JP6624743B2 - 部位特異的rna変異導入方法およびそれに使用する標的編集ガイドrnaならびに標的rna−標的編集ガイドrna複合体 - Google Patents
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Description
記号「bN1 bN2・・bNn-1bNn」は、5’−標的RNA[LA]のガイド側標的相補領域(14)を構成する塩基配列に相当する塩基配列を表し、記号「bN」がアデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)またはウラシル(U)から選ばれるいずれかの塩基からなる1〜15個、好ましくは12個程度、より好ましくは10個程度、特に好ましくは5個程度の同種または異種の塩基組み合わせで構成される連続塩基配列であるように構築する。)
と、3’−標的編集ガイドRNA[IIA]:
記号「dN1・・dNm」は、3’−アンチセンス領域の末端側標的認識領域(22)を構成する塩基配列を意味し、記号「dN」がアデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)またはウラシル(U)から選ばれるいずれか1種の塩基からなり、塩基数が、特に限定されないが、一般的には40個、好ましくは30個、より好ましくは20個程度になる同種または異種の塩基の組み合わせからなる連続塩基配列になるように構築するとともに、5’−標的RNAの末端側標的相補領域(12)の塩基配列の構成塩基数と同数であるとともに、その末端側標的相補領域の塩基配列と塩基対を構築し、
記号「eN1eN2 ・・eNn+p」は、記号「eN1eN2 ・・eNn」で表されるコア側標的認識領域のX隣接部分領域の塩基配列と、記号「eN1eN2 ・・eNp」で表されるADAR隣接部分領域の塩基配列を意味するとともに、そのX隣接部分領域は、記号「eN」がアデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)またはウラシル(U)から選ばれるいずれかの塩基からなり、塩基数が、本発明の目的ならびに機能を損なわない限り特に限定されないが、一般的には、1〜15個、好ましくは1〜12個、より好ましくは1〜10個、特に好ましくは5個以下からなる同種または異種の塩基の連続塩基配列を表し、またそのADAR隣接部分領域は、同様に、アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)またはウラシル(U)から選ばれるいずれかの塩基からなり、塩基数が一般的には0〜15個、好ましくは12個以下、より好ましくは10個以下からなる連続塩基配列を表している。)
と反応させて複合体化させて5’−標的RNA−3’−標的編集ガイドRNA複合体[IIIA]:
合成オリゴDNA(1)(guide RNA_D3_tempT7F)100 mMと合成オリゴDNA(2)(guide RNA_ D3_tempR)100 mMを含む反応溶液を95℃で3分間、続いて25度に減温して15分間処理してアニーリング反応を行ってDNA(guide RNA_D3_tempF/R)を得た。続いて、2.5 mM dNTPと5000 U/mL Klenow fragmentを加え(終濃度:guide RNA_D3_tempF/R 2 mM、dNTP 0.2 mM、Klenow fragment 2.5 U )を25 ℃で30分間伸長し、フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によりDNAを精製した。得られたDNAを鋳型とし、T7-Scribe Standard RNA IVT KITを用いてin vitro転写(37℃3時間)によりRNA(3'−標的編集ガイドRNA1)を合成した。その後、DNAse (終濃度:2 U)を加え、37℃で15分間処理し、フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によってRNAを精製した。得られたRNAを8 M Urea PAGE (8 %)で精製して、粉砕・浸漬によって抽出し、0.22 mmフィルター(DURAPORE)およびゲル濾過 (BIO RAD) によって精製した。
CTAATACGACTCACTATAGGGTGGAATAGTATACCATTCGTGGTATAG
(2)guide RNA_D3_tempR (44 mer)
TGACCACCCTGAGCTGCGGAGGTGGGATACTATACCACGAATGG
合成オリゴDNA(3)(guide RNA_D0_tempT7F)100 mMと合成オリゴDNA(4)(guide RNA_D0_tempR)100 mMを含む反応溶液を、実施例1と実質的に同様にして処理してRNA(3'−標的編集ガイドRNA2)を得た。
(3)guide RNA_D0_tempT7F (51 mer)
CTAATACGACTCACTATAGGTGGGTGGAATAGTATACCATTCGTGGTATAG
(4)guide RNA_D0_tempR (44 mer)
TGACCACCCTGAGCTGGGTAGGTGGGATACTATACCACGAATGG
合成オリゴDNA(5)(guide RNA_D3r_tempT7F)100 mMと合成オリゴDNA(6)(guide RNA_D3r_tempR)100 mMを含む反応溶液を、実施例1と実質的に同様にして処理してRNA(3'−標的編集ガイドRNA3)を得た。
(5)guide RNA_D3r_tempT7F (45 mer)
CTAATACGACTCACTATAGGGAAGCACTGCACGCCGCAGCGGGTG
(6)guide RNA_D3r_tempR (49 mer)
AGGTGGGATACTATACCACGAATGGTATACTATTCCACCCGCTGCGGCG
合成オリゴDNA(7)(guide RNA_D0r_tempT7F)100 mMと合成オリゴDNA(8)(guide RNA_D0r_tempR)100 mMを含む反応溶液を、実施例1と実質的に同様にして処理してRNA(3'−標的編集ガイドRNA4)を得た。
(7)guide RNA_D0r_tempT7F (45 mer)
CTAATACGACTCACTATAGGGAAGCACTGCACGCCGCGGTGGGTG
(8)guide RNA_D0r_tempR (52 mer):
GGTAGGTGGGATACTATACCACGAATGGTATACTATTCCACCCACCGCGGCG
GFP-Gq-TK Plasmidを鋳型とし、100 mM AcGFP_sRNA01_T7F01プライマー、100 mM AcGFP_sRNA01_R01プライマー、2.5 mM dNTP、1.25 U/mL Prime Star GXLを含む反応溶液中でPCR(1サイクル(98℃10秒間、55℃ 30秒間68℃30秒間)、30サイクル)によって増幅した (終濃度:GFP-Gq-TK Plasmid 4.0 pg/mL, AcGFP_sRNA01_T7 F/R 0.3 mM, dNTP 0.2 mM, PrimeStar GXL 2.5 U)。増幅したPCR製品をフェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によりDNAを精製した。得られたDNAを鋳型とし、T7-Scribe Standard RNA IVT KITを用いてin vitro転写(37℃、3時間)によりRNAを合成した。その後、DNAse(終濃度:2 U)を加え、処理し(37℃、15分間)、フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によってRNAを精製した。得られたRNAを8 M Urea PAGE (8 %)で精製して、粉砕・浸漬によって抽出し、0.22 mmフィルター(DURAPORE)およびゲル濾過 (BIO RAD)によって精製した。
CTAATACGACTCACTATAGGGCCACCCTGGTGACCACCC
GCGCGCGACTTGTAGTTGCC
アニーリングバッファー(150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.6))中で、精製した各標的編集ガイドRNA(終濃度:0.45 mM)と標的RNA(GFP sRNA 01)(終濃度:0.45 mM)のアニーリング反応(80℃3分間→25℃15分間)を行った。反応後、8 % Native PAGEで標的RNA(GFP RNA)と標的編集ガイドRNAの複合体の形成を確認した。
GFP sRNA 01:
5'-GGGUGAAUGGCCACAAGUUCAGCGUGAGCGGCGAGGGCGAGGGCGAUGCCACCUACGGCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACCGGCAAGCUGCCUGUGCCCUGGCCCACCCUGGUGACCACCCUGAGCUACGGCGUGCAGUGCUUCUC-3'
アニーリングバッファー(150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.6))中で、精製した各標的編集ガイドRNA(終濃度:0.45 mM)と標的RNA(GFP sRNA 01)(終濃度:0.45 mM)のアニーリング反応(80℃3分間→25℃15分間)を行った。反応後、8 % Native PAGEで標的RNA(GFP RNA)と標的編集ガイドRNAの複合体の形成を確認した。
実施例1で精製した5'−標的編集ガイドRNA1)または実施例3で精製した3'−標的編集ガイドRNA3(各終濃度:0.45 mM)と実施例5で合成した標的RNA(GFP RNA)(終濃度:0.45 mM)をアニーリング反応(80℃3分間→25℃15分間)してRNA複合体をそれぞれ得た。得られたRNA複合体(0.45 mM)をTE Bufferで50 mMになるように希釈した。希釈後、RNA複合体(終濃度:5 nM)に精製した組換えhADAR2(終濃度:0.8 mM)を加え、編集反応を行った(37℃、1時間)。編集反応後、フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によりRNA複合体1またはRNA複合体2をそれぞれ精製した。得られた各RNA複合体の沈殿をTE Buffer 5 mLに溶解し、Prime Script Reverse Transcription KitとAcGFP_sRNA_R01プライマー(終濃度:2.5 mM)を用いて逆転写反応を行った(65℃5分間急冷、42℃45分間、70℃15分間)。得られたcDNAを鋳型として用い、PCR(1.25 U/mL Prime Star GXL、AcGFP_sRNA_T7F01プライマー、cGFP_sRNA_R01プライマー、2.5 mM dNTP)(1サイクル(98℃10秒間、55℃15秒間、68秒間20秒間)、25サイクル)により二本鎖DNAを増幅した。その後、増幅したDNAとBig Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitを用いて、DNA塩基配列解析を行った。得られたクロマトチャートの標的編集部位のA(T)とG(C)のピーク比 (G / A+G)から編集率を算出した。RNA複合体1およびRNA複合体2のそれぞれの編集率は88.1%および91.2%であった。これに対して、標的RNAだけのコントロールはいずれも2.7%であった。
まず、AD-gRNAはin vitro転写法にて合成した。In vitro転写用テンプレートdsDNAを合成オリゴヌクレオチドを用いて常法に従って合成した。一般には、T7プロモーター配列を含むフォワードDNAオリゴヌクレオチド1μMと、リバースDNAオリゴヌクレオチド 1μMをアニーリングバッファ(50 mM Tris-HCl [pH 7.6] 、50 mM NaCl)で混合して後、95℃で3分間変性後、室温で15分間冷却してアニーリング反応を行った。dsDNAテンプレートを作製するために、アニーリング製品をKlenowポリメラーゼ (New England BioLabs) を用いて伸長した。得られたdsDNAをフェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿にて精製した。この精製dsDNAをテンプレートとして使用して、in vitro転写反応をAmpliScribe T7 Kit (Epicentre Biotechnologies) を用いて製造者プロトコルに従って行った。反応液をフェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿して、8 M Ureaを含む 5% ポリアクリルアミドゲルにて変性して AD-gRNAsを精製した。標的RNAは、dsDNAテンプレートを標準PCR反応(PrimeSTAR GXL DNA polymerase (TAKARA BIO))によるPCRによって調製した後、上述したようにin vitro転写と精製を行った。全てのDNAオリゴヌクレオチドとRNAサンプルの配列は表2〜表6に表示している。
組換えhADAR2は、ヒトADAR2のためのコーデイング領域をcDNA clone (clone ID 6014605, Open Biosystems) からPCRで増幅し、N-末端His-Expressタグ付融合タンパク質をクローン後、Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit (Zymo Research) を用いてINVSc1イースト細胞に形質転換した。得られた形質転換体は液体培地で培養し、組換えhADAR2をHisTrap HPカラム (GE Healthcare) で精製した。hADAR2を含む分画を集めて、保存用バッファ(10 mM Tris-HCl [pH 7.5]、150 mM NaCl、 5% glycerol, 1 mM DTT)で50-kDaの分子量カットオフFloat-A-Lyzer G2 (Spectra/Por) で投石した。精製したhADAR2はDC protein Assay Kit (BioRad) を用いて製造者プロトコルに従って定量した。
gRNAsとtarget RNAの複合体は、900 nM AD-gRNAと300 nM標的RNAを80℃で3分間加熱し、次いでアニーリングバッファ(10 mM Tris-HCl [pH 7.6] 、150 mM NaCl)を用いて1℃/10秒の割合で25℃に徐冷した。編集反応は次のように行った。得られた複合体5 nMと濃度を変えた精製hADAR2を反応バッファ(20 mM HEPES-KOH [pH 7.5]、100 mM NaCl、 2 mM MgCl2,、0.5 mM DTT、0.01% TritonX-100、 5% glycerol、 1 U/μl Murine RNAse Inhibitor [New England BioLabs] )20μlで混合した後、37℃で2時間培養した。反応終了後、反応したRNAをフェノール/クロロホルム抽出・エタノール沈殿をした。その後、RNAペレットをTEバッファ5μlに溶解した。反応RNAからcDNAを精製RNAから得るために、PrimeScript II Reverse Transcription Kit (TAKARA BIO) を用いて逆転写した。cDNAは、PrimeSTAR GXL DNA polymerase (TAKARA BIO) を用いて標準プロトコルに従ってPCR増幅した。各部位での辺雌雄効率は次のようなダイレクトシークエンシングによって分析した。ゲル精製PCR製品10 ngをリバースプライマーとBigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) でシークエンスし、次に3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) でシークエンスクロマトグラフィーを行った。各部位での編集割合は次のようにして算出した:A/(A+G)(式中、AとGは、Sequence Scanner software ver. 1.0 (Applied Biosystems) で測定したアデノシンとグアノシンのピーク高をそれぞれ意味する)。
in vitroコドン修復実験用レポーターは、レニラルシフェラーゼmRNA (Renilla luciferase mRNA (Rluc-WT)) に基づいて設計した。このレポーターmRNA (Rluc-W104X) は、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) を用いて、Trp104 (UGG) 内のG311を A311に変異して調製した。このRluc-W104Xレポーターを用いると、全長ワイルドタイプRlucトランスクリプトが合成され、A311がI311に編集された。In vitro編集反応と翻訳反応を連続して行った。まず、5μM Rluc-W104Xと15μM ADg-rLuc_A311を、アニーリングバッファーを用いて一緒に80℃で3分間加熱し、続いて1℃/10秒の割合で25℃に徐冷をしてアニールした。その後、レポーター・gRNA複合体0.5μMを反応バッファ―内で37℃で2時間処理して1.25μM hADAR2と編集反応を行った。並行して、コントロールサンプル(gRNAを含まない)を同一反応で処理した。
AD-gRNA発現プラスミドは、H1 RNA polymerase IIIプロモーターに基づいて、短鎖ヘアピンRNAsやmiRNAsなどの細胞内RNAsを発現するために使用されるpSUPER.neo (Oligoengine) を用いて構築された。AD-gRNAsをコードするDNAインサートを調製する際に、テトラウリジンをAD-gRNA配列の3 末端に挿入して特定位置のpol IIIの転写を終了させた。ベクターへのクローニングは、Hind IIIとBgl II制限部位を5 末端と3 末端にそれぞれ導入することによって促進された。DNAインサートは表2〜表6に示す合成オリゴヌクレオチドを用いて作製された。各DNAインサートはpSuper.neoベクターにクローンされ、得られたプラスミドの配列はDNAシークエンシング分析によって確認した。最後に、転写に使用する発現プラスミドはPlasmid Mini kit (Qiagen) を使用して製造者プロトコルに従って調製した。
HEK293細胞を、10%ウシ胎児血清を追加したDulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Sigma) に採取した。hADAR2とAcGFPを2方向性プロモーターからTet-on系の制御の下で同時に発現させたtet-ADAR2細胞を発明者の研究室で確立した。tet-ADAR2細胞は、10% Tet system-approvedウシ胎児血清 (Clontech)、1μg/mL puromycin、100μg/mL G418 (Sigma) を補充したDMEM内に単層として5% CO2の存在下37℃で培養した。tet-ADAR2細胞をDox5μg/mLを追加した上記培地で培養してADAR2とAcGFPの発現を誘導した。
Tet-ADAR2細胞(1.6×105) を5μg/mL Doxを含む培地を入れた35-mmデイッシュに追加した。細胞が約80%のコンフルエンスになったときに、X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent (Roche) を用いてAD-gRNA 2μgでトランスフェクトした。72時間トランスフェクトした後、tet-ADAR2細胞内でhADAR2を用いて同時発現させたAcGFP RNAのA100での編集効率は次のように分析した。全RNAは、トランスフェクトした細胞からSepasol RNA I Super G (Nacalai Tesque)を用いて製造者のプロトコルに従って抽出した。その後、RNAサンプル(30μg) を10 U DNase I (Takara Bio) で37℃で3時間処理した後、フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿をした。精製RNA (0.5μg) をアダプターリンクオリゴ (dT) 17プライマーとTranscriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit (Roche) を用いて製造者プロトコルに従って逆転写をした。得られた全RNAをテンプレートとして使用して、AcGFP cDNAをAcGFP-特異的プライマー (AcGFP_F and AcGFP_R) を用いてPCR 増幅した。A100部位でのA-I RNA編集効率は、ダイレクトシークエンシング法で分析した後、AとGの相対的ピーク高を定量し、各編集割合を(A + G) のピーク高で割ったGのピーク高に基づいて算出した。
in vitroコドン修復実験では、G173がA173に変換してストップコドンのコドンW58を変異した変異体GFP mRNA (AcGFP-W58X)を設計して、AD-gRNAが細胞内で機能性遺伝子発現を調節できるかどうかを決定した。AcGFP-W58X発現プラスミドをpcDNA3.1発現ベクター (Invitrogen) に基づいて構築した。さらに、hADAR2発現プラスミドをPCR-amplified hADAR2 cDNAを pcDNA3.1にクローンすることによって構築した。hADAR2、AcGFP-W58X、AD-gRNA発現ベクター各100 ngをサブコンフルエンスなHEK293細胞内に共トランスフェクトした。編集効率はトランスフェクト72時間後に行った。また細胞内GFP蛍光の回復は蛍光顕微鏡で分析した。
ΔCt=Ct(AD-gRNA) - Ct(GAPDH)
ADg-RNAの相対発現量は、R=2^−ΔCtによって推定し、グラフに表示した。
12 末端側標的相補領域
14 ガイド側標的相補領域
20 アンチセンス領域
22 末端側標的認識領域
24 コア側標的認識領域
26 ADAR結合領域
27 ガイド側分断領域
28 ADAR結合コア領域
50 3'−標的側相補領域
52 末端側標的相補領域
54 ガイド側標的相補領域
60 アンチセンス領域
62 末端側標的認識領域
64 コア側標的認識領域
66 ADAR結合領域
67 ガイド側分断領域
68 ADAR結合コア領域
Claims (10)
- 式[XXXIA]:
記号「 b N1 b N2・・ b Nn−1 b Nn」は、5’−標的RNAにおけるガイド端側標的相補領域に相当し、記号「 b N」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「n」は、1〜10の塩基数を意味し、
A*は、標的編集部位(*印)に存在する標的塩基アデニンを意味する。)
で表される5’−標的RNAと、
式[XXXIIA]:
記号「 e N1・・ e Nm」は、3’−標的編集ガイドRNAの末端側標的認識領域に相当し、記号「 e N」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「m」は前記と同じ意味を有し、40〜20の塩基数を意味し、5’−標的RNAの末端側標的相補領域の塩基配列の塩基数と同数であり、かつ、対応する塩基同士は塩基対を形成し、
記号「 d N1 d N2・・ d Nn+p」は、3’−標的編集ガイドRNAのコア側標的認識領域のC隣接部分領域とADAR隣接部分領域の塩基配列に相当し、記号「 d N」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「n」はコア側標的認識領域のC隣接部分領域の塩基配列の塩基数、記号「p」はコア側標的認識領域のADAR隣接部分領域の塩基数を表し、C隣接部分領域の塩基配列は複合体化の際に5’−標的RNAのガイド側標的相補領域の塩基配列と塩基対を形成し、またガイド側分断領域の塩基配列はADAR隣接部分領域の塩基配列と塩基対を形成する。)
で表される3’−標的編集ガイドRNAと、を反応させて式[XXXIIIA]:
で表される5’−編集標的RNAを得ることにより、標的塩基アデノシン(A)をA−I編集してイノシン(I)に変換することを含み、ヒト体内の細胞内で行われることを除く、部位特異的RNA変異導入方法。 - 式[XXXVIA]:
記号「 g N1 g N2・・ g Nn−1 g Nn」は、3’−標的RNAにおけるガイド端側標的相補領域に相当し、記号「 g N」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「n」は、1〜10個の塩基数を意味し、
A*は、標的編集部位(*印)に存在する標的塩基アデニンを意味する。)
で表される3’−標的RNAと、
式[XXXVIIA]:
記号「 h N1・・ h Nm」は、5’−標的編集ガイドRNAの末端側標的認識領域に相当し、記号「 h N」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「m」は前記と同じ意味を有し、40〜20の塩基数を意味し、3’−標的RNAの末端側標的相補領域の塩基配列の塩基数と同数であり、かつ、対応する塩基同士は塩基対を形成し、
記号「 j N1 j N2・・ j Nn+p」は、5’−標的編集ガイドRNAのコア側標的認識領域のX隣接部分領域とADAR隣接部分領域の塩基配列に相当し、記号「 j N」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「n」はコア側標的認識領域のX隣接部分領域の塩基配列の塩基数、記号「p」はコア側標的認識領域のADAR隣接部分領域の塩基数を表し、X隣接部分領域の塩基配列は複合体化の際に3’−標的RNAのガイド側標的相補領域の塩基配列と塩基対を形成し、またガイド側分断領域の塩基配列はADAR隣接部分領域の塩基配列と塩基対を形成する。)
で表される5’−標的編集ガイドRNAと、を反応させて式[XXXVIIIA]:
で表される3’−編集標的RNAを得ることを含み、ヒト体内の細胞内で行われることを除く、部位特異的RNA変異導入方法。 - 請求項1又は2に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、nが3であり、pが0である部位特異的RNA変異導入方法。
- 請求項1から3のいずれか1項に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記ADARの作用が生体内ADAR機構によることを特徴とする部位特異的RNA変異導入方法。
- 式[XXIIA]:
記号「 e N1・・ e Nm」は、標的編集ガイドRNAの末端側標的認識領域に相当し、記号「 e N」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「m」は前記と同じ意味を有し、40〜20の塩基数を意味し、標的RNAの末端側標的相補領域の塩基配列の塩基数と同数であり、かつ、対応する塩基同士は塩基対を形成し、
記号「 d N1 d N2・・ d Nn+p」は、標的編集ガイドRNAのコア側標的認識領域のC隣接部分領域とADAR隣接部分領域の塩基配列に相当し、記号「 e N」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「n」はコア側標的認識領域のC隣接部分領域の塩基配列の塩基数、記号「p」はコア側標的認識領域のADAR隣接部分領域の塩基数を表し、C隣接部分領域の塩基配列は複合体化の際に標的RNAのガイド側標的相補領域の塩基配列と塩基対を形成し、またガイド側分断領域の塩基配列はADAR隣接部分領域の塩基配列と塩基対を形成する。)
で表される3’−標的編集ガイドRNAである標的編集ガイドRNA。 - 式[XXVIIA]:
記号「 h N1・・ h Nm」は、標的編集ガイドRNAの末端側標的認識領域に相当し、記号「 h N」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「m」は前記と同じ意味を有し、40〜20の塩基数を意味し、標的RNAの末端側標的相補領域の塩基配列の塩基数と同数であり、かつ、対応する塩基同士は塩基対を形成し、
記号「 j N1 j N2・・ j Nn+p」は、標的編集ガイドRNAのコア側標的認識領域のX隣接部分領域とADAR隣接部分領域の塩基配列に相当し、記号「 j N」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「n」はコア側標的認識領域のX隣接部分領域の塩基配列の塩基数、記号「p」はコア側標的認識領域のADAR隣接部分領域の塩基数を表し、X隣接部分領域の塩基配列は複合体化の際に標的RNAのガイド側標的相補領域の塩基配列と塩基対を形成し、またガイド側分断領域の塩基配列はADAR隣接部分領域の塩基配列と塩基対を形成する。)
で表される5’−標的編集ガイドRNAである標的編集ガイドRNA。 - 請求項5又は6に記載の標的編集ガイドRNAであって、pが0であり、nが3である標的編集ガイドRNA。
- 請求項5から7のいずれか1項に記載の標的編集ガイドRNAと標的RNAとを複合体化し、ADARの作用によりA−I編集を誘導して該標的RNA部分の標的塩基アデノシンをイノシンに変換するための標的RNA−標的編集ガイドRNA複合体であって、
5’−標的RNA−3’−標的編集ガイドRNA複合体が5’−標的RNA−3’−標的編集ガイドRNA複合体[XXIIIA]:
若しくは5’−標的RNA−3’−標的編集ガイドRNA複合体[XXXIIIA]:
であること、または3’−標的RNA−5’−標的編集ガイドRNA複合体が3’−標的RNA−5’−標的編集ガイドRNA複合体[XXVIIIA]:
若しくは3’−標的RNA−5’−標的編集ガイドRNA複合体[XXXVIIIA]:
であることを特徴とする標的RNA−標的編集ガイドRNA複合体。 - 請求項8に記載の標的RNA−標的編集ガイドRNA複合体であって、pが0であり、nが3である標的RNA−標的編集ガイドRNA複合体。
- グルタミン酸受容体mRNA前駆体(GluR−B pre−mRNA)または編集に必要な領域のみを残して構築された人工編集基質(miniSL RNA)を基盤として、この編集基質のADAR結合領域だけを残し、特定位置で分断することによって得られた請求項5から7のいずれか1項に記載の標的編集ガイドRNA。
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