤滑剤、着色剤、湿潤剤、乳化剤、及び
ｐＨ緩衝剤などのうち適当なものを含有してもよい。

本発明の医薬組成物には、本発明のｓｉＲＮＡを、０．００１〜５０質量％、好ましく
は０．０１〜１０質量％、更に好ましくは０．１〜１質量％含有することができる。

本発明の医薬組成物の投与量は、有効量を適用すれば特に制限されないが、例えば、体
重１ｋｇあたり、好ましくは０．０００１〜１００ｍｇであり、更に好ましくは０．００
２〜１ｍｇである。

本発明の医薬組成物においては、本発明のｓｉＲＮＡに換えて、投与対象内で当該ｓｉ
ＲＮＡを発現可能な発現ベクターを用いることも可能である。
この場合の発現ベクターは、例えば、本発明のｓｉＲＮＡをコードすることができるＤ
ＮＡを、適当な遺伝子治療用ベクター、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウ
イルス（ＡＡＶ）ベクター、又はレンチウイルスベクター等に挿入することにより構築す
ることができる。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実
施例に限定されるものではない。
実施例１ｓｉＲＮＡの作製
下記表３に示されるＴＧＦ−β１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子を設計し、各ｓｉ
ＲＮＡオリゴヌクレオチドを化学合成法によって合成し、ＨＰＬＣ精製法にて精製して使
用した。

実施例２ＴＧＦ−β１の発現抑制効果の評価（in vitro）
（１）細胞
ヒト肺胞上皮由来のＡ５４９細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）を用いた
。

（２）培養条件
１×１０⁵個の細胞を１０％牛胎児血清含有のＤ−ＭＥＭ培地（Dulbecco's modified E
agle's Medium, 100unit/mLペニシリン, 100μg/mLストレプトマイシン含有，１２ウェル
プレート）に播種する。３７℃、５％ＣＯ₂条件下で一晩培養後、４０％コンフルエント
となったＡ５４９細胞の培地を無血清培地に交換した。

（３）前処理・ｓｉＲＮＡ添加量
ｓｉＲＮＡとして、上記表３に示すオリゴヌクレオチドを用い、細胞が４０％コンフル
エントとなった時点で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ (インビトロジェン社)を
用いて上記細胞への導入を行った。
具体的には、各ウェルあたり２．０μＬＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を９８
μＬＯＰＴＩ−ＭＥＭ（インビトロジェン）に添加し、５分間室温でインキュベーショ
ンした（Ａ溶液）。
０．２μＭｓｉＲＮＡ溶液０．６２５μＬを９９．３７５μＬＯＰＴＩ−ＭＥＭに
添加した（Ｂ溶液）。Ａ及びＢ溶液を混和し、室温で２０分間インキュベーションした。
インキュベーション後、１２−ウェルプレート各ウェルにＡＢ混液を添加した。ｓｉＲＮ
Ａ最終濃度が、０．１ｎＭとなるように添加した。

（４）後処理
（ｉ）サイトカイン処理
ｓｉＲＮＡ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混液を添加６時間後、培地を０．１％ＢＳ
Ａ（牛血清アルブミン）及びサイトカイン（１ｎｇ／ｍＬＩＬ−１β及び１ｎｇ／ｍＬ
ＴＮＦ−α）含有Ｄ−ＭＥＭ培地に交換し、１２時間培養した。培養後上清をサンプリ
ングした。

（ｉｉ）細胞中全ＲＮＡ抽出
細胞中全ＲＮＡ抽出には、自動核酸抽出装置ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８１０（富士フイル
ム株式会社）とＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８１０の専用キットであるＱｕｉｃｋＧｅｎｅＲ
ＮＡｃｕｌｔｕｒｅｄｃｅｌｌｋｉｔＳ（富士フイルム株式会社）を用いた。細胞
を１．０ｍＬＰＢＳで洗浄し、細胞溶解液０．５ｍＬを添加し、細胞中に含まれる全Ｒ
ＮＡの抽出を行った。０．５ｍＬ溶解液（ＬＲＣ、メルカプトエタノール添加済み）を添
加した１２ウェルプレートをシーソー型振盪機で５分間撹拌した。ピペッティングにより
液を５−６往復させてよく混ぜ、液をエッペンドルフチューブへ移した。エタノールを４
２０μＬ添加し、ボルテックスミキサーで１５秒間撹拌後、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８１０
で処理を行なった。ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８１０での処理中、ＤＮａｓｅ（ＲＱ１ＲＮ
ａｓｅ−ｆｒｅｅＤＮａｓｅ，Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。抽出した全ＲＮＡサンプ
ルは、次処理を行うまで−８０℃冷蔵庫にて保管した。

（iii）全ＲＮＡのｃＤＮＡ化
培養細胞から抽出された全ＲＮＡサンプル中のＲＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）を、２６０ｎ
ｍにおける吸光度の測定値から計算した（対照：ＴＥバッファー）。この値をもとに、各
サンプルにおいてＲＮＡ量が０．１μｇに相当する溶液量を９６ウェルプレートに入れた
。これに蒸留水を加えて全量１２μＬとし、さらにQuantiTect Reverse Transcription K
it（ＱＩＡＧＥＮ）に含まれるgDNA Wipeout Buffer ２μＬを加え、ボルテックス混和
後、４２℃で２分間インキュベートし、その後４℃に冷却した。これにQuantiTect Rever
se Transcription Kit（ＱＩＡＧＥＮ）に含まれるQuantiscript Reverse Transcriptase
１μＬ、Quantiscript RT Buffer ４μＬ、及びRT Primer Mix １μＬを加え、混和
し、４２℃で１５分間インキュベートした。続いてQuantiscript Reverse Transcriptase
を失活させるため９５℃で３分間加熱した後、４℃に冷却した。
この調製液（ｃＤＮＡ調製原液）をＴＥバッファーで５倍希釈し、標的遺伝子（ＴＧＦ
−β１）をターゲットとしたＰＣＲ用ｃＤＮＡ溶液とした。
また、ｃＤＮＡ調製原液をＴＥバッファーで５０倍希釈し、内部標準遺伝子としてＧＡ
ＰＤＨを選定しＰＣＲ用ｃＤＮＡ溶液とした。なお、コントロールサンプル（ｓｉＲＮＡ
非投与）のｃＤＮＡ調製原液をＴＥバッファーで１、１０、１００、及び１０００倍希釈
し、ＴＧＦ−β１をターゲットとしたＰＣＲ検量線用サンプルとした。同様にコントロー
ルサンプルｃＤＮＡ調製原液をＴＥバッファーで１０、１００、１０００、及び１０００
０倍希釈し、ＧＡＰＤＨをターゲットとしたＰＣＲ検量線用サンプルとした。

（５）ＴＧＦ−β１発現量の測定方法
ＴＧＦ−β１に由来するｃＤＮＡ産物２．５μＬを鋳型として、１２．５μＬQuantiFa
st SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN)と、ヒト由来ＴＧＦ−β１遺伝子又はヒト由来
ＧＡＰＤＨ遺伝子の２．５μＬ QuantiTect Primer Assay (QIAGEN)を用いて、滅菌蒸留
水にて最終容量２５μＬとしたＰＣＲ反応溶液を調製した。調製した溶液は、Applied Bi
osystems 7500 (Life Technologies Japan)にて、９５℃で５分間加熱した後、１）９５
℃，１０秒、２）６０℃，３５秒のサイクルを４０回繰り返した後に、９５℃から６０℃
に徐冷し、熱解離測定を行った。ＰＣＲ増幅過程に由来するＣｔ（Threshold Cycle）値
を基に、ＧＡＰＤＨ遺伝子のＣｔ値による各標的遺伝子の増幅割合を補正し、標的遺伝子
のｍＲＮＡ抑制効果を評価した。結果を図１及び表４に示す。

ｓｉＲＮＡ番号が、ｄ，ｐ，ｒ，ｆ，ｃ，ｇ，ｑ，ｊ，ｎ，ｉ，ｈ，ｅ，ａ，ｋ，ｌ，
ｏのものは、０．１ｎＭの濃度においても４０％以上のＴＧＦ−β１の発現抑制効率を有
していることがわかった。特に、ｓｉＲＮＡ番号が、ｌおよびｏのｓｉＲＮＡは、０．１
ｎＭにおいても８０％以上の抑制効率を示した。さらに、この配列は０．０１ｎＭにおい
ても顕著な抑制効果を示した。

実施例３キメラ型ｓｉＲＮＡの作成
ｓｉＲＮＡ番号（ｌ）を基に、下記表５に示したＴＧＦ−β１遺伝子を標的とするキメ
ラ型ｓｉＲＮＡ分子を設計し、各キメラ型ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを化学合成法に
よって合成し、ＨＰＬＣ精製法にて精製して使用した。

実施例４ＴＧＦ−β１の発現抑制効果の評価
表５に示すオリゴヌクレオチド（濃度：１０ｎＭ又は０．１ｎＭ）を用いて実施例２と
同様の方法で、ＴＧＦ−β１の発現抑制効果を評価した。結果を図２及び表６に示す。

実施例５リン酸又はチオリン酸結合キメラ型ｓｉＲＮＡの合成
ｓｉＲＮＡ番号（ｌ）を基に、下記表７に示したＴＧＦ−β１遺伝子を標的とするリン
酸又はチオリン酸結合キメラ型ｓｉＲＮＡ分子を設計し、各キメラ型ｓｉＲＮＡオリゴヌ
クレオチドを化学合成法によって合成し、ＨＰＬＣ精製法にて精製して使用した。

実施例６ＴＧＦ−β１の発現抑制効果の評価
表７に示すオリゴヌクレオチドを用いて実施例２と同様の方法でＴＧＦ−β１の発現抑
制効果を評価した。結果を図３及び表８に示す。

実施例７オーバーハング部分にＤＮＡを有するｓｉＲＮＡの合成
ｓｉＲＮＡ番号（ｌ）を基に、下記表９に示したＴＧＦ−β１遺伝子を標的とするオー
バーハング部分にＤＮＡを有するｓｉＲＮＡ分子を設計し、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチ
ドを化学合成法によって合成し、ＨＰＬＣ精製法にて精製して使用した。

実施例８ＴＧＦ−β１の発現抑制効果の評価
表９に示すオリゴヌクレオチドを用いて実施例２と同様の方法でＴＧＦ−β１の発現抑
制効果を評価した。結果を表１０に示す。

実施例９肺線維症モデルにおける効力の評価（in vivo試験）
マウスとヒトの共通配列であるｓｉＲＮＡ番号（ｑ）（配列番号34及び35）を基に、キ
メラ型siRNA（q-C8：センス鎖(5'→3')：CCAAGGGCUACCAtgccaact（配列番号52）、アンチ
センス鎖(5'→3')：ttggcaUGGUAGCCCUUGGGC（配列番号53）を設計し、実施例３と同様に
してキメラ型ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、ＨＰＬＣ精製法にて精製した。こ
れを被験物質として用いて、ブレオマイシン肺線維症モデルマウスにて効力の評価を行っ
た。
マウス（C57BL/6NCrSlc(SLC)、メス、13週齢）にペントバルビタール(大日本住友製薬
株式会社製)をマウス腹腔内に投与後、麻酔下のマウス背部皮下にALZET^TMosmotic pump（
model 2001, DURECT Corporation）を埋め込み作成した。なお、ALZET^TM osmotic pumpに
は約10mg/mLのブレオマイシン生理食塩水溶液200μLをあらかじめ注入しており、ブレオ
マイシンは日本化薬株式会社製を使用した。
被験物質は、ALZET^TMosmotic pump埋め込み後、3、7、14日目に蒸留水（大塚製薬株式
会社）で溶解し、毎回100μg/bodyをMicroSprayer^TM(model IA-1C、PENN CENTURY, Inc.)
を用いて気管内投与した。投与容量は、ブレオマイシン投与開始後3、7日目は75μL/body
、14日目は50μL/bodyで行った。
なお、比較対照として、ALZET^TMosmotic pumpに生理食塩水のみ200μLを注入して、被
験物質として蒸留水を投与した群、およびALZET^TM osmotic pumpに約10mg/mLのブレオマ
イシン生理食塩水溶液200μLを注入して、被験物質として蒸留水を投与した群を設定した
。

ALZET^TMosmotic pump埋め込み後21日目に、ペントバルビタールをマウス腹腔内に投与
し、麻酔下のマウスの頚部皮膚および筋肉を剥離し気管を露出させる。頚静脈から全採血
し致死させた後、留置針を用いて生理食塩水（大塚製薬株式会社）2mLを3回に分けて気管
内へ注入し、BALF（bronchoalveolar lavage fluid）約2mLを回収した。次いで、開胸し
、左心耳に切り込みを入れ、右心室より生理食塩水約1mLで灌流を行い、肺を摘出した。
摘出した肺の左葉は、組織学的評価を行なうため10%中性緩衝ホルマリン固定液（和光純
薬工業株式会社）に浸漬した。
採取したBALFは、遠心分離（2000rpm、4℃、10分間）し、上清のTGF-β１蛋白量をELIS
A法にて測定した。結果を図４に示す。図中、ＳＡＬは、生理食塩水(saline)、ＤＷは、
蒸留水(distilled water)、ＢＬＭは、ブレオマイシン(bleomycin)を示す。
10%中性緩衝ホルマリン固定液で固定した肺組織は、パラフィン包埋、組織切片作製後
、H.E.(Hematoxilin-Eosin)染色およびマッソントリクローム染色を行った。組織図を図
５に示す。

図４より、被験物質投与群(BLM/TGF-β1)では、BALF中のTGF-β1量が顕著に下した。こ
の効果は、比較対照の蒸留水投与群(BLM/DW)では観察されなかった。また、図５の組織図
より被験物質投与群では、炎症および線維化の程度が低減されることがわかった。

Claims

配列番号１の塩基番号１２８５〜１３１８番の塩基、１３９８〜１４１８番の塩基、１
４３４〜１４６３番の塩基、１５４８〜１５７９番の塩基、１６０８〜１６２８番の塩基
、１７００〜１７２６番の塩基、１７７８〜１７９８番の塩基、１８０６〜１８２６番の
塩基及び１８８７〜１９０７番の塩基よりなる群から選ばれる連続する１７〜２３塩基を
標的配列とし、全長が３０ヌクレオチド以下であるｓｉＲＮＡ。