WO2017043490A1

WO2017043490A1 - 自然免疫誘導効果が増強した二重鎖リボ核酸

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Publication number: WO2017043490A1
Application number: PCT/JP2016/076192
Authority: WO
Inventors: 哲郎中野; 洋志藤田; 貴博井口; 浩一郎三宅
Original assignee: 協和発酵バイオ株式会社
Priority date: 2015-09-07
Filing date: 2016-09-06
Publication date: 2017-03-16

Abstract

本発明は、二重鎖リボ核酸（dsRNA）を構成する２以上の一本鎖リボ核酸（ssRNA）において、５'末端のホスホロチオエート数の該dsRNA 1分子あたりの平均を１以上、または５'末端のリン酸数の該dsRNA 1分子あたりの平均を１以上としたことを特徴とする、アジュバント等の用途において高い機能を有する自然免疫誘導効果が改善したdsRNAまたはその塩；該dsRNA等を含有してなる免疫刺激物質、アジュバント、または医薬品等；ならびにそのようなdsRNA等を製造する方法を提供する。

Description

自然免疫誘導効果が増強した二重鎖リボ核酸

　本発明は、医薬品あるいは医薬品添加剤として有用性の高い二重鎖リボ核酸、およびその製法に関する。

　生体には、生体内に進入したウイルスや細菌などの病原体をすばやく認識し排除する自然免疫システムが備わっている。病原体が侵入した生体は、樹状細胞などの免疫担当細胞がToll-like receptor(TLR)やRIG-I-like receptors(RLRs)などの受容体を介して病原体の分子構造を多面的に認識し、I型インターフェロン(IFN)や炎症性サイトカインの産生といった自然免疫応答を起こす。このような自然免疫によって認識される病原体の構成成分やそれを模倣した物質は、免疫刺激物質と呼ばれ、医薬品あるいはワクチン用アジュバントとしての利用が期待されている。特にワクチンの用途においては、抗原の免疫原性を高めるのみならず、免疫寛容を一時的にブレークする化合物としても着目されており、その実用化に期待が集まっている。そのような免疫刺激物質の一つが人工合成した二重鎖リボ核酸（dsRNA）である。

　人工合成されたdsRNAの代表例としては、二重鎖を構成する一本鎖リボ核酸（ssRNA）がアデニル酸ホモポリマーとウリジル酸ホモポリマーであるpoly(A:U)や、二重鎖を構成するssRNAがグアニル酸ホモポリマーとシチジル酸ホモポリマーであるpoly(G:C)、二重鎖を構成するssRNAがイノシン酸ホモポリマーとシチジル酸ホモポリマーであるpolyIC、二重鎖を構成するssRNAがシチジル酸とウリジル酸が約１２：１で混ざり合ったポリマーC12Uとイノシン酸ホモポリマーであるpoly(I:C12U)などがある。これらのホモdsRNA、とりわけpolyICとpoly(I:C12U)は、ウイルス性疾患の治療薬や抗がん治療薬の候補として数多くの基礎研究や応用研究が行われている。

　polyICなどのdsRNAの自然免疫誘導効果および単回投与毒性は、dsRNAの鎖長が長くなるにつれて増大するといった特徴がある（非特許文献1）。

　人工ホモdsRNAは、リボヌクレオチド二リン酸を基質にポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼなどの酵素を用いてssRNAを合成し、アニーリング処理にて二重鎖を形成させることにより作製される。このような酵素合成されたssRNAは、酵素反応の特性上、鎖長にばらつきをもった混合物となる。また、イノシン酸ポリマーとシチジル酸ポリマーのようなホモポリマー同士をアニーリングすると、従来タイプの構造体の場合には、アニーリング条件を調整しても複数のssRNAが連なり、結果として生成するdsRNAの平均鎖長は長鎖化してしまい、化合物本来の自然免疫誘導効果を精度良く評価することができなかった。これに対し、本発明者らは人工ホモdsRNAの鎖長を一定に揃える技術を見いだし、特許文献１の中で発明を開示した。

　ところで、ホスホロチオエートとは、オリゴヌクレオチドのリン酸基と互換性のあるリン酸誘導体で、リン酸の酸素原子の一つを硫黄原子に置換した化合物を指す。オリゴヌクレオチドにおける3’-5’間のリン酸基がホスホロチオエートに置換されたホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼによる分解反応に耐性を示すことから、アンチセンスDNAや核酸医薬の分野で採用されている。また、CpGオリゴヌクレオチドと称されるアジュバント化合物は、その3’-5’間のリン酸基の一部またはすべてがホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドである。

　CpGオリゴヌクレオチドの自然免疫誘導効果は、ホスホロチオエート化される3’-5’リン酸基の位置や数によって質的量的に変化することが知られている（非特許文献２）。しかし、5’末端のホスホロチオエート化又はリン酸化のもたらす薬効に関する知見は見当たらない。また、アンチセンスの分野で自明となっているホスホロチオエート化の意義、すなわちエンドヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの分解を抑制する知見に基づけば、5’末端のホスホロチオエート化又はリン酸化によって自然免疫誘導効果が増強することは予想すらできなかった。

　なお、本願でいう鎖長とは、RNAの塩基数と同義である。ssRNAの鎖長の単位は塩基（base）またはキロ塩基(1 kb = 1000 base)と表記し、dsRNAの場合には、塩基対 (bp)またはキロ塩基対(1 kbp = 1000 bp)と表記する。
　また、ssRNAやdsRNAの重量平均鎖長は、好ましくは、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（SEC）分析法により決定される鎖長である。具体的には、分子量が既知であるdsRNAやdsDNAを標準品としてSEC分析を行い、得られたデータから平均鎖長や鎖長の中央値を算出する。

WO2014/088087

Japanese Journal of Microbiology (1976) 20(2): 71-76 Journal of Immunology (2001) 166: 2372-2377

　人工ホモdsRNAを、医薬品あるいは医療の現場で安全性を担保しながら利用するためには、鎖長が変化しにくいdsRNAであることに加えて、dsRNA分子あたりの自然免疫誘導能を増大させることも重要な課題となる。

　本発明の目的は、医薬品またはワクチン用アジュバントとして安全で高活性なdsRNAまたはその塩、およびその製造方法、さらには自然免疫誘導効果が改善するdsRNA配合製品を提供することにある。

　ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて塩基性雰囲気下で酵素合成された人工ホモdsRNAの5’末端は、大部分が5’ヒドロキシルである。なぜならば、リボヌクレオチドの5’-3’ホスホジエステル結合は、塩基性雰囲気下で非酵素的に加水分解され、2’ヒドロキシルによって優先的に求核攻撃を受け、解裂後は5’ヒドロキシル体と2’-3’環状リン酸体を形成するためである（生物工学 (2011) 89(4): 200-203）。なお、2’-3’環状リン酸体はさらに反応して2’リン酸体もしくは3’リン酸体に収束する。
　本発明者らは、dsRNA分子中の5’一リン酸の比率を増大させることにより、自然免疫誘導効果が増大すること、更に、5’末端を一リン酸ではなくモノホスホロチオエート化することにより、自然免疫誘導効果がより増大することを見いだし、本発明を完成するに至った。

　本発明は即ち、以下の［１］～［５］に関する。
［１］重量平均鎖長が0.1 キロ塩基対（kbp）から2.0 kbpの範囲内にある、アジュバント用の二重鎖リボ核酸（dsRNA）またはその塩であって、
　該dsRNAの第１の鎖は２以上の一本鎖リボ核酸（ssRNA）からなり、該第１の鎖を構成する２以上のssRNAの全ては、同種のリボヌクレオチドからなるホモポリマーであること、
　該dsRNAの第２の鎖は１つのssRNAからなり、該第１の鎖を構成する２以上のssRNAの各々と二重鎖を形成できる程度に、該第１の鎖のssRNAと相補する塩基配列を有すること、
　該第１の鎖を構成する２以上のssRNAの重量平均鎖長は該第２の鎖を構成する１つのssRNAの重量平均鎖長の1/2以下であること、および
　該第１の鎖を構成する２以上のssRNAおよび該第２の鎖を構成する１つのssRNAの５’末端のホスホロチオエート数の該dsRNA 1分子あたりの平均が１以上であること
を特徴とする、dsRNAまたはその塩。
［２］重量平均鎖長が0.1 キロ塩基対（kbp）から2.0 kbpの範囲内にある、アジュバント用の二重鎖リボ核酸（dsRNA）またはその塩であって、
　該dsRNAの第１の鎖は2以上の一本鎖リボ核酸（ssRNA）からなり、該第１の鎖を構成する2以上のssRNAの全ては、同種のリボヌクレオチドからなるホモポリマーであること、
　該dsRNAの第２の鎖は１つのssRNAからなり、該第１の鎖を構成する2以上のssRNAの各々と二重鎖を形成できる程度に、該第１の鎖のssRNAと相補する塩基配列を有すること、
　該第１の鎖を構成する2以上のssRNAの重量平均鎖長は該第２の鎖を構成する１つのssRNAの重量平均鎖長の1/2以下であること、および
　該第１の鎖を構成する2以上のssRNAおよび該第２の鎖を構成する1つのssRNAの５’末端のリン酸数の該dsRNA 1分子あたりの平均が１以上であること
を特徴とする、dsRNAまたはその塩。
［３］上記［１］または［２］に記載のdsRNAまたはその塩を含有してなる免疫刺激物質、アジュバント、または医薬品。
［４］重量平均鎖長が0.1 キロ塩基対（kbp）から2.0 kbpの範囲内にある、アジュバント用の二重鎖リボ核酸（dsRNA）またはその塩の製造方法であって、該方法は、
（１）同種のリボヌクレオチドからなるssRNAを調製する工程、
（２）前記（１）のssRNAに対して二重鎖を形成できる程度の相補性を有する塩基配列を有するssRNAを調製する工程、
（３）前記（１）のssRNAと前記（２）のssRNAとをアニーリングさせることにより、dsRNAを生成させる工程、および
（４）工程（３）の前に前記（１）で調製されるssRNAおよび前記（２）で調製されるssRNAのうちの少なくとも一方の５’末端をホスホロチオエート化するか、または、工程（３）の後に該dsRNAの５’末端をホスホロチオエート化する工程、あるいは、工程（３）の前に前記（１）で調製されるssRNAおよび前記（２）で調製されるssRNAの５’末端をリン酸化するか、または、工程（３）の後に該dsRNAの５’末端をリン酸化する工程
を含み、前記（１）のssRNAの重量平均鎖長が、前記（２）のssRNAの重量平均鎖長の1/2以下であってかつ0.02～1.0 キロ塩基（kb）である、方法。
［５］前記工程（４）において５’末端にホスホロチオエート基またはリン酸基を導入されるssRNAまたは鎖が、シチジル酸を80%以上の割合で含む、上記［４］に記載の方法。

　本発明で開示した知見を利用することで、アジュバント効果が増大したdsRNA、およびそのdsRNAを配合した有効性の高い免疫賦活剤、アジュバント、ワクチン等を提供することができる。本発明はまた、そのようなdsRNAの製造方法も提供する。

（dsRNAまたはその塩）
　本発明は新規のdsRNAまたはその塩（以下、これらを総称して「本発明のdsRNA」と呼称することもある）を提供する。本発明のdsRNAは、該第１の鎖および該第２の鎖を構成するssRNAの５’末端のホスホロチオエート数の該dsRNA 1分子あたりの平均が1以上、好ましくは１～２０、より好ましくは１～１０、最も好ましくは１～５であること、あるいは、該第１の鎖および該第２の鎖を構成するssRNAの５’末端のリン酸数の該dsRNA 1分子あたりの平均が１以上、好ましくは２～２０、より好ましくは２～１０、最も好ましくは２．５～８であることを特徴とする。
　なお、上記の通り、第１の鎖は２以上のssRNAからなるものであり、従って本発明のdsRNAにおいては、第２の鎖であるssRNAに対して、第１の鎖である２以上のssRNAがリボヌクレオチド間の相補的な結合により結合している事象が生じ得る。その場合、該dsRNAを構成する第１の鎖は、それを構成する全てのssRNAがホスホジエステル結合で結合したものではなく、直接的には結合していない複数のssRNAを含むことになる。本明細書においては、全てのssRNAが「鎖」状に連結しているか否かに関わらず、dsRNAを構成する２つの鎖のうち、２以上のssRNAからなる側を便宜上、第１の鎖と表現し、１つのssRNAからなる側を便宜上、第２の鎖と表現する。

　本発明の第１の鎖を構成する全てのssRNAは、同種のリボヌクレオチドからなるホモポリマーである。該ssRNAは、以下に限定されないが例えば、アデニル酸ホモポリマー、ウリジル酸ホモポリマー、グアニル酸ホモポリマー、シチジル酸ホモポリマー、イノシン酸ホモポリマー等であり得る。

　一方、第２の鎖を構成するssRNAは、本発明のdsRNAの使用環境において、第１の鎖を構成する２以上のssRNAの各々と二重鎖を形成できる程度に、該第１の鎖のssRNAと相補する塩基配列を有する。従って、第２の鎖のssRNAは、全ての塩基が第１の鎖のssRNAの塩基に相補的となる配列に限定されるものではない。なお、本発明のdsRNAの使用環境とは、生体に投与することを前提とした用途では、例えば、温度が約37℃の生理食塩水（pHが約7.4、塩化ナトリウム濃度が約150 mM）中に溶解した条件下と考えることができる。
　そのため、例えば、第２の鎖のssRNAは、第１の鎖の各ssRNAを構成するリボヌクレオチドに対して相補的なリボヌクレオチドが１種または複数種組み合わされた配列のssRNAは無論のこと、第１の鎖のssRNAとの相補的な結合を著しく阻害しない範囲で、更にそこに、第１の鎖の各ssRNAを構成するリボヌクレオチドに対して相補的ではないリボヌクレオチドが、当該ssRNAを構成する全リボヌクレオチドに対して20%未満、好ましくは10%未満、より好ましくは5%未満、更により好ましくは3%未満、特に好ましくは2%未満、最も好ましくは1%未満の頻度で組み込まれたssRNAであってもよい。リボヌクレオチドの塩基間の相補性については当該技術分野において良く知られている。

　具体的には、第１の鎖のssRNAがアデニル酸ホモポリマーの場合には、第２の鎖のssRNAとしてはウリジル酸とイノシン酸から選ばれたリボヌクレオチドが1種または複数種組み合わされた配列のssRNAは無論のこと、第１の鎖のssRNAとの相補的な結合を著しく阻害しない範囲で、更にそこにアデニル酸および／またはグアニル酸および／またはシチジル酸および／またはキサンチル酸が、当該ssRNAを構成する全リボヌクレオチドに対して20%未満、好ましくは10%未満、より好ましくは5%未満、更により好ましくは3%未満、特に好ましくは2%未満、最も好ましくは1%未満の頻度で組み込まれたssRNAであってもよい。
　また、第１の鎖のssRNAがウリジル酸ホモポリマーの場合には、第２の鎖のssRNAとしてはアデニル酸からなる配列のssRNAは無論のこと、第１の鎖のssRNAとの相補的な結合を著しく阻害しない範囲で、更にそこにウリジル酸および／またはグアニル酸および／またはイノシン酸および／またはシチジル酸および／またはキサンチル酸が、当該ssRNAを構成する全リボヌクレオチドに対して20%未満、好ましくは10%未満、より好ましくは5%未満、更により好ましくは3%未満、特に好ましくは2%未満、最も好ましくは1%未満の頻度で組み込まれたssRNAであってもよい。
　また、第１の鎖のssRNAがグアニル酸ホモポリマーの場合には、第２の鎖のssRNAとしてはシチジル酸ホモポリマーは無論のこと、第１の鎖のssRNAとの相補的な結合を著しく阻害しない範囲で、更にそこにウリジル酸および／またはアデニル酸および／またはグアニル酸および／またはイノシン酸および／またはキサンチル酸が、当該ssRNAを構成する全リボヌクレオチドに対して20%未満、好ましくは10%未満、より好ましくは5%未満、更により好ましくは3%未満、特に好ましくは2%未満、最も好ましくは1%未満の頻度で組み込まれたssRNAであってもよい。
　また、第１の鎖のssRNAがシチジル酸ホモポリマーの場合には、第２の鎖のssRNAとしてはグアニル酸とイノシン酸から選ばれたリボヌクレオチドが1種または複数種組み合わされた配列のssRNAは無論のこと、第１の鎖のssRNAとの相補的な結合を著しく阻害しない範囲で、更にそこにアデニル酸および／またはウリジル酸および／またはシチジル酸および／またはキサンチル酸が、当該ssRNAを構成する全リボヌクレオチドに対して20%未満、好ましくは10%未満、より好ましくは5%未満、更により好ましくは3%未満、特に好ましくは2%未満、最も好ましくは1%未満の頻度で組み込まれたssRNAであってもよい。
　また、第１の鎖のssRNAがイノシン酸ホモポリマーの場合には、第２の鎖のssRNAとしてはアデニル酸とシチジル酸から選ばれたリボヌクレオチドが1種または複数種組み合わされた配列のssRNAは無論のこと、第１の鎖のssRNAとの相補的な結合を著しく阻害しない範囲で、更にそこにウリジル酸および／またはグアニル酸および／またはイノシン酸および／またはキサンチル酸が、当該ssRNAを構成する全リボヌクレオチドに対して20%未満、好ましくは10%未満、より好ましくは5%未満、更により好ましくは3%未満、特に好ましくは2%未満、最も好ましくは1%未満の頻度で組み込まれたssRNAであってもよい。一つの実施形態では、第１の鎖のssRNAはイノシン酸ホモポリマーであり、かつ第２の鎖のssRNAはシチジル酸を80%以上の割合で含むssRNAであり、例えば、第１の鎖のssRNAがイノシン酸ホモポリマーであり、かつ第２の鎖のssRNAがシチジル酸ホモポリマーである場合等が挙げられる。

　一つの実施形態において、本発明のdsRNAにおいてホスホロチオエート化またはリン酸化されているssRNAまたは鎖は、それを構成するリボヌクレオチドの80%以上、90%以上、95%以上、98%以上、または全てが、ピリミジン塩基を有するものであってよい。ピリミジン塩基を有するリボヌクレオチドとしては、ウリジル酸、シチジル酸などが挙げられる。

　作製したRNAが二重鎖を形成しているかどうかは、例えば、ssRNAとdsRNAのAbs260nmの吸光係数の相違を利用した温度-吸光度曲線を調べることで判定することができる。すなわち、核酸塩基に由来するAbs260nmの吸収は、核酸塩基同士が水素結合することにより減少する特性を利用する。具体的には、RNA検体を生理食塩水で希釈して石英セルに充填し、温度制御機能付きの分光光度計でゆっくりと石英セルを加熱しながら連続的に吸光度を測定することで温度-吸光度曲線を測定する。検体がdsRNAの場合には、ssRNA間の水素結合が壊れてssRNAに解離しはじめる温度を境にAbs260nmが急激に上昇するため、その温度-吸光度曲線はシグモイド曲線となるが、検体が二重鎖を形成していないssRNA混合物の場合には、その温度-吸光度曲線は線形となる。

　本発明のdsRNAは、アジュバントとしての活性および安全性の観点から、0.1 kbpから2.0 kbpの範囲内、より好ましくは0.1 kbpから1.0 kbpの範囲内、更により好ましくは0.2 kbpから0.6 kbpの範囲内の重量平均鎖長を有する。また、第１の鎖を構成するssRNAの重量平均鎖長は例えば0.02～1.0 kbであり、好ましくは0.02～0.4 kb、より好ましくは0.02～0.2 kbである。一方、第２の鎖のssRNAの重量平均鎖長は例えば0.04～2.0 kbであり、好ましくは0.04～0.8 kb、より好ましくは0.04～0.4 kbである。

　重量平均鎖長は、前記した通り、SEC分析法によって決定することができる。アガロースゲル電気泳動法やポリアクリルアミドゲル電気泳動法で鎖長を算出する手法もあるが、電気泳動バッファーは塩濃度が低いために、電気泳動中にdsRNAが部分解離して切断されるといった課題があり鎖長分布を精度良く解析するには難がある。したがって、アガロースゲル電気泳動法やポリアクリルアミドゲル電気泳動法で算定した精度の低い鎖長と本発明の実施例で示したデータとを比較することはできない。

　SEC分析は、水溶性のSEC分析用カラムを装着したSEC解析システムを用いて行うことができる。その場合、溶離液の塩濃度を高く保ち、カラム温度を低くして分析を行うことが肝要である。具体的には例えば、下記の通りにSEC分析を行うことができる。SEC解析システムとしては、島津製作所製のLC Solution GPCを使用し、イソクラテックモードでクロマトグラフィーを行い、Abs 260nmの吸光強度を測定する。カラムとしては、4000 bp以下のdsRNAの分析を行う目的で、TSKgel G5000PWXL（東ソー株式会社製）を使用する。分子量マーカーとしては、モノヌクレオチドと自動合成機で作製したオリゴヌクレオチド、およびλDNAを鋳型にして適当なDNA配列をPCR法で増幅して得られる約100 bpから約4000 bpの各種DNA断片を使用する。
　分析条件は以下の通りである。
　　・溶離液： 10mM トリス硫酸バッファー（pH7.0）、150mM 硫酸ナトリウム
　　・ポンプ流速： 0.5 ml/min
　　・カラム： TSK-Gel G-5000PWXL
　　・カラム温度： 25℃
　　・UV検出： Abs 260 nm

　LC-Solution GPCから出力されるAbs 260 nmの吸光強度は、表計算ソフトなどで再処理する必要がある。なぜならば、記録されたAbs 260 nmの吸光データは、RNAの濃度ではなく、RNAの濃度とそのRNAの鎖長数の積を表しているからである。LC-Solution SECに記録された経時的な吸光度データとSEC分子量データのマトリックスを表計算ソフトに取り込み、SEC分子量から塩基数を求め、吸光度を塩基数で除した値Aを求め、値Aと分子量のデータを統計処理して数平均鎖長、重量平均鎖長と中央値（値Aが極大となる鎖長）を求める。なお、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼで合成したRNAの塩基数とSEC分子量の関係式は、以下の計算式を使用できる。
　　ssRNAの場合
　　　　塩基数＝SEC分子量／（NMP-18）
　　　　NMP：ヌクレオチド一リン酸の平均分子量
　　dsRNAの場合
　　　　塩基数＝SEC分子量／（NMP1＋NMP2－36）
　　　　NMP1：センス側のヌクレオチド一リン酸の平均分子量
　　　　NMP2：アンチセンス側のヌクレオチド一リン酸の平均分子量

　本発明のdsRNAにおけるホスホロチオエート構造の位置は問わず、第１の鎖および第２の鎖を構成するssRNAのうちの１以上、好ましくは１～２０、より好ましくは１～１０、最も好ましくは１～５のssRNAにおいて、その5'末端がホスホロチオエート化されていればよい。5'ホスホロチオエート構造を持たないssRNAの5'末端の構造は問わず、3’末端の構造も問わない。具体的には、5’ホスホロチオエート構造を持たないssRNAの5’末端は、ヒドロキシルか一リン酸か二リン酸か三リン酸のいずれであってもよく、3’末端はヒドロキシルか一リン酸か2’-3’環状リン酸のいずれであってもよい。

　また、本発明のdsRNAにおいて、第1の鎖と第2の鎖を構成するssRNAのうちの１以上、好ましくは２～２０、より好ましくは２～１０、最も好ましくは２．５～８のssRNAにおいて、その5'末端がリン酸化されていればよい。このとき、5’リン酸構造を持たないssRNAの5'末端の構造はヒドロキシルである。また、3’末端の構造は問わない。具体的には、3’末端はヒドロキシルか一リン酸か2’-3’環状リン酸のいずれであってもよい。

　本発明のdsRNAは、dsRNAの5’末端にオリゴデオキシヌクレオチド（オリゴDNA）が付加されたDNA-RNAハイブリッド型の構造体となっていても構わない。この場合、当該dsRNA の5’末端の構造とは、オリゴDNAの5’末端の構造も含まれる。

　本発明のdsRNAにおける塩としては金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等が挙げられる。金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられる。アンモニウム塩としては、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられる。有機アミン付加塩としては、トリスヒドロキシアミノメタン等の塩が挙げられる。アミノ酸付加塩としては、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、オルニチン等の塩が挙げられる。

（免疫刺激物質、アジュバント、医薬品）
　本発明のdsRNAはアジュバントとして用いられる。すなわち、本発明のdsRNA、およびその混合物は、ワクチンや抗がん剤やタンパク医薬、抗体医薬、核酸医薬など他に有効成分がある医薬品の性能を改善する目的で、ワクチン、医薬品、動物薬、水産薬等に配合される。剤形は、注射剤、点鼻剤、点眼剤、経皮吸収剤などどのような形態でも良い。
　また、本発明のdsRNAは、他の成分との組み合わせや製剤技術と組み合わせて使用することもできる。例えば、ポリリジンやポリグルタミン酸などのカチオン性ポリマーと水素結合させたハイブリッドポリマーとしての利用や、シグナル伝達経路の異なる他の免疫刺激物質との混合、カチオン性リポソームや水中油型乳剤、無機または有機質ナノ粒子に含有または吸着させた複合アジュバントとしての利用、増粘剤と混合して展着力を改善する製剤としての利用が挙げられる。さらには、ウイルス様粒子技術（Virus-like particle）やドラッグデリバリー技術や皮膚パッチ製剤技術と組み合わせることもできる。さらには、シグナル伝達経路の異なる免疫刺激物質と混合して使用することもできる。

　本発明のdsRNAの自然免疫誘導効果は、自然免疫を誘導するインターフェロンβ（以後、IFNβともいう。）の分泌量を、後述の試験例１または３に記載の方法で測定することにより、または、病原体認識分子であるRIG-I-like receptor (以後、RLRともいう。)との結合能を、後述の試験例２に記載の方法で測定することにより評価することができる。

（製造方法）
　本発明はまた、dsRNAまたはその塩の製造方法（以下、本発明の製造方法）を提供する。該方法は、
（１）同種のリボヌクレオチドからなるssRNAを調製する工程、
（２）前記（１）のssRNAに対して二重鎖を形成できる程度の相補性を有する塩基配列を有するssRNAを調製する工程、
（３）前記（１）のssRNAと前記（２）のssRNAとをアニーリングさせることにより、dsRNAを生成させる工程、および
（４）工程（３）の前に前記（１）で調製されるssRNAおよび前記（２）で調製されるssRNAのうちの少なくとも一方の５’末端をホスホロチオエート化するか、または、工程（３）の後に該dsRNAの５’末端をホスホロチオエート化する工程、あるいは、工程（３）の前に前記（１）で調製されるssRNAおよび前記（２）で調製されるssRNAの５’末端をリン酸化するか、または、工程（３）の後に該dsRNAの５’末端をリン酸化する工程を含む。
　工程（１）、（２）で調製されたssRNAとしては、本発明のdsRNAについてそれぞれ第１の鎖または第２の鎖を構成するssRNAとして上述したものと同様のものとすることができ、それにより本発明のdsRNAを製造することができる。

　工程（１）、（２）において、ssRNAは、市販のRNA合成装置を用いてリボヌクレオチド一リン酸を原料に化学合成することができる。また、市販のRNAポリメラーゼを用いて、デオキシリボ核酸を鋳型にリボヌクレオチド三リン酸から酵素合成することもできる。また、市販のポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて、鋳型なしにリボヌクレオチド二リン酸から酵素合成することもできる。ssRNAの調製に際し、例えば文献［特開平2-227077］に記載の方法等を適宜利用してもよい。

　ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼで酵素合成したssRNAは、平均鎖長が2 kbを超えることが多いが、反応時間を延長することでより短い鎖長のssRNAを得ることができる。また、RNAの短鎖化は、超音波処理や固体での乾熱処理、アルカリ処理、RNA分解酵素を用いた酵素処理などどのような方法を用いても良い。

　合成したssRNAの精製、およびそれをアニールしたdsRNAの精製は、透析や沈殿濾過やカラム精製等の公知の手法で実施することができる。精製したssRNAおよびdsRNAは1-20 mg/mlの水溶液として取得することが可能であり、さらに凍結乾燥などの処理によって固体として取得することもできる。

　工程（３）におけるアニーリング操作は、非特許文献１等に記載の公知の方法で行うことができる。アニーリングに用いるssRNAは精製したssRNAのみならず未精製のssRNAを用いてもよい。

　工程（４）において、５’末端がリン酸化されたssRNAまたはdsRNAの合成は、T4ホスホヌクレオチドキナーゼの5’リン酸基転移活性を利用して成し得る。T4ポリヌクレオチドキナーゼは、ATPのγ位のリン酸基をポリリボヌクレオチド(二本鎖および一本鎖)のリボース5’位に転移し得る酵素である。
　工程（４）において、５’末端がホスホロチオエート化されたssRNAまたはdsRNAの合成も、T4ホスホヌクレオチドキナーゼの5’リン酸基転移活性を利用して成し得る。すなわち、ATPの代わりにアデノシン-5'-O-(3-チオ三リン酸）をホスホロチオエート基供与体として用いることでポリリボ核酸の５’末端にホスホロチオエート基を付加させることができる。
　T4ホスホヌクレオチドキナーゼの5’リン酸基転移反応は、リボ核酸の５’末端のリン酸基のリン酸数や状態を問わずリン酸基の交換や付加を行う。また、T4ホスホヌクレオチドキナーゼの5’リン酸基転移反応は、ポリリボ核酸を構成する配列内部の5’-3’リン酸基および3’末端のリン酸基には作用しないため、T4ホスホヌクレオチドキナーゼを用いることで5’位置特異的な修飾反応を実施することができる。

　ssRNAの5’末端のリン酸化率は、Calf Intestine Alkaline Phosphatase(CIAP)などのアルカリホスファターゼを過剰添加して反応させ、遊離したリン酸量を定量分析し、リン酸モル濃度をssRNAモル濃度で除すことで算出できる（Pi法と略す）。
　遊離リン酸の定量分析は、マラカイドグリーンリン酸分析キット（BioAssay Systems社[USA]）などを利用すればよい。

　また、ssRNAおよびdsRNAの5’末端のリン酸化率は、ATPを基質とするT4 Phosphonucleotide kinase (PNK)反応を行い、付加したリン酸と等モル生じるADPを定量分析し、そのADPモル濃度をssRNAまたはdsRNAのモル濃度で除すことで算出することもできる（ADP法と略す）。

　生成したADPの定量分析は、HPLC分析が利用できる。例えば、核酸分析用の弱アニオンタイプの分析カラムを用いてイソクラテックモードでクロマトグラフィーを行い、Abs 260nmの吸光強度をモニタリングして、ADP標準品とのシグナルの強さから定量する。
　分析条件の一例を挙げると以下の通りである。
　　・溶離液： 250mM リン酸ナトリウムバッファー（pH7.0）
　　・カラム： Shodex AXpak WA-624 (6.0mmI.D. x 150mm)
　　・カラム温度： 35℃
　　・UV検出： Abs 260 nm

　一方、ssRNAおよびdsRNAの5’末端のホスホロチオエート化率は、ホスホロチオエート基をFluorescein Maleimideによりラベル化し、Fluorescein Maleimideを標準品とする蛍光分析（励起波長 485 nm、蛍光波長 535 nm）に供してラベル体を定量分析し、そのラベル体モル濃度をssRNAまたはdsRNAのモル濃度で除すことで算出することができる。

　ssRNAまたはdsRNAのモル平均分子量は、SEC分析法で算出された数平均分子量から求める。このとき、5’末端および3’末端の構造の違いは誤差と見なし数値計算上考慮しないものとする。計算式は下記のとおりである。
　　ssRNAの場合
　　　　モル平均分子量＝SECで算出された数平均分子量
　　dsRNAの場合
　　　　モル平均分子量＝SECで算出された数平均分子量

　本発明の製造方法により作製されるdsRNAは、第１の鎖および第２の鎖を構成するssRNAの５’末端のホスホロチオエート数の該dsRNA 1分子あたりの平均が１以上、好ましくは１～２０、より好ましくは１～１０、最も好ましくは１～５、または第１の鎖および第２の鎖を構成するssRNAの５’末端のリン酸数の該dsRNA 1分子あたりの平均が１以上、好ましくは２～２０、より好ましくは２～１０、最も好ましくは２．５～８である。

　dsRNAの塩を取得したいとき、dsRNAが塩の形で得られる場合には、そのまま精製すればよく、遊離の形で得られる場合には、水に溶解してカチオンを加えて塩を形成させ、沈殿濾過やカラム精製等の通常の方法で精製すればよい。

　以下に、試験例と比較例を示す。

比較例１．5’-末端非リン酸化poly ICの作製
　Poly Iおよびpoly Cの5’-末端の脱リン酸化処理は、Calf Intestine Alkaline Phosphatase(CIAP)[タカラバイオ社]を用い、同社の標準プロトコールに準じて実施した。すなわち、poly I-01 [重量平均塩基長 101b、数平均分子量 8804] 40 mg をCIAP反応バッファー[組成： 50 mM トリス塩酸バッファー(pH9.0), 1 mM 塩化マグネシウム]に溶解して5mLとし、30000 U/ml CIAP 0.0033 mlを加えて、37℃で30分間反応させた。反応終了後、0.1 mlを分析用に分取し、残りをフェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿の順序で精製して5’-末端が脱リン酸化された5’OH-poly I [重量平均塩基長 110b] 39 mgを得た。poly C-01 [重量平均塩基長 413b、数平均分子量68310] 40 mg を上述したpoly Iと同条件でCIAPによる5’-末端の脱リン酸化処理を行い、0.1 mlを分析用に分取し、残りを同じ手順で精製して5’OH-poly C [重量平均塩基長 407b] 36 mgを得た。次に5’OH-poly I 約18 mgと5’OH-poly C 約18 mgを生理食塩水に溶解し、混合液を70℃まで昇温した後に室温までゆっくりと降温した。その後、エタノール沈殿による精製を行い、5’-末端が非リン酸化された5’OH-poly IC 29 mg [重量平均塩基長 391bp]を得た。

実施例１．5’-末端リン酸化poly ICの作製
　Poly Iおよびpoly Cの5’-末端のモノリン酸化処理は、T4 Phosphonucleotide kinase (PNK)[タカラバイオ社]を用い、標準プロトコールに準じて実施した。反応に際しては、Poly Iの不溶化を避けるために塩化マグネシウム濃度を10 mMから3.3 mMに下げて実施した。すなわち、比較例１で作製した5’OH-poly I [重量平均塩基長 110b、数平均分子量 15764] 15 mgを反応液 [終濃度： 50 mM トリス塩酸バッファー(pH8.0), 3.3 mM 塩化マグネシウム, 5 mM ジチオスレイトール、0.7 mMアデノシン三リン酸]に溶解して 6.75 mLとし、10000 U /ml PNK 0.75 mlを加えて37℃で30分間反応させた。その後、0.1 mlを分析用に分取し、残りをフェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿の順序で精製して5’末端がモノリン酸化された5’P-poly I [重量平均塩基長 116b、数平均分子量 15606] 12 mgを得た。同様に、比較例１で作製した5’OH-poly C [重量平均塩基長 407b、数平均分子量 79073] 15 mg を反応液[終濃度： 50 mM トリス塩酸バッファー(pH8.0), 3.3 mM 塩化マグネシウム, 5 mM ジチオスレイトール、0.2 mMアデノシン三リン酸]に溶解して6.75 mLとし、10000 U /ml PNK 0.75 mlを加えて37℃で30分間反応させた。その後、0.1 mlを分析用に分取し、残りをフェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿の順序で精製し、5’末端がモノリン酸化された5’P-poly C [重量平均塩基長392b、数平均分子量 79647] 12 mgを得た。次に5’P-poly I 約10 mgと5’P-poly C 約10 mgを生理食塩水に溶解し、混合液を70℃まで昇温した後に室温までゆっくりと降温した。その後、エタノール沈殿による精製を行い、5’-末端がモノリン酸化された5’P-poly IC 13 mg[重量平均塩基長 391 bp]を得た。

分析例１．リン酸化率の測定とdsRNA1分子における5’リン酸分子数の算出
　比較例１におけるpoly I-01の5’リン酸化率はPi法で算出した。すなわち、poly I-01を添加したCIAP反応終了液のリン酸モル濃度をマラカイドグリーンリン酸アッセイキットで定量分析し、poly I-01のモル濃度で除してpoly I-01の5’リン酸化率を算出した。同様にpoly C-01を添加したCIAP反応終了液のリン酸モル濃度を定量分析し、poly C-01のモル濃度で除してpoly C-01の5’リン酸化率を算出した。
　比較例１の5’OH-poly Iおよび5’OH-poly Cの5’リン酸化率は、Pi法で算出した。すなわち、比較例１のCIAP反応をpoly I-01 の代わりに5’OH-poly Iを用いて1/20スケールで実施し、反応終了液の遊離リン酸濃度を定量分析し、5’OH-poly Iのモル濃度で除して5’OH-poly I の5’リン酸化率を算出した。同様に比較例１のCIAP反応をpoly C-01 の代わりに5’OH-poly Cを用いて1/20スケールで実施し、反応終了液の遊離リン酸濃度を定量分析し、5’OH-poly Cのモル濃度で除して5’OH-poly C の5’リン酸化率を算出した。
　実施例１の5’P-poly Iおよび5’P-poly Cの5’リン酸付加率は、ADP法とPi法の2通りの方法で算出した。すなわち、実施例１の5’OH-poly Iを基質とするPNK反応終了液のADP濃度をHPLC法で定量分析し、ADPモル濃度から5’P-poly Iの 5’リン酸付加率を算出した。同様に、実施例１の5’ OH-poly Cを基質とするPNK反応終了液のADP濃度をHPLC法で定量分析し、ADPモル濃度から5’P-poly Cの5’リン酸付加率を算出した。
　また、比較例１のCIAP反応をpoly I-01 の代わりに5’P-poly Iを用いて1/20スケールで実施し、反応終了液の遊離リン酸濃度の定量分析を行い、供試した5’P-poly Iのモル濃度で除して5’リン酸化率を算出した。同様に比較例１のCIAP反応をpoly I-01 の代わりに5’P-poly Cを用いて1/20スケールで実施し、5’P-polyCのモル濃度で除して5’リン酸付加率を算出した。
　分析結果を下記表１に示す。

　表１においてPi法で算出した5’リン酸化率とADP法で算出した5’リン酸化率は約10%の偏差でほぼ合致したことから、5’リン酸化率の算出法としてはPi法とADP法のどちらを採用しても構わないと判断できる。
　表１の5’リン酸化率に基づく、dsRNA1分子あたりの5’リン酸分子数（平均）は下記表２の通りである。

作製例１．5’末端ホスホロチオエート化poly Cの作製
　5’末端のホスホロチオエート化は、T4 Phosphonucleotide kinase (PNK)[タカラバイオ社]と添付バッファーを用い、同社の標準プロトコールに準じて実施した。すなわち、poly C-02 28 mgを反応液 [終濃度： 50 mM トリス塩酸バッファー(pH8.0), 10 mM 塩化マグネシウム, 5 mM ジチオスレイトール、0.12 mMアデノシン-5'-O-(3-チオ三リン酸)]に溶解して 6.8 mLとし、10000 U /ml PNK 1.2 mlを加えて37℃で6時間反応させた。反応終了後、0.1 mlを分析用に分取し、残りをフェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿の順に精製し、5’末端がホスホロチオエート化された5’S-poly C 24 mg[重量平均塩基長 395 b、数平均分子量 55465]を得た。

分析例２．ホスホロチオエート化率の測定
　作製例１で分取した反応液18 μlに対して、29 mM Fluorescein Maleimide/DMSO溶液 9μlを加え遮光して室温で2 h静置してホスホロチオエート基をFluorescein Maleimideでラベル化した。ミリQ水 70 μlで希釈した後、5’フェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿による精製を行い、30 mM NaCl水溶液 180 μlで再溶解し、ラベル化5’S-poly C (2.8 mg/ml; 0.051 mM)溶液を取得した。この溶液をFluorescein Maleimideを標準品とする蛍光分析（励起波長 485 nm、蛍光波長 535 nm）に供しラベル体を定量分析したところ、ラベル体濃度は0.050 mMであった。5’S-poly Cのホスホロチオエート化率は、98%と算出された。

実施例２．5’末端ホスホロチオエート化poly ICの作製
　作製例１で作製した5’S-poly C 約10 mgとpoly I [重量平均塩基長 98 b] 約10 mgを生理食塩水に溶解し、混合液を70℃まで昇温した後に室温までゆっくりと降温した。その後、エタノール沈殿による精製を行い、5’末端がホスホロチオエート化された5’S-poly IC-1 18 mg [重量平均塩基長 393 bp]を得た。

試験例１．自然免疫誘導効果の評価
　実施例１，２および比較例１で示した各種dsRNAの自然免疫誘導効果は、IFNβ産生細胞株として知られるヒト胎児肺組織由来の線維芽細胞株MRC-5を用いて評価した。すなわち、ウシ血清10%含有MEM培地で継代培養したMRC-5を12ウェルプレートに1 ml/well播種し、37℃、5% CO₂環境下で約20時間静置培養した。ウシ血清を含まないMEM培地１ ml/wellに交換後、各種dsRNAを0.1μg/wellまたは0.03 μg/wellをトランスフェクション試薬LyoVec（InvivoGen, USA）と共に培養液に添加し、37℃、5% CO₂環境下で静置培養した。培養2時間後にウシ血清を0.1 ml/well添加し培養を継続した。ネガティブコントロールはdsRNAの代わりにPBSを使用した。培養20h後に培養上清を採取し、上清に含まれるIFNβの濃度を、ヒトインターフェロンβ ELISAキット（株式会社鎌倉テクノサイエンス）を用いて定量分析した。結果を表３に示す。

　表３に示すとおり、第2の鎖の5’末端をホスホロチオエート化したdsRNA、ならびに第1の鎖の5’末端および第2の鎖の5’末端をリン酸化したdsRNAは、5’末端をホスホロチオエート化またはリン酸化していないdsRNAと比較して、アジュバントとして用いられたときに自然免疫を誘導するIFNβ誘導量が増加したことから、より高い自然免疫誘導効果を奏することが分かった。
　また、自然免疫誘導を増大させる効果は、より少ない添加量でIFNβが誘導された、第2の鎖の5’末端をホスホロチオエート化したdsRNAの方が高いことが分かった。

試験例２．RLR結合性の比較
　実施例１，２および比較例１で示した各種dsRNAのRLR結合性をレポーター細胞アッセイで比較した。RLRレポーター細胞C57/WT MEF（InvivoGen, USA）は、NF-κBおよびIRF3/7で誘導される分泌性胎盤アルカリホスファターゼ(SEAP)レポーター遺伝子が導入されたマウス初代胎児線維芽細胞株で、試料のRLR結合性をSEAPの誘導量で相対比較できる。C57/WT MEFを用いたレポーターアッセイは、メーカーのプロトコルに準じておこなった。すなわち、ウシ血清10%含有DMEM培地で継代培養したC57/WT MEFの細胞懸濁液を12ウェルプレートに1 ml/well播種し、37℃、5% CO₂環境下で約20時間静置培養した。ウシ血清を含まないDMEM培地 1 ml/wellに交換後、各種dsRNA 100 ngまたは生理食塩水をトランスフェクション試薬LyoVec（InvivoGen, USA）と共に添加し、37℃、5% CO₂環境下で静置培養した。2時間後にウシ血清を0.1 ml/well加え、さらに14時間培養し、培養上清を採取して分泌されたSEAPを定量分析した。SEAPの定量分析にはQuantiBlueキット（InvivoGen, USA）を用い、E.coliアルカリホスファターゼ（タカラバイオ、日本）を標準品として数値化した。結果を表４に示す。

　表４に示すとおり、第2の鎖の5'末端をホスホロチオエート化したdsRNA、ならびに第1の鎖の5'末端および第2の鎖の5'末端をリン酸化したdsRNAは、5'末端をホスホロチオエート化またはリン酸化していないdsRNAと比較して、病原体認識分子であるRLRに対して、より高い結合能を有することが分かった。
　したがって、試験例１で見られた、第2の鎖の5'末端をホスホロチオエート化したdsRNA、ならびに、第1の鎖の5'末端および第2の鎖の5'末端をリン酸化したdsRNAの、5'末端をホスホロチオエート化またはリン酸化していないdsRNAに対するより高い自然免疫誘導効果は、病原体認識分子であるRLRへの結合能を評価する方法によっても示された。

実施例３．5’末端リン酸化poly ICの作製
　4分子のpoly Iと1分子のpoly Cから構成されるpIC41 [重量平均塩基長 397 bp、5’リン酸分子数 <1] 9 mgをPNK反応バッファー[終濃度： 50 mM トリス塩酸バッファー(pH8.0), 10 mM 塩化マグネシウム, 5 mM ジチオスレイトール、0.25 mM アデノシン三リン酸]に溶解して 4.05 mlとし、10000 U /ml PNK 0.45 mlを加えて37℃で30分間反応させた。その後、0.02 mlを分析用に分取し、残りをフェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿の順に精製し5’末端がリン酸化された5’P-pIC41 6.3 mg[重量平均塩基長 408 bp、数平均分子量 226487]を得た。
　5'P-pIC41 1分子あたりの5'リン酸分子数は、ADP法で求めた。すなわち、分取した分析用サンプルのADP濃度をHPLC法で定量分析し、ADPモル濃度を5'P-pIC41のモル濃度で除して算出した。5'P-pIC41 1分子あたりの5'リン酸分子数は、4.7であった。

実施例４．5’末端ホスホロチオエート化poly ICの作製
　実施例３で使用したpIC41 [重量平均塩基長 397 bp、5’リン酸分子数<1] 15 mgをPNK反応バッファー[終濃度： 50 mM トリス塩酸バッファー(pH8.0), 10 mM 塩化マグネシウム, 5 mM ジチオスレイトール、0.12 mM アデノシン-5'-O-(3-チオ三リン酸)]に溶解して6.4 mlとし、10000 U /ml PNK 1.1 mlを加えて37℃で6時間反応させた。その後、0.02 mlを分析用に分取し、残りをフェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿の順に精製し5’末端がホスホロチオエート化された5’S-pIC41 12.5 mg[重量平均塩基長 398 bp、数平均分子量 210501]を得た。
　5'S-pIC41 1分子あたりの5'ホスホロチオエート分子数は、分析例２と同様にFluorescein Maleimideラベル化法でラベル体を定量分析し、ラベル体モル濃度を5'S-pIC41のモル濃度で除して算出した。5'S-pIC41 1分子あたりの5'ホスホロチオエート分子数は、2.8であった。

実施例５．5’末端リン酸化poly ICの作製
　10分子のpoly Iと1分子のpoly Cから構成されるpIC101 [重量平均塩基長 354 bp、5’リン酸分子数 1.0未満] 9 mgをPNK反応バッファー[終濃度： 50 mM トリス塩酸バッファー(pH8.0), 10 mM 塩化マグネシウム, 5 mM ジチオスレイトール、1.5 mM アデノシン三リン酸]に溶解して4.05 mlとし、10000 U /ml PNK 0.45 mlを加えて37℃で30分間反応させた。その後、0.02 mlを分析用に分取し、残りをフェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿の順に精製し5’末端がリン酸化された5’P-pIC101 6.3 mg[重量平均塩基長 371 bp、数平均分子量 194599]を得た。
　5'P-pIC101 1分子あたりの5'リン酸分子数は、ADP法で求めた。すなわち、分取した分析用サンプルのADP濃度をHPLC法で定量分析し、ADPモル濃度を5'P-pIC101のモル濃度で除して算出した。5'P-pIC101 1分子あたりの5'リン酸分子数は、7.9であった。

実施例６．5’末端ホスホロチオエート化poly ICの作製
　実施例5で使用したpIC101 [重量平均塩基長 354 bp、5’リン酸分子数 1.0未満] 15 mgをPNK反応バッファー[終濃度： 50 mM トリス塩酸バッファー(pH8.0), 10 mM 塩化マグネシウム, 5 mM ジチオスレイトール、0.12 mM アデノシン-5'-O-(3-チオ三リン酸)]に溶解して6.4 mlとし、10000 U /ml PNK 1.1 mlを加えて37℃で6時間反応させた。その後、0.02 mlを分析用に分取し、残りをフェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿の順に精製し5’末端がホスホロチオエート化された5’S-pIC101 12.5 mg[重量平均塩基長 364 bp、数平均分子量 180333]を得た。
　5'S-pIC101 1分子あたりの5'ホスホロチオエート分子数は、分析例２と同様にFluorescein Maleimideラベル化法でラベル体を定量分析し、ラベル体モル濃度を5'S-pIC101のモル濃度で除して算出した。5'S-pIC101 1分子あたりの5'ホスホロチオエート分子数は、4.5であった。

実施例７．5’末端リン酸化poly IC12Uの作製
　シチジル酸とウリジル酸が12対1の割合で配合されたssRNA[polyC12U] 1分子と4分子のpoly Iから構成されるpIC12U41 [重量平均塩基長 338 bp、5’リン酸分子数 1.0未満] 9 mgをPNK反応バッファー[終濃度： 50 mM トリス塩酸バッファー(pH8.0), 10 mM 塩化マグネシウム, 5 mM ジチオスレイトール、0.25 mM アデノシン三リン酸]に溶解して4.05 mlとし、10000 U /ml PNK 0.45 mlを加えて37℃で30分間反応させた。その後、0.02 mlを分析用に分取し、残りをフェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿の順に精製し5’末端がリン酸化された5’P-pIC12U41 6.6 mg[重量平均塩基長 333 bp、数平均分子量157699]を得た。
　5'P-pIC12U41 1分子あたりの5'リン酸分子数は、ADP法で求めた。すなわち、分取した分析用サンプルのADP濃度をHPLC法で定量分析し、ADPモル濃度を5'P-pIC12U41のモル濃度で除して算出した。5'P-pIC12U41 1分子あたりの5'リン酸分子数は、3.9であった。

実施例８．5’末端ホスホロチオエート化poly IC12Uの作製
　実施例７で使用したpIC12U41 [重量平均塩基長 338 bp、5’リン酸分子数 1.0未満] 15 mgをPNK反応バッファー[終濃度： 50 mM トリス塩酸バッファー(pH8.0), 10 mM 塩化マグネシウム, 5 mM ジチオスレイトール、0.12 mM アデノシン-5'-O-(3-チオ三リン酸)]に溶解して6.4 mlとし、10000 U /ml PNK 1.1 mlを加えて37℃で6時間反応させた。その後、0.02 mlを分析用に分取し、残りをフェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿の順に精製し5’末端がホスホロチオエート化された5’S-pIC12U41 11.7 mg[重量平均塩基長 314 bp、数平均分子量 133953]を得た。
　5'S-pIC12U41 1分子あたりの5'ホスホロチオエート分子数は、分析例２と同様にFluorescein Maleimideラベル化法でラベル体を定量分析し、ラベル体モル濃度を5'S-pIC12U41のモル濃度で除して算出した。5'S-pIC12U41 1分子あたりの5'ホスホロチオエート分子数は、2.1であった。

試験例３．自然免疫誘導効果の評価
　実施例３－６、８で示した各種dsRNAの自然免疫誘導効果を、IFNβ産生細胞株として知られるヒト胎児肺組織由来の線維芽細胞株MRC-5を用いて評価した。すなわち、ウシ血清10%含有MEM培地で継代培養したMRC-5を12ウェルプレートに1 ml/well播種し、37℃、5% CO₂環境下で約20時間静置培養した。ウシ血清を含まないMEM培地１ ml/wellに交換後、各種dsRNAを1 μg/wellをトランスフェクション試薬LyoVec（InvivoGen, USA）と共に培養液に添加し、37℃、5% CO₂環境下で静置培養した。培養2時間後にウシ血清を0.1 ml/well添加し培養を継続した。ネガティブコントロールはdsRNAの代わりにPBSを使用した。培養16h後に培養上清を採取し、上清に含まれるIFNβの濃度を、ヒトインターフェロンβ ELISAキット（株式会社鎌倉テクノサイエンス）を用いて定量分析した。結果を表５に示す。

　表５より、第2の鎖の5’末端をホスホロチオエート化したdsRNA、ならびに第1の鎖の5’末端および第2の鎖の5’末端をリン酸化したdsRNAの、5’末端をホスホロチオエート化またはリン酸化していないdsRNAに対するより高い自然免疫誘導効果は、ホスホロチオエートまたはリン酸の数、ならびにdsRNAの塩基長には影響されないことがわかった。

　本出願は日本で出願された特願２０１５－１７６１２０（出願日：２０１５年９月７日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

　重量平均鎖長が0.1 キロ塩基対（kbp）から2.0 kbpの範囲内にある、アジュバント用の二重鎖リボ核酸（dsRNA）またはその塩であって、
　該dsRNAの第１の鎖は２以上の一本鎖リボ核酸（ssRNA）からなり、該第１の鎖を構成する２以上のssRNAの全ては、同種のリボヌクレオチドからなるホモポリマーであること、
　該dsRNAの第２の鎖は１つのssRNAからなり、該第１の鎖を構成する２以上のssRNAの各々と二重鎖を形成できる程度に、該第1の鎖のssRNAと相補する塩基配列を有すること、
　該第１の鎖を構成する２以上のssRNAの重量平均鎖長は該第２の鎖を構成する１つのssRNAの重量平均鎖長の1/2以下であること、および
　該第１の鎖を構成する２以上のssRNAおよび該第２の鎖を構成する１つのssRNAの５’末端のホスホロチオエート数の該dsRNA 1分子あたりの平均が１以上であること
を特徴とする、dsRNAまたはその塩。
　重量平均鎖長が0.1 キロ塩基対（kbp）から2.0 kbpの範囲内にある、アジュバント用の二重鎖リボ核酸（dsRNA）またはその塩であって、
　該dsRNAの第１の鎖は2以上の一本鎖リボ核酸（ssRNA）からなり、該第１の鎖を構成する2以上のssRNAの全ては、同種のリボヌクレオチドからなるホモポリマーであること、
　該dsRNAの第２の鎖は１つのssRNAからなり、該第１の鎖を構成する2以上のssRNAの各々と二重鎖を形成できる程度に、該第１の鎖のssRNAと相補する塩基配列を有すること、
　該第１の鎖を構成する2以上のssRNAの重量平均鎖長は該第２の鎖を構成する１つのssRNAの重量平均鎖長の1/2以下であること、および
　該第１の鎖を構成する2以上のssRNAおよび該第２の鎖を構成する1つのssRNAの５’末端のリン酸数の該dsRNA 1分子あたりの平均が１以上であること
を特徴とする、dsRNAまたはその塩。
　請求項１または２に記載のdsRNAまたはその塩を含有してなる免疫刺激物質、アジュバント、または医薬品。
　重量平均鎖長が0.1 キロ塩基対（kbp）から2.0 kbpの範囲内にある、アジュバント用の二重鎖リボ核酸（dsRNA）またはその塩の製造方法であって、該方法は、
（１）同種のリボヌクレオチドからなるssRNAを調製する工程、
（２）前記（１）のssRNAに対して二重鎖を形成できる程度の相補性を有する塩基配列を有するssRNAを調製する工程、
（３）前記（１）のssRNAと前記（２）のssRNAとをアニーリングさせることにより、dsRNAを生成させる工程、および
（４）工程（３）の前に前記（１）で調製されるssRNAおよび前記（２）で調製されるssRNAのうちの少なくとも一方の５’末端をホスホロチオエート化するか、または、工程（３）の後に該dsRNAの５’末端をホスホロチオエート化する工程、あるいは、工程（３）の前に前記（１）で調製されるssRNAおよび前記（２）で調製されるssRNAの５’末端をリン酸化するか、または、工程（３）の後に該dsRNAの５’末端をリン酸化する工程
を含み、前記（１）のssRNAの重量平均鎖長が、前記（２）のssRNAの重量平均鎖長の1/2以下であってかつ0.02～1.0 キロ塩基（kb）である、方法。
　前記工程（４）において５’末端にホスホロチオエート基またはリン酸基を導入されるssRNAまたは鎖が、シチジル酸を80%以上の割合で含む、請求項４に記載の方法。