KR20240052763A - 스타스민 2 (stmn2)를 표적화하는 rna 가이드를 포함하는 유전자 편집 시스템 및 이의 용도 - Google Patents

스타스민 2 (stmn2)를 표적화하는 rna 가이드를 포함하는 유전자 편집 시스템 및 이의 용도 Download PDF

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티아 마리 디토마소
앤서니 제임스 개리티
노아 마이클 자키모
퀸튼 노먼 웨셀스
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아버 바이오테크놀로지스, 인크.
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Abstract

스타스민 2 (STMN2) 유전자의 유전적 편집을 위한 시스템으로서, 이는 (i) Cas12i2 폴리펩티드 또는 Cas12i2 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산, 및 (ii) RNA 가이드 또는 RNA 가이드를 인코딩하는 제2 핵산을 포함하며, 여기서 RNA 가이드는 STMN2 유전자 내에서 표적 서열에 특이적인 스페이서 서열을 포함한다. 또한 본원에 개시된 유전자 편집 시스템을 사용하여 STMN2 유전자를 편집하는 방법 및/또는 STMN2 유전자와 연관된 질환을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.

Description

스타스민 2 (STMN2)를 표적화하는 RNA 가이드를 포함하는 유전자 편집 시스템 및 이의 용도
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2021년 8월 11일 출원된 미국 가출원 번호 63/231,784, 및 2022년 3월 21일 출원된 미국 가출원 번호 63/322,002의 35 U.S.C. § 119(e) 하에서 이익을 주장하고, 이들의 각각의 내용은 그들 전체가 본원에 참조로 편입된다.
배경
집합적으로 CRISPR-Cas 또는 CRISPR/Cas 시스템으로서 알려진, 클러스터링된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복 (CRISPR) 및 CRISPR-연관된 (Cas) 유전자는 외래 유전적 요소에 대해 특정한 종을 방어하는 고세균 및 박테리아에서의 적응 면역 시스템이다.
본 개시내용 요약
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 스타스민 2 (STMN2) 유전자의 유전적 편집을 위한 시스템의 개발에 기초한다. 시스템은 Cas12i 폴리펩티드 예컨대 Cas12i2 폴리펩티드 및 CRISPR 뉴클레아제 폴리펩티드에 의해 STMN2 유전자 내에서 유전적 부위에 절단을 매개하는 RNA 가이드를 포함한다. 본원에 보고된 대로, 본원에 개시된 유전자 편집 시스템은 높은 편집 효율 및 정확도로 STMN2 유전자의 성공적 편집을 달성하였다.
이론에 의한 제한됨 없이, 본원에 개시된 유전자 편집 시스템은 하기 유리한 특성 중 하나 이상을 나타낼 수 있다. SpCas9 및 Cas12a와 비교하여, 그들의 짧은 성숙한 crRNA (40-43 nt)와 공동으로, 전달 및 합성의 비용의 측면에서 바람직한 Cas12i 이펙터는 더 짧다 (1033 내지 1093aa). Cas12i 절단은 Cas9 절단에 의해 유도된 작은 결실 및 +1 삽입과 비교하여 더 큰 결실을 초래한다. Cas12i PAM 서열은 또한 Cas9의 것들과 상이하다. 그러므로, 관심의 유전적 부위의 더 크고 상이한 부문들은 Cas9와 비교하여 Cas12i 폴리펩티드 및 RNA 가이드로 파괴될 수 있다. 태그화-기반 태그 통합 부위 시퀀싱 (TTISS)의 편견 없는 접근법을 사용하여, 고유한 통합 이벤트의 수가 더 높은 더욱 잠재적 오프-표적 부위는 Cas12i2와 비교하여 SpCas9에 대하여 식별되었다. WO/2021/202800 참조. 그러므로, Cas12i 예컨대 Cas12i2는 Cas9보더 더욱 특이적일 수 있다.
따라서, STMN2 유전자를 편집하기 위한 유전자 편집 시스템, 이를 포함하는 약학적 조성물 또는 키트, 유전적으로 변형된 세포를 생산하기 위한 유전자 편집 시스템을 사용하는 방법, 및 그렇게 생산된 결과로 생긴 세포가 본원에 제공된다. 본원에 개시된 유전자 편집 시스템의 용도, 이를 포함하는 약학적 조성물 및 키트, 및/또는 대상체에서 신경퇴행성 질환 (예를 들면, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTD))을 치료하기 위하여 그렇게 생산된 유전적으로 변형된 세포가 본원에 또한 제공된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 (i) Cas12i 폴리펩티드 또는 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산, 및 (ii) RNA 가이드 또는 RNA 가이드를 인코딩하는 제2 핵산을 포함하는, 스타스민 2 (STMN2) 유전자의 유전적 편집을 위한 시스템을 특성화한다. RNA 가이드는 STMN2 유전자 내에서 표적 서열에 특이적인 스페이서 서열을 포함하며, 표적 서열은 표적 서열에 5' 위치하는, 5'-TTN-3'의 모티프를 포함하는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 인접한다.
일부 구현예에서, Cas12i는 Cas12i2 폴리펩티드이다. 다른 구현예에서, Cas12i는 Cas12i4 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, Cas12i 폴리펩티드는 서열번호: 448과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 Cas12i2 폴리펩티드이다. 일부 경우에서, Cas12i2 폴리펩티드는 서열번호: 448에 비해 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 예에서, Cas12i2 폴리펩티드에서의 하나 이상의 돌연변이는 서열번호: 448의 위치 D581, G624, F626, P868, I926, V1030, E1035, 및/또는 S1046에 있다. 일부 예에서, 하나 이상의 돌연변이는, 임의로 D581R, G624R, F626R, P868T, I926R, V1030G, E1035R, S1046G, 또는 이들의 조합인, 아미노산 치환이다.
일 예에서, Cas12i2 폴리펩티드는 위치 D581, D911, I926, 및 V1030에서의 돌연변이 (예를 들면, D581R, D911R, I926R, 및 V1030G의 아미노산 치환)를 포함한다. 또 다른 예에서, Cas12i2 폴리펩티드는 위치 D581, I926, 및 V1030에서의 돌연변이 (예를 들면, D581R, I926R, 및 V1030G의 아미노산 치환)를 포함한다. 더욱 또 다른 예에서, Cas12i2 폴리펩티드는 위치 D581, I926, V1030, 및 S1046에서의 돌연변이 (예를 들면, D581R, I926R, V1030G, 및 S1046G의 아미노산 치환)를 포함한다. 더 또 다른 예에서, Cas12i2 폴리펩티드는 위치 D581, G624, F626, I926, V1030, E1035, 및 S1046에서의 돌연변이 (예를 들면, D581R, G624R, F626R, I926R, V1030G, E1035R, 및 S1046G의 아미노산 치환)를 포함한다. 또 다른 예에서, Cas12i2 폴리펩티드는 위치 D581, G624, F626, P868, I926, V1030, E1035, 및 S1046에서의 돌연변이 (예를 들면, D581R, G624R, F626R, P868T, I926R, V1030G, E1035R, 및 S1046G의 아미노산 치환)를 포함한다.
본원에 개시된 유전자 편집 시스템 중 임의의 것에서 사용을 위한 예시적 Cas12i2 폴리펩티드는 서열번호: 449-453 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일 예에서, 본원에 개시된 유전자 편집 시스템 중 임의의 것에서 사용을 위한 예시적 Cas12i2 폴리펩티드는 서열번호: 450의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 본원에 개시된 유전자 편집 시스템 중 임의의 것에서 사용을 위한 예시적 Cas12i2 폴리펩티드는 서열번호: 453의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 Cas12i 폴리펩티드 (예를 들면, Cas12i2 폴리펩티드)를 인코딩하는 제1 핵산을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 제1 핵산은 제1 벡터 (예를 들면, 바이러스성 벡터 예컨대 아데노-연관된 바이러스성 벡터 또는 AAV 벡터)에 위치한다. 일부 경우에서, 제1 핵산은 메신저 RNA (mRNA)이다. 일부 경우에서, Cas12i 폴리펩티드를 위한 코딩 서열은 코돈 최적화된다.
일부 구현예에서, 표적 서열은 STMN2 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 또는 인트론 내에 있을 수 있다.
일부 구현예에서, RNA 가이드는 서열번호: 4508, 4512, 4559, 및 4561 중 어느 하나의 서열을 포함하거나, 제2 핵산은 서열번호: 4508, 4512, 4559, 및 4561 중 어느 하나를 포함하는 RNA 가이드를 인코딩한다.
일부 구현예에서, RNA 가이드는 서열번호: 4505, 4506, 4507, 4508, 4509, 4510, 4511, 4512, 4513, 4514, 4515, 4554, 4555, 4556, 4557, 4558, 4559, 4560, 4561, 및 4562 중 어느 하나의 서열을 포함하거나, 제2 핵산은 서열번호: 4505, 4506, 4507, 4508, 4509, 4510, 4511, 4512, 4513, 4514, 4515, 4554, 4555, 4556, 4557, 4558, 4559, 4560, 4561, 및 4562 중 어느 하나를 포함하는 RNA 가이드를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 스페이서 서열은 길이가 20-30-뉴클레오티드일 수 있다. 일부 예에서, 스페이서 서열은 길이가 20-뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, RNA 가이드는 스페이서 및 직접 반복 서열을 포함한다. 일부 예에서, 직접 반복 서열은 길이가 23-36-뉴클레오티드이다. 일 예에서, 직접 반복 서열은 서열번호: 1-10 중 어느 하나 또는 길이가 적어도 23-뉴클레오티드인 이의 단편과 적어도 90% 동일하다. 일부 특정 예에서, 직접 반복 서열은 서열번호: 1-10 중 어느 하나, 또는 길이가 적어도 23-뉴클레오티드인 이의 단편이다. 비-제한 예로써, 직접 반복 서열은 5'-AGAAAUCCGUCUUUCAUUGACGG-3' (서열번호: 10)이다.
일부 구현예에서, 시스템은 RNA 가이드를 인코딩하는 제2 핵산을 포함할 수 있다. 일부 예에서, RNA 가이드를 인코딩하는 핵산은 바이러스성 벡터에 위치할 수 있다. 일부 예에서, 바이러스성 벡터는 Cas12i 폴리펩티드 (예를 들면, Cas12i2 폴리펩티드)를 인코딩하는 제1 핵산 및 RNA 가이드를 인코딩하는 제2 핵산 둘 모두를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 시스템 중 임의의 것은 제1 벡터에 위치하는, Cas12i 폴리펩티드 (예를 들면, Cas12i2 폴리펩티드)를 인코딩하는 제1 핵산, 및 제2 벡터에 위치하는, RNA 가이드를 인코딩하는 제2 핵산을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 제1 및/또는 제2 벡터는 바이러스성 벡터이다. 일부 특정 예에서, 제1 및 제2 벡터는 동일한 벡터이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 시스템 중 임의의 것은, Cas12i 폴리펩티드 (예를 들면, Cas12i2 폴리펩티드) 또는 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산, RNA 가이드 또는 RNA 가이드를 인코딩하는 제2 핵산, 또는 둘 모두를 포괄하는, 하나 이상의 지질 나노입자 (LNP)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 시스템은, Cas12i 폴리펩티드 (예를 들면, Cas12i2 폴리펩티드) 또는 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산, 및 RNA 가이드를 인코딩하는 제2 핵산을 포함하는 바이러스성 벡터를 포괄하는, LNP를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 바이러스성 벡터는 AAV 벡터이다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 시스템은 RNA 가이드 또는 RNA 가이드를 인코딩하는 제2 핵산, 및 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산을 포함하는 바이러스성 벡터를 포괄하는, LNP를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 바이러스성 벡터는 AAV 벡터이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 또한 본원에 개시된 유전자 편집 시스템 중 임의의 것을 포함하는 약학적 조성물, 및 유전자 편집 시스템의 구성요소를 포함하는 키트를 제공한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 또한 세포에서 스타스민 2 (STMN2) 유전자를 편집하는 방법으로서, 숙주 세포에서 STMN2 유전자를 유전적으로 편집하기 위해 본원에 개시된 시스템 중 임의의 것과 숙주 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 방법을 특성화한다. 일부 예에서, 숙주 세포는 시험관내 배양된다. 다른 예에서, 접촉시키는 단계는 숙주 세포를 포함하는 대상체에게 STMN2 유전자를 편집하기 위한 시스템을 투여함으로써 수행된다.
숙주 세포에서 STMN2 유전자를 유전적으로 편집하기 위해 본원에 개시된 시스템과 숙주 세포를 접촉시킴으로써 생산될 수 있는, 파괴된 스타스민 2 (STMN2) 유전자를 포함하는 세포가 또한 본 개시내용의 범위 내에 있다.
더 다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 신경퇴행성 질환 (예를 들면, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTD))을 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 본원에 개시된 세포 중 임의의 것 또는 스타스민 2 (STMN2) 유전자를 편집하기 위한 시스템 중 임의의 것을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
(i) 표적 서열에 5' 위치하는, 표적 서열이 5'-TTN-3'의 모티프를 포함하는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 인접한, 스타스민 2 (STMN2) 유전자에서 표적 서열에 특이적인 본원에 개시된 대로 스페이서 서열; 및 (ii) 직접 반복 서열을 포함하는 RNA 가이드가 본원에 또한 제공된다.
일부 구현예에서, 스페이서는 길이가 20-30-뉴클레오티드일 수 있다. 일부 예에서, 스페이서는 길이가 20-뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 길이가 23-36-뉴클레오티드일 수 있다. 일부 예에서, 직접 반복 서열은 길이가 23-뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 표적 서열은 STMN2 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 또는 인트론 내에 있다.
일부 구현예에서, RNA 가이드는 서열번호: 4508, 4512, 4559, 및 4561 중 어느 하나의 서열을 포함하거나, 제2 핵산은 서열번호: 4508, 4512, 4559, 및 4561 중 어느 하나를 포함하는 RNA 가이드를 인코딩한다.
일부 구현예에서, RNA 가이드는 서열번호: 4505, 4506, 4507, 4508, 4509, 4510, 4511, 4512, 4513, 4514, 4515, 4554, 4555, 4556, 4557, 4558, 4559, 4560, 4561, 및 4562 중 어느 하나의 서열을 포함하거나, 제2 핵산은 서열번호: 4505, 4506, 4507, 4508, 4509, 4510, 4511, 4512, 4513, 4514, 4515, 4554, 4555, 4556, 4557, 4558, 4559, 4560, 4561, 및 4562 중 어느 하나를 포함하는 RNA 가이드를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 서열번호: 1-10 중 어느 하나 또는 길이가 적어도 23-뉴클레오티드인 이의 단편과 적어도 90% 동일할 수 있다. 일부 예에서, 직접 반복 서열은 서열번호: 1-10 중 어느 하나, 또는 길이가 적어도 23-뉴클레오티드인 이의 단편이다. 비-제한 예로써, 직접 반복 서열은 5'-AGAAAUCCGUCUUUCAUUGACGG-3' (서열번호: 10)이다.
본원에 개시된 유전자 편집 시스템 중 임의의 것, 이를 포함하는 약학적 조성물 또는 키트, 또는 대상체에서 신경퇴행성 질환 (예를 들면, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTD)) 치료하기에 사용을 위한 유전자 편집 시스템에 의해 생성된 유전적으로 변형된 세포, 뿐만 아니라 본원에 개시된 유전자 편집 시스템, 이를 포함하는 약학적 조성물 또는 키트, 또는 대상체에서 신경퇴행성 질환 (예를 들면, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTD))의 치료를 위하여 약제를 제조하기 위한 유전자 편집 시스템에 의해 생성된 유전적으로 변형된 세포의 용도가 본원에 또한 제공된다.
본 발명의 하나 이상의 구현예의 상세는 아래 설명에 제시된다. 본 발명의 다른 특성 또는 이점은 하기 도면 및 몇몇 구현예의 상세한 설명으로부터, 그리고 또한 첨부된 청구항으로부터 명백할 것이다.
하기 도면은 본 명세서의 부분을 형성하고 본 개시내용의 특정 양태를 추가로 증명하기 위해 포함되고, 이는 본원에 제시된 특정 구현예의 상세한 설명과 조합으로 도면을 참조하여 더욱 양호하게 이해될 수 있다.
도 1은 실시예 1에 기재된 대로, 표시된 가이드에 의한 STMN2 인트론 표적 서열의 편집 백분율을 도시한다.
도 2a는 가이드 4, 8, 55, 및 57에 의해 STMN2 인트론 1에서 비밀 스플라이스 부위의 >15%의 파괴를 도시한다.
도 2b는 가이드 12, 46, 47, 48, 및 49에 의해 STMN2 인트론 1에서 3 TDP-43 결합 모티프 중 적어도 하나의 >15%의 파괴를 도시한다.
도 2c는 가이드 17 및 18에 의해 STMN2 인트론 1에서 조기 폴리아데닐화 신호의 >15%의 파괴를 도시한다.
도 3은 표시된 RNA 가이드들의 각각이 비밀 스플라이스 부위, TDP-43 결합 모티프, 및 조기 폴리아데닐화 신호의 위치에 비해 STMN2의 인트론 1을 결합시키는 위치를 도시하는 개략도이다.
도 4는 SH-SY5Y 세포에서 테스트된 RNA 가이드의 인델 활성을 도시한다.
도 5a는 실시예 1 및 실시예 2, 각각으로부터 HEK293T 세포 및 SH-SY5Y 세포에서 증명된 인델 활성 (% 인델)을 비교하는 플롯이다. 도 5b는 실시예 1 및 실시예 2, 각각으로부터 HEK293T 세포 및 SH-SY5Y 세포에서 증명된 스플라이스 부위 모티프 파괴를 비교하는 플롯이다.
본 개시내용은 (i) Cas12i 폴리펩티드 또는 Cas12i2 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산; 및 (ii) RNA 가이드 또는 RNA 가이드를 인코딩하는 제2 핵산을 포함하는, 스타스민 2 (STMN2) 유전자의 유전적 편집을 위한 시스템에 관한 것으로, 여기서 RNA 가이드는 STMN2 유전자 내에서 표적 서열에 특이적인 스페이서 서열을 포함하고, 표적 서열은 표적 서열에 5' 위치하는, 5'-TTN-3'의 모티프를 포함하는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 인접한다. 이러한 시스템을 포함하는 약학적 조성물 또는 키트 뿐만 아니라 이의 용도가 본 개시내용에 또한 제공된다. 세포에서 STMN2 유전자를 편집하는 방법, 파괴된 STMN2 유전자를 포함하는 그렇게 생산된 세포, 대상체에서 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법, 및 (i) 표적 서열에 5' 위치하는, 표적 서열이 5'-TTN-3'의 모티프를 포함하는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 인접한, STMN2 유전자에서 표적 서열에 특이적인 스페이서 서열; 및 (ii) 직접 반복 서열을 포함하는 RNA 가이드, 뿐만 아니라 이들의 용도가 본원에 추가로 개시된다.
본원에 개시된 유전자 편집 시스템에서 사용을 위한 Cas12i 폴리펩티드는 Cas12i2 폴리펩티드, 예를 들면, 본원에 개시된 것들과 같은 야생형 Cas12i 폴리펩티드 또는 이의 변이체일 수 있다. 일부 예에서, Cas12i2 폴리펩티드는 서열번호: 448과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 서열번호: 448에 비해 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 다른 예에서, Cas12i 폴리펩티드는 본원에 또한 개시되는 Cas12i4 폴리펩티드일 수 있다.
정의
본 개시내용은 특정한 구현예에 관하여 그리고 특정 도면을 참조로 기재될 것이지만, 본 개시내용은 거기에 제한되지 않고 청구항에 의해서만 제한된다. 이후에 제시된 바와 같은 용어는 일반적으로 달리 지시되지 않는 한 그들의 상식으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "활성"은 생물학적 활성을 지칭한다. 일부 구현예에서, 활성은 효소적 활성, 예를 들면, Cas12i 폴리펩티드의 촉매적 능력을 포함한다. 예를 들어, 활성은 뉴클레아제 활성을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 경우에 용어 "STMN2"는 "스타스민-2"를 지칭한다. STMN2는 단백질의 스타스민 계열의 뉴런-특이적 구성원이고 미세소관 안정성 및 신호 전달의 조절에서 역할을 한다. 본원에 제시된 대로 서열번호: 454는 STMN2 유전자 서열의 예를 제공한다. 이 서열에 대하여 유전자 ID: 11075를 또한 참조한다 (www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/11075).
본원에 사용된 경우에, 용어 "Cas12i 폴리펩티드" (또한 본원에 Cas12i로서 지칭됨)는 RNA 가이드에 의해 특정된 표적 핵산 상의 표적 서열에 결합하는 폴리펩티드를 지칭하고, 여기서 폴리펩티드는 야생형 Cas12i 폴리펩티드와 적어도 일부 아미노산 서열 상동성을 갖는다. 일부 구현예에서, Cas12i 폴리펩티드는 본원에 참조된 주제 및 목적을 위하여 참조로 편입되는, 미국 특허 번호 10,808,245의 서열번호: 1-5 및 11-18 중 어느 하나와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12i 폴리펩티드는 본 출원의 서열번호: 4503, 448, 4504, 및 482 중 어느 하나와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 Cas12i 폴리펩티드는 WO/2021/202800에 기재된 대로 Cas12i2 폴리펩티드이고, 이의 관련한 개시내용은 본원에 참조된 주제 및 목적을 위하여 참조로 편입된다. 일부 구현예에서, Cas12i 폴리펩티드는 표적 핵산을 (예를 들면, 닉 또는 이중 가닥 파손으로서) 절단한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "에 인접한"은 또 다른 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 매우 근접한 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드가 2개 서열을 분리하지 않으면 또 다른 뉴클레오티드 서열에 인접한다 (즉, 바로 인접한다). 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 더 작은 수의 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오티드)가 2개 서열을 분리하면 또 다른 뉴클레오티드 서열에 인접한다. 일부 구현예에서, 제1 서열은 2개 서열이 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 뉴클레오티드만큼 분리되면 제2 서열에 인접한다. 일부 구현예에서, 제1 서열은 2개 서열이 최대 2 뉴클레오티드, 최대 5 뉴클레오티드, 최대 8 뉴클레오티드, 최대 10 뉴클레오티드, 최대 12 뉴클레오티드, 또는 최대 15개 뉴클레오티드만큼 분리되면 제2 서열에 인접한다. 일부 구현예에서, 제1 서열은 2개 서열이 2-5 뉴클레오티드, 4-6 뉴클레오티드, 4-8 뉴클레오티드, 4-10 뉴클레오티드, 6-8 뉴클레오티드, 6-10 뉴클레오티드, 6-12 뉴클레오티드, 8-10 뉴클레오티드, 8-12 뉴클레오티드, 10-12 뉴클레오티드, 10-15 뉴클레오티드, 또는 12-15개 뉴클레오티드만큼 분리되면 제2 서열에 인접한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "복합체"는 둘 이상의 분자의 그룹화를 지칭한다. 일부 구현예에서, 복합체는 서로 상호작용하는 (예를 들면, 이에 결합하는, 이와 접촉하는, 이에 부착하는) 폴리펩티드 및 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어, 용어 "복합체"는 RNA 가이드 및 폴리펩티드 (예를 들면, Cas12i 폴리펩티드)의 그룹화를 지칭할 수 있다. 대안적으로, 용어 "복합체"는 RNA 가이드, 폴리펩티드, 및 표적 서열의 상보적 영역의 그룹화를 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 경우에, 용어 "복합체"는 STMN2-표적화 RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드의 그룹화를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "프로토스페이서 인접 모티프" 또는 "PAM"은 표적 서열 (예를 들면, STMN2 표적 서열)에 인접한 DNA 서열을 지칭한다. 이중-가닥 DNA 분자에서, PAM 모티프를 함유하는 가닥은 "PAM-가닥"으로 칭해지고 상보적 가닥은 "비-PAM 가닥"으로 칭해진다. RNA 가이드는 본원에 개시된 표적 서열에 상보적인 비-PAM 가닥에서 한 부위에 결합한다.
일부 구현예에서, PAM 가닥은 코딩 (예를 들면, 센스) 가닥이다. 다른 구현예에서, PAM 가닥은 비-코딩 (예를 들면, 안티센스 가닥)이다. RNA 가이드가 염기-짝짓기를 통해 비-PAM 가닥을 결합시키기 때문에, 비-PAM 가닥은 표적 가닥으로서 또한 알려지는 한편, PAM 가닥은 비-표적 가닥으로서 또한 알려진다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "표적 서열"은 (PAM 가닥 상에서) PAM 모티프에 인접한 DNA 단편을 지칭한다. 표적 서열의 상보적 영역은 비-PAM 가닥 상에 있다. 표적 서열은 PAM 모티프에 바로 인접할 수 있다. 대안적으로, 표적 서열 및 PAM은 작은 서열 세그먼트 (예를 들면, 최대 5개 뉴클레오티드, 예를 들어, 최대 4, 3, 2, 또는 1개 뉴클레오티드)만큼 분리될 수 있다. 표적 서열은 당업계에 알려지는, PAM 모티프를 인식하는 CRISPR 뉴클레아제에 따라, PAM 모티프의 3' 단부에 또는 PAM 모티프의 5' 단부에 위치할 수 있다. 예를 들어, 표적 서열은 Cas12i 폴리펩티드 (예를 들면, Cas12i2 폴리펩티드 예컨대 본원에 개시된 것들)에 대하여 PAM 모티프의 3' 단부에 위치한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은, 비제한적으로, 서열번호: 454에 제시된 서열을 포함하여, STMN2 유전자 서열 내에서의 서열이다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "스페이서" 또는 "스페이서 서열"은 표적 서열 (DNA 서열)의 RNA 등가물인 RNA 가이드에서 한 부문이다. 스페이서는 (PAM 가닥에서) 표적 서열에 상보적인 부위에서 염기-짝짓기를 통해 비-PAM 가닥에 결합할 수 있는 서열을 함유한다. 이러한 스페이서는 표적 서열에 특이적인 것으로서 또한 알려진다. 일부 경우에서, 스페이서는 RNA-DNA 서열 차이를 제외하고, 표적 서열에 적어도 75% (예를 들면, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일할 수 있다. 일부 경우에서, 스페이서는 RNA-DNA 서열 차이를 제외하고 표적 서열에 100% 동일할 수 있다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "RNA 가이드" 또는 "RNA 가이드 서열"은 표적 서열 (예를 들면, STMN2 유전자의 서열)에 본원에 기재된 폴리펩티드 (예를 들면, Cas12i 폴리펩티드)의 표적화를 용이하게 하는 임의의 RNA 분자 또는 변형된 RNA 분자를 지칭한다. 예를 들어, RNA 가이드는 특정 핵산 서열 (표적 서열 예컨대 STMN2 유전자 내에서 표적 서열)에 상보적이도록 설계되는 분자일 수 있다. RNA 가이드는 스페이서 서열 및 직접 반복 (DR) 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, RNA 가이드는, 예를 들어, 표적 서열에 상보적인 서열을 결합시키는, RNA 가이드에서 함유된 DNA-결합 서열에서, 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 변형된 RNA 분자일 수 있다. 일부 예에서, DNA-결합 서열은 DNA 서열 또는 DNA/RNA 하이브리드 서열을 함유할 수 있다. 용어 CRISPR RNA (crRNA), 프레-crRNA, 및 성숙한 crRNA는 RNA 가이드를 지칭하기 위해 본원에 또한 사용된다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "상보적"은 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드가 염기-짝짓기를 통해 이중-가닥 복합체를 형성하여 제2 폴리뉴클레오티드 상에서 작용 (예를 들면, 절단)하기 위해 제1 폴리뉴클레오티드와 복합체화되는 이펙터 폴리펩티드를 허용하도록 제2 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, 표적 서열의 상보적 서열)에 특정 수준의 상보성을 갖는 제1 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, RNA 가이드의 스페이서 서열)를 지칭한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오티드는 제2 폴리뉴클레오티드에 실질적으로 상보적, 즉, 제2 폴리뉴클레오티드에 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상보성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오티드는 제2 폴리뉴클레오티드에 완전히 상보적, 즉, 제2 폴리뉴클레오티드에 100% 상보성을 갖는다.
2개 핵산의 또는 2개 아미노산 서열의 "퍼센트 동일성" (별칭, 서열 동일성)은 Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993에서 처럼 수정된, Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990의 알고리즘을 사용하여 결정된다. 이러한 알고리즘은 Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)에 편입된다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 본 개시내용의 핵산 분자와 상동인 뉴클레오티드 서열을 수득하기 위해 NBLAST 프로그램, 점수=100, 단어길이-12로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 개시내용의 단백질 분자에 상동인 아미노산 서열을 수득하기 위해 XBLAST 프로그램, 점수=50, 단어 길이=3으로 수행될 수 있다. 갭이 2개 서열 사이 실재하는 경우, 갭핑된 BLAST는 Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997에 기재된 대로 활용될 수 있다. BLAST 및 갭핑된 BLAST 프로그램을 활용하는 때, 각각의 프로그램 (예를 들면, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "편집"은, 예를 들면, STMN2 유전자 내에서 표적 핵산에 도입된 하나 이상의 변형을 지칭한다. 편집은 하나 이상의 치환, 하나 이상의 삽입, 하나 이상의 결실, 또는 이들의 조합일 수 있다. 본원에 사용된 경우에, 용어 "치환"은 참조 서열에 비해, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 상이한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들로의 대체를 지칭한다. 본원에 사용된 경우에, 용어 "삽입"은 참조 서열에 비해, 핵산 서열에서 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 이득을 지칭하다. 본원에 사용된 경우에, 용어 "결실"은 참조 서열에 비해, 핵산 서열에서 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 손실을 지칭한다.
특정한 과정은 결실을 포함하는 서열을 만드는 방법에 암시되지 않는다. 가령, 결실을 포함하는 서열은 개별 뉴클레오티드로부터 직접적으로 합성될 수 있다. 다른 구현예에서, 결실은 참조 서열을 제공하고 그 다음 변경함으로써 만들어진다. 핵산 서열은 유기체의 게놈에 있을 수 있다. 핵산 서열은 세포에 있을 수 있다. 핵산 서열은 DNA 서열일 수 있다. 결실은 프레임시프트 돌연변이 또는 비-프레임시프트 돌연변이일 수 있다. 본원에 기재된 결실은 최대 수 킬로베이스의 결실을 지칭한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "업스트림" 및 "다운스트림"은 핵산 분자에서 단일 핵산 (예를 들면, DNA) 서열 내에서의 상대 위치를 지칭한다. "업스트림" 및 "다운스트림"은 RNA 전사가 발생하는 5'에서 3' 방향, 각각에 관련한다. 제1 서열은 제1 서열의 3' 단부가 제2 서열의 5' 단부 앞에 발생하는 때 제2 서열의 업스트림이다. 제1 서열은 제1 서열의 5' 단부가 제2 서열의 3' 단부 뒤에 발생하는 때 제2 서열의 다운스트림이다. 일부 구현예에서, 5'-NTTN-3' 또는 5'-TTN-3' 서열은 본원에 기재된 인델의 업스트림이고, Cas12i-유도 인델은 5'-NTTN-3' 또는 5'-TTN-3' 서열의 다운스트림이다.
I. 유전자 편집 시스템
일부 양태에서, 본 개시내용은 STMN2 유전자를 표적화하는 RNA 가이드를 포함하는 유전자 편집 시스템을 제공한다. 이러한 유전자 편집 시스템은 STMN2 표적 유전자를 편집하는데, 예를 들면, STMN2 유전자를 파괴하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 경우에 용어 "STMN2"는 "스타스민-2"를 지칭한다. STMN2는 단백질의 스타스민 계열의 뉴런-특이적 구성원이고 미세소관 안정성 및 신호 전달의 조절에서 역할을 한다. 본원에 제시된 대로 서열번호: 454는 STMN2 유전자 서열의 예를 제공한다. 이 서열에 대하여 유전자 ID: 11075를 또한 참조한다 (www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/11075).
일부 구현예에서, RNA 가이드는 직접 반복 구성요소 및 스페이서 서열로 구성된다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 Cas12i 폴리펩티드를 결합시킨다. 일부 구현예에서, 스페이서 서열은 STMN2 표적 서열에 특이적이고, 여기서 STMN2 표적 서열은 본원에 기재된 대로 5'-NTTN-3' 또는 5'-TTN-3' PAM 서열에 인접한다. 이중-가닥 표적의 경우에서, RNA 가이드는 표적의 제1 가닥 (즉, 비-PAM 가닥)에 결합하고 본원에 기재된 대로 PAM 서열은 제2, 상보적 가닥 (즉, PAM 가닥)에 존재한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은, 복합체가 STMN2를 표적화하는 RNA 가이드를 포함하는, 복합체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드를 포함하는 복합체를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드는 서로 약 1:1의 몰비로 결합한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드를 포함하는 복합체는 STMN2 유전자 내에서 표적 서열의 상보적 영역에 결합한다. 일부 구현예에서, STMN2를 표적화하는 RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드를 포함하는 복합체는 약 1:1의 몰비로 STMN2 유전자 내에서 표적 서열의 상보적 영역에 결합한다. 일부 구현예에서, 복합체는 STMN2 표적 서열 및/또는 상보적 서열을 절단할 수 있는 효소적 활성, 예컨대 뉴클레아제 활성을 포함한다. RNA 가이드, Cas12i 폴리펩티드, 및 STMN2 표적 서열의 상보적 영역은, 어느 한쪽 단독으로 또는 함께, 자연적으로 발생하지 않는다. 일부 구현예에서, 복합체에서 RNA 가이드는 본원에 기재된 직접 반복 및/또는 스페이서 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 대로 RNA 가이드 및/또는 본원에 기재된 대로 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 RNA를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 RNA는 동일한 조성물 내에서 함께 포함된다. 일부 구현예에서, RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 RNA는 별도 조성물 내에서 포함된다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 본원에 기재된 직접 반복 및/또는 스페이서 서열을 포함한다.
본원에 개시된 유전자 편집 시스템의 사용은 다른 알려진 뉴클레아제 시스템의 것들보다 이점을 갖는다. Cas12i 폴리펩티드는 다른 뉴클레아제보다 더 작다. 예를 들어, Cas12i2는 길이가 1,054개 아미노산이고, 반면 S. 피오게네스(pyogenes) Cas9 (SpCas9)는 길이가 1,368개 아미노산이고, S. 써모필루스(thermophilus) Cas9 (StCas9)는 길이가 1,128개 아미노산이고, FnCpf1은 길이가 1,300개 아미노산이고, AsCpf1은 길이가 1,307개 아미노산이고, LbCpf1은 길이가 1,246개 아미노산이다. 전사-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)를 필요로 하지 않는 Cas12i RNA 가이드는 또한 Cas9 RNA 가이드보다 더 작다. 더 작은 Cas12i 폴리펩티드 및 RNA 가이드 크기는 전달에 유익하다. Cas12i 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 SpCas9 폴리펩티드를 포함하는 조성물과 비교하여 감소된 오프-표적 활성을 또한 증명한다. WO/2021/202800 참조, 이의 관련한 개시내용은 본원에 참조된 주제 및 목적을 위하여 참조로 편입됨. 게다가, Cas12i 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 의해 유도된 인델은 SpCas9 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 의해 유도된 인델과 상이하다. 예를 들어, SpCas9 폴리펩티드는 길이가 1개 뉴클레오티드의 삽입 및 결실을 주로 유도한다. 하지만, Cas12i 폴리펩티드는 더 큰 결실을 유도하고, 이는 유전자의 더 큰 부문 예컨대 STMN2 파괴하기에 유익할 수 있다.
또한 STMN2 유전자의 유전적 편집을 위한 시스템이 본원에 제공되며, 이는 (i) Cas12i 폴리펩티드 (예를 들면, Cas12i2 폴리펩티드) 또는 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 (예를 들면, Cas12i2 폴리펩티드는 서열번호: 448과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 448에 비해 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있음); 및 (ii) RNA 가이드가 STMN2 유전자 내에서 (예를 들면, STMN2 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 또는 인트론 내에서) 표적 서열에 특이적인 스페이서 서열을 포함하고, 표적 서열은 표적 서열에 5' 위치하는, 5'-TTN-3'의 모티프 (5'-NTTN-3')를 포함하는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 인접한, RNA 가이드 또는 RNA 가이드를 인코딩하는 제2 핵산을 포함한다.
A. RNA 가이드
일부 구현예에서, 본원에 기재된 유전자 편집 시스템은 STMN2 유전자를 표적화하는, 예를 들어, STMN2 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 또는 인트론을 표적화하는 RNA 가이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 유전자 편집 시스템은 STMN2를 표적화하는 둘 이상 (예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 그 이상) RNA 가이드를 포함할 수 있다.
RNA 가이드는 본원에 기재된 대로 유전자 편집 시스템에서 함유된 Cas12i 폴리펩티드를 STMN2 표적 서열로 지시할 수 있다. 둘 이상의 RNA 가이드는 본원에 기재된 대로 둘 이상의 별도 Cas12i 폴리펩티드 (예를 들면, 동일한 또는 상이한 서열을 갖는 Cas12i 폴리펩티드)를 둘 이상 (예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 그 이상) STMN2 표적 서열로 지시할 수 있다. 특정한 종류의 RNA 가이드의 아래 예를 읽는 당업자는, 일부 구현예에서, RNA 가이드가 STMN2 표적-특이적임을 이해할 것이다. 즉, 일부 구현예에서, RNA 가이드는 (예를 들면, 세포 내에서) 하나 이상의 STMN2 표적 서열에 특이적으로 결합하고 비-표적화된 서열 (예를 들면, 동일한 세포 내에서 비-특이적 DNA 또는 랜덤 서열)에 결합하지 않는다.
일부 구현예에서, RNA 가이드는 스페이서 서열 이어서 5'에서 3' 방향으로 서열을 지칭하는 직접 반복 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 제1 직접 반복 서열 이어서 스페이서 서열 및 5'에서 3' 방향으로 서열을 지칭하는 제2 직접 반복 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 RNA 가이드의 제1 및 제2 직접 반복은 동일하다. 일부 구현예에서, 이러한 RNA 가이드의 제1 및 제2 직접 반복은 상이하다.
일부 구현예에서, RNA 가이드의 스페이서 서열 및 직접 반복 서열(들)은 동일한 RNA 분자 내에서 존재한다. 일부 구현예에서, 스페이서 및 직접 반복 서열은 서로 직접적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 짧은 링커, 예를 들면, 길이가 1, 2, 또는 3개 뉴클레오티드인 RNA 링커는 스페이서와 직접 반복 서열 사이 존재한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드의 스페이서 서열 및 직접 반복 서열(들)은, 염기 짝짓기 상호작용에 의해 서로 연합되는, 별도 분자에 존재한다.
RNA 가이드의 예시적 직접 반복 및 스페이서 구성요소에 관한 추가의 정보는 하기와 같이 제공된다.
(i). 직접 반복
일부 구현예에서, RNA 가이드는 직접 반복 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드의 직접 반복 서열은 12-100, 13-75, 14-50, 또는 15-40개 뉴클레오티드 (예를 들면, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개 뉴클레오티드)의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 표 1의 서열 또는 표 1의 서열의 한 부문이다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 9의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 34를 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 9의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 34를 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 9의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 34를 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 9의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 34를 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 9의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 34를 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 9의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 34를 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 9의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 34를 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 9의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 34를 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 9의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 34를 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 9의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 34를 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 9의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 34를 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 9의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 34를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 서열번호: 10에 제시된다. 일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 서열번호: 10에 제시된 서열의 한 부문을 포함한다.
일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 표 1의 서열과 또는 표 1의 서열의 한 부문과 적어도 90% 동일성 (예를 들면, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성)을 갖는다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 2 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 3 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 4 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 5 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 6 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 7 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 8 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 9 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 10 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 11 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 12 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 13 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 하나의 14 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 9의 1 내지 뉴클레오티드 34를 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 9의 2 내지 뉴클레오티드 34를 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 9의 3 내지 뉴클레오티드 34를 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 9의 4 내지 뉴클레오티드 34를 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 9의 5 내지 뉴클레오티드 34를 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 9의 6 내지 뉴클레오티드 34를 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 9의 7 내지 뉴클레오티드 34를 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 9의 8 내지 뉴클레오티드 34를 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 9의 9 내지 뉴클레오티드 34를 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 9의 10 내지 뉴클레오티드 34를 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 9의 11 내지 뉴클레오티드 34를 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 9의 12 내지 뉴클레오티드 34를 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 서열번호: 10과 적어도 90% 동일성 (예를 들면, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성)을 갖는다. 일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 서열번호: 10에 제시된 서열의 한 부문과 적어도 90% 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, Cas12i2 폴리펩티드 및 서열번호: 10의 직접 반복 및 20개 뉴클레오티드의 스페이서 길이를 포함하는 RNA 가이드를 포함하는 조성물은 인델을 STMN2 표적 서열에 도입할 수 있다.
일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 서열번호: 1-10 중 어느 하나의 역 보체와 적어도 90% 동일하다 (표 1, 참조). 일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 서열번호: 1-10 중 어느 하나의 역 보체이다.
일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 표 2의 서열 또는 표 2의 서열의 한 부문이다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 표 2의 서열과 또는 표 2의 서열의 한 부문과 적어도 95% 동일성 (예를 들면, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성)을 갖는다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 95% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 2 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 95% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 3 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 95% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 4 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 95% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 5 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 95% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 6 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 95% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 7 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 95% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 8 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 95% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 9 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 95% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 10 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 95% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 11 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 95% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 12 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 95% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 13 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 95% 동일성을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 표 2의 서열과 또는 표 2의 서열의 한 부문과 적어도 90% 동일성 (예를 들면, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성)을 갖는다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 2 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 3 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 4 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 5 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 6 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 7 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 8 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 9 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 10 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 11 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 12 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 13 내지 뉴클레오티드 36을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 역 보체와 적어도 90% 동일하다. 일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 역 보체와 적어도 95% 동일하다. 일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 서열번호: 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 또는 479 중 어느 하나의 역 보체이다.
일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 서열번호: 480 또는 서열번호: 480의 한 부문과 적어도 90% 동일하다. 일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 서열번호: 480 또는 서열번호: 480의 한 부문과 적어도 95% 동일하다. 일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 서열번호: 480 또는 서열번호: 480의 한 부문과 100% 동일하다.
일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 표 3의 서열 또는 표 3의 서열의 한 부문이다. 일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 표 3의 서열 또는 표 3의 서열의 한 부문과 적어도 95% 동일성 (예를 들면, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성)을 갖는다. 일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 표 3의 서열 또는 표 3의 서열의 한 부문과 적어도 90% 동일성 (예를 들면, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성)을 갖는다. 일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 서열번호: 485-487 중 어느 하나의 역 보체와 적어도 90% 동일하다. 일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 서열번호: 485-487 중 어느 하나의 역 보체와 적어도 95% 동일하다. 일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 서열번호: 485-487 중 어느 하나의 역 보체이다.
일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 표 4의 서열 또는 표 4의 서열의 한 부문이다. 일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 표 4의 서열 또는 표 4의 서열의 한 부문과 적어도 95% 동일성 (예를 들면, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성)을 갖는다. 일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 표 4의 서열 또는 표 4의 서열의 한 부문과 적어도 90% 동일성 (예를 들면, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성)을 갖는다. 일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 서열번호: 488-490 중 어느 하나의 역 보체와 적어도 90% 동일하다. 일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 서열번호: 488-490 중 어느 하나의 역 보체와 적어도 95% 동일하다. 일부 구현예에서, 직접 반복 서열은 서열번호: 488-490 중 어느 하나의 역 보체이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 직접 반복 서열은 우라실 (U)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 직접 반복 서열은 티민 (T)을 포함한다. 일부 구현예에서, 표 1-4에 따른 직접 반복 서열은 표 1-4에서 우라실로서 표시된 하나 이상의 장소에 티민을 포함하는 서열을 포함한다.
(ii). 스페이서 서열
일부 구현예에서, RNA 가이드는 DNA 표적화 또는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드의 스페이서 서열은 12-100, 13-75, 14-50, 또는 15-30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 뉴클레오티드)의 길이를 갖고 비-PAM 가닥 서열에 상보적이다. 일부 구현예에서, 스페이서 서열은, 예를 들면, 게놈성 유전자자리의 특정 DNA 가닥에 상보적이도록 설계된다.
일부 구현예에서, RNA 가이드 스페이서 서열은 표적 서열의 상보적 가닥과 실질적으로 동일하다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 참조 핵산 서열, 예를 들면, 표적 서열의 상보적 가닥과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.5% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 2개 이러한 핵산 사이 퍼센트 동일성은 2개 최적으로 정렬된 핵산 서열의 검사에 의해 또는 표준 파라미터를 사용하는 소프트웨어 프로그램 또는 알고리즘 (예를 들면, BLAST, ALIGN, CLUSTAL) 사용에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, RNA 가이드는 12-100, 13-75, 14-50, 또는 15-30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 뉴클레오티드)의 길이를 갖고 표적 서열에 상보적인 비-PAM 가닥 상의 영역에 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 상보적인 스페이서 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 표적 DNA 서열에 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 상보적인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 표적 게놈성 서열에 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 상보적인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 표적 서열에 상보적인 비-PAM 가닥 상의 영역에 최대 50의 길이 및 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 상보적인 서열, 예를 들면, RNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 표적 DNA 서열에 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 상보적인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 표적 게놈성 서열에 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 상보적인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 스페이서 서열은 표 5A 또는 5B의 서열 또는 표 5A 또는 5B의 서열의 한 부문이다. 서열번호: 229-446 또는 2497-4502의 표시가 목록에서 존재하는 개재 번호의 각각, 즉, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 및 446, 또는 2497, 2498, 2499, 2500, 2501, 2502, 2503, 2504, 2505, 2506, 2507, 2508, 2509, 2510, 2511, 2512, 2513, 2514, 2515, 2516, 2517, 2518, 2519, 2520, 2521, 2522, 2523, 2524, 2525, 2526, 2527, 2528, 2529, 2530, 2531, 2532, 2533, 2534, 2535, 2536, 2537, 2538, 2539, 2540, 2541, 2542, 2543, 2544, 2545, 2546, 2547, 2548, 2549, 2550, 2551, 2552, 2553, 2554, 2555, 2556, 2557, 2558, 2559, 2560, 2561, 2562, 2563, 2564, 2565, 2566, 2567, 2568, 2569, 2570, 2571, 2572, 2573, 2574, 2575, 2576, 2577, 2578, 2579, 2580, 2581, 2582, 2583, 2584, 2585, 2586, 2587, 2588, 2589, 2590, 2591, 2592, 2593, 2594, 2595, 2596, 2597, 2598, 2599, 2600, 2601, 2602, 2603, 2604, 2605, 2606, 2607, 2608, 2609, 2610, 2611, 2612, 2613, 2614, 2615, 2616, 2617, 2618, 2619, 2620, 2621, 2622, 2623, 2624, 2625, 2626, 2627, 2628, 2629, 2630, 2631, 2632, 2633, 2634, 2635, 2636, 2637, 2638, 2639, 2640, 2641, 2642, 2643, 2644, 2645, 2646, 2647, 2648, 2649, 2650, 2651, 2652, 2653, 2654, 2655, 2656, 2657, 2658, 2659, 2660, 2661, 2662, 2663, 2664, 2665, 2666, 2667, 2668, 2669, 2670, 2671, 2672, 2673, 2674, 2675, 2676, 2677, 2678, 2679, 2680, 2681, 2682, 2683, 2684, 2685, 2686, 2687, 2688, 2689, 2690, 2691, 2692, 2693, 2694, 2695, 2696, 2697, 2698, 2699, 2700, 2701, 2702, 2703, 2704, 2705, 2706, 2707, 2708, 2709, 2710, 2711, 2712, 2713, 2714, 2715, 2716, 2717, 2718, 2719, 2720, 2721, 2722, 2723, 2724, 2725, 2726, 2727, 2728, 2729, 2730, 2731, 2732, 2733, 2734, 2735, 2736, 2737, 2738, 2739, 2740, 2741, 2742, 2743, 2744, 2745, 2746, 2747, 2748, 2749, 2750, 2751, 2752, 2753, 2754, 2755, 2756, 2757, 2758, 2759, 2760, 2761, 2762, 2763, 2764, 2765, 2766, 2767, 2768, 2769, 2770, 2771, 2772, 2773, 2774, 2775, 2776, 2777, 2778, 2779, 2780, 2781, 2782, 2783, 2784, 2785, 2786, 2787, 2788, 2789, 2790, 2791, 2792, 2793, 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2960, 2961, 2962, 2963, 2964, 2965, 2966, 2967, 2968, 2969, 2970, 2971, 2972, 2973, 2974, 2975, 2976, 2977, 2978, 2979, 2980, 2981, 2982, 2983, 2984, 2985, 2986, 2987, 2988, 2989, 2990, 2991, 2992, 2993, 2994, 2995, 2996, 2997, 2998, 2999, 3000, 3001, 3002, 3003, 3004, 3005, 3006, 3007, 3008, 3009, 3010, 3011, 3012, 3013, 3014, 3015, 3016, 3017, 3018, 3019, 3020, 3021, 3022, 3023, 3024, 3025, 3026, 3027, 3028, 3029, 3030, 3031, 3032, 3033, 3034, 3035, 3036, 3037, 3038, 3039, 3040, 3041, 3042, 3043, 3044, 3045, 3046, 3047, 3048, 3049, 3050, 3051, 3052, 3053, 3054, 3055, 3056, 3057, 3058, 3059, 3060, 3061, 3062, 3063, 3064, 3065, 3066, 3067, 3068, 3069, 3070, 3071, 3072, 3073, 3074, 3075, 3076, 3077, 3078, 3079, 3080, 3081, 3082, 3083, 3084, 3085, 3086, 3087, 3088, 3089, 3090, 3091, 3092, 3093, 3094, 3095, 3096, 3097, 3098, 3099, 3100, 3101, 3102, 3103, 3104, 3105, 3106, 3107, 3108, 3109, 3110, 3111, 3112, 3113, 3114, 3115, 3116, 3117, 3118, 3119, 3120, 3121, 3122, 3123, 3124, 3125, 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4454, 4455, 4456, 4457, 4458, 4459, 4460, 4461, 4462, 4463, 4464, 4465, 4466, 4467, 4468, 4469, 4470, 4471, 4472, 4473, 4474, 4475, 4476, 4477, 4478, 4479, 4480, 4481, 4482, 4483, 4484, 4485, 4486, 4487, 4488, 4489, 4490, 4491, 4492, 4493, 4494, 4495, 4496, 4497, 4498, 4499, 4500, 4501, 또는 4502로, 서열번호: 229-446 또는 2497-4502의 목록에 대한 등가물로서 간주되어야 함이 이해되어야 한다.
스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 16을 포함할 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 17을 포함할 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 18을 포함할 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 19를 포함할 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 20을 포함할 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 21을 포함할 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 22를 포함할 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 23을 포함할 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 24를 포함할 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 25를 포함할 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 26을 포함할 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 27을 포함할 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 28을 포함할 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 29를 포함할 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 30을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 스페이서 서열은 표 5A 또는 5B의 서열 또는 표 5A 또는 5B의 서열의 한 부문과 적어도 90% 동일성 (예를 들면, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성)을 갖는다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 16을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 17을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 18을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 19를 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 20을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 21을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 22를 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 23을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 24를 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 25를 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 26을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 27을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 28을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 29를 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 스페이서 서열은 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 30을 포함하는 서열과 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다.
* 3개의 3' 뉴클레오티드는 5'-TTN-3' 모티프를 나타낸다.
본 개시내용은 본원에 본 개시내용과 일치하는, 위에 나열된 직접 반복 서열 및 스페이서 서열의 모든 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 스페이서 서열은 우라실 (U)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 스페이서 서열은 티민 (T)을 포함한다. 일부 구현예에서, 표 5A 또는 5B에 따른 스페이서 서열은 표 5A 또는 5B에서 우라실로서 표시된 하나 이상의 (예를 들면, 모든) 장소에 티민을 포함하는 서열을 포함한다.
본 개시내용은 (예를 들면, 위에 표 5A 또는 5B에 제시된 대로) 본원에 기재된 직접 반복 및 스페이서의 임의의 및 모든 조합을 포함하는 RNA 가이드를 포함한다.
일부 구현예에서, RNA 가이드는 서열번호: 4505-4562 중 어느 하나와 적어도 90% 동일성 (예를 들면, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 서열번호: 4505-4562 중 어느 하나와 적어도 95% 동일성 (예를 들면, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 서열번호: 4505-4562 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, RNA 가이드는 서열번호: 4508, 4512, 4559, 및 4561 중 어느 하나의 서열을 포함하거나, 제2 핵산은 서열번호: 4508, 4512, 4559, 및 4561 중 어느 하나를 포함하는 RNA 가이드를 인코딩한다.
일부 구현예에서, RNA 가이드는 서열번호: 4505, 4506, 4507, 4508, 4509, 4510, 4511, 4512, 4513, 4514, 4515, 4554, 4555, 4556, 4557, 4558, 4559, 4560, 4561, 및 4562 중 어느 하나의 서열을 포함하거나, 제2 핵산은 서열번호: 4505, 4506, 4507, 4508, 4509, 4510, 4511, 4512, 4513, 4514, 4515, 4554, 4555, 4556, 4557, 4558, 4559, 4560, 4561, 및 4562 중 어느 하나를 포함하는 RNA 가이드를 인코딩한다.
B. 핵산 변형
RNA 가이드는 본 개시내용의 범위 내에 포함되는 참조 서열, 특히 모체 폴리리보뉴클레오티드와 관하여 하나 이상의 공유 변형을 포함할 수 있다.
예시적 변형은 당, 핵염기, 인터뉴클레오시드 링키지 (예를 들면, 결합 포스페이트/포스포디에스테르 링키지/포스포디에스테르 백본) 및 이들의 임의의 조합에 대한 임의의 변형을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 예시적 변형의 일부는 아래 상세히 기재된다.
RNA 가이드는, 예컨대 당, 핵염기, 또는 인터뉴클레오시드 링키지에 대한 (예를 들면, 결합 포스페이트에 대한/포스포디에스테르 링키지에 대한/포스포디에스테르 백본에 대한) 임의의 유용한 변형을 포함할 수 있다. 피리미딘 핵염기의 하나 이상의 원자는 임의로 치환된 아미노, 임의로 치환된 티올, 임의로 치환된 알킬 (예를 들면, 메틸 또는 에틸), 또는 할로 (예를 들면, 클로로 또는 플루오로)로 대체 또는 치환될 수 있다. 특정 구현예에서, 변형 (예를 들면, 하나 이상의 변형)은 당 및 인터뉴클레오시드 링키지의 각각에 존재한다. 변형은 리보핵산 (RNA)의 데옥시리보핵산 (DNA), 트레오세 핵산 (TNA), 글리콜 핵산 (GNA), 펩티드 핵산 (PNA), 잠금된 핵산 (LNA) 또는 이들의 하이브리드)로의 변형일 수 있다. 추가의 변형은 본원에 기재된다.
일부 구현예에서, 변형은 화학적 또는 세포성 유도된 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포내 RNA 변형의 일부 비제한 예는 Nat Reviews Mol Cell Biol, 2017, 18:202-210으로부터 "RNA 변형 및 구조는 RNA-단백질 상호 작용을 안내하기 위해 협력한다"에서 Lewis 및 Pan에 의해 기재된다.
상이한 당 변형, 뉴클레오티드 변형, 및/또는 인터뉴클레오시드 링키지 (예를 들면, 백본 구조)는 서열에서 다양한 위치에 실재할 수 있다. 당업자는 서열의 기능이 실질적으로 감소되지 않도록, 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 변형(들)이 서열의 임의의 위치(들)에 위치할 수 있음을 인식할 것이다. 서열은 (어느 한쪽 전반적 뉴클레오티드 함량과 관련하여, 또는 하나 이상의 유형의 뉴클레오티드, 즉 A, G, U 또는 C 중 임의의 하나 이상과 관련하여) 약 1% 내지 약 100% 변형된 뉴클레오티드 또는 임의의 개재 백분율 (예를 들면, 1% 내지 20%>, 1% 내지 25%, 1% 내지 50%, 1% 내지 60%, 1% 내지 70%, 1% 내지 80%, 1% 내지 90%, 1% 내지 95%, 10% 내지 20%, 10% 내지 25%, 10% 내지 50%, 10% 내지 60%, 10% 내지 70%, 10% 내지 80%, 10% 내지 90%, 10% 내지 95%, 10% 내지 100%, 20% 내지 25%, 20% 내지 50%, 20% 내지 60%, 20% 내지 70%, 20% 내지 80%, 20% 내지 90%, 20% 내지 95%, 20% 내지 100%, 50% 내지 60%, 50% 내지 70%, 50% 내지 80%, 50% 내지 90%, 50% 내지 95%, 50% 내지 100%, 70% 내지 80%, 70% 내지 90%, 70% 내지 95%, 70% 내지 100%, 80% 내지 90%, 80% 내지 95%, 80% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 및 95% 내지 100%)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, (예를 들면, 2' 위치 또는 4' 위치에서) 당 변형 또는 서열의 하나 이상의 리보뉴클레오티드에서의 당의 대체는 백본 변형 뿐만 아니라, 포스포디에스테르 링키지의 변형 또는 대체를 포함할 수 있다. 서열의 특정 예는, 비제한적으로, 포스포디에스테르 링키지의 변형 또는 대체를 포함하는, 변형된 백본 또는 무 천연 인터뉴클레오시드 링키지 예컨대 인터뉴클레오시드 변형을 포함하는 서열을 포함한다. 변형된 백본을 갖는 서열은, 그 중에서도, 백본에서 인 원자를 갖지 않는 것들을 포함한다. 본 출원의 목적을 위하여, 그리고 당업계에 때때로 참조된 대로, 그들의 인터뉴클레오시드 백본에서 인 원자를 갖지 않는 변형된 RNA는 또한 올리고뉴클레오시드로 간주될 수 있다. 특정한 구현예에서, 서열은 이의 인터뉴클레오시드 백본에서 인 원자가 있는 리보뉴클레오티드를 포함할 것이다.
변형된 서열 백본은, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 예컨대 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트, 예컨대 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상 3'-5' 링키지를 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 결합된 유사체, 및 뉴클레오시드 단위의 인접한 쌍이 3'-5'에서 5'-3'으로 또는 2'-5'에서 5'-2'로 결합되는 반전된 극성을 갖는 것들을 포함할 수 있다. 다양한 염, 혼합된 염 및 유리 산 형태는 또한 포함된다. 일부 구현예에서, 서열은 음성으로 또는 양성으로 하전될 수 있다.
서열에 편입될 수 있는 변형된 뉴클레오티드는 인터뉴클레오시드 링키지 (예를 들면, 포스페이트 백본) 상에서 변형될 수 있다. 본원에, 폴리뉴클레오티드 백본의 맥락에서, 어구 "포스페이트" 및 "포스포디에스테르"는 교환가능하게 사용된다. 백본 포스페이트 기는 산소 원자 중 하나 이상을 상이한 치환체로 치환함으로써 변형될 수 있다. 추가로, 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 본원에 기재된 대로 미변형된 포스페이트 모이어티의 또 다른 인터뉴클레오시드 링키지로의 대량 대체를 포함할 수 있다. 변형된 포스페이트 기의 예는, 비제한적으로, 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노포스페이트, 보라노포스페이트 에스테르, 수소 포스포네이트, 포스포르아미데이트, 포스포로디아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트, 및 포스포트리에스테르를 포함한다. 포스포로디티오에이트는 황에 의해 대체된 둘 모두의 비-결합 산소를 갖는다. 포스페이트 링커는 결합 산소의 질소 (브릿징된 포스포르아미데이트), 황 (브릿징된 포스포로티오에이트), 및 탄소 (브릿징된 메틸렌-포스포네이트)로의 대체에 의해 또한 변형될 수 있다.
α-티오 치환된 포스페이트 모이어티는 비천연 포스포로티오에이트 백본 링키지를 통해서 RNA 및 DNA 중합체에 안정성을 부여하기 위해 제공된다. 포스포로티오에이트 DNA 및 RNA는 증가된 뉴클레아제 저항성 그리고 후속적으로 세포성 환경에서 더 긴 반감기를 갖는다.
특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 알파-티오-뉴클레오시드 (예를 들면, 5'-O-(1-티오포스페이트)-아데노신, 5'-O-(1-티오포스페이트)-시티딘 (a-티오-시티딘), 5'-O-(1-티오포스페이트)-구아노신, 5'-O-(1-티오포스페이트)-우리딘, 또는 5'-O-(1-티오포스페이트)-슈도우리딘)을 포함한다.
인 원자를 함유하지 않는 인터뉴클레오시드 링키지를 포함하는, 본 개시내용에 따라 이용될 수 있는 기타 인터뉴클레오시드 링키지는 본원에 기재된다.
일부 구현예에서, 서열은 하나 이상의 세포독성 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포독성 뉴클레오시드는 서열, 예컨대 2기능적 변형에 편입될 수 있다. 세포독성 뉴클레오시드는, 비제한적으로, 아데노신 아라비노시드, 5-아자시티딘, 4'-티오-아라시티딘, 시클로펜테닐시토신, 클라드리빈, 클로파라빈, 시타라빈, 시토신 아라비노시드, 1-(2-C-시아노-2-데옥시-베타-D-아라비노-펜토푸라노실)-시토신, 데시타빈, 5-플루오로우라실, 플루다라빈, 플록수리딘, 젬시타빈, 테가푸르 및 우라실의 조합, 테가푸르 ((RS)-5-플루오로-1-(테트라히드로푸란-2-일)피리미딘-2,4(1H,3H)-디온), 트록사시타빈, 테자시타빈, 2'-데옥시-2'-메틸리덴시티딘 (DMDC) 및 6-머캅토퓨린을 포함할 수 있다. 추가의 예는 플루다라빈 포스페이트, N4-베헤노일-1-베타-D-아라비노푸라노실시토신, N4-옥타데실-1-베타-D-아라비노푸라노실시토신, N4-팔미토일-1-(2-C-시아노-2-데옥시-베타-D-아라비노-펜토푸라노실) 시토신, 및 P-4055 (시타라빈 5'-엘라이드산 에스테르)를 포함한다.
일부 구현예에서, 서열은 하나 이상의 전사후 변형 (예를 들면, 캡핑, 절단, 폴리아데닐화, 스플라이싱, 폴리-A 서열, 메틸화, 아실화, 인산화, 리신 및 아르기닌 잔기의 메틸화, 아세틸화, 및 티올 기 및 티로신 잔기의 니트로실화, 등)을 포함한다. 하나 이상의 전사후 변형은 임의의 전사후 변형, 예컨대 RNA (Rozenski, J, Crain, P, and McCloskey, J. (1999). The RNA Modification Database: 1999 업데이트. Nucl Acids Res 27: 196-197)에서 식별된 100개 초과 상이한 뉴클레오시드 변형 중 임의의 것일 수 있다 일부 구현예에서, 제1 단리된 핵산은 메신저 RNA (mRNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는 피리딘-4-온 리보뉴클레오시드, 5-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-히드록시우리딘, 3-메틸우리딘, 5-카르복시메틸-우리딘, 1-카르복시메틸-슈도우리딘, 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘, 1-타우리노메틸-4-티오-우리딘, 5-메틸-우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디히드로우리딘, 디히드로슈도우리딘, 2-티오-디히드로우리딘, 2-티오-디히드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 및 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘으로 이루어지는 군으부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는 5-아자-시티딘, 슈도이소시티딘, 3-메틸-시티딘, N4-아세틸시티딘, 5-포르밀시티딘, N4-메틸시티딘, 5-히드록시메틸시티딘, 1-메틸-슈도이소시티딘, 피롤로-시티딘, 피롤로-슈도이소시티딘, 2-티오-시티딘, 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 제불라린, 5-아자-제불라린, 5-메틸-제불라린, 5-아자-2-티오-제불라린, 2-티오-제불라린, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시-슈도이소시티딘, 및 4-메톡시-1-메틸-슈도이소시티딘으로 이루어지는 군으부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2,6-디아미노퓨린, 1-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-이소펜테닐아데노신, N6-(시스-히드록시이소펜테닐)아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-히드록시이소펜테닐)아데노신, N6-글리시닐카르바모일아데노신, N6-트레오닐카르바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐 카르바모일아데노신, N6,N6-디메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 및 2-메톡시-아데닌으로 이루어지는 군으부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는 이노신, 1-메틸-이노신, 와이오신, 와이부토신, 7-데아자-구아노신, 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신, 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸구아노신, N2-메틸구아노신, N2,N2-디메틸구아노신, 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, 및 N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신으로 이루어지는 군으부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오시드를 포함한다.
서열은 분자의 전체 길이를 따라 균일하게 변형될 수 있거나 아닐 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 또는 모든 유형의 뉴클레오티드 (예를 들면, 자연-발생 뉴클레오티드, 퓨린 또는 피리미딘, 또는 A, G, U, C, I, pU의 임의의 하나 이상 또는 모두)는 서열에서, 또는 이의 주어진 미리결정된 서열 영역에서 균일하게 변형될 수 있거나 아닐 수 있다. 일부 구현예에서, 서열은 슈도우리딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열은 내인성 대 바이러스성 RNA로서 서열을 특성규명하는 면역 시스템에 도움이 될 수 있는 이노신을 포함한다. 이노신의 편입은 개선된 RNA 안정성/감소된 분해를 또한 매개할 수 있다. 예를 들어, 이의 전체가 참조로 편입되는, See Yu, Z. et al. (2015) ADAR1에 의한 RNA 편집이 dsRNA를 "자가"로서 표시한다. Cell Res. 25, 1283-1284, 참조.
일부 구현예에서, RNA 가이드의 뉴클레오티드 중 하나 이상은 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드의 처음 3개 뉴클레오티드의 각각은 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드의 마지막 4개 뉴클레오티드의 각각은 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드의 처음에서 마지막, 두번째에서 마지막, 그리고 세번째에서 마지막 뉴클레오티드의 각각은 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 변형을 포함하고, 여기서 RNA 가이드의 마지막 뉴클레오티드는 미변형된다. 일부 구현예에서, RNA 가이드의 처음 3개 뉴클레오티드의 각각은 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 변형을 포함하고, RNA 가이드의 처음에서 마지막, 두번째에서 마지막, 그리고 세번째에서 마지막 뉴클레오티드의 각각은 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 변형을 포함한다.
본원에 개시된 유전자 편집 시스템이 본원에 개시된 Cas12i 폴리펩티드, 예를 들면, mRNA 분자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 때, 이러한 핵산 분자는, 적용가능한 경우, 본원에 개시된 변형 중 임의의 것을 함유할 수 있다.
C. Cas12i 폴리펩티드
일부 구현예에서, 본 개시내용의 조성물 또는 시스템은 WO/2019/178427에 기재된 대로 Cas12i 폴리펩티드를 포함하고, 이의 관련한 개시내용은 본원에 참조된 주제 및 목적을 위하여 참조로 편입된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 유전적 편집 시스템은 본원에 기재된 Cas12i2 폴리펩티드 (예를 들면, 서열번호: 448을 포함하고/거나 서열번호: 447 (또는 T들이 U들로 대체되는 이의 한 버전)에 의해 인코딩된 폴리펩티드)를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12i2 폴리펩티드는 적어도 하나의 RuvC 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 유전적 편집 시스템은 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자 (예를 들면, DNA 분자 또는 폴리리보뉴클레오티드 분자)를 포함한다.
본원에 기재된 Cas12i2 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 참조 핵산 서열, 예를 들면, 서열번호: 447 (또는 T들이 U들로 대체되는 이의 한 버전)과 실질적으로 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas12i2 폴리펩티드는 참조 핵산 서열, 예를 들면, 서열번호: 447 (또는 T들이 U들로 대체되는 이의 한 버전))과 최소 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.5% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩된다. 2개의 이러한 핵산 사이 퍼센트 동일성은 2개 최적으로 정렬된 핵산 서열의 검사에 의해 또는 표준 파라미터를 사용하는 소프트웨어 프로그램 또는 알고리즘 (예를 들면, BLAST, ALIGN, CLUSTAL) 사용에 의해 수동으로 결정될 수 있다. 2개 핵산 서열이 실질적으로 동일한 하나의 표시는 핵산 분자가 엄격한 조건의 온도 및 이온성 강도 하에서 (예를 들면, 중간 내지 고 염격성의 범위 내에서) 다른 것의 상보적 서열을 하이브리드화한다는 것이다. 예를 들면, Tijssen, "핵산 프로브를 이용한 하이브리드화. 파트 I. 이론 및 핵산 제조" (Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol 24), 참조.
일부 구현예에서, Cas12i2 폴리펩티드는 참조 핵산 서열, 예를 들면, 서열번호: 447 (또는 T들이 U들로 대체되는 이의 한 버전)과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 그 이상 서열 동일성, 100%가 아닌 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 Cas12i2 폴리펩티드는 서열번호: 448과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 하나 이상의 참조 폴리펩티드와 특정된 정도의 아미노산 서열 동일성, 예를 들면, 서열번호: 448의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 99%, 그러나 100%가 아닌, 서열 동일성을 갖는 Cas12i2 폴리펩티드를 설명한다. 상동성 또는 동일성은, 본원에 기재된 대로, 예를 들면, 프로그램 예컨대 BLAST, ALIGN, 또는 CLUSTAL을 사용하여 아미노산 서열 정렬에 의해 결정될 수 있다.
이전에 기재된 정렬 방법 중 임의의 것을 사용하여 정렬된 때, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0개 아미노산 잔기(들)만큼 서열번호: 448의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하고, 효소적 활성, 예를 들면, 뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 본 개시내용의 Cas12i2 폴리펩티드가 또한 제공된다.
일부 구현예에서, Cas12i2 폴리펩티드는, 예를 들어, 위치 D581, G624, F626, P868, I926, V1030, E1035, S1046, 또는 이들의 임의의 조합에서 서열번호: 448에 비해 하나 이상의 돌연변이를 함유할 수 있다. 일부 경우에서, 하나 이상의 돌연변이는 아미노산 치환, 예를 들어, D581R, G624R, F626R, P868T, I926R, V1030G, E1035R, S1046G, 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, Cas12i2 폴리펩티드는 서열번호: 449, 서열번호: 450, 서열번호: 451, 서열번호: 452, 또는 서열번호: 453의 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 예에서, Cas12i2 폴리펩티드는 위치 D581, D911, I926, 및 V1030에서의 돌연변이를 함유한다. 이러한 Cas12i2 폴리펩티드는 D581R, D911R, I926R, 및 V1030G (예를 들면, 서열번호: 449)의 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 일부 예에서, Cas12i2 폴리펩티드는 위치 D581, I926, 및 V1030에서의 돌연변이를 함유한다. 이러한 Cas12i2 폴리펩티드는 D581R, I926R, 및 V1030G (예를 들면, 서열번호: 450)의 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 일부 예에서, Cas12i2 폴리펩티드는 위치 D581, I926, V1030, 및 S1046에서의 돌연변이를 함유할 수 있다. 이러한 Cas12i2 폴리펩티드는 D581R, I926R, V1030G, 및 S1046G (예를 들면, 서열번호: 451)의 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 일부 예에서, Cas12i2 폴리펩티드는 위치 D581, G624, F626, I926, V1030, E1035, 및 S1046에서의 돌연변이를 함유할 수 있다. 이러한 Cas12i2 폴리펩티드는 D581R, G624R, F626R, I926R, V1030G, E1035R, 및 S1046G (예를 들면, 서열번호: 452)의 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 일부 예에서, Cas12i2 폴리펩티드는 위치 D581, G624, F626, P868, I926, V1030, E1035, 및 S1046에서의 돌연변이를 함유할 수 있다. 이러한 Cas12i2 폴리펩티드는 D581R, G624R, F626R, P868T, I926R, V1030G, E1035R, 및 S1046G (예를 들면, 서열번호: 453)의 아미노산 치환을 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 Cas12i2 폴리펩티드는 서열번호: 449, 서열번호: 450, 서열번호: 451, 서열번호: 452, 또는 서열번호: 453과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호: 449, 서열번호: 450, 서열번호: 451, 서열번호: 452, 또는 서열번호: 453과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 Cas12i2 폴리펩티드는 이의 각각의 모체/참조 서열과 폴리펩티드를 구별하는 아미노산 변화 (또는 이들 변화의 적어도 1, 2, 3개 등)를 유지한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 하나 이상의 참조 폴리펩티드와 특정된 정도의 아미노산 서열 동일성, 예를 들면, 서열번호: 449, 서열번호: 450, 서열번호: 451, 서열번호: 452, 또는 서열번호: 453의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 99%, 그러나 100%가 아닌, 서열 동일성을 갖는 Cas12i2 폴리펩티드를 설명한다. 상동성 또는 동일성은, 본원에 기재된 대로, 예를 들면, 프로그램 예컨대 BLAST, ALIGN, 또는 CLUSTAL을 사용하여 아미노산 서열 정렬에 의해 결정될 수 있다.
이전에 기재된 정렬 방법 중 임의의 것을 사용하여 정렬된 때, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0개 아미노산 잔기(들)만큼 서열번호: 449, 서열번호: 450, 서열번호: 451, 서열번호: 452, 또는 서열번호: 453의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하고, 효소적 활성, 예를 들면, 뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 본 개시내용의 Cas12i2 폴리펩티드가 또한 제공된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 조성물은 본원에 기재된 Cas12i4 폴리펩티드 (예를 들면, 서열번호: 482를 포함하고/거나 서열번호: 481 (또는 T들이 U들로 대체되는 이의 한 버전)에 의해 인코딩된 폴리펩티드)를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12i4 폴리펩티드는 적어도 하나의 RuvC 도메인을 포함한다.
본원에 기재된 Cas12i4 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 참조 핵산 서열, 예를 들면, 서열번호: 481 (또는 T들이 U들로 대체되는 이의 한 버전)과 실질적으로 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas12i4 폴리펩티드는 참조 핵산 서열, 예를 들면, 서열번호: 481 (또는 T들이 U들로 대체되는 이의 한 버전)과 최소 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.5% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩된다. 2개의 이러한 핵산 사이 퍼센트 동일성은 2개 최적으로 정렬된 핵산 서열의 검사에 의해 또는 표준 파라미터를 사용하는 소프트웨어 프로그램 또는 알고리즘 (예를 들면, BLAST, ALIGN, CLUSTAL) 사용에 의해 수동으로 결정될 수 있다. 2개 핵산 서열이 실질적으로 동일한 하나의 표시는 핵산 분자가 엄격한 조건의 온도 및 이온성 강도 하에서 (예를 들면, 중간 내지 고 염격성의 범위 내에서) 다른 것의 상보적 서열을 하이브리드화한다는 것이다.
일부 구현예에서, Cas12i4 폴리펩티드는 참조 핵산 서열, 예를 들면, 서열번호: 481 (또는 T들이 U들로 대체되는 이의 한 버전)과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 그 이상 서열 동일성, 그러나 100%가 아닌 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 Cas12i4 폴리펩티드는 서열번호: 482와 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 하나 이상의 참조 폴리펩티드와 특정된 정도의 아미노산 서열 동일성, 예를 들면, 서열번호: 482의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 99%, 그러나 100%가 아닌, 서열 동일성을 갖는 Cas12i4 폴리펩티드를 설명한다. 상동성 또는 동일성은, 본원에 기재된 대로, 예를 들면, 프로그램 예컨대 BLAST, ALIGN, 또는 CLUSTAL을 사용하여 아미노산 서열 정렬에 의해 결정될 수 있다.
이전에 기재된 정렬 방법 중 임의의 것을 사용하여 정렬된 때, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0개 아미노산 잔기(들)만큼 서열번호: 482의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하고, 효소적 활성, 예를 들면, 뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 본 개시내용의 Cas12i4 폴리펩티드가 또한 제공된다.
일부 구현예에서, Cas12i4 폴리펩티드는 서열번호: 483 또는 서열번호: 484의 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 Cas12i4 폴리펩티드는 서열번호: 483 또는 서열번호: 484와 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호: 483 또는 서열번호: 484와 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 Cas12i4 폴리펩티드는 이의 각각의 모체/참조 서열과 이를 구별하는 아미노산 변화 (또는 이들 변화의 적어도 1, 2, 3개 등)를 유지한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 하나 이상의 참조 폴리펩티드와 특정된 정도의 아미노산 서열 동일성, 예를 들면, 서열번호: 483 또는 서열번호: 484의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 99%, 그러나 100%가 아닌, 서열 동일성을 갖는 Cas12i4 폴리펩티드를 설명한다. 상동성 또는 동일성은, 본원에 기재된 대로, 예를 들면, 프로그램 예컨대 BLAST, ALIGN, 또는 CLUSTAL을 사용하여 아미노산 서열 정렬에 의해 결정될 수 있다.
이전에 기재된 정렬 방법 중 임의의 것을 사용하여 정렬된 때, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0개 아미노산 잔기(들)만큼 서열번호: 483 또는 서열번호: 484의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하고, 효소적 활성, 예를 들면, 뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 본 개시내용의 Cas12i4 폴리펩티드가 또한 제공된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 조성물은 본원에 기재된 Cas12i1 폴리펩티드 (예를 들면, 서열번호: 4503을 포함하는 폴리펩티드)를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12i1 폴리펩티드는 적어도 하나의 RuvC 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 Cas12i1 폴리펩티드는 서열번호: 4503과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 하나 이상의 참조 폴리펩티드와 특정된 정도의 아미노산 서열 동일성, 예를 들면, 서열번호: 4503의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 99%, 그러나 100%가 아닌, 서열 동일성을 갖는 Cas12i1 폴리펩티드를 설명한다. 상동성 또는 동일성은, 본원에 기재된 대로, 예를 들면, 프로그램 예컨대 BLAST, ALIGN, 또는 CLUSTAL을 사용하여 아미노산 서열 정렬에 의해 결정될 수 있다.
이전에 기재된 정렬 방법 중 임의의 것을 사용하여 정렬된 때, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0개 아미노산 잔기(들)만큼 서열번호: 4503의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하고, 효소적 활성, 예를 들면, 뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 본 개시내용의 Cas12i1 폴리펩티드가 또한 제공된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 조성물은 본원에 기재된 Cas12i3 폴리펩티드 (예를 들면, 서열번호: 4504를 포함하는 폴리펩티드)를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12i3 폴리펩티드는 적어도 하나의 RuvC 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 Cas12i3 폴리펩티드는 서열번호: 4504와 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 하나 이상의 참조 폴리펩티드와 특정된 정도의 아미노산 서열 동일성, 예를 들면, 서열번호: 4504의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 99%, 그러나 100%가 아닌, 서열 동일성을 갖는 Cas12i3 폴리펩티드를 설명한다. 상동성 또는 동일성은, 본원에 기재된 대로, 예를 들면, 프로그램 예컨대 BLAST, ALIGN, 또는 CLUSTAL을 사용하여 아미노산 서열 정렬에 의해 결정될 수 있다.
이전에 기재된 정렬 방법 중 임의의 것을 사용하여 정렬된 때, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0개 아미노산 잔기(들)만큼 서열번호: 4504의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하고, 효소적 활성, 예를 들면, 뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 본 개시내용의 Cas12i3 폴리펩티드가 또한 제공된다.
본원에 기재된 변화가 하나 이상의 아미노산 변화일 수 있어도, Cas12i 폴리펩티드에 대한 변화는 또한 실질적 성격의 것, 예컨대 아미노- 및/또는 카르복실-말단 연장으로서 폴리펩티드의 융합일 수 있다. 예를 들어, Cas12i 폴리펩티드는 추가의 펩티드, 예를 들면, 하나 이상의 펩티드를 함유할 수 있다. 추가의 펩티드의 예는 표지화를 위한 에피토프 펩티드, 예컨대 폴리히스티딘 태그 (His-태그), Myc, 및 FLAG를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 Cas12i 폴리펩티드는 검출가능한 모이어티 예컨대 형광성 단백질 (예를 들면, 녹색 형광성 단백질 (GFP) 또는 황색 형광성 단백질 (YFP))에 융합될 수 있다.
일부 구현예에서, Cas12i 폴리펩티드는 적어도 하나의 (예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상) 핵 위치 신호 (NLS)를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12i 폴리펩티드는 적어도 하나의 (예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상) 핵 외 수송 신호 (NES)를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12i 폴리펩티드는 적어도 하나의 (예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상) NLS 및 적어도 하나의 (예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상) NES를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 Cas12i 폴리펩티드는 자가-불활성화하는 중일 수 있다. 이의 전체가 참조로 편입되는, Epstein et al., "AAV 벡터를 위한 자가-불활성화 CRISPR 시스템 조작하기", Mol. Ther., 24 (2016): S50, 참조.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 특정한 숙주 세포 또는 유기체에서 사용을 위하여 코돈-최적화될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 마우스, 래트, 토끼, 개, 가축, 또는 비-인간 영장류를 포함하는 임의의 비-인간 진핵생물에 대하여 코돈-최적화될 수 있다. 코돈 활용 표는, 예를 들어, kazusa.orjp/codon/의 월드 와이드 웹 사이트에서 이용가능한 "코돈 활용 데이터베이스"에서 용이하게 이용가능하고 이들 표는 다수의 방식으로 적응될 수 있다. 이의 전체가 참조로 본원에 편입되는, Nakamura et al. Nucl. Acids Res. 28:292 (2000), 참조. 특정한 숙주 세포에서 발현을 위하여 특정한 서열을 최적화하는 코돈을 위한 컴퓨터 알고리즘, 예컨대 Gene Forge (Aptagen; Jacobus, PA)는 또한 이용가능하다. 일부 예에서, Cas12i 폴리펩티드 예컨대 본원에 개시된 대로 Cas12i2 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 코돈 최적화될 수 있는 mRNA 분자일 수 있다.
예시적 Cas12i 폴리펩티드 서열 및 상응하는 뉴클레오티드 서열은 표 7에 나열된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 유전자 편집 시스템은 본원에 개시된 대로 Cas12i 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유전자 편집 시스템은 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터 (예를 들면, 바이러스성 벡터 예컨대 AAV 벡터, 예컨대 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 유전자 편집 시스템은 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA 분자를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, mRNA 분자는 코돈-최적화될 수 있다.
II. 유전자 편집 시스템 구성요소의 제조
본 개시내용은 본원에 개시된 유전자 편집 시스템의 구성요소, 예를 들면, RNA 가이드의 생산 방법, Cas12i 폴리펩티드의 생산 방법, 및 RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드를 복합체화하는 방법을 제공한다.
A. RNA 가이드
일부 구현예에서, RNA 가이드는 DNA 분자의 시험관내 전사에 의해 만들어진다. 그래서, 예를 들어, 일부 구현예에서, RNA 가이드는 업스트림 프로모터 서열 (예를 들면, T7 폴리머라제 프로모터 서열)을 사용하여 RNA 가이드를 인코딩하는 DNA 분자의 시험관내 전사에 의해 생성된다.
일부 구현예에서, DNA 분자는 다중 RNA 가이드를 인코딩하거나 시험관내 전사 반응은, 상이한 RNA 가이드를 각각 인코딩하는, 여러 상이한 DNA 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 화학적 합성 방법을 사용하여 만들어진다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 RNA 가이드를 인코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드로 형질감염된 세포에서 RNA 가이드 서열을 발현시킴으로써 만들어진다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 여러 상이한 RNA 가이드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 상이한 RNA 가이드를 각각 인코딩하는, 여러 상이한 플라스미드는 세포에 형질감염된다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 RNA 가이드를 인코딩하고 Cas12i 폴리펩티드를 또한 인코딩하는 플라스미드로부터 발현된다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 RNA 가이드를 발현하지만 Cas12i 폴리펩티드를 발현하지 않는 플라스미드로부터 발현된다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 상업용 판매업체로부터 구입된다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는, 예를 들면, 상기 기재된 대로 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 사용하여 합성된다.
B. Cas12i 폴리펩티드
일부 구현예에서, 본 개시내용의 Cas12i 폴리펩티드는 (a) 본 개시내용의 Cas12i 폴리펩티드를 생산하는 박테리아를 배양하고, Cas12i 폴리펩티드를 단리하고, 임의로, Cas12i 폴리펩티드를 정제하고, Cas12i 폴리펩티드를 RNA 가이드와 복합체화함으로써 제조될 수 있다. Cas12i 폴리펩티드는 (b) 알려진 유전적 조작 기법에 의해, 구체적으로 박테리아로부터 본 개시내용의 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 단리하고, 재조합 발현 벡터를 작제하고, 그 다음 숙주 세포에서 RNA 가이드와 복합체화하는 재조합 단백질의 발현을 위하여 RNA 가이드를 발현시키는 적절한 숙주 세포에 벡터를 전달함으로써 또한 제조될 수 있다. 대안적으로, Cas12i 폴리펩티드는 (c) 시험관내 커플링된 전사-번역 시스템에 의해 및 그 다음 RNA 가이드와의 복합체화에 의해 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 Cas12i 폴리펩티드를 발현하는데 사용된다. 숙주 세포는 특히 제한되지 않고, 다양한 알려진 세포는 바람직하게 사용될 수 있다. 숙주 세포의 구체적 예는 박테리아 예컨대 E. 콜리, 효모 (출아 효모, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 및 분열 효모, 쉬조사카로미세스 폼비(Schizosaccharomyces pombe)), 선충류 (예쁜 꼬마 선충), 아프리카 발톱 개구리알(Xenopus laevis oocytes), 및 동물 세포 (예를 들어, CHO 세포, COS 세포 및 HEK293 세포)를 포함한다. 위에 기재된 발현 벡터를 숙주 세포에 전달하는 방법, 즉, 형질전환 방법은 특히 제한되지 않고, 알려진 방법 예컨대 전기천공, 인산칼슘 방법, 리포솜 방법 및 DEAE 덱스트란 방법이 사용될 수 있다.
숙주가 발현 벡터로 형질전환된 후, 숙주 세포는 Cas12i 폴리펩티드의 생산을 위하여 배양, 재배 또는 육종될 수 있다. Cas12i 폴리펩티드의 발현 후, 숙주 세포는 수집될 수 있고 Cas12i 폴리펩티드는 종래 방법 (예를 들어, 여과, 원심분리, 세포 파괴, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 등)에 따라 배양물 등으로부터 정제될 수 있다.
일부 구현예에서, Cas12i 폴리펩티드 발현을 위한 방법은 Cas12i 폴리펩티드의 적어도 5개 아미노산, 적어도 10개 아미노산, 적어도 15개 아미노산, 적어도 20개 아미노산, 적어도 50개 아미노산, 적어도 100개 아미노산, 적어도 150개 아미노산, 적어도 200개 아미노산, 적어도 250개 아미노산, 적어도 300개 아미노산, 적어도 400개 아미노산, 적어도 500개 아미노산, 적어도 600개 아미노산, 적어도 700개 아미노산, 적어도 800개 아미노산, 적어도 900개 아미노산, 또는 적어도 1000개 아미노산의 번역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 발현을 위한 방법은 Cas12i 폴리펩티드의 약 5개 아미노산, 약 10개 아미노산, 약 15개 아미노산, 약 20개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 150개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 250개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 500개 아미노산, 약 600개 아미노산, 약 700개 아미노산, 약 800개 아미노산, 약 900개 아미노산, 약 1000개 아미노산 또는 그 이상의 번역을 포함한다.
다양한 방법은 숙주 세포에서 Cas12i 폴리펩티드의 생산의 수준을 결정하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은, 비제한적으로, 예를 들어, 본원에 다른 곳에 기재된 대로 표지화 태그 또는 Cas12i 폴리펩티드에 특이적인 다클론성 또는 단클론성 항체 어느 한쪽을 활용하는 방법을 포함한다. 예시적 방법은, 비제한적으로, 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성면역검정 (MA), 형광성 면역검정 (FIA), 및 형광성 활성화된 세포 분류 (FACS)를 포함한다. 이들 및 기타 검정은 당업계에 잘 알려진다 (예를 들면, Maddox et al., J. Exp. Med. 158:1211 [1983], 참조).
본 개시내용은, 폴리리보뉴클레오티드가 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 숙주 세포에 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 것, 세포에서 Cas12i 폴리펩티드를 발현시키는 것, 그리고 Cas12i 폴리펩티드를 세포로부터 수득하는 것을 포함하는, 세포에서 Cas12i 폴리펩티드의 생체내 발현 방법을 제공한다.
본 개시내용은 폴리리보뉴클레오티드가 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 숙주 세포에 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 것 그리고 세포에서 Cas12i 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하는, 세포에서 Cas12i 폴리펩티드의 생체내 발현 방법을 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리리보뉴클레오티드는 RNA 가이드가 있는 세포에 전달되고, 일단 세포에서 발현되면, Cas12i 폴리펩티드 및 RNA 가이드는 복합체를 형성한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리리보뉴클레오티드는 단일 조성물 내에서 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리리보뉴클레오티드는 별도 조성물 내에서 포함된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 대상체, 예를 들면, 인간 환자에서 존재한다.
C. 복합체
일부 구현예에서, STMN2를 표적화하는 RNA 가이드는 Cas12i 폴리펩티드와 복합체화되어 리보핵단백질 (RNP)을 형성한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드의 복합체화는 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 50℃, 또는 55℃ 중 약 어느 하나보다 더 낮은 온도에서 일어난다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 약 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분, 55분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 또는 그 이상 시간 중 적어도 약 어느 하나의 인큐베이션 기간에 걸쳐 약 37℃에서 Cas12i 폴리펩티드로부터 해리하지 않는다.
일부 구현예에서, RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드는 복합체화 완충액에서 복합체화된다. 일부 구현예에서, Cas12i 폴리펩티드는 RNA 가이드와 복합체를 형성하기 위해 복합체화 완충액으로 대체되는 완충액에서 저장된다. 일부 구현예에서, Cas12i 폴리펩티드는 복합체화 완충액에서 저장된다.
일부 구현예에서, 복합체화 완충액은 약 7.3 내지 8.6의 범위에서 pH를 갖는다. 일 구현예에서, 복합체화 완충액의 pH는 약 7.3이다. 일 구현예에서, 복합체화 완충액의 pH는 약 7.4이다. 일 구현예에서, 복합체화 완충액의 pH는 약 7.5이다. 일 구현예에서, 복합체화 완충액의 pH는 약 7.6이다 일 구현예에서, 복합체화 완충액의 pH는 약 7.7이다. 일 구현예에서, 복합체화 완충액의 pH는 약 7.8이다. 일 구현예에서, 복합체화 완충액의 pH는 약 7.9이다. 일 구현예에서, 복합체화 완충액의 pH는 약 8.0이다. 일 구현예에서, 복합체화 완충액의 pH는 약 8.1이다. 일 구현예에서, 복합체화 완충액의 pH는 약 8.2이다. 일 구현예에서, 복합체화 완충액의 pH는 약 8.3이다. 일 구현예에서, 복합체화 완충액의 pH는 약 8.4이다. 일 구현예에서, 복합체화 완충액의 pH는 약 8.5이다. 일 구현예에서, 복합체화 완충액의 pH는 약 8.6이다.
일부 구현예에서, Cas12i 폴리펩티드는 본원에 기재된 대로 정제에 앞서 숙주 세포에서 과발현될 수 있고 RNA 가이드와 복합체화될 수 있다. 일부 구현예에서, Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA 또는 DNA는 세포에 도입되어서 Cas12i 폴리펩티드는 세포에서 발현된다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는, 단일 mRNA 또는 DNA 작제물로부터 동시에, 별도로, 또는 순차적으로든, 세포에 또한 도입되어서, RNP 복합체는 세포에서 형성된다.
III. 유전적 편집 방법
본 개시내용은 또한 STMN2 유전자 내에서 표적 부위를 변형시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 STMN2-표적화 RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드를 세포에 도입하는 것을 포함한다. STMN2-표적화 RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드는 세포에 리보핵단백질 복합체로서 도입될 수 있다. STMN2-표적화 RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드는 핵산 벡터 상에서 도입될 수 있다. Cas12i 폴리펩티드는 mRNA로서 도입될 수 있다. RNA 가이드 및 템플레이트 DNA는 세포에 직접적으로 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 세포/조직/사람에 전달되어 세포/조직/사람에서 STMN2를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 세포/조직/사람에 전달되어 세포/조직/사람에서 STMN2 생산을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 세포/조직/사람에 전달되어 세포/조직/사람에서 신경퇴행성 질환 (예를 들면, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTD))을 치료한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 신경퇴행성 질환 (예를 들면, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTD))이 있는 사람에 전달된다.
본원에 개시된 유전자 편집 시스템의 임의의 것은 STMN2 유전자를 유전적으로 조작하는데 사용될 수 있다. 유전자 편집 시스템은 가이드 RNA, Cas12i2 폴리펩티드, 및 템플레이트 DNA를 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 STMN2 유전자에서 표적 서열에 특이적인, 예를 들면, STMN2 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 또는 인트론에서의 영역에 특이적인 스페이서 서열을 포함한다.
A. 표적 서열
일부 구현예에서, 본원에 개시된 대로 RNA 가이드는 5'-TTN-3' PAM 서열 또는 5'-NTTN-3' PAM 서열에 인접하는 표적 서열에 상보적이도록 설계된다.
일부 구현예에서, 표적 서열은 STMN2 유전자 또는 STMN2 유전자의 유전자자리 (예를 들면, 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 또는 인트론) 내에 있고, 여기에 RNA 가이드는 염기 짝짓기를 통해 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 표적 서열의 단 1개 카피를 갖는다. 일부 구현예에서, 세포는 표적 서열의 1개 초과 카피, 예컨대 2, 3, 4, 5, 10, 100개, 또는 그 이상 카피의 적어도 약 어느 하나를 갖는다.
일부 구현예에서, STMN2 유전자는 포유류 유전자이다. 일부 구현예에서, STMN2 유전자는 인간 유전자이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 표적 서열은 서열번호: 454의 서열, 또는 이의 역 보체 내에 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 서열번호: 454에 제시된 STMN2 유전자의 엑손, 또는 이의 역 보체 내에, 예를 들면, 서열번호: 455-461 중 어느 하나의 서열 (또는 이들의 임의의 것의 역 보체) 내에 있다. 서열번호: 454의 STMN2 유전자의 엑손 영역 내에서의 표적 서열은 표 6에 제시된다. 엑손 서열은 표 7에 제시된다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 서열번호: 454에 제시된 STMN2 유전자의 인트론, 또는 이의 역 보체 내에 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 서열번호: 454에 제시된 STMN2 유전자 서열의 변이체 (예를 들면, 다형성 변이체), 또는 이의 역 보체 내에 있다. 일부 구현예에서, STMN2 유전자 서열은 서열번호: 454에 제시된 서열의 상동체, 또는 이의 역 보체이다. 일부 구현예에서, STMN2 유전자 서열은 비-인간 STMN2 서열이다.
일부 구현예에서, 표적 서열은 5'-NTTN-3' PAM 서열에 인접하고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 5'-NTTN-3' 서열은 표적 서열에 바로 인접할 수 있거나, 예를 들어, 표적 서열의 뉴클레오티드의 작은 수 (예를 들면, 1, 2, 3, 4, 또는 5) 내에 있을 수 있다. 일부 구현예에서 5'-NTTN-3' 서열은 5'-NTTY-3', 5'-NTTC-3', 5'-NTTT-3', 5'-NTTA-3', 5'-NTTB-3', 5'-NTTG-3', 5'-CTTY-3', 5'-DTTR'3', 5'-CTTR-3', 5'-DTTT-3', 5'-ATTN-3', 또는 5'-GTTN-3'이고, 여기서 Y는 C 또는 T이고, B는 A를 제외한 임의의 뉴클레오티드이고, D는 C를 제외한 임의의 뉴클레오티드이고, R은 A 또는 G이다. 일부 구현예에서, 5'-NTTN-3' 서열은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3'이다. PAM 서열은 표적 서열에 대해 5'일 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 서열은 단일-가닥 (예를 들면, 단일-가닥 DNA)이다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 이중-가닥 (예를 들면, 이중-가닥 DNA)이다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 단일-가닥 및 이중-가닥 영역 둘 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 선형이다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 원형이다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드, 손상된 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 변형되지 않는다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 이중-가닥 표적 서열의 제1 가닥 (예를 들면, 표적 가닥 또는 스페이서-상보적 가닥)에 결합하고, 5'-NTTN-3' PAM 서열은 제2, 상보적 가닥 (예를 들면, 비-표적 가닥 또는 비-스페이서-상보적 가닥)에서 존재한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 표적 가닥 (예를 들면, 스페이서-상보적 가닥) 상에서 5'-NAAN-3' 서열에 인접하여 결합한다.
5'-NTTN-3' 서열은 표적 서열에 바로 인접할 수 있거나, 예를 들어, 표적 서열의 뉴클레오티드의 작은 수 (예를 들면, 1, 2, 3, 4, 또는 5) 내에 있을 수 있다. 일부 구현예에서 5'-NTTN-3' 서열은 5'-NTTY-3', 5'-NTTC-3', 5'-NTTT-3', 5'-NTTA-3', 5'-NTTB-3', 5'-NTTG-3', 5'-CTTY-3', 5'-DTTR-3', 5'-CTTR-3', 5'-DTTT-3', 5'-ATTN-3', 또는 5'-GTTN-3'이고, 여기서 Y는 C 또는 T이고, B는 A를 제외한 임의의 뉴클레오티드이고, D는 C를 제외한 임의의 뉴클레오티드이고, R은 A 또는 G이다. 일부 구현예에서, 5'-NTTN-3' 서열은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3'이다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 이중-가닥 표적 핵산의 제1 가닥 (즉, 비-PAM 가닥)에 결합하도록 설계되고, 5'-NTTN-3' PAM 서열은 제2, 상보적 가닥 (즉, PAM 가닥)에서 존재한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는, 5'-NAAN-3' 서열에 인접하는, PAM 가닥 상의 표적 서열에 상보적인 비-PAM 가닥 상의 영역에 결합한다.
일부 구현예에서, 표적 서열은 세포에서 존재한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 핵에서 존재한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포에 내인성이다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 게놈성 DNA이다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 염색체성 DNA이다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 단백질-코딩 유전자 또는 이의 기능적 영역, 예컨대 코딩 영역, 또는 조절성 요소, 예컨대 프로모터, 인핸서, 5' 또는 3' 미번역된 영역, 등이다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 표적 서열의 용이하게 접근가능한 영역에서 존재한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 표적 유전자의 엑손에 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 표적 유전자의 엑손-인트론 접합을 가로지른다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 유전자의 비-코딩 영역, 예컨대 조절성 영역에서 존재한다.
B. 유전자 편집
일부 구현예에서, Cas12i 폴리펩티드는 효소적 활성 (예를 들면, 뉴클레아제 활성)을 갖는다. 일부 구현예에서, Cas12i 폴리펩티드는 세포에서 하나 이상의 DNA 이중-가닥 파손을 유도한다. 일부 구현예에서, Cas12i 폴리펩티드는 세포에서 하나 이상의 DNA 단일-가닥 파손을 유도한다. 일부 구현예에서, Cas12i 폴리펩티드는 세포에서 하나 이상의 DNA 닉을 유도한다. 일부 구현예에서, DNA 파손 및/또는 닉은 하나 이상의 인델 (예를 들면, 하나 이상의 결실)의 형성을 초래한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 RNA 가이드는 Cas12i 폴리펩티드와 복합체를 형성하고 5'-NTTN-3' 서열에 인접한 표적 서열로 Cas12i 폴리펩티드를 지시한다. 일부 구현예에서, 복합체는 5'-NTTN-3' 서열에 인접한 결실 (예를 들면, 뉴클레오티드 결실 또는 DNA 결실)을 유도한다. 일부 구현예에서, 복합체는 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열에 인접한 결실을 유도한다. 일부 구현예에서, 복합체는 T/C-풍부 서열에 인접한 결실을 유도한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 다운스트림이다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 다운스트림이다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 다운스트림이다.
일부 구현예에서, 결실은 STMN2 유전자의 발현을 변경시킨다. 일부 구현예에서, 결실은 STMN2 유전자의 기능을 변경시킨다. 일부 구현예에서, 결실은 STMN2 유전자를 불활성화시킨다. 일부 구현예에서, 결실은 프레임쉬프팅 결실이다. 일부 구현예에서, 결실은 비-프레임쉬프팅 결실이다. 일부 구현예에서, 결실은 세포 독성 또는 세포사 (예를 들면, 세포자멸)로 이어진다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 내에서 시작한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 내에서 시작한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 내에서 시작한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 뉴클레오티드) 내에서 시작한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 뉴클레오티드) 내에서 시작한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 뉴클레오티드) 내에서 시작한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 내에서 시작한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 내에서 시작한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 내에서 시작한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 5'-NTTN-3' 서열의 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 T/C-풍부 서열의 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 5'-NTTN-3' 서열의 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 T/C-풍부 서열의 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 5'-NTTN-3' 서열의 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 T/C-풍부 서열의 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 5'-NTTN-3' 서열의 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 T/C-풍부 서열의 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 내에서 시작하고 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드) (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 5'-NTTN-3' 서열의 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 T/C-풍부 서열의 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 5'-NTTN-3' 서열의 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 T/C-풍부 서열의 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 5'-NTTN-3' 서열의 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 T/C-풍부 서열의 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 5'-NTTN-3' 서열의 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 T/C-풍부 서열의 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 내에서 시작하고 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 내에서 종료한다.
일부 구현예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 5'-NTTN-3' 서열의 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3' 서열의 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다. 일부 구현예에서, 결실은 T/C-풍부 서열의 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 시작하고 T/C-풍부 서열의 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 뉴클레오티드) 다운스트림 내에서 종료한다.
일부 구현예에서, 결실은 길이가 최대 약 50개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 또는 55개 뉴클레오티드)이다. 일부 구현예에서, 결실은 길이가 최대 약 40개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 또는 45개 뉴클레오티드)이다. 일부 구현예에서, 결실은 길이가 약 4개 뉴클레오티드 내지 약 40개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 또는 45개 뉴클레오티드)이다. 일부 구현예에서, 결실은 길이가 약 4개 뉴클레오티드 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드)이다. 일부 구현예에서, 결실은 길이가 약 10개 뉴클레오티드 내지 약 25개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드)이다. 일부 구현예에서, 결실은 길이가 약 10개 뉴클레오티드 내지 약 15개 뉴클레오티드 (예를 들면, 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오티드)이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 둘 이상의 RNA 가이드는 40개 초과 뉴클레오티드의 길이를 갖는 결실을 도입하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 둘 이상의 RNA 가이드는 적어도 약 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 16, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 또는 400개 뉴클레오티드의 결실을 도입하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 둘 이상의 RNA 가이드는 STMN2 유전자 또는 서열번호: 454의 전부 또는 한 부문을 결실하는데 사용된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 STMN2 유전자에서 본원에 기재된 대로 결실을 포함하는 세포를 조작하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 대로 Cas12i 효소 및 본원에 기재된 대로 직접 반복 서열 및 스페이서 서열을 포함하는 RNA 가이드를 포함하는 복합체를 사용하여 실시된다.
일부 구현예에서, STMN2를 표적화하는 RNA 가이드는 플라스미드에서 인코딩된다. 일부 구현예에서, STMN2를 표적화하는 RNA 가이드는 합성 또는 정제된 RNA이다.　일부 구현예에서, Cas12i 폴리펩티드는 플라스미드에서 인코딩된다. 일부 구현예에서, Cas12i 폴리펩티드는 합성이거나 정제되는 RNA에 의해 인코딩된다.
C. 전달
예를 들어, 담체, 예컨대 담체 및/또는 중합체성 담체, 예를 들면, 리포솜을 포함하는, 본원에 개시된 유전자 편집 시스템 중 임의의 것의 구성요소는 제형화될 수 있고, 알려진 방법에 의해 세포 (예를 들면, 원핵, 진핵, 식물, 포유류, 등)에 전달될 수 있다. 이러한 방법은, 비제한적으로, 형질감염 (예를 들면, 지질-매개, 양이온성 중합체, 인산칼슘, 덴드리머); 전기천공 또는 막 파괴의 기타 방법 (예를 들면, 핵감염), 바이러스성 전달 (예를 들면, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV)), 미세주사, 미세발사체 충격 ("유전자 총"), 퓨진, 직접 음파 로딩, 세포 압착, 광학적 형질감염, 원형질체 융합, 관통감염, 자기감염, 엑소좀-매개 전달, 지질 나노입자-매개 전달, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 하나 이상의 핵산 (예를 들면, Cas12i 폴리펩티드, RNA 가이드, 공여체 DNA, 등을 인코딩하는 핵산), 이의 하나 이상의 전사체, 및/또는 미리-형성된 RNA 가이드/Cas12i 폴리펩티드 복합체를, 삼원 복합체가 형성되는, 세포에 전달하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 RNA는 단일 조성물로 함께 전달된다. 일부 구현예에서, RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 RNA는 별도 조성물로 전달된다. 일부 구현예에서, 별도 조성물로 전달된 RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 RNA는 동일한 전달 기술을 사용하여 전달된다. 일부 구현예에서, 별도 조성물로 전달된 RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 RNA는 상이한 전달 기술을 사용하여 전달된다.
일부 구현예에서, Cas12i 구성요소 및 RNA 가이드 구성요소는 함께 전달된다. 예를 들어, Cas12i 구성요소 및 RNA 가이드 구성요소는 단일 AAV 입자에서 함께 패키징된다. 또 다른 예에서, Cas12i 구성요소 및 RNA 가이드 구성요소는 지질 나노입자 (LNP)를 통해 함께 전달된다. 일부 구현예에서, Cas12i 구성요소 및 RNA 가이드 구성요소는 별도로 전달된다. 예를 들어, Cas12i 구성요소 및 RNA 가이드는 별도 AAV 입자로 패키징된다. 또 다른 예에서, Cas12i 구성요소는 제1 전달 기전에 의해 전달되고 RNA 가이드는 제2 전달 기전에 의해 전달된다.
예시적 세포내 전달 방법은, 비제한적으로, 다음을 포함한다: 바이러스, 예컨대 AAV, 또는 바이러스-유사 제제; 화학적-기반 형질감염 방법, 예컨대 인산칼슘, 덴드리머, 리포솜, 또는 양이온성 중합체 (예를 들면, DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민)를 사용하는 것들; 비-화학적 방법, 예컨대 미세주사, 전기천공, 세포 압착, 초음파천공, 광학적 형질감염, 관통감염, 원형질체 융합, 박테리아성 접합, 플라스미드 또는 트랜스포존의 전달; 입자-기반 방법, 예컨대 유전자 총, 자기감염 또는 자기 보조된 형질감염, 입자 충격 사용하기; 및 하이브리드 방법, 예컨대 핵감염. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA, RNA 가이드, 또는 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA 및 RNA 가이드를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA는 서열번호: 447 또는 서열번호: 481에 제시된 뉴클레오티드 서열의 전사체 또는 이들의 변이체이다. 일부 구현예에서, 본 출원은 이러한 방법에 의해 생산된 세포, 및 이러한 세포를 포함하거나 이로부터 생산된 유기체 (예컨대 동물, 식물, 또는 진균)를 추가로 제공한다.
D. 유전적으로 변형된 세포
본원에 개시된 유전자 편집 시스템 중 임의의 것은 다양한 세포에 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 단리된 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 세포 배양물 또는 둘 이상의 세포 유형의 공-배양물에 있다. 일부 구현예에서, 세포는 생체외이다. 일부 구현예에서, 세포는 살아있는 유기체로부터 수득되고 세포 배양물에서 유지된다. 일부 구현예에서, 세포는 단일-세포성 유기체이다.
일부 구현예에서, 세포는 원핵 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 박테리아성 세포이거나 박테리아성 세포에서 유래된다. 일부 구현예에서, 세포는 고세균 세포이거나 고세균 세포에서 유래된다.
일부 구현예에서, 세포는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 식물 세포이거나 식물 세포에서 유래된다. 일부 구현예에서, 세포는 진균성 세포이거나 진균성 세포에서 유래된다. 일부 구현예에서, 세포는 동물 세포이거나 동물 세포에서 유래된다. 일부 구현예에서, 세포는 무척추동물 세포이거나 무척추동물 세포에서 유래된다. 일부 구현예에서, 세포는 척추동물 세포이거나 척추동물 세포에서 유래된다. 일부 구현예에서, 세포는 포유류 세포이거나 포유류 세포에서 유래된다. 일부 구현예에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 제브라 피시 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 설치류 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 합성적으로 만들어져서, 때때로 인공 세포로 불린다.
일부 구현예에서, 세포는 세포주에서 유래된다. 조직 배양에 대하여 매우 다양한 세포주는 당업계에 알려진다. 세포주의 예는, 비제한적으로, 293T, MF7, K562, HeLa, CHO, 및 이들의 유전자이식 변종을 포함한다. 세포주는 당업자에 알려진 다양한 공급원으로부터 입수가능하다 (예를 들면, American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, Va.), 참조). 일부 구현예에서, 세포는 불멸 또는 불멸화된 세포이다.
일부 구현예에서, 세포는 1차 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 줄기 세포 예컨대 전분화 줄기 세포 (예를 들면, 전능성), 만능성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 협능성 줄기 세포, 또는 단능성 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 유도된 만능성 줄기 세포 (iPSC)이거나 iPSC에서 유래된다. 일부 구현예에서, 세포는 분화된 세포이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 분화된 세포는 신경 세포 (예를 들면, 신경아교 세포, 예컨대 성상교 세포, 희소돌기아교 세포, 소교 세포, 또는 뇌실막 세포, 또는 뉴런), 근육 세포 (예를 들면, 근세포), 지방 세포 (예를 들면, 지방세포), 뼈 세포 (예를 들면, 조골세포, 골세포, 파골세포), 혈액 세포 (예를 들면, 단핵구, 림프구, 호중구, 호산구, 호염기구, 대식세포, 적혈구, 또는 혈소판), 상피 세포, 면역 세포 (예를 들면, 림프구, 호중구, 단핵구, 또는 대식세포), 간 세포 (예를 들면, 간세포), 섬유아세포, 또는 성 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 말기 분화된 세포이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 말기 분화된 세포는 뉴런성 세포, 지방세포, 심근세포, 골격근 세포, 표피 세포, 또는 장 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 B 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 자연 살해 (NK) 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 종양 침윤 림프구 (TIL)이다. 일부 구현예에서, 세포는 암 세포 (예를 들면, 결장직장암 세포, 신장 세포 암 세포, 유방암 세포, 또는 신경교종 세포)이다. 일부 구현예에서, 세포는 포유류 세포, 예를 들면, 인간 세포 또는 뮤린 세포이다. 일부 구현예에서, 뮤린 세포는 야생형 마우스, 면역억압된 마우스, 또는 질환-특이적 마우스 모델에서 유래된다. 일부 구현예에서, 세포는 살아있는 조직, 기관, 또는 유기체 내에서 세포이다.
본원에 개시된 유전자 편집 시스템 중 임의의 것을 사용하여 생산된 유전적으로 변형된 세포 중 임의의 것은 또한 본 개시내용의 범위 내이다. 이러한 변형된 세포는 파괴된 STMN2 유전자를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 유전자 편집 시스템, 이를 포함하는 조성물, 벡터, 핵산, RNA 가이드 및 세포 중 임의의 것은 요법에서 사용될 수 있다. 본원에 개시된 유전자 편집 시스템, 조성물, 벡터, 핵산, RNA 가이드 및 세포는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법에서 사용될 수 있다. 당업계에 알려진 임의의 적합한 전달 또는 투여 방법은 본원에 개시된 조성물, 벡터, 핵산, RNA 가이드 및 세포를 전달하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 본원에 개시된 조성물, 벡터, 핵산, 또는 RNA 가이드와 표적 서열을 접촉하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 본원에 개시된 대로 STMN2 서열을 편집하는 방법을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 RNA 가이드를 사용하여 조작된 세포는 생체외 유전자 요법에 사용된다.
IV. 치료적 응용
본원에 개시된 대로 이러한 유전자 편집 시스템을 사용하여 생성된 유전자 편집 시스템 또는 변형된 세포 중 임의의 것은 STMN2 유전자와 연관되는 질환, 예를 들어, 신경퇴행성 질환 (예를 들면, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTD)) 치료하기에 사용될 수 있다. 당업계에 알려진 임의의 적합한 전달 또는 투여 방법은 본원에 개시된 조성물, 벡터, 핵산, RNA 가이드 및 세포를 전달하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 본원에 개시된 조성물, 벡터, 핵산, 또는 RNA 가이드와 표적 서열을 접촉하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 본원에 개시된 대로 STMN2 서열을 편집하는 방법을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 RNA 가이드를 사용하여 조작된 세포는 생체외 유전자 요법에 사용된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 유전자 편집 시스템 중 임의의 것의 치료를 필요로 하는 대상체 (예를 들면, 인간 환자)에게 투여하는 것을 포함하는 본원에 개시된 대로 표적 질환 (예를 들면, 신경퇴행성 질환)을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 유전자 편집 시스템은 유전자 편집이 필요한 특정 조직 또는 특정 유형의 세포에 전달될 수 있다. 유전자 편집 시스템은 구성요소 중 하나 이상, 구성요소 중 하나 이상을 인코딩하는 하나 이상의 벡터 (예를 들면, 바이러스성 벡터), 또는 이들의 조합을 포괄하는 LNP를 포함할 수 있다. 유전자 편집 시스템의 구성요소는, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는, 약학적 조성물을 형성하기 위해 제형화될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 유전자 편집 시스템 중 임의의 것을 사용하여 생산된 변형된 세포는 치료를 필요로 하는 대상체 (예를 들면, 인간 환자)에게 투여될 수 있다. 변형된 세포는 본원에 기재된 치환, 삽입, 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 변형된 세포는 CRISPR 뉴클레아제, 역전사효소 폴리펩티드, 및 편집 템플레이트 RNA (예를 들면, RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA)에 의해 변형된 세포주를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 변형된 세포는 상이한 유형의 유전자 편집이 있는 세포를 포함하는 이질 집단일 수 있다. 대안적으로, 변형된 세포는 STMN2 유전자에서 하나의 특정한 유전자 편집을 포함하는 실질적으로 균질 세포 집단 (예를 들면, 전체 집단에서 세포의 적어도 80%)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 세포는 적합한 배지에서 현탁될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템 또는 이의 구성요소를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 이러한 조성물은 약학적 조성물일 수 있다. 유용한 약학적 조성물은 경구, 직장, 질, 비경구, 국부, 폐, 비강내, 병변내, 협측, 안과, 정맥내, 기관내 또는 또 다른 루트의 투여에 적합한 제형으로 제조, 패키징, 또는 판매될 수 있다. 본 개시내용의 약학적 조성물은 단일 단위 용량으로서, 또는 복수의 단일 단위 용량으로서 벌크로 제조, 패키징, 또는 판매될 수 있다. 본원에 사용된 경우에, "단위 용량"은 대상체에게 투여될, 약학적 조성물 (예를 들면, 유전자 편집 시스템 또는 이의 구성요소)의 별개의 양 또는 이러한 투약량의 편리한 분수, 예컨대, 예를 들어, 이러한 투약량의 1/2 또는 1/3이다.
비경구 투여에 적합한 약학적 조성물의 제형은 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 멸균수 또는 멸균 등장성 식염수와 조합된 활성 제제 (예를 들면, 유전자 편집 시스템 또는 이의 구성요소 또는 변형된 세포)를 포함할 수 있다. 이러한 제형은 볼루스 투여에 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조, 패키징, 또는 판매될 수 있다. 일부 주사가능한 제형은 단위 투약량 형태로, 예컨대 앰풀로 또는 보존제를 함유하는 다용량 컨테이너로 제조, 패키징, 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여를 위한 일부 제형은, 비제한적으로, 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 중 에멀젼, 페이스트, 및 이식가능한 서방성 또는 생분해성 제형을 포함한다. 일부 제형은, 비제한적으로, 현탁화, 안정화, 또는 분산화 제제를 포함하는 하나 이상의 추가의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
약학적 조성물은 멸균 주사가능한 수성 또는 유성 현탁액 또는 용액의 형태일 수 있다. 이 현탁액 또는 용액은 알려진 기술분야에 따라 제형화될 수 있고, 세포 이외에도, 본원에 기재된 추가의 성분 예컨대 분산화 제제, 습윤화 제제, 또는 현탁화 제제를 포함할 수 있다. 이러한 멸균 주사가능한 제형은 비-독성 경구로-허용가능한 희석제 또는 용매, 예컨대 물 또는 식염수를 사용하여 제조될 수 있다. 기타 허용가능한 희석제 및 용매는, 비제한적으로, 링거액, 등장성 염화나트륨 용액, 및 고정유 예컨대 합성 모노- 또는 디-글리세리드를 포함한다. 유용한 기타 경구로-투여가능한 제형은 세포를 패키징된 형태로, 리포솜성 제조물로, 또는 생분해성 중합체 시스템의 구성요소로서 포함할 수 있는 것들을 포함한다. 지속된 방출 또는 이식을 위한 일부 조성물은 약학적으로 허용가능한 중합체성 또는 소수성 재료 예컨대 에멀젼, 이온 교환 수지, 난용성 중합체, 또는 난용성 염을 포함할 수 있다.
V. 키트 및 이의 용도
본 개시내용은 또한, 예를 들어, STMN2 유전자의 유전적 변형을 위하여 본원에 기재된 방법을 실시하는데 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 RNA 가이드, 템플레이트 DNA, 및 Cas12i 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 이러한 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 임의로 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 본원에 기재된 대로 벡터 내에서 포함된다. 일부 구현예에서, 키트는 본원에 개시된 RNA 가이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. Cas12i 폴리펩티드 (또는 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드) 및 (예를 들면, 리보핵단백질로서) RNA 가이드는 키트 내에서 동일하거나 다른 용기 내에 패키징될 수 있거나, 이의 내용물이 사용 전에 혼합될 수 있는, 별도 바이알 또는 기타 용기에서 패키징될 수 있다.
Cas12i 폴리펩티드, RNA 가이드, 및 템플레이트 DNA는 키트 내에서 동일하거나 다른 용기 내에 패키징될 수 있거나, 이의 내용물이 사용 전에 혼합될 수 있는, 별도 바이알 또는 기타 용기에서 패키징될 수 있다. 키트는, 임의로, RNA 가이드, 템플레이트 DNA, 및 Cas12i 폴리펩티드의 사용을 위한 완충액 및/또는 지침을 추가적으로 포함할 수 있다.
본원에 인용된 모든 참고문헌 및 간행물은 이로써 참조로 편입된다.
추가의 구현예
또한 본 개시내용의 범위 내에 있는 추가의 구현예가 아래 제공된다.
구현예 1: RNA 가이드를 포함하는 조성물로서, 여기서 RNA 가이드는 (i) STMN2 유전자 내에서 비-PAM 가닥 (표적 서열의 상보적 서열) 상의 영역에 실질적으로 상보적 또는 완전 상보적인 스페이서 서열 및 (ii) 직접 반복 서열을 포함하며; 여기서 표적 서열은 서열 5'-NTTN-3'를 포함하는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 인접한, 조성물.
구현예 1에서, 표적 서열은 STMN2 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 또는 인트론 내에 있을 수 있다. 일부 예에서, STMN2 유전자는 서열번호: 454의 서열, 서열번호: 454의 역 보체, 서열번호: 454의 변이체, 또는 서열번호: 454의 변이체의 역 보체를 포함한다.
구현예 1에서, 스페이서 서열은 다음을 포함할 수 있다: (a) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 16; (b) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 17; (c) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 18; (d) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 19; I 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 20; (f) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 21; (g) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 22; (h) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 23; (i) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 24; (j) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 25; (k) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 26; (l) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 27; (m) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 28; (n) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 29; 또는 (o) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 30.
구현예 1의 조성물의 임의의 것에서, 스페이서 서열은 다음을 포함할 수 있다: (a) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 16; (b) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 17; (c) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 18; (d) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 19; (e) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 20; (f) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 21; (g) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 22; (h) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 23; (i) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 24; (j) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 25; (k) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 26; (l) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 27; (m) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 28; (n) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 29; 또는 (o) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 30.
구현예 1의 조성물의 임의의 것에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함할 수 있다: (a) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; (o) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 34; (p) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 34; (q) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 34; (r) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 34; (s) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 34; (t) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 34; (u) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 34; (v) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 34; (w) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 34; (x) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 34; (y) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 34; (z) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 34; 또는 (aa) 서열번호: 10 또는 이의 한 부문의 서열과 적어도 90% 동일한 서열.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; (o) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 34; (p) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 34; (q) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 34; (r) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 34; (s) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 34; (t) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 34; (u) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 34; (v) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 34; (w) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 34; (x) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 34; (y) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 34; (z) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 34; 또는 (aa) 서열번호: 10 또는 이의 한 부문.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; 또는 (o) 서열번호: 480 또는 이의 한 부문의 서열과 적어도 90% 동일한 서열.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; 또는 (o) 서열번호: 480 또는 이의 한 부문.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; 또는 (o) 서열번호: 486 또는 서열번호: 487 또는 이의 한 부문의 서열과 적어도 90% 동일한 서열.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; 또는 (o) 서열번호: 486 또는 서열번호: 487 또는 이의 한 부문.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; (o) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 15 내지 뉴클레오티드 36; 또는 (p) 서열번호: 490 또는 이의 한 부문의 서열과 적어도 90% 동일한 서열.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; (o) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 15 내지 뉴클레오티드 36; 또는 (p) 서열번호: 490 또는 이의 한 부문.
일부 예에서, 스페이서 서열은 서열번호: 11-228 또는 491-2496 중 어느 하나의 서열의 보체와 실질적으로 상보적이다.
구현예 1의 조성물의 임의의 것에서, PAM은 서열 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3'를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 표적 서열은 PAM 서열에 바로 인접한다.
일부 예에서, RNA 가이드는 서열번호: 4505-4562 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 갖는다.
일부 예에서, RNA 가이드는 서열번호: 4505-4562 중 어느 하나의 서열을 갖는다.
구현예 2: 구현예 1의 조성물은, 하기 중 하나일 수 있는, Cas12i 폴리펩티드 또는 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리리보뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다: (a) 서열번호: 448, 서열번호: 449, 서열번호: 450, 서열번호: 451, 서열번호: 452, 또는 서열번호: 453의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 Cas12i2 폴리펩티드; (b) 서열번호: 482, 서열번호: 483, 또는 서열번호: 484의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 Cas12i4 폴리펩티드; (c) 서열번호: 4503의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 Cas12i1 폴리펩티드; 또는 (d) 서열번호: 4504의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 Cas12i3 폴리펩티드.
특정 예에서, Cas12i 폴리펩티드는 다음이다: (a) 서열번호: 448, 서열번호: 449, 서열번호: 450, 서열번호: 451, 서열번호: 452, 또는 서열번호: 453의 서열을 포함하는 Cas12i2 폴리펩티드; (b) 서열번호: 482, 서열번호: 483, 또는 서열번호: 484의 서열을 포함하는 Cas12i4 폴리펩티드; (c) 서열번호: 4503의 서열을 포함하는 Cas12i1 폴리펩티드; 또는 (d) 서열번호: 4504의 서열을 포함하는 Cas12i3 폴리펩티드.
구현예 2의 조성물의 임의의 것에서, RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드는 리보핵단백질 복합체를 형성할 수 있다. 일부 예에서, 리보핵단백질 복합체는 표적 핵산을 결합시킨다. 일부 예에서, 조성물은 세포 내에서 존재한다.
구현예 2의 조성물의 임의의 것에서, RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드는 벡터, 예를 들면, 발현 벡터에서 인코딩될 수 있다. 일부 예에서, RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드는 단일 벡터에서 인코딩된다. 다른 예에서, RNA 가이드는 제1 벡터에서 인코딩되고 Cas12i 폴리펩티드는 제2 벡터에서 인코딩된다.
구현예 3: 본원에 개시된 RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템. 일부 예에서, 벡터 시스템은 본원에 개시된 RNA 가이드를 인코딩하는 제1 벡터 및 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 벡터를 포함한다. 벡터는 발현 벡터일 수 있다.
구현예 4: RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드를 포함하는 조성물로서, 여기서 RNA 가이드는 (i) STMN2 유전자 내에서 비-PAM 가닥 상의 영역에 실질적으로 상보적 또는 완전히 상보적인 스페이서 서열 (표적 서열의 상보적 서열), 및 (ii) 직접 반복 서열을 포함하는, 조성물.
일부 예에서, 표적 서열은, 서열번호: 454의 서열, 서열번호: 454의 역 보체, 서열번호: 454의 서열의 변이체, 또는 서열번호: 454의 변이체의 역 보체를 포함할 수 있는, STMN2 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 또는 인트론 내에 있다.
일부 예에서, 스페이서 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 16; (b) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 17; (c) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 18; (d) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 19; (e) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 20; (f) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 21; (g) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 22; (h) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 23; (i) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 24; (j) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 25; (k) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 26; (l) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 27; (m) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 28; (n) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 29; 또는 (o) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 30.
일부 예에서, 스페이서 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 16; (b) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 17; (c) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 18; (d) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 19; (e) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 20; (f) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 21; (g) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 22; (h) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 23; (i) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 24; (j) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 25; (k) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 26; (l) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 27; (m) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 28; (n) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 29; 또는 (o) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 30.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; (o) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 34; (p) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 34; (q) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 34; (r) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 34; (s) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 34; (t) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 34; (u) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 34; (v) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 34; (w) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 34; (x) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 34; (y) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 34; (z) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 34; 또는 (aa) 서열번호: 10 또는 이의 한 부문의 서열과 적어도 90% 동일한 서열.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; (o) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 34; (p) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 34; (q) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 34; (r) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 34; (s) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 34; (t) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 34; (u) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 34; (v) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 34; (w) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 34; (x) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 34; (y) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 34; (z) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 34; 또는 (aa) 서열번호: 10 또는 이의 한 부문.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; 또는 (o) 서열번호: 480 또는 이의 한 부문의 서열과 적어도 90% 동일한 서열.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; 또는 (o) 서열번호: 480 또는 이의 한 부문.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; 또는 (o) 서열번호: 486 또는 서열번호: 487 또는 이의 한 부문의 서열과 적어도 90% 동일한 서열.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; 또는 (o) 서열번호: 486 또는 서열번호: 487 또는 이의 한 부문.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; (o) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 15 내지 뉴클레오티드 36; 또는 (p) 서열번호: 490 또는 이의 한 부문의 서열과 적어도 90% 동일한 서열.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; (o) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 15 내지 뉴클레오티드 36; 또는 (p) 서열번호: 490 또는 이의 한 부문.
구현예 4의 조성물의 임의의 것에서, 스페이서 서열은 서열번호: 11-228 또는 491-2496 중 어느 하나의 서열의 보체와 실질적으로 상보적일 수 있다.
일부 예에서, 표적 서열은 서열 5'-NTTN-3'를 포함하는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 인접한다. 일부 예에서, PAM은 서열 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3'를 포함한다.
일부 예에서, 표적 서열은 PAM 서열에 바로 인접한다. 일부 예에서, 표적 서열은 PAM 서열의 1, 2, 3, 4, 또는 5개 뉴클레오티드 내에 있다.
구현예 4의 조성물의 임의의 것에서, Cas12i 폴리펩티드는 다음이다: (a) 서열번호: 448, 서열번호: 449, 서열번호: 450, 서열번호: 451, 서열번호: 452, 또는 서열번호: 453의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 Cas12i2 폴리펩티드; (b) 서열번호: 482, 서열번호: 483, 또는 서열번호: 484의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 Cas12i4 폴리펩티드; (c) 서열번호: 4503의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 Cas12i1 폴리펩티드; 또는 (d) 서열번호: 4504의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 Cas12i3 폴리펩티드.
일부 예에서, Cas12i 폴리펩티드는 다음이다: (a) 서열번호: 448, 서열번호: 449, 서열번호: 450, 서열번호: 451, 서열번호: 452, 또는 서열번호: 453의 서열을 포함하는 Cas12i2 폴리펩티드; (b) 서열번호: 482, 서열번호: 483, 또는 서열번호: 484의 서열을 포함하는 Cas12i4 폴리펩티드; (c) 서열번호: 4503의 서열을 포함하는 Cas12i1 폴리펩티드; 또는 (d) 서열번호: 4504의 서열을 포함하는 Cas12i3 폴리펩티드.
구현예 4의 조성물의 임의의 것에서, RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드는 리보핵단백질 복합체를 형성할 수 있다. 일부 예에서, 리보핵단백질 복합체는 표적 핵산을 결합시킨다.
구현예 4의 조성물의 임의의 것에서, 조성물은 세포 내에서 존재할 수 있다.
구현예 4의 조성물의 임의의 것에서, RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드는 벡터, 예를 들면, 발현 벡터에서 인코딩될 수 있다. 일부 예에서, RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드는 단일 벡터에서 인코딩된다. 다른 예에서, RNA 가이드는 제1 벡터에서 인코딩되고 Cas12i 폴리펩티드는 제2 벡터에서 인코딩된다.
구현예 5: 본원에 개시된 RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템. 일부 예에서, 벡터 시스템은 본원에 개시된 RNA 가이드를 인코딩하는 제1 벡터 및 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 벡터를 포함한다. 일부 예에서, 벡터는 발현 벡터이다.
구현예 6: (i) STMN2 유전자 내에서 비-PAM 가닥 상의 영역에 실질적으로 상보적 또는 완전히 상보적인 스페이서 서열 (표적 서열의 상보적 서열), 및 (ii) 직접 반복 서열을 포함하는 RNA 가이드.
일부 예에서, 표적 서열은, 서열번호: 454의 서열, 서열번호: 454의 역 보체, 서열번호: 454의 서열의 변이체, 또는 서열번호: 454의 변이체의 역 보체를 포함할 수 있는, STMN2 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 또는 인트론 내에 있다.
일부 예에서, 스페이서 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 16; (b) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 17; (c) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 18; (d) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 19; (e) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 20; (f) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 21; (g) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 22; (h) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 23; (i) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 24; (j) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 25; (k) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 26; (l) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 27; (m) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 28; (n) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 29; 또는 (o) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 30.
일부 예에서, 스페이서 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 16; (b) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 17; (c) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 18; (d) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 19; (e) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 20; (f) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 21; (g) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 22; (h) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 23; (i) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 24; (j) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 25; (k) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 26; (l) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 27; (m) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 28; (n) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 29; 또는 (o) 서열번호: 229-446 또는 2497-4502 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 30.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; (o) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 34; (p) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 34; (q) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 34; (r) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 34; (s) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 34; (t) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 34; (u) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 34; (v) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 34; (w) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 34; (x) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 34; (y) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 34; (z) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 34; 또는 (aa) 서열번호: 10 또는 이의 한 부문의 서열과 적어도 90% 동일한 서열.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; (o) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 34; (p) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 34; (q) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 34; (r) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 34; (s) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 34; (t) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 34; (u) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 34; (v) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 34; (w) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 34; (x) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 34; (y) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 34; (z) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 34; 또는 (aa) 서열번호: 10 또는 이의 한 부문.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; 또는 (o) 서열번호: 480 또는 이의 한 부문의 서열과 적어도 90% 동일한 서열.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36f; (m) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; 또는 (o) 서열번호: 480 또는 이의 한 부문.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; 또는 (o) 서열번호: 486 또는 서열번호: 487 또는 이의 한 부문의 서열과 적어도 90% 동일한 서열.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; 또는 (o) 서열번호: 486 또는 서열번호: 487 또는 이의 한 부문.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; (o) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 15 내지 뉴클레오티드 36; 또는 (p) 서열번호: 490 또는 이의 한 부문의 서열과 적어도 90% 동일한 서열.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; (o) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 15 내지 뉴클레오티드 36; 또는 (p) 서열번호: 490 또는 이의 한 부문.
구현예 6의 RNA 가이드의 임의의 것에서, 스페이서 서열은 서열번호: 11-228 또는 491-2496 중 어느 하나의 서열의 보체와 실질적으로 상보적일 수 있다.
구현예 6의 RNA 가이드의 임의의 것에서, 표적 서열은 서열 5'-NTTN-3'를 포함하는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 인접할 수 있고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 예에서, PAM은 서열 5'-ATTA-3', 5'-ATTT-3', 5'-ATTG-3', 5'-ATTC-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTTT-3', 5'-TTTG-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTG-3', 5'-GTTC-3', 5'-CTTA-3', 5'-CTTT-3', 5'-CTTG-3', 또는 5'-CTTC-3'를 포함한다.
일부 예에서, 표적 서열은 PAM 서열에 바로 인접한다. 다른 예에서, 표적 서열은 PAM 서열의 1, 2, 3, 4, 또는 5개 뉴클레오티드 내에 있다.
일부 예에서, RNA 가이드는 서열번호: 4505-4562 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 갖는다. 특정 예에서, RNA 가이드는 서열번호: 4505-4562 중 어느 하나의 서열을 갖는다.
구현예 7: 본원에 기재된 대로 RNA 가이드를 인코딩하는 핵산.
구현예 8: 본원에 기재된 대로 이러한 RNA 가이드를 포함하는 벡터.
구현예 9: 본원에 기재된 대로 조성물, RNA 가이드, 핵산, 또는 벡터를 포함하는 세포. 일부 예에서, 세포는 진핵 세포, 동물 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 1차 세포, 세포주, 줄기 세포, 뉴런, 또는 T 세포이다.
구현예 10: 본원에 기재된 대로 조성물, RNA 가이드, 핵산, 또는 벡터를 포함하는 키트.
구현예 11: STMN2 서열을 편집하는 방법으로서, 본원에 기재된 대로 조성물 또는 RNA 가이드와 STMN2 서열을 접촉하는 것을 포함하는 방법. 일부 예에서, 본 방법은 시험관내 실시된다. 다른 예에서, 본 방법은 생체외 실시된다.
일부 예에서, STMN2 서열은 세포에 있다.
일부 예에서, 조성물 또는 RNA 가이드는 STMN2 서열에서 결실을 유도한다. 일부 예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열에 인접하고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 특정 예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 다운스트림이다. 일부 특정 예에서, 결실은 길이가 최대 약 40개 뉴클레오티드이다. 일부 경우에서, 결실은 길이가 약 4개 뉴클레오티드 내지 40개 뉴클레오티드, 약 4개 뉴클레오티드 내지 25개 뉴클레오티드, 약 10개 뉴클레오티드 내지 25개 뉴클레오티드, 또는 약 10개 뉴클레오티드 내지 15개 뉴클레오티드이다.
일부 예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 5개 뉴클레오티드 내지 약 15개 뉴클레오티드, 약 5개 뉴클레오티드 내지 약 10개 뉴클레오티드, 또는 약 10개 뉴클레오티드 내지 약 15개 뉴클레오티드 내에서 시작한다.
일부 예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 5개 뉴클레오티드 내지 약 15개 뉴클레오티드, 약 5개 뉴클레오티드 내지 약 10개 뉴클레오티드, 또는 약 10개 뉴클레오티드 내지 약 15개 뉴클레오티드 다운스트림 내에서 시작한다.
일부 예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 20개 뉴클레오티드 내지 약 30개 뉴클레오티드, 약 20개 뉴클레오티드 내지 약 25개 뉴클레오티드, 또는 약 25개 뉴클레오티드 내지 약 30개 뉴클레오티드 내에서 종료한다.
일부 예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 20개 뉴클레오티드 내지 약 30개 뉴클레오티드, 약 20개 뉴클레오티드 내지 약 25개 뉴클레오티드, 약 25개 뉴클레오티드 내지 약 30개 뉴클레오티드 다운스트림 내에서 종료한다.
일부 예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 5개 뉴클레오티드 내지 약 15개 뉴클레오티드 다운스트림 내에서 시작하고 5'-NTTN-3' 서열의 약 20개 뉴클레오티드 내지 약 30개 뉴클레오티드 다운스트림 내에서 종료한다.
일부 예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 5개 뉴클레오티드 내지 약 15개 뉴클레오티드 다운스트림 내에서 시작하고 5'-NTTN-3' 서열의 약 20개 뉴클레오티드 내지 약 25개 뉴클레오티드 다운스트림 내에서 종료한다.
일부 예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 5개 뉴클레오티드 내지 약 15개 뉴클레오티드 다운스트림 내에서 시작하고 5'-NTTN-3' 서열의 약 25개 뉴클레오티드 내지 약 30개 뉴클레오티드 다운스트림 내에서 종료한다.
일부 예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 5개 뉴클레오티드 내지 약 10개 뉴클레오티드 다운스트림 내에서 시작하고 5'-NTTN-3' 서열의 약 20개 뉴클레오티드 내지 약 30개 뉴클레오티드 다운스트림 내에서 종료한다.
일부 예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 5개 뉴클레오티드 내지 약 10개 뉴클레오티드 다운스트림 내에서 시작하고 5'-NTTN-3' 서열의 약 20개 뉴클레오티드 내지 약 25개 뉴클레오티드 다운스트림 내에서 종료한다.
일부 예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 5개 뉴클레오티드 내지 약 10개 뉴클레오티드 다운스트림 내에서 시작하고 5'-NTTN-3' 서열의 약 25개 뉴클레오티드 내지 약 30개 뉴클레오티드 다운스트림 내에서 종료한다.
일부 예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 10개 뉴클레오티드 내지 약 15개 뉴클레오티드 다운스트림 내에서 시작하고 5'-NTTN-3' 서열의 약 20개 뉴클레오티드 내지 약 30개 뉴클레오티드 다운스트림 내에서 종료한다.
일부 예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 10개 뉴클레오티드 내지 약 15개 뉴클레오티드 다운스트림 내에서 시작하고 5'-NTTN-3' 서열의 약 20개 뉴클레오티드 내지 약 25개 뉴클레오티드 다운스트림 내에서 종료한다.
일부 예에서, 결실은 5'-NTTN-3' 서열의 약 10개 뉴클레오티드 내지 약 15개 뉴클레오티드 다운스트림 내에서 시작하고 5'-NTTN-3' 서열의 약 25개 뉴클레오티드 내지 약 30개 뉴클레오티드 다운스트림 내에서 종료한다.
일부 예에서, 5'-NTTN-3' 서열은 5'-CTTT-3', 5'-CTTC-3', 5'-GTTT-3', 5'-GTTC-3', 5'-TTTC-3', 5'-GTTA-3', 또는 5'-GTTG-3'이다.
일부 예에서, 결실은 STMN2 서열에서 돌연변이와 중첩한다. 일부 경우에서, 결실은 STMN2 서열에서 삽입과 중첩한다. 일부 경우에서, 결실은 STMN2 서열 또는 이의 한 부문의 반복 확장을 제거한다. 일부 경우에서, 결실은 STMN2 서열의 한쪽 또는 양쪽 대립유전자를 파괴한다.
본원에 기재된 구현예 1-11의 조성물, RNA 가이드, 핵산, 벡터, 세포, 키트, 또는 방법 중 임의의 것에서, RNA 가이드는 서열번호: 4505-4562 중 어느 하나의 서열을 포함할 수 있다.
구현예 12: 대상체에서 신경퇴행성 질환 (예를 들면, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTD))를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 본원에 기재된 조성물, RNA 가이드, 또는 세포를 투여하는 것을 포함하는 방법.
본원에 기재된 조성물, RNA 가이드, 세포, 키트, 또는 방법 중 임의의 것에서, RNA 가이드 및/또는 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리리보뉴클레오티드는 지질 나노입자 내에서 포함된다. 일부 예에서, RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리리보뉴클레오티드는 동일한 지질 나노입자 내에서 포함된다. 다른 예에서, RNA 가이드 및 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리리보뉴클레오티드는 별도 지질 나노입자 내에서 포함된다.
구현예 13: (i) STMN2 유전자 내에서 표적 부위에 상보적인 스페이서 서열 (표적 부위는 비-PAM 가닥 상에 있고 표적 서열에 상보적임), 및 (ii) 직접 반복 서열을 포함하는 RNA 가이드.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; (o) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 34; (p) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 34; (q) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 34; (r) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 34; (s) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 34; (t) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 34; (u) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 34; (v) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 34; (w) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 34; (x) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 34; (y) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 34; (z) 서열번호: 9의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 34; 또는 (aa) 서열번호: 10 또는 이의 한 부문의 서열과 적어도 90% 동일한 서열.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 1-8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; (o) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 34; (p) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 34; (q) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 34; (r) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 34; (s) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 34; (t) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 34; (u) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 34; (v) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 34; (w) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 34; (x) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 34; (y) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 34; (z) 서열번호: 9의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 34; 또는 (aa) 서열번호: 10 또는 이의 한 부문.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; 또는 (o) 서열번호: 480 또는 이의 한 부문의 서열과 적어도 90% 동일한 서열.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 462-479 중 어느 하나의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; 또는 (o) 서열번호: 480 또는 이의 한 부문.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 485와 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; 또는 (o) 서열번호: 486 또는 서열번호: 487 또는 이의 한 부문의 서열과 적어도 90% 동일한 서열.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 485의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; 또는 (o) 서열번호: 486 또는 서열번호: 487 또는 이의 한 부문.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; (o) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 서열과 적어도 90% 동일한 서열의 뉴클레오티드 15 내지 뉴클레오티드 36; 또는 (p) 서열번호: 490 또는 이의 한 부문의 서열과 적어도 90% 동일한 서열.
일부 예에서, 직접 반복 서열은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 36; (b) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 2 내지 뉴클레오티드 36; (c) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 3 내지 뉴클레오티드 36; (d) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 4 내지 뉴클레오티드 36; (e) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 5 내지 뉴클레오티드 36; (f) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 6 내지 뉴클레오티드 36; (g) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 7 내지 뉴클레오티드 36; (h) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 8 내지 뉴클레오티드 36; (i) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 9 내지 뉴클레오티드 36; (j) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 36; (k) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 11 내지 뉴클레오티드 36; (l) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 12 내지 뉴클레오티드 36; (m) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 36; (n) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 36; (o) 서열번호: 488 또는 서열번호: 489의 뉴클레오티드 15 내지 뉴클레오티드 36; 또는 (p) 서열번호: 490 또는 이의 한 부문.
일부 예에서, RNA 가이드의 처음 3개 뉴클레오티드의 각각은 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 변형을 포함한다.
일부 예에서, RNA 가이드의 마지막 4개 뉴클레오티드의 각각은 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 변형을 포함한다.
일부 예에서, RNA 가이드의 처음 내지 마지막, 두번째 내지 마지막, 및 세번째 내지 마지막 뉴클레오티드의 각각은 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 변형을 포함하고, 여기서 RNA 가이드의 마지막 뉴클레오티드는 미변형된다.
구현예 14: 본원에 기재된 대로 RNA 가이드를 인코딩하는 핵산.
구현예 15: 본원에 기재된 대로 핵산을 포함하는 벡터.
구현예 16: (i) 본원에 기재된 대로 구현예 13의 RNA 가이드 및 (ii) Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템. 일부 예에서, 벡터 시스템은 RNA 가이드를 인코딩하는 제1 벡터 및 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 벡터를 포함한다.
구현예 17: 본원에 기재된 대로 구현예 13-16의 RNA 가이드, 핵산, 벡터, 또는 벡터 시스템을 포함하는 세포. 일부 예에서, 세포는 진핵 세포, 동물 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 1차 세포, 세포주, 줄기 세포, 뉴런, 또는 T 세포이다.
구현예 18: 본원에 기재된 대로 구현예 13-16의 RNA 가이드, 핵산, 벡터, 또는 벡터 시스템을 포함하는 키트.
구현예 19: STMN2 서열을 편집하는 방법으로서, 본원에 기재된 대로 구현예 13의 RNA 가이드와 STMN2 서열을 접촉시키는 것을 포함하는 방법. 일부 예에서, STMN2 서열은 세포에 있다.
일부 예에서, RNA 가이드는 STMN2 서열에서 인델 (예를 들면, 삽입 또는 결실)을 유도한다.
구현예 20: 대상체에서 신경퇴행성 질환 (예를 들면, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTD))을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 본원에 기재된 대로 구현예 13의 RNA 가이드를 투여하는 것을 포함하는 방법.
일반 기법
본 개시내용의 실행은, 달리 표시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 분자 생물학 (재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 및 면역학의 종래 기법을 이용할 것이다. 이러한 기법은 문헌, 예컨대 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판 (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds. 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds. 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995); DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985>>; Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984>>; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986>>; Immobilized Cells and Enzymes (lRL Press, (1986>>; 및 B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.)에서 충분히 설명된다.
추가 설명 없이도, 당업자가, 위의 설명에 기초하여, 본 개시내용을 최대한 활용할 수 있음이 믿어진다. 하기 특정 구현예는, 그러므로, 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하며, 어떠한 방식으로든 본 개시내용의 나머지 부분을 제한하는 것은 아니다. 본원에 인용된 모든 간행물은 본원에 참조된 목적 또는 주제에 대하여 참조로 편입된다.
실시예
하기 실시예는 본 개시내용의 일부 구현예를 추가로 예시하기 위해 제공되지만 본 개시내용의 범위를 제한하려는 의도는 아니고; 당업자에 알려진 기타 절차, 방법론, 또는 기법이 대안적으로 사용될 수 있음이 그들의 예시적 성격에 의해 이해될 것이다.
실시예 1 - 변이체 Cas12i2에 의한 STMN2 인트론의 표적화
본 실시예는 변이체 Cas12i2 (서열번호: 450) 및 RNA 가이드에 대하여 코딩하는 플라스미드로 형질감염후 세포내 STMN2 유전자에서 다중 표적에 관한 인델 평가를 설명한다.
변이체 Cas12i2 폴리펩티드를 CMV 프로모터를 포함하는 플라스미드에 클로닝한다. STMN2 인트론 1 유전자를 표적화하는 RNA 가이드에 대하여 코딩하는 단편을 pUC19 백본 (New England Biolabs)에 클로닝하였다. 플라스미드를 그 다음 최대-준비하였고 희석하였다. crRNA, 표적, 및 PAM 서열을 표 6에 나열한다.
형질감염 대략 16 시간 전에, DMEM/10%FBS+Pen/Strep (D10 배지) 중 25,000개 HEK293T 세포를 96-웰 플레이트의 각 웰에 플레이팅하였다. 형질감염의 당일에, 세포는 70-90% 융합성이었다. 형질감염되어야 하는 각 웰에 대하여, LIPOFECTAMINE® 2000 형질감염 시약 (ThermoFisher) 및 Opti-MEM® 감소된 혈청 배지 (ThermoFisher)의 혼합물을 제조하였고 실온에서 5 분 동안 인큐베이션하였다 (용액 1). 인큐베이션후, LIPOFECTAMINE® 2000:Opti-MEM® (형질감염 시약 (ThermoFisher): 감소된 혈청 배지 (ThermoFisher)) 혼합물을 뉴클레아제 플라스미드, RNA 가이드 플라스미드, 및 Opti-MEM® 감소된 혈청 배지 (ThermoFisher)를 함유하는 별도 혼합물에 첨가하였다 (용액 2). 음성 대조군의 경우에, RNA 가이드 플라스미드를 용액 2에 포함하지 않았다. 용액 1 및 2를 8 회 피펫 혼합하였고, 그 다음 실온에서 25 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 이후, 용액 1 및 2 혼합물을 세포를 함유하는 96-웰 플레이트의 각 웰에 적가하였다. 형질감염 72 시간후, 세포를 각 웰의 중심에 TRYPLETM (재조합 세포-해리 효소; ThermoFisher)을 첨가하고 37℃에서 대략 5 분 동안 인큐베이션함으로써 트립신화하였다. D10 배지를 그 다음 각 웰에 첨가하였고 혼합하여 세포를 재현탁하였다. 재현탁된 세포를 10 분 동안 500 x g로 원심분리시켜 펠렛을 수득하였고, 상청액을 폐기하였다. QUICKEXTRACTTM (DNA 추출 용액; Lucigen) 추출 시약을 각 웰에 첨가하여 펠렛화된 세포를 용해하였다. 세포를 15 분 동안 65℃, 15 분 동안 68℃, 및 10 분 동안 98℃에 인큐베이션하였다.
NGS를 위한 샘플을 PCR의 2 라운드에 의해 제조하였다. 제1 라운드 (PCR1)를 사용하여 표적에 따른 특정 게놈성 영역을 증폭하였다. 라운드 2 PCR (PCR2)를 수행하여 일루미나 어뎁터 및 지수를 첨가하였다. 반응을 그 다음 풀링하였고 컬럼 정제에 의해 정제하였다. 시퀀싱 실행을 300 주기 NEXTSEQTM (Illumina) 500/550 고출력 v2.5 키트로 실시하였다.
도 1에 도시된 대로, RNA 가이드 1, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 및 58 모두는, 무-RNA 가이드 대조군에 대하여 배경 비율보다 >1% 및 >0.2% 높은 것으로 정의된, 측정가능한 인델 활성을 초래하였다.
RNA 가이드 4, 8, 55, 및 57은 인트론 1에서 비밀 스플라이스 부위의 >15% 파괴를 초래하였고 (도 2a), 여기에서 파괴를 비밀 스플라이스 부위의 하나 이상의 염기에 삽입 또는 결실로서 정의한다. RNA 가이드 4에 의해 생성된 인델의 97%는 인트론 1내 비밀 스플라이스 부위의 파괴를 초래하였고, 여기에서 파괴를 비밀 스플라이스 부위의 하나 이상의 염기에 삽입 또는 결실로서 정의한다.
RNA 가이드 12, 46, 47, 48, 및 49는 인트론 1내 3개 TDP-43 결합 모티프 중 적어도 하나의 >15% 파괴를 초래하였고 (도 2b), 여기에서 파괴를 TDP-43 결합 모티프의 하나 이상의 염기에 삽입 또는 결실로서 정의한다. RNA 가이드 12에 의해 생성된 인델의 97%는 인트론 1내 3개 TDP-43 결합 모티프 중 적어도 하나의 파괴를 초래하였고, 여기에서 파괴를 TDP-43 결합 모티프의 하나 이상의 염기에 삽입 또는 결실로서 정의한다.
RNA 가이드 17 및 18은 인트론 1내 조기 폴리아데닐화 신호의 >15% 파괴를 초래하였고 (도 2c), 여기에서 파괴를 폴리아데닐화 신호의 하나 이상의 염기에 삽입 또는 결실로서 정의한다. RNA 가이드 17에 의해 생성된 인델의 88%는 인트론 1에 조기 폴리아데닐화 신호의 파괴를 초래하였고, 여기에서 파괴를 조기 폴리아데닐화 부위의 하나 이상의 염기에 삽입 또는 결실로서 정의한다. RNA 가이드 18에 의해 생성된 인델의 93%는 인트론 1에 조기 폴리아데닐화 신호의 파괴를 초래하였고, 여기에서 파괴를 조기 폴리아데닐화 부위의 하나 이상의 염기에 삽입 또는 결실로서 정의한다.
도 3은 RNA 가이드의 각각이 비밀 스플라이스 부위, TDP-43 결합 모티프, 및 조기 폴리아데닐화 신호의 위치에 비해 STMN2의 인트론 1을 결합시키는 위치를 묘사한다. 더 어두운 회색은 NGS 읽기의 30% 초과에서 인델을 증명하는 RNA 가이드를 반영하고, 더 밝은 회색은 NGS 읽기의 30% 미만에서 인델을 증명하는 RNA 가이드를 반영한다. 본 실시예는 그래서 Cas12i2 가이드가 STMN2의 인트론 1을 편집하였고 비밀 스플라이스 부위, TDP-43 결합 모티프, 및 조기 폴리아데닐화 신호를 파괴할 수 있었음을 보여준다.
실시예 2 - SH-SY%Y 세포에서 변이체 Cas12i2에 의한 STMN2 인트론 1의 표적화
본 실시예는 인트론 1의 비밀 스플라이스 부위를 표적화하는 RNA 가이드 및 변이체 Cas12i2 (서열번호: 450)에 대하여 코딩하는 플라스미드로 형질감염후 신경모세포종 세포주에서 STMN2 유전자에서의 다중 표적에 관한 인델 평가를 설명한다.
표 6의 변이체 Cas12i2 폴리펩티드 및 RNA 가이드 4, 5, 8, 9, 55, 56, 57, 및 58을 실시예 1에 기재된 대로 클로닝하였고, 정제하였고, 희석하였다. 형질감염 대략 16 시간 전에, EMEM:F12/10%FBS+Pen/Strep (EF12-10 배지) 중 25,000개 SH-SY5Y 세포를 96-웰 플레이트의 각 웰에 플레이팅하였다. 형질감염의 당일에, 세포는 70-90% 융합성이었다. 형질감염되어야 하는 각 웰에 대하여, LIPOFECTAMINE® 2000 형질감염 시약 (ThermoFisher) 및 Opti-MEM® 감소된 혈청 배지 (ThermoFisher)의 혼합물을 제조하였고 실온에서 5 분 동안 인큐베이션하였다 (용액 1). 인큐베이션후, LIPOFECTAMINE® 2000:Opti-MEM® (형질감염 시약 (ThermoFisher): 감소된 혈청 배지 (ThermoFisher)) 혼합물을 뉴클레아제 플라스미드, RNA 가이드 플라스미드, 및 Opti-MEM® 감소된 혈청 배지 (ThermoFisher)를 함유하는 별도 혼합물에 첨가하였다 (용액 2). 음성 대조군의 경우에, RNA 가이드 플라스미드를 용액 2에 포함하지 않았다. 용액 1 및 2를 8 회 피펫 혼합하였고, 그 다음 실온에서 25 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 이후, 용액 1 및 2 혼합물을 세포를 함유하는 96-웰 플레이트의 각 웰에 적가하였다. 형질감염 72 시간후, 세포를 각 웰의 중심에 TRYPLETM (재조합 세포-해리 효소; ThermoFisher)을 첨가하고 37℃에서 대략 5 분 동안 인큐베이션함으로써 트립신화하였다. EF12-10 배지를 그 다음 각 웰에 첨가하였고 혼합하여 세포를 재현탁하였다. 재현탁된 세포를 10 분 동안 500 x g로 원심분리시켜 펠렛을 수득하였고, 상청액을 폐기하였다. QUICKEXTRACTTM (DNA 추출 용액; Lucigen) 추출 시약을 각 웰에 첨가하여 펠렛화된 세포를 용해하였다. 세포를 15 분 동안 65℃, 15 분 동안 68℃, 및 10 분 동안 98℃에 인큐베이션하였다.
NGS를 위한 샘플을 PCR의 2 라운드에 의해 제조하였다. 제1 라운드 (PCR1)를 사용하여 표적에 따른 특정 게놈성 영역을 증폭하였다. 라운드 2 PCR (PCR2)를 수행하여 일루미나 어뎁터 및 지수를 첨가하였다. 반응을 그 다음 풀링하였고 컬럼 정제에 의해 정제하였다. 시퀀싱 실행을 300 주기 NEXTSEQTM (Illumina) 500/550 고출력 v2.5 키트로 실시하였다.
도 4는 SH-SY5Y 세포에서 테스트된 RNA 가이드의 인델 활성을 도시한다. 가이드 4는 0.56% 스플라이스 부위 모티프 파괴 및 2.0% 전반적 편집을 보여주었고; 총 편집의 25% 초과는 스플라이스 부위를 파괴하였다. 가이드 5는 0.12% 스플라이스 부위 모티프 파괴 및 1.5% 전반적 편집을 보여주었고; 총 편집의 10% 미만은 스플라이스 부위를 파괴하였다. 가이드 8은 0.62% 스플라이스 부위 모티프 파괴 및 2.4% 전반적 편집을 보여주었고; 총 편집의 25% 초과는 스플라이스 부위를 파괴하였다. 가이드 9는 0.34% 스플라이스 부위 모티프 파괴 및 3.8% 전반적 편집을 보여주었고; 총 편집의 10% 미만은 스플라이스 부위를 파괴하였다. 가이드 55는 2.2% 스플라이스 부위 모티프 파괴 및 4.9% 전반적 편집을 보여주었고; 총 편집의 40% 초과는 스플라이스 부위를 파괴하였다. 가이드 56은 2.3% 스플라이스 부위 모티프 파괴 및 4.9% 전반적 편집을 보여주었고; 총 편집의 45% 초과는 스플라이스 부위를 파괴하였다. 가이드 57은 0% 스플라이스 부위 모티프 파괴 및 1.6% 전반적 편집을 보여주었다. 가이드 58은 0.49% 스플라이스 부위 모티프 파괴 및 3.3% 전반적 편집을 보여주었고; 총 편집의 10% 초과는 스플라이스 부위를 파괴하였다.
도 5a는 실시예 1 및 실시예 2, 각각으로부터 HEK293T 세포 및 SH-SY5Y 세포에서 증명된 인델 활성 (% 인델)을 비교하는 플롯이다. 도 5b는 실시예 1 및 실시예 2, 각각으로부터 HEK293T 세포 및 SH-SY5Y 세포에서 증명된 스플라이스 부위 모티프 파괴를 비교하는 플롯이다. 도 5a에 도시된 대로, 가이드 55 및 가이드 9는 2개 세포 유형에 걸쳐서 최고 % 인델을 증명하였다. 가이드 56은 SH-SY5Y 세포에서 최고 % 인델 그러나 HEK293T 세포에서 낮은 % 인델을 증명하였다. 가이드 55는 2개 세포 유형에서 최고 스플라이스 부위 모티프 파괴를 또한 초래하였다 (도 5b).
본 실시예는 그래서 STMN2의 인트론 1의 비밀 스플라이스 부위가 여러 세포 유형에서 Cas12i2 및 여러 RNA 가이드에 의해 표적화될 수 있음을 보여준다.
기타 구현예
본 명세서에 개시된 특성들의 모두는 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 특성은 동일하거나, 동등하거나, 유사한 목적을 제공하는 대체 특성에 의해 대체될 수 있다. 그래서, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 개시된 각 특성은 동등하거나 유사한 특성의 일반적인 시리즈의 예일 뿐이다.
위의 설명으로부터, 당업자는 본 개시내용의 필수 특징을 쉽게 규명할 수 있고, 이의 정신과 범위를 벗어나지 않고, 본 개시내용을 다양한 용도 및 조건에 적응시키기 위해 다양한 변화와 수정을 가할 수 있다. 그래서, 기타 구현예는 청구항 내에 있다.
등가물
몇몇 본 발명의 구현예가 본원에 기재되고 예시되었지만, 당업자는 본원에 기재된 기능을 수행하고/하거나 결과 및/또는 하나 이상의 이점을 수득하기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 쉽게 구상할 것이고, 이러한 변동 및/또는 수정의 각각은 본원에 기재된 본 발명의 구현예의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 더욱 일반적으로, 당업자는 본원에 기재된 모든 파라미터, 치수, 재료, 및/또는 구성이 예시적인 것으로 의미됨 그리고 실제 파라미터, 치수, 재료, 및/또는 구성이 본 발명의 교시가 사용되는 특정 응용 또는 응용들에 따라 달라질 것임을 쉽게 이해할 것이다. 당업자는 단지 일상적인 실험작업을 사용하여 본원에 기재된 특정 발명의 구현예에 대한 많은 등가물을 인식할 것이거나, 규명할 수 있을 것이다. 그러므로, 전술하는 구현예가 단지 예로써 제시됨 그리고, 첨부된 청구항 및 이의 등가물의 범위 내에서, 본 발명의 구현예가 구체적으로 기재되고 청구된 것과 달리 실시될 수 있음이 이해되어야 한다. 본 개시내용의 본 발명의 구현예는 본원에 기재된 각 개별 특성, 시스템, 물품, 재료, 키트, 및/또는 방법에 관한 것이다. 이외에도, 둘 이상의 이러한 특성, 시스템, 물품, 재료, 키트, 및/또는 방법의 임의의 조합은, 이러한 특성, 시스템, 물품, 재료, 키트, 및/또는 방법이 상호 모순되지 않으면, 본 개시내용의 본 발명의 범위 내에 포함된다.
모든 정의는, 본원에 정의되고 사용된 경우에, 사전적 정의, 참조로 편입된 문서에서의 정의, 및/또는 정의된 용어의 일반적인 의미를 통제하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은, 일부 경우에 문서 전체를 포괄할 수 있는, 각각이 인용되는 주제와 관련하여 참조로 편입된다.
본 명세서 및 청구항에서 본원에 사용된 경우에 부정관사 "한(a)" 및 "하나(an)"는, 달리 반대로 명확하게 표시되지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서 및 청구항에서 본원에 사용된 경우에 어구 "및/또는"은 그렇게 연접된 요소 중 "어느 하나 또는 둘 모두", 즉, 일부 경우에 합동으로 존재하고 다른 경우에 분리적으로 존재하는 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"으로 나열된 여러 요소는 동일한 방식, 즉, 그렇게 연접된 요소 중 "하나 이상"으로 해석되어야 한다. 기타 요소는, 구체적으로 식별된 그들 요소와 관련이 있든 없든, "및/또는" 절에 의해 구체적으로 식별된 요소 외에 임의로 존재할 수 있다. 그래서, 비-제한 예로서, "A 및/또는 B" 지칭은 개방형 언어 예컨대 "포함하는"과 공동으로 사용된 때, 일 구현예에서, A만 (임의로 B 이외의 요소 포함); 또 다른 구현예에서, B만 (임의로 A 이외의 요소 포함); 더욱 또 다른 구현예에서, A 및 B 둘 모두 (임의로 기타 요소 포함); 등을 지칭할 수 있다.
본 명세서 및 청구항에서 본원에 사용된 경우에 "또는"은 위에 정의된 대로 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리하는 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포함됨, 즉, 요소의 수 또는 목록, 및, 임의로, 추가의 미나열된 항목의 적어도 하나의 포함, 뿐만 아니라 하나 초과의 포함하기로서 해석되어야 한다. 반대로 분명히 표시된 용어만, 예컨대 "의 하나만" 또는 "의 정확히 하나", 또는, 청구항에서 사용된 때, "으로 이루어지는"은 요소의 수 또는 목록의 정확히 하나의 요소의 포함을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본원에 사용된 경우에 용어 "또는"은 배타성의 용어, 예컨대 "어느 하나", "의 하나", "의 하나만", 또는 "의 정확히 하나"가 앞에 온 때 배타적 대안 (즉 "하나 또는 다른 하나 그러나 둘 모두는 아님")을 나타내는 것으로만 해석되어야 한다. 청구항에서 사용된 때, "으로 본질적으로 이루어지는"은 특허법의 분야에서 사용된 경우에 이의 일반적인 의미를 가질 수 있다.
본 명세서 및 청구항에서 본원에 사용된 경우에, 하나 이상의 요소의 목록과 관련하여 어구 "적어도 하나"는 요소의 목록에서 요소의 임의의 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 하지만, 요소의 목록 내에 구체적으로 나열된 각 및 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함할 필요는 없고 요소의 목록에서 요소의 임의의 조합을 제외하지 않는다. 본 정의는 또한, 구체적으로 식별된 그들 요소와 관련이 있든 없든, 어구 "적어도 하나"가 지칭하는 요소의 목록 내에서 구체적으로 식별된 요소 이외에 요소가 임의로 존재할 수 있음을 허용한다. 그래서, 비-제한 예로서, "A 및 B의 적어도 하나" (또는, 동등하게, "A 또는 B의 적어도 하나", 또는, 동등하게 "A 및/또는 B의 적어도 하나")는, 일 구현예에서, 임의로 하나 초과 A를 포함하고, B는 존재하지 않는 적어도 하나 (및 임의로 B 이외의 요소를 포함함); 또 다른 구현예에서, 임의로 하나 초과 B를 포함하고, A는 존재하지 않는 적어도 하나 (및 임의로 A 이외의 요소를 포함함); 더욱 또 다른 구현예에서, 임의로 하나 초과 A를 포함하는 적어도 하나, 및 임의로 하나 초과 B를 포함하는 적어도 하나 (및 임의로 다른 요소를 포함함); 등을 지칭할 수 있다.
반대로 명확하게 표시되지 않는 한, 하나 초과의 단계 또는 행위를 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서, 본 방법의 단계 또는 행위의 순서가 반드시 본 방법의 단계 또는 행위가 인용되는 순서로 제한되지 않음이 또한 이해되어야 한다.

Claims (62)

  1. 스타스민 2 (STMN2) 유전자의 유전적 편집을 위한 유전자 편집 시스템으로서,
    (i) Cas12i2 폴리펩티드가 서열번호: 448과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 서열번호: 448에 비해 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, Cas12i2 폴리펩티드 또는 Cas12i2 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산; 및
    (ii) RNA 가이드가 STMN2 유전자 내에서 표적 서열에 특이적인 스페이서 서열을 포함하고, 표적 서열은 표적 서열에 5' 위치하는, 5'-TTN-3'의 모티프를 포함하는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 인접한, RNA 가이드 또는 RNA 가이드를 인코딩하는 제2 핵산
    을 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  2. 제 1 항에 있어서, Cas12i2 폴리펩티드에서 상기 하나 이상의 돌연변이가 서열번호: 448의 위치 D581, G624, F626, P868, I926, V1030, E1035, 및/또는 S1046에 있는, 유전자 편집 시스템.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이가, 임의로 D581R, G624R, F626R, P868T, I926R, V1030G, E1035R, S1046G, 또는 이들의 조합인, 아미노산 치환인, 유전자 편집 시스템.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 Cas12i2 폴리펩티드는 다음을 포함하는, 유전자 편집 시스템:
    (i) 임의로 D581R, D911R, I926R, 및 V1030G의 아미노산 치환인, 위치 D581, D911, I926, 및 V1030에서의 돌연변이;
    (ii) 임의로 D581R, I926R, 및 V1030G의 아미노산 치환인, 위치 D581, I926, 및 V1030에서의 돌연변이;
    (iii) 임의로 D581R, I926R, V1030G, 및 S1046G의 아미노산 치환인, 위치 D581, I926, V1030, 및 S1046에서의 돌연변이;
    (iv) 임의로 D581R, G624R, F626R, I926R, V1030G, E1035R, 및 S1046G의 아미노산 치환인, 위치 D581, G624, F626, I926, V1030, E1035, 및 S1046에서의 돌연변이; 또는
    (v) 임의로 D581R, G624R, F626R, P868T, I926R, V1030G, E1035R, 및 S1046G의 아미노산 치환인, 위치 D581, G624, F626, P868, I926, V1030, E1035, 및 S1046에서의 돌연변이.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 Cas12i2 폴리펩티드는 서열번호: 449, 450, 451, 452, 또는 453의 아미노산 서열을 포함하고, 임의로 상기 Cas12i2 폴리펩티드는 서열번호: 450 또는 453의 아미노산 서열을 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, Cas12i2 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산을 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 제1 핵산은 메신저 RNA (mRNA)인, 유전자 편집 시스템.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 제1 핵산은, 임의로 아데노-연관된 바이러스성 (AAV) 벡터인, 바이러스성 벡터에 포함되는, 유전자 편집 시스템.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 서열은 STMN2 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 또는 인트론 내에 있는, 유전자 편집 시스템.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 가이드는 서열번호: 4508, 4512, 4559, 및 4561 중 어느 하나의 서열을 포함하거나, 상기 제2 핵산은 서열번호: 4508, 4512, 4559, 및 4561 중 어느 하나를 포함하는 RNA 가이드를 인코딩하는, 유전자 편집 시스템.
  11. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 가이드는 서열번호: 4505, 4506, 4507, 4508, 4509, 4510, 4511, 4512, 4513, 4514, 4515, 4554, 4555, 4556, 4557, 4558, 4559, 4560, 4561, 및 4562 중 어느 하나의 서열을 포함하거나, 상기 제2 핵산은 서열번호: 4505, 4506, 4507, 4508, 4509, 4510, 4511, 4512, 4513, 4514, 4515, 4554, 4555, 4556, 4557, 4558, 4559, 4560, 4561, 및 4562 중 어느 하나를 포함하는 RNA 가이드를 인코딩하는, 유전자 편집 시스템.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스페이서 서열은 길이가 20-30-뉴클레오티드이고, 임의로 상기 스페이서 서열은 길이가 20-뉴클레오티드인, 유전자 편집 시스템.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 가이드는 스페이서 서열 및 직접 반복 서열을 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 직접 반복 서열은 길이가 23-36-뉴클레오티드인, 유전자 편집 시스템.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 직접 반복 서열은 서열번호: 1-10 중 어느 하나 또는 길이가 적어도 23-뉴클레오티드인 이의 단편과 적어도 90% 동일한, 유전자 편집 시스템.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 직접 반복 서열은 서열번호: 1-10 중 어느 하나, 또는 길이가 적어도 23-뉴클레오티드인 이의 단편인, 유전자 편집 시스템.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 직접 반복 서열은 5'-AGAAAUCCGUCUUUCAUUGACGG-3' (서열번호: 10)인, 유전자 편집 시스템.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 RNA 가이드를 인코딩하는 제2 핵산을 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  19. 제 18 항에 있어서, RNA 가이드를 인코딩하는 상기 제2 핵산은 바이러스성 벡터에 위치하는, 유전자 편집 시스템.
  20. 제 8 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스성 벡터는 Cas12i2 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 및 RNA 가이드를 인코딩하는 제2 핵산을 모두 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  21. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은, 제1 벡터에 위치하는, Cas12i2 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산을 포함하고, 상기 시스템은, 제2 벡터에 위치하는, RNA 가이드를 인코딩하는 제2 핵산을 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 벡터는 동일한 벡터인, 유전자 편집 시스템.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은, (i), (ii), 또는 둘 모두를 포괄하는, 하나 이상의 지질 나노입자 (LNP)를 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 시스템은, (i)을 포괄하는, LNP를 포함하고, 상기 시스템은 RNA 가이드를 인코딩하는 제2 핵산을 포함하는 바이러스성 벡터를 포함하고; 임의로 상기 바이러스성 벡터는 AAV 벡터인, 유전자 편집 시스템.
  25. 제 23 항에 있어서, 상기 시스템은, (ii)를 포괄하는, LNP를 포함하고, 상기 시스템은 Cas12i2 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산을 포함하는 바이러스성 벡터를 포함하고; 임의로 상기 바이러스성 벡터는 AAV 벡터인, 유전자 편집 시스템.
  26. 스타스민 2 (STMN2) 유전자의 유전적 편집을 위한 유전자 편집 시스템으로서,
    (i) 임의로 Cas12i 폴리펩티드가 Cas12i2 폴리펩티드인, Cas12i 폴리펩티드 또는 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산; 및
    (ii) RNA 가이드가 STMN2 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 또는 인트론 내에서 표적 서열에 특이적인 스페이서 서열을 포함하고, 표적 서열은 표적 서열에 5' 위치하는, 5'-TTN-3'의 모티프를 포함하는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 인접한, RNA 가이드 또는 RNA 가이드를 인코딩하는 제2 핵산
    을 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 RNA 가이드는 서열번호: 4508, 4512, 4559, 및 4561 중 어느 하나의 서열을 포함하거나, 상기 제2 핵산은 서열번호: 4508, 4512, 4559, 및 4561 중 어느 하나를 포함하는 RNA 가이드를 인코딩하는, 유전자 편집 시스템.
  28. 제 26 항에 있어서, 상기 RNA 가이드는 서열번호: 4505, 4506, 4507, 4508, 4509, 4510, 4511, 4512, 4513, 4514, 4515, 4554, 4555, 4556, 4557, 4558, 4559, 4560, 4561, 및 4562 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 상기 제2 핵산은 서열번호: 4505, 4506, 4507, 4508, 4509, 4510, 4511, 4512, 4513, 4514, 4515, 4554, 4555, 4556, 4557, 4558, 4559, 4560, 4561, 및 4562 중 어느 하나를 포함하는 RNA 가이드를 인코딩하는, 유전자 편집 시스템.
  29. 제 26 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산을 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 제1 핵산은 메신저 RNA (mRNA)인, 유전자 편집 시스템.
  31. 제 29 항에 있어서, 상기 제1 핵산은, 임의로 아데노-연관된 바이러스성 (AAV) 벡터인, 바이러스성 벡터에 포함되는, 유전자 편집 시스템.
  32. 제 26 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스페이서 서열은 길이가 20-30-뉴클레오티드이고, 임의로 상기 스페이서 서열은 길이가 20-뉴클레오티드인, 유전자 편집 시스템.
  33. 제 26 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 가이드는 스페이서 서열 및 직접 반복 서열을 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 직접 반복 서열은 길이가 23-36-뉴클레오티드인, 유전자 편집 시스템.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 직접 반복 서열은 서열번호: 1-10 중 어느 하나 또는 길이가 적어도 23-뉴클레오티드인 이의 단편과 적어도 90% 동일한, 유전자 편집 시스템.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 직접 반복 서열은 서열번호: 1-10 중 어느 하나, 또는 길이가 적어도 23-뉴클레오티드인 이의 단편인, 유전자 편집 시스템.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 직접 반복 서열은 5'-AGAAAUCCGUCUUUCAUUGACGG-3' (서열번호: 10)인, 유전자 편집 시스템.
  38. 제 26 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 RNA 가이드를 인코딩하는 제2 핵산을 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  39. 제 38 항에 있어서, RNA 가이드를 인코딩하는 상기 제2 핵산은 바이러스성 벡터에 위치하는, 유전자 편집 시스템.
  40. 제 31 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스성 벡터는 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 및 RNA 가이드를 인코딩하는 제2 핵산 둘 모두를 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  41. 제 26 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은, 제1 벡터에 위치하는, Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산을 포함하고, 상기 시스템은, 제2 벡터에 위치하는, RNA 가이드를 인코딩하는 제2 핵산을 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  42. 제 26 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은, (i), (ii), 또는 둘 모두를 포괄하는, 하나 이상의 지질 나노입자 (LNP)를 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  43. 제 42 항에 있어서, 상기 시스템은, (i)을 포괄하는, LNP를 포함하고, 상기 시스템은 RNA 가이드를 인코딩하는 제2 핵산을 포함하는 바이러스성 벡터를 포함하고; 임의로 상기 바이러스성 벡터는 AAV 벡터인, 유전자 편집 시스템.
  44. 제 42 항에 있어서, 상기 시스템은, (ii)를 포괄하는, LNP를 포함하고, 상기 시스템은 Cas12i 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산을 포함하는 바이러스성 벡터를 포함하고; 임의로 상기 바이러스성 벡터는 AAV 벡터인, 유전자 편집 시스템.
  45. 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 제시된 유전자 편집 시스템을 포함하는 약학적 조성물.
  46. 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 제시된 유전자 편집 시스템의 요소 (i) 및 (ii)를 포함하는 키트.
  47. 세포에서 스타스민 2 (STMN2) 유전자를 편집하는 방법으로서, 숙주 세포에서 STMN2 유전자를 유전적으로 편집하기 위해 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 제시된 STMN2 유전자를 편집하기 위한 유전자 편집 시스템과 숙주 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  48. 제 47 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 시험관내 배양되는, 방법.
  49. 제 47 항에 있어서, 접촉시키는 단계는 숙주 세포를 포함하는 대상체에게 STMN2 유전자를 편집하기 위한 유전자 편집 시스템을 투여함으로써 수행되는, 방법.
  50. 파괴된 스타스민 2 (STMN2) 유전자를 포함하는 세포로서, 상기 세포는 임의로 숙주 세포에서 STMN2 유전자를 유전적으로 편집하기 위해 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항의 유전자 편집 시스템과 숙주 세포를 접촉시키고, 이에 따라 STMN2 유전자를 파괴함으로써 생산되는, 세포.
  51. 대상체에서 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법으로서, 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 제시된 스타스민 2 (STMN2) 유전자를 편집하기 위한 유전자 편집 시스템 또는 제 50 항의 세포를 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  52. 제 51 항에 있어서, 상기 대상체는, 임의로 근위축성 측삭 경화증 (ALS)인, 신경퇴행성 질환을 갖는 인간 환자인, 방법.
  53. 제 51 항에 있어서, 상기 대상체는, 임의로 전두측두엽 치매 (FTD)인, 신경퇴행성 질환을 갖는 인간 환자인, 방법.
  54. RNA 가이드로서, (i) 표적 서열에 5' 위치하는, 5'-TTN-3'의 모티프를 포함하는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 표적 서열이 인접한, 스타스민 2 (STMN2) 유전자에서 표적 서열에 특이적인 스페이서 서열; 및 (ii) 직접 반복 서열을 포함하는, RNA 가이드.
  55. 제 54 항에 있어서, 상기 스페이서 서열은 길이가 20-30-뉴클레오티드, 임의로 길이가 20-뉴클레오티드인, RNA 가이드.
  56. 제 54 항 또는 제 55 항에 있어서, 상기 직접 반복 서열은 길이가 23-36-뉴클레오티드, 임의로 길이가 23-뉴클레오티드인, RNA 가이드.
  57. 제 54 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 서열은 STMN2 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 또는 인트론 내에 있는, RNA 가이드.
  58. 제 54 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 가이드는 서열번호: 4508, 4512, 4559, 및 4561 중 어느 하나의 서열을 포함하는, RNA 가이드.
  59. 제 54 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 가이드는 서열번호: 4505, 4506, 4507, 4508, 4509, 4510, 4511, 4512, 4513, 4514, 4515, 4554, 4555, 4556, 4557, 4558, 4559, 4560, 4561, 및 4562 중 어느 하나의 서열을 포함하는, RNA 가이드.
  60. 제 54 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 직접 반복 서열은 서열번호: 1-10 중 어느 하나 또는 길이가 적어도 23-뉴클레오티드인 이의 단편과 적어도 90% 동일한, RNA 가이드.
  61. 제 60 항에 있어서, 상기 직접 반복 서열은 서열번호: 1-10 중 어느 하나, 또는 길이가 적어도 23-뉴클레오티드인 이의 단편인, RNA 가이드.
  62. 제 61 항에 있어서, 상기 직접 반복 서열은 5'-AGAAAUCCGUCUUUCAUUGACGG-3' (서열번호: 10)인, RNA 가이드.
KR1020247007547A 2021-08-11 2022-08-11 스타스민 2 (stmn2)를 표적화하는 rna 가이드를 포함하는 유전자 편집 시스템 및 이의 용도 KR20240052763A (ko)

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MX2022012189A (es) 2020-03-31 2023-01-05 Arbor Biotechnologies Inc Composiciones que comprenden una variante del polipéptido cas12i2 y usos de las mismas.
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